JP2018525983A

JP2018525983A - ゲノム編集システムおよび使用方法

Info

Publication number: JP2018525983A
Application number: JP2018503753A
Authority: JP
Inventors: バオ、カイ; マドリード、スーザン・マンプスティ; シュミット、ブライアン・エフ
Original assignee: ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2018-09-13
Anticipated expiration: 2036-07-28
Also published as: CN107849562B; WO2017019867A1; JP6937740B2; CN107849562A; US20180208945A1; EP3329001B1; EP3329001A1; DK3329001T3

Abstract

糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でのゲノム編集のための組成物および方法が提供される。本開示の方法および組成物は、真菌細胞のゲノム遺伝子座に対するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムおよびより短い相同性アーム（すなわち、５００ｂｐ未満）を有するドナーポリヌクレオチドに関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６２／１９８，０４９号明細書（２０１５年７月２８日に出願されている）に対する優先権を主張する。

配列表
ＥＦＳを介して添付して提出した配列表テキストファイルには、２０１６年７月２７日に作成したファイル「ＮＢ４０９７２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」（２２キロバイトのサイズである）が含まれている。配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に従い、全体が参照により本明細書に援用される。

本開示は、一般に、分子生物学、遺伝学、生化学、ゲノム編集および糸状真菌の分野に関する。ある特定の実施形態では、本開示は、微生物細胞中での相同組換えのための組成物およびこの方法ならびにこのような方法により誘導されている微生物細胞を対象とする。その他の実施形態では、本開示は、微生物細胞のゲノムを編集するための組成物およびこの方法を対象とする。

ゲノムＤＮＡ中における特定の標的部位での切断の誘導を使用して、この標的部位でまたはこの標的部位付近で改変を導入することができることは公知である。例えば、遺伝子ターゲティングのための相同組換えは、標的とするＤＮＡ部位が二本鎖切断を含む場合に増強されることが分かっている（例えばＲｕｄｉｎｅｔａｌ．，１９８９；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．を参照されたい）。

Ｃａｓシステムの部位特異的性質を前提して、例えば哺乳動物細胞中での、このシステムに基づくゲノム改変／操作技術が説明されている（例えばＨｓｕｅｔａｌ．２０１４を参照されたい）。Ｃａｓベースのゲノム操作は、意図したとおりに機能する場合、ｃｒＲＮＡのＤＮＡターゲティング領域（すなわち、可変ターゲティングドメイン）がゲノム中の所望の標的部位に対して相同である組換えｃｒＲＮＡ（または同等に機能するポリヌクレオチド）を設計し、この組換えｃｒＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを宿主細胞中で（あらゆる好都合なおよび従来の手段によって）機能的複合体へと組み合わせることにより、複雑なゲノム内での任意の特定の位置を事実上標的とする能力を付与する。

Ｃａｓベースのゲノム操作技術が多くの異なる宿主細胞型に、更には糸状真菌細胞に適用されているが（例えばＬｉｕｅｔａｌ．，２０１５を参照されたい）、これらの技術は公知の制限を有する。例えば、遺伝子編集の効率は株依存的であり、一般に、複数の分子操作工程がドナーＤＮＡ構築等に必要とされる。

従って、微生物細胞中でゲノム標的部位を改変するための／変更するためのより効果的で効率的な、またはそうでなければより頑強もしくはフレキシブルなＣａｓベースのゲノム操作法およびこの組成物を開発することが依然として必要とされている。

本開示は、一般に、糸状真菌細胞のゲノムを編集する方法を対象とする。より特定すると、ある特定の実施形態では、本開示は、糸状真菌細胞中でゲノム編集する方法であって、糸状真菌細胞中にＣａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドポリヌクレオチドと、ドナーポリヌクレオチドとを導入することであって、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１個の相同性アームを含み、相同性アームは、５００個未満のヌクレオチドの長さであり、真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座に対する配列相同性を含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座でまたはこのゲノム遺伝子座付近で作用することを可能とする複合体を形成する、導入することを含む方法を対象とする。ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座中に挿入される（取り込まれる）。

ある特定のその他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同性アームの上流（５’）に存在し、それに作動可能に連結されており、または相同性アームの下流（３’）に存在し、それに作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列を更に含む。目的のヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド等を含み得る。その他の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、一般に、５個以上のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、相同性アームは、３５０個未満のヌクレオチドの長さである。その他の実施形態では、相同性アームは、１５０個未満のヌクレオチドの長さである。ある特定のその他の実施形態では、相同性アームは、１００〜４０個のヌクレオチドの長さである。

ある特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座中に挿入される（取り込まれる）。その他の実施形態では、挿入されるドナー核酸またはポリヌクレオチドにより、ＤＮＡ欠失、ＤＮＡ破壊、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ反転、ＤＮＡ点変異、ＤＮＡ置換、ＤＮＡノックイン、ＤＮＡノックアウトおよびＤＮＡノックダウンからなる群から選択されるゲノム改変が生じる。

更にその他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列の上流（５’）に存在し、それに作動可能に連結されている相同性アームおよび同一の目的のヌクレオチド配列の下流（３’）に存在し、それに作動可能に連結されている相同性アームを含み、２つの相同性アームの少なくとも１個は、５００個未満のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座中に挿入される。ある特定の実施形態では、少なくとも１個の相同性アームは、３５０個未満のヌクレオチドの長さである。ある特定のその他の実施形態では、少なくとも１個の相同性アームは、１５０個未満のヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、少なくとも１個の相同性アームは、１００〜４０個のヌクレオチドの長さである。その他の実施形態では、両方の相同性アームは、５００個未満のヌクレオチドである。ある特定のその他の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、少なくとも１個の異種ヌクレオチドを含む。更にその他の実施形態では、目的ヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列を含む。

その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓニッカーゼまたはこの機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｎｔ）である。特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの機能的変異体である。その他の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される属に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。

その他の実施形態では、導入工程は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（またはこの機能的変異体）を真菌細胞中で発現させるための発現カセットを含むポリヌクレオチド構築物を導入することを含む。別の実施形態では、導入工程は、ガイドポリヌクレオチドを真菌細胞中で発現させるための発現カセットを含むポリヌクレオチド構築物を導入することを含む。別の実施形態では、導入工程は、真菌細胞中に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセット、ガイドＲＮＡ用の発現カセット、およびドナーＤＮＡを含む環状ポリヌクレオチド構築物を導入することを含む。別の実施形態では、導入工程は、ガイドポリヌクレオチドまたはＣａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞中に直接導入することを含む。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（またはこの機能的変異体）は、核局在化シグナルに作動可能に連結されている。

その他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡである。ある特定のその他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡである。

その他の実施形態では、糸状真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる属から選択される。

本開示のその他の実施形態は、本明細書で開示する方法および組成物により製造されている組換え糸状真菌細胞を対象とする。

ｐｙｒ４遺伝子座中への１９ヌクレオチドの挿入配列（ＴＳ２）を有する１００ｍｅｒの一本鎖ドナーテンプレートを示す図である。図１Ａ：ｐｙｒ４ゲノム遺伝子座標的部位２（ＴＳ２）の概略図。１Ｆおよび１Ｒ、ＭＨ１７９および１８０は、分析に使用されるＰＣＲプライマーである。１００塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ドナーテンプレートである。図１Ｂ：一本鎖ドナーＤＮＡの１００ｎｔの上側鎖（ｕｐｐｅｒｓｔｒａｎｄ）。１９ｎｔの挿入配列は、ｐｙｒ４遺伝子座中の機能損失変異を生じさせる３個の異なるリーディングフレーム中で２個の制限部位（Ｐｍｅ１、Ｐａｃ１）および終止コドン（ＴＡＡ）を生じさせるだろう。図１Ｃ：相同組換え用のドナーテンプレート：１００塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド：１Ｃ−１、１００ｎｔの上側鎖、および１Ｃ−２、１００ｎｔの下側鎖（ｌｏｗｅｒｓｔｒａｎｄ）配列（標的部位に対する相補鎖）。１００塩基の一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用する相同組換え修復およびゲノム編集の効率を示す図である。図２Ａ：ＰＣＲ増幅は、プライマー１Ｆおよび１Ｒ、配列番号１２および１３を使用してＦＯＡ耐性コロニーから抽出されたＤＮＡに対して実行した。１．２ｋｂの産物が生じるｐｙｒ４遺伝子中の標的部位ＴＳ２にわたるＰＣＲ増幅。図２Ｂ：ＰＣＲ産物の制限消化は、Ｐａｃ１の存在を示した。図２Ｃ：ＰＣＲ産物の制限消化は、Ｐｍｅ１の存在を示した。２００塩基の一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用する相同組換え修復およびゲノム編集の効率を示す図である。図３Ａ：２００塩基の一本鎖ＤＮＡテンプレートの配列。図３Ｂ：ＰＣＲ増幅は、プライマー１Ｆおよび１Ｒ、配列番号１２および１３を使用してＦＯＡ耐性コロニーから抽出されたＤＮＡに対して実行した。１．２ｋｂの産物が生じるｐｙｒ４遺伝子中の標的部位ＴＳ２にわたるＰＣＲ増幅。図３Ｃ：ＰＣＲ産物の制限消化は、Ｐａｃ１の存在を示した。野生型ｐｙｒ４遺伝子と、１００（Ａ）および２００（Ｂ）塩基の一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用するＣａｓ９媒介型相同組換え修復を示すＦＯＡ耐性株に由来するｐｙｒ４遺伝子との配列アラインメントを示す図である。挿入コドンおよび隣接相同性アームを有する二本鎖ＤＮＡテンプレートの配列を示す図である。挿入コドンおよび隣接相同性アームを有する二本鎖ＤＮＡテンプレートの配列を示す図である。長さ７３０ｂｐの二本鎖ＤＮＡドナー修復テンプレートを示す図である。図６Ａ：７３０ｂｐの二本鎖ＤＮＡを示す概略図。図６Ｂ：ＦＯＡ耐性コロニーのゲノムＤＮＡに由来するプライマー（配列番号１４および１５）を使用するＴＳ２にわたるｐｙｒ４遺伝子座のＰＣＲ増幅。図６Ｃ：ＰａｃＩを使用することによるＰＣＲ産物の制限酵素消化。長さ１１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡドナー修復テンプレートを示す図である。図７Ａ：１１００ｂｐのｄｓＤＮＡを示す概略図。図７Ｂ：ＦＯＡ耐性コロニーのゲノムＤＮＡに由来するプライマー（配列番号１４および１５）を使用するＴＳ２にわたるｐｙｒ４遺伝子座のＰＣＲ増幅。図７Ｃ：ＰａｃＩを使用することによるＰＣＲ産物の制限酵素消化。ｐＳＢ−ＳｐｙＣａｓ９発現ベクターを示す図である。高レベルのＣａｓ９の産生を示す、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｔｂｉｌｉｓ）中の細胞内で発現させたＣａｓ９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。図９Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタンブロットを示す。図９Ｂは、実施例８によるクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＭＩＢ遺伝子のＣａｓ９媒介型標的化破壊に使用される単一プラスミド中の２ｋｂの相同性アーム、Ｃａｓ９遺伝子、およびガイドＲＮＡを示す、実施例１０による発現カセットを示す図である。単一プラスミド中のＣａｓ９遺伝子、ガイドＲＮＡを示すが、ＭＩＢ遺伝子の標的化破壊用の２ｋｂの相同性アームを有さない発現カセットを示す図である。相同性アームの欠落は、実施例１０の説明による相同組換え用のドナーとしてのｕｌｔｒａｍｅｒの使用を可能とした。

概要
ある特定の実施形態では、本開示は、微生物細胞中での効率的な相同組換えのための方法およびこの組成物に関する。ある特定のその他の実施形態では、本開示は、微生物細胞中でゲノム編集する方法およびこの組成物を対象とする。その他の実施形態では、本開示は、本開示のこのような方法および組成物により作製された微生物細胞に関する。

略語および頭字語
以下の略語／頭字語は、別途指定しない限り、以下の意味を有する：
ｃＤＮＡ相補的ＤＮＡ
ＤＮＡデオキシリボ核酸
ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸
ｋＤａキロダルトン
ＭＷ分子量
ＰＥＧポリエチレングリコール
ｐｐｍ百万分率、例えば、乾燥固体１グラム当たりのμｇタンパク質
ＲＮＡリボ核酸
ＳＤＳ−ＰＡＧＥドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓｐ．種
Ｔｍ融解温度
ｗ／ｖ重量／体積
ｗ／ｗ重量／重量
℃ 摂氏度
Ｈ_２Ｏ水
ｇまたはｇｍグラム
μｇマイクログラム
ｍｇミリグラム
ｋｇキログラム
μＬおよびμｌマイクロリットル
ｍＬおよびｍｌミリリットル
ｍｍミリメートル
μｍマイクロメートル
Ｍモル濃度
ｍＭミリモル濃度
μＭマイクロモル濃度
Ｕ単位
ｓｅｃ秒
ｍｉｎ（ｓ）分（ｍｉｎｕｔｅ）／分（ｍｉｎｕｔｅｓ）
ｈｒ（ｓ）時間（ｈｏｕｒ）／時間（ｈｏｕｒｓ）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ＨＥＰＥＳ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＣＶカラム体積

