JP2017538425A - 真菌ゲノム改変システムおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されるPCT特許出願PCT/CN2014/093914、PCT/CN2014/093916およびPCT/CN2014/093918(全てが2014年12月16日に出願されている)に対する優先権を主張する。
(37C.F.R.§1.52(e)に従って)EFSを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。EFSを介して提出した配列表テキストファイルには、2015年12月3日に作成したファイル「40532−WO−PCT−4_2015−832 final_ST25.txt」(165キロバイトのサイズである)が含まれている。
本明細書で使用する場合、「Casエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Casエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Cas遺伝子によりコードされるCRISPR関連(Cas)ポリペプチドに関し、Casタンパク質は、1種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的DNA配列を切断することができる(例えば「CRISPR−Cas systems and methods for altering expression of gene products」という表題の米国特許第8697359号明細書を参照されたい)。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するCasエンドヌクレアーゼの変異体もこの定義に含まれ、この変異体として、ニッキングエンドヌクレアーゼ活性を有する(即ち二本鎖DNA標的部位で一本鎖ニックを導入する)Cas変異体が挙げられる(下記の定義を参照されたい)。(これまで同定されている野生型Casエンドヌクレアーゼは標的部位で二本鎖切断を導入することに留意されたい)。Casエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドにより導かれて二本鎖DNA中の特定の標的部位(例えば細胞のゲノム中の標的部位)を認識して切断する。いくつかの異なる型のCRISPR−Casシステムが説明されており、I型CRISPR−Casシステム、II型CRISPR−CasシステムおよびIII型CRISPR−Casシステムに分類され得る(例えばLiu and Fan,CRISPR−Cas system:a powerful tool for genome editing.Plant Mol Biol(2014)85:209−218での説明を参照されたい)。ある特定の態様では、CRISPR−Casシステムは、Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体(例えばCasニッカーゼ等)を用いるII型CRISPR−Casシステムである。Cas9エンドヌクレアーゼは、あらゆる好都合なCas9エンドヌクレアーゼであることができ、下記の細菌種由来のCas9エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない:ストレプトコッカス(Streptococcus)種(例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)およびS.サーモフィルス(S.thermophilus))、カンピロバクター(Campylobacter)種(例えばC.ジェジュニ(C.jejuni))、ナイセリア(Neisseria)種(例えばN.メニンジティデス(N.meningitides))、フランシセラ(Francisella)種(例えばF.ノビシダ(F.novicida))ならびにパスツレラ(Pasteurella)種(例えばP.ムルトシダ(P.multocida))。Cas9に関して多くのその他の種を使用することができる。例えば、機能的Casエンドヌクレアーゼまたはこの変異体であって、配列番号45および48〜53のいずれか一つに対して少なくとも70%の同一性を有し、例えば配列番号45および48〜53のいずれか一つに対して少なくとも80%の同一性を有し、少なくとも90%の同一性を有し、少なくとも95%の同一性を有し、少なくとも96%の同一性を有し、少なくとも97%の同一性を有し、少なくとも98%の同一性を有し、少なくとも99%の同一性を有し、例えば最大で100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む機能的Casエンドヌクレアーゼまたはこの変異体を用いることができる。その他の実施形態では、Casエンドヌクレアーゼまたはこの変異体は、II型CRISPR−CasシステムのCpf1エンドヌクレアーゼである。Cpf1は、Cas9とは異なる特徴により頑強なDNA干渉を媒介する。Cpf1はtracrRNAを欠いており、Tリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを用いる。Cpf1は、千鳥足状のDNA二本鎖切断を介してDNAを切断する。例えばZetsche etal.,Cell(2015)163:759−771を参照されたい。
およびトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
真菌細胞(例えば糸状真菌細胞)中でのゲノム遺伝子座とドナーDNAとの相同組み換えを促進するためにガイドRNA/Casエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。
本発明の態様は、上記で説明した方法の実行で使用されるトランスジェニック真菌細胞と、結果として生じる、改変ゲノムを有する真菌細胞とを含む。そのため、本発明の実施形態は、本明細書で説明する方法のいずれかの態様により製造されている組換え真菌細胞と、この組換え真菌細胞を製造するために用いられるあらゆる親真菌細胞とを含む。
本発明の態様は、本明細書で説明する方法および組成物で使用される組換えポリヌクレオチドに関する。
1.糸状真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーDNAとの相同組換えの方法であって、
a)Casエンドヌクレアーゼと、ガイドRNAと、前記真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーDNAとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Casエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドRNAは、前記Casエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム遺伝子座中のまたは前記ゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
b)前記集団から、前記ゲノム遺伝子座と前記ドナーDNAとの相同組換えが起きている少なくとも1個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Casエンドヌクレアーゼ、前記ガイドRNAまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
2.前記真菌細胞中における前記標的部位での非相同末端結合(NHEJ)メカニズムが活性化されていない、機能していない、または低下している、実施形態1に記載の方法。
3.前記真菌細胞中における非相同末端結合(NHEJ)経路が、1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、実施形態2に記載の方法。
4.前記1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分が、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、xrsおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態3に記載の方法。
5.前記1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分がku80である、実施形態4に記載の方法。
