CN105283556A - 使用呈现出蛋白伴侣表达水平升高的经转化的细菌细胞在细菌无细胞合成系统中表达生物学活性蛋白 - Google Patents

Abstract

本申请描述了用于改善无细胞合成系统中正确折叠的生物学活性目标蛋白的表达的方法和系统。所述方法和系统使用具有活性氧化磷酸化系统的细菌无细胞提取物，并且包含外源蛋白伴侣。可通过用来制备所述无细胞提取物的细菌表达所述外源蛋白伴侣。所述外源蛋白伴侣可为蛋白二硫键异构酶和/或肽基脯氨酰顺反异构酶。发明人发现，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的组合对正确折叠的生物学活性目标蛋白的量产生协同增加。

Description

使用呈现出蛋白伴侣表达水平升高的经转化的细菌细胞在细菌无细胞合成系统中表达生物学活性蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年4月19日提交的美国专利申请第61/813,914号和于2014年2月7日提交的美国专利申请第61/937,069号的优选权的益处，其各自的公开通过引用整体并入本文。

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为了所有目的，将于2014年4月16日创建的文件-58-2PC.TXT中书写的序列表(73,728字节，机读格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)通过引用整体并入本文。

发明背景

在细菌无细胞合成系统中表达蛋白是一种用于表达重组靶蛋白的成熟建立的技术。可从表达或过表达目标蛋白的细菌制备提取物以提供细菌无细胞合成系统，所述细菌无细胞合成系统具有取决于所述蛋白的改变的特性。然而，细菌生长期间蛋白的过表达经常导致细菌较慢的生长速率和从所述细菌制备的提取物中较低的蛋白合成活性。

进一步，来自这样的提取物的重组蛋白的表达通常导致不正确的折叠和生物学活性的损失。蛋白伴侣的使用可改善蛋白的正确折叠和其生物学活性。因此，存在对改善的用于表达重组蛋白的细菌细胞提取物的需求，所述细菌细胞提取物从过表达蛋白伴侣的细菌制备，其中这样的提取物可合成大量正确折叠的蛋白。如下所述，本发明满足以上这些需求和其他需求。

发明概述

本公开提供用于改善无细胞合成系统中生物学活性和/或正确折叠的目标蛋白的表达的方法和系统。所述无细胞合成系统包含细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统和用于无细胞蛋白合成所需的组分。所述无细胞合成系统还包含外源蛋白伴侣。在某些实施方案中，通过用来制备所述细菌提取物的细菌表达外源蛋白伴侣。

因此，在一个方面，描述了改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水平的方法，所述方法包括以下步骤：

i)制备细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，其中用来制备所述提取物的细菌以至少约1gm/升的提取物浓度表达外源蛋白伴侣；

ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统；以及

iii)在允许目标蛋白的表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细胞合成系统。

在第二方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且其中在细菌中以至少1gm/升的提取物水平表达外源蛋白伴侣；和，

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

在第三方面，描述了在细菌无细胞合成系统中表达正确折叠的生物学活性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

i)制备细菌提取物，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸、核糖体，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶，其中蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；

ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸；以及

iii)在允许目标蛋白的表达和正确折叠的条件下，孵育所述细菌提取物与所述核酸。

在第四方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且还包含蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶，

其中，所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；和

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中，所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

在第五方面，描述了改善大肠杆菌(Ecoli)细胞培养物的活力和/或生长速率的方法，所述方法包括以下步骤：

i)用表达蛋白DsbC的核酸转化大肠杆菌，所述表达蛋白DsbC的核酸可操作地连接组成型启动子；以及

ii)在允许过表达DsbC蛋白至胞内浓度至少1mg/ml的条件下，培养被转化的大肠杆菌细胞。

附图简述

图1显示真核PDI和细菌DsbC为功能上可互换的。

图2A显示实施例中所描述的蛋白伴侣顺序表达筛选的示意图。

图2B显示通过将细菌无细胞系统表达的蛋白伴侣加入至细菌无细胞合成系统可改善IgG滴度。

图3显示蛋白伴侣Skp、SlyD和FkpA改善正确组装的IgG的溶解性和/或量。

图4显示蛋白伴侣FkpA改善IgG蛋白的溶解性和折叠。

图5显示将纯化的FkpA加入至含有DsbC的提取物促进IgG的折叠。

图6显示将外源的DsbC蛋白加入至含有FkpA的提取物增加IgG滴度。

图7显示在提取物中通过CFPS所产生的GMCSF蛋白的量，所述提取物来自表达蛋白伴侣DsbC或FkpA的所示的菌株。

图8显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率，所述转化有质粒的菌株在组成型启动子的控制下表达1X或2X拷贝的DsbC(上图)。下图显示存在于周质裂解物中的DsbC蛋白的量。

图9显示通过过表达1X或2X拷贝DsbC的细菌菌株所产生的DsbC蛋白的量。上图显示细胞内浓度。下图显示提取物浓度。

图10显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率(上图)，所述转化有质粒的菌株在组成型启动子的控制下表达1X或2X拷贝FkpA。下面左图显示存在于总提取物中的FkpA蛋白的量，所述提取物制备自表达1X和2X拷贝FkpA的细菌。下面右图显示细菌菌株的倍增时间。

图11显示来自表达1X和2X拷贝FkpA的细菌的提取物中FkpA浓度的测定量。

图12显示将C端His标签加至FkpA的结果。(a)显示通过在30℃下提取物活化(预孵育)后的离心旋转，增加了提取物的FkpA水平，所述提取物制备自过表达FkpA-His(2XFkpA-His(e49))的细菌。(b)显示含有FkpA-His的提取物比含有野生型FkpA的提取物产生更多的总IgG(比较2XFkpA(e44)与2XFkpA-His(e49))，并且通过将活化后的提取物离心增加了正确折叠的IgG(比较最终旋转的2XFkpA与最终旋转的2XFkpA-His)。对照(Con)1和对照2为对照提取物，其制备自不表达FkpA的细菌。

图13显示蛋白伴侣的过表达改善了开放式无细胞合成系统中几种IgG的产量。(A)在SBJY001、2xDsbC和2xD+2xF提取物中，在¹⁴C-亮氨酸存在下表达曲妥珠单抗(trastuzumab)、结合CD30抗原的布妥昔单抗(brentuximab)以及与生殖细胞系轻链Vk3-20结合的生殖细胞系重链VH3-7和VH3-23，并且通过SDS-PAGE和放射自显影显现。(B)如实施例所述定量不同的提取物中所表达的组装的IgG。

定义

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。参见例如，Lackie,DictionaryofCellandMolecularBiology,Elsevier(第四版.2007)；Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborPress(ColdSpringsHarbor,NY1989)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons(Hoboken,NY1995)。术语“a”或“an”意指“一个或多个”。术语“包含(comprise)”和其变体(如“包含(comprises)”和“包括(comprising)”)，当其在所列举的步骤或元素之前时，意指其他步骤或元素的加入是任选的并且不被排除。与本文所描述的方法、装置和材料相似或等同的任何方法、装置和材料可被用于本发明的实践中。提供以下的定义以便于理解本文频繁使用的某些具体术语，并不意味着限制本公开的范围。

术语“活性氧化磷酸化系统”指在蛋白合成期间显示活性氧化磷酸化作用的细菌裂解物。例如，所述细菌裂解物可使用ATP合成酶和氧的还原产生ATP。应理解，本领域已知的其他翻译系统在蛋白合成期间也可使用活性氧化磷酸化作用。可通过使用具体的抑制剂(如电子传递链抑制剂)来抑制该途径以证明氧化磷酸化作用的激活。

术语“抗体”指这样的蛋白，其在功能上被定义为结合蛋白，且结构上被定义为包含被技术人员确认的源自产生抗体的动物的免疫球蛋白编码基因构架区的氨基酸序列。抗体可由基本上被免疫球蛋白基因或其片段所编码的一条或多条多肽组成。被确认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，其分别地依次定义免疫球蛋白类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知典型的免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对完全相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变的轻链(VL)”和“可变的重链(VH)”分别指这些轻链和重链。

抗体存在为完整的免疫球蛋白或存在为用不同的肽酶消化所产生的众多被良好表征的片段。因此，例如胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体而产生F(ab)'₂(Fab的二聚体，其自身为通过二硫键与VH-CH1连接的轻链)。在温和的条件下破坏铰链区中的二硫键可还原F(ab)'₂，从而将(Fab')₂二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上为具有部分铰链区的Fab(其他抗体片段的详细描述参见，FundamentalImmunology,W.E.Paul,ed.,RavenPress,N.Y.(1993))。虽然依据完整抗体的消化定义不同的抗体片段，但技术人员了解，这样的Fab'片段可用化学方法或通过利用重组DNA方法重新合成。因此，本文使用的术语“抗体”也包括通过完整抗体的修饰所产生的抗体片段或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段。抗体也包括单链抗体(以单条多肽链存在的抗体)，和单链Fv抗体(sFv或scFv)，在单链Fv抗体中可变的重链和可变的轻链被连接在一起(直接地或通过肽接头)以形成连续的多肽。单链Fv抗体为共价连接的VH-VL异源二聚体，其可表达自包含VH-和VL-编码序列的核酸，所述VH-和VL-编码序列被直接地连接或通过编码肽的接头连接(Huston等.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。虽然VH和VL彼此连接为单一多肽链，但VH和VL结构域以非共价连接。在丝状噬菌体的表面上所表达的首个功能性抗体分子为单链Fv's(scFv)；然而，替代性表达策略也成功了。例如，如果链中的一条(轻链或重链)与g3衣壳蛋白融合，且互补链导出至周质作为可溶的分子，那么可在噬菌体上展示Fab分子。可在相同或不同的复制子上编码两条链；重点是，各个Fab分子中的两条抗体链在翻译后组装，并且通过链中的一条与g3p的连接而将二聚体并入噬菌体颗粒(参见，例如美国专利第5733743号)。将自然地聚集但化学上分开的来自抗体V区的轻链和重链多肽链转变为折叠为与抗原结合位点结构基本类似的三维结构的分子的scFv抗体和众多其他结构是本领域技术人员已知的(参见，例如美国专利第5,091,513号、5,132,405号和4,956,778号)。抗体也包括已在噬菌体上展示的所有的抗体(例如，scFv、Fv、Fab和二硫键连接的Fv(Reiter等(1995)ProteinEng.8:1323-1331)。抗体也可包括双抗体(diantibodies)、微抗体(miniantibodies)和scFv-Fc融合体。

术语“源于细菌的无细胞提取物”指能够将DNA转录为mRNA和/或将mRNA翻译为多肽的体外反应混合物的制备物。所述混合物包括核糖体、ATP、氨基酸和tRNA。它们可直接地源自裂解的细菌、源自纯化的组分或两者的组合。

术语“细菌无细胞合成系统”指在包含生物提取物和/或指定试剂的反应混合物中的多肽体外合成。所述反应混合物将包含用于生成大分子的模板，例如DNA、mRNA等等；用于合成大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等等；以及用于合成所需的辅因子、酶和其他试剂，例如核糖体、不带电荷的tRNA、具有非天然氨基酸的带电荷的tRNA、聚合酶、转录因子、tRNA合成酶等等。

术语“生物学活性蛋白”指保留目标蛋白的至少部分生物学活性的蛋白。可通过将通过本文所描述的方法表达的目标蛋白的活性、功能和/或结构与参考目标蛋白的活性比较，测定所述生物学活性。例如，如果参考目标蛋白为IgG，那么生物学活性蛋白将包括正确折叠和组装的IgG分子。在某些实施方案中，参考蛋白可为通过不含有外源蛋白伴侣的细菌无细胞合成系统所表达的蛋白。也可使用适合于目标蛋白的体外或体内检测来测定生物学活性。目标蛋白的生物学活性可被表示为，每单位体积的无细胞蛋白合成反应混合物的生物学活性。在某些实施方案中，通过本文所描述的方法产生的蛋白的生物学活性为参考蛋白活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

术语“组成型启动子”指这样的核酸序列，在适当的条件下，其允许与启动子序列可操作地结合或连接的核酸序列或基因连续地转录。合适的条件包括转录因子和核糖核苷酸，所述转录因子如RNA聚合酶与启动子序列结合，所述核糖核苷酸被并入转录的RNA。组成型启动子通常为未经调节的启动子，因为它们在正常的细胞条件下促进连续的转录。

术语“二硫键异构酶”或“蛋白二硫键异构酶(PDI)”指包含多重结构域的蛋白家族，每个结构域具有典型的硫氧还蛋白(Trx)折叠。PDI分子具有包含CXXC基序的两个或更多个活性位点，所述CXXC基序为用于异构酶活性的位点。在体外，根据环境的氧化还原电位，PDI催化二硫键的氧化形成、还原或异构化。PDI为折叠催化剂类的成员，也被称为折叠酶(foldases)。折叠催化剂通过以下步骤促进折叠：使蛋白折叠过程中某个限速步骤加速，从而降低聚集的蛋白折叠中间物的浓度。除了催化二硫键形成的异构酶功能之外，PDI也促进多肽折叠为它们的天然构型，并且因此作为蛋白伴侣。PDI的C端区包含多肽结合区，并且据信其负责蛋白伴侣的活性。PDI的异构酶活性和伴侣活性为分开且独立的活性，并且这两种活性似乎为用于含有二硫键的还原蛋白和变性蛋白的再活化所必需的。