定義
本組成物および方法を記載する前に、以下の用語および語句を定義する。本明細書に定義されていない用語は、当分野で公知および使用されるこれらの通常の意味に従うべきである。

ある範囲の値が記載されている場合、この範囲の上限と下限との間に介在する各値（別途文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで）ならびにこの言及した範囲中におけるあらゆるその他の言及した値または間に介在する値が本組成物および本方法に包含されることが理解される。言及した範囲における任意の特定の除外された限度を条件として、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲にふくまれ得、本組成物および本方法にも包含され得る。言及した範囲が一方のまたは両方の限度を含む場合、これらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本組成物および本方法に含まれる。

本明細書では、ある特定の範囲が用語「約」に先行される数値で示される。用語「約」は本明細書において、この用語が先行する正確な数およびこの用語が先行する近いまたは近似的な数である数を文字通り補強するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近い数または近似的な数であるかどうかの判定では、列挙されていない近いまたは近似的な数は、この数が示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、この数値の−１０％〜＋１０％の範囲を意味する。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を意味する。

本明細書に記載した見出しは、本明細書全体の参照により有することができる本組成物および本方法の様々な態様または実施形態を限定するものではない。従って、真下で定義する用語は、本明細書全体の参照により更に完全に定義される。

本文書は、読みやすくするために多くの節に分かれているが、読者は、ある節での記載をその他の節に適用することができることを認識するだろう。このように、本開示の様々な節に使用される見出しは限定的に解釈されるべきではない。

別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本組成物および本方法が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本組成物および本方法の実施または試験では、本明細書で説明するものと類似のまたは等価のあらゆる方法および材料も使用することができるが、代表例の方法および材料をこれより説明する。

本明細書で引用する全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により援用されると具体的におよび個々に示されたかのように参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示するためにおよび説明するために参照により本明細書に援用される。引用したあらゆる刊行物はその開示が本出願日前であるが、本組成物および本方法が先行の開示によりそのような刊行物に先行する権利がないということを認めると解釈すべきはない。更に、記載されている公開日は、個々に確認する必要があるであろう実際の公開日とは異なる場合がある。

この詳細な説明に従って、下記の略語および定義を適用する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。そのため、例えば「酵素」への言及には複数のそのような酵素が含まれ、「投与量」への言及には、１回または複数回の投与量および当業者に既知のこの等量等への言及が含まれる。

あらゆる任意選択的な要素を除外するように特許請求の範囲を作成することができることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙または「消極的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用に関連して「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」「含まない（ｎｏｔｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「除外する（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」および同類のもののような排他的な用語を使用するための先行する根拠として機能することが意図されている。

用語「本質的に〜からなる」は、本明細書で使用する場合、この用語の後の成分が総組成物の３０重量％未満の総量で他の公知の成分の存在下で存在し、この成分の作用または活性に寄与も干渉もしない組成物を意味することに更に留意されたい。

用語「含む」は、本明細書で使用する場合、限定されないが、用語「含む」の後の成分を含むことを意味することに更に留意されたい。用語「含む」の後の成分は必要とされ、または必須であるが、この成分を含む組成物は、その他の非必須または任意選択の成分を更に含み得る。

用語「からなる」は、本明細書で使用する場合、用語「からなる」の後の成分を含み、限定されることを意味することにも留意されたい。従って、用語「からなる」の後の成分は必要とされ、または必須であり、その他の成分はその組成物中に存在しない。

本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で説明されているおよび示されている個々の実施形態はそれぞれ、個別の成分と、本明細書で説明する本組成物および本方法の範囲および趣旨から逸脱することなくその他のいくつかの実施形態の内のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたはこの特徴と容易に組み合わされ得る特徴とを有する。任意の列挙された方法を、列挙した事象の順序でまたは論理的に可能であるあらゆるその他の順序で実行することができる。

本明細書で使用する場合、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドに関し、Ｃａｓポリペプチドは、１種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的ＤＮＡ配列を切断することができる（例えば米国特許第８，６９７，３５９号明細書を参照されたい）。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体もこの定義に含まれる。本明細書で詳述するドナーＤＮＡ挿入方法で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドによりガイドされて、二本鎖ＤＮＡ中の特異的標的部位を（例えば、細胞のゲノム中の標的部位で）認識および切断する。

用語「ゲノム編集」は、本明細書で使用する場合、人工的に操作されたヌクレアーゼまたは「分子はさみ」を使用してＤＮＡが挿入され、置き換えられ、またはゲノムから除去される遺伝子操作の一類型である。これは、配列特異的な遺伝子またはタンパク質の機能および効果を解明するための有用なツールである。

本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することできるおよびＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識して切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関する。このガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であることができる。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であることができる。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは「ガイドＲＮＡ」とも称される。

このガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも称される）であることができる。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の別々の分子を含む。この２個の別々の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができる。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。一実施形態では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはより多くのヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。

ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチドドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む単分子であることもできる。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができるヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。本開示の一実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。

二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して単一ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、標的細胞中で単一ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。

ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば本明細書で説明する改変を参照されたい）またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。

単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドの長さであることができる。別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定されないがＧＡＡＡテトラループ配列等のテトラループ配列を含むことができる。

ガイドポリヌクレオチド、および／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変を、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用のまたはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更および細胞透過性の増加の群から選択される。

本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」（および等価物）には、ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断を誘導することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチド（単一または二重）との複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の極めて近くでＤＮＡ二本鎖をほどき、ガイドＲＮＡによる標的配列の認識時に両方のＤＮＡ鎖を切断するが、但し、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端で適切に配向されている場合に限られる。

本明細書で使用する場合、用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、「機能的に等価な断片」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの一部または部分配列を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的断片は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的断片は親ポリペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。

関連して、用語「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」、「機能的に等価な変異体」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの変異体を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的変異体は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的変異体は親ペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。

断片および変異体を、部位特異的な変異誘発および合成構築等のあらゆる好都合な方法により得ることができる。

本明細書で使用する場合、「コドン改変遺伝子」または「コドン優先（ｃｏｄｏｎ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子および変異遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、従って、これに関して制限は意図されていない。

本明細書で使用する場合、「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「制御配列」は、コーディング配列の上流（５’−非コーディング配列）、コーディング配列内またはコーディング配列の下流（３’−非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を意味しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができるがこれらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は近位のおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントであってもよいしプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもいし天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、および／または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができることが当業者に理解される。ほとんどの場合では制御配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが更に認識される。当分野で公知であるように、プロモーターを、このプロモーターの強度および／またはこのプロモーターが活性である条件に従って、例えば構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性／抑制性プロモーター、組織特異的に／発達的に制御されるプロモーター、細胞周期依存性プロモーター等に分類することができる。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を意味する。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であるおよび逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むおよび細胞内でまたはｉｎｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であるおよびある特定の条件下で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列）との相補性であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを意味する。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。

本明細書で使用する場合、用語「機能的に付着している」または「作動可能に連結されている」は、既知のまたは所望の活性を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の制御領域または機能的ドメイン（例えばプロモーター、エンハンサー領域、ターミネーター、シグナル配列、エピトープタグ等）が、この既知のまたは所望の活性に従って、制御領域または機能的ドメインが標的（例えば遺伝子またはポリペプチド）の発現、分泌または機能を制御することを可能にするような様式でこの標的に付着しているまたは連結されていることを意味する。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現を制御することができる場合には、このコーディング配列に作動可能に連結されている（即ち、このコーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）。

本明細書で使用される場合、用語「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなり、当分野で公知である。

本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、生物学的な成分または組成物（例えば細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクター等）に関して使用される場合、この生物学的な成分または組成物が天然では見出されない状態にあることを示す。換言すると、この生物学的な成分または組成物は、ヒトの介入により天然の状態から改変されている。例えば、組換え細胞には、天然の親（即ち非組換え）細胞中で見出されない１種もしくは複数種の遺伝子を発現する細胞、天然の親細胞とは異なる量で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞、および／または天然の親細胞とは異なる条件下で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞が包含される。組換え核酸は、１個もしくは複数個のヌクレオチドで天然配列と異なり得る、異種配列（例えば異種プロモーター、非天然のもしくは変異のシグナル配列をコードする配列等）に作動可能に連結され得る、イントロン配列を欠くことができる、および／または単離型であり得る。組換えポリペプチド／酵素は、１個もしくは複数個のアミノ酸で天然配列と異なり得る、異種配列と融合され得る、トランケートされ得る、もしくはアミノ酸の内部欠失を有し得る、天然細胞中では見出されない様式で発現され得る（例えば、このポリペプチドをコードする発現ベクターの細胞中の存在に起因して、このポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から発現され得る）、および／または単離型であり得る。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチド／酵素は、野生型対応物と同一であるが非天然型（例えば単離型または富化型）である配列を有することが強調される。

本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、目的のポリヌクレオチド配列（例えば、細胞中で発現させる目的の遺伝子）を担持する染色体外エレメント（「発現ベクター」または「発現カセット」）を意味する。そのようなエレメントは概して、二本鎖ＤＮＡの形態であり、多くのヌクレオチド配列が連結されているまたは目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に組み換えられている（任意の起源に由来する）一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの（線状のまたは環状の）自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞中で発現させようとするポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする遺伝子であることができる。発現カセット／ベクターは概して遺伝子を含み、この遺伝子は、この遺伝子の宿主細胞中での発現を可能にするエレメントに作動可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかでの機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を意味する。

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への挿入（例えば組換えＤＮＡ構築物／発現構築物）に関する用語「導入される」は、そのような課題を実施するためのあらゆる方法を意味しており、所望の生体分子の導入を達成するための「遺伝子導入」、「形質転換」、「形質導入」、物理的手段または同類のものの内のいずれかの手段を含む。

「一時的に導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）」、「一時的に導入される（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」、「一時的導入」、「一時的に発現する」および同類のものは、非永続的な方法で生体分子が宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入されることを意味する。二本鎖ＤＮＡに関して、一時的導入として、導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれず、そのため増殖中に全ての娘細胞に伝達されない状況と、導入されたＤＮＡ分子（染色体に組み込まれている可能性がある）が、あらゆる好都合な方法を使用して（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて、エピソームＤＮＡ構築物に関する陽性選択圧を除去することにより、選択培地を使用して染色体からの組込みポリヌクレオチドの全てまたは一部のループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇｏｕｔ）を促進することにより等）所望の時間で除去される状況とが挙げられる。これに関して制限は意図されていない。一般に、ＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボザイム等）またはポリペプチド（例えばＣａｓポリペプチド）の宿主細胞への導入は、この生体分子が複製されず、細胞増殖中に娘細胞に不確定に伝えられるという点で一時的と考えられる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体に関して、一時的導入は、標的とされたＣａｓエンドヌクレアーゼ活性を発揮するために両方の生体分子が必要とされることから、いずれかの成分が一時的に導入される状況をカバーする。そのため、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の一時的導入として、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの内のいずれか一方または両方が一時的に導入される実施形態が挙げられる。例えば、ガイドＲＮＡが一時的に導入される、ゲノムに組み込まれたＣａｓエンドヌクレアーゼ用発現カセット（そのため導入は一時的でなはない）を有する宿主細胞は、一時的に導入されたＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体（またはシステム）を有すると言うことができ、なぜならば、この機能的複合体は一時的に宿主細胞中に存在するからである。

本明細書で使用される場合、用語「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチド）を意味する。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在している）を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るがこれに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「真菌細胞」、「真菌」、「真菌宿主細胞」および同類のものは、本明細書で使用する場合、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５により定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５）および全ての栄養胞子形成（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５）とを含む。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、用語「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓｙｅａｓｔ）、および不完全菌（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を意味する。従って、酵母宿主細胞として、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞が挙げられる。酵母の種として、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「糸状真菌細胞」は、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態を含む。糸状真菌属の適切な細胞として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビィエルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、ケリポリオプシシ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、カエルトミウム（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミケス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スキタルジウム（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミケス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。

