JP6814143B2 - 真菌ゲノム改変システムおよび使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されるPCT特許出願PCT/CN2014/093918、PCT/CN2014/093916およびPCT/CN2014/093914(全てが2014年12月16日に出願されている)に対する優先権を主張する。
(37C.F.R.§1.52(e)に従って)EFSを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。EFSを介して提出した配列表テキストファイルには、2015年12月13日に作成したファイル「40532−WO−PCT−6_2015−868 Final_ST25.txt」(151キロバイトのサイズである)が含まれている。
本明細書で使用する場合、「Casエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Casエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Cas遺伝子によりコードされるCRISPR関連(Cas)ポリペプチドに関し、Casタンパク質は、1種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的DNA配列を切断することができる(例えば「CRISPR−Cas systems and methods for altering expression of gene products」という表題の米国特許第8697359号明細書を参照されたい)。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するCasエンドヌクレアーゼの多様体もこの定義に含まれる。本明細書で詳述するドナーDNA挿入方法で用いられるCasエンドヌクレアーゼは、標的部位でDNAに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。Casエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドにより導かれて二本鎖DNA中の特定の標的部位(例えば、細胞のゲノム中の標的部位)を認識して切断する。
およびトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
真菌細胞(例えば糸状真菌細胞)のゲノム中の標的部位でDNA配列を改変するためにガイドRNA/Casエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。
1.糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でDNA配列を改変する方法であって、
a)CasエンドヌクレアーゼおよびガイドRNAを糸状真菌細胞の集団に導入することであり、前記Casエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドRNAは、前記Casエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
b)前記集団から、前記標的部位で前記DNA配列の改変を有する少なくとも1個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Casエンドヌクレアーゼ、前記ガイドRNAまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
2.前記標的部位での前記DNA配列の改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
3.前記Casエンドヌクレアーゼを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突(微粒子銃粒子送達)技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、実施形態1または2に記載の方法。
4.前記ガイドRNAを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突(微粒子銃粒子送達)技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、実施形態1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5.前記同定する工程が、前記標的部位での前記DNA配列の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの真菌細胞の集団を培養することを含む、実施形態1〜4のいずれか一つに記載の方法。
6.前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7.前記CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの多様体である、実施形態1〜6のいずれか一つに記載の方法。
8.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、実施形態7に記載の方法。
9.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、配列番号1〜7のいずれか一つまたはその機能的断片に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態8に記載の方法。
10.前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の方法。
11.前記導入する工程が、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜10のいずれか一つに記載の方法。
12.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態1〜9および11のいずれか一つに記載の方法。
13.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドRNAを直接導入することを含む、実施形態1〜10および12のいずれか一つに記載の方法。
14.前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているCasコーディング配列を含む、実施形態10に記載の方法。
