WO2003025116A2

WO2003025116A2 - Verfahren zur erhöhung der löslichkeit, der expressionsrate und der aktivität von proteinen während der rekombinanten herstellung

Info

Publication number: WO2003025116A2
Application number: PCT/EP2002/010329
Authority: WO
Inventors: Manfred Watzele; Regina Schweizer; Cordula Nemetz; Robin Steigerwald; Thomas Emrich; Katrin Zaiss; Erhard Fernholz; Baerbel Walckhoff; Hans Joachim Schoenfeld; Birgit Offen
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh; F. Hoffmann-La-Roche Ag
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2002-09-14
Publication date: 2003-03-27
Also published as: US20040248238A1; JP2005503157A; DE10145694A1; WO2003025116A3; EP1430078A2

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Lysates enthaltend Helferproteine, wobei ein Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, transformiert wird mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene, wobei die Helferproteine in diesem Stamm ex-primiert werden und wobei das Lysat enthaltend Helferproteine aus diesen Stämmen gewonnen wird. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Lysat enthaltend Helferproteine erhältlich nach dem erfindungsgemässen Verfahren, Verschnitte aus diesen Lysaten und die Verwendung der Lysat und Verschnitte in in vitro Translationssystemen.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit, der Expressionsrate und der Aktivität von Proteinen während der rekombinanten Herstellung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Lysates enthaltend Helferproteine, wobei ein Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in-vitro Translations-Lysaten, transformiert wird mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene, wobei die Helferproteine in diesem Stamm ex- primiert werden und wobei das Lysat enthaltend Helferproteine aus diesen Stämmen gewonnen wird. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Lysat enthaltend Helferproteine erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, Verschnitte aus diesen Lysaten und die Verwendung der Lysate und Verschnitte in in vitro Translationssystemen.

Die Zugabe von hoch gereinigten Helferproteinen wurde im Stand der Technik bereits beschrieben. So ist in der Anmeldung WO 94/24303 die Verwendung von DnaJ, DnaK, GrpE, GroEL und GroES zur Aktivierung eines in vitro synthetisierten Proteins beschrieben. Beschrieben wird ein Zeil- freier Extrakt, der weitgehend frei von Protein- und DNA-abbauenden Enzymen ist und die Inkubation in einem in vitro Transkriptions/Translations-Medium, welches Helferproteine enthält.

In WO 94/24303, wie auch in Kudlicki et al. (1995), J. Bacteriol. 177, 5517 und Kudlicki et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 31160 wird ein isolierter Komplex aus Ribosomen und einem Pep- tid/Protein durch Zugabe von Helferproteinen und ATP wieder aufgelöst, wobei das aktive Protein freigesetzt wird.

Ryabova et al. (1997), Nature Biotechnology 15, 79 beschreiben den Einsatz von DnaJ, DnaK, GrpE, GroEL und GroES im Zusammenspiel mit Proteindisulfidisomerase bei der in vitro Translation mit einem E. coli Lysat. Die Zugabe von DnaJ, DnaK, GrpE allein führte zur Erhöhung der Löslichkeit eines Disulfid-haltigen Proteins, während die Zugabe von Proteindisulfidisomerase zu einer Erhöhung der Aktivität führte.

Merk et al. (1999), J. Biochem. 125, 328 beschreiben den Einsatz von DnaJ, DnaK, GrpE, GroEL und GroES im Zusammenspiel mit Proteindisulfidisomerase bei der gekoppelten oder verknüpf- ten in vitro Transkription/Translation mit einer E. coli Ribosomen Fraktion. Die Zugabe der Helferproteine führte zu einer erhöhten Löslichkeit und zu einer erhöhten Aktivität der Proteine.

In Fedorof & Baldwin (1998) Meth. Enzymol.290, 1 sind Helferproteine in den verschiedenen Zeil-freien Extrakten gebräuchlicher in vitro Transkriptions/Translations- Ansätze aus E. coli, Kaninchen-Retikulozyten und Weizenkeim aufgeführt.

In Fedorof & Baldwin (1997) J. Biol. Chem. 272, 5 wird die Bedeutung verschiedener Helferproteine bei der Kotranslationalen Proteinfaltung und die (oben erwähnten) Beispiele in der in vitro Proteinsynthese zusammengefaßt.

Im Stand der Technik werden also hochgereinigte Helferproteine zugesetzt, bzw. werden die in dem Lysat vorhandenen Helferproteine eingesetzt. Die Zugabe gereinigter Helferproteine ist unwirtschaftlich, während die in den Lysaten vorhandenen Helferproteine im allgemeinen nicht ausreichen, um Proteine ausreichend vor Aggregation und Mißfaltung zu schützen.

EP 0885967 A2 beschreibt die Koexpression von DnaJ-, Dnak-, GrpE-Helferproteinen in einem zellulären Expressions-System zur Verbesserung der Proteinfaltung.

Die Koexpression von Helferproteinen ist jedoch nachteilig, da das Synthesepotential des Expressionssystems neben dem zu exprimierenden Protein auf weitere Proteine verteilt werden muß.

In Bachand et al. (2000) RNA, 6, 778 wird beschrieben, daß die humane Telomerase, bestehend aus der katalytischen Untereinheit hTERT und aus der beteiligten RNA hTR, in vitro mit einem Kaninchen Retikulozyten System und in vivo in Hefezellen in aktiver Form hergestellt wurde.