糸状真菌種の適切な細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ブエルカンデラ・アデュスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、コプリヌス・キネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ミケリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ネウロスポラ・インテルメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアーテ（Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔｅ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロミケス・フラブス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｕｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「標的部位」、「標的配列」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」（および等価物）は本明細書において互換的に使用され、ゲノム改変（例えばドナーＤＮＡの挿入およびその後の目的のゲノム領域の欠失）を促進するためにＣａｓエンドヌクレアーゼ切断が望ましい真菌細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、この用語が使用される文脈では、この用語の意味がわずかに変更され得る。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の標的部位は一般に非常に特異的であり、正確なヌクレオチド位置に定義され得ることが多いが、ある場合では、所望のゲノム改変用の標的部位は、ＤＮＡ切断が起こる部位のみと比べて広く定義され得る（例えばゲノムから欠失されるゲノム遺伝子座または領域）。そのため、ある特定の場合（Ｃａｓ／ガイドＲＮＡの活性により起こるゲノム改変）では、ＤＮＡ切断が「標的部位でまたは標的部位付近で」起こると説明される。標的部位は真菌細胞ゲノム中の内在性部位であり得る、或いは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、または標的部位を、天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。

本明細書で使用する場合、用語「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドも含むことができる。そのため、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含む。ヌクレオチド（通常は５’−モノフォスフェート形態で見出される）は下記のように一文字記号で言及される：アデノシンまたはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）の場合の「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンの場合の「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンの場合の「Ｇ」、ウリジンの場合の「Ｕ」、デオキシチミジンの場合の「Ｔ」、プリンの場合の「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンの場合の「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴの場合の「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴの場合の「Ｈ」、イノシンの場合の「Ｉ」およびあらゆるヌクレオチドの場合の「Ｎ」。

本明細書で使用する場合、用語「に由来する」は、用語「を起源とする」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」および「から生成される」を包含しており、別の特定の材料中に起源が見出されるまたは別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有するある特定の材料を一般に示す。

本明細書で使用する場合、少なくとも２種の核酸またはポリペプチドの文脈における用語「実質的に類似」または「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、親配列もしくは参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは更に少なくとも９９％同一である配列を含むこと、または機能性を付加することなく本明細書を回避するためにのみ行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失もしくは修飾を含まないことを意味する。

本明細書で使用する場合、核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を意味しており、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列を最適にアラインさせるために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ちギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。配列同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。この同一性を、本明細書で説明するプログラムのいずれかを使用して決定することができる。

配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは類似性計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるだろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化された場合にソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味することができる。

本明細書で使用する場合、用語「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌＶ方法」は、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，１９９２）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用のおよび同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝４である。ＣｌｕｓｔａｌＶプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。

本明細書で使用する場合、用語「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌＷ方法」は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，１９９２）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤｅｌａｙＤｉｖｅｒｇｅｎＳｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡＴｒａｎｓｉｔｉｏｎＷｅｉｇｈｔ＝０．５、ＰｒｏｔｅｉｎＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＧｏｎｎｅｔＳｅｒｉｅｓ、ＤＮＡＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。

別途述べない限り、本明細書で提供される配列の同一性／類似性の値は、下記のパラメータを使用するＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を意味する：ギャップ生成ペナルティの重み（ｐｅｎａｌｔｙｗｅｉｇｈｔ）５０、ギャップ長伸長ペナルティの重み３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列に関する同一性％および類似性％；ＧＡＰ生成ペナルティの重み８およびギャップ長伸長ペナルティの重み２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９）を使用するアミノ酸配列に関する同一性％および類似性％。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，（１９７０）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化するおよびギャップの数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。

多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の同定で有用であることが当業者に理解されるだろう。同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性は本開示の説明に有用であり得、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、機能的分子（限定されないが、例えば特定のポリペプチド（例えば酵素）または機能的ＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等））をコードし、または発現させることができ、このコーディング配列に先行する制御配列（５’−非コーディング配列）および／または後続する制御配列（３’−非コーディング配列）を含む核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列と共に天然で見出される遺伝子を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「変異遺伝子」とは、人の介入により変更されている遺伝子のことである。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失または置換により、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異真菌細胞とは、変異遺伝子を含む真菌細胞のことである。

本明細書で使用する場合、用語「標的型変異」は、本明細書で開示するまたは当業者に既知である標的配列のＤＮＡ中で二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することにより行われた天然遺伝子中の変異のことである。

用語「ポリヌクレオチド改変テンプレート」は、編集すべきヌクレオチド配列と比較して少なくとも１個のヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド改変として、例えば、（ｉ）少なくとも１個のヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１個のヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組合せを挙げることができる。任意選択で、ポリヌクレオチド改変テンプレートは、少なくとも１個のヌクレオチド改変に隣接する相同ヌクレオチド配列を更に含み得、隣接相同ヌクレオチド配列は、編集すべき所望のヌクレオチド配列との十分な相同性を提供する。あるいは、隣接相同配列は、本明細書で「相同性アーム」と称される。

本明細書で使用する場合、用語「ドナーＤＮＡ」、「ドナー核酸配列」および「ドナーポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位中に（すなわち、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体の活性と同時に）挿入すべき「目的のポリヌクレオチド」を含むポリヌクレオチド改変テンプレートを意味する。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、目的のポリヌクレオチドに隣接する少なくとも１個の相同性領域（「相同性アーム」）を含む（すなわち、相同性アームは、目的のポリヌクレオチドの上流（５’）または下流（３’）に存在する）。従って、ある特定の実施形態では、少なくとも１個の相同性アームを含むドナーＤＮＡ構築物は、真菌細胞ゲノムの（Ｃａｓ）標的部位中に存在し、またはこの標的部位に隣接するゲノム領域に対する相同性を共有する。その他の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、目的のポリヌクレオチドに隣接する上流（５’）相同性アームおよび下流（３’）相同性アームの両方を含む。従って、本開示のその他の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、目的のポリヌクレオチドの上流（５’）に存在し、それに作動可能に連結されている第１の相同性アームおよび目的のポリヌクレオチドの下流（３’）に存在し、それに作動可能に結合されている第２の相同性アームを含む。ドナーＤＮＡ構築物の第１の相同性アームおよび第２の相同性アームは、真菌細胞ゲノムの（Ｃａｓ）標的部位の第１のゲノム領域および第２のゲノム領域に対する相同性をそれぞれ共有する。従って、特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ（またはポリヌクレオチド改変テンプレート）は、標的部位での配列に対して異種である目的のポリヌクレオチド配列（または目的の塩基対）により離隔された２つの相同配列（すなわち、５’および３’相同性アーム）を含む。ゲノム標的領域と２個のドナーＤＮＡ相同性アームとの間の相同組換えにより、典型的には、この標的部位での配列の編集が生じる。

「相同」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム配列に対する相同領域」とは、真菌細胞ゲノムの所与の「ゲノム配列」と類似する配列を有するＤＮＡの領域のことである。まとめると、本明細書では、ゲノム遺伝子座中のゲノム配列に対して相同な配列およびゲノム配列自体が「反復配列」と称される場合がある。相同領域は、反復配列と相同なゲノム配列（選択培養条件下で選択され得る）との間の相同組換えによりループアウト標的領域のループアウトを促進するのに十分である任意の長さであることができる。

例えば、反復配列（相同性アーム）は、少なくとも５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１１００、５０〜１２００、５０〜１３００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１６００、５０〜１７００、５０〜１８００、５０〜１９００、５０〜２０００、５０〜２１００、５０〜２２００、５０〜２３００、５０〜２４００、５０〜２５００、５０〜２６００、５０〜２７００、５０〜２８００、５０〜２９００、５０〜３０００、５０〜３１００個またはより多くの塩基の長さを含むことができる。「十分な相同性」は、２種のポリヌクレオチド配列（例えばドナーＤＮＡ中のおよび真菌細胞のゲノム中の直接反復配列）が、例えば適切な選択培養条件下で、反復配列間において配列をループアウトさせるのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性として、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とが挙げられる。配列類似性を、少なくとも１つの配列の全長にわたる配列同一性パーセントで、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチド等の局在化した類似性を含む保存領域および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。

本明細書で使用する場合、用語「ゲノム領域」または「ゲノム遺伝子座」とは、標的部位（例えば、ゲノム欠失標的、およびドナーＤＮＡ中の反復配列に対して相同であるゲノム反復配列が挙げられる）のいずれかの側上に存在する或いは標的部位の一部も含む真菌細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことである。このゲノム領域は、少なくとも５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜７００、５０〜８００、５０〜９００、５０〜１０００、５０〜１１００、５０〜１２００、５０〜１３００、５０〜１４００、５０〜１５００、５０〜１６００、５０〜１７００、５０〜１８００、５０〜１９００、５０〜２０００、５０〜２１００、５０〜２２００、５０〜２３００、５０〜２４００、５０〜２５００、５０〜２６００、５０〜２７００、５０〜２８００、５０〜２９００、５０〜３０００、５０〜３１００個またはより多くの塩基を含むことができる。

本明細書で使用する場合、用語「ゲノム欠失標的」および等価物とは、使用者が本開示の態様に従って欠失させようとする真菌ゲノム中の配列のことである（図１を参照されたい）。「ループアウト標的領域」および等価物とは、真菌ゲノム中において直接反復配列間の相同組換えによりループアウトされる、直接反復配列（例えばゲノム反復配列およびこのゲノム反復配列に相同であるドナーＤＮＡ中の反復配列）の間の領域のことである。ある特定の実施形態では、ループアウト標的領域は、ゲノム欠失標的、および真菌ゲノム中の標的部位で挿入されるドナーＤＮＡ上の選択可能マーカーを含む。表現型マーカーとは、陽性選択可能マーカーであるか陰性選択可能マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカーおよび選択可能マーカーが挙げられるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーのことである。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。具体的には、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合は特定の条件下で、ある分子またはこの分子を含む細胞を同定すること、またはこの分子または細胞を有利にもしくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは活性（限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生等）をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物もしくは組成物および同類のものの結合部位を提供することができる。

選択可能マーカーの例として、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；クロリムロンエチル、ベノミル、バスタおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）等の別の毒性化合物および抗生物質に対する耐性を付与する生成物をコードするＤＮＡセグメント；普通はレシピエント細胞で欠失している生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、優性異種マーカー−ａｍｄＳ）をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定され得る生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ等の表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＲＰ）、青緑色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）および細胞表面タンパク質等の蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；ＰＣＲ用の新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていない２種のＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ改変酵素、化学物質等が作用するまたは作用しないＤＮＡ配列の包含；ならびに同定を可能にする特定の改変（例えばメチル化）に必要なＤＮＡ配列の包含が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」は、細胞外部へのタンパク質の分泌を容易にするタンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形態は、シグナル配列を欠き、それは分泌プロセスの間に切断除外される。

本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されているアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを意味するために互換的に使用される。アミノ酸残基用の慣用の一文字または三文字コードが、本明細書で使用される。ポリマーは直鎖でも分枝鎖でもよく、これは改変アミノ酸を含み得、これは非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、天然にまたは介入：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意のその他の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、１種または複数種のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸等が挙げられる）、および当分野で公知のその他の改変を含むポリペプチドもこの定義に含まれる。

「異種」核酸構築物または配列は、これが発現される細胞に対して天然でない、または天然形態で存在しない配列の一部を有する。異種は、対照配列に関して、発現を目下調節している同一遺伝子を調節するように事実上機能しない対照配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）を意味する。一般に、異種核酸配列は、これらが天然状態で存在する細胞にもゲノムの一部にも内因性でなく、感染、遺伝子導入、形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔等により細胞に添加されたものである。「異種」核酸構築物は、天然細胞中で見出される対照配列／ＤＮＡコード配列の組合せと同一のまたは異なる対照配列／ＤＮＡコード配列の組合せを含み得る。

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、単細胞生物か、多細胞生物に由来し、組織培養物中に置かれる細胞か、多細胞生物の一部として存在する細胞かに関係なく、本開示による核酸構築物による形質転換を受けやすい任意の真菌を含む。このような宿主細胞、例えば、酵母およびその他の真菌細胞、または細菌は、ＤＮＡを複製し、本開示で使用されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを産生するために使用することができる。本発明に適切な細胞は、一般に、糸状真菌または酵母である。糸状真菌、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）に由来する細胞が特に好ましい。その他の好ましい生物として、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）およびトリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）のいずれか１個が挙げられる。

本明細書で使用する場合、細胞中への核酸配列の挿入に関する用語「導入される」は、当分野で公知の「遺伝子導入」、「形質転換」または「形質導入」を意味する。

本明細書で使用する場合、「形質転換された」は、細胞が、組換えＤＮＡ技術の使用により形質転換されたことを意味する。形質転換は、典型的には、細胞中への１種または複数種のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されるヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列であり得、すなわち、形質転換すべき細胞に対して天然でない配列、例えば、融合タンパク質である。