6.前記CasエンドヌクレアーゼがCasニッカーゼである、実施形態1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7.前記CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、実施形態1〜5のいずれか一つに記載の方法。
8.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、実施形態7に記載の方法。
9.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号45および48〜53のいずれか一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態8に記載の方法。
10.前記ドナーDNAが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記目的のポリヌクレオチド配列が前記ゲノム遺伝子座に挿入される、実施形態1〜9のいずれか一つに記載の方法。
11.前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜10のいずれか一つに記載の方法。
12.前記導入する工程が、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜11のいずれか一つに記載の方法。
13.前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列を含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜12のいずれか一つまたは実施形態48〜54のいずれか一つに記載の方法。
14.前記DNA構築物が、前記選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーDNAとの両方を含む、実施形態13に記載の方法。
15.前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼをコードする配列と、前記ガイドRNAをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、前記ドナーDNAとを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態1〜14のいずれか一つに記載の方法。
16.前記DNA構築物が線状DNA構築物である、実施形態11〜15のいずれか一つに記載の方法。
17.前記DNA構築物が環状DNA構築物である、実施形態11〜15のいずれか一つに記載の方法。
18.前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットまたは前記Casエンドヌクレアーゼをコードする配列が、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているCasコーディング配列を含む、実施形態11および15〜17のいずれか一つに記載の方法。
19.前記Casコーディング配列が、配列番号44に対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列を含むCas9コーディング配列である、実施形態18に記載の方法。
20.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態1〜10、12〜14および16〜17のいずれか一つに記載の方法。
21.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドRNAを直接導入することを含む、実施形態1〜11、13〜14および16〜20のいずれか一つに記載の方法。
22.前記Casエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態1〜21のいずれか一つに記載の方法。
23.前記真菌細胞がユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、実施形態1〜22のいずれか一つに記載の方法。
24.前記真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、実施形態1〜23のいずれか一つに記載の方法。
25.前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、実施形態1〜24のいずれか一つに記載の方法。
26.前記相同組換えにより、前記標的部位でまたは前記標的部位付近でDNA配列が改変され、前記改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態1〜25のいずれか一つに記載の方法。
27.前記同定する工程が、前記相同組換えまたは前記改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態1〜26のいずれか一つに記載の方法。
28.前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態1〜27のいずれか一つに記載の方法。
29.前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーDNAとを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含み、前記同定する工程が、前記選択可能マーカーを失っているが前記ドナーDNAを保持している不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態1〜28のいずれか一つに記載の方法。
30.実施形態1〜29のいずれか一つに記載の方法により製造されている組換え糸状真菌細胞。
31.Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含む第1の組換えDNA構築物を含む組換え糸状真菌細胞。
32.前記組換え糸状真菌細胞が、NHEJ経路中の1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、実施形態30または31に記載の組換え真菌細胞。
33.前記NHEJ経路の1種または複数種の成分が、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4およびxrsからなる群から選択される、実施形態32に記載の組換え真菌細胞。
34.前記真菌細胞がku80の発現および/または活性を抑制する遺伝子改変を含む、実施形態33に記載の組換え真菌細胞。
35.前記CasエンドヌクレアーゼがCasニッカーゼである、実施形態31に記載の組換え真菌細胞。
36.ガイドRNA用の発現カセットを含む第2の組換えDNA構築物を更に含み、前記ガイドRNAおよび前記Casエンドヌクレアーゼが、前記Casエンドヌクレアーゼが前記組換え糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、実施形態30〜35のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
37.目的のポリヌクレオチドを含むドナーDNAを更に含む実施形態30〜36のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
38.前記CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、実施形態30〜37のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
39.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号45および48〜53のいずれか一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態38に記載の組換え真菌細胞。
40.前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、配列番号44に対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態31〜39のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
41.前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているCasエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、実施形態31〜40のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
