JP7469806B2 - ゲノム編集方法、組成物、細胞、細胞製剤、及び細胞製剤の製造方法 - Google Patents
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Description
本願は、2018年3月29日に、日本に出願された特願2018-66174号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年、ゲノム編集ヌクレアーゼの発見により、ゲノム上の任意の箇所でDNA二重鎖を切断することができるようになった。この結果、ゲノムDNAと導入外来遺伝子との間で相同組換えを誘導しやすくなった(例えば、特許文献1、非特許文献1~2参照。)。
相同組換えの頻度を上げる試みとして、例えば非特許文献3~4に挙げられる方法が提案されている。
[1]単離された細胞中のゲノム編集方法であって、500bp未満の長さの相同アームを5’端と3’端に有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、少なくとも一方を相同組換えにより、標的ゲノムに導入することを特徴とするゲノム編集方法。
[2]前記外来DNAの5’端と3’端のうち、両方を相同組換えにより、外来DNAを前記標的ゲノム導入する、[1]に記載のゲノム編集方法。
[3]前記細胞が、血球系細胞又は未分化細胞である、[1]又は[2]に記載のゲノム編集方法。
[4]前記細胞が、幹細胞である、[1]~[3]のいずれかに記載のゲノム編集方法。
[5]前記細胞が、造血幹細胞である、[1]~[4]のいずれかに記載のゲノム編集方法。
[6]前記外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を相同組換えにより、他方を非相同組換えにより、外来DNAを前記標的ゲノムに導入する、[1]に記載のゲノム編集方法。
[8]前記細胞が、血球系細胞又は未分化細胞である、[7]に記載のゲノム編集方法。
[9]前記細胞が、幹細胞である、[7]又は[8]に記載のゲノム編集方法。
[10]前記細胞が、造血幹細胞である、[7]~[9]のいずれかに記載のゲノム編集方法。
[12]更に標的ゲノムDNA切断酵素又は前記酵素をコードするDNA若しくはmRNAを含有する、[11]に記載の組成物。
[13]医薬用である、[11]又は[12]に記載の組成物。
[14]重症複合免疫不全症治療用である、[11]~[13]のいずれかに記載の組成物。
[16]前記外来DNAの5’端と3’端のうち、両方を相同組換えにより、外来DNAを標的ゲノムDNAに導入する、[15]に記載の細胞製剤の製造方法。
[17]前記細胞が、血球系細胞又は未分化細胞である、[15]又は[16]に記載の細胞製剤の製造方法。
[18]前記細胞が、幹細胞である、[15]~[17]のいずれかに記載の細胞製剤の製造方法。
[19]前記細胞が、造血幹細胞である、[15]~[18]のいずれかに記載の細胞製剤の製造方法。
[20]前記外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を相同組換えにより、他方を非相同組換えにより、外来DNAを標的ゲノムDNAに導入する、[15]に記載の細胞製剤の製造方法。
[22]前記細胞が、血球系細胞又は未分化細胞である、[21]に記載の細胞製剤の製造方法。
[23]前記細胞が、幹細胞である、[21]又は[22]に記載の細胞製剤の製造方法。
[24]前記細胞が、造血幹細胞である、[21]~[23]のいずれかに記載の細胞製剤の製造方法。
[25]細胞の標的ゲノム上、外来DNAのゲノム挿入部位の5’側又は3’側に、外来DNA由来の断片を有することを特徴とする細胞。
[26][25]に記載の細胞を含有することを特徴とする細胞製剤。
本発明のゲノム編集方法は、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、少なくとも一方を相同組換えにより、標的ゲノムに導入する方法である。
一実施形態において、本発明は、細胞中のゲノム編集方法であって、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’末端と3’末端における相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入する方法を提供する。
本実施形態において、標的ゲノムDNAの二重鎖切断に用いるシステムは、CRISPR-Cas9システムが好ましい。
動物細胞の例として、動物由来の幹細胞、生殖細胞、生殖系列細胞、株化細胞、初代培養細胞、及び、幹細胞から誘導された細胞又は初代培養細胞から作製された細胞が挙げられる。前記幹細胞はまた、株化された細胞であっても、初代培養細胞であってもよい。
本発明のゲノム編集方法は、必ずしも単離された細胞に限らない。動物個体そのものあるいは個体内の体細胞や幹細胞も対象となる。
動物の幹細胞は、幹細胞に対して遺伝子操作を加えた細胞であってもよい。このような細胞として、例えば、ヒト白血球型抗原(HLA)を改編することにより免疫拒絶反応を抑えた多能性幹細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、造血幹細胞が好ましい。
