CN107223157B - 用于辅助菌株介导的真菌基因组修饰的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞、例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

Description

用于辅助菌株介导的真菌基因组修饰的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月16日提交的美国临时申请序列号：62/092,444的优先权，将其以全文通过引用结合在此。

序列表

将按照37C.F.R.§1.52(e)、经由EFS提交的序列表通过引用结合在此。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2015年12月11日创建的文件“40692-WO-PCT_2015-579final_ST25.txt”，其大小为100千字节。

背景技术

应用用于真菌基因组修饰的辅助菌株概念的先决条件是通过融合两种不同细胞类型：辅助菌株(HS)和靶菌株(TS)，形成异核体的能力。在一些真菌细胞(例如粗糙脉孢菌)中，可以通过简单混合HS和TS的孢子，并且允许它们在选择培养基上一起萌发，来完成这一融合。在其他真菌细胞(例如里氏木霉)中，并不是这么容易地发生细胞融合，并且必需制造原生质体来促进融合。一旦来自HS和TS的细胞融合，共享的细胞质允许HS提供的益处可用于TS。在粗糙脉孢菌中，细胞被连接至合胞体，该合胞体允许细胞质连同细胞器在细胞小室之间进行迁移(Roper，M.Simonin，A.，Hickey，P.C.，Leeder，A.，and Glass，N.L.2013.Nuclear dynamics in fungal chimera.一旦利用了来自异核体的益处，组分菌株需要被分开。这是通过使异核体形成孢子、将单个分生孢子涂板、并且验证源自单个单核孢子的菌株来实现的。在粗糙脉孢菌中，可以在包含碘乙酸的培养基上产生包含单个细胞核的小分生孢子(Ebbole，D.和Sachs，M.S.1990.A rapid and simple method forisolation of Neurospora crassa homokaryons using microconidia.[用于使用小分生孢子分离粗糙脉孢菌同核体的迅速并且简单的方法]Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学通讯]37)，同时某些里氏木霉菌株主要具有多核的分生孢子。在里氏木霉中，如果产生多核的分生孢子的菌株不能被产生单核的分生孢子的菌株取代，则需要进行另外的轮的孢子纯化，从而延长该程序。

作为这些差异和其他差异的结果，仍未将辅助菌株概念并入用于里氏木霉中的常规操纵和菌株改进的方法中。

因此，仍然存在对于开发用于多种真菌宿主细胞(包括里氏木霉)的有效率的并且有效的辅助菌株介导的基因组工程化方法和组合物的需求。

发明内容

提供了采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞、例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

本披露的方面在于用于供体DNA与真菌细胞，例如丝状真菌细胞中的基因组座位的同源重组的组合物和方法。

因此，本披露的方面包括用于供体DNA与真菌细胞中的基因组座位的同源重组的方法，该方法包括：(a)产生辅助真菌菌株和靶真菌菌株之间的异核体，其中该辅助真菌菌株包含使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体；(b)将供体DNA引入该异核体中，其中该供体DNA包含对于在该靶菌株中的基因组座位处的同源重组而言与该基因组座位足够同源的区域；(c)自(b)的异核体细胞产生孢子并且接种这些孢子；并且(d)鉴定来自接种的孢子的细胞，在所述细胞中(i)已经通过在基因组座位的同源重组将供体DNA整合进基因组中，以及(ii)不存在使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体。

在某些实施例中，表达构建体使以下项中的一个或多个沉默：ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、和xrs。在某些实施例中，表达构建体使ku80、ku70、或二者沉默。

在某些实施例中，该方法进一步包括将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中，其中该Cas/引导RNA复合物具有基因组座位内的靶位点。在某些实施例中，Cas是Cas切口酶。在一些实例中，Cas内切核酸酶可操作地连接至一个或多个核靶向信号(也称为核定位信号/序列；NLS)。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别提供了具有在N末端和C末端的NLS序列的丝状真菌细胞优化的Cas9基因，以及编码的氨基酸序列的实例。在真核生物中，很多不同的NLS是已知的。它们包括单分型、双分型和三分型。可以使用任何适合的NLS，单分型在某种程度上更适合以下实例，这些实例包括SV40NLS(SEQ ID NO:9)、源自里氏木霉blr2(蓝光调节因子2；SEQ ID NO:10)基因的NLS、或二者的组合。

在某些实施例中，供体DNA包含感兴趣的多核苷酸序列，其中在基因组座位的同源重组导致感兴趣的多核苷酸序列插入该基因组座位。

在某些实施例中，Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或其变体。在某些实施例中，Cas9内切核酸酶或其变体包含来自以下物种的全长Cas9或其功能片段，该物种选自由以下各项组成的组：链球菌属物种，化脓性链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌；弯曲杆菌属物种，空肠弯曲杆菌；奈瑟氏菌属物种，脑膜炎奈瑟球菌；弗朗西丝氏菌属物种，新凶手弗朗西丝菌；和巴斯德菌属物种，多杀巴斯德菌。

在某些实施例中，将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用于Cas内切核酸酶的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用于引导RNA的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该引入步骤包括将Cas内切核酸酶直接引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该引入步骤包括将引导RNA直接引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该真菌细胞是丝状真菌细胞。在某些实施例中，该真菌细胞是真菌亚门或盘菌亚门真菌细胞。在某些实施例中，真菌细胞选自由以下各项组成的组：木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰孢霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、肉座菌属、和裸胞壳属。在某些实施例中，该真菌细胞是木霉属细胞。在某些实施例中，该真菌细胞是木霉属物种，例如里氏木霉。

在一些实施例中，供体DNA已经在真菌细胞的基因组座位处部分整合进基因组中。在一些实施例中，供体DNA已经在真菌细胞的基因组座位处完全整合进基因组中。

在某些实施例中，供体DNA的整合导致基因组座位的修饰。在具体的实施例中，修饰选自由以下各项组成的组：一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、编码感兴趣的蛋白的表达盒的插入、一个或多个核苷酸的取代、及其任何组合。

在某些实施例中，鉴定步骤包括：在针对该供体DNA在该基因组座位处的整合或该基因组座位的修饰进行选择或筛选的条件下，培养从步骤(c)的孢子生长的细胞。

本披露的方面在于由上述方法产生的重组真菌细胞，连同在进行这些方法时用于用作亲本宿主细胞的那些细胞。

在此示出了本披露的方法和组合物的另外的实施例。

附图说明

根据下面的详细描述和附图可以更充分地理解本披露，下面的详细描述和附图形成了本申请的一部分。

图1.使用具有沉默的NHEJ的辅助菌株来改进靶向的DNA盒的同源整合的策略的示意性呈现。NHEJsil＝非同源末端连接沉默盒，GR＝基因置换序列，amdS＝编码来自构巢曲霉的乙酰胺酶的基因，his 3＝编码组氨醇脱氢酶(EC 1.1.1.23)、来自里氏木霉的磷酸核糖基-ATP-焦磷酸水解酶(EC 3.6.1.31)、和磷酸核糖基-AMP环水解酶(EC 3.5.4.19)的多域结构基因，hph＝编码来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因的基因，pyr2＝编码乳清苷5’-单磷酸焦磷酸化酶的基因。

图2A-2C.Ku80沉默构建体的说明：pAVTrku80sil(FIG.2A)、pAVTrku70ku80sil(FIG.2B)、和pAVTrku70lig4ku80sil(FIG.2C)。

图3.his3缺失构建体pAVΔ-his3的说明。hph＝编码来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶的潮霉素抗性基因，kan(R)＝编码磷酸转移酶的卡那霉素抗性基因。

图4.基因置换(GR)构建体pAV GR pyr2。pyr2＝编码乳清苷5’-单磷酸焦磷酸化酶的基因、Apr＝编码β-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因、F1ORI＝复制的F1起点、URA3＝编码乳清苷5’-磷酸脱羧酶的酿酒酵母基因、2MICRON＝酿酒酵母2-微米质粒-起始序列。

图5.异核体转化，其中用构建体同时转化多个菌株。

图 6.包含Cre重组酶基因的端粒载体(表达克隆/pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre)。

图7.用于补充菌落生长并且确定等位基因显性的辅助菌株。

在图5和7中的缩写：

his 3＝编码组氨醇脱氢酶(EC 1.1.1.23)、来自里氏木霉的磷酸核糖基-ATP-焦磷酸水解酶(EC 3.6.1.31)、和磷酸核糖基-AMP环水解酶(EC 3.5.4.19)的多域结构基因

hph＝编码来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因的基因，

ad3A＝编码来自里氏木霉的磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀羧胺合酶(EC 6.3.2.6)的基因。

pyr2＝乳清苷5’-单磷酸焦磷酸化酶基因

图8.his3缺失构建体pAVΔ-his3的说明。

发明详细说明

提供了采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞、例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

在更详细地描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明组合物和方法不限于所描述的具体实施例，并且因此当然可以变化。还应当理解，在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明组合物和方法的范围将仅由所附权利要求书限制。

在提供了一系列值的情况下，应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内，并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内，服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下，排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。

本文提供了某些范围，其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性等值的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.4至6.6，除非pH值另有具体定义。

本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此，将说明书作为一个整体参考时，下面即将定义的术语被定义得更全面。

将本文件分为若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本披露的不同部分的标题不应被解释为限制。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然相似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中，但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。

在本说明书中引用的所有公开物和专利都通过引用结合在此，就好像每个单独的公开物或专利被具体地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对其在申请日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前发明而本发明组合物和方法不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地证实。

根据此详细描述，适用以下缩写和定义。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多个这样的酶，并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。

进一步注意的是，权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此，该陈述意在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语例如“单独”、“仅”等或利用“否定型”限定的前提基础。

如将对于本领域技术人员显而易见的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

定义

术语“功能片段”、“功能上等同的片段(fragment that is functionallyequivalent和functionally equivalent fragment)”等可互换地使用，并且是指保留亲本多肽的定性的酶活性的亲本多肽的一部分或子序列。在此注意到，与亲本多肽相比，功能片段可以具有改变的定量的酶活性。

术语“功能变体”、“功能上等同的变体(variant that is functionallyequivalent和functionally equivalent variant)”等可互换地使用，并且是指保留亲本多肽的定性的酶活性的亲本多肽的变体。在此注意到，与亲本多肽相比，功能变体可以具有改变的定量的酶活性。

可以经由适合的方法获得片段和变体，这些方法包括定点诱变和合成构建。

“基因组”在用于真菌细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体)中的细胞器DNA。

“密码子修饰的基因”或“密码子优选的基因”或“密码子优化的基因”是使其密码子使用频率被设计为模拟宿主细胞优选密码子使用的频率的基因。进行核酸改变以对基因进行密码子优化是“同义的”，意味着它们并不改变亲本基因的编码的多肽的氨基酸序列。然而，对于具体的宿主细胞，天然的和变体的基因都可以被密码子优化，并且因此不旨在这方面进行限制。

“编码序列”是指编码具体的氨基酸序列的多核苷酸序列。“调节序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括但不限于：启动子、翻译前导子序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位点、效应子结合位点、和茎环结构。

“启动子”是指能够控制功能RNA的编码序列的表达的DNA序列。启动子序列由近端元件和较远端上游元件组成，后者的元件通常称为增强子。“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部来源于天然基因，或者由源自于在自然界存在的不同启动子的不同元件构成，和/或包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，因为在大多数情况下还不能完全限定调节序列的确切范围，具有一些变化的DNA片段可能具有相同的启动子活性。如本领域熟知的，可以根据其强度和/或其具有活性的条件，将启动子分类，例如组成型启动子、强启动子、弱启动子、诱导型/阻抑型启动子、组织特异性/发育调节启动子、细胞周期依赖型启动子、等。