15.前記Casコーディング配列が、配列番号8に対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列を含むCas9コーディング配列またはこの機能的断片である、実施形態14に記載の方法。
16.前記Casエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態1〜15のいずれか一つに記載の方法。
17.前記ガイドRNA用の発現カセットが、ユーサコマイセート(Euascomycete)中でまたはペジゾマイセート(Pezizomycete)中で機能するRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが前記ガイドRNAをコードするDNAに作動可能に連結されている、実施形態11に記載の方法。
18.前記プロモーターがトリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来する、実施形態17に記載の方法。
19.前記プロモーターが、配列番号11もしくは12に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態17または18に記載の方法。
20.前記プロモーターが配列番号11または12の配列を含む、実施形態19に記載の方法。
21.前記ガイドRNA用の発現カセットが、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドRNAコーディングDNAを含む、実施形態11および17〜20のいずれか一つに記載の方法。
22.前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号90に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態21に記載の方法。
23.前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が配列番号90の配列を含む、実施形態22に記載の方法。
24.前記糸状真菌細胞がユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、実施形態1〜23のいずれか一つに記載の方法。
25.前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、実施形態1〜24のいずれか一つに記載の方法。
26.前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、実施形態1〜25のいずれか一つに記載の方法。
27.前記導入する工程が、(i)前記Casエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および(ii)前記親真菌細胞集団に前記ガイドRNAを一時的に導入することを含む、実施形態1、2、4〜9、11、13および16〜19のいずれか一つに記載の方法。
28.前記導入する工程が、(i)前記ガイドRNAを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および(ii)前記親真菌細胞集団に前記Casエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含む、実施形態1〜3、5〜10、12および14〜19のいずれか一つに記載の方法。
29.前記標的部位での前記DNA配列の改変が相同組換えに起因しない、実施形態1〜28のいずれか一つに記載の方法。
30.前記方法が前記真菌細胞の集団にドナーDNAを導入することを含まない、実施形態1〜29のいずれか一つに記載の方法。
31.実施形態1〜30のいずれか一つの記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
32.Casエンドヌクレアーゼまたはこの多様体をコードする、操作された核酸であって、前記Casエンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、配列番号1〜7のいずれか一つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%もしくは95%の同一性を有するアミノ酸配列またはこの機能的断片を含み、前記核酸が、配列番号8に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるポリヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、操作された核酸。
33.前記核酸が配列番号8の配列を含む、実施形態32に記載の操作された核酸。
34.Casエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドRNAをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドRNAをコードする核酸が、ユーサコマイセート(Euascomycete)中でまたはペジゾマイセート(Pezizomycete)中で機能するRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターを含み、前記プロモーターがトリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来する、操作された核酸
35.前記プロモーターが、配列番号11もしくは12に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態34に記載の操作された核酸。
36.Casエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドRNAをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドRNAをコードする核酸が、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列を有するガイドRNAコーディングDNAを含む、操作された核酸。
37.前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号90に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは100%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態36に記載の操作された核酸。