生殖細胞、生殖系列細胞の例として、卵子、卵母細胞、卵原細胞、精子、精母細胞、精原細胞、精子幹細胞(精原幹細胞)、始原生殖細胞等が挙げられる。卵子と精子が受精した受精卵でもよい。また、受精卵が分裂した、2細胞~8細胞胚でもよく、着床するまでの桑実胚~胚盤胞でもよい。
本実施形態においては、血球系細胞又は未分化細胞が好ましい。未分化細胞としては、幹細胞がより好ましく、造血幹細胞が特に好ましい。
相同アームの長さの下限値は、5bp以上が好ましく、10bp以上がより好ましい。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴(AAV)ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、等が挙げられる。
ターゲティングベクターの例として、CRISR/Cas9システムを利用したゲノム編集用の各種ベクターが挙げられ、例えば、HITI(Homology-independent targeted integration)システムを利用したターゲティングベクターが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、細胞中のゲノム編集方法であって、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を相同組換えにより、他方を非相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入する方法を提供する。
短い相同アームの長さとしては、50bp以下が好ましく、30bp以下がより好ましく、10bp以下が特に好ましく、0bpであってもよい。長い相同アームの長さとしては、30bp以上が好ましく、40bp以上がより好ましく、50bp以上が特に好ましい。
導入された短い相同アームは、非相同組換えに寄与し、長い相同アームは、相同組換えに寄与する。本実施形態において、非相同組換えとは、非相同末端結合を意味する。
外来DNAの長さとしては、ゲノム上に挿入できる長さであれば特に限定されず、例えば100bp~10kbpが挙げられる。
一実施形態において、本発明は、単離された細胞中のゲノム編集方法であって、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、外来DNAの5’側と3’側のうち、両側を相同組換えにより、標的ゲノムに導入する方法を提供する。
標的ゲノムDNAを二重鎖切断しないこと以外は、第一実施形態と同様である。
本発明の組成物は、500bp未満の長さの相同アームを両端に有する外来DNAを含有する。
添加剤は、1種を単独で又は2種以上を混合することにより用いられる。
本発明の遺伝子治療方法は、変異を有する標的ゲノムDNAを切断する酵素又は前記酵素をコードするDNA若しくはmRNAと、500bp未満の長さの相同アームを両端に備えた、前記標的ゲノムDNAの野生型DNAの少なくとも一部を有する外来DNAと、を含有する医薬組成物を対象に投与する方法である。
第二実施形態において、本発明の細胞は、その標的ゲノム上、外来DNAのゲノム挿入部位の5’側又は3’側に、外来DNA由来の断片が残存することを特徴とする。上述した第二実施形態のゲノム編集方法によれば、外来DNAの一端がまず非相同組換えによって、二重鎖切断によって生じた標的ゲノムDNAの一端とつながる。そのため、本発明の細胞は、外来DNAのゲノム挿入部位の5’側または3’側に、外来DNA由来の断片をもつ。図4の結果に示されるように、標的ゲノムDNAの5’端で非相同組換えが起きた場合には、外来DNAのゲノム挿入部位の5’側に外来DNA由来の断片を有する。標的ゲノムDNAの3’側で非相同組換えが起きた場合には、外来DNAのゲノム挿入部位の3’側に外来DNA由来の断片を有する。
本発明の細胞製剤は、上述した第二実施形態のゲノム編集方法を用いることにより、例えば、変異を有する標的ゲノムDNAが野生型に編集された細胞を含有する。更に、上記[細胞]で述べたように、本発明の細胞製剤は、その標的ゲノム上、外来DNAのゲノム挿入部位の5’側又は3’側に、外来DNA由来の断片が残存する細胞を含む。
本発明の細胞製剤の製造方法は、重症複合免疫不全症を治療するための細胞製剤の製造方法であって、細胞において、500bp未満の長さの相同アームを有し且つ前記標的ゲノムDNAの野生型DNAの少なくとも一部を有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、少なくとも一方を相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入する方法である。
一実施形態において、植物細胞中のゲノム編集方法であって、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’末端と3’末端における相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入する方法を提供する。
[ドナープラスミドの構築]