在革兰氏阴性菌中，通过Dsb(二硫键的形成)蛋白家族催化二硫键的形成、还原和异构化，所述Dsb蛋白家族包括DsbA、DsbB、DsbC和DsbD。DsbA通过转移其活性位点的二硫化物至靶蛋白来催化二硫键的氧化形成，其留下还原形式的DsbA。DsbB使DsbA重新氧化，并且将它的电子传递至呼吸链而使氧化的DsbB再生。DsbC催化二硫键的重新排列，并且被认为是真核PDI的对应物。通过DsbD将DsbC维持在其还原形式。DsbC为各23kDa亚基单体的同源二聚体，所述同源二聚体具有四个巯基，两个在活性位点-Cys⁹⁸-Gly-Tyr-Cys¹⁰¹(SEQIDNO：29)处，另外两个在Cys¹⁴¹和Cys¹⁶³处。与PDI类似，DsbC具有独立于其异构酶活性的蛋白伴侣活性(参见，例如，Chen等，J.Biol.Chem.274:19601-19605,1999和Kolag,O.,等,MicrobialcellFactories,2009,8:9)。各个单体由具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂折叠的N端二聚化结构域和具有硫氧还蛋白折叠的C端催化结构域组成(McCarthyA.A.等,Nat.Struct.Biol.7:196-199,2000)。其他Dsb蛋白包括DsbE和DsbG。

术语“外源蛋白伴侣”通常指不是由用来制备细菌提取物的细菌菌株正常地表达的蛋白伴侣(例如重组蛋白伴侣)，或由不存在于天然细菌菌株中的核酸构建体表达的重组蛋白伴侣。例如，如果用来制备细菌提取物的天然细菌菌株自然地表达低水平的内源性蛋白伴侣(例如，不足以改善生物学活性的目标蛋白的表达水平的水平)，那么可从非天然的核酸构建体表达外源蛋白伴侣，使得编码外源蛋白伴侣的核酸序列处在与编码蛋白伴侣的内源性序列不同的调控序列的控制下。例如，蛋白伴侣DsbC和FkpA为自然生成的大肠杆菌蛋白，但它们的表达水平低于使用本文所描述的ELISA分析来检测细菌提取物中蛋白的检测极限。因此，术语“外源的”与“异源的”是同义的，其指不是由用来制备细菌提取物的细菌菌株正常地表达的蛋白伴侣，或编码不存在于天然细菌菌株中的蛋白伴侣的核酸。在某些实施方案中，该术语指重组蛋白伴侣，其被加入至细菌无细胞提取物中，并且因此不是由用来制备所述提取物的细菌所表达的。

两个或更多个核酸或多肽序列的语境中的术语“同一的”、“基本上同一的”、“同一性百分比”，指在比较窗口或指定区域内比较且比对最大一致性时，使用分别在以下文献中所描述的BLAST和PSI-BLAST算法测定相同的或具有具体百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，指定区域内60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的两个或更多个序列或子序列：Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)和Altschul等(NucleicAcidsRes.,25:3389-3402,1997)。通过美国国家生物技术中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(参见网址ncbi.nlm.nih.gov)可公开地获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度W的短字来识别高得分序列对(HSP)，当短字与数据库序列中相同长度的字对齐时，其匹配或满足某些正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人，同上)。这些最初的相邻字匹配(hit)作为用于起始搜索的种子，以找到含有它们的更长HSP。字匹配沿着每条序列的两个方向延伸，远至累积的对比分数可被增加。使用参数M(给予一对匹配的残基奖励得分；总是>0)和N(给予错配残基处罚得分；总是<0)计算核苷酸序列的累积分数。对于氨基酸序列，使用记分矩阵计算累积分数。当出现以下情况时，中止字匹配在各个方向上的延伸：累积的比对分数从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分的残基比对的累积，累积的分数转向0或负数，或到达序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵作为默认值(参见HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919,1992)。

通过将比较窗口内两条最佳比对的序列比较，测定“序列同一性百分比”，其中与用于两条序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的部分多核苷酸或多肽序列包含添加或缺失(即，缺口)。通过以下计算百分比：测定在两条序列上均出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

本文使用的“比较窗口”包含涉及选自以下连续位置数中任一个的节段(segment)：从20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中，在最佳比对两条序列之后，可将序列与相同连续位置数的参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。

BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计分析(参见，例如，KarlinandAltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-87,1993)。BLAST算法所提供的一种相似性测定是最小求和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率指示。例如，如果将测试核酸与参考核酸比较的最小求和概率小于约0.2，通常小于约0.01，以及更通常小于约0.001，那么核酸被认为与参考序列相似。

当使用序列同一性百分比提及多肽时，公认的是一个或多个在其他方面不相同的残基位置可以是通过保守氨基酸替换而不同，其中，第一氨基酸残基被替换为具有相似化学特性(如相似的电荷、疏水性或亲水性质)的另一个氨基酸残基，并且因此不改变多肽的功能特性。当多肽序列因保守替换而不同时，可向上调整序列同一性的百分数以针对替换的保守性进行矫正。可使用公知的方法做出这样的调整，例如，将保守替换作为局部错配而不是完全错配来记分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如将相同的氨基酸记分为1，以及将非保守的替换记分为0，将保守的替换记分为0和1之间。可使用Pearson等人(Meth.Mol.Biol.24:307-331,1994)所描述的算法计算保守替换的得分。也可通过序列的简单目测和人工比对进行比对。

当使用术语“保守地修饰的变异”提及具体的多核苷酸序列时，指不同的多核苷酸序列或基本上相同的序列，所述不同的多核苷酸序列编码相同或基本上相同的(例如指定区域内至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)氨基酸序列，或者其中多核苷酸不编码氨基酸序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能相同的多核苷酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，通过密码子指定每一个位置上的精氨酸，在不改变编码多肽的情况下可将密码子改变为所描述的任何相应的密码子。这样的核苷酸序列变异为“沉默变异”，其可被认为是“保守地修饰的变异”的种类。同样应认识到，本文所公开的编码蛋白变体的每条多核苷酸序列也描述每种可能的沉默变异。还应认识到，可通过标准技术修饰多核苷酸中除了AUG(其通常仅为甲硫氨酸的密码子)和UUG(其通常仅为色氨酸的密码子)之外的每个密码子以产生功能上相同的分子。因此，本文暗含地描述了不改变编码的多肽序列的多核苷酸的各个沉默变异。

此外，应认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于10％，并且大体上小于1％)的单个替换、缺失或添加可被认为是保守地修饰的变异，只要该改变的结果是用化学上相似的氨基酸替换氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸替换是本领域公知的，其包括以下六组，其中每组含有被认为是用于彼此保守替换的氨基酸：

1)丙氨酸(Ala，A)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)；

2)天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)；

3)天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)；

4)精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)

5)异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、甲硫氨酸(Met，M)、缬氨酸(Val，V)；以及

6)苯丙氨酸(Phe，F)、酪氨酸(Tyr，Y)、色氨酸(Trp，W)。

如果氨基酸序列或核苷酸序列在给定的比较窗口内彼此之间或与参考序列之间共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，那么两条或更多条氨基酸序列或者两条或更多条核苷酸序列被认为是“基本上相同的”。如果两个或更多个蛋白将提供功能上相似氨基酸的保守氨基酸替换并入氨基酸序列，那么它们也被认为是基本上相似的。

术语“孵育条件在其他方面相同”指除了对照或参考提取物不含有或不表达外源蛋白伴侣，用于比较目的的实验条件是相同的。本术语也包括表达或含有一类外源蛋白伴侣(例如PDI)的对照提取物和表达或含有两种不同类的外源蛋白伴侣(例如PDI和PPIase)的提取物之间的比较。例如，可从表达或过表达一类蛋白伴侣(例如PDI或DsbC)的细菌菌株制备提取物，并且可将来自另一类蛋白伴侣(例如，纯化的PPIase如FkpA)的纯化蛋白加入至所述提取物。条件也可包括调整细菌提取物中外源蛋白伴侣的总浓度(例如，一类伴侣如PDI的总浓度，或两类不同的蛋白伴侣(如PDI和PPI)组合的总浓度)至相同。另外，细菌提取物的组分和编码目标蛋白的核酸是相同的。允许目标蛋白表达且正确折叠的示例性条件在本申请实施例中有描述。

术语“肽基脯氨酰异构酶”、“肽基脯氨酰顺反异构酶”和“脯氨酰基异构酶”(PPI或PPIase)可互换使用，并且其指被称为蛋白折叠催化剂的蛋白伴侣类。PPI催化氨基酸脯氨酸中的反式肽基脯氨酰基键转化为天然蛋白或功能蛋白中的顺式构型。PPI可拥有不同的亚基或具有不同功能的模块，例如，具有催化活性的模块和具有蛋白伴侣或蛋白结合活性的模块。PPI的三个家族已被确认：亲环素类(其异构酶活性被环孢菌素A抑制)；FKBP(结合FK506的蛋白)，其被FK506和雷帕霉素抑制；以及微小菌素(parvulin)。亲环素类的非限制性实例包括PpiA(RotA)。FKBP的非限制性实例包括FkpA、SlyD和触发因子(TF或tig)。微小菌素的非限制性实例包括SurA和PpiD。PPI的另外的实例包括CypA、PpiB、Cpr1、Cpr6和Fpr1。基于序列比对，FkpA、SlyD和触发因子是相关的。对于FkpA，蛋白伴侣活性和催化活性分别存在于N端和C端结构域(SaulF.A.,J.Mol.Biol.335:595-608,2004)。

术语“解聚酶(deaggregase)”指协助使例如在细菌无细胞翻译系统中产生的目标蛋白进行解聚和/或溶解的蛋白伴侣。这样的蛋白伴侣尤其在高浓度下是有益的，因为它们的作用机理是化学计量的而不是起催化作用的，并且据信是在新合成的蛋白折叠时通过使所述蛋白的疏水小片稳定来起作用。解聚酶的实例包括IbpA、IbpB和Skp。

术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文可互换使用，并且指氨基酸残基的聚合物(polymer)。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为对应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本文使用的该术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长的蛋白和截短的蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“正确折叠的蛋白”指具有生物学活性或功能的蛋白或多肽的天然构象。因此，该术语指具有在折叠状态拥有最少自由能的三级结构的蛋白或多肽。当使用所述术语提及细菌中表达的重组蛋白时，大体上指在胞质溶胶中过表达的可溶蛋白，使得正确折叠的重组蛋白不形成不溶解的聚集体(aggregate)和/或不被变性或展开。

术语“协同的”或“协同”可互换地指两种或更多种试剂的相互作用，使得它们的组合效果大于其各自效果的总和。协同的药物相互作用可使用中效原理来测定(参见，ChouandTalalay(1984)AdvEnzymeRegul22:27andSynergismandAntagonisminChem其他apy,ChouandRideout,eds.,1996,Academic,pp.61-102)，以及使用计算机程序Calcusyn通过联合指数来定量地测定(ChouandHayball,1996,Biosoft,Cambridge,MA)。也参见，ReynoldsandMaurer,Chapter14inMethodsinMolecularinMedicine,vol.110:Chemosensitivity,Vol.1:InvitroAssays,Blumenthal,ed.,2005,HumanaPress。用联合指数(CI)来定量协同、总和和拮抗，如以下所示：CI<1(协同)；CI＝1(总和)；CI>1(拮抗)。CI值0.7-0.9表明中度至轻度的协同。CI值0.3-0.7表明协同。CI值0.1-0.3表明强的协同。CI值<0.1表明非常强的协同。

发明详述

本文所描述的方法和系统可用于改善和/或增加无细胞合成系统(例如细菌的无细胞合成系统)中生物学活性蛋白的表达水平。通过使用细菌提取物来实现生物学活性的目标蛋白的表达水平增加，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有外源蛋白伴侣。可通过用于制备提取物的细菌来表达外源蛋白伴侣。发明人意外地发现，通过在用于制备提取物的细菌中表达相对大量的外源蛋白伴侣，通过无细胞合成系统表达了增加量的生物学活性的目标蛋白。因此，意外的是，提取物表达大量蛋白的能力没有被相对高浓度水平的蛋白伴侣负面地影响，使得在无细胞蛋白合成反应中所产生的正确折叠且生物学活性蛋白的总量大幅高于通过在不含有外源蛋白伴侣的无细胞合成系统中所表达的正确折叠且生物学活性蛋白的量。因此，虽然通过无细胞蛋白合成系统中所产生的目标蛋白的总量，与不表达外源伴侣的无细胞蛋白合成系统中所产生的蛋白总量基本上相同，但提取物中蛋白伴侣的浓度水平的增加导致正确折叠的组装且生物学活性的目标蛋白的量增加。发明人也意外地发现，通过表达两种不同类的蛋白伴侣(例如，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶)，获得了正确折叠的生物学活性蛋白表达水平的协同改善。现在将描述所述方法和系统。