38.前記ガイドRNAをコードする核酸が、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するプロモーターとトリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列との両方を含み、前記プロモーターが、配列番号11または12に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記プロモーターが、配列番号11もしくは12に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含み、前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号90に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態34または36に記載の操作された核酸。
実施例1:T.リーゼイ(T.reesei)U6 snRNA遺伝子の同定
RNAポリメラーゼIII依存性プロモーターは、RNAポリメラーゼII依存性プロモーターの使用に起因するであろう5’キャップ構造の付加またはポリアデニル化が生じないT.リーゼイ(T.reesei)中でのガイドRNAの産生に望ましい。しかしながら、T.リーゼイ(T.reesei)中で機能するRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターは説明されていない。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)snr52遺伝子、ヒトU6 snRNA遺伝子またはトウモロコシU6 snRNA遺伝子からの5’上流領域等のその他の種由来の既知のRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターがT.リーゼイ(T.reesei)中で機能する能力に関して試験することを検討した。
単一ガイドRNA(sgRNA)分子がストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質と相互作用することにより、このエンドヌクレアーゼの標的をin vivoで真核生物のゲノム(REFS)中の特定の遺伝子座に設定することができることが分かっている。sgRNAは、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)II型CRISPR−Casシステムの成分であることが自然に観測されるtracrRNAとcrRNAとの間の融合体として設計されているハイブリッド分子である(Gasiunas et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:E2579−86、Jinek et al.(2012)Science 337:816−21、Mali et al.(2013)Science 339:823−26およびCong et al.(2013)Science 339:819−23)。sgRNAの最初の20個のヌクレオチドはゲノム中の標的部位に相補的である。sgRNA相補領域に隣接するゲノム中の標的部位に追加の配列(PAM、プロトスペーサー隣接モチーフ)が存在することも必要である。S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の場合、PAMは配列NGG(NはA、G、CまたはTである)である。
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子(NLS配列を含む)を設計し、合成し、T.リーゼイ(T.reesei)中での発現に関して試験した(配列番号9)。コードされるタンパク質(配列番号10)は、N末端SV40核局在化シグナル(NLS、配列番号19)とT.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子に由来するC末端NLS(配列番号20)とを有する(両方とも下記の配列番号10において下線を引いている)。
配列番号9
上記に示すCas9をコードする合成DNA配列を、Gatewayクローニング(InVitrogen)により適切な発現ベクター中に移すことを可能にすべく、この合成DNA配列が、隣接するattL1部位とattL2部位との間に存在し得るように、pENTR/D−TOPOに挿入した。下記の特徴を含むGateway適合性発現ベクター(compatible expression vector)pTrex2gHygが入手可能であった:Gatewayクローニング部位により離れているT.リーゼイ(T.reesei)pki1(ピルベートキナーゼ)遺伝子由来のプロモーター領域およびT.リーゼイ(T.reesei)cbh1(セロビオヒドロラーゼI)遺伝子由来のターミネーター領域、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)cpc1(交差経路制御1)プロモーター領域とアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)trpC(グルタミンアミドトランスフェラーゼ活性、インドールグリセロールホスフェートシンターゼ活性およびホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ活性を有する三機能タンパク質)ターミネーター領域とに機能的に連結されている細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに選択用のおよび大腸菌(E.coli)中での維持用の細菌ベクター配列。Gatewayクローニング手順(InVitrogen)を使用してcas9遺伝子をpTrex2gHygにクローニングし、pTrex2gHyg MoCasを得た(図2を参照されたい)。
異なる推定上のRNAポリメラーゼIII依存性のプロモーターおよびターミネーターが隣接しているgAd3A TS1 sgRNAをコードする合成DNA配列を得た。これらの合成DNA配列はそれぞれ、両端に制限酵素認識部位(EcoRIおよびBamHI)も有していた。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株を2種の別々の発現ベクター(Cas9産生用の1種およびgRNA産生用の1種)で共形質転換する、またはCas9およびgRNAの両方の発現用の単一ベクターで形質転換する、一連の実験を下記に説明する。これらの実験から、U6イントロンがgRNA転写領域内にも存在する場合にのみ、T.リーゼイ(T.reesei)U6遺伝子からの5’上流領域がgRNA転写を促進したことが実証される。これらの実験から、T.リーゼイ(T.reesei)形質転換体では、標的とされた遺伝子の不活性化が高効率で起こり得ることも実証される。