本明細書で使用する場合、用語「発現」は、核酸配列に基づきポリペプチドが産生されるプロセスを意味する。プロセスは、転写および翻訳の両方を含む。

微生物細胞ゲノムを改変するための方法および組成物
本開示は、微生物細胞中での相同組換えのための方法およびこのような方法により作製された微生物細胞に関する。本開示はまた、微生物細胞中でゲノム編集する方法に関する。

１．遺伝子編集の方法
ある特定の実施形態では、本開示の真菌は、タンパク質（様々な加水分解酵素、例えば、セルラーゼおよびキシラナーゼが挙げられる）の産生に使用される生物工学的に適用される微生物である。例えば、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｊｅｃｏｒｉｎａ）（同義語トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ））は、ほぼ間違いなく最良の研究されたセルロース分解真菌であり、このセルラーゼおよびヘミセルラーゼは、現在、再生可能なリグノセルロース系バイオマスのバイオ燃料への酵素的変換の調査の最前線にある。従って、工業用タンパク質／セルラーゼ産生を更に改善するため、およびセルラーゼまたはヘミセルラーゼ遺伝子調節についてのメカニズムに関する新たな見識を得るための効率的な分子ツールを開発することが必要とされている。

相同組換え（ＨＲ）による遺伝子ターゲティングは、遺伝子の機能を研究するため、および様々な用途のために真菌株の特徴を変更するための重要な技術である。これにもかかわらず、高い割合の相同遺伝子（ＨＲ）ターゲティングを有する酵母のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とは対照的に、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）（Ｂｌｅｕｙａｒｄｅｔａｌ．，２００６）経路は、その他の真菌（種々の糸状真菌が挙げられる）中でのＤＮＡ組み込みの主な様式であり、これにより配列相同性を有さない鎖の直接的なライゲーションが生じると考えられる。

遺伝子ターゲティングのためのＨＲは、標的とするＤＮＡ部位が二本鎖切断を含む場合に増強されることが分かっている（例えばＲｕｄｉｎｅｔａｌ．，１９８９；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．を参照されたい）。現時点で、最も一般的なゲノム編集ツールであるＩＩ型群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ）システムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のプロトスペーサーおよび隣接する下流５’−ＮＧＧヌクレオチド配列（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）にマッチする２０ｂｐ配列から構成される標的ＤＮＡ中の二本鎖切断（ＤＳＢ）を触媒し得る（例えばＣｏｎｇｅｔａｌ．，２０１３を参照されたい）。

過去２年間にわたり、多くの研究は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、種々の生物中のゲノム中での遺伝子変更を容易にする強力なゲノム編集法であることを実証してきた。Ｃａｓベースゲノム操作技術が多くの異なる宿主細胞型に、更には糸状真菌細胞に適用されているが（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１５）、これらは制限を有し、例えば、遺伝子編集はｃａｓ９発現微生物株依存的であり、ドナーＤＮＡ構築に複数の分子操作工程が必要とされること等が挙げられる。

従って、上記に基づき、微生物細胞中でゲノム標的部位を改変するための／変更するための、より頑強に効果的および効率的なＣａｓベースのゲノム編集法およびこの組成物を開発することが当分野で依然として必要とされている。

２．遺伝子編集に必要とされるドナーＤＮＡ中のショート相同性アーム
１個または複数個のショート相同性アームを有するドナーＤＮＡを微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）のゲノム中の標的部位に挿入するために、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が本明細書に提供される。

第１の態様では、本開示は、微生物細胞中でのドナーＤＮＡと標的とするゲノム遺伝子座との相同組換えを介する微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）のゲノム中での標的とする遺伝子編集のための改善された方法を提供する。このような方法は、（ａ）微生物細胞の集団に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、微生物細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを導入することであって、ドナーＤＮＡ中の相同性アームの一方または両方の長さは短く、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、例えば、４０ｂｐ〜４５０ｂｐ、または４５ｂｐ〜４００ｂｐ、または５０ｂｐ〜３５０ｂｐ、または５５ｂｐ〜３００ｂｐ等の範囲であり、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが微生物細胞のゲノム遺伝子座中またはこのゲノム遺伝子座付近で標的部位で作用することを可能とする複合体を形成し得る、導入すること、ならびに（ｂ）ドナーＤＮＡとゲノム遺伝子座との相同組換えが起きた微生物細胞の集団から少なくとも１個の微生物細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、または両方が微生物細胞の集団に導入される。

第２の態様では、本開示は、微生物細胞中でのゲノム編集の方法であって、（ａ）微生物細胞の集団に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、微生物細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを導入することであって、ドナーＤＮＡ中の相同性アームの少なくとも１個の長さは短く、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、例えば、４５ｂｐ〜４５０ｂｐ、５０ｂｐ〜４００ｂｐ、５５ｂｐ〜３５０ｂｐ、５５ｂｐ〜３００ｂｐ等の範囲であり、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが微生物細胞のゲノムのゲノム遺伝子座中またはこのゲノム遺伝子座付近で標的部位で作用することを可能とする複合体を形成し得る、導入すること；ならびに（ｂ）ゲノム遺伝子座中の標的部位でのＤＮＡ改変が起きた微生物細胞の集団から少なくとも１個の微生物細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、または両方が微生物細胞の集団に導入される方法を提供する。

細胞中にＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体をドナーＤＮＡとともに導入することは、典型的には、微生物細胞のゲノム中の標的部位でのポリヌクレオチド中での二本鎖切断の正確な修復の生成に必要である。本明細書で提供されるＣａｓシステムの成分は、使用者が望むように同時にまたは順次に導入することができる。

Ａ．Ｃａｓエンドヌクレアーゼの導入
本開示の目的のため、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの導入を、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突技術、細胞融合技術等が挙げられるあらゆる好都合な方法で行うことができる。

あるいは、二本鎖切断活性でなくニッキングエンドヌクレアーゼ活性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼ（すなわち、標的部位でＤＮＡの一本鎖のみを切断する；本明細書で「Ｃａｓニッカーゼ」とも称される）を用いることができる。標的部位でのニックの誘導は、二本鎖切断のように標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を活性化させないが、これは目的のゲノム遺伝子座（Ｃａｓニッカーゼのための標的部位を含むもの、またはこの標的部位付近に存在するもの）と、ドナーＤＮＡとの間の相同組換えを改善し得る。Ｃａｓニッカーゼの例として、下記のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体が挙げられる。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓニッカーゼが挙げられる）は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである（例えばＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／１４１６８０号パンフレットを参照されたい）。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの例として、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））に由来するものが挙げられる（例えば、Ｆｏｎｆａｒａｅｔａｌ．，２０１３で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼを参照されたい）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば真菌細胞中での発現にコドン最適化されている最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子によりコードされる。

ある特定の場合には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、核局在化シグナルをコードする１種または複数種のポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、その結果、細胞中で発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は核へと効率的に運ばれる。あらゆる好都合な核局在化シグナル、例えばＣａｓコドン領域の上流（５’）およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在する（すなわち、作動可能に連結されている）ＳＶ４０核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣａｓコドン領域の下流（３’）およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在する（すなわち、作動可能に連結されている）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来する核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。その他の核局在化シグナルを用いることができる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ発現微生物細胞は使用者により入手され、従って、使用者はＣａｓエンドヌクレアーゼを発現し得る組換えＤＮＡ構築物を細胞中に導入することを必要としないが、ガイドポリヌクレオチドをＣａｓ発現細胞中に導入することのみを必要とする。例えば、真菌細胞をＣａｓ発現ＤＮＡ構築物により最初に安定的に遺伝子導入し、次いでガイドポリヌクレオチドを安定的Ｃａｓ発現細胞中に導入することができる（直接またはガイドポリヌクレオチド発現ＤＮＡ構築物を使用）。この設定は、異なるガイドポリヌクレオチドを独立して導入することができる安定的Ｃａｓ発現真菌細胞の集団を使用者が生成することができるため、ある特定の利点を提供する。その他の実施形態では、２種以上のガイドポリヌクレオチドを同一のＣａｓ９発現細胞中に導入することができる。

更に別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を使用して、「標的株」にＣａｓエンドヌクレアーゼをｉｎｔｒａｎｓで供給することができる「ヘルパー株（ｈｅｌｐｅｒｓｔｒａｉｎ）」を生成することができる。簡潔に言うと、例えば、各株からのプロトプラストの融合により、または糸状真菌の種に応じた菌糸の吻合により、このヘルパー株と標的株との間で異核共存体を生成することができる。異核共存体の維持は、適切な栄養および／もしくはその他のマーカー遺伝子または各親株中の変異、および親株は増殖することができないが異核共存体は相補性に起因して増殖することができるような適切な選択培地上での増殖に依存するだろう。異核共存体形成時またはその後のいずれかで、ガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡを遺伝子導入により導入する。ガイドＲＮＡを直接導入してもよいし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子を有するＤＮＡ構築物を介して導入してもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはヘルパー株の核中で遺伝子から発現され、異核共存体の細胞質中に存在する。ＣａｓエンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡと会合し、ドナーＤＮＡが挿入されるゲノム中の所望の標的部位を標的とする活性複合体を生成する。その後、この異核共存体から胞子を回収し、標的部位で挿入されているドナーＤＮＡを有する標的株を回収するために選択またはスクリーニングにかける。発現カセットを使用してガイドＲＮＡを導入する場合、ガイドＲＮＡ発現構築物が安定的に維持されていない異核共存体を選択する。

一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、微生物細胞中に直接遺伝子導入する。その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡベクターを微生物細胞中に形質転換する。

ｉ．ＤＮＡベクター
Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、宿主細胞中での発現に適切であるように構築することができる。遺伝子コードの公知の縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチドを定型的な技能により設計および作製することができる。所望の宿主細胞に応じて、コドン最適化が発現の試行前に必要とされ得ることも公知である。

本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、公知の形質転換技術、例えば、以下に開示されるものを使用して宿主細胞に移すことができる。

適切なベクターは、宿主細胞中に形質転換し、その中で複製することができるものであり得る。例えば、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、ベクターの繁殖および増殖の手段として細菌宿主細胞中で形質転換および複製することができる。ベクターは、コードポリヌクレオチドが機能的Ｃａｓエンドヌクレアーゼとして発現されるように、発現宿主中に適切に形質転換することもできる。

代表的な有用なベクターは、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ（米国特許出願公開第２０１３／０３２３７９８号明細書を参照されたい）およびｐＴＴＴ（米国特許出願公開第２０１１／００２０８９９号明細書を参照されたい）であり、これらは宿主のゲノム中に挿入することができる。ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭおよびｐＴＴＴは、両方とも、これらが本発明のＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するように、定型的な技能により改変することができる。

この目的に有用なベクターは、典型的には、クローニングベクターの成分、例えば、選択宿主生物中でのベクターの自己複製を許容するエレメントおよび選択目的のための表現型により検出可能な１種または複数種のマーカー等を含む。発現ベクターは、通常、制御ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意選択で、リプレッサー遺伝子または１種もしくは複数種のアクチベーター遺伝子を含む。更に、発現ベクターは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを宿主細胞の細胞小器官、例えば、核に標的化し得るアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。制御配列の指向下での発現のため、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの核酸配列は、発現に関して適切な方法で制御配列に作動可能に連結されている。

本発明のＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中での転写を可能とするプロモーターに作動可能に連結させることができる。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子、および誘導性のまたは構成的に発現される遺伝子に由来し得る。特に細菌宿主中でＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列の転写を指向するためのプロモーターの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺伝子ｄａｇＡまたはｃｅｌＡプロモーター、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バシルス・ステアロテェルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。

真菌宿主中での転写のため、有用なプロモーターの例として、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ等をコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子が細菌種、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、例えば、Ｔ７プロモーターおよびファージラムダプロモーターが挙げられるバクテリオファージプロモーターから適切なプロモーターを選択することができる。この方針に沿って、酵母種中での発現に適切なプロモーターの例として、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１およびＧａｌ１０プロモーターならびにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。糸状真菌宿主細胞中での発現は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来の内因性誘導性プロモーターであるｃｂｈ１または構成的糖分解プロモーター（例えば、ｐｋｉ）を含むことが多い。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．２００８を参照されたい。

典型的には、Ｃａｓ９は、本発明の目的のために分泌されない。そうではなく、Ｃａｓ９は標的とされ、ＤＮＡ編集が核中で起こるように核中で保持される。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＣａｓ９配列に付加または融合することができる。しかしながら、その他の実施形態では、例えば細菌において、このようなＮＬＳ配列の融合または付加は任意選択である。

発現ベクターは、適切な転写ターミネーターおよび真核細胞中では、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されているポリアデニル化配列も含み得る。終結およびポリアデニル化配列は、適切には、プロモーターと同一の資源に由来し得る。

ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を可能とするＤＮＡ配列を更に含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製開始点である。