Holt et al. (1999) Genes & Development 13, 817 beschreiben, daß zur Rekonstitution von in vitro (Kaninchen Retikulozyten System) synthetisierter hTERT mit der beteiligten RNA hTR weitere Proteinfaktoren hsp 90 und p23 aus dem Retikulozytenextrakt als Helferproteine nötig sind.

Die Expression von Telomerase im zellfreien Kaninchen Retikulozyten System ist für den Großmaßstab jedoch nicht durchführbar, da hierbei große Lysatmengen benötigt werden, welche teuer in der Herstellung sind. Ein weiterer Grund, der dagegen spricht, ist der Tierschutz. Masutomi et al. (2000), J. Biol. Chem., 275, 22568 beschreiben die Expression von hTERT in Insektenzellen und die Rekonstitution mit in vitro transkribierter hTR. Sie weisen jedoch darauf hin, daß alle Methoden, Telomerase in bakteriellen Expressionssystemen zu synthetisieren, gescheitert sind.

Weinrich et al. (1997) Nat. Genet. 17, 498 erwähnen die erfolgreiche Synthese funktioneil aktiver Telomerase in einem Weizenkeim Transkriptions-Translationssystem. Das Weizenkeim Expressionssystem ist jedoch Erfahrungen wenig produktiv und liefert wegen dem Vorhandensein hoher Nuklease- und Proteaseaktivitäten größtenteils unvollständige Translationsprodukte.

Es bestand somit die Aufgabe, ein Verfahren zu entwickeln, daß es ermöglicht, bei der in vitro Synthese eines Proteins (im folgenden auch Zielprotein genannt) Helferproteine in optimaler und wirtschaftlicher Weise zur Verfugung zu stellen. Insbesondere soll die Zugabe der Helferproteine in der Weise optimiert werden, daß das in vitro synthetisierte Protein (Zielprotein) ausreichend vor Aggregation und Mißfaltung geschützt ist.

Die vorliegende Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Lysates enthaltend Helferproteine, dadurch gekennzeichnet,

daß ein Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, transformiert wird mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene, daß die Helferproteine in diesem Stamm exprimiert werden und daß das Lysat enthaltend Helferproteine aus diesen Stämmen gewonnen wird.

Dieses erfindungsgemäße Lysat ist dann während der in vitro Synthese des Zielproteins anwesend.

Helferproteine im Sinne der Erfindung sind dabei Proteine, welche die Löslichkeit, die Faltung und/oder die Aktivität der in vitro exprimierten Proteine erhöhen und dabei fallweise auch deren Expressionsrate steigern können. Ein lösliches Protein im Sinne der Erfindung bedeutet, daß das Protein aus dem Reaktionsansatz nach einer 2-minütigen Zentrifugation bei 10000-facher Erdbeschleunigung g im Überstand bleibt und nicht sedimentiert. Eine Steigerung der Löslichkeit im Sinne der Erfindung bedeutet, daß bei Zusatz der Helferproteine ein höherer Anteil des Proteins (mindestens 10%) in Lösung bleibt, als beim Ansatz ohne Zusatz der Helferproteine. Beispiele für Helferproteine sind sogenannte heat shock Proteine und Chaperone wie die aus dem DnaK oder GroE System, Chaperonine, Proteindisulfidisomerase, Trigger-Faktor und Prolyl-cis-trans Isomerase.

Die Faltungshelferproteine sind aus einer oder mehreren der folgenden Proteinklassen ausgewählt: Hsp60-, Hsp70-, Hsp90-, HsplOO-Proteinfamilie, Familie der kleinen Hitzeschockproteine und Isomerasen.

Molekulare Chaperone stellen die größte Gruppe von faltungsassistierenden Proteine dar und werden erfindungsgemäß als Faltungshelferprotein verstanden (Gething und Sambrook, 1992; Hartl, 1996; Buchner, 1996; Beißinger und Buchner, 1998). Aufgrund ihrer Überexpression unter Stressbedingungen können die meisten molekularen Chaperone auch in die Gruppe der Hitzeschockproteine einordnet werden (Georgopoulos und Welch, 1993; Buchner, 1996), diese Gruppe wird erfindungsgemäß ebenfalls als Faltungshelferprotein verstanden.

Nachfolgend werden wichtige Faltungshelferproteine, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden, näher erläutert. Die Gruppe der molekularen Chaperone läßt sich anhand von Sequenzhomologien und der molekularen Massen in fünf nicht verwandte Proteinklassen, die Hsp60-, Hsp70-, Hsρ90-, HsplOO-Proteinfamilien und die Familie der kleinen Hitzeschockproteine unterteilen (Gething und Sambrook, 1992; Hendrick und Hartl, 1993).