4種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子(cbh1、cbh2、egl1およびegl2)が欠失した、公的に入手可能な株RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の株を使用した。この株は、機能するpyr4遺伝子も欠いていた。バイオリスティック形質転換(biolistic transformation)(米国特許出願公開第20060003408A1号明細書で説明されている)を使用して、等量のpTrex2gHyg MoCasとp219M gAd3ATS1−1、p219M gAd3ATS1−2またはp219M gAd3ATS1−3のいずれかとの混合物で共形質転換した。2%のグルコース、100mg/LのハイグロマイシンBおよび200mg/Lのアデニンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。2番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。安定した形質転換体はより急速に増殖し、このコロニーは輪郭が滑らかであり、菌糸体はより密集していた。不安定な形質転換体はより遅く増殖し、菌糸体はより低密度であり、コロニーは輪郭がでこぼこで不規則であった。2番目のプレート上での増殖後、グルコースを含み、ハイグロマイシンを含まず、14mg/Lのアデニンを含むフォーゲルの培地に形質転換体を移し、アデニン栄養要求体であることを示す赤色/褐色コロニーを示す形質転換体をスクリーニングした。p219M gAd3ATS1−1により5個の安定した形質転換体および23個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン原栄養体であった。p219M gAd3ATS1−2により11個の安定した形質転換体および38個の不安定な形質転換体が得られ、11個全ての安定した形質転換体および不安定な形質転換体の内の29個がアデニン原栄養体であった。p219M gAd3ATS1−3により19個の安定した形質転換体および2個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン栄養要求体であった。明らかに、アデニン栄養要求体は、T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーター、イントロンおよびターミネーターを用いてsgAd3ATS1の転写を制御するgAd3ATS1−3によってのみ得られた。アデニン栄養要求体は、天然T.リーゼイ(T.reesei)ad3A遺伝子座での標的としたCas9切断を示す。試験したgAd3ATS1−3による全ての形質転換体がアデニン栄養要求体であったことから、Cas9媒介型の遺伝子不活性化は効率的であると結論付けることができる。
4種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子(cbh1、cbh2、egl1およびegl2)が欠失した、公的に入手可能な株RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の株を使用した。この株は、機能するpyr4遺伝子も欠いていた。この株を、等量のpTrex2gHyg MoCasとp219M gTrGA TS2との混合物でバイオリスティック法を使用して共形質転換した。1%のグルコース、100ug/mlのハイグロマイシンBおよび2mg/mlのウリジンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。2番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。17個の安定した形質転換体と4個の不安定な形質転換体を得た。これらの形質転換体を、グルコースを含まず1%の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌可能なコロニーは、よく増殖して胞子を形成する。グルコアミラーゼを分泌不能なコロニーは非常にまばらな菌糸体で増殖し、明らかに識別可能である。17個の安定した形質転換体の内の14個はグルコアミラーゼを分泌不能であり、4個全ての不安定な形質転換体がグルコアミラーゼを分泌しなかった。
工程1:1分にわたり94C
工程2:25秒にわたり94C
工程3:30秒にわたり63C(1サイクル当たり0.2Cの温度低下)
工程4:8分にわたり70C
工程2〜4を更に24回繰り返した
工程5:4Cで保持した
T.リーゼイ(T.reesei)pyr2遺伝子内の様々な位置を標的とするガイドRNA発現カセットを含むプラスミドpTrex2gHyg MoCasの誘導体によるプロトプラストのPEG媒介型形質転換により、T.リーゼイ(T.reesei)株QM6aまたはRL−P37の形質転換体を生成した。この遺伝子の不活性化により、ウリジン栄養要求性および5−フルオロオロチン酸(FOA)に対する耐性が付与される。最初に、ハイグロマイシンBを含む培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンBを含む新鮮な寒天プレートに移して安定または不安定と印を付けた。次いで、形質転換体を、2mg/mlのウリジンおよび1.2mg/mlのFOAを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレートに移した。FOAの存在下で増殖する能力は、Cas9媒介型のpyr2遺伝子不活性化に起因するウリジン栄養要求性を示す。
Cas9およびガイドRNAの発現ベクターpTrex2gHyg MoCAS gPyr2 TS6の、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)テロメア配列を含むバージョンを構築した(図6に示す)。このベクターに、下記に示すDNA配列(配列番号55)を挿入した。下線を引いた領域は反復テロメア配列を含んでおり、それぞれがこの断片の中心方向へ読み取られる。中心部分は、テロメアの反復を確実に維持するために大腸菌(E.coli)での選択を可能にするプロモーターおよびターミネーターを有する細菌カナマイシン耐性遺伝子である。トリコデルマ(Trichoderma)では、テロメアを有するベクターは各末端でテロメア配列と共に線状化すると予想され、低コピー数で自律的に維持されるはずであるが、染色体DNA中への偶発的な組み込みも起こり得る。
実施例8:大腸菌(E.coli)中でのCRISPR SpyCas9の異種発現