为了产生生物学活性的目标蛋白，本文所描述的方法和系统使用具有活性氧化磷酸化系统的细菌提取物，以及用于无细胞蛋白合成所需的其他组分，如生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体。所述细菌提取物的组分在下文更详细地描述。在一个方面，从表达外源蛋白伴侣的重组细菌制备所述细菌提取物。在某些实施方案中，用来制备所述提取物的细菌以至少约1克(g)/升(L)的提取物浓度表达外源蛋白伴侣。例如，用来制备所述提取物的细菌，可表达以下提取物浓度的外源蛋白伴侣：至少约1g/升、2g/升、3g/升、4g/升、5g/升、6g/升、7g/升、8g/升、9g/升、10g/升或更多的提取物。在某些实施方案中，外源蛋白伴侣的总浓度为约1-20g/L的提取物、约1-15g/L的提取物、约1-10g/L的提取物、或约1-5g/L的提取物。在某些实施方案中，细菌表达以下细胞内浓度的外源蛋白伴侣：至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、或至少40mg/ml。在某些实施方案中，细菌表达以下范围的细胞内浓度的外源蛋白伴侣：约1mg/ml至约40mg/ml、约1mg/ml至约20mg/ml、约1mg/ml至约15mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml、或约1mg/ml至约5mg/ml。

外源蛋白伴侣可为导致正确折叠的和/或生物学功能的目标蛋白的产生增加的任何蛋白伴侣。如本文更详细地描述的，蛋白伴侣可为与目标靶蛋白相互作用以协助目标蛋白的正确折叠和/或防止其聚集为无功能聚集体的蛋白。虽然不受理论束缚，认为分子伴侣通过结合未折叠的、部分折叠的或错误折叠的多肽中暴露的疏水基团来防止聚集。因此，结合目标蛋白暴露的疏水基团并防止其聚集的任何蛋白伴侣，可被用于本文所描述的方法中。

外源蛋白伴侣也可为催化共价变化的酶，所述共价变化对目标蛋白形成天然和功能性构象是重要的。例如，在某些实施方案中，外源蛋白伴侣为蛋白二硫键异构酶(PDI)或肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)。PDI的实例包括但不限于：哺乳类PDI、酵母PDI或细菌PDI。在某些实施方案中，PDI为大肠杆菌的Dsb(二硫键的形成)家族的成员(例如DsbA或DsbC)。在一个实施方案中，外源蛋白伴侣为硫氧还蛋白(Trx)。PPI的实例包括但不限于：亲环素类(其异构酶活性被环孢菌素A抑制)；FKBPs(结合FK506的蛋白)，其被FK506和雷帕霉素抑制；和微小菌素。大肠杆菌中的PPIase的三个家族呈现有限的序列和结构相似性，但是它们对于非结构肽共享高的催化活性和相对低的亲和力。本领域技术人员理解，PDI和PPI蛋白伴侣可具有包括蛋白伴侣(蛋白结合)结构域和催化结构域的模块结构。参见，例如，Kolag,O.等,MicrobialcellFactories,2009,8:9；Wang,C-C.,MethodsinEnzymology,2002,348:66-75。可用于本文所描述的方法和系统中的其他蛋白伴侣被称为解聚酶，其包括例如Skp。

在另一个方面，本公开也提供了用于在细菌无细胞合成系统中使用包含PDI和PPIase的细菌提取物来表达正确折叠的生物学活性蛋白的方法和系统。所述方法包括制备细菌提取物，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的组分，如生物学功能tRNA、氨基酸、核糖体。细菌提取物还包括蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，其中蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶以足以改善(例如提高)正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在。在该实施方案中，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的表达，对正确折叠的生物学活性目标蛋白的表达提供协同的改善。例如，改善目标蛋白的表达至其浓度超过蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的一者但不是两者存在时的浓度，并且其中孵育条件在其他方面相同。在蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的表达对蛋白表达提供协同改善的实施方案中，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度为，至少约1gm/升(g/L)的提取物。例如，在某些实施方案中，所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度为：至少约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L或更多的提取物。在某些实施方案中，是蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度为：约1-20g/L的提取物，约1-15g/L的提取物，约1-14g/L的提取物，约1-10g/L的提取物、或约1-5g/L的提取物。在某些实施方案中，PDI选自Dsb家族蛋白，如DsbA、DsbC和DsbG，而PPI选自：FkpA、SlyD、tig、SurA和Cpr6。

本文所描述的细菌提取物，可从用编码二硫键异构酶和脯氨酰异构酶的基因共转化的细菌制备。用来制备所述提取物的细菌(例如，大肠杆菌)可从可操作地连接组成型启动子的基因表达外源蛋白伴侣。在某些实施方案中，所述外源蛋白伴侣为：DsbA、DsbC、FkpA、SlyD和/或Skp或其组合。在某些实施方案中，所述细菌提取物为来自大肠杆菌的S30提取物。

本文所描述的细菌无细胞合成系统可具有约20微升和500升之间的体积，并且孵育时间为持续约1小时至约36小时。例如，孵育时间可为约1-36小时、约1-24小时、约1-18小时、或约1-12小时。

为了产生目标蛋白，将细菌提取物与编码目标蛋白的核酸组合，以生成细菌无细胞合成系统。编码目标蛋白的核酸通常为DNA或mRNA。用于从核酸表达目标蛋白的方法在下文更详细地描述。在允许目标蛋白的表达和/或正确折叠的条件下，孵育细菌无细胞合成系统。在某些实施方案中，表达目标蛋白至浓度为：至少约100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1000mg/L或更高。用于表达目标蛋白的条件在下文更详细地描述。

在某些实施方案中，目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。在一个实施方案中，目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。目标蛋白也可为抗体或抗体片段。在某些实施方案中，目标蛋白被表示为具有本文所描述的伴侣蛋白的融合蛋白。

在另一个方面，本公开提供了用于改善大肠杆菌细胞培养物的活力和/或生长速率的方法。所述方法包括用可操作地连接组成型启动子的Dsb蛋白转化大肠杆菌细胞；以及在允许Dsb蛋白过表达的条件下，培养被转化的大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，以至少约1mg/ml的细胞内浓度表达Dsb蛋白。例如，在某些实施方案中，以约1mg/ml至约40mg/ml的细胞内浓度表达Dsb蛋白。

在某些实施方案中，蛋白伴侣可在N端或C端包含聚氨基酸标签，例如聚组氨酸(例如His₆；SEQIDNO：24)标签或聚(Ser-Arg)标签。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含带电荷的氨基酸。在某些实施方案中，带电荷的氨基酸为带正电荷的。在某些实施方案中，带电荷的氨基酸为带负电荷的。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含极性氨基酸。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含交替带电荷的和极性的氨基酸。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含Ser-Arg-Ser-Arg-Ser-Arg-Ser-Arg(SEQIDNO：25)。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys(SEQIDNO：26)。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQIDNO：27)。在某些实施方案中，聚氨基酸标签包含Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu(SEQIDNO：28)。虽然不受任何具体的理论或作用机理的束缚，据信C端标签增加蛋白伴侣的溶解性，其导致在由表达被标记的蛋白伴侣的细菌制备的提取物中蛋白伴侣的量增加。在某些实施方案中，聚氨基酸标签的存在导致所产生的目标蛋白的总量增加。在某些实施方案中，离心含有聚氨基酸标记的蛋白伴侣的活化提取物，将增加正确地组装的目标蛋白的量。

通用方法

除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。从业者特别针对Green,M.R.andSambrook,J.,编著,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第四版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2012)和Ausubel,F.M.,等.CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement99),JohnWiley&Sons,NewYork(2012)，为了本领域的定义和术语，将其通过引用并入本文。标准方法也出现在Bindereif,&Westhof(2005)HandbookofRNABiochemistry,Wiley-VCH,Weinheim,Germany，其描述了用于RNA操作和检测的详细方法，并且通过引用将其并入本文。用于产生重组核酸的合适分子技术的实例，以及足以指导技术人员进行某些克隆练习的说明参见文献：Green,M.R.,andSambrook,J.,(Id.)；Ausubel,F.M.,等.(Id.)；BergerandKimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology(Volume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.1987)；和PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,SanDiego,Calif.1990)，通过引用将其并入本文。

用于蛋白纯化、层析、电泳、离心和结晶的方法描述于：Coligan等(2000)CurrentProtocolsinProteinScience,Vol.1,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork。用于无细胞合成的方法描述于：Spirin&Swartz(2008)Cell-freeProteinSynthesis,Wiley-VCH,Weinheim,Germany。使用无细胞合成将非天然氨基酸并入蛋白的方法描述于：Shimizu等(2006)FEBSJournal,273,4133-4140。

PCR扩增方法是本领域公知的，并且描述于，例如，Innis等PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPressInc.SanDiego,Calif.,1990。扩增反应通常包括要待扩增的DNA、热稳定的DNA聚合酶、两对寡核苷酸引物、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、反应缓冲液和镁。通常，合适的热循环数目为1-25。用于引物设计和PCR条件优化的方法是本领域公知的，并且可在标准分子生物学文本中找到，如Ausubel等ShortProtocolsinMolecularBiology，第五版，Wiley，2002；和Innis等PCRProtocols，AcademicPress，1990。计算机程序可用于具有所需特异性和最佳扩增特性的引物设计(例如，OligoVersion5.0(NationalBiosciences))。在某些实施方案中，PCR引物还可包含限制性内切酶的识别位点，以促进将扩增的DNA片段插入载体的特异性限制酶位点。如果限制性位点被加入至PCR引物的5'端，优选包含几个(例如两个或三个)额外的5'碱基，以允许更有效的酶切。在某些实施方案中，PCR引物也可包含RNA聚合酶启动子位点(如T7或SP6)，以允许随后的体外转录。用于体外转录的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，VanGelder等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1663-1667,1990；Eberwine等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:3010-3014,1992)。

当通过名称提及本文所描述的蛋白时，应理解，该蛋白包括具有相似功能和相似氨基酸序列的蛋白。因此，本文所描述的蛋白包括野生型原型蛋白，以及同系物、多态变体和重组产生的突变蛋白。例如，名称“DsbC蛋白”包括来自大肠杆菌的野生型原型蛋白(例如SEQIDNO：1)、以及来自其他物种的同系物、多态变体和重组产生的突变蛋白。如果蛋白如DsbC和FkpA与野生型蛋白具有基本上相同的生物学活性或功能能力(例如，任一项的至少80％)，那么它们被定义为具有相似的功能。如果蛋白如DsbC和FkpA与原型蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，那么它们被定义为具有相似的氨基酸序列。使用BLASTP程序测定蛋白的序列同一性，默认为字长3、期望(E)10以及BLOSUM62得分矩阵(参见HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919,1992)。

通过与针对原型蛋白所产生的多克隆抗体特异性结合的常规测试，确定蛋白同系物、多态变体或重组的突变蛋白是否包括在本文所描述的蛋白伴侣内。例如，DsbC蛋白包括与针对原型蛋白SEQIDNO：1所产生的多克隆抗体结合的蛋白，以及FkpA蛋白包括与针对原型蛋白SEQIDNO：6所产生的多克隆抗体结合的蛋白。

关于本文所描述的蛋白伴侣与多克隆抗体的反应，在指定的免疫分析条件下，测试蛋白与至少两倍于背景的特异性抗体结合，并且特异性抗体基本上不大量结合样品中存在的其他蛋白。例如，可选择针对SEQIDNO：1编码的DsbC，其剪接变体或部分产生多克隆抗体，以便仅获得与DsbC而不与除DsbC多态变体外的其他蛋白发生特异性免疫反应的那些多克隆抗体。可通过排除与Dsb家族其他成员发生交叉反应的抗体来实现这种选择。多种免疫分析的模式可被用来选择与具体蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析被常规地用来选择与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)foradescriptionofimmunoassayformatsandconditionthatcanbeusedtodeterminespecificimmunoreactivity)。通常，特异性的或选择性的反应具有至少两倍的背景信号或噪音，并且更通常多于10-100倍背景。

应理解，本文所描述的伴侣蛋白中至少某些为具有相似功能和不同程度序列同源性的相关蛋白大家族的成员。因此，本文所描述的蛋白伴侣包括具有相似功能的家族成员的同系物，例如PDI和PPIases的同系物，Dsb蛋白的同系物，FkpA蛋白的同系物等等。因此，在某些实施方案中，蛋白伴侣可与本文所描述的蛋白伴侣具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。进一步，实施例中提供的数据显示，真核的PDI和细菌的DsbC在它们产生正确组装的IgG的能力方面为功能上可互换的，所述数据提供了本文所描述的蛋白伴侣的同系物可被用于本文所描述的方法和系统中的证据。