Watanabe M et al., PLoS One., 2013 Oct 9;8(10):e76478.に記載されるSCIDモデルピッグ由来造血幹細胞のゲノム上のInterleukin-2 receptor gamma遺伝子(以下、IL2RGともいう。)における5’制御領域からエクソン1途中までの変異(85bp及び1bpの欠損、2bp及び1bpの塩基置換)を修復すべく、ドナープラスミド(HITIターゲティグベクター)を用いてドナープラスミドを作製した。ドナープラスミドの構造を図1に示す。ドナープラスミドは、変異部位を含む155bpの外来DNAに、以下の組合せの相同アームを付加した構造を有する。
(a)5’末端が10bp、3’末端が50bpの相同アーム
(b)5’末端、3’末端ともに50bpの相同アーム
(c)5’末端が50bp、3’末端が10bpの相同アーム
(d)5’末端、3’末端ともに10bpの相同アーム
5’-GGCCCAGGTT-3’(配列番号1)
5’側の50bpの相同アームを含む塩基配列を以下に示す。
5’-CAAAAGGAAATGTGTGGGTGGGGAGGGGTAGTGGGTAAGGGGCCCAGGTT-3’(配列番号2)
5’-cctgacacagtctacacccaggaaacaaggagtaagcgccATGCTCAAACCCCCCCTCCCCGTCAAGTCTCTCCTCTTCCTCCAGCTCCCTCTGCTCGGCGTCGGCCTCAATCCTAAGGTCCTCACCCACAGCGGCAACGAGGACATCACCGCTG-3’(配列番号3)
5’-GTGGGAAACTGGGACGTTGGGGGTAGGGTTGGTGAGCCGGGGGAGGCTGG-3’(配列番号4) 3’側の10bpの相同アームの塩基配列を以下に示す。
5’-GTGGGAAACT-3’(配列番号5)
相同アームの両端に付加するHITI塩基配列を以下に示す。
5’-CCTTCGGGTTCAGTCCCACCCCA-3’(配列番号6)
Cas9タンパク質、配列番号7(5’-UGGGGUGGGACUGAACCCGAGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)に示されるcrRNA、tracrRNA(Alt-R(登録商標) CRISPR-Cas9 tracrRNA、カタログ番号1072534、Integrated DNA Technologies社製)、及び上記ドナープラスミドを、エレクトロポレーションによりIL2RG欠損ピッグ造血幹細胞へ導入した。ピッグ造血幹細胞は、ピッグ骨髄中の各種(CD3、CD16、及びCD45RA)分化マーカー陰性細胞(Lin-)を用いた。
エレクトロポレーションの7日後に細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによる外来DNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図1に示すAとBの組み合わせ、及びCとDの組み合わせを用いた。5’端の相同組換えが起きると、プライマーAとBの組み合わせによるPCRにより335bpのDNAが増幅される。3’端の相同組換えが起きると、プライマーCとDの組み合わせによるPCRにより、197bpのDNAが増幅される。
図2に、増幅されたPCR産物を電気泳動した結果を示す。図2に示されるように、5’末端及び3’末端において、相同組換えが生じたこと示すサイズのバンドのみが認められた。図2中、NHEJ(Non-homologous end joining)は非相同組換えに相当するバンドサイズを示し、HDR (Homology directed repair)は相同組換えに相当するバンドサイズを示す。
TAクローニングしたPCR産物を大腸菌に導入し、形成された各コロニーのシーケンスを行った。
使用した相同アームの組合せは以下の通りである。
(a)5’末端が10bp、3’末端が50bpの相同アーム
(b)5’末端、3’末端ともに50bpの相同アーム
(c)5’末端が50bp、3’末端が10bpの相同アーム
(d)5’末端、3’末端ともに10bpの相同アーム
5’末端では、組み換えが生じた(a)4クローン、(b)8クローン、(c)7クローン、(d)6クローン中、全てのクローンにおいて相同組換えが起きており、3’末端では、組み換えが生じた(a)8クローン、(b)7クローン、(c)8クローン、(d)10クローン中、全てのクローンにおいて相同組換えが起きており、5’末端、3’末端共に極めて高い頻度(100%)で、相同組換えが起きていることが確認された。また、かかる相同組換えにより修復された変異配列は、野生型IL2RGのエクソン1をコードする配列であること(エラーフリーの修復)が確認された。
上記のゲノム修復を行ったIL2RG欠損ピッグ造血幹細胞を、同一個体のIL2RG欠損ピッグへ自家移植した。移植の4週間後、当該個体の末梢血由来の細胞を採取し、相同組換えによってゲノム修復された細胞の有無をPCR解析で確認した。その結果、相同組換えに相当するバンドのみが検出され、非相同組換えに相当するバンドは検出されなかった(図3)。さらに、得られたPCR産物のシーケンス解析を行ったところ、SCIDピッグの遺伝子変異が、相同組換えによりエラーフリーで健常塩基配列に修復されていることが確認された。これは、当該ピッグの遺伝子異常がもっぱらターゲティングベクターの相同組換えによって修復されたことを示す。