42.前記Casエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態31〜41のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
43.前記核局在化シグナルが、SV40核局在化シグナル(配列番号46)、T.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子(配列番号47)に由来する核ターゲティングシグナルおよびこれら両方の組み合わせからなる群から選択される、実施形態42に記載の組換え真菌細胞。
44.前記真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される糸状真菌細胞である、実施形態30〜43のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
45.Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体をコードする糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む組換えDNA構築物。
46.前記糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列が配列番号44に対して少なくとも70%同一である、実施形態45に記載の組換えDNA構築物。
47.前記ガイドRNA用の発現カセットが、ユーサコマイセート(Euascomycete)中でまたはペジゾマイセート(Pezizomycete)中で機能するDNAポリメラーゼIII依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが、前記ガイドRNAをコードするDNAに作動可能に連結されている、実施形態12に記載の方法。
48.前記プロモーターがトリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来する、実施形態47に記載の方法。
49.前記プロモーターが、配列番号40または41に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態48に記載の方法。
50.前記プロモーターが配列番号40または41の配列を含む、実施形態49に記載の方法。
51.前記ガイドRNA用の発現カセットが、トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドRNAコーディングDNAを含む、実施形態12および47〜50のいずれか一つに記載の方法。
52.前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号42に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態51に記載の方法。
53.前記トリコデルマ(Trichoderma)U6 snRNA遺伝子に由来するイントロン配列が配列番号42の配列を含む、実施形態52に記載の方法。
実施例1:T.リーゼイ(T.reesei)U6 snRNA遺伝子の同定
RNAポリメラーゼIII依存性プロモーターは、RNAポリメラーゼII依存性プロモーターの使用に起因するであろう5’キャップ構造の付加またはポリアデニル化が生じないT.リーゼイ(T.reesei)中でのガイドRNAの産生に望ましい。しかしながら、T.リーゼイ(T.reesei)中で機能するRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターは説明されていない。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)snr52遺伝子、ヒトU6 snRNA遺伝子またはトウモロコシU6 snRNA遺伝子からの5’上流領域等のその他の種由来の既知のRNAポリメラーゼIII依存性プロモーターがT.リーゼイ(T.reesei)中で機能する能力に関して試験することを検討した。
単一ガイドRNA(sgRNA)分子がストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質と相互作用することにより、このエンドヌクレアーゼの標的をin vivoで真核生物のゲノム中の特定の遺伝子座に設定することができることが分かっている。sgRNAは、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)II型CRISPR−Casシステムの成分であることが自然に観測されるtracrRNAとcrRNAとの間の融合体として設計されているハイブリッド分子である(Gasiunas et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:E2579−86、Jinek et al.(2012)Science 337:816−21、Mali et al.(2013)Science 339:823−26およびCong et al.(2013)Science 339:819−23)。sgRNAの最初の20個のヌクレオチドはゲノム中の標的部位に相補的である。sgRNA相補領域に隣接するゲノム中の標的部位に追加の配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)が存在することも必要である。S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の場合、PAMは配列NGG(NはA、G、CまたはTである)である。
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子(NLS配列を含む)を設計し、合成し、T.リーゼイ(T.reesei)中での発現に関して試験した(配列番号7)。コードされるタンパク質(配列番号8)は、N末端SV40核局在化シグナル(NLS、配列番号46)とT.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子に由来するC末端NLS(配列番号47)とを有する(両方とも下記の配列番号8において下線を引いている)。
配列番号7
上記に示すCas9をコードする合成DNA配列を、Invitrogen(商標)Gateway(登録商標)クローニング技術(Thermo Fisher Scientific Inc.,Grand Island、NY)により適切な発現ベクター中に移すことを可能にすべく、この合成DNA配列が、隣接するattL1部位とattL2部位との間に存在し得るように、pENTR/D−TOPOに挿入した。下記の特徴を含むGateway適合性発現ベクター(compatible expression vector)pTrex2gHygが入手可能であった:Gatewayクローニング部位により離れているT.リーゼイ(T.reesei)pki1(ピルベートキナーゼ)遺伝子由来のプロモーター領域およびT.リーゼイ(T.reesei)cbh1(セロビオヒドロラーゼI)遺伝子由来のターミネーター領域、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)cpc1(交差経路制御1)プロモーター領域とアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)trpC(グルタミンアミドトランスフェラーゼ活性、インドールグリセロールホスフェートシンターゼ活性およびホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ活性を有する三機能タンパク質)ターミネーター領域とに機能的に連結されている細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに選択用のおよび大腸菌(E.coli)中での維持用の細菌ベクター配列。Gatewayクローニング手順を使用してCas9遺伝子をpTrex2gHygにクローニングし、pTrex2gHyg MoCasを得た(図2を参照されたい)。
異なる推定上のRNAポリメラーゼIII依存性のプロモーターおよびターミネーターが隣接しているgAd3A TS1 sgRNAをコードする合成DNA配列を得た。これらの合成DNA配列はそれぞれ、両端に制限酵素認識部位(EcoRIおよびBamHI)も有していた。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株を2種の別々の発現ベクター(Cas9産生用の1種およびgRNA産生用の1種)で共形質転換した、またはCas9およびgRNAの両方の発現用の単一ベクターで形質転換した、一連の実験を下記に説明する。これらの実験から、U6イントロンがgRNA転写領域内にも存在する場合にのみ、T.リーゼイ(T.reesei)U6遺伝子からの5’上流領域がgRNA転写を促進したことが実証される。これらの実験から、T.リーゼイ(T.reesei)形質転換体では、標的とされた遺伝子の不活性化が高効率で起こり得ることも実証される。