ベクターは、選択可能マーカー、例えば、産物が単離宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性等を付与する遺伝子も含み得る。更に、ベクターは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー、例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤおよびｘｘｓＣ、ハイグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含み得、または選択は、同時形質転換、例えば、当分野で公知のものにより行うことができる。例えば、公開されているＰＣＴ出願の国際公開第９１／１７２４３号パンフレットを参照されたい。

ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ構築物、プロモーター、ターミネーターおよびその他のエレメントをそれぞれライゲートするため、ならびにそれらを、複製に必要な情報を含有する適切なベクター中に挿入するために使用される手順は、当業者に公知であり、容易に利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，２^ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９，ａｎｄ３^ｒｄｅｄ．，２００１を参照されたい。

ｉｉ．形質転換の方法
宿主細胞中へのＤＮＡ構築物またはベクターの導入として、形質転換；電気穿孔；核マイクロインジェクション；形質導入；遺伝子導入、例えば、リポフェクション媒介およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介遺伝子導入；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクティル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による高速衝突；ならびにプロトプラスト融合等の技術が挙げられる。一般的な形質転換技術は、当分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（２００１）、前掲を参照されたい。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）中での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書に記載されている。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株については、Ｃａｏｅｔａｌ．（２０００）も参照される。遺伝子的に安定な形質転換体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸が宿主細胞染色体中に安定的に組み込まれるベクターシステムを用いて構築することができる。次いで、公知技術により形質転換体を選択および精製する。

形質転換のためのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の調製は、例えば、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含み得る（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ．１９８９を参照されたい）。菌糸は、出芽させた栄養胞子から得ることができる。細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することにより、プロトプラストが生じる。懸濁化培地中の浸透圧安定剤の存在により、プロトプラストが保護される。これらの安定剤として、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。通常、これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍで変動し、例えば、１．２Ｍのソルビトール溶液を懸濁培地中で使用することができる。

宿主トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株中へのＤＮＡ取り込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。一般に、約１０〜５０ｍＭのＣａＣｌ_２が、取り込み溶液に使用される。追加の適切な化合物として、緩衝系、例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）；１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．０）およびポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールは、細胞膜を融合させ、従って培地の含有物をトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株の細胞質中へ送達するものと考えられる。この融合により、高頻度で、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーが残される。

通常、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の形質転換には、プロトプラストまたは典型的には密度１０^５〜１０^７／ｍＬ、特に２×１０^６／ｍＬで透過処理が施された細胞が使用される。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａＣｌ_２）中の体積１００μＬのこれらのプロトプラストまたは細胞を、所望のＤＮＡと混合することができる。一般に、高濃度のＰＥＧを取り込み溶液に添加する。０．１〜１体積の２５％のＰＥＧ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができ；しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５体積で添加することが有用である。添加剤、例えば、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等を取り込み溶液に添加し、形質転換を容易にすることもできる。同様の手順がその他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書を参照されたい。

Ｂ．ガイドＲＮＡの導入
一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの導入を、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突技術、細胞融合技術等が挙げられるあらゆる好都合な方法で行うことができる。

ある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする発現カセット（または遺伝子）を含む組換えＤＮＡ構築物を導入することにより、ガイドポリヌクレオチドを真菌細胞に導入する。一部の実施形態では、この発現カセットは真核生物のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。このプロモーターは、ＲＮＡｐｏｌＩＩ依存性プロモーターからＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写時に起こる５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化をＲＮＡｐｏｌＩＩＩによる転写が生じないことから特に興味深い。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは、糸状真菌細胞のＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。

別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された部位の標的化を可能にするために、ｉｎｖｉｔｒｏで合成されたガイドＲＮＡを取り込むように誘導され得る。ある場合では、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡが取り込まれているおよび高頻度でガイドＲＮＡが同時に取り込まれていると予想される細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を担持する別のＤＮＡ構築物との両方の取込みを誘導することが望ましいであろう。上記のように、ベクターＤＮＡが挿入されていない目的の遺伝子改変（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）用の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体のスクリーニングが得られる。

例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞は、第２の選択可能マーカー（および任意選択で、別々のドナーＤＮＡ）を含むガイドＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ構築物により形質転換することができる。第２の選択可能マーカーの使用のために選択される宿主細胞は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性およびゲノム中の規定の目的標的部位への標的化を可能とするこのＤＮＡ構築物からガイドＲＮＡを発現するだろう。

本開示のある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し得るＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ領域（またはｃｒＲＮＡ断片）および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ領域（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含むガイドＲＮＡである。上記で示すとおり、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを微生物細胞ゲノム標的部位に指向し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがゲノム標的部位中に二本鎖切断を導入することを可能とし得る。一部の場合、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよび別々のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖である。その他の例では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域の両方を含む単一ＲＮＡ分子（例えば、融合物）である（本明細書で融合ガイドＲＮＡと称される場合もある）。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対する融合ガイドＲＮＡを使用する１つの利点は、その融合ガイドＲＮＡを発現させるために１個の発現カセットのみが必要とされることである。

Ｃ．ドナーＤＮＡの導入
（例えば、標的部位でのＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体（この複合体は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する）の活性により）宿主細胞のゲノムＤＮＡ中で二本鎖切断が導入される場合、細胞のＤＮＡ修復メカニズムは、（このエラーを起こしやすい性質に起因して）二本鎖切断部位での変異を起こし得る切断修復のために活性化される。破損した末端を結合させるための最も一般的な修復メカニズムは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である。染色体の構造的完全性は典型的には、この修復により維持されるが、欠失、挿入またはその他の再配列も起こり得る（ＳｉｅｂｅｒｔａｎｄＰｕｃｈｔａ，２００２；Ｐａｃｈｅｒｅｔａｌ．，２００７）。

標的特異的遺伝子編集、例えば、遺伝子挿入、遺伝子置換およびその他の配列組み込みのため、ドナーＤＮＡは、真菌細胞のゲノム中の対応する第１の領域および第２の領域に対して相同である第１の領域および第２の領域（すなわち、相同性アーム）を含み、相同性領域は、一般に、ゲノムＤＮＡがＣａｓエンドヌクレアーゼにより切断される標的部位を含み、または包囲する。これらの相同領域は、対応するゲノムの相同領域との相同組換えを促進し、この相同組換えにより、ドナーＤＮＡとゲノムとの間でＤＮＡが交換される。そのため、この提供される方法により、真菌細胞ゲノム中での標的部位における切断部位でまたはこの切断部位付近でドナーＤＮＡの目的のポリヌクレオチドが組み込まれ、それによって元々の標的部位が変更され、それによって変更ゲノム標的部位が生じる。

所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同領域との間の構造的類似性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および真菌細胞ゲノムの「ゲノム領域」により共有される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更に１００％の配列同一性であることができる。

ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対する相同性を有することができる。一部の実施形態では、相同領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対して更に５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。更にその他の実施形態では、相同領域は、下流のゲノム領域に加えて標的部位の断片との相同性も有することができる。一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片を更に含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。

相同性アームの長さは、遺伝子導入ならびに組換え効力および効率にも寄与する。典型的には、このような長さは、標的化編集を達成するために０．５〜１ｋｂの範囲であることが当分野で公知である。

驚いたことに、本開示で、ある特定の糸状真菌中で、長さ１００ｂｐ以下（例えば、８０ｂｐ以下ほど短く、６０ｂｐ以下ほど短く、または更には４０ｂｐ以下ほど短い）ほど短い相同性アームを使用して、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体により刺激される効率的な相同組換えを達成することができることが発見された。更に、慣習的な二本鎖ドナーＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は標的化遺伝子編集を媒介するように機能する一方、本明細書で例示されるとおり、本開示の一本鎖ドナーＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、特により短い相同アームが用いられる場合（すなわち、１００ｂｐ以下ほど短い相同性アーム）、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体により刺激される相同組換えの媒介で同等に機能する。従って、多工程分子操作およびＣａｓシステムにより媒介される標的化遺伝子編集が、実質的に簡易化される。

Ｄ．微生物細胞
本明細書で開示する方法および組成物で用いる微生物細胞は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５により定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５）および全ての栄養胞子形成真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈｅｔａｌ．，１９９５）とに由来するあらゆる真菌宿主細胞であることができる。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞である。酵母の種として、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、微生物細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはラサムソニア（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）の種が挙げられるがこれらに限定されない糸状真菌細胞である。別の好ましい例では、糸状真菌細胞は、アスペルギルス・アクフェアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｆｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＩｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）、ラサムソニア・アルギラセア（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、ラサムソニア・ブレビスチピタタ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｂｒｅｖｉｓｔｉｐｉｔａｔａ）、ラサムソニア・ビソクラミドイデス（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）、ラサムソニア・シリンドロスポラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、ラサムソニア・コンポスチコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）、ラサムソニア・エブルネアン（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｅｂｕｒｎｅａｎ）またはラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）から選択される。

ある特定の実施形態では、微生物宿主細胞は、細菌細胞、例えば、バシルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バシルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バシルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・ステアロテェルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバシルス・ツリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ）等またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種等である。

上記種について、本開示および資源種は、このような生物の完全および不完全状態の両方、ならびに名称が公知である種であるか否かにかかわらず、これらの他の分類学上等価物、例えば、アナモルフを包含するであろうことが理解される。当業者は、このような資源種の適切な等価物の同一性を容易に認識するだろう。

上記種の株は、多数の菌株保存機関、例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、ＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕＶｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）で容易に入手可能である。

Ｅ．ゲノム編集のための潜在的標的
一部の実施形態では、特定の遺伝子を本開示の方法を使用して改変の標的とし、この遺伝子として、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびこれらの組み合わせ）をコードする遺伝子が挙げられる。

本明細書で説明する方法を実行するための多くのバリエーションが存在する。例えば、真菌宿主細胞中で外来性配列として存在するＣａｓ発現カセットを有する代わりに、このＣａｓ発現カセットを真菌宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。この親細胞株の生成により、本明細書の他の場所で詳述するように、使用者が、後に目的のゲノム部位を標的とするであろう所望のガイドＲＮＡを（例えばガイドＲＮＡ発現ベクターとして）簡単に導入することが可能になるだろう。これらの実施形態の内の一部では、組み込まれたＣａｓ遺伝子を、必要に応じてゲノムからのその後のループアウト／除去のためにこのＣａｓ遺伝子に隣接するポリヌクレオチド複製配列を含むように設計することができる。

Ｆ．Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体による遺伝子編集の実行
標的部位が必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（以下「ＰＡＭ」）を含む限り、本開示の方法を使用して微生物細胞ゲノム中の実質的にいかなる標的部位も標的とすることができる。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（５’から３’へ、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）を有し、そのため、ゲノム中の標的部位の選択に対する相当な制限を加えない。その他の既知のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは異なるＰＡＭ部位を有する（例えば、Ｆｏｎｆａｒａｅｔａｌ．，２０１３で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼＰＡＭ部位を参照されたい）。

少なくとも１つの標的部位の長さは変動することができ、例えば、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはより多くのヌクレオチドの長さである標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であることができる（すなわち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取る）ことが更に可能である。切断部位は標的配列内に存在することができる、または切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバージョンでは、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みが千鳥足状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであることができる一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。

ある場合では、真菌細胞のゲノム中の活性変異体標的配列も使用することができ、このことは、標的部位が（ガイドポリヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列内の）ガイドポリヌクレオチド中の関連配列と１００％同一ではないことを意味する。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を含むことができ、活性変異体標的配列は生物学的活性を保持しており、従ってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の二本鎖切断を確認するためのアッセイは当分野で既知であり、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。

目的の標的部位として、目的の遺伝子の領域内に位置する標的部位が挙げられる。目的の遺伝子内の領域の非限定的な例として、オープンリーディングフレーム、プロモーター、転写制御エレメント、翻訳制御エレメント、転写ターミネーター配列、ｍＲＮＡスプライス部位、タンパク質コーディング配列、イントロン部位、イントロン強化モチーフ（ｉｎｔｒｏｎｅｎｈａｎｃｉｎｇｍｏｔｉｆ）などが挙げられる。

Ｇ．所望のゲノム編集を有する微生物細胞の同定
ある特定の実施形態では、微生物細胞のゲノム改変により検出可能な表現型効果が生じ、多くの場合には使用者の所望の結果である。非限定的な例として、選択可能な細胞増殖表現型（例えば抗生物質に対する耐性または感度、栄養要求性特性の獲得または喪失、増殖率の増加または低下等）、検出可能マーカー（例えば蛍光マーカー、細胞表面分子、発色酵素等）の発現、および培養上清中で活性が検出され得る酵素の分泌が挙げられる。