[ドナープラスミドの構築]
Watanabe M et al., PLoS One., 2013 Oct 9;8(10):e76478.に記載されるSCIDモデルピッグ由来骨髄間質細胞のゲノム上のIL2RGを修復すべく、図4に示すドナープラスミド(ターゲティグベクター)を作製した。
Cas9タンパク質、配列番号7に示されるcrRNA、tracrRNA、及び上記ドナープラスミドをエレクトロポレーションにより導入した。ピッグ由来骨髄間質細胞は、ピッグ骨髄単核球を液体培養して得られる付着細胞を用いた。
エレクトロポレーション3日後の細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。挿入確認に用いたプライマーは図4に示すAとBの組み合わせ、及びCとDの組み合わせを用いた。プライマーAとBの組み合わせによるPCRでは、非相同組換えが起きると389bpのDNAが増幅される。プライマーCとDの組み合わせによるPCRでは、非相同組換えが起きると399bpのDNAが増幅され、相同組換えが起きると301bpのDNAが増幅される。
図5に、PCR産物を電気泳動した結果を示す。図5に示されるように、5’末端では、非相同組換えに相当するサイズのバンドが、3’末端では、相同組換え及び非相同組換えに相当するサイズのバンドが認められた。図5中、NHEJは非相同組換えに相当するバンドサイズを示し、HDRは相同組換えに相当するバンドサイズを示す。すなわち、ピッグ由来骨髄間質細胞では、外来DNAの5’端では非相同組換え、3’端では相同組換えという片側相同組み換えを生じた。これは、相同アームの短い側の5’端(10bp)では非相同組換えが、相同アームの長い側の3’端(50bp)では相同組換えが生じたことを示す。
TAクローニングしたPCR産物を大腸菌に導入し、形成された各コロニーのシーケンスを行った。5’末端では、5クローン中、全てのクローンにおいて、非相同組換えが起きており、3’末端では、7クローン中、6クローンという高い頻度で、相同組換えが起きていることが確認された。
マウス造血幹細胞ゲノムのRosa26領域、β-Actin (Actb)遺伝子座に、MCS (Multicloning Site)、GFP、blasticidin S deaminase (BSR)遺伝子をノックインすべく、両端10bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端50bpの相同アームを含むドナープラスミド、及び両端100bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。マウス造血幹細胞は、マウス骨髄中の各種(CD5、CD45R、CD11b、Gr-1、7-4、及びTer-119)分化マーカー陰性細胞(Lin-)を用いた。
5’- TGCAACTCCA-3’(配列番号8)
5’-TGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCA-3’(配列番号9)
5’-AATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCA-3’(配列番号10)
5’- ACAGGTGTAA-3’(配列番号11)
5’-ACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGT-3’(配列番号12)
5’-ACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAAGGAAAATGGGAGGATAGGTAGT-3’(配列番号13)
5’-actagttctagcatctgtagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcgcatgcggatccggtaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAgaattc-3’(配列番号14)
5’-CCATCTTCTAGAAAGACTGGAGT-3’(配列番号15)
エレクトロポレーション3日後に細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。図6に示されるように、5’末端及び3’末端で、相同組換えに相当するサイズのバンドだけが認められた。すなわち、マウス造血幹細胞ゲノムのRosa26領域に、GFP遺伝子が相同組換えのみにより挿入された。
マウス受精卵のActb遺伝子座に、GFP遺伝子をノックインすべく、両端100bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。5’側の相同アームの外側(5’端側)に、ストップコドンを備えているため、5’端で相同組換えが生じた場合にGFPが発現する。
5’-GGATCGGTGGCTCCATCCTGGCCTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGATGAGTCCGGCCCCTCCATCGTGCACCGCAA-3’(配列番号17)