• Hsp60

Das am Besten untersuchte Chaperon überhaupt ist GroEL, ein Vertreter der HspδO Familie aus E. coli. Die Vertreter der Hsp60 Familie werden auch als Chaperonine bezeichnet und in zwei Gruppen unterteilt. GroEL und sein Ko-Chaperon GroES und deren stark homologe Verwandte aus anderen Bakterien sowie Mitochondrien und Chloroplasten bilden die Gruppe der I Chaperone (Sigler et al., 1998; Fenton und Horwich, 1997). Die Hsp60 Proteine aus dem eukaryoti- schen Cytosol und aus Archebakterien werden als Gruppe II Chaperone zusammengefaßt (Gut- sche et al., 1999). In beiden Gruppen zeigen die Hsp60 Proteine einen ähnlichen oligomeren Aufbau. Im Falle von GroEL und den anderen Gruppe I Chaperoninen lagern sich 14 GroEL Untereinheiten zu einem Zylinder aus zwei heptameren Ringen zusammen, während die heptamere Ringstruktur bei den Chaperoninen der Gruppe II aus Archebakterien meist aus zwei unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Vertreter der Gruppe II Chaperonine aus dem eu- karyotischen Cytosol, wie z. B. der CCT-Komplex aus Hefe, sind hingegen aus 8 verschiedenen Untereinheiten mit genau definierter Organisation aufgebaut (Liou und Willison, 1997). Im zentralen Hohlraum dieses Zylinders können nicht native Proteine eingelagert und gebunden wer- den. Das Ko-Chaperon GroES bildet ebenfalls einen heptameren Ring und bindet in dieser Form an den Polen des GroEL- Zylinders. Diese Bindung von GroES führt allerdings zu einer Limitierung der Substratbindung in Abhängigkeit ihrer Größe 10-55kDa; Ewalt et al., 1997). Die Substratbindung wird dabei durch ATP-Bindung und Hydrolyse reguliert.

• Hsp70

Neben den Vertretern der Hsp60 Familie binden auch die Hsp70 Proteine an die naszierende Polypeptidkette (Beckman et al., 1990; Welch et al., 1997). Sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen existieren meist mehrere konstitutiv exprimierte und stressinduzierte Vertreter der Hsp70 Familie (Vickery et al., 1997; Kawula und Lelivelt, 1994; Fink, 1997; Welch et al., 1997). Diese sind neben der Proteinfaltung direkt am Ribosom auch an der Translokation von Proteinen über Zeil- und Organellmembranen beteiligt (Schatz & Doberstein, 1996). Es wurde gezeigt, daß Proteine nur im ungefalteten bzw. teilgefalteten Zustand durch Membranen geschleust werden können (Hannavy et al., 1993). Während des Translokationsprozesses in Organellen sind vor allem Vertreter der Hsp70 Familie an der Entfaltung und Stabilisierung auf der cytosolischen Seite, als auch an der Rückfaltung auf der Organellseite beteiligt (Hauke und Schatz, 1997). Dabei ist bei allen Prozessen die ATPase- Aktivität von Hsp70 essentiell für die Funktion des Proteins. Charakteristisch für das Hsp70-System ist die Kontrolle der Aktivität durch Ko-Chaperone (Hsp40; DnaJ), wobei durch gezielte Modulation der ATPase-Aktivität das Gleichgewicht zwischen Substratbindung und Freisetzung beeinflußt wird (Bukau und Horwich, 1998).

• Hsp90

Mit etwa 1% des löslichen Proteins im eukaryontischen Cytosol stellt Hsp90 eines der am stärksten exprimierten Proteine dar (Welch und Feramisco, 1982). Die Vertreter dieser Familie agieren vorwiegend in multimeren Komplexen, wobei sie eine Vielzahl von wichtigen Signal- transduktionsproteinen mit nativähnlichen Strukturen erkennen. Durch die Bindung an Hsp90 und seine Partnerproteine werden diese Strukturen stabilisiert und so die Bindung von Liganden an die Signalproteine erleichtert. So können die Substrate ihre aktive Konformation erlangen (Sullivan et al., 1997; Bohen et al., 1995; Buchner, 1999).

• HsplOO

In jüngster Zeit zeichneten sich besonders die HsplOO Chaperone durch ihre Fähigkeit in Zusammenarbeit mit den Hsp70 Chaperonen bereits gebildete Aggregate wieder aufzulösen aus (Parsell et al., 1994; Golloubinoff et al., 1999; Mogk et al., 1999). Während ihre Hauptaufgabe die Vermittlung von Thermotoleranz zu sein scheint (Schirmer et al, 1994; Kruger et al., 1994), vermitteln einige Vertreter wie ClpA und ClpB zusammen mit der Protease-Untereinheit ClpP den proteolytischen Abbau von Proteinen (Gottesman et al., 1997).

• sHsps

Die fünfte Klasse von Chaperonen, die kleinen Hitzeschockproteine (sHsps) stellen eine sehr divergente Familie von Hitzeschockproteinen dar, die in fast allen Organismen gefunden werden. Namensgebend für diese Familie von Chaperonen ist ihr relativ geringes monomeres Molekulargewicht von 15-40 kDa. In der Zelle existieren sHsps aber meist als hocholigomere Komplexe mit bis zu 50 Untereinheiten woraus Molekülmassen von 125 kDa bis zu 2 MDa beobachtet wurden (Spectof et al., 1971; Arrigo et al., 1988; Andreasi-Bassi et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997). In vitro können sHsps wie die anderen Chaperone die Aggregation von Proteinen unterdrücken (Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993; Merck et al, 1993; Jakob und Buchner, 1994, Lee et al., 1995; Ehrnsperger et al., 1997b). Dabei binden sHsps bis zu ein Substratmolekül je Untereinheit und zeigen somit eine höhere Effizienz als das Modellchaperon GroEL (Jaenicke und Creighton, 1993; Ganea und Harding, 1995; Lee et al., 1997; Ehrnsperger et al, 1998a). Unter Streßbedingungen verhindert die Bindung von nicht nativem Protein an sHsps die irreversible Aggregation der Proteine. Durch die Bindung an sHsps werden die Proteine in einem löslichem faltungskompetentem Zustand gehalten. Nach der Wiederherstellung von physiologische Bedingungen kann das nicht native Protein von ATP -abhängigen Chaperonen wie Hsp70 aus dem Komplex mit sHsp gelöst und reaktiviert werden.