无细胞蛋白合成(CFPS)技术

为了表达本文所描述的生物学活性的目标蛋白，可使用无细胞蛋白合成系统。已开发了细胞提取物，其支持在体外合成反应期间由纯化的mRNA转录物或由转录自DNA的mRNA在体外合成蛋白。

反应混合物中多肽的CFPS包含细菌提取物和/或指定的试剂。反应混合物至少包含ATP或能量来源；用于产生大分子的模板，例如DNA、mRNA等等；氨基酸以及用于多肽合成所需的这类辅因子、酶和其他试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子、氨基酰合成酶、延伸因子、起始因子等等。在本发明的一个实施方案中，能量来源为自我平衡的能量来源。也包括催化从高能磷酸键再生ATP的酶，例如乙酸激酶、肌酸激酶等等。这样的酶可存在于用于翻译的提取物中，或可被加入至反应混合物。这样的合成反应系统为本领域公知的，并且已在文献中有描述。

本文使用的术语“反应混合物”指能够催化从核酸模板合成多肽的反应混合物。所述反应混合物包含来自细菌细胞的提取物，例如大肠杆菌S30提取物。S30提取物是本领域公知的，并且描述于例如，Lesley,S.A.,等(1991),J.Biol.Chem.266,2632–8。可在有氧或厌氧的条件下进行所述合成。

在某些实施方案中，干燥细菌提取物。被干燥的细菌提取物(110％的原始固体，其通过测定原材料的固体百分比而确定)，可在Milli-Q超纯水(例如反渗水)中复溶。在一个实施方案中，将精确称重的小份等分的干燥提取物(其代表10mL提取物的110％的原始固体)，加入至磁力搅拌器上具有搅拌条的玻璃烧杯中10mLMilli-Q超纯水中。搅拌得到的混合物，直到使粉末溶解。一旦溶解，除非立即使用，否则将所述材料转移至15mLFalcon管中，并且保存在-80℃。

反应混合物中的提取物的体积百分比将变化，其中所述提取物通常为至少约10％的总体积；更通常至少约20％；并且在某些实例中，当提供所述提取物为至少约50％；或至少约60％；并且通常不多于约75％的总体积时，其可提供另外的益处。

一般的系统包含编码目标蛋白的核酸模板。所述核酸模板为RNA分子(例如mRNA)或编码mRNA的核酸(例如RNA、DNA)，并且所述核酸为任何形式(例如线性的、环状的、超螺旋的、单链的、双链的等等)。核酸模板引导期望的蛋白的产生。

为了维持模板，可选择被用来产生提取物的细胞，以用于降低、大大的降低、或消除有害的酶的活性，或者用于具有修饰的活性的酶。具有修饰的核酸酶或磷酸酶活性的细菌细胞(例如具有至少一个突变的磷酸酶或核酸酶基因或其组合)，可被用于细胞提取物的合成以增加合成效率。例如，用来制备用于CFPS的S30提取物的大肠杆菌菌株可为RNaseE或RNaseA缺陷株(例如通过突变)。

也可改造CFPS系统以引导将可检测标记的氨基酸，或者非常规或非天然氨基酸并入期望的蛋白。氨基酸可为合成的或源自另一种生物来源。为了特异性目的，可将不同种类的非天然氨基酸(其包括但不限于可检测标记的氨基酸)加入至CFPS反应中，并且被有效地并入蛋白。参见，例如，Albayrak,C.andSwartz,JR.,Biochem.BiophysRes.Commun.,431(2):291-5；YangWC等.Biotechnol.Prog.(2012),28(2):413-20；Kuechenreuther等.PLoSOne,(2012),7(9):e45850；和SwartzJR.,AIChEJournal,58(1):5-13。

在一般的CFPS反应中，编码目标蛋白的基因在转录缓冲液中表达，其产生mRNA，所述mRNA在CFPS提取物和翻译缓冲液中被翻译为目标蛋白。可分别地加入转录缓冲液、无细胞提取物和翻译缓冲液，或者在它们被加入之前将这些溶液中的两种或更多种混合，或者将它们同时地加入。

为了在体外合成目标蛋白，在某些时候，CFPS提取物包含编码目标蛋白的mRNA分子。在某些CFPS系统中，在从天然来源纯化mRNA后，或在使用RNA聚合酶(如RNA聚合酶II、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA聚合酶III和/或源于噬菌体的RNA聚合酶)从克隆的DNA进行体外合成而制备mRNA后，将其外源地加入。在其他系统中，在体外从模板DNA产生mRNA；转录和翻译均发生于该类型的CFPS反应中。在某些实施方案中，转录和翻译系统是耦合的，或包含互补的转录和翻译系统，其在相同的反应中进行RNA和蛋白的合成。在这样的体外转录和翻译系统中，CFPS提取物含有在单个系统中进行转录(产生mRNA)和翻译(合成蛋白)所需的所有组分(外源的或内源的)。本文所描述的耦合的转录和翻译系统有时被称为开放的无细胞合成(OCFS)系统，并且能够实现高滴度的正确折叠的目标蛋白，例如高滴度的抗体表达。

无细胞蛋白合成反应混合物包含以下组分：模板核酸，如DNA或PCR片段，所述DNA包含可操作地连接至少一个启动子和任选地一个或多个其他调控序列的目标基因(例如，含有目标基因的克隆或表达载体)；RNA聚合酶，其识别目标基因可操作地连接的启动子(例如T7RNA聚合酶)，以及任选地，涉及模板核酸可操作地连接的任选的调控序列的一个或多个转录因子；核糖核苷三磷酸(rNTPs)；任选地，其他转录因子和因此的辅因子；核糖体；转运RNA(tRNA)；其他或任选的翻译因子(例如翻译起始、延伸和终止因子)和因此的辅因子；一种或多种能量来源(例如ATP、GTP)；任选地，一种或多种能量再生组分(例如PEP/丙酮酸激酶、AP/乙酸激酶或磷酸肌酸/肌酸激酶)；任选地，提高产量和/或效率的因子(例如核酸酶、核酸酶抑制剂、蛋白稳定剂、伴侣蛋白)和因此的辅因子；以及，任选地增溶剂。反应混合物还包含氨基酸和用于蛋白合成特异性地所需的其他材料，所述其他材料包括：盐(例如乙酸，谷氨酸或硫酸的钾、镁、铵和锰盐)，聚合物(例如聚乙二醇、右旋糖酐、二乙基氨乙基右旋糖酐、季铵乙基和氨乙基右旋糖酐等等)，环AMP，蛋白或核酸降解酶的抑制剂，蛋白合成的抑制剂或调节剂，氧化/还原调节剂(例如DTT、抗坏血酸、谷胱甘肽和/或它们的氧化物)，非变性表面活性剂(例如TritonX-100)，缓冲液组分，精胺，亚精胺，腐胺等等。CFPS反应的组分在以下文献中有更详细的讨论：美国专利第7,338,789号和7,351,563号，以及美国专利申请公布第2010/0184135号和第2010/0093024号，为了所有目的，通过引用将其各自的公开整体并入本文。

根据提取物中存在的特异性酶，例如，一种或多种许多已知的核酸酶，可选择聚合酶或磷酸酶抑制剂，并且其被有利地用来改善合成效率。

蛋白和核酸合成通常需要能量源。能量是用于起始转录以产生mRNA所必需的(例如，使用DNA模板并且用于翻译的起始时，使用例如GTP形式的高能磷酸)。通过核糖体一个密码子的各个随后步骤(三个核苷酸；一个氨基酸)需要将另外的GTP水解为GDP。ATP通常也是必需的。为了在蛋白合成期间使氨基酸聚合，ATP必须首先被激活。因此用于蛋白和/或核酸合成加工，需要来自高能磷酸键的相当数量的能量。

能量来源为化学底物，其可被酶促地作用以提供能量来实现期望的化学反应。通常使用的能量来源其允许通过断裂如存在于核苷三磷酸(例如ATP)中的高能磷酸键来释放能量用于合成。可转变为高能磷酸键的任何来源是特别适合的。通常，ATP、GTP以及其他三磷酸盐被认为是用于支持蛋白合成的等同的能量来源。

为了提供用于合成反应的能量，所述系统可包含添加的能量来源，如葡萄糖、丙酮酸盐、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、氨甲酰磷酸、乙酰磷酸、磷酸肌酸、磷酸丙酮酸、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸甘油酸盐和葡萄糖-6-磷酸，所述能量来源可形成或再生高能量的三磷酸盐化合物，如ATP、GTP、其他NTPs等等。

起初合成系统中不存在充足的能量时，优先地补充另外的能量来源。也可在体外合成反应期间加入或补充能量来源。

在某些实施方案中，使用PANOx-SP系统进行无细胞蛋白合成反应，所述PANOx-SP系统包含NTP、大肠杆菌tRNA、氨基酸、乙酸镁、谷氨酸镁、乙酸钾、谷氨酸钾、亚叶酸、TrispH8.2、DTT、丙酮酸激酶、T7RNA聚合酶、二硫键异构酶、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、NAD、CoA、草酸钠、腐胺、亚精胺和S30提取物。

在某些实施方案中，可合成含有非天然氨基酸(nnAA)的蛋白。在这样的实施方案中，反应混合物可包含非天然氨基酸，与20种天然生成的氨基酸正交的tRNA，以及可连接nnAA与正交tRNA的tRNA合成酶。参见，例如，美国专利申请公布第2010/0093024号。或者，反应混合物可包含结合tRNA的nnAA，其中自然地生成的tRNA合成酶被缺失。参见，例如，PCT公布第WO2010/081111号。

在某些实例中，无细胞合成反应不需要添加常规的二次能量来源，而使用氧化磷酸化和蛋白合成的共活化。在某些实例中，在反应系统如Cytomim(细胞质模拟)系统中进行CFPS。Cytomim系统被定义的反应条件为：具有优化的镁离子浓度且在聚乙二醇不存在下进行。该系统不累积磷酸，已知磷酸抑制蛋白合成。

可使用抑制剂测试活性氧化磷酸化途径的存在，所述抑制剂特异性地抑制所述途径中的步骤，如电子传递链抑制剂。氧化磷酸化途径的抑制剂实例包括毒素(如氰化物、一氧化碳、叠氮化物、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和2,4-二硝基苯酚)，抗体(如寡霉素)，杀虫剂(如鱼藤酮)，以及琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂(如丙二酸盐和草酰乙酸盐)。

在某些实施方案中，使用Cytomim系统进行无细胞蛋白合成反应，所述系统包含NTP、大肠杆菌tRNA、氨基酸、乙酸镁、谷氨酸镁、乙酸钾、谷氨酸钾、亚叶酸、TrispH8.2、DTT、丙酮酸激酶、T7RNA聚合酶、二硫键异构酶、丙酮酸钠、NAD、CoA、草酸钠、腐胺、亚精胺和S30提取物。在某些实施方案中，用于Cytomim系统的能量底物为丙酮酸盐、谷氨酸和/或葡萄糖。在所述系统的某些实施方案中，用核苷单磷酸(NMP)代替核苷三磷酸(NTP)。

可用碘乙酰胺处理细胞提取物以便使能减少二硫键且损害蛋白正确折叠的酶失活。本文进一步所述，也可用原核生物的二硫键异构酶(如，但不限于大肠杆菌DsbC和PDI)处理细胞提取物。可用DsbC、FkpAh和肽基脯氨酰异构酶处理细胞提取物。也可将二硫化谷胱甘肽(GSSG)和谷胱甘肽(GSH)以能促进蛋白正确折叠且防止形成异常二硫化蛋白的比例加入至提取物。

在某些实施方案中，CFPS反应包含倒转的膜囊泡以进行氧化磷酸化。如本文所述，这些囊泡可在细胞提取物制备过程的高压均质化步骤期间形成，并且保留在用于反应混合物的提取物中。

在用于CFPS反应之前，可使无细胞提取物解冻至室温。当合成具有二硫键的蛋白时，可将提取物与50μM碘乙酰胺孵育30分钟。在某些实施方案中，CFPS反应包含约30％(v/v)碘乙酰胺处理的提取物，以及约8mM谷氨酸镁，约10mM谷氨酸铵，约130mM谷氨酸钾，约35mM丙酮酸钠，约1.2mMAMP，约0.86mM的各GMP、UMP和CMP，约2mM氨基酸(约1mM的酪氨酸)，约4mM草酸钠，约0.5mM腐胺，约1.5mM亚精胺，约16.7mM磷酸钾，约100mMT7RNA聚合酶，约2-10μg/mL质粒DNA模板，约1-10μM大肠杆菌DsbC，以及总浓度约2mM的被氧化的谷胱甘肽(GSSG)。任选地，无细胞提取物可包含1mM还原的GSH。

无细胞合成反应条件可按本领域已知的分批、连续流动或半连续流动的方式进行。反应条件为可线性扩展的，例如，0.5L搅拌的釜反应器中0.3L规模，至10L发酵罐中4L规模，以及至200L发酵罐中100L规模。