5’-GGACTGTTACTGAGCTGCGTTTTACACCCTTTCTTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGAAAAAAAAAAAATAAGAGACAACATTGGCATGGCTTTGTTTTT-3’(配列番号18)
5’-AGTCCGCCTAGAAGCACTTGCGG-3’(配列番号19)
Cas9タンパク質、配列番号20(5’-AGUCCGCCUAGAAGCACUUGGUUUUAGAGCUAUGCU-3’)に示されるcrRNA、tracrRNA、及び上記ドナープラスミドを、マイクロインジェクションによりマウス受精卵に導入した。
マイクロインジェクション6日後に細胞からゲノムDNAを抽出し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。図7Aに示されるように、蛍光顕微鏡で観察すると細胞が緑色蛍光を呈していることから、5’端ではGFP遺伝子が相同組換えによりノックインされていることが確認された。また、図7Bに示されるように、5’末端では相同組換えに相当するサイズのPCRバンドが認められ、3’末端では、非相同組換えに相当するサイズのPCRバンドが認められた。すなわち、マウス受精卵では片側相同組換えによりノックインされた。この結果は、片側相同組換えには、相同アームの長さが両端で必ずしも異なる必要はないことを示す。
ヒトT細胞性白血病細胞(Jurkat細胞)ゲノムのHPRT遺伝子座に、GFP遺伝子をノックインすべく、両端約60bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端約240bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。
5’-GATGAACCAGGTTATGACCTTGATTTATTTTGCATACCTAATCATTATGCTGAGGATTTG-3’(配列番号21)
5’-CCGGCCTGTTGTTTTCTTACATAATTCATTATCATACCTACAAAGTTAACAGTTACTAATATCATCTTACACCTAAATTTCTCTGATAGACTAAGGTTATTTTTTAACATCTTAATCCAATCAAATGTTTGTATCCTGTAATGCTCTCATTGAAACAGCTATATTTCTTTTTCAGATTAGTGATGATGAACCAGGTTATGACCTTGATTTATTTTGCATACCTAATCATTATGCTGAGGATTTG-3’(配列番号22)
5’- GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGGACTAATTATGGACAGGTAAGTAAGATCTTAAAATGAGG-3’(配列番号23)
5’-GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGGACTAATTATGGACAGGTAAGTAAGATCTTAAAATGAGGTTTTTTACTTTTTCTTGTGTTAATTTCAAACATCAGCAGCTGTTCTGAGTACTTGCTATTTGAACATAAACTAGGCCAACTTATTAAATAACTGATGCTTTCTAAAATCTTCTTTATTAAAAATAAAAGAGGAGGGCCTTACTAATTACTTAGTATCAGTTGTGGTATAGTGGGACTC-3’(配列番号24)
5’-gaattcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTtCAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGcGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAcCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGgTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAggatcc-3’(配列番号25)
5’-ACCCTTTCCAAATCCTCAGCATAATG-3’(配列番号26)
エレクトロポレーション3日後に細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。図8に示されるように、5’末端及び3’末端で、相同組換えに相当するサイズのバンドが認められた。すなわち、ヒトT細胞性白血病細胞では、両側相同組換えによるノックインが認められた。当該ノックインがエラーフリーの相同組換えによるものであることは、下記の通りシーケンスによって確認した。
ヒト胎児腎臓細胞株(HEK293T)ゲノムのLMNB1遺伝子座に、GFP遺伝子をノックインすべく、両端101bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。
5’-CGCCGGTTTGTGCCTTCGGTCCCCGCTTCGCCCCCTGCCGTCCCCTCCTTATCACGGTCCCGCTCGCGGCCTCGCCGCCCCGCTGTCTCCGCCGCCCGCCA-3’(配列番号28)