• Isomerasen

Als Isomerasen kommen für das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise Faltungskatalysatoren aus der Klasse der Peptidyl-prolyl-cis/trans Isomerasen und Vertreter der Disulfidisomera- sen.

Faltungshelferproteine, die in gleicher oder ähnlicher Weise funktionieren wie die oben beschriebenen Faltungshelferproteine, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wenn der Stamm mit verschiedenen Vektoren transformiert wurde, wobei sich die Vektoren mindestens darin unterscheiden, daß die darin enthaltenen Gene für unterschiedliche Helferproteine kodieren. Auf diese Weise können verschiedene Helferproteine, die für die in vitro Synthese des jeweiligen Zielproteins wichtig sind, in einem Lysat hergestellt werden.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, zusätzlich wenigstens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: RNAse-arm oder -defizient, Exonuklease-arm oder - defizient, Protease-arm oder defi- zient.

Eine Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren, wobei das Lysat in der Weise gewonnen wird, daß zusätzlich zu den Helferproteinen alle Komponenten in dem Lysat enthalten sind, welche für eine in vitro Translation oder für eine in vitro Transkription/Translation eines Zielproteins erforderlich sind. Für eine in vitro Translation oder für eine in vitro Transkription/Translation eines Zielproteins sind mindestens die folgenden Komponenten erforderlich:

• Ribosomen

• Aminoacyl tRNA-Synthasen

• Initiationsfaktoren

• Elongationsfaktoren

• Terminationsfaktoren

• Enzyme, die zu einer Regeneration von ATP, GTP, UTP und CTP ausgehend von einem eingesetzten primären Energiedonor nötig sind. Solche primären Energiedonoren sind beispielsweise Acetylphosphat, Kreatinphosphat, Phosphoenolpyruvat, Pyruvat, Glucose oder weitere dem Fachmann bekannte mögliche Substrate, die direkt oder über mehrere enzymkatalysierte Zwischenschritte umgesetzt werden, so daß Moleküle mit einer energiereichen Phosphatbindung entstehen, welche diese Phosphatgruppe dann wieder auf ein Nukleotidmonophosphat oder ein Nukleotiddiphosphat übertragen können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Lysat enthaltend Helferproteine, wobei dieses Lysat erhältlich ist durch das erfindungsgemäße Verfahren. Prinzipiell sind auch andere Verfahren denkbar, mit dem das erfindungsgemäße Lysat erhalten werden kann, z. B. Verfahren, bei denen die Promotoren der in den Stämmen natürlich vorkommenden Helferproteingene verändert werden, so daß eine größere Menge an dem Helferprotein gebildet wird. Eine weitere Methode ist die Transformation von einem Stamm mit einem DNS Stück, welches das co- dierte Helferprotein enthält und welches in das Genom des Stammes ein oder mehrmals integriert wird, um dann von diesem Stamm bei der Zellteilung mit amplifiziert zu werden. Jedes Lysat, daß die gleichen Eigenschaften aufweist, wie das Lysat, welches erhältlich ist durch das erfindungsgemäße Verfahren, ist von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist das. oben beschriebene Lysat, wobei mindestens zwei verschiedene Helferproteine enthalten sind,

Von der Erfindung umfaßt sind auch Lysate enthaltend im wesentlichen ein Helferprotein.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Lysat wobei die Helferproteine ausgewählt werden aus der folgenden Gruppe:

- Helferproteine des Dnak Systems (DnaK, DnaJ und/oder GrpE)

- Helferproteine des GroE-Systems (GroEL, GroES) Chaperonine

- Proteindisulfidisomerase,

- Trigger-Faktor und

- Prolyl-cis-trans Isomerase.

Als ganz besonders vorteilhaft können sich Verschnitte erweisen aus verschiedenen erfindungsgemäßen Lysaten. Auf diese Weise könnte die Anzahl der Helferproteine und deren Konzentration für die jeweilige in vitro Translation bzw. in vitro Transkription und Translation des Zielproteins optimiert werden.

Eine bevorzugte Ausfuhrungsform sind Verschnitt aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Lysaten mit einem Lysat enthaltend alle Komponenten, welche für eine in vitro Translation oder für eine in vitro Transkription/Translation erforderlich sind.

Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, der mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene transformiert wurde.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysates oder einem erfindungsgemäßen Verschnitt zur in vitro Translation bzw. zur in vitro Transkription/Translation. Des weiteren umfaßt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysates oder einem erfindungsgemäßen Verschnitt in einem CECF oder CFCF Reaktor. Eine derartige Versuchsanordnung ist in den Prinzipien der "continuous exchange cell- free" (CECF), bzw. der "continuous flow cell-free" (CFCF) Proteinsynthese realisiert (US 5,478,730; EPA 0 593 757; EPA 0 312 612; Baranov & Spirin (1993) Meth. Enzym.217, 123-142). CECF-Reaktoren bestehen aus mindestens zwei diskreten Kammern, welche durch eine poröse Membranen gegeneinander abgetrennt sind. Durch diese poröse Grenzfläche werden die hochmolekularen Komponenten in der Reaktionskammer zurückgehalten, während niedermolekulare Komponenten zwischen Reaktionskammer und Versorgungskammer ausgetauscht werden . Bei CFCF- Verfahren wird eine Versorgungslösung direkt in die Reaktionskammer gepumpt und die Reaktionsendprodukte werden durch eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen aus dem Reaktionskompartiment gepresst. Entsprechende Reaktorenprinzipien wurden bei der "continuous exchange cell-free" (CECF), bzw. der "continuous flow cell-free" (CFCF) Proteinsynthese realisiert (US 5,478,730; EPA 0 593 757; EPA 0 312 612; Baranov & Spirin (1993) Meth. Enzym. 217, 123-142).