4種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子(cbh1、cbh2、egl1およびegl2)が欠失した、公的に入手可能な株RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の株を使用した。この株は、機能するpyr4遺伝子も欠いていた。バイオリスティック形質転換(biolistic transformation)(米国特許出願公開第20060003408A1号明細書で説明されている)を使用して、等量のpTrex2gHyg MoCas(図2)とp219M gAd3A TS1−1、p219M gAd3A TS1−2またはp219M gAd3A TS1−3のいずれかとの混合物で共形質転換した。2%のグルコース、100mg/LのハイグロマイシンBおよび200mg/Lのアデニンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。2番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。安定した形質転換体はより急速に増殖し、このコロニーは輪郭が滑らかであり、菌糸体はより密集していた。不安定な形質転換体はより遅く増殖し、菌糸体はより低密度であり、コロニーは輪郭がでこぼこで不規則であった。2番目のプレート上での増殖後、グルコースを含み、ハイグロマイシンを含まず、14mg/Lのアデニンを含むフォーゲルの培地に形質転換体を移し、アデニン栄養要求体であることを示す赤色/褐色コロニーを示す形質転換体をスクリーニングした。p219M gAd3A TS1−1により5個の安定した形質転換体および23個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン原栄養体であった。p219M gAd3A TS1−2により11個の安定した形質転換体および38個の不安定な形質転換体が得られ、11個全ての安定した形質転換体および不安定な形質転換体の内の29個がアデニン原栄養体であった。p219M gAd3A TS1−3により19個の安定した形質転換体および2個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン栄養要求体であった。明らかに、アデニン栄養要求体は、T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーター、イントロンおよびターミネーターを用いてsgAd3A TS1の転写を制御するgAd3A TS1−3によってのみ得られた。アデニン栄養要求体は、天然T.リーゼイ(T.reesei)ad3A遺伝子座での標的としたCas9切断を示す。試験したgAd3A TS1−3による全ての形質転換体がアデニン栄養要求体であったことから、Cas9媒介型の遺伝子不活性化は効率的であると結論付けることができる。
4種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子(cbh1、cbh2、egl1およびegl2)が欠失した、公的に入手可能な株RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の株を使用した。この株は、機能するpyr4遺伝子も欠いていた。この株を、等量のpTrex2gHyg MoCasとp219M gTrGA TS2との混合物でバイオリスティック法を使用して共形質転換した。1%のグルコース、100μg/mlのハイグロマイシンBおよび2mg/mlのウリジンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。2番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。17個の安定した形質転換体と4個の不安定な形質転換体を得た。これらの形質転換体を、グルコースを含まず1%の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌可能なコロニーは、よく増殖して胞子を形成する。グルコアミラーゼを分泌不能なコロニーは非常にまばらな菌糸体で増殖し、明らかに識別可能である。17個の安定した形質転換体の内の14個はグルコアミラーゼを分泌不能であり、4個全ての不安定な形質転換体がグルコアミラーゼを分泌しなかった。
工程1:1分にわたり94℃
工程2:25秒にわたり94℃
工程3:30秒にわたり63℃(1サイクル当たり0.2℃の温度低下)
工程4:8分にわたり70℃
工程2〜4を更に24回繰り返した
工程5:4℃で保持した
T.リーゼイ(T.reesei)pyr2遺伝子内の様々な位置を標的とするガイドRNA発現カセットを含むプラスミドpTrex2gHyg MoCasの誘導体によるプロトプラストのPEG媒介型形質転換により、T.リーゼイ(T.reesei)株QM6aまたはRL−P37の形質転換体を生成した。この遺伝子の不活性化により、ウリジン栄養要求性および5−フルオロオロチン酸(FOA)に対する耐性が付与される。最初に、ハイグロマイシンBを含む培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンBを含む新鮮な寒天プレートに移して安定または不安定と印を付けた。次いで、形質転換体を、2mg/mlのウリジンおよび1.2mg/mlのFOAを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレートに移した。FOAの存在下で増殖する能力は、Cas9媒介型のpyr2遺伝子不活性化に起因するウリジン栄養要求性を示す。
Cas9およびガイドRNAの発現ベクターpTrex2gHyg MoCAS gPyr2 TS6の、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)テロメア配列を含むバージョンを構築した(図6に示す)。このベクターに、下記に示すDNA配列(配列番号38)を挿入した。下線を引いた領域は反復テロメア配列を含んでおり、それぞれがこの断片の中心方向へ読み取られる。中心部分は、テロメアの反復を確実に維持するために大腸菌(E.coli)での選択を可能にするプロモーターおよびターミネーターを有する細菌カナマイシン耐性遺伝子である。トリコデルマ(Trichoderma)では、テロメアを有するベクターは各末端でテロメア配列と共に線状化すると予想され、低コピー数で自律的に維持されるはずであるが、染色体DNA中への偶発的な組み込みも起こり得る。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株T4(1)7を下記の実験に使用した。このT4(1)7は、セルラーゼ生産性の増大に関するスクリーニングによりRL−P37に由来する株であり、この株をウリジン栄養要求体にするpyr2遺伝子を不活性化する単一点変異を有する。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)の「四重欠失株」(RL−P37に由来し、セロビオヒドロラーゼ1遺伝子、セロビオヒドロラーゼ2遺伝子、エンドグルカナーゼ1遺伝子およびエンドグルカナーゼ2遺伝子が欠失している(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1およびΔegl2株、国際公開第92/06184号パンフレットおよび国際公開第05/001036号パンフレットを参照されたい))に由来し、天然のエンドグルカナーゼ−3遺伝子およびベータグルコシダーゼ−1遺伝子の欠失を有する株(MAD6)を、Cas9標的部位での非相同末端結合(NHEJ)DNA挿入の役割を確認するために設計した実験に使用した。このMAD6株はまた、DNA組換え用の主要なNHEJ経路に必須な天然遺伝子(ヒトku80に対してオルソロガス)も欠失している(このMAD6株をどのようにして作製するかの説明に関して米国特許出願公開第20130149742A1号明細書「Filamentous fungal host strains and DNA constructs,and methods of use thereof」を参照されたい)。この株を、pTrex2gHyg MoCAS gTrGA TS11Bと上記で説明したドナーGla1rep断片とで共形質転換した。