Spirin等(1988)Science242：1162-1164研发的连续流动的体外蛋白合成系统证明了反应可被延长至多数小时。从那以后，许多课题组重现且改善了该系统(参见，例如，Kigawa等(1991)J.Biochem.110:166-168；Endo等(1992)J.Biotechnol.25:221-230)。Kim和Choi(Biotechnol.Prog.12:645-649,1996)报道了使用简单的透析膜反应器，通过采用“半连续操作”，可将分批和连续流动系统的优点组合。它们能够重现连续流动系统的延长的反应周期，同时维持常规的分批系统的起始速率。然而，连续的和半连续的方法均需要大量的昂贵试剂，所述试剂量增加的因子明显大于产物产量增加的因子。

已对常规的分批系统作出某些改进(Kim等(1996)Eur.J.Biochem.239:881-886；Kuldlicki等(1992)Anal.Biochem.206:389-393；Kawarasaki等(1995)Anal.Biochem.226:320-324)。尽管半连续的系统在延长的周期内维持蛋白合成的起始速率，但常规的分批系统依然提供一些优势，例如操作的方便性、容易扩大规模、较低的试剂费用和极好的再现性。同样，分批系统可以多路(multiplexed)模式很容易地实施，以同时地表达不同的遗传材料。

Patnaik和Swartz(Biotechniques24:862-868,1998)已报道了，通过反应条件的大量优化，可将蛋白合成的起始具体速率提高至与体内表达的速率相似的水平。值得注意的是，他们使用无任何冷凝步骤所制备的常规细胞提取物实现了如此高速率的蛋白合成(Nakano等(1996)J.Biotechnol.46:275-282；Kim等(1996)Eur.J.Biochem.239:881-886)。Kigawa等(1999)FEBSLett442:15-19报道了高水平的蛋白合成，他们使用冷凝的提取物且使用磷酸肌酸作为能量来源。这些结果暗示，分批系统的进一步改进，尤其是在蛋白合成反应的长效性方面，会大大增加分批的体外蛋白合成的生产率。然而，关于常规的分批系统中蛋白合成提早停止的原因依然不清楚。

本文所描述的蛋白合成反应可运用大规模的反应器，小规模的反应器，或可为多路反应(multiplexed)以同时进行多个合成。连续反应可使用加料机理引入试剂流，并且作为该过程的一部分可分离终产物。分批系统也是令人感兴趣的，其中可引入另外的试剂以延长活性合成的时间周期。反应器可以任何模式运行，如分批、扩展的分批、半分批、半连续的、补料-分批和连续的模式，并且可根据应用目的选择运行模式。

产生裂解物

本文所描述的方法和系统使用细胞裂解物用于体外翻译目标靶蛋白。为了简便，用作裂解物来源的生物体可被称为来源生物体或宿主细胞。宿主细胞可为细菌、酵母、哺乳动物或植物细胞，或能够合成蛋白的任何其他类型细胞。裂解物包含能够翻译编码期望的蛋白的信使核糖核酸(mRNA)的组分，以及任选地包含能够转录编码期望的蛋白的DNA的组分。这样的组分包括，例如DNA指导的RNA聚合酶(RNA聚合酶)，用于编码期望蛋白的DNA的转录起始所需的任何转录活化剂，转运核糖核酸(tRNAs)，氨酰基-tRNA合成酶，70S核糖体，N¹⁰-甲酰四氢叶酸，甲酰甲硫氨酸-tRNAf^Met合成酶，肽基转移酶，起始因子如IF-1、IF-2和IF-3，延伸因子如EF-Tu、EF-Ts和EF-G，释放因子如RF-1、RF-2和RF-3，等。

任何实施方案使用裂解物源自的细菌细胞。源自任何细菌菌株的细菌裂解物可被用于本发明的方法中。可按照以下获得细菌裂解物。在众多生长培养基的任一培养基中和本领域公知的且为了具体细菌生长专业人员很容易优化的生长条件下，培养所选择的细菌至对数期。例如，用于合成的自然环境利用源自在含葡萄糖和磷酸培养基上生长的细菌细胞的细胞裂解物，其中葡萄糖的存在浓度为至少约0.25％(重量/体积)，更通常至少约1％；以及通常不多于约4％，更通常不多于约2％。这样的培养基的实例为2YTPG培养基，然而本领域技术人员应了解，许多培养基可适合于该目的，因为存在许多适合用于细菌(如大肠杆菌)生长的公开培养基，所述公开培养基使用明确的和不明确的营养物来源。通过以下方法裂解过夜收集的细胞：将细胞小球悬浮在合适的细胞悬浮缓冲液中，并且通过超声处理破碎悬浮的细胞，在弗氏压碎器中破坏悬浮的细胞，连续流动的高压匀浆，或本领域已知的可用于高效细胞裂解的任何其他方法。然后将细胞裂解物离心或过滤，以去除大的DNA片段和细胞碎片。

用来制备细胞裂解物的细菌菌株通常具有降低的核酸酶和/或磷酸酶活性，以增加无细胞合成效率。例如，用来制备无细胞提取物的细菌菌株可在编码核酸酶RNaseE和RNaseA的基因上具有突变。所述菌株也可具有使细胞合成反应的组分稳定的突变，例如在基因如tnaA、speA、sdaA或gshA中的缺失，其分别防止在无细胞合成反应中氨基酸色氨酸、精氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的降解。此外，所述菌株可具有使无细胞合成的蛋白产物稳定的突变，如在蛋白酶ompT或lonP中的敲除。

目标蛋白

本文所描述的方法和系统用于增加正确折叠的生物学活性目标蛋白的表达。目标蛋白可为能够在细菌无细胞合成系统中表达的任何蛋白。非限制性实例包括具有二硫键的蛋白和具有至少两个脯氨酸残基的蛋白。目标蛋白可为例如抗体或其片段、治疗蛋白、生长因子、受体、细胞因子、酶、配体等等。目标蛋白的其他实例如下文所述。

具有二硫键的蛋白

本文所提供的方法可用于在生物活性构象中具有至少一个二硫键的任何蛋白。二硫键通过以共价的方式连接残基而将折叠单元锁定为稳定的构象，使蛋白的三级结构稳定。

在原核生物的细胞中，当DsbA蛋白将其二硫键提供至新合成的多肽时形成二硫键，所述新合成多肽在其天然结构中包含二硫键。整体的膜蛋白DsbB在自身内形成二硫键，然后所述二硫键被转移至DsbA。在某些真核生物细胞中，主要的二硫化物途径由膜相关的黄素蛋白EroI和可溶的硫氧还蛋白-样蛋白PDI构成。EroI，使用黄素辅因子通过氧介导其半胱氨酸对的再氧化，使其自身内形成二硫键，以及然后将所述键转移至PDI。依次地，PDI将二硫键直接地转移至还未采用其天然结构的新合成多肽。

二硫键存在于许多蛋白中，其包括但不限于：分泌蛋白、免疫蛋白、细胞外基质蛋白、糖蛋白、溶酶体蛋白和膜蛋白。二硫键和具有二硫键的蛋白的详细描述可在以下文献中找到：例如，Fass,D.Annu.Rev.Biophys.,2012,41:63-79，Sevier,C.S.andKaiser,C.A.Antioxidants&RedoxSignaling,2006,8(5):797-811和deMarco,A.,MicrobialCellFactories,2009,8:26。

具有脯氨酸的蛋白

本文所提供的方法可用于具有至少两个脯氨酸残基的任何蛋白。含有脯氨酸的蛋白通常有利于二级结构元件，如转角和聚脯氨酸螺旋。聚脯氨酸螺旋可为延长的、左手螺旋且扭转角和ψ＝+146°的肽骨架。相对高比例的脯氨酸可存在于蛋白中靠近跨膜螺旋的中心处。脯氨酸残基也可存在于β-转角和α-螺旋加帽的基序中，例如，在α-螺旋的末端或甚至来自所述末端的一个或两个残基处。脯氨酸也可经历对蛋白正确折叠重要的顺反异构化。

富含脯氨酸的蛋白包括具有重复性短的富含脯氨酸序列的蛋白，具有串联重复的富含脯氨酸序列的蛋白，具有非重复的富含脯氨酸区域的蛋白，和具有富含羟脯氨酸的蛋白。脯氨酸残基可存在于多种蛋白中，其包括但不限于：膜整合蛋白如转运蛋白、通道蛋白和受体蛋白、球状蛋白、荷尔蒙、神经肽、粘蛋白、免疫球蛋白以及细胞外基质蛋白。

已表明，富含脯氨酸的肽可提高和/或维持细胞中一氧化氮的产生，加强细胞中精氨琥珀酸合成酶的活性，增加细胞内钙离子的浓度，并且作为含有SH3、WW、EVH1或BHB结构域的蛋白的配体。含有脯氨酸的蛋白的详细描述，可在以下文献中找到：例如Williamson,M.Biochem.J.1994,297:249-260和Kay等FASEBJ.,14:231-241。

蛋白伴侣

为了改善生物学活性目标蛋白的表达，本方法和系统使用包含外源蛋白伴侣的细菌提取物。分子伴侣为协助其他大分子结构的非共价折叠或展开以及组装或拆解的蛋白。蛋白伴侣的一个主要功能是防止新合成的多肽链和组装的亚基聚集为无功能的结构。鉴定的首个蛋白伴侣核质蛋白，其协助从DNA和正确折叠的组蛋白组装核小体。这样的组装伴侣帮助折叠的亚基组装为低聚体结构。蛋白伴侣与最初蛋白的折叠有关因为它们从核糖体伸出、与细胞内蛋白的运输以及错误折叠的蛋白或变性蛋白的蛋白降解有关。虽然大多数新合成的蛋白能在蛋白伴侣不存在下折叠，但少数新合成的蛋白完全地需要它们。通常，蛋白伴侣的内部为疏水的，而表面结构为亲水的。虽然蛋白伴侣促进底物蛋白折叠的确切机理未知，但据认为，蛋白伴侣通过使部分折叠的结构和天然形式之间的活化障碍降低，加快期望的折叠步骤以确保正确的折叠。进一步，特异性蛋白伴侣展开错误折叠的蛋白或聚集的蛋白，并且通过相继的展开和重折叠回天然的生物学活性形式来拯救所述蛋白。

压缩可折叠底物的一个蛋白伴侣子集被称为伴侣素(chaperonin)(例如组I伴侣素GroEL/GroES复合物)。组II伴侣素，例如，认为TRiC(TCP-1环复合物，也被称为CCT，用于含有TCP-1的伴侣素)折叠细胞骨架蛋白肌动蛋白和微管蛋白，以及其他底物。伴侣素以堆积的双环结构为特点，并且存在于原核生物、真核生物的胞质溶胶以及在线粒体中。

其他类型的蛋白伴侣，涉及真核生物的线粒体和内质网(ER)的膜转运。细菌的易位特异性伴侣将新合成的前体多肽链维持在能够易位(通常为展开的)的状态中，并且将它们引导至通常被称为转运蛋白或转运通道的易位子上。原核生物和真核生物中类似的蛋白复合物最通常指，将具有靶信号序列的新生多肽从胞质溶胶运输至内质网(ER)的内部(池状的或内腔)空间，但其也被用来将新生蛋白整合进膜自身(膜蛋白)中。在内质网(ER)中，存在帮助折叠蛋白的普通蛋白伴侣(BiP、GRP94、GRP170)、凝集素(钙联接蛋白和钙网蛋白)和非典型的分子伴侣(HSP47和ERp29)。折叠的蛋白伴侣包括：蛋白二硫键异构酶(PDI、DsbA、DsbC)和肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI、FkpA、SlyD、TF)。

也将多数的蛋白伴侣归类为热激蛋白(Hsp)，因为它们在细胞应激(如热激)期间被高度地上调，并且通过升高温度或其他细胞应激使蛋白变性时，聚集的趋势增加。标记用于降解的蛋白的泛素也具有热激蛋白的特征。某些高度特异的‘立体蛋白伴侣’将独特的结构构象(立体的)信息传达至蛋白上，所述蛋白不能被自发地折叠。蛋白伴侣的其他功能包括协助蛋白降解、细菌的粘附活性，以及对与蛋白聚集有关的朊病毒疾病的应答。

被称为折叠酶的酶，催化用于合成的蛋白的天然和功能构象形成所必需的共价变化。折叠酶的实例包括蛋白二硫键异构酶(PDI)和肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)，所述PDI用来催化天然二硫键的形成，所述PPI用来催化将稳定的反式肽基脯氨酰基键异构化为用于蛋白的功能折叠所需的顺式构型。天然二硫键的形成和脯氨酰亚胺键的顺反异构化均为共价反应，并且其常常为蛋白折叠过程中的限速步骤。最近被提议为蛋白伴侣，在化学计量的浓度中，折叠酶增加某些变性蛋白的再活化产量。蛋白伴侣的其他实例包括解聚酶如Skp，以及氧化还原蛋白Trr1和Glr1。

在某些实施方案中，蛋白伴侣可与另一个蛋白共表达，所述另一个蛋白的作用为增加期望的蛋白伴侣的活性。例如Dsb蛋白DsbA和DsbC可与DsbB和DsbD共表达，其分别氧化和还原DsbA及DsbC。