Überraschenderweise konnte durch die Zugabe der Helferproteine auch eine deutliche Steigerung der Expressionsrate der Zielproteine erzielt werden.

Erfindungsgemäß können die Zielproteine alle Arten von pro- und eukaryontischen Proteinen und auch archaeale Proteine sein. Problematisch in in vitro Transkriptions/Translationssystemen war bisher insbesondere die Expression von sekretorischen Proteinen und Membranproteinen, besonders dann wenn keine Faltungshelferproteine in ausreichender Menge vorhanden sind. Die erfolgreiche Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen wurde im Stand der Technik zwar beschrieben, war aber deutlichen Limitationen unterworfen (Hupa und Ploegh, 1997; Falk et al., 1997). Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich insbesondere für die Expression von Lipoproteinen und membranständigen Proteinen bzw. sekretorischen Proteinen als Zielprotein eignen, da Faltungshelferproteine durch die Koexpression in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden.

Des weiteren erwies sich als überraschender Vorteil, daß durch Zugabe der erfindungsgemäßen Lysate zu einem zellfreien in vivo Translationssystem aktive Telomerase hergestellt werden konnte. Bisher konnte weder in prokaryontischen Zellen, noch in zellfreien prokaryontischen Lysaten aktive Telomerase exprimiert werden. Somit ist auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Lysates oder eines erfindungsgemäßen Verschnittes zur in vitro Translation bzw. zur in vitro Transkription/Translation von Telomerase. Die zellfreie in vitro Expression von Telomerase mit prokaryontischen Lysaten konnte erfindungsgemäß durch die Zugabe eines erfindungsgemäßen Lysates enthaltend die Helferproteine DnaK und DnaJ zu einem herkömmlich hergestellten E. coli Extrakt erreicht werden. Durch die Zugabe dieses erfindungsgemäßen Lysates wurde die Aggregation der ungefalteten katalytischen Untereinheit der Telomerase verhindert und die Rekonstitution mit der RNA Komponente hTR zur aktiven Telomerase ermöglicht. Damit besteht aufgrund der vorliegenden Erfindung erstmals die Möglichkeit, aktive und reine Telomerase kostengünstig herzustellen.

Da die Telomerase in allen Eukaryonten von der Hefe bis zum Menschen exprimiert wird, ist die Analyse der „reinen" Telomerase schwierig, da prinzipiell immer Kofaktoren aus den Expressionssystemen zusätzlich vorhanden sind.

Da in E. coli die meisten posttranslationalen Modifikationen eukaryontischer Zellen nicht vorhanden sind, besteht nun die Möglichkeit, in vitro synthetisierte Telomerase beispielsweise gezielt mit Kinasen zu modifizieren und dadurch die Wirkungsweise und die Einflüsse dieser Modifikationen zu untersuchen.

Bisher waren auch die Einführung von unnatürlichen Aminosäuren zur Struktur und Funktionsanalyse, oder gezielten post-translationalen Modifikationen Liu J.-P. (1999) Faseb J. 13, 2091, (z. B. Phosphorylierungen) sind in zellulären Expressionssystemen nur eingeschränkt möglich. Durch die zellfreie Synthese der Telomerase beispielsweise stehen nun alle Möglichkeiten zum Einbau unnatürlicher Aminosäuren offen, wie beispielsweise der Einbau von ¹⁵N oder ¹³C markierten Aminosäuren für NMR Untersuchungen, Seleno-markierten Aminosäuren zur röntgen- kristallographischen Analytik, Fluoreszenz- oder Spin-markierten Aminosäuren (Hohsaka et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 12194) zur Untersuchung von Bindungsmechanismen.

Figurenbeschreibung

Figur 1:

Telomeraseanteil im Pellet beziehungsweise im Überstand des Zentrifugates der Reaktionsprodukte erhalten mit und ohne Zugabe von Helferproteinen.

Figur 2:

Anteil eines gelösten Fusionsproteins in Abhängigkeit von der Menge zugegebener Helferproteine. Figur 3:

Löslicher Telomeraseanteü in E. coli Lysaten aus zwei verschiedenen Herstellungen in flüssigem oder lyophilisertem Zustand mit und ohne Zugabe von Helferproteinen.

Figur 4:

Einfluß der Zugabe einzelner Helferproteine zum Lysat auf den löslichen Telomeraseanteü.

Figur 5:

Einfluß der Zugabe von DnaK und DnaJ mit und ohne GrpE auf den löslichen Telomeraseanteü.

Figur 6:

Einfluß von Helferproteinen des DnaK Systems auf die Aktivität des grün fluoreszierenden Proteins

(GFP)

Figur 7:

Erhöhung der Synthesemenge von Telomerase in Abhängigkeit von der Zugabe der Helferproteine.

Figur 8:

Löslicher Telomeraseanteü in Abhängigkeit vom Einsatz von Lysaten aus den ZeUen transformiert mit den DnaK/DnaJ/GrpE System

Figur 9:

Löslicher Telomeraseanteü in Lysaten aus dem nicht-transfor ierten A19 Stamm, welche mit 25% bzw. 50% Lysat aus dem mit einem Plasmid codierend für die Proteine aus den DnaK System transformierten A19 Stamm verschnitten wurden.