gla1遺伝子座での相同組換えによるこの断片の組込みによって、gla1遺伝子を不活性化させ、PAM配列から1bpを欠失させてTS11標的部位を除去することができた。PEG媒介型方法によってプロトプラストから形質転換体を得た。1.1Mのソルビトールおよび100ug/mLのハイグロマイシンBを含むフォーゲルの最少培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンのみを含む最少培地の新鮮な寒天プレートに移した91個の形質転換体の内、4個のみが安定したハイグロマイシン耐性表現型を有した(非選択的条件下での増殖期間後にハイグロマイシンを含む培地上に再び蒔いた場合に増殖する能力により確認した)。全ての形質転換体を、唯一の炭素源として1%の不溶性デンプンを含むフォーゲルの最少培地に移し、4個の安定した形質転換体を含む17個(18%)がグルコアミラーゼ陰性であることが分かった。PCRおよびDNA配列分析から、gla1遺伝子座での相同組換えによりドナーGla1repが組み込まれている場合では、13個の不安定な形質転換体の内の12個および安定した形質転換体の内の1個が、予想したTS11PAMで1bpのみの欠失を有していることが分かった。その他の不安定な形質転換体は、グルコアミラーゼ陰性表現型を有していたにもかかわらず野生型gla1配列を有した。その他の3個の安定した形質転換体では、gla1遺伝子座の場合に予想されるサイズの明瞭なPCR産物が得られず、これらの形質転換体ではベクターまたはドナーGla1repの挿入が起きていた可能性がある。全ての不安定なグルコアミラーゼ陰性形質転換体をハイグロマイシンを含まない培地上で増殖させ、ハイグロマイシンを含む培地に戻した。いずれも増殖することができず、このことは、これらの形質転換体がpTrex2gHyg MoCAS gTrGA TS11Bベクターを失っていたことを示す。
実施例10:大腸菌(E.coli)中でのCRISPR SpyCas9−D10Aニッカーゼの異種発現
大腸菌(E.coli)コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9−D10A(SpyCas9−D10A)ニッカーゼ遺伝子を合成し、Generay(Shanghai、China)によりNcoI部位およびHindIII部位で発現ベクターpET30aに挿入し、結果としてプラスミドpET30a−SpyCas9−D10Aニッカーゼを得た(図7)。図7のプラスミドマップで示すように、発現カセットの完全なコーディング配列は、5’から3’への方向で、N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域をコードする配列(配列番号68、メチオニン用の開始コドンを含む)、SV40核局在化シグナルをコードする配列(配列番号69)、SpyCas9−D10Aニッカーゼをコードする配列(配列番号65)、およびBLR2核局在化シグナルをコードする配列(配列番号70)を含み、全てが作動可能に連結されている。この全コーディング配列を配列番号54に示す。配列番号68によりコードされるN−末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列を配列番号67(1位でメチオニンを含む)に示し、配列番号69によりコードされるSV40核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号46に示し、配列番号65によりコードされるSpyCas9−D10Aニッカーゼのアミノ酸配列を配列番号66に示し、配列番号70によりコードされるBLR2核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号47に示す。配列番号54によりコードされるアミノ酸配列を配列番号55に示す。
SpyCas9(D10A)の精製に、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の組み合わせを適用した。粗ブロス2リットルを得て遠心分離した。細胞をペレット化し、溶解緩衝液(20mMのHEPES、pH7.5、500mMのNaCl、0.1%のTritonX−100、1mMのDTTおよび1mMのTCEP、Rocheから購入したプロテアーゼ阻害剤カクテル)400mlに再懸濁させ、超音波処理器(35%パワー、20分、2秒オン/3秒オフ)(SCIENT2−II D、Ningbo Scientz Biotechnology Co.,LTD.、Zhejiang、China)で溶解させた。溶解物を、40分にわたる20,000gでの遠心分離により清澄化した。
in vitroニッカーゼ切断アッセイ用の基質DNA断片の調製
Zymo Research Corporation(Irvine、CA)のZF Fungal/Bacterial DNAミニプレップキットを使用して、RL−P37に由来するならびにセロビオヒドロラーゼ1遺伝子、セロビオヒドロラーゼ2遺伝子、エンドグルカナーゼ1遺伝子およびエンドグルカナーゼ2遺伝子が欠失している(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1およびΔegl2株、「四重欠失株」とも呼ばれる、国際公開第92/06184号パンフレットおよび国際公開第05/001036号パンフレットを参照されたい)トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株からゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNA 1ngをテンプレートして用い、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)グルコアミラーゼ(TrGA)遺伝子(Gene ID:18483895)およびこの遺伝子の部分5’−UTRを含むDNA断片(配列番号56)を、KOD−Plus PCRキット(東洋紡株式会社、日本)とそれぞれ0.4μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー:5’−gactgtctccaccatgtaatttttc−3’(配列番号57)および5’−ggcagactacaagtctactagtactac−3’(配列番号58)とを使用するPCRにより増幅させた。PCR産物をZymo Research CorporationのDNA Clean & Concentrator(商標)−5キットで精製して濃縮し、濃縮後のPCR産物のDNA濃度をNanoDrop(商標)Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific Inc.)で測定した。
TrGA遺伝子中の2つのVTドメイン(TrGA_sgF1およびTrGA_sgR1)ならびにこれらのVTドメインに特有のPAMを、下流活性および形質転換実験のために同定した。TrGA_sgF1(配列番号59)またはTrGA_sgR1(配列番号60)のいずれかを有する、T7プロモーター配列および単一ガイドRNA配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、GenerayによりpMD18Tベクターに挿入し、結果としてpMD18T(T7−Spy−TrGA_sgF1)(図8A)またはpMD18T(T7−Spy−TrGA_sgR1)(図8B)をそれぞれ得た。それぞれ0.4μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー:5’−tgatgacggtgaaaacctc−3’(配列番号71)および5’−aaaagcaccgactcgg−3’(配列番号72)を用いるPCRにより、pMD18T(T7−Spy−TrGA_sgF1)またはpMD18T(T7−Spy−TrGA_sgR1)のいずれかから、in vitroでの転写用のDNA断片を増幅させた。PCR産物をZymo Research CorporationのDNA Clean & Concentrator(商標)−5キットで精製して濃縮し、濃縮後のPCR産物のDNA濃度をNanoDrop(商標)Spectrophotometerで測定した。