用编码蛋白伴侣的基因的转化细菌

用于本文所描述的方法和系统的细菌提取物含有外源蛋白伴侣。可将本文所描述的外源蛋白伴侣加入至提取物中，或所述外源蛋白伴侣可被用来制备无细胞提取物的细菌表达。在后者的实施方案中，可从编码外源蛋白伴侣的基因表达外源蛋白伴侣，所述编码外源蛋白伴侣的基因与起始基因转录的启动子可操作地连接。

可用于本发明的启动子包括组成型启动子和调控型(可诱导的)启动子。启动子可为原核生物的或真核生物的，其取决于宿主。用于本发明实践中的原核生物(包括噬菌体)启动子为：lac、T3、T7、λPr'P1'和trp启动子。用于本发明实践中的真核生物(其包括病毒)启动子为：普遍存在的启动子(例如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、微管蛋白)，中间丝启动子(例如结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP)，治疗基因启动子(例如MDR类型、CFTR、VIII因子)，组织特异性启动子(例如平滑肌细胞中的肌动蛋白启动子)，应答刺激的启动子(例如类固醇激素受体、维甲酸受体)，四环素调控的转录调节剂，即刻早期巨细胞病毒，逆转录病毒LTR，金属硫蛋白，SV-40，E1a和MLP启动子。WO96/01313、美国专利第5,168,062号和5,385,839号中描述四环素调控的转录调节剂和CMV启动子，通过引用将其全部的公开并入本文。

在某些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。细菌中组成型启动子的实例包括spc核糖体蛋白操纵子启动子P_spc、质粒pBR322的β-内酰胺酶基因启动子P_bla、噬菌体λ的P_L启动子、质粒pBR322的复制控制启动子P_RNAI和P_RNAII、rrnB核糖体RNA操纵子的P1和P2启动子、tet启动子以及pACYC启动子。

定量的测定目标蛋白和蛋白伴侣

可使用本领域已知的任何方法测定通过本文所述的方法和系统所产生的目标蛋白的量。例如，可使用凝胶电泳(例如PAGE)、Western分析或毛细管电泳(例如CaliperLabChip)来纯化和定量所表达的目标蛋白。可通过并入放射性标记氨基酸来监测无细胞翻译反应中的蛋白合成，通常用³⁵S-标记的甲硫氨酸或¹⁴C-标记的亮氨酸。可通过电泳后的放射自显影来显现放射性标记蛋白的分子大小并且将其定量，或者通过免疫沉淀来分离放射性标记蛋白。重组的His标签的并入，通过Ni²⁺亲和柱层析提供了另一种纯化手段。以可溶的蛋白产量或通过使用酶促或结合活性的检测来测定表达系统的蛋白产生。

可通过以下方法定量被加入至无细胞合成系统的蛋白伴侣的量：在用来制备细菌提取物的细菌细胞培养物中加入放射性氨基酸如¹⁴C-亮氨酸，并且通过例如使用三氯乙酸(TCA)使放射性蛋白沉淀并测定回收的放射性总量以定量表达的蛋白伴侣的量。也可用免疫方法测定蛋白伴侣的量，例如，通过ELISA，其中针对蛋白伴侣的单克隆或多克隆抗体被用来检测和定量固定在板上或Western印迹上的伴侣蛋白。

定量测定表达蛋白的生物学活性和正确折叠

可使用特异性用于目标蛋白的体外或体内检测，来定量通过本文所描述的方法产生的目标蛋白的生物学活性。目标蛋白的生物学活性可被表示为每单位体积无细胞蛋白合成反应混合物的生物学活性。通过将所产生的总蛋白的量与可溶蛋白的量比较，可定量表达的目标蛋白的正确折叠。例如，可通过用放射性标记的氨基酸(如¹⁴C-亮氨酸)放射性地标记目标蛋白，并且用TCA使标记的蛋白沉淀，测定蛋白和所产生蛋白的可溶部分(fraction)的总量。可通过在还原和非还原条件下进行凝胶电泳(PAGE)以测定以正确分子量迁移的可溶蛋白部分，来确定折叠和组装的蛋白的量。在非还原条件下，蛋白聚集体可被捕获在凝胶基质上，或可迁移为高分子量的污点，所述污点难以表征为离散的实体；然而在还原的条件下，并且当加热样品时，含有二硫键的蛋白被变性，聚集体被离解，并且表达的蛋白迁移为单个条带。用于测定正确折叠和组装的抗体蛋白的量的方法如实施例所述。可使用免疫分析例如ELISA来确定抗体分子的功能活性。

实施例

实施例1

该实施例表明，通过细菌的无细胞蛋白合成系统所表达的伴侣蛋白，能增加通过无细胞蛋白合成系统所表达的正确地组装的IgG的量，并且细菌PDI和PPI的组合协同地作用以增加正确地组装的IgG的量。

改造细菌内质网以用于免疫球蛋白的快速表达。

材料和方法：

小规模的无细胞表达。VWR恒温混合仪上以650rpm，在10μg/mLDNA(表达载体pYD317中，2.5μg/mL曲妥珠单抗轻链DNA，7.5μg/mL曲妥珠单抗重链DNA)存在下的96-孔微量滴定板中，于30℃运行100μl无细胞蛋白合成反应12小时。室温(20℃)下，用50μM碘乙酰胺处理无细胞提取物30分钟，并且将其加入至预混的组分中。除非另有指示，蛋白合成反应的终浓度为30％细胞提取物(v/v)，2mMGSSG，8mM谷氨酸镁，10mM谷氨酸铵，130mM谷氨酸钾，35mM丙酮酸钠，1.2mMAMP，0.86mM的各GMP、UMP和CMP，2mM氨基酸(除了1mM酪氨酸和苯丙氨酸)，4mM草酸钠，1mM腐胺，1.5mM亚精胺，15mM磷酸钾，20μg/mLT7RNAP。

PDI和DsbC的可交换性。在不同浓度的PDI和DsbC下运行无细胞蛋白合成反应，以了解二硫键异构酶对IgG折叠和组装的需求。将0-5μM重组PDI与0-13μM重组DsbC结合，加入至无细胞反应中。VWR恒温混合仪中以650rpm，用30％对照提取物在8μg/mLHC-HIS6DNA和2μg/mLLCDNA存在下的96-孔微量滴定板中，于30℃运行100μl无细胞反应12小时。随后将所述反应物以5000xg离心10分钟，并且用PBS将上清液稀释2倍，然后使用Biomekrobotic系统在IMACPhytips(200μltip，5μl树脂层)上纯化。用20mMTrispH8，300mMNaCl，500mM咪唑洗脱样品，并且使用毛细管电泳在CaliperLapChipGXII上定量所洗脱的IgG。

蛋白伴侣的连续表达筛选。将候选的蛋白伴侣克隆进无细胞表达质粒pYD317内。从这些质粒产生PCR片段，所述PCR片段含有夹在T7启动子和终止子序列之间的蛋白伴侣基因。随后在标准微量滴定板条件下，于30℃通过无细胞蛋白合成从这些PCR片段表达蛋白伴侣16个小时。为了抵抗DNA的降解使PCR片段稳定，将40μg/mLGamS蛋白加入至反应中。随后将表达蛋白伴侣的提取物在5000xg下离心10分钟，并且将含有蛋白伴侣的上清液以20％(v/v)的比例加入新的无细胞反应中，用于在¹⁴C-亮氨酸存在下表达IgG(8μg/mL曲妥珠单抗重链DNA和2μg/mL曲妥珠单抗轻链DNA)。如之前所述(MAbs.2012Mar1；4(2))，基于¹⁴C-亮氨酸并入IgG分子的比率计算IgG滴度。涉及蛋白伴侣的IgG滴度改善被表示为，相对于加入表达GFP的提取物的改善倍数。为了估计被加入至IgG表达反应中的蛋白伴侣的量，也在¹⁴C-亮氨酸存在下运行蛋白伴侣无细胞反应，并且定量表达的蛋白。

2xDsbC和2xFkpA提取物。制备细菌基因DsbC(2xDsbC)和FkpA(2xFkpA)在组成型启动子(pACYC)之后的双顺反子质粒，并且将其转化进细菌。如YangW.C.等.Biotechnol.Prog.(2012),28(2):413-20所述，将这些菌株培养至对数期，并且将其裂解用于制备无细胞提取物。将FkpA蛋白加入至含有2xDsbC提取物的IgG无细胞反应中，以测试FkpA是否进一步改善IgG折叠和组装。通过将13μMDsbC蛋白加入至具有2xFkpA提取物的无细胞反应进行该反向实验。

结果：

PDI和DsbC的可互换性。为了更好地了解IgG折叠和组装对真核的和细菌的二硫键异构酶的依赖性，在不同浓度的PDI和DsbC下运行IgG无细胞蛋白合成反应。在存在0-5μMPDI与0-13μMDsbC组合的无细胞反应中表达IgG。将表达的IgG-His通过Ni⁺⁺树脂纯化并且通过毛细管电泳定量(图1)。不存在DsbC时，IgG高度地依赖用于折叠的PDI(图1，实心的圆圈)。然而，当反应中DsbC的浓度增加时，对PDI的依赖性下降，使得在6.4μMDsbC下所述反应中不存在归因于PDI的额外益处(图1，空心的三角)。而且，通过增加反应中DsbC的浓度，我们发现IgG滴度的显著改善超过我们之前所观察到的(图1，空心的圆圈)。在效果方面，我们观察到用相似功能的细菌蛋白伴侣代替真核二硫键异构酶在真核蛋白折叠方面的有效性。

蛋白伴侣的连续表达筛选。在体内，已知真核的蛋白伴侣对IgG的折叠和组装发挥重要的作用。因此，IgG分子在缺乏这些生理折叠酶的细菌系统中的表达是具有挑战性的(REFS)。同样地，我们实施筛选方法以鉴定应为IgG折叠和/或组装的积极效应物的蛋白伴侣。在我们的无细胞系统中表达候选的蛋白伴侣，并且随后将所述表达的蛋白伴侣加入新的无细胞反应中用于IgG的表达。IgG折叠的任何改善被表示为，相对于加入表达GFP(不太可能与IgG相互作用的蛋白)的对照提取物的滴度改善。为了改善筛选的处理量，在蛋白伴侣被加入至IgG反应之前，不将其从提取物纯化。为此，我们想要确保蛋白伴侣DNA在随后的IgG反应中不被转录和表达。同样地，从比质粒DNA明显更不稳定的PCR模板表达蛋白伴侣。加入GamS蛋白帮助保护PCR模板，使得能够合成足够水平的伴侣蛋白。

考虑到它们在体内折叠IgG的作用，蛋白伴侣的一些家族尤其令人关注。测试来自细菌、酵母和人的PPIases、折叠酶、解聚酶和氧化还原蛋白。在氧化还原蛋白伴侣当中，我们发现PDI(酵母同系物)和DsbC显著地协助IgG的形成，与我们之前的发现一致(图2B)。有趣的是，人PDI(hPDI)不显著地影响IgG的折叠，可能是由于其在细胞提取物中表达很弱，所述细胞提取物不允许加入足够量的人PDI来协助IgG折叠。相反，细菌蛋白DsbC在提取物中很好地表达，其允许加入～5uMDsbC至IgG反应(表达～25μMDsbC，并且将其以20％的比例加入至IgG反应)。所测试的PPIases中，证明一些PPIases有益于IgG的表达(图2B)。从这些结果，我们决定继续研究Skp、SlyD和FkpA。

纯化的Skp、SlyD和FkpA可改善IgG滴度。为了证实来自蛋白伴侣筛选的匹配记录(hit)，我们表达并纯化Skp、SlyD和FkpA，并且将它们加回至IgG无细胞蛋白合成反应(图3)。对于蛋白伴侣Skp，我们看出Skp有助于HC和LC的溶解性，但不显著增加组装的IgG的量。然而，对于脯氨酰异构酶SlyD和FkpA，我们观察到，加入这些蛋白伴侣越多，可溶蛋白和组装的IgG的量成比例地增加。我们推断出，脯氨酰基异构化是之前限制无细胞蛋白合成系统中IgG形成的功能，而这些外源蛋白的加入极大地改善了IgG折叠和组装。由于用DsbC和FkpA观察到的巨大改善，我们决定进一步表征它们在IgG折叠中的作用。

FkpA和DsbC协同地作用以折叠和组装IgG。为了更好地了解FkpA和DsbC在IgG形成中发挥的作用，我们独立地评估它们对IgG折叠的贡献(图4)。有趣的是，FkpA的加入显著地降低了在HC和LC合成期间形成的较高分子量聚集体的程度。增加FkpA的量，我们也观察到IgG的形成，以及许多部分组装的产物。这些蛋白迁移为模糊的条带，其暗示它们可能代表混合群体的二硫键交联键合的蛋白。另一方面，DsbC的加入产生了IgG的清楚明显的条带。然而，无FkpA时，显著比例的表达蛋白形成了较高阶的聚集体，其不能完全地进入SDS-PAGE凝胶。