Figur 10:

Coomassie gefärbtes SDS-Gel einer zeü-freien Expression von Rhodanese (35 kDa); Spur 1 und Spur

2: Ohne Zugabe von RTS GroEL/ES Lysat, Spur 3 und Spur 4: Mit Zugabe von RTS GroEL/ES Lysat.

In Spur 1 und 3 sind jeweüs die Überstandfraktionen, in Spur 2 und 4 die Niederschlagsfraktionen aufgetragen. Figur 11:

Gesamtaktivität der zell-frei exprimierten Rhodanese in Abhängigkeit von der Zugabe des Helferprotein enthaltenden Lysates; Säule 1: Expression ohne Zugabe von GroEL/ES-Lysat; Säule 2: Expression mit Zugabe von GroEL/ES-Lysat.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

A. Verwendete Reaktionskomponenten

1. Plasmide:

pIVEX2.3-GFP: Das Gen für das Green Fluorescent Protein aus Aequoria victoria (Prasher et al. (1992) Gene 111, 229) wurde über die Ncol SchnittsteUe in den ρIVEX2.3 Vektor (Röche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany) Moniert.

pIVEX2.4b-Mal-Epo: Aus pMAL-p2 (New England Biolabs, Beverley, MA, USA) wurde das Gen für das Maltose bindende Protein isoliert und in den Vektor pIVEX2.4b Woniert. Hinter dieses Gen wurde das Gen für das humane Erythropoietin (Jacobs et al. (1985) Nature 313, 806) ohne die Signalsequenz Woniert, wobei pIVEX2.4b-Mal-Epo entstand.

pIVEX2 ,4bNde-hTERT: Das Gen für die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase (Autexier C. et al. (1996) EMBO Journal. 15, 5928) wurde in den ρIVEX2.4bNde Vektor über die Nde 1 Schnittstelle einkloniert, wobei ρIVEX2.4bNde-hTERT entstand.

p]NEX2.4-Rhodanese: Das bovine mitochondriale Rhodanese Gen (Miller D.M et al. (1991), J. Biol Chem. 266, 4686) wurde über die Nco I Schnittstelle in den pIVEX2.4- Vektor Moniert, wobei pIVEX2.4-Rhodanese entstand.

2. Helferprotein-Plasmide

DRDKIG welches für die Proteine Dna-K, Dna-J und GrpE codiert (Dale GE et al. (1 94) Protein Eng. 7, 925), sowie gereinigtes Dna-K, Dna-J und GrpE Protein wurde von Dr. H. Schönfeld Hoffmann- La Röche Ltd., Basel Schweiz erhalten. pREP4-groESL welches für die Proteine Gro-EL und Gro-ES codiert wurde von P. Caspers erhalten (Caspers et al. ( 1994) Cell Mol. Biol.40, 635-44). Gereinigtes GroEL und GroES Protein wurde von Dr. H. Schönfeld Hoffmann- La Röche Ltd., Basel Schweiz erhalten.

3. E. coli S30 Lysat

Das Lysat wurde mit einem E. coli A19-Stamm nach dem Verfahren nach Zubay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267) präpariert.

B. Beispiele Beispiel 1

Beispiel la: Einfluss von Helferproteinen auf die Löslichkeit der Telomerase

Das prVEX2.4bNde-hTERT Plasmid wurde im bakterieUen in vitro Expressionssystem mit und ohne Zugabe von je 1 μM der Helferproteine DnaK, DnaJ und GrpE eingesetzt. Für die Expression wurde der Rapid Translation System RTS 500 E. coli circular template Kit (Röche Diagnostics GmbH) verwendet. Die Helferproteine wurden in gereinigter Form zugesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden anschließend für 2 min bei lOOOOxg zenfrifugiert. Das resultierende Peüet und der Überstand wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Das SDS-Gel wurde mittels Westernblot analysiert. Die Mengen an detektierten Protein sind in Figur 1 zu sehen.

Ergebnis: Es zeigte sich, dass im Falle der Zugabe von Helferproteinen ein wesentlich höherer Anteü gelöster Telomerase (Überstandsfraktion) vorliegt.

Beispiel 1b: Einfluss von Helferproteinen des DnaK Systems auf die Löslichkeit eines Fusionsproteins bestehend aus Maltose-Bindeprotein und Erythropoietin

Das Fusionsprotein wurde vom Expressionsvektor pIVEX2.4b-Mal-Epo im bakteriellen in vitro Expressionssystem mit und ohne Zugabe von je lμM der Helferproteine DnaK, GrpE und DnaJ (analog zu Beispiel la) synthetisiert. Die Reaktionsprodukte wurden anschließend für 2 min bei lOOOOxg zenfrifugiert. Das resultierende PeUet und der Überstand wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Das SDS-Gel wurde mittels Westernblot analysiert. Ergebnis: Es zeigte sich, dass im Falle der Zugabe steigender Mengen von Helferproteinen ein steigender Anteü gelösten Fusionsproteins (Überstandsfraktion=Supernatant) vorliegt (Figur 2).

Beispiel 2: Einfluss von Helferproteinen bei verschiedenen Lysatpräparationen und Lysatlyo- philisation Wie in Beispiel 1 wurden E. coli Lysate aus 2 verschiedenen Herstellungen in flüssigem oder lyophüi- siertem Zustand mit und ohne Zugabe von je 1 μM der Helferproteine DnaK, DnaJ und GrpE in einer Telomerase Expression eingesetzt.