“RNA转录物”是指生成自DNA序列的RNA聚合酶催化的转录的产物。“信使RNA”或“mRNA”是指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并且使用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。“有义”RNA是指包含mRNA并且可以在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并且在某些条件下，阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见例如美国专利号5,107,065)。反义RNA的互补性可以是相对于特定基因转录物的任何部分而言的，即相对于5'非编码序列、3'非编码序列、内含子、或编码序列而言的。“功能RNA”是指反义RNA、核糖酶RNA、或可以不翻译为多肽但是仍对细胞过程具有作用的其他RNA。术语“补体”和“反向补体”在此相对于mRNA转录物可互换地使用，并且意在定义信息的反义RNA。

如在此使用，“功能附接”或“可操作地连接”意指具有已知或所期望活性的多肽或多肽序列的调节区域或功能结构域(如启动子、增强子区、终止子、信号序列、表位标签、等)按这样一种方式附接于或连接于靶标(例如，基因或多肽)，以允许调节区域或功能结构域根据其已知或期望的活性来控制该靶标的表达、分泌或功能。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。

当关于生物的组分或组合物(例如细胞、核酸、多肽/酶、载体、等)使用时，术语“重组的”表明生物的组分或组合物处于在自然界不存在状态。换句话说，生物的组分或组合物已经从其自然状态被人为干涉修饰。例如，重组细胞涵盖表达其天然亲本(即非重组的)细胞中不存在的一个或多个基因的细胞，以不同于其天然亲本细胞的量表达一个或多个天然基因的细胞，和/或在不同于其天然亲本细胞的条件下表达一个或多个天然基因的细胞。重组核酸可以通过一个或多个核苷酸与天然序列不同，和/或可操作地连接至异源序列(例如异源启动子、编码非天然的或变体的信号序列的序列、等)，缺少内含子序列，和/或处于隔离型。重组多肽/酶可以通过一个或多个氨基酸与天然序列不同，可以与异源序列融合，可以被截短或具有氨基酸的内部缺失，可以按天然细胞中不存在的方式表达(例如来自由于细胞中存在编码多肽的表达载体而过表达多肽的重组细胞)，和/或处于隔离型。强调的是，在一些实施例中，重组的多核苷酸或多肽/酶具有与其野生型对应物一致但是处于非天然型(例如处于隔离型或富集型)的序列。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指携带感兴趣的多核苷酸序列(例如有待于在细胞中表达的感兴趣的基因)的染色体外元件(“表达载体”或“表达盒”)。这类元件通常处于双链DNA的形式，并且可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(处于线性的或环状的形式)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将感兴趣的多核苷酸引入细胞中。感兴趣的多核苷酸可以是编码有待于在靶细胞中表达的多肽或功能RNA的基因。表达盒/载体通常包含具有允许基因在宿主细胞中表达的可操作地连接的元件的基因。

如在此使用，称为“Cas内切核酸酶”或具有“Cas内切核酸酶活性”的多肽涉及由Cas基因编码的CRISPR相关(Cas)多肽，其中当与一个或多个引导多核苷酸功能上偶联时，Cas蛋白能够切割靶DNA序列(参见例如美国专利8697359，标题为“CRISPR-Cas systemsand methods for altering expression of gene products[用于改变基因产物的表达的CRISPR-Cas系统和方法]”)。保留引导多核苷酸引导的内切核酸酶活性的Cas内切核酸酶的变体也包括在本定义中，包括具有切口内切核酸酶活性的Cas变体，即它们在双链DNA靶位点处引入单链切口(参见以下定义)。(注意到，至今鉴定的野生型Cas内切核酸酶在靶位点处引入双链断裂。)由引导多核苷酸引导Cas内切核酸酶来识别并且切割双链DNA中的特异性靶位点，例如在细胞的基因组中的靶位点处。已经描述了若干不同类型的CRISPR-Cas系统，并且可以将其分类为I型、II型、和III型CRISPR-Cas系统(参见例如Liu和Fan，CRISPR-Cas system:a powerful tool for genome editing[CRISPR-Cas系统：用于基因组编辑的强大工具]，Plant Mol Biol[植物分子生物学]，(2014)85:209-218中的描述)。在某些方面中，CRISPR-Cas系统是采用Cas9内切核酸酶或其变体(包括例如Cas切口酶)的II型CRISPR-Cas系统。Cas9内切核酸酶可以是任何适合的Cas9内切核酸酶，包括但不限于来自以下细菌物种的Cas9内切核酸酶、及其功能片段：链球菌属物种(例如化脓性链球菌、变异链球菌、和嗜热链球菌)，弯曲杆菌属物种(例如空肠弯曲杆菌)，奈瑟氏菌属物种(例如脑膜炎奈瑟球菌)，弗朗西丝氏菌属物种(例如新凶手弗朗西丝菌)，以及巴斯德菌属物种(例如多杀巴斯德菌)。可以使用许多其他物种的Cas9。例如，可以采用包含与SEQ ID NO:2、8、和11-16中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列的功能Cas9内切核酸酶或其变体，例如与SEQ IDNO:2、8、和11-16中的任一个具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、并且包括高达100％同一性。在其他实施例中，Cas内切核酸酶或其变体是II型CRISPR-Cas系统的Cpf1内切核酸酶。Cpf1介导了具有不同于Cas9的特征的稳健的DNA干扰。Cpf1缺少tracrRNA并且利用了富含T的前间区序列邻近基序。它经由交错的DNA双链断裂切割DNA。参见例如Zetsche等人，Cell[细胞](2015)163:759-771。

如在此使用，当与一个或多个引导多核苷酸功能上偶联时，“Cas切口酶”是能够将单链切口引入靶双链DNA序列的Cas内切核酸酶。可以通过将亲本Cas内切核酸酶中的两个核酸酶结构域之一失活(例如通过定点诱变)，来重组地产生Cas切口酶。Cas切口酶的一个非限制性实例是描述于Sander和Joung(Nature Biotechnology[自然生物技术]，2013，1-9)中的Cas9切口酶，其中通过D10A突变使RuvC结构域失活。如上所述，通用术语“Cas内切核酸酶”涵盖双链切割的和切口Cas多肽二者。例如，如果引导RNA被描述为能够将Cas内切核酸酶引导至希望的靶位点，则对于双链切割Cas内切核酸酶和切口Cas多肽(如下文定义)二者，都将是如此。

如在此使用，术语“引导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并切割DNA靶位点的多核苷酸序列。引导多核苷酸可以是单分子或双分子。引导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。仅包含核糖核酸的引导多核苷酸也被称为“引导RNA”。

引导多核苷酸可以是双分子(也称为双链体引导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列(以下也称为“前间区序列”或“靶位点”)互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子引导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体引导多核苷酸的第一个分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可以包括在细菌和古细菌中天然存在的crRNA的片段。在一个实施例中，存在于在此披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的crRNA的片段的大小范围可以是，但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施例中，包含CER结构域的双链体引导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。在某些实施例中，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体的RNA。

引导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。“结构域”意指可以为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列的核苷酸的连续延伸。单引导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，单引导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含与CER结构域连接的VT结构域)，其中该连接是包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单引导多核苷酸可以被称为“单引导RNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单引导DNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单引导RNA-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合构成时)。在本披露的一个实施例中，单引导RNA包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中引导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶引导至真菌细胞基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。

使用单引导多核苷酸对比双链体引导多核苷酸的一个方面是，为了在靶细胞中表达单引导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。

术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链DNA靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的％互补是至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是100％互补的。VT结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一些实施例中，VT结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。VT结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任何组合构成。

术语引导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在此可互换地使用，并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如引导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如在此所述的修饰)或其任何组合构成。

连接单引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，连接单引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长度。在另一个实施例中，连接单引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于GAAA四核苷酸环序列。

如在此使用，术语“引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”(和等效物)包括Cas内切核酸酶和能够在DNA靶位点处引入双链断裂的引导多核苷酸(单或双)的复合物。当由引导RNA识别靶序列时，Cas内切核酸酶紧邻DNA靶位点解开DNA双链体，并且切割两个DNA链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(PAM)被适当地定向在靶序列的3’端。

如在此使用，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能终产物(例如mRNA、引导RNA、或蛋白质)的产生。

在将多核苷酸或多肽插入细胞的背景下的“引入的”(例如重组DNA构建体或表达构建体)是指用于进行这样一个任务的任何方法，并且包括以下项中的任何手段：“转染”、“转化”、“转导”、物理手段或相似手段，用来实现希望的生物分子的引入。

“成熟”蛋白是指翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽)。“前体”蛋白是指mRNA的翻译的初级产物(即其中仍存在前肽和原肽)。前肽和原肽可以是(但不限于)细胞内定位信号。

“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或包含其他DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传(有时在此称为“不稳定转化”)。包含转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因的”生物体。

如在此使用，“真菌细胞”、“真菌”、“真菌宿主细胞”等包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门、和接合菌门(如由以下定义：Hawksworth等人，在Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi[真菌的安-贝氏词典]，第8版，1995，CAB International[国际应用生物科学中心]，University Press[大学出版社]，剑桥，英国)，连同卵菌门(如在Hawksworth等人，同上中引用)，以及有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，同上)。在某些实施例中，真菌宿主细胞是酵母细胞，其中“酵母”意指产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母、以及属于半知菌的酵母(芽孢纲)。因此，酵母宿主细胞包括假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞。酵母的物种包括但不限于以下项：卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、产乳糖酶酵母、和亚罗解脂酵母细胞。

术语“丝状真菌细胞”包括真菌亚门的所有丝状体。丝状真菌属的适合细胞包括但不限于：支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢属、鬼伞属、革盖菌属、棒囊壳属、毛壳菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰刀菌属、赤霉菌属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、毛霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、柱顶孢属、裂褶菌属、孢子丝菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、栓菌属、和木霉属的细胞。丝状真菌物种包括但不限于：泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌(Fusarium cerealis)、克地镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、黑刺烟管菌、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗壮脉纹孢菌、间型脉孢菌、产紫青霉菌、变灰青霉菌、离生青霉菌(Penicillium solitum)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiate)、刺芹侧耳、黄篮状菌(Talaromyces flavus)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉的细胞。

当在Cas/引导多核苷酸系统的背景下使用时，术语“靶位点”、“靶序列”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”(和等效物)在此可互换地使用，并且是指在该处希望发生Cas内切核酸酶切割的真菌细胞的基因组中的多核苷酸序列。然而，在使用此术语的背景下，可以略微改变其含义。例如，针对Cas内切核酸酶的靶位点通常是非常特异性的并且可以通常被定义为确切的核苷酸序列/位置，而在一些情况下，与仅在此发生DNA切割的位点相比，针对希望的基因组修饰的靶位点可以被更广泛地定义，例如，希望发生同源重组的基因组座位或区域。因此，在某些情况下，经由Cas/引导RNA DNA切割的活性发生的基因组修饰被描述为发生在靶位点“处或其附近”。靶位点可以是真菌细胞基因组中的内源位点，或可替代地，靶位点可以与真菌细胞异源，并且由此在基因组中不天然存在，或与其天然存在处相比，靶位点可以发现于异源基因组位置处。

如在此使用，“核酸”意指多核苷酸并且包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链的或双链的聚合物。核酸还可以包括片段和修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换地用来指示任选包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链的RNA和/或DNA的聚合物。核苷酸(通常发现处于其5’-单磷酸酯形式)是指如下其单字母命名：“A”表示腺苷或脱氧腺苷(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞嘧啶或脱氧胞嘧啶，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

术语“衍生自”涵盖术语“源自”、“从...获得”、“可从...获得”、“从...分离”和“从...产生”，并且通常表示一个指定的材料在另一个指定的材料中找到其起源或具有可以参考另一指定材料来描述的特征。