5’-acCCCCGTGCCGCCGCGGATGGGCAGCCGCGCTGGCGGCCCCACCACGCCGCTGAGCCCCACGCGCCTGTCGCGGCTCCAGGAGAAGGAGGAGCTGCGCGA-3’(配列番号29)
5’-gatcTGACAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTtCAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGcGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAcCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGgTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCCGGCTCCGgtac-3’(配列番号30)
5’-GGGGTCGCAGTCGCCATGGCGGG-3’(配列番号31)
5’-CCCGCCATGGCGACTGCGACCCC-3’(配列番号32)
図9Aに示されるように、HITIまたはrcHITIのどちらのガイドRNA認識配列を備える場合においても、相同組換えに相当するバンドのみが認められた。
図9Bに示されるように、リポフェクション4日後にGFP陽性細胞をFACSによりGFP陽性細胞を純化し、更に1週間培養した後、蛍光顕微鏡で観察すると核膜が緑色を呈していることからGFPが核膜に局在していることが確認された。上記ドナープラスミドは、両端相同組換えが起きるとLMNB1遺伝子とGFP遺伝子が融合し、その産物は核膜に局在するように設計されているため、5’末端及び3’末端で相同組換えが起きていることが蛍光画像からも確認された。
また、図9Cに示されるように、リポフェクション後1週間でフローサイトメトリーを用いてGFP発現細胞を定量したところ、HITIまたはrcHITIの塩基配列を付加したドナープラスミドを用いた場合、8.9~9.2%で相同組換えが起きていることが確認された。
ヒト由来骨髄間質細胞のHPRT遺伝子座に、GFP遺伝子をノックインすべく、両端10bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端約60bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端約240bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。
5’- TGAGGATTTG-3’(配列番号34)
5’- GAAAGGGTGT-3’(配列番号35)
Cas9タンパク質と配列番号27に示される認識配列を持つsgRNAを共発現するプラスミド(px330-HPRT)、及び上記ドナープラスミドを、リポフェクションによりヒト由来骨髄間質細胞に導入した。
リポフェクション3日後に細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。図10に示されるように、5’末端及び3’末端で、相同組換えに相当するサイズのバンドが認められた。すなわち、ヒト由来骨髄間質細胞におけるノックインは両側相同組換えであった。
ヒトiPS細胞のHPRT遺伝子座に、GFP遺伝子をノックインすべく、両端10bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端約60bpの相同アームを含むドナープラスミド、両端約240bpの相同アームを含むドナープラスミドを作製した。
実験例1同様、Cas9タンパク質、配列番号36 (5’- UUAUGCUGAGGAUUUGGAAAGUUUUAGAGCUAUGCU -3’)に示されるcrRNA、tracrRNA、及び上記ドナープラスミドをエレクトロポレーションによりヒトiPS細胞に導入した。
エレクトロポレーション4日後に細胞からゲノムDNAを精製し、PCRによるDNA挿入の確認を行った。図11に示されるように、5’末端及び3’末端で、相同組換えに相当するサイズのバンドが認められた。また、シーケンスにより相同組換えであることを確認した。すなわち、ヒトiPS細胞におけるノックインは両側相同組換えであった。
<実験例3>における実験を、ZFNやTALENを用いて行った。両端100bpの相同アームを含むドナープラスミドを用いた。結果を図12に示す。ZFNやTALENを用いた場合にも同様に、5’末端及び3’末端で、相同組換えに相当するサイズ
のバンドが認められた。本発明において、標的ゲノムDNA切断酵素としては、CRISPR/Cas9に限らず、ZFNまたはTALENのいずれを使用してもかまわないことが明らかとなった。
表1に示すように、動物種や標的遺伝子座によらず、相同組換えによるノックインが行われることが確認された。
Claims (15)
- 単離された細胞(但し、ヒト生殖細胞、ヒト生殖系列細胞、ヒト受精卵を除く。)中のゲノム編集方法であって、外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、前記外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を非相同組換えにより、他方を相同組換えにより前記標的ゲノムに導入することを特徴とし、
前記外来DNAは、