このin vitroニッカーゼ切断アッセイは二段階反応である。第1段階では、精製したSpyCas9(D10A)1μg、基質DNA断片200ngおよび単一ガイドRNA(またはコントロールとしての水)200ngを、50mMのHEPES pH7.3、150mMのKCl、0.5mMのDTTおよび10mMのMgCl2を含む反応緩衝液15μl中で一緒に混合した。SpyCas9ニッカーゼアッセイで説明したように反応を実施した。第1段階の反応の終了後、SpyCas9(D10A)1μgおよび特定の単一ガイドRNA 200ngを添加した。第1段階の反応を繰り返した後、続いて反応結果を0.8%のアガロースゲル、30分にわたる140ボルトでの泳動を使用して分析し、結果を図10に示す。図10において、レーン1はDNAラダー(分子量を左側に示す)であり、レーン2はSpyCas9(D10A)と基質DNAおよびTrGA_sgF1のみとの反応を示し、レーン3はSpyCas9(D10A)と基質DNAおよびTrGA_sgR1のみとの反応を示し、レーン4はSpyCas9(D10A)と基質DNAおよび両方のsgRNAとの反応を示す。インタクトなDNA基質(配列番号56)のサイズは4.9kbであるのに対して、両方のsgRNAによる切断産物のサイズは2.8kbおよび2.1kbであるだろう。図10に示すように、基質DNA断片は両方のRNAの存在下でのみ切断されており(レーン4)、このことは、SpyCas9(D10A)が活性ニッカーゼであることを示唆する。
プロトプラストの調製
プロトプラストを調製するために、エンドグルカナーゼ−3遺伝子、エンドグルカナーゼ−4遺伝子、エンドグルカナーゼ−5遺伝子、エンドグルカナーゼ−6遺伝子、マンナナーゼ−1遺伝子およびアルファ−アミラーゼ遺伝子を更に欠失しているが正常なNHEJメカニズムを有するT.リーゼイ(T.reesei)の四重欠失株(上記で説明した)の5×108個の胞子(30℃で5日にわたりPDAプレート上で増殖させた)を、4つのバッフルを有する250mlの振とうフラスコ中で発芽培地(米国特許第8,679,815号明細書で説明されているレシピ)50ml中に播種し、170rpmで17時間にわたり27℃でインキュベートした。この液体体積を50mlのコニカルチューブ中に移して10分にわたり3000rpmで回転させることにより、菌糸体を回収した。上清をデカントし、菌糸体ペレットを1.2MのMgSO4−10mMのリン酸Na緩衝液を使用して2回洗浄し、溶解酵素緩衝液(1.2MのMgSO4−10mMのリン酸Na緩衝液(pH5.8)を使用してトリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)由来の溶解酵素(Sigmaカタログ#L1412)を溶解する、50mg/ml)15mlに再懸濁した。細胞懸濁液を、4つのバッフルを有する250mlの振とうフラスコに移し、200rpmで少なくとも2時間にわたり室温で振とうした。ガラス漏斗中で折り畳まれたMiracloth(Calbiochem Art.No.475855)に通すろ過によって、プロトプラストをGreinerチューブに回収した。ろ過したプロトプラストの上に、0.6Mのソルビトール−0.1MのTris−HCl緩衝液を慎重に添加した。4000rpmでの15分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集めた。プロトプラストを含む中間相を新しいチューブに移し、1.2Mのソルビトール−10mMのTrisHCl緩衝液を少なくとも等体積で添加した。4000rpmでの5分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集め、1.2Mのソルビトール、10mMのTris−HCl緩衝液を使用して2回洗浄した。ペレットを1.2Mのソルビトール−10mMのTris−HCl pH7.5−10mMのCaCl2緩衝液 少なくとも1mlに再懸濁し、顕微鏡下でプロトプラストの数を計数した。プロトプラスト懸濁液を、1.2Mのソルビトール−10mMのTris−HCl−10mMのCaCl2 4部および25%のPEG6000−50mMのCaCl2−10mMのTris−HCl 1部を使用して、将来の形質転換用に1ml当たり5×108個まで希釈した。
TrGA欠失カセットを構築し、図11に概略を示す。このTrGA欠失カセットは、pyr2プロモーター、pyr2CDSおよびpyr2ターミネーターを含むpyr2発現カセット、後のループアウト用の500bpの反復配列を含み、5’および3’のTrGA相同領域が隣接していた。
Spycas9ニッカーゼプレミックスおよび欠失カセットを使用してT.リーゼイ(T.reesei)のTrGA遺伝子をノックアウトさせるために、NEB緩衝液3(New England Biolabs)3μl中で保存緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、150mMのKClおよび40%のグリセロール)中のSpycas9ニッカーゼタンパク質25μgとヌクレアーゼフリー水に溶解させたsgRNA(TrGA_sgR1)20μgとを緩やかに混合してプレミックス30μlを得て、室温で30分にわたりインキュベートした。プレミックス30μlを欠失カセット20μg(20μl)と共にプロトプラスト200μL(1×108個)に添加し、30分にわたり氷上で維持した。30分にわたる氷上でのインキュベーション後、プロトプラストを、最少フォーゲルの寒天プレートの最上層として使用する、冷却した溶融ソルビトール/フォーゲル寒天(2%のグルコースを含む最少フォーゲルの寒天中に1.1Mのソルビトール)に添加した(Davis et al.,(1970)Methods in Enzymology 17A,pgs.79−143およびDavis,Rowland,NEUROSPORA,CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM,Oxford University Press,(2000))。このプレートを1週間にわたり30℃でインキュベートした。詳細な工程は米国特許第8,679,815号明細書(参照により本明細書に援用される)で説明されている。
フォーゲルのデンプン寒天中では、90個の株の内の47個が増殖の遅延を示した。これらの内の9個(図12を参照されたい、#1〜#9)を無作為に選択し、プライマーとしてFw1(5’−cactactacatccatacgcagcaaacatgg−3’(配列番号62))およびR3(5’−ggtcaagaagcacatgccagagttcg−3’(配列番号63))を使用するPCRスクリーニングを実施した。図13Aは、野生型株およびTrGA欠失株のゲノム遺伝子座とプライマーアニーリング部位(矢印は、PCR反応で使用した場合の重合の方向を示す)とを示す。
実施例14:遺伝子編集用の特異的相同ドナー断片(directed homologous donor fragment)を含むcas9発現プラスミドの使用によるgla1遺伝子からの単一塩基の欠失
この実施例では、単一塩基欠失を含む相同gla1ドナー断片をプラスミドpTrex2gHyg MoCas gTrGA TS11B(実施例8で説明した)に組み込むことにより、遺伝子破壊を誘導した。約1kbの合成DNA断片Gla1rep(配列番号39、図14中において「Tr−Gla 1kb相同断片」と標識した)をプラスミドpTrex2gHygMoCasgTrGATS11Bの唯一のEcoRV制限部位に挿入することにより、プラスミドpTrexMoCasGATS11−HDR(図14)を生成した。EcoRV部位は、pSL1180配列とハイグロマイシン耐性マーカー(hph)のN.クラッサ(N.crassa)cpc1プロモーターとの間のポリリンカー配列中に存在する。プライマー1556F(5’−ATGCGCAAATTTAAAGCGCTGATgtgtgtctaatgcctccaccac[配列番号73])および1557R(5’−ATATGGATCTGCGCGCGATCGATgatcgtgctagcgctgctgttg[配列番号74])を使用して、Gla1repと、pTrex2gHygMoCasgTrGATS11B中のEcoRV部位の両側と重複するための加数相同テイル(addend homologous tail)とを増幅させ、EcorV切断pTrex2gHygMoCasgTrGATS11Bプラスミドを有する断片のGibson Assembly(NEB Gibson Assembly Master Mix、New England Biolabs、Beverly、MAを使用する)を容易にした。
配列番号1
推定されるT.リーゼイ(T.reesei)U6遺伝子
sgRNAの配列(Nは標的部位に相補的な配列である)
sgRNA:gAd3A TS1
sgRNA:gTrGA TS2
sgRNA:gTrGA TS11
sgRNA:gPyr2 TS6
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子、N末端NLS配列およびC末端NLS配列あり
配列番号7によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9、N末端NLS配列およびC末端NLS配列あり