如在此使用，术语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据杂交在其下测量的条件的“严格”度来分类。严格度可以是基于例如结合复合物或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如，“最大严格”通常发生在约Tm 5℃(低于探针的Tm 5℃)；“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的Tm约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。可替代地，或另外，杂交条件可以基于杂交的盐或离子强度条件，和/或基于一个或多个严格洗涤，例如：6X SSC＝非常低严格；3X SSC＝低至中严格；1X SSC＝中严格；并且0.5X SSC＝高严格。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常希望使用相对严格的条件来形成杂交体(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。

如在此使用，术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。更具体来说，“杂交”是指在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的，一个核酸链与互补链形成双链体，即碱基对的过程。如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为核酸序列可与参考核酸序列“选择性杂交”。杂交条件是基于结合复合物或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如，“最大严格”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm5°)；“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的Tm约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列；而中等或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同系物。

中等和高严格杂交条件是本领域熟知的。例如，中等严格杂交可以在37℃下在包括20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×登哈特溶液，10％葡聚糖硫酸盐和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜孵育，然后在约37℃-50℃下以1x SSC洗涤滤器来进行。高严格杂交条件可以是在65℃和0.1X SSC(其中1XSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)下的杂交。可替代地，高度严格杂交条件可以在约42℃下在50％甲酰胺，5X SSC，5X登哈特溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中进行，随后在室温下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并在42℃下在0.1X SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。并且非常高的严格杂交条件可能是在68℃和0.1X SSC下的杂交。如果需要，本领域技术人员知道如何调节温度、离子强度等以适应因素如探针长度等等。

在至少两种核酸或多肽的背景下，“基本相似”或“基本上一致”意指多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少90％，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同一性的序列，或不包括只是为了规避本说明书而不添加功能性的氨基酸取代、插入、缺失或修饰。

在核酸的或多肽的序列的背景下，“序列同一性”或“同一性”是指在两个序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。

“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，该多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。百分比序列同一性的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或从50％至100％的任何整数百分比。可以使用在此描述的任何程序确定这些同一性。

序列比对和百分比同一性或相似性计算可以使用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MegAlign^TM程序。在此申请的背景内，应当理解的是，在使用序列分析软件来分析的情况下，分析的结果将基于参考的程序的“默认值”，除非另外指明。如在此使用，“默认值”将意指当第一次初始化时，最初加载该软件的任意组的值或参数。

“Clustal V比对方法”对应于比对方法标记的Clustal V(由以下描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5:151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci[生物科学中的计算机应用]8:189-191)，并且发现于LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MegAlignTM程序中。对于多重比对，默认值对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。使用Clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、以及存储的对话框(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、以及存储的对话框＝4。使用Clustal V程序比对序列后，可能通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

“Clustal W比对方法”对应于比对方法标记的Clustal W(由以下描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5:151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci[生物科学中的计算机应用]8:189-191)，并且发现于LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MegAlign v6.1程序中。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换重量＝0.5、蛋白质重量矩阵＝Gonnet系列、DNA重量矩阵＝IUB)。使用Clustal W程序比对序列后，可能通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

除非另行说明，否则在此提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下参数的GAP版本10((GCG，Accelrys公司，圣迭哥，利福尼亚州)获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用50的空位产生罚分权重和3的空位长度延伸罚分权重以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用8的空位产生罚分权重和2的空位长度延伸罚分权重以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)。GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453中的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大且空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并且使用匹配碱基的单位中的空位产生罚分和空位延伸罚分，产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。

本领域技术人员熟知的是，很多水平的序列同一性在鉴定来自其他物种的多肽中是有用的，并且被天然地或合成地修饰，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性。百分比同一性的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或从50％至100％的任何整数百分比。实际上，在描述本披露中，从50％至100％的任何整数氨基酸同一性会是有用的，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

“基因”包括编码并且能够表达功能分子，例如但不限于特定多肽(例如酶)，或功能RNA分子(例如引导RNA、反义RNA、核糖酶等)的核酸片段，并且包括编码序列之前的调节序列(5’非编码序列)和/或编码序列之后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。重组基因是指由可能来自不同生物体或相同生物体的不同基因的调节序列调节的基因。

“突变基因”是通过人为干预已经改变的基因。这样一个“突变基因”具有通过至少一个核苷酸添加、缺失或取代而与相应的非突变基因的序列不同的序列。在本披露的某些实施例中，突变基因包含生成自如在此披露的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的改变。突变真菌细胞是包含突变基因的真菌细胞。

如在此使用，“靶向突变”是通过使用涉及双链断裂诱导剂的方法，改变天然基因内的靶序列，而造成的天然基因中的突变，该双链断裂诱导剂能够在如在此披露的或本领域已知的靶序列的DNA中诱导双链断裂。

术语“供体DNA”或“供体核酸序列”或“供体多核苷酸”是指包含有待于插入靶细胞基因组中的感兴趣的多核苷酸序列的多核苷酸。因此，供体DNA中感兴趣的多核苷酸序列可以包括有待于在靶位点处或其附近插入的新颖区域，和/或当与有待于在靶位点处或其附近置换/编辑的核苷酸序列相比时，修饰的多核苷酸序列。在某些实施例中，供体DNA构建体进一步包含插入感兴趣的多核苷酸序列的侧翼的第一和第二同源性区域。供体DNA的第一和第二同源性区域分别与存在于真菌细胞基因组中的第一和第二基因组区域共享同源性。“同源性”意指相似的DNA序列。例如，发现于供体DNA上的“基因组区域的同源性区域”是与真菌细胞基因组中的给定“基因组区域”具有相似序列的DNA的区域。同源性区域可以具有足以促进在切割的靶位点处的同源重组的任何长度。例如，同源性区域可以包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800.5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基长度，这样使得同源性区域具有足够的同源性来经历与相应的基因组区域的同源重组。“足够的同源性”表示两个多核苷酸序列具有足够的结构相似性，来充当用于同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总长度，连同多核苷酸的序列相似性。可以通过针对序列全长的百分比序列同一性，和/或通过包含局部相似性的保守区域，例如具有100％序列同一性的连续核苷酸，以及针对一部分序列长度的百分比序列同一性，来描述序列相似性。

由靶标和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可以变化，并且包括具有处于以下范围中的单位整数值的总长度和/或区域：1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb，或高达并且包括靶位点的总长度。这些范围包括该范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。还可以通过针对包括以下百分比序列同一性的两个多核苷酸的全比对长度的百分比序列同一性来描述同源性的量：约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。足够的同源性包括连续核苷酸的多核苷酸长度、全局百分比序列同一性、以及任选地保守区域，或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。还可以通过两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的预测的能力来描述足够的同源性，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY)[分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约州]；Current Protocols inMolecular Biology[现代分子生物学实验技术]，Ausubel等人，编辑(1994)CurrentProtocols，(Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc)[当前试验方案，格林出版合伙公司和约翰威利父子公司]；以及Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes，(Elsevier，New York)[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交，爱思唯尔，纽约]。

如在此使用，“基因组区域”是在真菌细胞(例如靶细胞)的基因组中的染色体的区段。基因组区域可以包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，这样使得基因组区域具有足够的同源性来经历与相应的同源性区域的同源重组。基因组区域可以包括基因组中Cas/引导RNA靶位点周围的区域。

如在此使用，“同源重组”包括在同源性位点处两个DNA分子之间的DNA片段的交换，并且在本领域进行了充分描述。

“表型标记”是可筛选或可选择的标记，其包括视觉标记和可选择标记，无论其是阳性还是阴性可选择标记。可以使用任何表型标记。具体地，可选择或可筛选的标记包含允许人们通常在特定条件下鉴定、选择、或筛选包含它的分子或细胞，或对其进行筛选的DNA区段。这些标记可以编码活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或可以提供RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等的结合位点。

可选择标记的实例包括但不限于包含限制酶位点的DNA区段；编码提供对针对另外的毒性化合物和抗生素的抗性的产物的DNA区段，该毒性化合物和抗生素例如是氯嘧黄隆、苯菌灵、巴斯塔(Basta)、以及潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码在受体细胞中缺少的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷型标记、主要异源标记-amdS)；编码可以容易地鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，例如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和细胞表面蛋白)；产生用于PCR的新引物位点(例如，以前未并列的两个DNA序列的并列)，包含通过限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学品等不起作用或起作用的DNA序列；并且包含允许其鉴定的特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列。

用于修饰真菌细胞基因组的方法和组合物

如以上汇总，本披露提供了用于采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞，例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

在描述本披露的方面之前，重要的是注意到在不同真菌细胞物种之间，例如在里氏木霉和粗糙脉孢菌之间，以不同方式执行或控制多个细胞过程，例如调节衰老的分子过程。在粗糙脉孢菌中，将突变引入为泛素连接酶复合物的一部分的mus-10、为mitofuzin的F-box蛋白(Kato，等人，2010，Genetics[遗传学]185,1257-1269)，或fzo-1，一种mitofuzin(Kurashima，等人，2013，Eukaryot.Cell[真核细胞]12(2),233-243)引起结果是细胞死亡的衰老。当等同的突变被引入里氏木霉mus-10和fzo-1时，未观察到细胞死亡。因此，在一个物种(例如粗糙脉孢菌)中证实的过程不能自动地外推至所有其他物种(例如里氏木霉)。

里氏木霉具有两个主要模式，借此将DNA片段并入其基因组中：同源整合和异位整合。非同源末端连接(NHEJ)机器对于异位整合而言是重要的，并且如果这一机器的部件被缺失，则同源整合率显著增加(Guangtao，等人，2009，J.Biotechnol.[生物技术杂志]139,146-151)。

因此，用来增加靶菌株中的DNA片段的同源重组的一个替代方式是使用其中一个或多个NHEJ部件被沉默的辅助菌株(图1)。首先，辅助菌株(HS)被产生为包含NHEJ基因沉默构建体(具有amdS选择标记；乙酰胺酶)和第一营养标记(Δhis；菌株缺少组氨醇脱氢酶)。将这一菌株融合至包含第二不同营养标记(Δpyr2)的靶菌株(TS)。为了靶菌株和辅助菌株的方便并且更容易的分化，可以将隐性特征添加至靶菌株(例如改变的菌落形态或孢子颜色)，但是这一添加是任选的。在基本培养基上，强迫型异核体的共享细胞质允许在两个菌株中的NHEJ沉默。然后用包含与靶菌株基因组DNA(GR)同源的序列和补足靶菌株的营养标记缺陷的选择标记(pyr2；该构建体表示为GR::pyr2)的DNA片段转化这一异核体。将转化体涂板在选择培养基上，并且收获主要是单核的分生孢子。将分生孢子涂板在无任何补充剂的选择性基本培养基上。源自具有靶菌株细胞核(该细胞核具有同源整合的基因置换(GR::pyr2))的孢子的菌落将在选择性基本培养基上生长，因为它们对第二营养标记缺陷(Δpyr)进行了补充。它们还将具有隐性表型(例如改变的菌落形态或孢子颜色)。仅具有辅助菌株细胞核的孢子将不生长，因为基本培养基并不包含第一营养标记补充剂(在这一情况下，为L-组氨酸)。源自异核体孢子的菌落将在基本培养基上生长，但是他们的表型将是显性的(例如野生型菌落形态或野生型孢子颜色)，并且它们将被消除。

通过使用对NHEJ机器进行沉默的辅助菌株，可以实现同源重组的增加而不修饰靶菌株的基因组，减少了菌株发育所需的大量费力并且费时的步骤。

本披露的方面在于用于供体DNA与真菌细胞，例如丝状真菌细胞中的基因组座位的同源重组的组合物和方法。

因此，本披露的方面包括用于供体DNA与真菌细胞中的基因组座位的同源重组的方法，该方法包括：(a)产生辅助真菌菌株和靶真菌菌株之间的异核体，其中该辅助真菌菌株包含使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体；(b)将供体DNA引入该异核体中，其中该供体DNA包含对于在该靶菌株中的基因组座位处的同源重组而言与该基因组座位足够同源的区域；(c)自(b)的异核体细胞产生孢子并且接种这些孢子；并且(d)鉴定来自接种的孢子的细胞，在所述细胞中(i)已经通过在基因组座位的同源重组将供体DNA整合进基因组中，以及(ii)不存在使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体。