Ergebnis: Bei beiden Lysat Herstellungen war ein ähnlich positiver Effekt für die Helferprotein Substitution festzustellen. Das lyophilisierte Lysat zeigte einen geringeren löslichen Telomerase Anteü. Auch hier brachte die Helferprotein Zugabe eine gesteigerte Löslichkeit (Figur 3).

Beispiel 3: Zugabe einzelner Helferproteine zum Lysat

Es wurde in diesem Beispiel nicht das ganze DnaK System bestehend aus DnaK, DnaJ und GrpE sondern jeweÜs nur die gereinigten Einzelkomponenten in 1 μM Konzentration zugesetzt. Die Analyse war analog zu Beispiel 1.

Ergebnis: DnaJ und GrpE hatten keinen positiven Einfluß auf die Löslichkeit der Telomerase, während DnaK einen geringen, aber reproduzierbar positiven Effekt hatte (Figur 4).

Beispiel 4: Ein Gemisch aus DnaK und DnaJ ist ausreichend

Ein Gemisch aus DnaK und DnaJ mit und ohne Zugabe von GrpE wurde wie in Beispiel 1 getestet.

Ergebnis: Das Gemisch aus DnaK und DnaJ hat den gleichen Effekt wie das Gesamtgemisch aus allen 3 Komponenten (Figur 5).

Beispiel 5: Einfluss von Helferproteinen des DnaK Systems auf die Aktivität des Grün fluoreszierenden Proteins (GFP)

Wüdtyp GFP wurde ohne den zur Faltung nötigen Sauerstoff analog zu Beispiel 4 exprimiert indem das Reaktionsgefäß aus dem RTS 500 Kit bis oben aufgefüllt wurde. Nach Beenden der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt in ein offenes Gefäß pipettiert und in Gegenwart von Luft-Sauerstoff für 24 Stunden im Kühlschrank gelagert. In dieser Zeit kann der korrekt gefaltete Anteü des GFP Proteins oxidieren und so den Fluorophor ausbüden. Die Aktivität des GFP Proteins wurde dann anhand der Fluoreszenz gemessen.

Ergebnis: Die Aktivität von GFP steigt durch Zugabe eines Gemisches aus DnaK und DnaJ (Figur 6).

Beispiel 6: Erhöhung der Synthesemenge von Telomerase in Abhängigkeit von der Zugabe von Helferproteinen

Analog zu Beispiel 4 wurden Mengen von je 1 μM, 2 μM und 3 μM der beiden Helferproteine DnaK und DnaJ in der Telomerase Expression eingesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden nun jedoch bei lOO.OOOxg für 30 min zentrifugiert und die Fraktionen im Westernblot analysiert.

Ergebnis: Während bei 1 μM des Gemisches noch 40 % unlöslicher Telomerase vorhanden war, sank der Anteü unlöslicher Telomerase bei 2 μM des Gemisches auf 8 % und bei 3 μM auf < 1 %.

Die Gesamtmenge an synthetisierter Telomerase stieg bei aUen Ansätzen mit Helferprotein deutlich an. Be dem Ansatz mit 3 μM DnaK/DnaJ war der Anstieg sogar mehr als 50 % (Figur 7).

Beispiel 7: Messung der Aktivität von rekonstituierter Telomerase in Abhängigkeit von Helferproteinen.

Telomerase wurde in Gegenwart von je 0 μM, 2 μM und 10 μM an DnaK und DnaJ exprimiert. Anschließend wurden die Ansätze mit der RNA Komponente rekonstituiert und ein Aktivitätstest mit dem Telo TAGGGG Telomerase PCR ELISA (Röche Diagnostics GmbH) angesetzt. Die Rekonstitution der Telomerase erfolgte nach der Prozedur von Weinrich S. L. et al. (1997) Nature Genet. 17, 498.

Als Negativkontrolle wurden die Helferproteine vor dem Einsatz in der in vitro Proteinsynthese zunächst für 30 min bei 70 °C hitzebehandelt. Tabelle 1:

Ergebnis: Mit Helferproteinen konnte die Aktivität im Vergleich zu dem Ansatz ohne Helferproteine um mehr als das zehnfache gesteigert werden. Die hitzebehandelten Helferproteine waren hingegen völlig inaktiv.

Beispiel 8: Herstellung von Helferprotein produzierenden Stämmen.

Der Stamm A19 und der Stamm Xl-Blue wurden mit Plasmiden (s. unter A.) transformiert, die entweder die Helferproteine aus dem DnaK/DnaJ/GrpE System oder aus dem GroEL/ES System hinter einem IPTG induzierbaren Promotor enthalten. Der Stamm A19 besitzt eine Mutation mit Rnase I Gen, während der Stamm Xl-Blue eine Defizienz in Protease-Genen besitzt.

Die transformierten ZeUen wurden auf LB Medium angezüchtet und bei einer optischen Dichte von 1,0 gemessen bei 600 nm Wellenlänge für 30 min mit IPTG (Endkonzentration bis zu 1 mM) induziert.

Aus diesen Bakterien wurde ein Lysat für die in vitro Translation entsprechend der Prozedur von Zu- bay G ( 1973) Annu Rev. Genet. 7, 267 hergestellt. Nach Auftrennung der Lysate auf SDS-Gelen und Anfärbung mit Coomassie Brüliant Blue konnte gezeigt werden, dass alle transformierten Stämme je- weüs die entsprechenden Proteine aus dem DnaK/DnaJ/GrpE System oder dem GroEL/ES System exprimieren.