将两种蛋白伴侣组合进相同的IgG反应中时，它们协同地作用以折叠IgG(图5)。在含有DsbC的提取物(2xDsbC)中表达HC和LC，且加入不同量的外源FkpA蛋白。在50μMFkpA下，可表达大约900μg/mL的组装IgG。为了继续研究，改造过表达FkpA的菌株，从所述过表达FkpA的菌株制备细胞提取物。从加入有外源DsbC蛋白的FkpA提取物合成IgG(图6)。在30％提取物(v/v)的标准条件下以～600μg/mL制备具有降低的聚集作用的IgG。为进一步增加各个反应中FkpA的浓度，我们滴定反应中含有FkpA的提取物以使IgG滴度至>900μg/mL(图6)。

以上实施例表明，两种不同种类的蛋白伴侣PDI和PPI的组合，对无细胞表达系统中蛋白的正确折叠和组装提供协同效果。

实施例2

该实施例表明，用来制备细胞提取物的细菌菌株中外源蛋白伴侣的过表达，不抑制目标蛋白如GMCSF的产生。

菌株的描述：

SBDG028：SBJY001+pACYC2xDsbC+ΔRF1

SBDG031：SBJY001+pACYC2xDsbC

SBDG044：SBJY001+pACYC2xFkpA

SBDG049：SBJY001+pACYC2xFkpA-6xHis

细胞提取物的制备：

基本上如以下文献所述制备来自大肠杆菌菌株SBDG028、SBDG031、SBDG044和SBDG049的提取物：Zawada等,BiotechnologyandBioengineeringVol.108,No.7,2011年7月。

GMCSFCFPS反应

如以下文献所述进行用于GMCSF蛋白产生的无细胞反应步骤：Zawada等BiotechnologyandBioengineeringVol.108,No.7,2011年7月，通过引用将其整体并入本文。

图7显示在来自过表达DsbC或FkpA的所示细菌的提取物中，通过CFPS所产生的GMCSF蛋白的量。在来自不表达外源DsbC或FkpA的细菌的对照提取物中，产生非常少的GMCSF(数据未显示)。

实施例3

该实施例表明，过表达蛋白伴侣的细菌细胞与不过表达蛋白伴侣的细菌具有相似的生长速率。

方法：如实施例1所述，用表达一个(1X)或两个(2X)拷贝的DsbC和FkpA的重组质粒转化细菌菌株。将这些菌株培养至对数期，其被裂解用于制备无细胞提取物。测定菌株的生长速率(倍增时间)，使用Western分析和/或ELISA来定量通过细菌菌株所产生的蛋白伴侣的量。

为了测定所表达的蛋白伴侣的细胞内浓度，使用渗透压冲击法来裂解摇瓶中生长的细胞的周质。通过具有已知DsbC浓度标准物的凝胶电泳分离周质裂解物。光密度测定法被用来比较标准DsbC条带的强度与周质裂解物条带的强度。条带的强度被用来测定裂解物中DsbC浓度，其被用来反算细胞中DsbC的浓度。

通过ELISA测定无细胞提取物中伴侣蛋白的量。测定无细胞提取物中DsbC和FkpA滴度的ELISA为直接ELISA模式。检测由以下步骤组成：用标准物和样品包被检测板，然后允许识别DsbC或FkpA的抗体进行结合，冲洗掉过量的DsbC和FkpA抗体，引入抗-兔IgG的偶联HRP的二抗(在兔中制备DsbC和FkpA抗体)，冲洗掉过量的偶联二抗，然后使用ABTS底物检测存在于偶联二抗上的HRP。已知浓度的纯化DsbC和FkpA被用来创建7个点的标准曲线以用于样品浓度的测定。

DsbC：MSD(最小样品稀释)：1/120,000；MSD下的LLOQ(定量下限)：187.5μg/ml。

FkpA：MSD(最小样品稀释)：1/75,000；MSD下的LLOQ(定量下限)：390μg/ml

结果：

图8显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率，所述转化有质粒的菌株在组成型启动子的控制下表达1X或2X拷贝的DsbC。表达1X和2X拷贝DsbC的菌株的生长速率与未用表达质粒转化的对照菌株相似。图8的下图显示存在于如上所述的周质裂解物中的DsbC蛋白的量。

图9显示通过过表达1X或2X拷贝DsbC的菌株所产生的DsbC蛋白的量。上图显示如上所述测定的细胞内浓度。下图显示通过ELISA测定的提取物浓度。

图10显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率，所述转化有质粒的细菌菌株在组成型启动子的控制下表达1X或2X拷贝的FkpA。表达1X和2X拷贝FkpA的菌株的生长速率与未用表达质粒转化的对照菌株相似。图10的下面左图显示存在于由细菌制备的总提取物中FkpA蛋白的量，所述细菌表达1X和2X拷贝FkpA。图11显示来自表达1X和2X拷贝FkpA的细菌的提取物中FkpA浓度的定量。

示例性ELISA实验的结果如下表所示。关于FkpA的ELISA数据为来自与图9所示的提取制备物不同的提取制备物，其具有不同的DsbC浓度。

表1：通过ELISA所测定的提取物中DsbC浓度。

表2：通过ELISA所测定的提取物中FkpA浓度。

该实施例表明，过表达蛋白伴侣的重组细菌菌株能够快速生长，并且可用于制备无细胞蛋白合成的高质量提取物。

实施例4

该实施例显示，蛋白伴侣FkpA的C端上含有多电荷的氨基酸标签能增加提取物中FkpA的量，并且增加通过无细胞蛋白合成系统所产生的总蛋白的量。

克隆编码FkpA的基因，在载体pACYC-Pc中C端具有His₆(SEQIDNO：24)或(Ser-Arg)₄(SEQIDNO：25)标签。如上所述，将这些载体转化进菌株SBJY001，并且制备提取物。FkpA的ELISA显示，通过活化的提取物的最终离心旋转增加了提取物中His标记的FkpA变体的水平(图12a)。与含有wtFkpA的提取物相比，含有这些标记溶解性的FkpA蛋白的提取物产生了更多的总蛋白。此外，通过活化的提取物的最终旋转提高了组装的IgG水平(图12b)。

该实施例表明，在FkpA的C端加入多电荷的氨基酸标签，增加了通过用来制备提取物的细菌所表达FkpA的量，并且增加所产生的总蛋白的量。进一步，对于含有C端His-标记的FkpA的提取物，活化后使提取物向下旋转导致正确组装的IgG的量的增加。

实施例5

该实施例表明，两种独立的细菌菌株中的蛋白伴侣DsbC和FkpA的基因组整合导致具有高生长速率的细胞，其产生高的蛋白伴侣水平，并且源自这些菌株的无细胞提取物含有高水平的这两种蛋白伴侣，以及支持高水平的重组IgG和GMC-SF的无细胞合成。

菌株108

菌株SBDG108为SBMT095的衍生株。该菌株使用同源重组制备，将2拷贝的dsbC整合进染色体上的中等强度组成型启动子后的galK基因座。使SBMT095处于感受态，并且然后用pACYC-Pc0-2xFkpA(中等拷贝质粒，在组成型启动子后具有2拷贝的FkpA)转化。两个拷贝均编码野生型大肠杆菌FkpA，但是合成了一个基因以降低与WT基因的核苷酸同源性，使彼此能够在相同的质粒中被稳定地扩增。

使用DM80-80在分批模式的标准提取物发酵中，菌株SBDG108能够实现高的生长速率，同时仍然产生非常高的蛋白伴侣水平(参见表3)。

表3：提取物发酵中菌株108的特性。

细胞内DsbC滴度	4.1mg/ml
		细胞内FkpA滴度	13.9mg/ml
具体的生长速率	0.49/h

由菌株108制备的提取物含有高水平的两种蛋白伴侣，并且支持非常高水平的重组IgG和其他蛋白的无细胞合成(参见表4)。

表4：无细胞蛋白滴度

GMC-SF	0.44mg/ml
		曲妥珠单抗	1.1mg/ml

菌株150

菌株SBMT150为SBHS016的衍生株，具有ompT敏感性RF1的KGK10衍生株。为了产生SBMT150，将2拷贝的DsbC整合进染色体上的xylA基因座。将两拷贝的FkpA整合进galK基因座。用同源重组引入这两种染色体整合。

使用DM80-80在分批模式的标准提取物发酵中，菌株SBMT150能够实现高的生长速率，同时仍然产生高的蛋白伴侣水平(参见表5)。因为蛋白伴侣从所述基因组过表达，所以该菌株的发酵期间不需要抗生素。

表5：提取物发酵中菌株150的特性

细胞内DsbC滴度	2.5mg/ml
		细胞内FkpA滴度	3.4mg/ml
具体的生长速率	.071/h

由菌株108制备的提取物含有高水平的两种蛋白伴侣，并且支持重组IgG和其他蛋白高水平的无细胞合成，如下面的表6所示。

表6：无细胞蛋白滴度

GMC-SF	0.46mg/ml
		曲妥珠单抗	0.49mg/ml

总之，该实施例表明，可改造细菌菌株以稳定地并入蛋白伴侣表达盒，所述菌株在不损害生长速率的情况下表达高水平的伴侣蛋白，并且源自这些菌株的无细胞提取物产生高水平的重组目标蛋白。

实施例6

该实施例显示，源自过表达DsbC和FkpA蛋白伴侣的细菌细胞的提取物，可改善多种不同IgG的表达和组装。

方法：

2xDsbC和2xFkpA提取物。用基于pACYC的蛋白伴侣过表达质粒转化大肠杆菌菌株SBJY001(YinG,等,Aglycosylatedantibodiesandantibodyfragmentsproducedinascalableinvitrotranscription-translationsystem.mAbs2012；4)，并且在对数期收集所述菌株以制备细胞提取物。制备在大肠杆菌启动子Mt-cons-10之后携带一拷贝dsbC(1xDsbC)或两串联拷贝dsbC(2xDsbC)的质粒，并将其转化进细菌(ThouvenotB等.ThestrongefficiencyoftheEscherichiacoligapAP1promoterdependsonacomplexcombinationoffunctionaldeterminants.BiochemJ2004；383:371–82)，同样如此的是一拷贝fkpA(1xFkpA)或两拷贝fkpA(2xFkpA)。如以下文献所述，将这些菌株培养至对数期，并且将其裂解以制备无细胞提取物：ZawadaJ.F等.Microscaletomanufacturingscale-upofcell-freecytokineproduction--anewapproachforshorteningproteinproductiondevelopmenttimelines.BiotechnolBioeng2011；108:1570–8。单独或与外源加入的纯化蛋白结合，测试各提取物中产生IgG的活性。进一步修饰用于OCFS提取物所优化的细菌菌株SBHS016(源自菌株SBJY001)，以提高DsbC蛋白的产生。该菌株具有整合进细菌galK基因座的双重串联拷贝的dsbC，使用修饰的MT-cons-10启动子将其组成性地表达(ThouvenotB.等BiochemJ2004；383:371–82)。该双重串联拷贝的dsbC是除正常dsbC基因座上野生型基因之外的基因。该双重串联的基因盒含有一拷贝亲本dsbC基因，以及一拷贝被设计用于编码野生型蛋白的合成版dsbC基因，但是具有改变的密码子以抑制与基因组别处的其他版dsbC基因进行不想要的序列重组。用2xFkpA质粒转化该过表达DsbC菌株，以产生菌株‘2xD+2xF’。

结果：

在本文所描述的细菌体外转录/翻译系统中翻译一组不同的IgG。在对照提取物(SBJY001)、DsbC提取物(2xDsbC提取物)和DsbC+FkpA提取物(2xD+2xF)中翻译IgG。除与轻链Vk3-20结合的两种生殖细胞系重链VH3-7和VH3-23之外，所述组包括治疗抗体曲妥珠单抗(抗-Her2IgG1)和布妥昔单抗(抗-CD30IgG1)。如图13所示，2xDsbC提取物中IgG的表达极大地改善了所有四种IgG的产量。在DsbC+FkpA提取物中观察到进一步的改善，其促使曲妥珠单抗和布妥昔单抗两者的表达水平至1g/L，而生殖细胞系的IgG表达水平将近1.5g/L。

该实施例表明，来自过表达伴侣DsbC和FkpA的经改造细菌的提取物能增加广泛范围的免疫球蛋白在耦合有转录-翻译系统的OCFS中表达。

应理解，本文所描述的实施例和实施方案仅出于示例性目的，并且向本领域技术人员提示了基于以上实施例和实施方案的多种修饰或变化，并且其被包括在该申请的精神和范围以及所附权力要求的范围内。为了所有目的，通过引用将本文所引的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请整体并入本文。

非正式的序列表：

SEQIDNO：1NP_417369蛋白二硫键异构酶II[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](DsbC；xprA)(UniProtP0AEG6)

SEQIDNO：2NP_418297周质蛋白二硫键异构酶I[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](DsbA；dsf；ppfA)(UniProtP0AEG4)