在某些实施例中，表达构建体使以下项中的一个或多个沉默：ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、和xrs。在某些实施例中，表达构建体使ku80、ku70、或二者沉默。

在某些实施例中，Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或其变体。在某些实施例中，Cas9内切核酸酶或其变体包含来自以下物种的全长Cas9或其功能片段，该物种选自由以下各项组成的组：链球菌属物种，化脓性链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌；弯曲杆菌属物种，空肠弯曲杆菌；奈瑟氏菌属物种，脑膜炎奈瑟球菌；弗朗西丝氏菌属物种，新凶手弗朗西丝菌；和巴斯德菌属物种，多杀巴斯德菌。

在某些实施例中，将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用于Cas内切核酸酶的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用于引导RNA的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该引入步骤包括将Cas内切核酸酶直接引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该引入步骤包括将引导RNA直接引入该真菌细胞中。

在某些实施例中，该真菌细胞是丝状真菌细胞。在某些实施例中，该真菌细胞是真菌亚门或盘菌亚门真菌细胞。在某些实施例中，真菌细胞选自由以下各项组成的组：木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰孢霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、肉座菌属、和裸胞壳属。在某些实施例中，该真菌细胞是木霉属细胞。在某些实施例中，该真菌细胞是木霉属物种，例如里氏木霉。

在一些实施例中，供体DNA已经在真菌细胞的基因组座位处部分整合进基因组中。在一些实施例中，供体DNA已经在真菌细胞的基因组座位处完全整合进基因组中。“部分整合的”可以包括其中一部分供体DNA与真菌细胞的基因组重组的情境，例如供体DNA的20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或更多整合进真菌细胞的基因组中。

在某些实施例中，供体DNA的整合导致基因组座位的修饰。在具体的实施例中，修饰选自由以下各项组成的组：一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、编码感兴趣的蛋白的表达盒的插入、一个或多个核苷酸的取代、及其任何组合。在一些实施例中，修饰最初存在于供体DNA中。在某些实施例中，由表达盒编码的感兴趣的蛋白是酶。在具体的实施例中，感兴趣的蛋白是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段或其两种或更多种的杂混物或混合物。在又其他具体的实施例中，感兴趣的蛋白是肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的杂混物或混合物。

在某些实施例中，鉴定步骤包括：在针对该供体DNA在该基因组座位处的整合或该基因组座位的修饰进行选择或筛选的条件下，培养从步骤(c)的孢子生长的细胞。。以下提供了这些方面中的每一个的另外的细节。

可以按任何适合的方式，包括转染、转导、转化、电穿孔、粒子轰击、细胞融合技术等，来进行Cas内切核酸酶、引导多核苷酸、和/或供体DNA的引入。可以按使用者希望的，同时地或顺序地引入这些组分中的每一种。例如，可以用Cas表达DNA构建体稳定地转染真菌细胞，随后将引导多核苷酸引入稳定转染子(直接地引入抑或使用表达引导多核苷酸的DNA构建体)。这一设置可以甚至是有利的，因为使用者可以产生其中可以独立地引入不同引导多核苷酸的稳定Cas转染子真菌细胞的群体(在一些情况下，应该希望的是，可以将多于一种引导多核苷酸引入同一细胞)。在一些实施例中，使用者获得了表达Cas的真菌细胞，并且因此使用者并不需要将能够表达Cas内切核酸酶的重组DNA构建体引入细胞，但是还需要将引导多核苷酸引入表达Cas的细胞。

在某些实施例中，通过引入包含编码引导多核苷酸的表达盒(或基因)的重组DNA构建体，将引导多核苷酸引入真菌细胞/异核体。在一些实施例中，表达盒可操作地连接至真核RNA pol III启动子。这些启动子是特别引人关注的，因为通过RNA pol III进行转录并不导致当通过来自RNA pol II依赖型启动子的RNA聚合酶II进行转录时发生的5’帽结构的添加或聚腺苷酸化。在某些实施例中，RNA pol III启动子是丝状真菌细胞U6聚合酶III启动子(例如SEQ ID NO:3及其功能变体，例如SEQ ID NO:4；在下文进一步详细描述)。在某些实施例中，由U6聚合酶III启动子控制的基因包括U6基因内含子(SEQ ID NO:5)和/或U6基因转录终止子(SEQ ID NO:6)。

我们已经发现在丝状真菌中，在双链断裂处，转化的DNA的非同源插入是高度有利的，优于在双链断裂处、染色体DNA的两端之间的简单末端连接。因此，在其中通过用包含一个或多个DNA构建体的表达盒进行转化提供Cas内切核酸酶或引导RNA的情况下，在双链断裂处，以高频率插入那些DNA构建体或其片段。在Cas内切核酸酶或引导RNA表达构建体上的DNA序列和双链断裂周围的序列之间不存在同源性的情况下，发生这一插入。当希望发生供体DNA和基因组座位之间的同源重组时，这一过程也是有问题的，因为完整的供体DNA的插入比同源重组有利。我们已经发现，甚至当其处于包含预期在真菌细胞中自主维持的端粒序列的载体的形式时，发生转化的DNA的不希望的插入。

本披露的某些实施例包括将Cas内切核酸酶表达盒(和任选地可选择标记)整合进辅助菌株的基因组中，来产生表达Cas内切核酸酶的辅助菌株。可以按许多方式采用这些辅助细胞，来获得靶菌株中感兴趣的遗传修饰，例如包括供体DNA与靶菌株的基因组的同源重组。

例如，表达Cas内切核酸酶的宿主细胞可以用于产生可以反过来向“靶菌株”提供Cas内切核酸酶的“辅助菌株”。简言之，可以在辅助菌株和靶菌株之间产生异核体，例如通过来自各自菌株的原生质体的融合，或通过取决于丝状真菌的物种的菌丝的接合。异核体的维持将取决于在各自亲本菌株中适当的营养标记或其他标记基因或突变，和在适合的选择性培养基上的生长，这样使得亲本菌株不能生长，而异核体由于互补，能够生长。在异核体形成时或随后，通过转染引入引导RNA(以及任选地供体DNA)。可以直接引入引导RNA，或经由具有Cas内切核酸酶表达盒和可选择标记基因的DNA构建体，引入引导RNA。Cas内切核酸酶表达自辅助菌株细胞核中的基因，并且存在于异核体的细胞质中。Cas内切核酸酶关联引导RNA，从而产生靶向基因组中一个或多个希望的靶位点的活性复合物。随后，从异核体回收孢子，并且经历选择或筛选，来回收在靶位点处或其附近具有修饰的靶菌株(例如，在基因组座位处，与供体DNA进行同源重组)。在其中表达盒被用于引入引导RNA的情况下，选择其中不稳定维持引导RNA表达构建体的异核体。

如以上所指出，本披露的方法包括将DNA构建体引入具有与染色体DNA(例如在Cas/引导RNA复合物的靶位点的每一侧上)的区域具有DNA序列同源性的细胞(或供体DNA)中。该意图是用于将DNA片段(例如线性DNA片段)通过同源整合/重组整合进靶细胞基因组中。

关于真菌细胞中的DNA修复，我们已经发现，在功能性NHEJ途径存在下，易错修复是有利的，优于在双链断裂位点处的同源重组。换句话说，关于在丝状真菌细胞中的双链断裂的DNA修复(在靶位点处，通过Cas/引导RNA复合物引入的那些)，我们已经发现，在功能性NHEJ途径存在下，在断裂处的DNA的非同源插入是高度有利的，优于(1)无DNA插入的非同源末端连接，以及(2)在双链断裂位点处与供体DNA的同源重组。因此，在本发明的某些方面，在处于群体的真菌细胞中，在靶位点处的非同源末端连接(NHEJ)途径的功能被抑制，而不是激活，是非功能的，或被减小。这可以按任何适合的方式实现，以下描述了其中的一些。

在一些实例中，供体DNA包括与真菌细胞的基因组中的相应的第一和第二区域同源的第一区域和第二区域。例如，同源性区域可以包括或围绕在该处基因组DNA被Cas内切核酸酶切割的靶位点。这些同源性区域促进了与其相应的基因组同源性区域的同源重组，导致供体DNA和基因组之间的DNA的交换。因此，提供的方法导致在异核体的靶细胞基因组中的同源区域处，供体DNA的感兴趣的多核苷酸的整合，其中当应用适当孢子形成/选择标准至异核体时，在靶细胞中产生改变的基因组。

给定基因组区域和在供体DNA上发现的相应的同源性区域之间的结构相似性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，由供体DNA的“同源性区域”和真菌细胞基因组的“基因组区域”共享的同源性或序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％序列同一性，这样使得序列经历同源重组。

可以通过任何适合的手段(如下文在别处讨论)引入供体DNA。

在其中采用Cas/引导RNA系统的某些实施例中，Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶(参见例如WO 2013141680，标题为“RNA-directed DNA Cleavage by the Cas9-crRNAComplex[通过Cas9-crRNA复合物的RNA引导的DNA切割]”)。Cas9内切核酸酶的实例包括来自以下项的那些：链球菌属物种(例如化脓性链球菌、变异链球菌、和嗜热链球菌)，弯曲杆菌属物种(例如空肠弯曲杆菌)，奈瑟氏菌属物种(例如脑膜炎奈瑟球菌)，弗朗西丝氏菌属物种(例如新凶手弗朗西丝菌)，和巴斯德菌属物种(例如多杀巴斯德菌)(例如SEQ ID NO:8和11至16，其功能片段，以及与保留功能活性的这些序列中的任一个具有至少80％序列同一性的序列)(参见例如以下文献描述的Cas9内切核酸酶：Fonfara等人，Nucleic AcidsRes.[核酸研究]，2013，1-14页：通过引用结合在此)。在一些实施例中，Cas内切核酸酶是由优化的Cas9内切核酸酶基因，例如优化用于在真菌细胞中表达(例如包含SEQ ID NO:7的Cas9编码基因，例如SEQ ID NO:1，如下文描述)编码的。

在某些实例中，Cas内切核酸酶基因可操作地连接至编码核定位信号的一个或多个多核苷酸上，这样使得在细胞中表达的Cas内切核酸酶/引导多核苷酸复合物被有效转运至细胞核。可以使用任何适合的核定位信号，例如存在于Cas密码子区上游并且与其框内融合的编码SV40核定位信号的多核苷酸，和存在于Cas密码子区下游并且与其框内融合的编码源自里氏木霉blr2(蓝光调节因子2)的核定位信号的多核苷酸。可以采用其他核定位信号。例如，Cas内切核酸酶可以可操作地连接至一个或多个核靶向信号(也称为核定位信号/序列；NLS)。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别提供了具有在N末端和C末端的NLS序列的丝状真菌细胞优化的Cas9基因，以及编码的氨基酸序列的实例。在真核生物中，很多不同的NLS是已知的。它们包括单分型、双分型和三分型。可以使用任何适合的NLS，单分型在某种程度上更适合以下实例，这些实例包括SV40NLS、源自里氏木霉blr2(蓝光调节因子2)基因的NLS、或二者的组合。

在本披露的某些实施例中，引导多核苷酸是包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA区域(或crRNA片段)和tracrRNA区域(或tracrRNA片段)的引导RNA。如以上指示的，引导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶引导至真菌细胞基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。在一些情况下，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含crRNA和单独的tracrRNA的双链体。在其他实例中，引导RNA是包含crRNA区域和tracrRNA区域二者的单个RNA分子(有时在此称为融合的引导RNA)。使用融合的引导RNA对比双链体的crRNA-tracrRNA的一个优点是仅需要制造一个表达盒，来表达融合的引导RNA。