大腸菌(E.coli)コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpyCas9)遺伝子を合成し、Generay(Shanghai、China)によりNcoI部位およびHindIII部位で発現ベクターpET30aに挿入し、結果としてプラスミドpET30a−SpyCas9を得た(図7)。図8Aのプラスミドマップで示すように、発現カセットの完全なコーディング配列は、5’から3’への方向で、N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域をコードする配列(配列番号13は開始コドンメチオニンを含む)、SV40核局在化シグナルをコードする配列(配列番号14)、SpyCas9をコードする配列(配列番号15)、およびBLR核局在化シグナルをコードする配列(配列番号16)を含み、全てが作動可能に連結されている。この全コーディング配列を配列番号17に示す。配列番号13によりコードされるN−末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列を配列番号18(1位でメチオニンを含む)に示し、配列番号14によりコードされるSV40核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号19に示し、配列番号15によりコードされるSpyCas9のアミノ酸配列を配列番号1に示し、配列番号16によりコードされるBLR核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号20に示す。配列番号17によりコードされるアミノ酸配列を配列番号21に示す。
SpyCas9の精製に、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の組み合わせを適用した。簡潔に言うと、SpyCas9を発現する大腸菌(E.coli)細胞((Rosetta2(De3)plysS、上記で説明した)を24時間にわたりMagicMedia(商標)25mlで250mlの振とうフラスコ中にて培養し、遠心分離により回収した。細胞(約40グラム)をペレット化し、溶解緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5、500mMのNaCl、0.1%のTritonX−100、1mMのDTTおよび1mMのTCEP、Rocheから購入したプロテアーゼ阻害剤カクテル)400mlに再懸濁させ、超音波処理器(35%パワー、20分、2秒オン/3秒オフ)(SCIENT2−II D、Ningbo Scientz Biotechnology Co.,LTD)で溶解させた。溶解物を、40分にわたる20000gでの遠心分離により清澄化した。
本発明者らは、Cas9 Target Finderを使用して実行可能な標的部位を同定した。適切なPAM部位を有する標的配列を、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のxyr1遺伝子(キシラン分解に関与する転写因子キシラナーゼ制御因子1(Protein ID 122208))およびトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のpyr4遺伝子(オロチジン−5’−モノホスフェートデカルボキシラーゼ(Protein ID 74020))のセンス鎖またはアンチセンス鎖で同定した。このプログラムを使用して、本発明者らは、配列パターンGGN18NGGまたはGN19NGGと一致する3−ヌクレオチドPAM配列(NGG)が続く全ての20ヌクレオチド長の標的配列を同定した。トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)ゲノム配列データベース(genome.jgi−psf.org/Trire2/Trire2.home)を使用してBasic local alignment search tool(BLAST)を実施し、20−nt配列の特有性をチェックして標的効果を回避した。下記の配列を使用して、2つのxyr1特異的標的部位(xyr1 Taおよびxyr1 Tc)用のならびに1つのpyr4特異的標的部位(pyr4 TS2)用のpSM1ガイドプラスミド(図8Aに示す)中でin vitroガイドRNA発現構築物を生成した。関連するPAM部位を有する標的配列と、アニーリングおよびBSA1制限部位でのpSM1ガイドプラスミド中へクローニングに使用するオリゴとを示す:
Xyr1 Ta
(1)標的配列(5’−3’、PAMに太字で下線を引いている):
(3)オリゴ2:AAACCATGCTGTGCGAGGTGCT(配列番号58)
Xyr1 Tc
(1)標的配列(5’−3’、PAMに太字で下線を引いている):
(3)オリゴ2:AAACGTTGAATTCTTCCTGGCA(配列番号61)
Pyr4 TS2
(1)標的配列5’−3’、PAMに太字で下線を引いている):
(3)オリゴ2:AAACTGTCGTAGTGCGTCTTGAGC(配列番号64)
Xyr1 Ta(配列番号65)
Thermo FisherのMEGAshortscript(商標)T7転写キットを製造業者の指示に従って使用して、xyr1 Ta用のおよびxyr1 Tc用のテンプレートからガイドRNAをin vitroで製造した。in vitroでの転写を少なくとも5時間にわたり37℃で実行した。転写したガイドRNAを、Thermo FisherのMEGAclear(商標)Transcription Clean−Upキットを使用して精製した。RNA濃度をNanoDrop(商標)(Thermo Fisher)で測定した。変性尿素−PAGEゲル(10%)を使用して、製造したガイドRNAの品質を確認した(データは示さない)。
方法
(i)プロトプラストの調製