Beispiel 9a: Einsatz von Lysaten aus den Zellen transformiert mit dem DnaK/DnaJ/GrpE System

Die Lysate aus den Zellen transformiert mit dem DnaK/DnaJ/GrpE System wurden anschließend zur in vitro Translation mit dem Telomerase Gen eingesetzt. Im Vergleich dazu wurden die Lysate aus den untransformierten Stämmen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass mit dem Lysat aus dem IPTG induzierten transformierten Stämmen im Gegensatz zu dem untransformierten Stämmen zu 100% lösliche Telomerase exprimiert werden konnte (Figur 8).

Beispiel 9b:

Es konnte gezeigt werden, dass mit dem Lysat aus dem IPTG induzierten transformierten Stämmen im Gegensatz zu dem untransformierten Stämmen zu 100% lösliche Telomerase exprimiert werden konnte.

Ergebnis: Bereits 25 % des Helferprotein enthaltenden Lysates reicht aus, um die Löslichkeit der Telomerase auf 90 % zu erhöhen. Mit 50 % dieses Lysates entsteht vollkommen lösliche Telomerase (Figur 9).

Beispiel 9c: Einsatz von Lysaten, präpariert aus den Zellen, welche mit pREP4-groESL transformiert wurden

In einem bakterieUen in vitro Expressionssystem (Rapid Translation System RTS 500 E. coli HY Kit, Röche Diagnostics GmbH) wurde bovine Rhodanese durch Verwendung des pINEX2.4-Rhodanese- Plasmids exprimiert (24 h, 30°C), wobei die Expression einmal ohne Zugabe von transformiertem Lysat (Bedingungen wie in der Produktbeschreibung des Herstellers angegeben), das andere Mal unter Zugabe von 50% eines Lysates (aus ZeUen, welche mit pREP4-groESL-Plasmid transformiert worden waren und durch Inkubation GroEL und GroES überexprimiert hatten) durchgeführt wurde. Die Reaktionsgemische wurden anschließend für 5 Min. bei 10.000 xg zentrifügiert, das resultierende Pellet und der Überstand in SDS-Probenpuffer aufgenommen, auf einem SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie-Blue angefärbt (s. Figur 10).

Ergebnis: Bereits 50 % des Helferprotein enthaltenden Lysates reicht aus, um die LösUchkeit der Rhodanese auf 90 % zu erhöhen.

Anschließend wurde untersucht, ob durch die Verwendung des GroEL/ES enthaltenden Lysates neben der Löslichkeit auch die Aktivität der exprimierten Rhodanese verbessert werden konnte, wobei die Enzym-Aktivität der beiden vorangegangenen Reaktionen nach der Methode von Weber, F. und Hager-Hartl, M. (Methode Mol. Biol. (2000), 140, 117) bestimmt wurde. Ergebnis: Auch die Aktivität der Rhodanese steigt mit der Zugabe des Helferprotein (GroEL/ES) enthaltenden Lysates signifikant an (s. Figur 11.)

Claims

Patentansprüche

1. Nerfahren zur HersteUung eines Lysates enthaltend Helferproteine, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, transformiert wird mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene, daß die Helferproteine in diesem Stamm exprimiert werden und daß das Lysat enthaltend Helferproteine aus diesen Stämmen gewonnen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm mit verschiedenen Vektoren transformiert wurde, wobei sich die Vektoren mindestens darin unterscheiden, daß die darin enthaltenen Gene für unterschiedliche Helferproteine kodieren.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 wobei der Stamm zusätzlich wenigstens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: RΝAse-arm oder -defizient, ExonuWease-arm oder - defizient, Protease-arm oder defizient.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lysat in der Weise gewonnen wird, daß zusätzlich aUe Komponenten in dem Lysat enthalten sind, welche für eine in vitro Translation oder für eine in vitro Transkription/Translation erforderlich sind.

5. Lysat enthaltend Helferproteine erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Lysat gemäß Anspruch 5 wobei mindestens zwei verschiedene Helferproteine enthalten sind,

7. Lysat gemäß Anspruch 5 enthaltend im wesentlichen ein Helferprotein.

8. Lysat gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 wobei die Helferproteine ausgewählt werden aus der folgenden Gruppe:

- Helferproteine des Dnak Systems (DnaK, DnaJ und/oder GrpE)

- Helferproteine des GroE-Systems (GroEL, GroES) Chaperonine Proteindisulfidisomerase,

Trigger-Faktor und - Prolyl-cis-trans Isomerase.

9. Verschnitt aus verschiedenen Lysaten gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8.

10. Verschnitt aus einem oder mehreren Lysaten gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 mit einem Lysat enthaltend alle Komponenten, welche für eine in vitro Translation oder für eine in vitro Transkription/Translation erforderlich sind.

11. Stamm, welcher geeignet ist für die Gewinnung von in vitro Translations-Lysaten, der mit einem Vektor enthaltend ein oder mehrere für ein oder mehrere Helferproteine kodierende Gene transformiert wurde.

12. Verwendung eines Lysates gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder einem Verschnitt gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 bei der in vitro Translation bzw. zur in vitro Transkription/Translation.

13. Verwendung eines Lysates gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder einem Verschnitt gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 bei der in vitro Translation bzw. in vitro Transkription von Telomerase.

14. Verwendung eines Lysates gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder einem Verschnitt gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 in einem CECF oder CFCF Reaktor.

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