可以使用披露的方法，通过Cas内切核酸酶来靶向真菌细胞基因组中几乎任何位点，只要靶位点包括需要的前间区序列邻近基序(PAM)。在化脓性链球菌Cas9的情况下，PAM具有序列NGG(5’至3’；其中N是A、G、C或T)，并且因此不对基因组中靶位点的选择强加显著限制。其他已知Cas9内切核酸酶具有不同PAM位点(参见例如以下文献中描述的Cas9内切核酸酶PAM位点：Fonfara等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，2013，1-14页：通过引用结合在此)。

靶位点的长度可以变化，并且包括例如为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸长度的靶位点。进一步可能的是，靶位点可以是回文的，即一个链上的序列与互补链上按相反方向读起来是相同的。切割位点可以在靶序列内，或切割位点可以在靶序列外。在另一个变化中，切割可以发生在正好彼此相对的核苷酸位置处，从而产生平端切割，或在其他情况下，切口可以是交错的，从而产生单链突出端，也称为“粘性末端”，它可以是5’突出端，抑或是3’突出端。

在一些情况下，也可以使用真菌细胞的基因组中的活性变体靶序列，这意味着靶序列并不是与引导多核苷酸中的相关序列(在引导多核苷酸的crRNA序列内)100％一致。此类活性变体可以包含与给定靶位点的至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，其中活性变体靶序列保留生物活性并且因此能够由Cas内切核酸酶识别和切割。用来通过内切核酸酶测量靶位点的双链断裂的测定是本领域已知的，并且通常测量试剂对包含识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。

感兴趣的靶位点包括位于感兴趣的基因的一个区域内的那些。感兴趣的基因内的区域的非限制性实例包括开放阅读框、启动子、转录调节元件、翻译调节元件、转录终止序列、mRNA剪接位点、蛋白编码序列、内含子位点、和内含子增强基序。在某些情况下，当供体DNA包含真菌细胞的基因组座位的同源性区域时，引入真菌细胞的Cas内切核酸酶和引导RNA能够形成复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够充当真菌细胞的基因组座位中的或其附近的靶位点。在一些实施例中，基因组上的Cas内切核酸酶切割位点(或靶位点)是在供体DNA和基因组座位之间的同源区域中，那里可以发生同源重组。在其他实施例中，切割位点在可以是距离同源区域从1bp至约10kb，例如距离同源区域的位点1bp、2bp、5bp、10bp、20bp、50bp、100bp、250bp、500bp、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、或10kb的任何位置的供体DNA和基因组座位之间的同源区域附近。

在某些实施例中，真菌细胞的基因组的修饰导致可以检测到的表型效应，这在很多情况下，是使用者希望的结果。非限制性实例包括获得可选择细胞生长表型(例如，对抗生素的抗性或敏感性、获得或失去营养缺陷型特征、增加或降低的生长速度等)，表达可检测标记(例如荧光标记、细胞表面分子、显色酶等)，以及选择其活性可以在培养上清液中检测到的酶)。

当真菌细胞的基因组的修饰导致表型效应时，通常采用的供体DNA包含为表型标记(或编码表型标记)的感兴趣的多核苷酸。可以使用任何适合的表型标记，包括允许人们通常在特定培养条件下鉴定、选择、或筛选包含它的真菌细胞，或对其进行筛选的任何可选择或可筛选标记。因此，在本发明的一些方面，具有希望的基因组修饰的真菌细胞的鉴定包括在针对靶位点处具有修饰的细胞进行选择或筛选的条件下，培养已经接收了Cas内切核酸酶和引导多核苷酸(以及任选地供体DNA)的真菌细胞群体。可以采用任何类型的选择系统，包括评估真菌细胞中酶活性(也称为可选择标记)的获得或失去，例如抗生素抗性的获得，或营养缺陷型标记的获得/失去。

在一些实例中，使用任何适合的方法(包括测序、PCR、DNA印迹、限制性内切酶分析等，包括此类方法的组合)直接检测真菌细胞中的基因组修饰。

在一些实施例中，使用披露的方法将特定基因靶向用于修饰，该基因包括编码酶的基因，这些酶例如是乙酸酯酶、胺肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、甲壳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酸酯酶、果胶解聚合酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。

本披露的方面在于由上述方法产生的重组真菌细胞，连同在进行这些方法时用于用作亲本宿主细胞的那些细胞。

在此示出了本披露的方法和组合物的另外的实施例。在此披露的方法和组合物的非限制性实例或实施例如下：

1.一种用于使供体DNA与真菌细胞中的基因组座位进行同源重组的方法，该方法包括：

(a)产生辅助真菌菌株和靶真菌菌株之间的异核体，其中该辅助真菌菌株包含使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体；

(b)将供体DNA引入该异核体中，其中该供体DNA包含对于在该靶菌株中的基因组座位处的同源重组而言与该基因组座位足够同源的区域；

(c)自(b)的异核体细胞产生孢子并且接种这些孢子；并且

(d)鉴定来自接种的孢子的细胞，在所述细胞中(i)已经通过在该基因组座位处的同源重组将该供体DNA整合进该基因组中，以及(ii)不存在使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体。

2.如实施例1所述的方法，其中该表达构建体使以下项中的一个或多个沉默：ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、和xrs。

3.如实施例2所述的方法，其中该表达构建体使ku80、ku70、或二者沉默。

4.如实施例1至3中任一项所述的方法，该方法进一步包括将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中，其中该Cas/引导RNA复合物具有基因组座位内的靶位点。

5.如实施例4所述的方法，其中该Cas是Cas切口酶。

6.如任何前述实施例所述的方法，其中供体DNA包含感兴趣的多核苷酸序列，其中在基因组座位处的同源重组导致感兴趣的多核苷酸序列插入该基因组座位。

7.如任何前述实施例所述的方法，其中Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或其变体。

8.如实施例7所述的方法，其中该Cas9内切核酸酶或其变体包含来自以下物种的全长Cas9或其功能片段，该物种选自由以下各项组成的组：链球菌属物种，化脓性链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌；弯曲杆菌属物种，空肠弯曲杆菌；奈瑟氏菌属物种，脑膜炎奈瑟球菌；弗朗西丝氏菌属物种，新凶手弗朗西丝菌；和巴斯德菌属物种，多杀巴斯德菌。

9.如实施例4至8中任一项所述的方法，其中将该功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用于Cas内切核酸酶的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

10.如实施例4至9中任一项所述的方法，其中将该功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含用引导RNA的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。

11.如实施例4至8或10中任一项所述的方法，其中该引入步骤包括将Cas内切核酸酶直接引入该真菌细胞中。

12.如实施例4至9或11中任一项所述的方法，其中该引入步骤包括将引导RNA直接引入该真菌细胞中。

13.如任何前述实施例所述的方法，其中该真菌细胞是丝状真菌细胞。

14.如任何前述实施例所述的方法，其中该真菌细胞是真菌亚门或盘菌亚门真菌细胞。

15.如任何前述实施例所述的方法，其中丝状真菌细胞选自由以下各项组成的组：木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰孢霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、肉座菌属、和裸胞壳属。

16.如任何前述实施例所述的方法，其中该真菌细胞是木霉属物种细胞。

17.如实施例16所述的方法，其中该木霉属物种是里氏木霉。

18.如任何前述实施例所述的方法，其中该供体DNA已经在该基因组座位处部分整合进该基因组中。

19.如任何前述实施例所述的方法，其中供体DNA的整合导致该基因组座位的修饰。

20.如实施例19所述的方法，其中该修饰选自由以下各项组成的组：一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、编码感兴趣的蛋白的表达盒的插入、一个或多个核苷酸的取代、及其任何组合。

21.如任何前述实施例所述的方法，其中该鉴定步骤包括：在针对该供体DNA在该基因组座位处的整合或该基因组座位的修饰进行选择或筛选的条件下，培养从步骤(c)的孢子生长的细胞。

22.一种通过如任何前述实施例所述的方法产生的重组真菌细胞。

实例

在以下实例中，除非另行说明，份数和百分比是按重量计，并且温度是摄氏度。应该理解，尽管这些实例说明了本披露的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域技术人员可以对本披露作出不同改变和修改，使其适应不同用途和条件。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。

基于辅助菌株的概念可以提供益处至其中里氏木霉或另一种丝状真菌被用作宿主，并且其中需要高的同源整合率的任何项目中。

实例1：辅助菌株用于补充菌落生长并且确定等位基因显性的用途

进行试验，从而使用辅助菌株来补充菌落生长并且确定等位基因显性。在图7中示出了此类试验之一的工作流程和结果。这一试验的步骤包括：

1)将辅助菌株(HS)和靶菌株(图7中的CS或菌落菌株)融合进异核体；

2)从该异核体产生分生孢子；

3)收获这些分生孢子并且稀释至适当浓度；

4)将分生孢子涂板在选择性培养基上，并且对菌落计数，从而为表型和营养缺陷型评分；并且

5)确认获得的菌株。

在这一具体实施例中，辅助菌株(HS)是具有野生型菌落生长速率和分生孢子生长的RL-P37Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2Δhis3菌株，并且靶菌落菌株(CS)是具有改变感兴趣的特征的感兴趣的基因的缺失的RL-P37Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2Δpyr2菌株(在这一实验中，感兴趣的特征是正常菌落生长速率和分生孢子生长，所以基因缺失菌株具有减少的菌落生长速率和分生孢子生长)。将HS菌株和CS菌株的原生质体共接种到补充有山梨糖醇的基本培养基平板上。在菌株融合进异核体并且开始生长后，将它们转移至无补充剂的基本培养基平板上，并且在28℃下并且按12h光暗循环，在促进分生孢子产生的条件下生长。该异核体具有等同于辅助菌株的野生型菌落生长和分生孢子生长，说明补全了CS菌株的减少的菌落生长和分生孢子生长，并且说明标记基因是隐性的。从异核体收获成熟的分生孢子，并且将连续稀释的分生孢子涂板到补充有组氨酸抑或尿苷的选择性基本培养基上。将当转移至基本培养基时生长的菌落鉴定为异核体并且将其消除。在补充有组氨酸的基本培养基上生长的所有菌株具有野生型菌落生长和分生孢子生长，这是与辅助菌株相关的特征。在补充有尿苷的基本培养基上生长的所有菌株具有减少的菌落生长和分生孢子生长，这是与感兴趣的基因的隐性突变相关的特征。这说明可以从异核体挽救包含感兴趣的基因的隐性突变的具有次最优的、减少的菌落生长和分生孢子生长的菌株。

实例2：具有DNA构建体的真菌细胞中的NHEJ机制的沉默

构建体

用于使ku80沉默的pAVTrku80sil构建体(图2A)包含被内含子序列中断的正义和反义ku80DNA序列，并且被异向启动子驱动。该异向启动子还驱动Ptilosarcus属物种绿色荧光蛋白(PtGFP)的表达，该蛋白用作反义盒表达的指标。该构建体还包含amdS选择性标记。

已经产生并且验证了用于使ku80和ku70二者沉默的中间构建体(pAVTrku70ku80sil，图2B)，以及用于使ku70、lig4和ku80沉默的另一构建体(pAVTrku70lig4ku80sil，图2C)。它们包含各自基因的大约500bp正义序列、内含子和等同的反义序列，随后是酵母pRS426载体主链中的ku70终止序列。

已经在酵母中体外组装并且克隆了整合进pRS426载体的基因置换构建体片段。将从这一构建体扩增具有pyr2标记的基因置换盒。

菌株

用里氏木霉ku80基因沉默构建体转化里氏木霉菌株(RL-P37Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2)(图2A)。选择、验证并且孢子纯化具有强GFP信号的六个稳定候选菌株。来自六个候选菌株中的每一个的四个孢子纯化的分离物在24孔板中生长，并且评估GFP信号的强度、沉默水平的指示。选择具有最高GFP信号的来自每个候选菌株的一个孢子纯化的分离物，用于使用Δhis3::hph缺失构建体进行转化。