合成DNA:gAd3A TS1−1(サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)snr52プロモーターとS.セレビシエ(S.cerevisiae)sup4ターミネーターとを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
合成DNA:gAd3A TS1−2(T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーターおよびターミネーターを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
合成DNA:gAd3A TS1−3(T.リーゼイ(T.reesei)U6のプロモーター、ターミネーターおよびイントロンを有するgAd3A TS1 sgRNA(配列番号3))
短いT.リーゼイ(T.reesei)U6プロモーター領域を有するガイドRNA発現カセットを合成DNAとして得た。ここで、TS11でT.リーゼイ(T.reesei)gla1遺伝子を標的とするsgRNA用の配列を含む一例を示す。
プライマー:gRNAフォワードaflII
cgtcagcttaagAATTCCTAAAGAAACAGCATGAAATGG
配列番号14
プライマー:gRNAリバースsfiI
cgtcagggccacgtgggccAAGAGAAAAAAAAGCACCACCGACTCGG
配列番号15
プライマー:Ad3 5’フォワード
tgaacacagccaccgacatcagc
配列番号16
プライマー:Ad3 5’リバース
gctggtgagggtttgtgctattg
配列番号17
プライマー:Ad3a 5005リバース
gattgcttgggaggaggacat
配列番号18
プライマー:Ad3 3’フォワード
cgaggccactgatgaagttgttc
配列番号19
プライマー:Ad3 3’リバース
Cagttttccaaggctgccaacgc
配列番号20
プライマー:Ad3a 5003フォワード
ctgatcttgcaccctggaaatc
配列番号21
Ad3 midリバース
ctctctatcatttgccaccctcc
配列番号22
プライマー:Adfragフォワード
ctccattcaccctcaattctcc
配列番号23
プライマー:Adfragリバース
gttcccttggcggtgcttggatc
配列番号24
プライマー:Ad3a 2kフォワード
caatagcacaaaccctcaccagc
配列番号25
Ad3a 2kリバース
gaacaacttcatcagtggcctcg
配列番号26
プライマー:glaA
ccgttagttgaagatccttgccg
配列番号27
プライマー:glaB
gtcgaggatttgcttcatacctc
配列番号28
プライマー:glaD
gagagacgcaggatgactcaaag
配列番号29
プライマー:glaH
tgccgtgggtcattggcatattc
配列番号30
プライマー:glaJ
tgccgactttgtccagtgattcg
配列番号31
プライマー:glaK
ttacatgtggacgcgagatagcg
配列番号32
プライマー:gla1repF
gtgtgtctaatgcctccaccac
配列番号33
プライマー:gla1repR
gatcgtgctagcgctgctgttg
配列番号34
プライマー:1553R
CCGTGATGGAGCCCGTCTTCT
配列番号35
プライマー:1555F
CGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTC
配列番号36
プライマー:pyr2F
gtataagagcaggaggagggag
配列番号37
プライマー:pyr2R
gaacgcctcaatcagtcagtcg
配列番号38
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)テロメア配列間の細菌カナマイシン耐性遺伝子(プロモーターおよびターミネーターを有する)
合成DNA:Gla1rep
完全なU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
トランケートされた/短いU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
U6遺伝子のイントロン
U6遺伝子の転写ターミネーター配列
TTTTTTTTCTCTT
配列番号44
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子、NLSなし
配列番号44によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9、NLSなし
SV40 NLS
PKKKRKV
配列番号47
T.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子のNLS
KKKKLKL
配列番号48
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)LMD−9 Cas9
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159 Cas9
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)Cas9
ナイセリア・メニンジティデス(Neisseria meningitides)Cas9
フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)亜種ノビシダ(novicida)Cas9
パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)Cas9
プラスミドpET30a−Cas9−D10Aニッカーゼ中における合成Cas9−D10Aニッカーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。N末端His6タグをコードするオリゴヌクレオチドを下線およびイタリック体で示し、SV40核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドをイタリック体および灰色ハイライトで示し、BLR核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドを下線および灰色ハイライトで示す。
プラスミドpET30a−Cas9−D10Aニッカーゼ(配列番号54によりコードされる)から発現されるCas9−D10Aニッカーゼタンパク質のアミノ酸配列。N末端His6タグを下線およびイタリック体で示し、変異アミノ酸は太字および下線であり(D10A)、SV40核局在化シグナルをイタリック体および灰色で示し、BLR核局在化シグナルを下線および灰色で示す。
基質DNA断片のヌクレオチド配列。UTR配列を小文字で示し、TrGA遺伝子を大文字で示した。2つの選択したVTドメイン(TrGA_sgF1およびTrGA_sgR1)をそれぞれ太字で示して下線を引いた。
配列番号56用のフォワードプライマー:
5’−gactgtctccaccatgtaatttttc−3’
配列番号58
TrGAプライマーKOR2、配列番号56用のリバースプライマー:
5’−ggcagactacaagtctactagtactac−3’
配列番号59
T7プロモーター、CERドメインおよびVTドメインTrGA_sgF1の転写用のオリゴヌクレオチド配列。VTドメインを大文字で示し、T7プロモーターおよびCERドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
T7プロモーター、CERドメインおよびVTドメインTrGA_sgR1の転写用のオリゴヌクレオチド配列。VTドメインを大文字で示し、T7プロモーターおよびCERドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
TrGAノックアウトカセットのヌクレオチド配列:
Fw1(5’−cactactacatccatacgcagcaaacatgg−3’)および
配列番号63
R3(5’−ggtcaagaagcacatgccagagttcg−3’)
配列番号64
TrGAF2(5’gactgtctccaccatgtaatttttc3’)
配列番号65
大腸菌(E.coli)コドン最適化Cas9−D10Aニッカーゼ遺伝子(停止コドンなし)
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9−D10Aニッカーゼのアミノ酸配列、配列番号65によりコードされる