微生物細胞のゲノムの改変により表現型効果が生じる場合、表現型マーカーである（または表現型マーカーをコードする）目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを用いることが多い。あらゆる好都合な表現型マーカーを使用することができ、この表現型マーカーとして、多くの場合は特定の培養条件下で、任意の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーを含む真菌細胞を同定する、またはこの真菌細胞を有利にもしくは不利に選択することを可能にする、この任意の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーが挙げられる。そのため、本発明の一部の態様では、所望のゲノム改変を有する真菌細胞の同定は、標的部位で改変を有する細胞を選択するための条件下で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチド（ならびに任意選択でドナーＤＮＡ）が与えられている真菌細胞集団を培養することを含む。真菌細胞中の酵素活性（選択可能マーカーとも称される）の獲得または喪失（例えば抗生物質耐性の取得または栄養要求性マーカーの獲得／喪失）に関して評価すること等のあらゆるタイプの選択システムを用いることができる。

ある場合では、微生物細胞中でのゲノム改変をあらゆる好都合な方法を使用して直接検出し、この方法として、シークエンシング、ＰＣＲ、サザンブロット、制限酵素分析および同類のもが挙げられ、そのような方法の組み合わせも挙げられる。

本開示を、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきでない以下の実施例により更に説明する。

本方法および組成物の態様は、限定するものと解釈すべきでない以下の実施例に照らして更に理解することができる。材料および方法の改変は、当業者に明らかである。

実施例１
ドナーテンプレートの調製
実施例１．１一本鎖オリゴヌクレオチドの調製
上側鎖および下側鎖の両方を含む種々の長さ：７０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドおよび２００ヌクレオチドの２０ｎモルの一本鎖ＤＮＡ断片（ｓｓＤＮＡ）（配列番号１〜６）を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により凍結乾燥脱塩ＤＮＡとして産生した。これらの７０ｎｔ、１００ｎｔおよび２００ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片は、それぞれ約２３〜２４ヌクレオチド、４０〜４１ヌクレオチド、および９０〜９１ヌクレオチドのフランキング配列を含んだ。この実施例で以下に列記される配列を「上側鎖」または「下側鎖」の名称により標識する一方、このような名称は、この実施例で二本鎖切断が行われ、いずれかの鎖が修復テンプレートとして機能し得るという点で、厳密には必要でないと考えられる。しかしながら、Ｃａｓニッカーゼ、例えば、本明細書で説明されているものを用いる場合、修復の効率は、修復テンプレートとして使用される鎖に依存するであろうことが考えられる。

配列番号１−７０塩基の上側一本鎖オリゴヌクレオチド

配列番号２−７０塩基の下側一本鎖オリゴヌクレオチド

配列番号３−１００塩基の上側一本鎖オリゴヌクレオチド

配列番号４−１００塩基の下側一本鎖オリゴヌクレオチド

配列番号５−上側一本鎖オリゴヌクレオチド２００塩基

配列番号６−下側一本鎖オリゴヌクレオチド２００塩基

実施例１．２二本鎖オリゴヌクレオチドの調製
種々の長さ：３３０ｂｐ、７３０ｂｐ、および１１００ｂｐの二本鎖ドナーＤＮＡテンプレートを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤＴ）により２００ｎｇのＤＮＡ断片として産生した。

二本鎖ドナーテンプレートのそれぞれは、標的部位ＴＳ２配列全体（配列番号１０）を置き換えるために使用される１９ヌクレオチド挿入配列を含んだ。

３３０ｂｐの二本鎖ドナーテンプレート（配列番号７）は、１５２ｂｐの上流隣接配列および１５９ｂｐの下流隣接配列を有する。

７３０ｂｐの二本鎖ドナーテンプレート（配列番号８）は、３５２ｂｐの上流隣接配列および３５９ｂｐの下流隣接配列を有する。

１１００ｂｐの二本鎖ドナーテンプレート（配列番号９）は、５６２ｂｐの上流隣接配列および５２９ｂｐの下流隣接配列を有する。

上流隣接配列と下流隣接配列との間の挿入配列は、３個のリーディングフレーム中の３個の終止コドンと、制限切断部位Ｐｍｅ１およびＰａｃ１とを含んだ。

実施例２
標的部位選択およびｓｇＲＮＡ合成
実施例２．１標的部位選択
上記の実施例１で説明した一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡを含む外因性ドナーテンプレートの存在下でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用する相同修復を試験するため、ｐｙｒ４マーカー遺伝子を選択した。ＰＡＭ（ＴＧＧ）部位を含む配列番号１０の２３ｂｐ配列を有するモチーフＧ−Ｎ２０−ＧＧを有する標的部位を選択した。

ｓｇＲＮＡ合成用のテンプレートは、ＩＤＴにより、Ｔ７プロモーター配列とそれに続くＰＡＭ部位を有さない２０塩基の標的部位（イタリックおよび下線文字）、ガイドＲＮＡ足場とそれに続くターミネーター部位（ＴＴＴＴＴ）を含む、配列番号１１に記載の配列を有するＤＮＡ断片として産生した。

配列番号１１−ガイドＲＮＡ配列用のテンプレート

実施例２．２ｓｇＲＮＡの産生
ガイドＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏでＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ、製品番号ＡＭ１３５４）を使用して産生した。ｉｎｖｉｔｒｏ転写は、３７℃で少なくとも５時間実行した。ＱｉａｇｅｎＲＮＡｅａｓｙＰｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、得られたＲＮＡを精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して産生されたＲＮＡの量を測定した。

実施例３
ガイドＲＮＡおよび一本鎖テンプレートの形質転換
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）株を、増加したセルラーゼ生産性をスクリーニングし、株をウリジン栄養要求体とするｐｙｒ２遺伝子を不活性化させる単一点変異を有することによりＲＬ−Ｐ３７から誘導した。この株を、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ）プロモーターの制御下の化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９用の発現カセットと、ＰＣＴ国際出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１８号明細書で説明されている天然プロモーターの制御下のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｐｙｒ２遺伝子用の発現カセットとを含むＤＮＡ構築物により形質転換した。ゲノム中に組み込まれたＣａｓ９−ｐｙｒ２カセットを有し、Ｃａｓ９遺伝子を構成的に発現する形質転換体を、機能的ｐｙｒ２遺伝子有する細胞を選択することにより同定した（フォーゲル培地上でのウリジン補給なしの増殖）。

プロトプラストをこのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株から調製した。この株をＰＤＡプレート上で３０℃で５日間増殖させた。胞子を集め、２５０ｍＬの４つのバッフルを有する振とうフラスコ中で５０ｍＬのＹＥＧ（５ｇ／Ｌの酵母エキスと２０ｇ／Ｌのグルコース）ブロス中に播種し、２００ｒｐｍで１６〜２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。

この液体体積を５０ｍＬのコニカルチューブ中に移し、２，５００ｒｐｍで１０分にわたり回転させることにより、菌糸体を回収した。上清をデカントした。次いで、菌糸体ペレットを、２ｇの溶解酵素（ＳＩＧＭＡ）を含む４０ｍＬ溶液を有する２５０ｍＬ、０．２２ミクロンのＣＡＣｏｒｎｉｎｇフィルターボトル中に移した。その後、混合物を３０℃でインキュベートし、２００ｒｐｍで２時間にわたり混合して形質転換用のプロトプラストを生成した。

滅菌ｍｉｒａｃｌｏｔｈに通すろ過により、プロトプラストを５０ｍＬコニカルチューブに回収した。次いで、これらを２，０００ｒｐｍで５分にわたり回転させることによりペレット化し、吸引した。プロトプラストペレットを、５０ｍＬの１．２Ｍのソルビトールにより１回洗浄し、回転沈降させ、吸引し、２５ｍＬのソルビトール／ＣａＣｌ_２により再度洗浄した。

プロトプラストを計数し、次いで２，０００ｒｐｍで５分にわたりペレット化し、上清をデカントし、プロトプラストペレットを、１ｍＬ当たり１．２５×１０^８個のプロトプラスト濃度を生成するために十分な量のソルビトール／ＣａＣｌ_２中で再懸濁し、プロトプラスト溶液を生成した。

最大１５μｇのｉｎｖｉｔｒｏ合成ガイドＲＮＡのアリコート（１．２μｇ／μＬ）および２μＬの０．１ｍＭの一本鎖ＤＮＡテンプレートを、１５ｍＬのコニカルチューブに入れ、チューブを氷上に置いた。次いで、２００μＬのプロトプラスト懸濁液を、５０μＬのＰＥＧ溶液とともにそれぞれの形質転換アリコートに添加した。チューブを穏やかに混合し、氷上で２０分にわたりインキュベートした。ＰＥＧ溶液を、４ｍＬの体積で形質転換アリコートチューブに添加し、これらを室温で５分にわたりインキュベートした。ソルビトール／ＣａＣｌ_２溶液を３．５ｍＬの体積で、チューブに添加した（８ｍｌの総体積を生成）。形質転換混合物を、それぞれ約４ｍＬを含む２個のアリコートに分割した。１．０ｍｇ／ｍＬのウリジン融解トップアガー（５０℃で保持することにより融解を維持）を含むフォーゲルソルビトールを形質転換反応物と混合し、次いでそれをプレーティングし、３０℃で４〜５日にわたりインキュベートした。

選択は、１．８ｍｇ／ｍＬのＦＯＡ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐ．）を有するフォーゲルおよび０．５ｍｇ／ｍＬのウリジンからなる上層寒天を使用して実行した。対照は、ガイドＲＮＡを有さない２μＬの０．１ｍＭの一本鎖ＤＮＡテンプレートとインキュベートしたプロトプラストを使用して実行した。

実施例４
耐性形質転換体の特徴付け
ゲノムＤＮＡを、ＦＯＡ−ウリジンプレート上で増殖するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）コロニーから高温フェノール抽出プロトコルを使用して単離した。少量の菌糸体（寒天を有する約０．２５ｃｍ^２の菌糸体）を６００μＬのｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、粉砕し、１２０μＬの溶解緩衝液中で再懸濁した。溶解緩衝液は、２００μＬの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）と、２００μＬの３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）と、２００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールブレンド（２５：２４：１、ｖ／ｖ）と、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および０．１ｍＭのＥＤＴＡにより調製された１，８００μＬのＴＥ緩衝液とをブレンドすることにより調製した。続いて、クロロホルム（１２０μＬ）を溶解菌糸体に添加し、ボルテックスにかけることにより混合し、サーモミキサー中で７２℃で６分にわたりインキュベートした。次いで、溶解物を短時間混合し、最大速度で３分にわたり遠心分離した。水相を、１００μＬのイソプロパノールを含有するチューブに移し、混合し、１０分にわたり遠心分離した。ペレットを１ｍＬの７０％エタノールにより洗浄し、遠心分離した。ペレットを６０μＬのＴＥ緩衝液中で再懸濁し、７２℃でインキュベートし、ＰＣＲ用テンプレートとして使用した。

ＰＣＲ反応は、１μＬのゲノムＤＮＡ、０．１μＬの５０μＭのプライマーのそれぞれ（フォワードおよびリバースプライマー）、０．２５μＬのＰＣＲヌクレオチドミックスおよび０．２５μＬのＰｆｕＵｌｔｒａＩＩＤＮＡポリメラーゼ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２５μＬの反応体積で実行した。

以下のプライマーを使用してｐｙｒ４標的部位ＴＳ２にわたりＰＣＲした。
以下を有するプライマーペア：
配列番号１２−１Ｆ：５’−ＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＧ−３’；および
配列番号１３−１Ｒ：５’−ＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧ−３’。

一本鎖ＤＮＡをドナーテンプレートとして使用する場合、これらのプライマーを使用した。
プライマーペア：
配列番号１４−ＭＨ１７９５’−ＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣ−３’および
配列番号１５−ＭＨ１８０５’ＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣ−３’
を使用して、二本鎖ＤＮＡをドナーテンプレートとして使用する形質転換からのコロニーをＰＣＲした。ＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲルを使用する電気泳動により分析した。ＰＣＲ産物を、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号２８１０４）を使用して精製した。

ＤＮＡシークエンシングを、シークエンシングプライマーｐＭＨ０９４（配列番号１６）を使用してＳｅｑｕｅｔｅｃｈＣｏｒｐ（Ｍｏｕｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）により実行した。

制限消化を、５μＬのＰＣＲ産物およびＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓからの制限酵素（Ｐａｃ１、カタログ番号Ｒ５５４７Ｓ、Ｐｍｅ１、カタログ番号Ｒ０５６０Ｓ）を使用して２０μＬの体積で３７℃で１５分にわたり実行した。反応産物を、１％のアガロースゲル上での電気泳動により分析した。

実施例５
ドナーＤＮＡテンプレートとしての１００ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドを使用するＣａｓ９媒介型相同組換え修復
ドナーＤＮＡテンプレート（１００ヌクレオチド）は、２つの一本鎖ＤＮＡを含んだ：（１）下側鎖である（配列番号１０の標的部位ＴＳ２に相補的な鎖である）配列番号４；および（２）上側鎖であり、ＴＳ２と同一の鎖である配列番号３。