实验方案

通过使用包含hph选择性标记的线性his3缺失盒(图3)进行转化，针对同源整合的效率，测试具有最高水平的GFP表达的包含沉默构建体的来自以上项的孢子纯化的菌株。选择具有最高比例的包含Δhis3缺失的转化体(60％)的沉默菌株(说明最高水平的NHEJ沉默)，并且将其用作辅助菌株。辅助菌株将与宿主菌株融合，该宿主菌株具有非功能pyr2基因座(营养标记)，和任选地改变的菌落形态(隐性特征)。然后将通过使用包含功能pyr2标记作为选择性标记(这一标记也是营养标记)的线性基因置换构建体(图4)进行的PEG转化，转化在基本培养基上生长的强迫型异核体，并且将其在基本培养基上涂板。将收获分生孢子，并且将连续稀释物在基本培养基上涂板。将针对缺失构建体的同源重组，评估在基本培养基上生长的菌落(并且具有改变的菌落形态，如果包括该特征的话)，并且将确定同源重组的效率。

以下描述了辅助菌株组合物和方法如何可以被采用的特定非限制性实例。

实例3：Cre重组酶在用于在靶细胞中去除DNA片段的辅助菌株或异核体中的用途

在一个实施例中，使用者可以在辅助菌株中表达Cre重组酶，并且将其用于去除侧翼是loxP位点的靶细胞中的任何DNA片段。

在另一个实施例中，使用者可以将表达Cre重组酶的端粒载体引入异核体，并且同时在辅助菌株和靶菌株的每一个中，去除侧翼是loxP位点的一个或多个DNA片段。示意性实例示出于图5中。通过同源重组获得两个缺失菌株，每个菌株具有缺失盒，该缺失盒包含侧翼是在野生型菌株的ad3A基因座处(菌株2)或his3基因座(菌株1)处的两个loxP位点的hph标记。为了再循环hph标记并且同时将其从一个或全部两个菌株去除，首先使用实例1中描述的程序，将菌株1和菌株2融合进强迫型异核体中。然后通过基因枪转化或PEC转化，用携带amdS标记的含cre端粒载体(图6)转化该异核体，然后将该异核体在适当的含乙酰胺平板上增殖，从而维持该载体。尽管在选择下，端粒载体提供Cre至全部两个组分菌株而不整合进基因组中，允许在loxP位点处的重组，并且在一个或全部两个起作用的基因组中环出hph标记。收获来自转化的异核体的分生孢子，并且将其涂板到补充有腺嘌呤和组氨酸的PDA培养基上。在经补充的PDA培养基上限定次数的转移后，针对营养缺陷型和对潮霉素B的抗性，测试单个菌落。已经环出hph盒的具有ad3A和his3缺失的菌株对潮霉素B没有抗性。为了确保端粒载体整合进基因组中的罕见事件不发生，通过PCR分析，针对端粒载体DNA片段的存在测试菌株，并且消除已经整合了含cre端粒载体的候选菌株。通过诊断PCR，确认野生型Δhis3Δhph菌株。这些结果说明，从引入异核体的端粒载体表达的Cre重组酶能够在不具有进入基因组的载体整合的辅助菌株和靶菌株的每一者中，成功去除侧翼是loxP位点的一个或多个DNA片段。

实例4：辅助菌株中的Cas RNA引导的内切核酸酶用于在靶细胞中产生靶向的双链 DNA断裂的用途

在另一个实施例中，使用者可以在优选具有沉默的NHEJ的辅助菌株中表达CasRNA引导的内切核酸酶，并且使用其来在靶细胞中产生靶向的双链DNA断裂。一个益处是，双链DNA断裂通过在靶位点处的同源重组，刺激供体DNA片段的整合。使NHEJ沉默最小化了经由NHEJ途径的供体DNA片段整合的频率。在一个实施例中，用类似于PCT申请号PCT/CN2014/093914(2014年12月16日提交，通过引用结合在此)中披露的那些的Cas9表达载体(图8)转化包含如实例2中描述的NHEJ沉默DNA构建体和展现有效同源重组的辅助菌株。这一载体使用了赋予对氯嘧磺隆的抗性作为可选择标记的里氏木霉als1基因的突变体版本，并且将已经稳定整合载体进染色体DNA的转化体选择为新的辅助菌株。将这一辅助菌株与靶菌株(具有非功能pyr2基因)融合，从而在缺少组氨酸和尿苷的选择性培养基上产生强迫型异核体。然后将该异核体与sgRNA(单引导RNA)和希望在靶细胞的基因组内发生在限定的靶位点处的整合的供体DNA片段的混合物共转化。将sgRNA设计为引导cas9内切核酸酶至所述限定的靶位点，并且该sgRNA是使用如在PCT申请号PCT/CN 2014/093916(2014年12月16日提交，通过引用结合在此)中描述的体外转录反应产生的。如以下提供了设计为引导Cas9至里氏木霉的ad3A、糖化酶(TrGA)、或pyr2基因的sgRNA的序列的实例。

sgRNA:gAd3A TS1；SEQ ID NO:17

guccucgagcaaaaggugccGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC。

sgRNA:gTrGA TS2；SEQ ID NO:18

guucagugcaauaggcgucuGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

sgRNA:gTrGA TS11；SEQ ID NO:19

gccaauggcgacggcagcacGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

sgRNA:gPyr2TS6；SEQ ID NO:20

gcacagcgggaugcccuuguGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

可替代地，在sgRNA的适当位置，包含sgRNA表达盒的DNA构建体被包括进共转化中。希望发生在限定的靶位点处的整合的DNA片段包括在cas9靶位点的一侧上具有侧翼DNA区域的末端同源性区域。它还包括可选择标记(例如pyr2)和用于感兴趣的基因的表达盒。当异核体的孢子形成，并且涂板了孢子，分离具有靶细胞表型但是对尿苷而言是原养型的(pyr2+)的菌落，并且针对在靶位点处的DNA片段的整合进行筛选。有利地，这一方法允许在同一靶位点处具有整合的不同感兴趣的基因的转化体的有效产生。

虽然前述组合物和方法已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述，但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文的传授内容显而易见的是可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。

因此，前面仅仅举例说明了本发明组合物和方法的原理。将了解的是本领域技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但体现本发明组合物和方法的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外，本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解诸位发明人所贡献的本发明的组合物和方法的原理和概念以推动本领域发展，并且将被视为而不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明组合物和方法的原理、方面、以及实施例的所有陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即不论结构如何而执行相同功能的任何开发的要素。因此，本发明的组合物和方法的范围不是旨在受限于本文显示和描述的示例性实施例。

序列

SEQ ID NO:1

密码子优化的化脓性链球菌Cas9编码基因；具有N-和C末端NLS序列

atggcaccgaagaagaagcgcaaggtgatggacaagaagtacagcatcggcctcgacatcggcaccaactcggtgggctgggccgtcatcacggacgaatataaggtcccgtcgaagaagttcaaggtcctcggcaatacagaccgccacagcatcaagaaaaacttgatcggcgccctcctgttcgatagcggcgagaccgcggaggcgaccaggctcaagaggaccgccaggagacggtacactaggcgcaagaacaggatctgctacctgcaggagatcttcagcaacgagatggcgaaggtggacgactccttcttccaccgcctggaggaatcattcctggtggaggaggacaagaagcatgagcggcacccaatcttcggcaacatcgtcgacgaggtggcctaccacgagaagtacccgacaatctaccacctccggaagaaactggtggacagcacagacaaggcggacctccggctcatctaccttgccctcgcgcatatgatcaagttccgcggccacttcctcatcgagggcgacctgaacccggacaactccgacgtggacaagctgttcatccagctcgtgcagacgtacaatcaactgttcgaggagaaccccataaacgctagcggcgtggacgccaaggccatcctctcggccaggctctcgaaatcaagaaggctggagaaccttatcgcgcagttgccaggcgaaaagaagaacggcctcttcggcaaccttattgcgctcagcctcggcctgacgccgaacttcaaatcaaacttcgacctcgcggaggacgccaagctccagctctcaaaggacacctacgacgacgacctcgacaacctcctggcccagataggagaccagtacgcggacctcttcctcgccgccaagaacctctccgacgctatcctgctcagcgacatccttcgggtcaacaccgaaattaccaaggcaccgctgtccgccagcatgattaaacgctacgacgagcaccatcaggacctcacgctgctcaaggcactcgtccgccagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccaatcaaaaaacggctacgcgggatatatcgacggcggtgccagccaggaagagttctacaagttcatcaaaccaatcctggagaagatggacggcaccgaggagttgctggtcaagctcaacagggaggacctcctcaggaagcagaggaccttcgacaacggctccatcccgcatcagatccacctgggcgaactgcatgccatcctgcggcgccaggaggacttctacccgttcctgaaggataaccgggagaagatcgagaagatcttgacgttccgcatcccatactacgtgggcccgctggctcgcggcaactcccggttcgcctggatgacccggaagtcggaggagaccatcacaccctggaactttgaggaggtggtcgataagggcgctagcgctcagagcttcatcgagcgcatgaccaacttcgataaaaacctgcccaatgaaaaagtcctccccaagcactcgctgctctacgagtacttcaccgtgtacaacgagctcaccaaggtcaaatacgtcaccgagggcatgcggaagccggcgttcctgagcggcgagcagaagaaggcgatagtggacctcctcttcaagaccaacaggaaggtgaccgtgaagcaattaaaagaggactacttcaagaaaatagagtgcttcgactccgtggagatctcgggcgtggaggatcggttcaacgcctcactcggcacgtatcacgacctcctcaagatcattaaagacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtcctcaccctgaccctgttcgaggaccgcgaaatgatcgaggagaggctgaagacctacgcgcacctgttcgacgacaaggtcatgaaacagctcaagaggcgccgctacactggttggggaaggctgtcccgcaagctcattaatggcatcagggacaagcagagcggcaagaccatcctggacttcctcaagtccgacgggttcgccaaccgcaacttcatgcagctcattcacgacgactcgctcacgttcaaggaagacatccagaaggcacaggtgagcgggcagggtgactccctccacgaacacatcgccaacctggccggctcgccggccattaaaaagggcatcctgcagacggtcaaggtcgtcgacgagctcgtgaaggtgatgggccggcacaagcccgaaaatatcgtcatagagatggccagggagaaccagaccacccaaaaagggcagaagaactcgcgcgagcggatgaaacggatcgaggagggcattaaagagctcgggtcccagatcctgaaggagcaccccgtggaaaatacccagctccagaatgaaaagctctacctctactacctgcagaacggccgcgacatgtacgtggaccaggagctggacattaatcggctatcggactacgacgtcgaccacatcgtgccgcagtcgttcctcaaggacgatagcatcgacaacaaggtgctcacccggtcggataaaaatcggggcaagagcgacaacgtgcccagcgaggaggtcgtgaagaagatgaaaaactactggcgccagctcctcaacgcgaaactgatcacccagcgcaagttcgacaacctgacgaaggcggaacgcggtggcttgagcgaactcgataaggcgggcttcataaaaaggcagctggtcgagacgcgccagatcacgaagcatgtcgcccagatcctggacagccgcatgaatactaagtacgatgaaaacgacaagctgatccgggaggtgaaggtgatcacgctgaagtccaagctcgtgtcggacttccgcaaggacttccagttctacaaggtccgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaatgcggtggtcgggaccgccctgatcaagaagtacccgaagctggagtcggagttcgtgtacggcgactacaaggtctacgacgtgcgcaaaatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccacggcaaaatacttcttctactcgaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgcgaacggcgagatccgcaagcgcccgctcatcgaaaccaacggcgagacgggcgagatcgtctgggataagggccgggatttcgcgacggtccgcaaggtgctctccatgccgcaagtcaatatcgtgaaaaagacggaggtccagacgggcgggttcagcaaggagtccatcctcccgaagcgcaactccgacaagctcatcgcgaggaagaaggattgggacccgaaaaaatatggcggcttcgacagcccgaccgtcgcatacagcgtcctcgtcgtggcgaaggtggagaagggcaagtcaaagaagctcaagtccgtgaaggagctgctcgggatcacgattatggagcggtcctccttcgagaagaacccgatcgacttcctagaggccaagggatataaggaggtcaagaaggacctgattattaaactgccgaagtactcgctcttcgagctggaaaacggccgcaagaggatgctcgcctccgcaggcgagttgcagaagggcaacgagctcgccctcccgagcaaatacgtcaatttcctgtacctcgctagccactatgaaaagctcaagggcagcccggaggacaacgagcagaagcagctcttcgtggagcagcacaagcattacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctcgaagcgggtgatcctcgccgacgcgaacctggacaaggtgctgtcggcatataacaagcaccgcgacaaaccaatacgcgagcaggccgaaaatatcatccacctcttcaccctcaccaacctcggcgctccggcagccttcaagtacttcgacaccacgattgaccggaagcggtacacgagcacgaaggaggtgctcgatgcgacgctgatccaccagagcatcacagggctctatgaaacacgcatcgacctgagccagctgggcggagacaagaagaagaagctcaagctctag