5’端と3’端のうち、一方は長さが100bp以下の相同アームを有し、他方の相同アームの長さが一方の相同アームの長さの2倍以上且つ30bp以上であるか、又は、
5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有しないか又は長さが10bp以下の相同アームを有し、他方は長さが50bp以上の相同アームを有する、ゲノム編集方法。 - 前記外来DNAは、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有しないか又は長さが10bp以下の相同アームを有し、他方は長さが50bp以上500bp未満の相同アームを有する、請求項1に記載のゲノム編集方法。
- 前記外来DNAは、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有さず、他方は長さが50bp以上の相同アームを有する、請求項1に記載のゲノム編集方法。
- 前記細胞が、血球系細胞、未分化細胞又は神経細胞である、請求項1~3のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
- 前記細胞が、造血幹細胞である、請求項1~5のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
- 単離された細胞中のゲノム編集方法であって、前記細胞は、血球系細胞又は造血幹細胞であり、500bp未満の長さの相同アームを5’端と3’端に有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、両側を相同組換えにより、標的ゲノムに導入し、
前記相同アームは、HITI塩基配列からなるDNAを両端に付加され、前記相同アームの長さは、10bp以上60bp以下であり、前記細胞は、T細胞又は造血幹細胞である、ゲノム編集方法。 - 5’端と3’端のうち、一方は長さが100bp以下の相同アームを有し、他方の相同アームの長さが一方の相同アームの長さの2倍以上且つ30bp以上である、外来DNA、又は、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有しないか又は長さが10bp以下の相同アームを有し、他方は長さが50bp以上の相同アームを有する、外来DNAを含有することを特徴とし、
標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、前記外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を非相同組換えにより、他方を相同組換えにより前記標的ゲノムに導入するための組成物。 - 前記外来DNAが、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有しないか又は長さが10bp以下の相同アームを有し、他方は長さが50bp以上500bp未満の相同アームを有する、請求項8に記載の組成物。
- 前記外来DNAが、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有さず、他方は長さが50bp以上の相同アームを有する、請求項8に記載の組成物。
- 更に標的ゲノムDNA切断酵素又は前記酵素をコードするDNA若しくはmRNAを含有する、請求項8~10のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬用である、請求項8~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 重症複合免疫不全症治療用である、請求項8~12のいずれか一項に記載の組成物。
- 重症複合免疫不全症を治療するための細胞製剤の製造方法であって、細胞(但し、ヒト生殖細胞、ヒト生殖系列細胞、ヒト受精卵を除く。)において、5’端と3’端のうち、一方は長さが100bp以下の相同アームを有し、他方の相同アームの長さが一方の相同アームの長さの2倍以上且つ30bp以上である、外来DNA、又は、5’端と3’端のうち、一方は相同アームを有しないか又は長さが10bp以下の相同アームを有し、他方は長さが50bp以上の相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、前記外来DNAの5’端と3’端のうち、一方を非相同組換えにより、他方を相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入することを特徴とする細胞製剤の製造方法。
- 重症複合免疫不全症を治療するための細胞製剤の製造方法であって、前記細胞は、血球系細胞又は造血幹細胞であり、細胞において、500bp未満の長さの相同アームを有する外来DNAを、標的ゲノムDNAの二重鎖切断時、外来DNAの5’端と3’端のうち、両側を相同組換えにより、前記細胞のゲノム中に導入し、
前記相同アームは、HITI塩基配列からなるDNAを両端に付加され、前記相同アームの長さは、10bp以上60bp以下であり、前記細胞は、T細胞又は造血幹細胞である、細胞製剤の製造方法。
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