SEQIDNO：3催化DsbA蛋白二硫键异构酶I重新氧化的NP_415703氧化还原酶[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](DsbB；roxB；ycgA)(UniProtP0A6M2)

SEQIDNO：4NP_418559融合的巯基：二硫键互换的蛋白：DsbC/保守蛋白的活化剂[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](DsbD；C-型细胞色素生物起源蛋白CycZ；内膜铜耐受蛋白；蛋白-二硫键还原酶)(UniProtP36655)

SEQIDNO：5NP_415137巯基：二硫键互换的蛋白，周质[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](DsbG；ybdP)(UniProtP77202)

SEQIDNO：6NP_417806FKBP-型肽基脯氨酰顺反异构酶(旋转异构酶)[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](FkpA；PPIase)(UniProtP45523)

SEQIDNO：7NP_417808FKBP-型肽基脯氨酰顺反异构酶(旋转异构酶)[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](SlyD；富含组氨酸的蛋白；金属伴侣蛋白SlyD；对溶菌蛋白D的敏感性；WHP；PPIase)(UniProtP0A9K9)

SEQIDNO：8NP_414595肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIase)[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](SurA；肽基脯氨酰顺反异构酶SurA；旋转异构酶SurA；存活蛋白A；PPIaseSurA)(UniProtP0ABZ6)

SEQIDNO：9NP_414720周质伴侣蛋白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](Skp；伴侣蛋白skp；结合DNA的17kDa蛋白；组氨酸-样蛋白HLP-1；hlpA)(UniProtP0AEU7)

SEQIDNO：10NP_009887蛋白二硫键异构酶PDI1[酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288c](yPDI；与硫氧还蛋白有关的糖蛋白1；TRG1；MFP1)(UniProtP17967)

SEQIDNO：11NP_000909蛋白二硫键异构酶前体[智人(Homosapiens)](hPDI；PDI；蛋白二硫键异构酶相关的1；DSI；胶原羟化酶；胶原脯氨酰基4-羟化酶β，原胶原-脯氨酸，2-酮戊二酸4-加双氧酶(脯氨酸4-羟化酶)，β多肽；脯氨酰基4-羟化酶亚基β；P4HB；PHDB；PO4DB；PO4HB；PROHB；P4Hβ；蛋白二硫键异构酶家族A，成员1；PDIA1；蛋白二硫键异构酶/氧化还原酶；结合甲状腺激素的蛋白p55；谷胱甘肽-胰岛素转氢酶；蛋白二硫键异构酶；脯氨酰基4-羟化酶亚基β；结合细胞甲状腺激素的蛋白；谷胱甘肽-胰岛素转氢酶；GIT；ERBA2L)(UniProtP07237)

SEQIDNO：12NP_010640硫氧还蛋白二硫键还原酶TRR1[酿酒酵母S288c](yTrr1；细胞质硫氧还蛋白还原酶)(UniProtP29509)

SEQIDNO：13NP_015234谷胱甘肽二硫键还原酶GLR1[酿酒酵母S288c](yGlr1；谷胱甘肽还原酶；GR；GRase；LPG17)(UniProtP41921)

SEQIDNO：14NP_414970肽基脯氨酰基顺/反异构酶(触发因子)[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](tig；TF；ECK0430；JW0426；PPIase)(UniProtP0A850)

SEQIDNO：15NP_000933肽基脯氨酰顺反异构酶B前体[智人](hPPIB；PPIaseB；PPIB；旋转异构酶B；亲环素B；亲环素-样蛋白；S-亲环素；SCYLP；CYP-S1；CYPB)(UniProtP23284)

SEQIDNO：16NP_010439肽基脯氨酰基异构酶CPR1[酿酒酵母S288c](Cpr1，肽基脯氨酰顺反异构酶，亲环素，CPH1，CYP1，结合环孢菌素A的蛋白，旋转异构酶，PPIase，PPI-II)(UniProtP14832)

SEQIDNO：17NP_013317肽基脯氨酰基异构酶CPR6[酿酒酵母S288c](Cpr6，亲环素，CYP40，旋转异构酶CPR6，PPIaseCPR6)(UniProtP53691)

SEQIDNO：18NP_014264肽基脯氨酰基异构酶FPR1[酿酒酵母S288c](Fpr1，FK506结合蛋白1，FKBP，FKB1，雷帕霉素结合蛋白，RBP1，PPIase)(UniProtP20081)

SEQIDNO：19NP_057390dnaJ同系物亚家族B成员11前体[智人](hERdj3；DnaJ(Hsp40)同系物，亚家族B，成员11；ER相关的DNAJ；ER相关的Hsp40共同伴侣蛋白；ER相关的dnaJ蛋白3；ERdj3；ERj3p；EDJ；ERJ3；ERj3；HEDJ；人DnaJ蛋白9；DnaJ蛋白同系物9HDJ9；DJ9；Dj-9；hDj-9；PWP1-相互作用蛋白4；APOBEC1结合蛋白2；ABBP-2；ABBP2；DNAJB11；PRO1080；UNQ537)(UniProtQ9UBS4)

SEQIDNO：20NP_00533878kDa调节葡萄糖的蛋白前体[智人](BiP；内质网腔Ca(2+)结合蛋白grp78；GRP-78；热激70kDa蛋白5；HSPA5；免疫球蛋白重链结合蛋白；MIF2)(UniProtP11021)

SEQIDNO：21NP_013911Hsp90家族伴侣蛋白HSC82[酿酒酵母S288c](yHsc82；HSC82；ATP依赖性分子伴侣蛋白HSC82；82kDa热激同源蛋白；热激蛋白Hsp90组成型同种型；HSP90；Hsp90家族的细胞质伴侣蛋白)(UniProtP15108)

SEQIDNO：22NP_418142热激伴侣蛋白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](IbpA；小热激蛋白IbpA；16kDa热激蛋白A；hslT；htpN；ECK3679；JW3664)(UniProtP0C054)

SEQIDNO：23NP_418141热激伴侣蛋白[大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655](IbpB；小热激蛋白IbpB；16kDa热激蛋白B；hslS；htpE；ECK3678；JW3663)(UniProtP0C058)

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水平的方法，其包括以下步骤：

i)合并细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统；以及，

ii)在允许所述目标蛋白表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细胞合成系统，

其中所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，且制备所述提取物的细菌所表达的外源二硫键异构酶和外源脯氨酰异构酶的总浓度为至少约1g/L的提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其中用来制备所述提取物的细菌还表达外源解聚酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中用编码所述二硫键异构酶、脯氨酰异构酶或解聚酶的基因共同转化用来制备所述提取物的细菌。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述外源二硫键异构酶为DsbC，所述外源脯氨酰异构酶为FkpA或SlyD，以及所述外源解聚酶为Skp。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源二硫键异构酶、脯氨酰异构酶或解聚酶。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌无细胞合成系统具有0.5-500升的体积，并且所述孵育持续1-36小时。

11.用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，其包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且其中在所述细菌中以至少1g/L的提取物水平表达外源二硫键异构酶和外源脯氨酰异构酶；和

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

12.(删除)

13.如权利要求11所述的系统，其中用编码所述二硫键异构酶和脯氨酰异构酶的基因共同转化用来制备所述提取物的细菌。

14.如权利要求11或13所述的系统，其中所述外源二硫键异构酶为DsbC，以及所述外源脯氨酰异构酶为FkpA或SlyD。

15.如权利要求11或13所述的系统，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

16.如权利要求11、13或15所述的系统，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源二硫键异构酶和所述外源脯氨酰异构酶。

17.如权利要求11、13或16所述的系统，其中所述提取物为大肠杆菌的S30提取物。

18.在细菌无细胞合成系统中表达正确折叠的生物学活性蛋白的方法，其包括以下步骤：

i)合并细菌提取物与编码目标蛋白的核酸；以及

ii)在允许所述目标蛋白表达和正确折叠的条件下，孵育所述细菌提取物与所述核酸，

其中，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸、核糖体，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白二硫化物异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，至少约1g/L的提取物浓度。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白二硫化物异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，1-14g/L的提取物浓度。

21.如权利要求18所述的方法，其中改善所述目标蛋白的表达至浓度超过其中蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的一者而非两者存在时的浓度，并且所述孵育条件在其他方面相同。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白二硫键异构酶选自：DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且所述肽基脯氨酰基顺/反异构酶选自FkpA和SlyD。

23.如权利要求18所述的方法，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的至少一种。

24.如权利要求18所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

26.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

27.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。

28.用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，其包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且还包含蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，

其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；和

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

29.如权利要求28所述的系统，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，至少约1g/L的提取物浓度。

30.如权利要求28所述的系统，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，1-14g/L的提取物浓度。

31.如权利要求28所述的系统，其中改善所述目标蛋白的表达至浓度超过其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶的一者而非两者存在时的浓度，并且所述孵育条件在其他方面相同。

32.如权利要求28所述的系统，其中所述蛋白二硫键异构酶选自：DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，以及所述肽基脯氨酰顺反异构酶选自FkpA和SlyD。

33.如权利要求28所述的系统，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的至少一种。

34.如权利要求28所述的系统，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

35.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

36.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

37.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。

38.制备细菌提取物的方法，其包括：

i)培养表达外源蛋白二硫键异构酶和外源肽基脯氨酰顺反异构酶的细菌，以及

ii)制备提取物，所述提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，

其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶存在的总浓度为，至少约1g/L的提取物。

39.用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞提取物，所述细菌无细胞提取物包含活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，以及还包含蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，

其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶存在的总浓度为，至少约1g/L的提取物。

Claims (37)

1.改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水平的方法，其包括以下步骤：

i)制备细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，其中用来制备所述提取物的细菌以至少约1gm/升的提取物浓度表达外源蛋白伴侣；

ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统；以及，

iii)在允许所述目标蛋白表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细胞合成系统。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白伴侣选自：二硫键异构酶、脯氨酰异构酶和解聚酶。

3.如权利要求1所述的方法，其中用编码二硫键异构酶和脯氨酰异构酶的基因共同转化用来制备所述提取物的细菌。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述外源蛋白伴侣选自：DsbC、FkpA和SlyD。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

6.如权利要求1所述的方法，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源蛋白伴侣。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌无细胞合成系统具有0.5-500升的体积，并且所述孵育持续1-36小时。

11.用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，其包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且其中在所述细菌中以至少1gm/升的提取物水平表达外源蛋白伴侣；和

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

12.如权利要求11所述的系统，其中所述蛋白伴侣选自二硫键异构酶和脯氨酰异构酶。

13.如权利要求11所述的系统，其中用编码二硫键异构酶和脯氨酰异构酶的基因共同转化用来制备所述提取物的细菌。

14.如权利要求11所述的系统，其中所述外源蛋白伴侣选自：DsbC、FkpA、和SlyD。

15.如权利要求11所述的系统，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

16.如权利要求11所述的系统，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源蛋白伴侣。

17.如权利要求11所述的系统，其中所述提取物为大肠杆菌的S30提取物。

18.在细菌无细胞合成系统中表达正确折叠的生物学活性蛋白的方法，其包括以下步骤：

i)制备细菌提取物，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸、核糖体，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；

ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸；以及

iii)在允许所述目标蛋白表达和正确折叠的条件下，孵育所述细菌提取物与所述核酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，至少约1gm/升的提取物浓度。

20.如权利要求18所述的方法，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，1-14gm/升的提取物浓度。

21.如权利要求18所述的方法，其中改善所述目标蛋白的表达至浓度超过其中蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的一者而非两者存在时的浓度，并且所述孵育条件在其他方面相同。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白二硫键异构酶选自：DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且所述肽基脯氨酰基顺/反异构酶选自FkpA和SlyD。

23.如权利要求18所述的方法，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源蛋白伴侣的至少一种。

24.如权利要求18所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

26.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

27.如权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。

28.用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，其包含：

i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且还包含蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶，

其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；和

ii)编码目标蛋白的核酸，

其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。

29.如权利要求28所述的系统，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，至少约1gm/升的提取物浓度。

30.如权利要求28所述的方法，其中蛋白二硫化物异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的总浓度存在为，1-14gm/升的提取物浓度。

31.如权利要求28所述的系统，其中改善所述目标蛋白的表达至浓度超过其中所述蛋白二硫键异构酶和所述肽基脯氨酰顺反异构酶的一者而非两者存在时的浓度，并且所述孵育条件在其他方面相同。

32.如权利要求28所述的系统，其中所述蛋白二硫键异构酶选自：DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，以及所述肽基脯氨酰顺反异构酶选自FkpA和SlyD。

33.如权利要求28所述的系统，其中用来制备所述提取物的细菌从可操作地连接组成型启动子的基因表达所述外源蛋白伴侣的至少一种。

34.如权利要求28所述的系统，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

35.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白在其生物学活性构象中具有至少一个二硫键。

36.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白具有至少两个脯氨酸残基。

37.如权利要求28所述的系统，其中所述目标蛋白为抗体或抗体片段。