SEQ ID NO:2

由SEQ ID NO:1编码的化脓性链球菌Cas9；具有N-和C末端NLS序列

MAPKKKRKVMDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKKKKLKL

SEQ ID NO:3

全U6基因启动子序列(不包括转录起始位点)

AAAAAACACTAGTAAGTACTTACTTATGTATTATTAACTACTTTAGCTAACTTCTGCAGTACTACCTAAGAGGCTAGGGGTAGTTTTATAGCAGACTTATAGCTATTATTTTTATTTAGTAAAGTGCTTTTAAAGTAAGGTCTTTTTTATAGCACTTTTTATTTATTATAATATATATTATATAATAATTTTAAGCCTGGAATAGTAAAGAGGCTTATATAATAATTTATAGTAATAAAAGCTTAGCAGCTGTAATATAATTCCTAAAGAAACAGCATGAAATGGTATTATGTAAGAGCTATAGTCTAAAGGCACTCTGCTGGATAAAAATAGTGGCTATAAGTCTGCTGCAAAACTACCCCCAACCTCGTAGGTATATAAGTACTGTTTGATGGTAGTCTATC

SEQ ID NO:4

截短的/较短的U6基因启动子序列(不包括转录起始位点)

AATTCCTAAAGAAACAGCATGAAATGGTATTATGTAAGAGCTATAGTCTAAAGGCACTCTGCTGGATAAAAATAGTGGCTATAAGTCTGCTGCAAAACTACCCCCAACCTCGTAGGTATATAAGTACTGTTTGATGGTAGTCTATC

SEQ ID NO:5

U6基因内含子

GTTCGTTTCGGCTTTTCCTCGGAACCCCCAGAGGTCATCAGTTCGAATCGCTAACAG

SEQ ID NO:6

U6基因转录终止序列

TTTTTTTTCTCTT

SEQ ID NO:7

丝状真菌细胞密码子优化的化脓性链球菌Cas9编码基因；无NLS

atggacaagaagtacagcatcggcctcgacatcggcaccaactcggtgggctgggccgtcatcacggacgaatataaggtcccgtcgaagaagttcaaggtcctcggcaatacagaccgccacagcatcaagaaaaacttgatcggcgccctcctgttcgatagcggcgagaccgcggaggcgaccaggctcaagaggaccgccaggagacggtacactaggcgcaagaacaggatctgctacctgcaggagatcttcagcaacgagatggcgaaggtggacgactccttcttccaccgcctggaggaatcattcctggtggaggaggacaagaagcatgagcggcacccaatcttcggcaacatcgtcgacgaggtggcctaccacgagaagtacccgacaatctaccacctccggaagaaactggtggacagcacagacaaggcggacctccggctcatctaccttgccctcgcgcatatgatcaagttccgcggccacttcctcatcgagggcgacctgaacccggacaactccgacgtggacaagctgttcatccagctcgtgcagacgtacaatcaactgttcgaggagaaccccataaacgctagcggcgtggacgccaaggccatcctctcggccaggctctcgaaatcaagaaggctggagaaccttatcgcgcagttgccaggcgaaaagaagaacggcctcttcggcaaccttattgcgctcagcctcggcctgacgccgaacttcaaatcaaacttcgacctcgcggaggacgccaagctccagctctcaaaggacacctacgacgacgacctcgacaacctcctggcccagataggagaccagtacgcggacctcttcctcgccgccaagaacctctccgacgctatcctgctcagcgacatccttcgggtcaacaccgaaattaccaaggcaccgctgtccgccagcatgattaaacgctacgacgagcaccatcaggacctcacgctgctcaaggcactcgtccgccagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccaatcaaaaaacggctacgcgggatatatcgacggcggtgccagccaggaagagttctacaagttcatcaaaccaatcctggagaagatggacggcaccgaggagttgctggtcaagctcaacagggaggacctcctcaggaagcagaggaccttcgacaacggctccatcccgcatcagatccacctgggcgaactgcatgccatcctgcggcgccaggaggacttctacccgttcctgaaggataaccgggagaagatcgagaagatcttgacgttccgcatcccatactacgtgggcccgctggctcgcggcaactcccggttcgcctggatgacccggaagtcggaggagaccatcacaccctggaactttgaggaggtggtcgataagggcgctagcgctcagagcttcatcgagcgcatgaccaacttcgataaaaacctgcccaatgaaaaagtcctccccaagcactcgctgctctacgagtacttcaccgtgtacaacgagctcaccaaggtcaaatacgtcaccgagggcatgcggaagccggcgttcctgagcggcgagcagaagaaggcgatagtggacctcctcttcaagaccaacaggaaggtgaccgtgaagcaattaaaagaggactacttcaagaaaatagagtgcttcgactccgtggagatctcgggcgtggaggatcggttcaacgcctcactcggcacgtatcacgacctcctcaagatcattaaagacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtcctcaccctgaccctgttcgaggaccgcgaaatgatcgaggagaggctgaagacctacgcgcacctgttcgacgacaaggtcatgaaacagctcaagaggcgccgctacactggttggggaaggctgtcccgcaagctcattaatggcatcagggacaagcagagcggcaagaccatcctggacttcctcaagtccgacgggttcgccaaccgcaacttcatgcagctcattcacgacgactcgctcacgttcaaggaagacatccagaaggcacaggtgagcgggcagggtgactccctccacgaacacatcgccaacctggccggctcgccggccattaaaaagggcatcctgcagacggtcaaggtcgtcgacgagctcgtgaaggtgatgggccggcacaagcccgaaaatatcgtcatagagatggccagggagaaccagaccacccaaaaagggcagaagaactcgcgcgagcggatgaaacggatcgaggagggcattaaagagctcgggtcccagatcctgaaggagcaccccgtggaaaatacccagctccagaatgaaaagctctacctctactacctgcagaacggccgcgacatgtacgtggaccaggagctggacattaatcggctatcggactacgacgtcgaccacatcgtgccgcagtcgttcctcaaggacgatagcatcgacaacaaggtgctcacccggtcggataaaaatcggggcaagagcgacaacgtgcccagcgaggaggtcgtgaagaagatgaaaaactactggcgccagctcctcaacgcgaaactgatcacccagcgcaagttcgacaacctgacgaaggcggaacgcggtggcttgagcgaactcgataaggcgggcttcataaaaaggcagctggtcgagacgcgccagatcacgaagcatgtcgcccagatcctggacagccgcatgaatactaagtacgatgaaaacgacaagctgatccgggaggtgaaggtgatcacgctgaagtccaagctcgtgtcggacttccgcaaggacttccagttctacaaggtccgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaatgcggtggtcgggaccgccctgatcaagaagtacccgaagctggagtcggagttcgtgtacggcgactacaaggtctacgacgtgcgcaaaatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccacggcaaaatacttcttctactcgaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgcgaacggcgagatccgcaagcgcccgctcatcgaaaccaacggcgagacgggcgagatcgtctgggataagggccgggatttcgcgacggtccgcaaggtgctctccatgccgcaagtcaatatcgtgaaaaagacggaggtccagacgggcgggttcagcaaggagtccatcctcccgaagcgcaactccgacaagctcatcgcgaggaagaaggattgggacccgaaaaaatatggcggcttcgacagcccgaccgtcgcatacagcgtcctcgtcgtggcgaaggtggagaagggcaagtcaaagaagctcaagtccgtgaaggagctgctcgggatcacgattatggagcggtcctccttcgagaagaacccgatcgacttcctagaggccaagggatataaggaggtcaagaaggacctgattattaaactgccgaagtactcgctcttcgagctggaaaacggccgcaagaggatgctcgcctccgcaggcgagttgcagaagggcaacgagctcgccctcccgagcaaatacgtcaatttcctgtacctcgctagccactatgaaaagctcaagggcagcccggaggacaacgagcagaagcagctcttcgtggagcagcacaagcattacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctcgaagcgggtgatcctcgccgacgcgaacctggacaaggtgctgtcggcatataacaagcaccgcgacaaaccaatacgcgagcaggccgaaaatatcatccacctcttcaccctcaccaacctcggcgctccggcagccttcaagtacttcgacaccacgattgaccggaagcggtacacgagcacgaaggaggtgctcgatgcgacgctgatccaccagagcatcacagggctctatgaaacacgcatcgacctgagccagctgggcggagac

SEQ ID NO:8

由SEQ ID NO:7编码的化脓性链球菌Cas9；无NLS

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

SEQ ID NO:9

SV40 NLS

PKKKRKV

SEQ NO:10

里氏木霉blr2(蓝光调节因子2)基因NLS

KKKKLKL

SEQ ID NO:11

嗜热链球菌LMD-9Cas9

MTKPYSIGLDIGTNSVGWAVTTDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKAYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKKLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDHIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDVPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLSPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVVASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFTVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG

SEQ ID NO:12

变异链球菌UA159Cas9

MKKPYSIGLDIGTNSVGWAVVTDDYKVPAKKMKVLGNTDKSHIEKNLLGALLFDSGNTAEDRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSEEMGKVDDSFFHRLEDSFLVTEDKRGERHPIFGNLEEEVKYHENFPTIYHLRQYLADNPEKVDLRLVYLALAHIIKFRGHFLIEGKFDTRNNDVQRLFQEFLAVYDNTFENSSLQEQNVQVEEILTDKISKSAKKDRVLKLFPNEKSNGRFAEFLKLIVGNQADFKKHFELEEKAPLQFSKDTYEEELEVLLAQIGDNYAELFLSAKKLYDSILLSGILTVTDVGTKAPLSASMIQRYNEHQMDLAQLKQFIRQKLSDKYNEVFSDVSKDGYAGYIDGKTNQEAFYKYLKGLLNKIEGSGYFLDKIEREDFLRKQRTFDNGSIPHQIHLQEMRAIIRRQAEFYPFLADNQDRIEKLLTFRIPYYVGPLARGKSDFAWLSRKSADKITPWNFDEIVDKESSAEAFINRMTNYDLYLPNQKVLPKHSLLYEKFTVYNELTKVKYKTEQGKTAFFDANMKQEIFDGVFKVYRKVTKDKLMDFLEKEFDEFRIVDLTGLDKENKVFNASYGTYHDLCKILDKDFLDNSKNEKILEDIVLTLTLFEDREMIRKRLENYSDLLTKEQVKKLERRHYTGWGRLSAELIHGIRNKESRKTILDYLIDDGNSNRNFMQLINDDALSFKEEIAKAQVIGETDNLNQVVSDIAGSPAIKKGILQSLKIVDELVKIMGHQPENIVVEMARENQFTNQGRRNSQQRLKGLTDSIKEFGSQILKEHPVENSQLQNDRLFLYYLQNGRDMYTGEELDIDYLSQYDIDHIIPQAFIKDNSIDNRVLTSSKENRGKSDDVPSKDVVRKMKSYWSKLLSAKLITQRKFDNLTKAERGGLTDDDKAGFIKRQLVETRQITKHVARILDERFNTETDENNKKIRQVKIVTLKSNLVSNFRKEFELYKVREINDYHHAHDAYLNAVIGKALLGVYPQLEPEFVYGDYPHFHGHKENKATAKKFFYSNIMNFFKKDDVRTDKNGEIIWKKDEHISNIKKVLSYPQVNIVKKVEEQTGGFSKESILPKGNSDKLIPRKTKKFYWDTKKYGGFDSPIVAYSILVIADIEKGKSKKLKTVKALVGVTIMEKMTFERDPVAFLERKGYRNVQEENIIKLPKYSLFKLENGRKRLLASARELQKGNEIVLPNHLGTLLYHAKNIHKVDEPKHLDYVDKHKDEFKELLDVVSNFSKKYTLAEGNLEKIKELYAQNNGEDLKELASSFINLLTFTAIGAPATFKFFDKNIDRKRYTSTTEILNATLIHQSITGLYETRIDLNKLGGD