配列番号３および４は、それぞれ、４０ヌクレオチドの（５’）相同性アームおよび４１ヌクレオチドの（３’）相同性アームが隣接する１９ヌクレオチドの終止コドン配列を含んだ（図１に示す）。

７０塩基の一本鎖ＤＮＡ（配列番号１および２）も、１９ヌクレオチドの挿入配列に隣接する２３〜２４ヌクレオチドの相同性アームを用いて設計し、２００塩基のもの（配列番号５および６）も、１９ヌクレオチドの挿入配列に隣接する９０〜９１ヌクレオチドの相同性アームを用いて設計した。

単離された１０個のＦＯＡ耐性株のうちの５個で、制限部位Ｐｍｅ１およびＰａｃ１を含む１，２００ｂｐのＰＣＲ産物を得、シークエンシングした。効率的な破壊および修復は、ｐｙｒ４遺伝子座での終止コドン挿入配列に隣接する４０ヌクレオチドの５’相同性アームおよび４１ヌクレオチドの３’相同性アームを有する１００塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用したＦＯＡ耐性コロニーの５０％で観察された（図２に示すとおり）。

一本鎖ＤＮＡを相同組換え（ＨＲ）による修復用のドナーテンプレートとして使用するＤＮＡ配列アラインメントを図４Ａに示す。ＦＯＡ耐性株から増幅させたＰＣＲ産物を精製し、配列番号１６を使用してシークエンシングした。個々の修復イベントの配列分析により、ｐｙｒ４遺伝子が１０個のクローンのうち５個で一本鎖ＤＮＡ修復テンプレートを含むことが明らかになった。

残りの５個のクローンはインデルを含み、ＤＳＢの部位特異的誘導および非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）を介する修復を示した。シークエンシング結果は、図２の制限消化結果と一致した。

Ｐａｃ１およびＰｍｅ１により消化されたＰＣＲ産物は、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を介する相同組換えが起き、２個の制限部位を有する１９ヌクレオチドの挿入配列の存在をもたらすことを示した。

実施例６
ドナーＤＮＡテンプレートとしての２００塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用するＣａｓ９媒介型相同組換え修復
１０個のＦＯＡ耐性コロニーからの菌糸体を単離し、ゲノムＤＮＡ抽出を実行した。結果を図３に示す。

２００塩基の一本鎖ＤＮＡの配列（配列番号６）を、形質転換実験において使用した。アガロースゲル電気泳動（０．８％のアガロースゲル）を使用して、１Ｆおよび１Ｒプライマー（配列番号１２および１３）を使用して誘導したＰＣＲ産物（１．２ｋｂバンド）を分析した。Ｐａｃ１を使用する制限消化により、１０個のＰＣＲ産物のうちの４個でＰａｃ１部位の存在が明らかになった。相同組換え修復の頻度は、株の４０％で観察された（図３に示すとおり）。

１０個全てのＰＣＲ産物を精製し、シークエンシングプライマー配列番号１６を使用してＤＮＡシークエンシングにかけた。図４Ｂは、このようなシークエンシングおよび個々の修復イベントの分析の結果を提示し、これにより、ｐｙｒ４遺伝子が１０個のクローンのうちの４個で一本鎖ＤＮＡ修復テンプレートを含むことが明らかになった。

残りの６個のクローンはインデルを含み、Ｃａｓ９誘導ＤＳＢを示し、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）を使用して修復を達成した。シークエンシング結果は、図３に示される制限消化結果と一致した。これらの結果により、Ｃａｓ９媒介型二本鎖切断により誘導される、ＮＨＥＪ修復経路に加えた２００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡドナーテンプレートの存在下での相同組換え修復（ＨＤＲ）の刺激が裏付けられた。まとめると、９０〜９１塩基の相同性隣接配列は、真菌中でのＨＤＲによる修復を刺激し得る。

実施例７
二本鎖ＤＮＡをドナーＤＮＡテンプレートとして使用するＣａｓ９媒介型相同組換え修復
二本鎖ＤＮＡテンプレートは、隣接相同性配列の最小長さとして５００ｂｐで遺伝子置換実験において慣習的に使用されている。この実施例の目標は、１５０ｂｐから最大５００ｂｐまでのより短い隣接相同性配列を有する二本鎖ＤＮＡテンプレート（配列番号７、８および９）も、相同組換えを誘導し得るか否かを試験することである。

図５は、それぞれ、挿入コドンおよびほぼ対称的な隣接相同アームを含む、使用される二本鎖ＤＮＡテンプレートを示す。

ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により、図６のゲルＢ、レーン２および４で淡く視認可能な非常に大きい分子量バンドの存在が示された。これは、ドナーテンプレートまたは非特異的組換え産物のコンカテマー化により引き起こされることが考えられる異常な修復イベントを反映し得た。

ゲルＣでは、ＰＣＲ産物の制限酵素消化により、ｐｙｒ４遺伝子内のＰａｃ１部位の存在が示された。これは、１０個の産物のうちの４個で観察され、実験／コロニーの４０％がＣａｓ９媒介型相同組換え修復を有し、実験／コロニーの６０％がＮＨＥＪ関連修復を有することを示した。

遺伝子置換実験を、約５００ｂｐの対称的相同性アームを有する１，１００ｂｐの二本鎖ドナーテンプレートを使用して行った。ドナーＤＮＡは、ＦＯＡ耐性コロニーの診断および確認に使用される制限部位を有する終止挿入配列も含んだ。

アガロースゲル分析を、個々のＦＯＡ耐性コロニーのゲノムＤＮＡから増幅させたＰＣＲ産物のそれぞれに対して実施した。

図６に示されるとおり、アガロースゲルＢ、レーン４および８は、対照試料からのＰＣＲ産物（Ｃ）と比較して低い分子量を有するＰＣＲ産物を示し、ｐｙｒ４遺伝子の大きな欠失を示した。Ｐａｃ１による制限消化により、試料＃５の他に（アガロースゲルＣレーン５に示されるとおり）、大多数のＰＣＲ産物がＰａｃ１により消化もされず、消化可能でもないことが実証された。これにより、ＨＤＲが低頻度で起きる一方、ＮＨＥＪ修復経路が主に起きることが示された。

実施例８
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡテンプレート（ｓｓＯＤＮ）を使用する相同組換え修復
アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）過剰産生株３Ｍ−４３／ｐｙｒＡ（Ｎｉｋｏｌａｅｖｅｔａｌ．，２０１３を参照されたい）を使用して、Ｃａｓ９を使用してＬ−アラビトールデヒドロゲナーゼ（ＬＤＡ）経路を破壊する目標でゲノム編集を行った。Ｎｉｋｏｌａｅｖｅｔａｌ．（２０１３）で説明されているとおり、Ｌ−アラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子経路の破壊は、適切な条件下で培養した場合、その株によるキシラナーゼ産生の増加をもたらすことが予測された。

Ｎｉｋｏｌａｅｖｅｔａｌ．（２０１３）は、ＬＤＡ破壊アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）株３Ｍ−４３からのキシラナーゼ産生の増加が転写因子ｘｌｎＲにより媒介されること；および８０個の試験物のうち単一の得られた株が、慣用の遺伝子置換方針を使用して破壊されたｘｌｎＲ遺伝子を含むことを更に報告しており、慣用の遺伝子置換方針が（実行可能であるが）非効率的であり、良くても頑強性を欠くことを示した。

本実施例では、上側鎖および下側鎖の両方の１００〜２００塩基のｕｌｔｒａｍｅｒは、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入することができる。Ｃａｓ９誘導二本鎖切断の相同組換え修復用のドナーテンプレートとして使用すべき配列番号１７〜２０を有する４個の異なる一本鎖オリゴヌクレオチドも、ＩＤＴにより作製することができる。

より特定すると、配列番号１７は、５’末端での４４塩基および３’末端での３７塩基の相同性アームを有する１９塩基の終止コドン挿入配列（大文字）を有する１００塩基のｕｌｔｒａｍｅｒ上側鎖である：

配列番号１８は、５’末端での３７塩基および３’末端での４４塩基の相同性アームを有する１９塩基の終止コドン挿入配列（大文字）を有する１００塩基のｕｌｔｒａｍｅｒ下側鎖である：

配列番号１９は、５’末端での９４塩基および３’末端での８７塩基の相同性アームを有する１９塩基の終止コドン挿入配列（大文字）を有する２００ｕｌｔｒａｍｅｒの上側鎖である：

配列番号２０は、５’末端での８７塩基および３’末端での９４塩基の相同性アームを有する１９塩基の終止コドン挿入配列（大文字）を有する２００ｕｌｔｒａｍｅｒの下側鎖である：

上記で提示したとおり、１００塩基長であるオリゴヌクレオチドは、それぞれ４４および３７塩基の５’および３’相同性アームが隣接する１９塩基長の終止コドンを含み得る（配列番号１７および１８）。

２００塩基長であるオリゴヌクレオチドは、それぞれ５’および３’での９４および８７塩基の相同性アームが隣接する１９塩基の終止コドン挿入配列も含み得る（配列番号１９および２０）。

Ｃａｓ９発現ベクターｐＧｄｐＡ：Ｃａｓ９は、コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子（すなわち、本明細書で提供されるとおり、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）発現のためにコドン最適化されたもの）を使用して構築することができる。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）プロモーター、ｇｐｄＡｍＲＮＡの５’非翻訳領域、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣターミネーターを使用してＣａｓ９コード配列の発現をドライブすることができる。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ｐｙｒＡ遺伝子の３．９ｋｇのＸｂａ１断片を、選択マーカーとして使用すべきｐＧｐｄ：Ｃａｓ９プラスミド中に挿入することができる。

真菌同時形質転換は、こうして構築された２μｇのｐｙｒＡ選択配列を有するＣａｓ９発現ベクターと、２０μｇのｉｎｖｉｔｒｏ合成ガイドＲＮＡと、３個のリーディングフレーム中の配列番号２１の終止コドンを含む１００μＭの１００または２００塩基のいずれかの一本鎖ｕｌｔｒａｍｅｒとを使用して実行することができる：

ｘｌｎＲ遺伝子は、亜鉛二核クラスターＺｎ２Ｃｙｓ６タンパク質をコードする。２０ｂｐの標的配列（配列番号２２）を選択することができる：配列番号２２：（ＣＡＡＣＴＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡ）。

配列番号２２は、それがｘｌｎＲのＮ末端付近で亜鉛二核ＤＮＡ結合ドメイン内に局在するため、Ｃａｓ９誘導二本鎖切断用の標的部位としてのＰＡＭ部位「ＣＧＧ」に先行する。

Ｔ７プロモーター（下線）、２０ｂｐの標的部位（大文字）、ｔｒａｃｒ配列を含むガイドＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ合成用のテンプレート配列（配列番号２３）を、ＩＤＴからｇブロックとしてオーダーすることができ、次いで、ガイドＲＮＡを、ＭｅｇａｓｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してｉｎｖｉｔｒｏ合成することができる。

配列番号２３は、ｇＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ合成用のテンプレートである：

同時形質転換は、アスペルギルス・ツギンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｇｉｎｇｅｎｓｉｓ）３Ｍ−４３／ｐｙｒＡ株由来のプロトプラストと、上記で説明したｐｒｙＡ選択配列を有するＣａｓ９発現ベクター（２μｇの量）と、ｉｎｖｉｔｒｏ合成ガイドＲＮＡ（２０μｇの量）と、１００塩基または２００塩基の一本鎖ｕｌｔｒａｍｅｒドナーテンプレートとを用いて形質転換混合物を調製することにより実行することができる。次いで、こうして調製した形質転換混合物を、１リットル当たり６ｇのＮａＮＯ_３、１．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｇのＫＣｌ、Ｖｉｓｈｎｉａｃ微量元素、１．５％の寒天、および炭素源としての２０ｇのフルクトースを含む最少培地プレート（ｐＨ６．０）上にプレーティングする。

次いで、誘導後に最少寒天プレート上で現れるコロニーを、Ｄ−キシロースおよびキシランを炭素源として含む新たな最少寒天プレートに移す。

いくつかの形質転換体は、キシランベース寒天プレート上でのハロー形成に基づきアッセイまたは推定することができるとおり、Ｄ−キシロース上での増殖の低減または更にキシラナーゼ活性の完全な不存在を実証するだろう。増殖の低減またはキシラナーゼ活性の完全な不存在は、転写因子の破壊が成功していることの良好な指標である。