プロトプラストを調製するために、所望のT.リーゼイ(T.reesei)の5×108個の胞子を、4つのバッフルを有する250mlの振とうフラスコ中で発芽培地(米国特許第8,679,815号明細書で説明されているレシピ)50ml中に播種し、170rpmで17時間にわたり27℃でインキュベートする。この液体体積を50mlのコニカルチューブ中に移して10分にわたり3000rpmで回転させることにより、菌糸体を回収する。上清をデカントし、菌糸体ペレットを1.2MのMgSO4−10mMのリン酸Na緩衝液を使用して2回洗浄し、溶解酵素緩衝液(1.2MのMgSO4−10mMのリン酸Na緩衝液(pH5.8)を使用してトリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)由来の溶解酵素(Sigmaカタログ#L1412)を溶解する、50mg/ml)15mlに再懸濁する。細胞懸濁液を、4つのバッフルを有する250mlの振とうフラスコに移し、200rpmで少なくとも2時間にわたり室温で振とうする。ガラス漏斗中で折り畳まれたMiracloth(Calbiochem Art.No.475855)に通すろ過によって、プロトプラストをGreinerチューブに回収する。ろ過したプロトプラストの上に、0.6Mのソルビトール−0.1MのTris−HCl緩衝液を慎重に添加する。4000rpmでの15分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集める。プロトプラストを含む中間相を新しいチューブに移し、1.2Mのソルビトール−10mMのTrisHCl緩衝液を少なくとも等体積で添加する。4000rpmでの5分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集め、1.2Mのソルビトール、10mMのTris−HCl緩衝液を使用して2回洗浄する。ペレットを1.2Mのソルビトール−10mMのTris−HCl pH7.5−10mMのCaCl2緩衝液 少なくとも1mlに再懸濁し、顕微鏡下でプロトプラストの数を計数する。プロトプラスト懸濁液を、1.2Mのソルビトール−10mMのTris−HCl−10mMのCaCl2 4部および25%のPEG6000−50mMのCaCl2−10mMのTris−HCl 1部を使用して、後続の形質転換で使用するために1ml当たり5×108個まで希釈する。
所望のカーゴ(例えば、DNA構築物、ガイドRNA、Cas9/ガイドRNA複合体等)をプロトプラスト200μL(約1×108個)に添加し、30分にわたり氷上で維持する。インキュベーション後、プロトプラストを、最少フォーゲルプレートの最上層とする、冷却した溶融ソルビトール/フォーゲル寒天(最少フォーゲル寒天の1.1Mソルビトール)に添加する(Davis et al.,(1970)Methods in Enzymology 17A,pp.79−143およびDavis,Rowland,NEUROSPORA,CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM,Oxford University Press,(2000))。このプレートを1週間にわたり30℃でインキュベートする。詳細な工程は米国特許第8,679,815号明細書(参照により本明細書に援用される)で説明されている。
不活性化されているpyr2遺伝子(オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(タンパク質ID21435)をコードする)を有するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株のプロトプラスト(株T4 mpg1 Δpyr2)を、ピルビン酸キナーゼ(pki)プロモーターの制御下でCas9用の発現カセットを含むおよびT.リーゼイ(T.reesei)由来のpyr2遺伝子の天然プロモーターの制御下でこのpyr2遺伝子用の発現カセットを含むDNA構築物にて上記で説明したように形質転換した。ゲノムに組み込まれているおよびCas9遺伝子を構成的に発現するCas9−pyr2カセットによる形質転換体を、機能するpyr2遺伝子を有する細胞(フォーゲルの培地上でのウリジン補充なしでの増殖)を選択することにより同定した。
in vitroでCas9/ガイドRNA複合体を形成するために、精製したCas9タンパク質20μgを、20mMのHepes、100mMのNaCl、5mMのMgCl2、0.1mMのEDTA pH6.5(最終体積は40μLである)中でPyr4TS2ガイドRNA 20μgと混合し、15〜30分にわたり室温でインキュベートして複合体を形成させた。Cas9/ガイドRNAを、上記で説明したようにT.リーゼイ(T.reesei)プロトプラストに形質転換し、フォーゲルのUridine FOAプレート上で増殖させた。
配列番号1
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9、NLSなし(配列番号8および配列番号15によりコードされる)
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)LMD−9 Cas9
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159 Cas9
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)Cas9
ナイセリア・メニンジティデス(Neisseria meningitides)Cas9
フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)亜種ノビシダ(novicida)Cas9
パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)Cas9
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子、NLSなし
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子、N末端NLS配列およびC末端NLS配列あり
N末端NLS配列およびC末端NLS配列を有するストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9(配列番号9によりコードされる)
完全なU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
トランケートされた/短いU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のポリヌクレオチド配列(開始コドンあり)、配列番号18をコードする
SV40 NLSコーディング配列(配列番号19をコードする)
ccaaaaaagaaacgcaaggtt
配列番号15
大腸菌(E.coli)コドン最適化Cas9遺伝子(停止コドンなし)
BLR2核局在化シグナルコーディング配列(配列番号20をコードする)
aagaagaaaaaactgaaactg
配列番号17
プラスミドpET30a−SpyCas9中におけるSpyCas9合成遺伝子のヌクレオチド配列。N末端His6タグをコードするオリゴヌクレオチド、SV40核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチド、およびBLR核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列(開始メチオニンあり)
Mhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkama
配列番号19
SV40 NLS
PKKKRKV
配列番号20
T.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子のNLS
KKKKLKL
配列番号21
プラスミドpET30a−SpyCas9から発現されるSpyCas9タンパク質のアミノ酸配列。N末端His6タグ、SV40核局在化シグナルおよびBLR核局在化シグナルをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
推定されるT.リーゼイ(T.reesei)U6遺伝子
sgRNAの配列(Nは標的部位に相補的な配列である)
sgRNA:gAd3A TS1
sgRNA:gTrGA TS2
sgRNA:gTrGA TS11
sgRNA:gPyr2 TS6
合成DNA:gAd3A TS1−1(サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)snr52プロモーターとS.セレビシエ(S.cerevisiae)sup4ターミネーターとを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
合成DNA:gAd3A TS1−2(T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーターおよびターミネーターを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
合成DNA:gAd3A TS1−3(T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーター、ターミネーターおよびイントロンを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
短いT.リーゼイ(T.reesei)U6プロモーター領域を有するガイドRNA発現カセットを合成DNAとして得た。ここで、TS11でT.リーゼイ(T.reesei)gla1遺伝子を標的とするsgRNA用の配列を含む一例を示す。
プライマー:gRNAフォワードaflII
cgtcagcttaagAATTCCTAAAGAAACAGCATGAAATGG
配列番号33
プライマー:gRNAリバースsfiI
cgtcagggccacgtgggccAAGAGAAAAAAAAGCACCACCGACTCGG
配列番号34
プライマー:Ad3 5’フォワード
tgaacacagccaccgacatcagc
配列番号35
プライマー:Ad3 5’リバース
gctggtgagggtttgtgctattg
配列番号36
プライマー:Ad3a 5005リバース
gattgcttgggaggaggacat
配列番号37
プライマー:Ad3 3’フォワード
cgaggccactgatgaagttgttc
配列番号38
プライマー:Ad3 3’リバース
Cagttttccaaggctgccaacgc
配列番号39
プライマー:Ad3a 5003フォワード
ctgatcttgcaccctggaaatc
配列番号40
Ad3 midリバース
ctctctatcatttgccaccctcc
配列番号41
プライマー:Adfragフォワード
ctccattcaccctcaattctcc
配列番号42
プライマー:Adfragリバース
gttcccttggcggtgcttggatc
配列番号43
プライマー:Ad3a 2kフォワード
caatagcacaaaccctcaccagc
配列番号44
Ad3a 2kリバース
gaacaacttcatcagtggcctcg
配列番号45
プライマー:glaA
ccgttagttgaagatccttgccg
配列番号46
プライマー:glaB
gtcgaggatttgcttcatacctc
配列番号47
プライマー:glaJ
tgccgactttgtccagtgattcg
配列番号48
プライマー:glaK
ttacatgtggacgcgagatagcg
配列番号49
プライマー:gla1repF
gtgtgtctaatgcctccaccac
配列番号50
プライマー:gla1repR
gatcgtgctagcgctgctgttg
配列番号51
プライマー:1553R
CCGTGATGGAGCCCGTCTTCT
配列番号52
プライマー:1555F
CGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTC
配列番号53
プライマー:pyr2F
gtataagagcaggaggagggag
配列番号54
プライマー:pyr2R
gaacgcctcaatcagtcagtcg
配列番号55
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)テロメア配列間の細菌カナマイシン耐性遺伝子(プロモーターおよびターミネーターを有する)
Xyr1 Ta標的配列(5’−3’、PAMに太字で下線を引いている):
Xyr1 Ta(2)オリゴ1
TAGGCAGCACCTCGCACAGCATG
配列番号58
Xyr1 Taオリゴ2
AAACCATGCTGTGCGAGGTGCT
配列番号59
Xyr1 Tc標的配列(5’−3’、PAMに太字で下線を引いている):
Xyr1 Tcオリゴ1
TAGGCTGCCAGGAAGAATTCAAC
配列番号61
Xyr1 Tcオリゴ2
AAACGTTGAATTCTTCCTGGCA
配列番号62
Pyr4 TS2標的配列(5’−3’、PAMに太字で下線を引いている)
Pyr4 TS2オリゴ1
TAGGCTCAAGACGCACTACGACA
配列番号64
Pyr4 TS2オリゴ2
AAACTGTCGTAGTGCGTCTTGAGC
配列番号65
Xyr1 Ta
Xyr1 Tc
Pyr4 TS2
K21 control T4
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgacatggtctcgg
配列番号69
T4 4−3
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgCGacatggtctcgg
配列番号70
T4 4−13
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgacatggtctcgg
配列番号71
T4 4−11
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgGacatggtctcgg
配列番号72
T4 4−12