SEQ ID NO:13

空肠弯曲杆菌Cas9

MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK

SEQ ID NO:14

脑膜炎奈瑟球菌Cas9

MAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVR

SEQ ID NO:15

土拉弗朗西斯菌新凶手亚种Cas9

MNFKILPIAIDLGVKNTGVFSAFYQKGTSLERLDNKNGKVYELSKDSYTLLMNNRTARRHQRRGIDRKQLVKRLFKLIWTEQLNLEWDKDTQQAISFLFNRRGFSFITDGYSPEYLNIVPEQVKAILMDIFDDYNGEDDLDSYLKLATEQESKISEIYNKLMQKILEFKLMKLCTDIKDDKVSTKTLKEITSYEFELLADYLANYSESLKTQKFSYTDKQGNLKELSYYHHDKYNIQEFLKRHATINDRILDTLLTDDLDIWNFNFEKFDFDKNEEKLQNQEDKDHIQAHLHHFVFAVNKIKSEMASGGRHRSQYFQEITNVLDENNHQEGYLKNFCENLHNKKYSNLSVKNLVNLIGNLSNLELKPLRKYFNDKIHAKADHWDEQKFTETYCHWILGEWRVGVKDQDKKDGAKYSYKDLCNELKQKVTKAGLVDFLLELDPCRTIPPYLDNNNRKPPKCQSLILNPKFLDNQYPNWQQYLQELKKLQSIQNYLDSFETDLKVLKSSKDQPYFVEYKSSNQQIASGQRDYKDLDARILQFIFDRVKASDELLLNEIYFQAKKLKQKASSELEKLESSKKLDEVIANSQLSQILKSQHTNGIFEQGTFLHLVCKYYKQRQRARDSRLYIMPEYRYDKKLHKYNNTGRFDDDNQLLTYCNHKPRQKRYQLLNDLAGVLQVSPNFLKDKIGSDDDLFISKWLVEHIRGFKKACEDSLKIQKDNRGLLNHKINIARNTKGKCEKEIFNLICKIEGSEDKKGNYKHGLAYELGVLLFGEPNEASKPEFDRKIKKFNSIYSFAQIQQIAFAERKGNANTCAVCSADNAHRMQQIKITEPVEDNKDKIILSAKAQRLPAIPTRIVDGAVKKMATILAKNIVDDNWQNIKQVLSAKHQLHIPIITESNAFEFEPALADVKGKSLKDRRKKALERISPENIFKDKNNRIKEFAKGISAYSGANLTDGDFDGAKEELDHIIPRSHKKYGTLNDEANLICVTRGDNKNKGNRIFCLRDLADNYKLKQFETTDDLEIEKKIADTIWDANKKDFKFGNYRSFINLTPQEQKAFRHALFLADENPIKQAVIRAINNRNRTFVNGTQRYFAEVLANNIYLRAKKENLNTDKISFDYFGIPTIGNGRGIAEIRQLYEKVDSDIQAYAKGDKPQASYSHLIDAMLAFCIAADEHRNDGSIGLEIDKNYSLYPLDKNTGEVFTKDIFSQIKITDNEFSDKKLVRKKAIEGFNTHRQMTRDGIYAENYLPILIHKELNEVRKGYTWKNSEEIKIFKGKKYDIQQLNNLVYCLKFVDKPISIDIQISTLEELRNILTTNNIAATAEYYYINLKTQKLHEYYIENYNTALGYKKYSKEMEFLRSLAYRSERVKIKSIDDVKQVLDKDSNFIIGKITLPFKKEWQRLYREWQNTTIKDDYEFLKSFFNVKSITKLHKKVRKDFSLPISTNEGKFLVKRKTWDNNFIYQILNDSDSRADGTKPFIPAFDISKNEIVEAIIDSFTSKNIFWLPKNIELQKVDNKNIFAIDTSKWFEVETPSDLRDIGIATIQYKIDNNSRPKVRVKLDYVIDDDSKINYFMNHSLLKSRYPDKVLEILKQSTIIEFESSGFNKTIKEMLGMKLAGIYNETSNN

SEQ ID NO:16

多杀巴斯德菌Cas9

MQTTNLSYILGLDLGIASVGWAVVEINENEDPIGLIDVGVRIFERAEVPKTGESLALSRRLARSTRRLIRRRAHRLLLAKRFLKREGILSTIDLEKGLPNQAWELRVAGLERRLSAIEWGAVLLHLIKHRGYLSKRKNESQTNNKELGALLSGVAQNHQLLQSDDYRTPAELALKKFAKEEGHIRNQRGAYTHTFNRLDLLAELNLLFAQQHQFGNPHCKEHIQQYMTELLMWQKPALSGEAILKMLGKCTHEKNEFKAAKHTYSAERFVWLTKLNNLRILEDGAERALNEEERQLLINHPYEKSKLTYAQVRKLLGLSEQAIFKHLRYSKENAESATFMELKAWHAIRKALENQGLKDTWQDLAKKPDLLDEIGTAFSLYKTDEDIQQYLTNKVPNSVINALLVSLNFDKFIELSLKSLRKILPLMEQGKRYDQACREIYGHHYGEANQKTSQLLPAIPAQEIRNPVVLRTLSQARKVINAIIRQYGSPARVHIETGRELGKSFKERREIQKQQEDNRTKRESAVQKFKELFSDFSSEPKSKDILKFRLYEQQHGKCLYSGKEINIHRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLASENQNKGNQTPYEWLQGKINSERWKNFVALVLGSQCSAAKKQRLLTQVIDDNKFIDRNLNDTRYIARFLSNYIQENLLLVGKNKKNVFTPNGQITALLRSRWGLIKARENNNRHHALDAIVVACATPSMQQKITRFIRFKEVHPYKIENRYEMVDQESGEIISPHFPEPWAYFRQEVNIRVFDNHPDTVLKEMLPDRPQANHQFVQPLFVSRAPTRKMSGQGHMETIKSAKRLAEGISVLRIPLTQLKPNLLENMVNKEREPALYAGLKARLAEFNQDPAKAFATPFYKQGGQQVKAIRVEQVQKSGVLVRENNGVADNASIVRTDVFIKNNKFFLVPIYTWQVAKGILPNKAIVAHKNEDEWEEMDEGAKFKFSLFPNDLVELKTKKEYFFGYYIGLDRATGNISLKEHDGEISKGKDGVYRVGVKLALSFEKYQVDELGKNRQICRPQQRQPVR

SEQ ID NO:17

sgRNA:gAd3A TS1

guccucgagcaaaaggugccGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC。

SEQ ID NO:18

sgRNA:gTrGA TS2

guucagugcaauaggcgucuGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

SEQ ID NO:19

sgRNA:gTrGA TS11

gccaauggcgacggcagcacGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

SEQ ID NO:20

sgRNA:gPyr2 TS6

gcacagcgggaugcccuuguGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC

Claims (16)

1.一种用于使供体DNA与木霉属物种细胞中的基因组座位进行同源重组的方法，该方法包括：

(a) 产生辅助木霉属物种菌株和靶木霉属物种菌株之间的异核体，其中该辅助木霉属物种菌株包含使非同源末端连接（NHEJ）机制沉默的表达构建体，其中所述表达构建体使以下项中的一个或多个沉默：ku80、ku70、和lig4；

(b) 将供体DNA引入该异核体中，其中该供体DNA包含对于在该靶菌株中的基因组座位处的同源重组而言与该基因组座位足够同源的区域；

(c) 自 (b) 的异核体细胞产生孢子并且接种这些孢子；并且

(d) 鉴定来自接种的孢子的细胞，在所述细胞中 (i) 已经通过在该基因组座位处的同源重组将该供体DNA整合进该基因组中，以及 (ii) 不存在使非同源末端连接（NHEJ）机制沉默的表达构建体。

2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括将功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中，其中该Cas/引导RNA复合物具有该基因组座位内的靶位点。

3.如权利要求2所述的方法，其中该Cas是Cas切口酶。

4.如权利要求1所述的方法，其中该供体DNA包含感兴趣的多核苷酸序列，其中在该基因组座位处的同源重组导致该感兴趣的多核苷酸序列插入该基因组座位。

5.如权利要求2所述的方法，其中该Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或其变体。

6.如权利要求5所述的方法，其中该Cas9内切核酸酶或其变体包含来自以下物种的全长Cas9或其功能片段，该物种选自由以下各项组成的组：链球菌属物种（Streptococcus sp.）；弯曲杆菌属物种（Campylobacter sp.）；奈瑟氏菌属物种（Neisseria sp）；弗朗西丝氏菌属物种（Francisella sp.）；和巴斯德菌属物种（Pasteurella sp.）。

7.如权利要求2所述的方法，其中将该功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含该Cas内切核酸酶的表达盒的DNA构建体引入该木霉属物种细胞中。

8.如权利要求2所述的方法，其中将该功能Cas/引导RNA复合物引入该异核体中包括将包含该引导RNA的表达盒的DNA构建体引入该木霉属物种细胞中。

9.如权利要求2所述的方法，其中该引入步骤包括将该Cas内切核酸酶直接引入该木霉属物种细胞中。

10.如权利要求2所述的方法，其中该引入步骤包括将该引导RNA直接引入该真菌细胞中。

11.如权利要求1所述的方法，其中该木霉属物种是里氏木霉（Trichoderma reesei）。

12.如权利要求1所述的方法，其中该供体DNA已经在该基因组座位处部分整合进该基因组中。

13.如权利要求1所述的方法，其中该供体DNA的整合导致该基因组座位的修饰。

14.如权利要求13所述的方法，其中该修饰选自由以下各项组成的组：一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、编码感兴趣的蛋白的表达盒的插入、一个或多个核苷酸的取代、及其任何组合。

15.如权利要求1所述的方法，其中该鉴定步骤包括：在针对该供体DNA在该基因组座位处的整合或该基因组座位的修饰进行选择或筛选的条件下，培养从步骤 (c) 的孢子生长的细胞。

16.如权利要求5所述的方法，其中该Cas9内切核酸酶或其变体包含来自以下物种的全长Cas9或其功能片段，该物种选自由以下各项组成的组：化脓性链球菌（S. pyogenes,）、变异链球菌（S. mutans）、嗜热链球菌（S. thermophilus），空肠弯曲杆菌（C. jejuni），脑膜炎奈瑟球菌（N. meningitides），新凶手弗朗西丝菌（F. novicida），和多杀巴斯德菌（P. multocida）。

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