コロニーを、３％の糖ビートパルプ（ＳＢＰ）基質およびコムギブラン（ＷＢ）上での５日にわたる３４℃での液体培地中での増殖後、エンドキシラナーゼ（ＥＸＬ）活性についてスクリーニングすることもできる。ｘｌｎＲ遺伝子中の変異は、キシラナーゼ活性の不存在により確認することができる。このような欠失または変異は、ｘｌｎＲ遺伝子ノックアウト表現型が現れるコロニー中でゲノムＤＮＡと、配列番号２４（フォワードプライマー）および配列番号２５（リバースプライマー）のｘｌｎＲ遺伝子特異的プライマーとを使用するＰＣＲにより確認することもできる。約３，８２０ｋｂのサイズのＰＣＲ産物を、全ての形質転換体中で生成することができる。Ｄ−キシロース上での増殖が低減し、キシラナーゼ活性が不存在のそれらの形質転換体は、ｐｍｅ１およびｐａｃ１部位を含むＰＣＲ産物を示すだろう。約１，１００ｂｐおよび２，７００ｂｐのサイズの２個のバンドをもたらす制限消化を使用して部位の存在を確認することができる。これらのバンドは、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）中でドナー修復テンプレートとして作用する一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する成功したＣａｓ９誘導二本鎖切断および相同組換え修復を裏付けるだろう。

結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９方針の使用が、真菌株中の遺伝子を改変または破壊する慣用の手段と比較して糸状真菌株、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中での遺伝子編集を達成するためのかなり効率的な手段であることも実証するだろう。

実施例９
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でのＣａｓ９の発現
１．図８に記載のｐＳＢ−ＳｐｙＣａｓ９発現ベクターの構築
ＳｐｙＣａｓ９遺伝子（配列番号２６）を担持するＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（４．２ｋｂ）を、（５．６ｋｂの断片をもたらす）同一酵素によりｐＳＢ切断物中にライゲートした。より特定すると、配列番号２６のポリヌクレオチドは、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を有する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１ＧＡＳ（ＬｏｃｕｓＳｐｙ＿１０４６）のＣａｓ９の配列であり、ＢｓｒＤＩ制限部位を太字で標識した。Ｃ末端の下線付き文字は、核局在化配列およびデカ−Ｈｉｓタグを標識する。

次いで、ライゲーションミックスを使用して枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｃ２９８７細胞を形質転換し、約１００個の形質転換体を得た。８個のコロニーをピックし、これらの配列をミニプレップ後に確認した。次いで、それらをプールし、使用してＣＢ２０−１および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８細胞を形質転換した。

Ｓｐｙ−Ｃａｓ９の２個の形質転換体（ＡおよびＢ）をピックし、ＬＢおよび１０ｐｐｍのネオマイシンにより作製された個々の２ｍＬの前培養物中で増殖させた。１ｍＬの体積の前培養物を使用して１０ｐｐｍのネオマイシンを有する３５ｍＬのＧｒａｎｔＩＩ培地に播種した。次いで、培養物を２８０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で約６３時間にわたり増殖させ、強化シールを使用してＵｌｔｒａ−Ｙｉｅｌｄフラスコ中で７０％の湿度で維持した。

培養物を完成させた後、ブロスを遠心分離し、細胞ペレットおよび上清を別々に保存した。細胞ペレットを培養物のそれぞれのうちの細胞１ｍＬから採取し、ペレットを０．５ｍＬの緩衝液Ｐ１中で懸濁した。次いで、５ｍＬのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ（Ｔ４リゾチーム）をそれぞれの混合物に添加した。混合物を３７℃で約０．５時間にわたりインキュベートした。

培養物は、０．５時間の終了時に粘性になることが観察された。５ｍＬの体積のＯｍｎｉｃｌｅａｖｅヌクレアーゼを添加し、インキュベーションを更に０．５時間実行した。試料は依然として混濁した一方、混合物は溶解の結果として低減した粘度を有する。次いで、溶解させた細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に置き、ウエスタンブロットを使用してＨｉｓタグ検出を実行した。ＳｐｙＣａｓ９の発現が観察された。

２．枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｈｒＡ遺伝子のターゲティングおよび編集
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の早期胞子形成経路に関与するｐｈｒＡ遺伝子の配列を配列番号２７として以下に提示し、ターゲティング部位に下線を引いた。

ｐｈｒＡ遺伝子の欠失は、無秩序のＲａｐＡホスファターゼ活性を引き起こし、胞子形成が開始されない結果が伴うことが予測された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（１９９７）：８６１２−８６１６を参照されたい）。

上記で下線が引かれ、本明細書で配列番号２８として提示されるターゲティング配列は、ＰＡＭ部位「ＡＧＧ」を含み、それをＣａｓ９活性用の標的部位として使用した。Ｔ７プロモーターを、ＰＡＭ部位ヌクレオチドを有さない２０ｂｐのｐｈｒＡ配列の前に付加し、ガイド足場配列を３’末端に付加した。得られた配列をｉｎｖｉｔｒｏガイドＲＮＡ合成用のテンプレートとして使用し、ガイドＲＮＡ精製に使用されるＭｅｇａＳｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）およびＲＮＡＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を適用した。

野生型枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８（ｔｒｐＣ２）を、ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒから入手した。次いで、２個のｕｌｔｒａｍｅｒを有するＣａｓ９発現プラスミド（１９塩基の終止コドン挿入配列を有するｐｈｒＡオープンリーディングフレーム全体を含む１５４塩基の一本鎖上側鎖および下側鎖オリゴヌクレオチド）、および上記で説明したｉｎｖｉｔｒｏ合成ガイドＲＮＡを含む形質転換混合物を、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ胞子形成培地中で３７℃で約３０時間にわたり増殖させた。

Ｃａｓ９発現プラスミドを有さない対照株を、Ｃａｓ９を発現する株と比較した。Ｃａｓ９および非Ｃａｓ９の胞子形成の割合を計算し、胞子カウントと生存細胞カウントとの比として提示した。Ｃａｓ９株中で胞子形成が停止したことが観察され、それはｐｈｒＡ遺伝子の破壊を示した。

配列番号２９（フォワードプライマー）および配列番号３０（リバースプライマー）のプライマーペアを、コロニーＰＣＲに使用した。

ｐｈｒＡ遺伝子のＰＣＲ増幅およびＰｍｅＩまたはＰａｃＩを使用する後続の制限消化により、４％のアガロースゲル上で約７０〜８０塩基の二重バンドが示された。これにより、ドナーシグナル鎖オリゴヌクレオチドを使用するｐｈｒＡ遺伝子の相同組換え修復が達成されることが示された。

実施例１０
ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）中での化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の発現
文献では、Ｃａｓ９媒介型標的化染色体欠失が、３種の異なるタイプのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株中で報告され、効率は７０〜１００％の範囲で変動した（ＡＣＳＳｙｎｔｈｅｔｉｃＢｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１９：４（６）７２３−７２８を参照されたい）。この報告された研究は、数キロベースの長さのドナーテンプレートを使用した。ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）中での発現のためにコドン最適化された化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をコードする遺伝子を配列番号３１に記載する。

本実験では、一本鎖オリゴヌクレオチドの形態のｕｌｔｒａｍｅｒを含むドナーテンプレートを、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）中でＣａｓ９媒介型遺伝子編集を生じさせるように設計した。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して、メチルイソボルネオール（ＭＩＢ）生合成を担う２遺伝子オペロンに属する２種のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）遺伝子、ｓｃｏ７７００およびｓｃｏ７７０１を欠失させることができる。メチルイソボルネオールは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）により産生される揮発性有機化合物であり、それは湿潤土の特徴的な匂いおよび大規模発酵プラントで不所望なまたは更には問題であり得ると考えられることが多い多数の不快な風味または臭気を担うと考えられる。Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００８）１６：１３０（２８）：８９０８−８９０９を参照されたい。

図１０は、対照としてのプラスミド中の、Ｃａｓ９遺伝子および配列番号３２の２０ｂｐの標的部位と一緒のガイドＲＮＡ配列を有し、２ｋｂの相同性修復ドナーを有する発現カセットを示す。図１１は、終止コドンを有する２００塩基のｕｌｔｒａｍｅｒの使用を可能とするために２ｋｂの相同性修復ドナーテンプレートを有さない発現カセットを示す。

２μｇのＣａｓ９−ｇＲＮＡ発現カセットおよび１００μＭの２００塩基オリゴヌクレオチド（配列番号３３）のｕｌｔｒａｍｅｒを使用してｓｃｏ７７００およびｓｃｏ７７０１遺伝子を破壊した。

ＭＩＢ遺伝子の破壊を、３０℃で培養した５０ｍＬの培養物からの臭気の不存在を使用して確認した。ＭＩＢ遺伝子のＰＣＲ増幅とそれに続くＰｍｅＩまたはＰａｃＩ制限消化により、更にＭＩＢ遺伝子の破壊がより正確に保証された。

参照文献
ＰＣＴ国際公開第１９９１／１７２４３号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１３／１４１６８０号パンフレット
ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１８号明細書
米国特許出願公開第２０１１／００２０８９９号明細書
米国特許出願公開第２０１３／０３２３７９８号明細書
米国特許第５，１０７，０６５号明細書
米国特許第６，０２２，７２５号明細書
米国特許第８，６９７，３５９号明細書
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Claims

糸状真菌細胞中でゲノム編集する方法であって、
前記糸状真菌細胞中に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドポリヌクレオチドと、ドナーポリヌクレオチドとを導入する導入工程を含み、
前記ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１個の相同性アームを含み、前記相同性アームは、５００個未満のヌクレオチドの長さであり、前記真菌細胞の標的とするゲノム遺伝子座に対する配列相同性を含み、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記標的とするゲノム遺伝子座でまたはこのゲノム遺伝子座付近で作用することを可能とする複合体を形成する、方法。
前記ドナーポリヌクレオチドを、前記真菌細胞の前記標的とするゲノム遺伝子座中に挿入する、請求項１に記載の方法。
前記ドナーポリヌクレオチドが、前記相同性アームの上流（５’）に存在し、それに作動可能に連結されており、または前記相同性アームの下流（３’）に存在し、それに作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列を、前記真菌細胞の前記標的とするゲノム遺伝子座中に挿入する、請求項３に記載の方法。
前記挿入されるドナーポリヌクレオチドが、ＤＮＡ欠失、ＤＮＡ破壊、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ反転、ＤＮＡ点変異、ＤＮＡ置換、ＤＮＡノックイン、ＤＮＡノックアウトおよびＤＮＡノックダウンからなる群から選択されるゲノム改変を含む、請求項２に記載の方法。
前記挿入される目的のヌクレオチド配列が、ＤＮＡ欠失、ＤＮＡ破壊、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ反転、ＤＮＡ点変異、ＤＮＡ置換、ＤＮＡノックイン、ＤＮＡノックアウトおよびＤＮＡノックダウンからなる群から選択されるゲノム改変を含む、請求項４に記載の方法。
前記相同性アームが、３５０個未満のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
前記相同性アームが、１５０個未満のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
前記相同性アームが、１００〜４０個のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
前記ドナーポリヌクレオチドが、目的のヌクレオチド配列の上流（５’）に存在し、それに作動可能に連結されている相同性アームおよび同一の目的のヌクレオチド配列の下流（３’）に存在し、それに作動可能に連結されている相同性アームを含み、前記２個の相同性アームの少なくとも１個は、５００個未満のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列を、前記真菌細胞の前記標的とするゲノム遺伝子座中に挿入する、請求項１０に記載の方法。
少なくとも１個の相同性アームが、３５０個未満のヌクレオチドの長さである、請求項１０に記載の方法。
少なくとも１個の相同性アームが、１５０個未満のヌクレオチドの長さである、請求項１０に記載の方法。
少なくとも１個の相同性アームが、１００〜４０ヌクレオチド長である、請求項１０に記載の方法。
両方の相同性アームが、５００個未満のヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列が、少なくとも１個の異種ヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列が、異種ポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列が、少なくとも１個の異種ヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
前記目的のヌクレオチド配列が、異種ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓニッカーゼまたはこの機能的変異体である、請求項１に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの機能的変異体である、請求項１に記載の方法。
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される種である、請求項２１に記載の方法。
前記導入工程が、前記真菌細胞中での前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの機能的変異体の発現用の発現カセットを含むポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
前記導入工程が、前記真菌細胞中での前記ガイドＲＮＡの発現用の発現カセットを含むポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
前記導入工程が、前記真菌細胞中に、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセット、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセット、およびドナーＤＮＡを含む環状ポリヌクレオチド構築物を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
前記導入工程が、前記ガイドポリヌクレオチドまたはＣａｓエンドヌクレアーゼを前記真菌細胞中に直接導入することを含む、請求項１に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの機能的変異体が、核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
前記ドナーポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記ドナーポリヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる属から選択される、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法により製造されている組換え糸状真菌細胞。