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgacatggtctcgg
配列番号73
T4 4−18
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgGacatggtctcgg
配列番号74
T4 4−20
T4 4−19
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgGacatggtctcgg
配列番号76
T4 4−4
tggcccgtcgaatgttgtggtcaaggcgcccttcgGacatggtctcgg
配列番号77
T4 4−7
tggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgGacatggtctcgg
配列番号78
9−96
Pyr4 Tr
クエリ
ctggccgacaagattggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgacatggtctc
配列番号81
サブジェクト
ctggccgacaagattggcccgtcgattgtcgtgctcaagacgcactacgGacatggtctc
配列番号82
Pyr4 Try
P37 #13 4.2 rc
P37 4.1 #12 rc
P37 #15 4.4 rc
P37 #14 4.3
コンセンサス(欠失アラインメント)
野生型pyr4完全コーディング配列
Xyr1遺伝子コーディング配列
U6イントロン
U6遺伝子転写ターミネーター配列
TTTTTTTTCTCTT
配列番号92
Pyr4 TS2ガイドRNA用の標的配列
GCTCAAGACGCACTACGACA
Claims (16)
- 糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でDNA配列を改変する方法であって、
a)CasエンドヌクレアーゼおよびガイドRNAを糸状真菌細胞の集団に導入する工程であって、前記Casエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドRNAは、前記Casエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入する工程、ならびに
b)同定する工程であって、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの前記細胞の集団を培養することと、前記不安定な形質転換体から前記標的部位で前記DNA配列の改変を有する少なくとも1個の真菌細胞を同定することを含む、同定する工程
を含み、
前記導入する工程が、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することにより、前記ガイドRNAを前記真菌細胞の集団に一時的に導入することを含み、
前記ガイドRNA用の発現カセットが、ユーサコマイセート(Euascomycete)中でまたはペジゾマイセート(Pezizomycete)中で機能するRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが前記ガイドRNAをコードするDNAに作動可能に連結され、
前記プロモーターが、配列番号11または12に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
前記Casエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼまたはその変異体であり、そして、
前記標的部位での前記DNA配列の改変がドナーDNAと前記糸状真菌細胞のゲノム間の相同組換えに起因しない、方法。 - (i)前記標的部位での前記DNA配列の改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、および/または
(ii)前記Casエンドヌクレアーゼを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突(微粒子銃粒子送達)技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成し、および/または
(iii)前記ガイドRNAを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突(微粒子銃粒子送達)技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、請求項1に記載の方法。 - 前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、配列番号1〜7のいずれか一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているCasコーディング配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記Casコーディング配列が、配列番号8に対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列を含むCas9コーディング配列である、請求項7に記載の方法。
- 前記DNA構築物が、選択マーカー遺伝子を含み、前記不安定な形質転換体をスクリーニングすることが、前記選択マーカー遺伝子を欠失した形質転換体をスクリーニングすることを含む、請求項7または8に記載の方法。
- 前記Casエンドヌクレアーゼが、核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイドRNA用の発現カセットが、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドRNAコーディングDNAを含み、 前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号90に対して少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状真菌細胞が、ユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、(i)前記Casエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および(ii)前記親真菌細胞集団に前記ガイドRNAを一時的に導入することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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