N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列(開始メチオニンあり)
mhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkama
配列番号68
N末端His6タグ/トロンビン/S・Tag(商標)/エンテロキナーゼ領域のポリヌクレオチド配列(開始コドンあり)、配列番号67をコードする
SV40 NLSコーディング配列(配列番号46をコードする)
ccaaaaaagaaacgcaaggtt
配列番号70
BLR核局在化シグナルコーディング配列(配列番号47をコードする)
Aagaagaaaaaactgaaactg
配列番号71
tgatgacggtgaaaacctc
配列番号72
aaaagcaccgactcgg
配列番号73
Gla1repプライマー1556F
ATGCGCAAATTTAAAGCGCTGATgtgtgtctaatgcctccaccac
配列番号74
Gla1repプライマー1557R
ATATGGATCTGCGCGCGATCGATgatcgtgctagcgctgctgttg
配列番号75
シークエンシングプライマー1538F
CCACCACAGGAACCAAACC
配列番号76
シークエンシングプライマー1539R
CTGCGACGGAGGGAATGACG
配列番号77
シークエンシングプライマー1540F
GGGCAGGACTGGCAAGGATGT
配列番号78
シークエンシングプライマー1541R
GCCGTCACGCCAGGAACAAG
配列番号79
TrGAプライマーKOF1
gaacaatcttctttgcaatgttggtc
配列番号80
Pyr2プライマーR1
gaggaagtcctgcttgtaggcaggc
配列番号81
Pyr2プライマーF4
cgacagagcagtcatatggggatacg
Claims (34)
- 糸状真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーDNAとの相同組換えの方法であって、
a)Casエンドヌクレアーゼと、ガイドRNAと、前記真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーDNAとを糸状真菌細胞の集団に導入することであって、前記Casエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドRNAは、前記Casエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム遺伝子座中のまたは前記ゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
b)前記集団から、前記ゲノム遺伝子座と前記ドナーDNAとの相同組換えが起きている少なくとも1個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Casエンドヌクレアーゼ、前記ガイドRNAまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。 - 前記真菌細胞中における前記標的部位での非相同末端結合(NHEJ)メカニズムが活性化されていない、機能していない、または低下している、請求項1に記載の方法。
- 前記真菌細胞中における非相同末端結合(NHEJ)経路が、1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分が、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、xrsおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分がku80である、請求項4に記載の方法。
- 前記CasエンドヌクレアーゼがCasニッカーゼである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号45および48〜53のいずれか一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記ドナーDNAが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記目的のポリヌクレオチド配列が前記ゲノム遺伝子座に挿入される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列を含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA構築物が、前記選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーDNAとの両方を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記Casエンドヌクレアーゼをコードする配列と、前記ガイドRNAをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、前記ドナーDNAとを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA構築物が線状DNA構築物である、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA構築物が環状DNA構築物である、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットまたは前記Casエンドヌクレアーゼをコードする配列が、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているCasコーディング配列を含む、請求項11および15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casコーディング配列が、配列番号44に対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列を含むCas9コーディング配列である、請求項18に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項1〜10、12〜14および16〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドRNAを直接導入することを含む、請求項1〜11、13〜14および16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状真菌細胞がユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相同組換えにより、前記標的部位でまたは前記標的部位付近でDNA配列が改変され、前記改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定する工程が、前記相同組換えまたは前記改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーDNAとを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含み、前記同定する工程が、前記選択可能マーカーを失っているが前記ドナーDNAを保持している不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程(a)からの細胞の集団を培養することを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法により製造されている組換え糸状真菌細胞。
- Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含む第1の組換えDNA構築物を含む組換え糸状真菌細胞。
- 前記組換え糸状真菌細胞が、NHEJ経路中の1種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、請求項30または31に記載の組換え真菌細胞。
- 前記NHEJ経路の1種または複数種の成分が、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4およびxrsからなる群から選択される、請求項32に記載の組換え真菌細胞。
- 目的のポリヌクレオチドを含むドナーDNAを更に含む請求項30〜33のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
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