JP2019525759A - Bcl11aホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法 - Google Patents
Bcl11aホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、向上したゲノム編集組成物、およびBCL11A遺伝子を編集するための方法を提供する。本開示は、異常ヘモグロビン症の少なくとも1つの症状を予防、治療、または改善するためのゲノム編集した細胞をさらに提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)に従って、2016年10月28日出願の米国仮出願第62/414,273号、2016年8月16日出願の米国仮出願第62/375,829号、2016年7月27日出願の米国仮出願第62/367,465号、2016年7月25日出願の米国仮出願第62/366,530号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、35U.S.C.§119(e)に従って、2016年10月28日出願の米国仮出願第62/414,273号、2016年8月16日出願の米国仮出願第62/375,829号、2016年7月27日出願の米国仮出願第62/367,465号、2016年7月25日出願の米国仮出願第62/366,530号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する説明
本出願に付随する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、BLBD_071_04WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、141KBであり、2017年7月25日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webを介して電子的に提出される。
本出願に付随する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、BLBD_071_04WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、141KBであり、2017年7月25日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webを介して電子的に提出される。
本開示は、向上したゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、B細胞CLL/リンパ腫11A(BCL11A)遺伝子を編集するための再プログラムされたヌクレアーゼ、組成物、およびその使用方法に関する。
関連技術の記載
異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンの構造および/または合成の変化に起因する単因子遺伝性血液障害の多様な群である。最も一般的な異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症(SCD)、α−サラセミア、およびβ−サラセミアである。世界人口の約5%がグロビン遺伝子変異を保持している。世界保健機構は、毎年300,000人を超える乳児が深刻なヘモグロビン障害を持って生まれている。異常ヘモグロビン症は、軽症の低色素性貧血から、中等症の血液疾患、重症で生涯にわたる多臓器関与型の輸血依存性貧血まで、大きなばらつきのある臨床症状を示す。
異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンの構造および/または合成の変化に起因する単因子遺伝性血液障害の多様な群である。最も一般的な異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症(SCD)、α−サラセミア、およびβ−サラセミアである。世界人口の約5%がグロビン遺伝子変異を保持している。世界保健機構は、毎年300,000人を超える乳児が深刻なヘモグロビン障害を持って生まれている。異常ヘモグロビン症は、軽症の低色素性貧血から、中等症の血液疾患、重症で生涯にわたる多臓器関与型の輸血依存性貧血まで、大きなばらつきのある臨床症状を示す。
異常ヘモグロビン症に対する唯一の根治的である可能性のある治療は、同種造血幹細胞移植である。しかしながら、HLA適合性HSC移植は、罹患者の20%未満にしか利用可能でないと推測されており、また長期毒性が重大である。加えて、HSC移植は、SCDまたは重症のサラセミアを有する対象では高い死亡率および疾病率とも関連付けられている。高い死亡率および疾病率は、なかでも、HSC移植前の輸血関連の鉄過剰、移植片対宿主病(GVHD)、および対象の移植前処置に必要な高用量の化学療法/放射線療法に一部起因する。
異常ヘモグロビン症のための支持療法は、鉄キレート、および場合によっては脾臓摘出術と組み合わせた、生涯にわたる定期的な輸血を含む。SCDのための追加の治療は、鎮痛剤、抗生物質、ACE阻害剤、およびヒドロキシウレアを含む。しかしながら、ヒドロキシウレア治療と関連付けられる副作用は、血球減少、色素沈着過度、体重増加、日和見感染、無精子症、低マグネシウム血症、および癌を含む。
既存の方法で治療された患者は、推定寿命がよくても50〜60年である。
本開示は、概して、ひとつには、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびmegaTALを含む組成物に関する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、ヒトB細胞リンパ腫/白血病11A(BCL11A)遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントを含むポリペプチドを一部企図する。
特定の実施形態において、HEバリアントは、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)バリアントである。
一部の実施形態において、ポリペプチドは、HEバリアントの生物学的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠く。
さらなる実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、4個のN末端アミノ酸を欠く。
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、8個のN末端アミノ酸を欠く。
追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠く。
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、C末端アミノ酸を欠く。
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、2個のC末端アミノ酸を欠く。
一部の実施形態において、HEバリアントは、I−CreIおよびI−SceIからなる群から選択される、LHEのバリアントである。
一部の実施形態において、HEバリアントは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択される、LHEのバリアントである。
さらなる実施形態において、HEバリアントは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択される、LHEのバリアントである。
特定の実施形態において、HEバリアントは、I−OnuI LHEバリアントである。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、DNA認識インターフェースにおける1個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEのアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、DNA認識インターフェースにおける、少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEのアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜19に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の26、28、30、32、34、35、36、37、40、41、42、44、48、50、53、68、70、72、76、78、80、82、138、143、159、178、180、184、186、189、190、191、192、193、195、201、203、207、223、225、227、232、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
さらなる実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、L26R、L26Y、R28S、R28G、R30Q、R30H、N32R、N32S、N32K、N33S、K34D、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、E42R、G44T、G44R、T48I、T48G、T48V、H50R、D53E、V68K、V68R、A70N、A70E、A70N、A70Q、A70L、A70S、S72A、S72T、S72V、S72M、A76L、A76H、A76R、S78Q、K80R、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eのうちの少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72A、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R30Q、N32S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32K、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
追加の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28G、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、H50R、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30H、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72T、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26R、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72TA76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26Y、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68R、A70E、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、S72V、A76R、S78Q、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70Q、S72M、A76R、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70L、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号1〜5に示されるアミノ酸配列I−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48V、V68K、A70S、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号6〜19のいずれか1つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号6に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号7に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号9に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号10に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号11に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号12に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号13に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号14に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号15に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号16に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号17に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号18に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、HEバリアントは、配列番号19に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
一部の実施形態において、ポリペプチドは、DNA結合ドメインをさらに含む。
さらなる実施形態において、DNA結合ドメインは、TALE DNA結合ドメインおよびジンクフィンガーDNA結合ドメインからなる群から選択される。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5のTALE反復単位〜約11.5のTALE反復単位を含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5のTALE反復単位〜約12.5のTALE反復単位を含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5のTALE反復単位〜約13.5のTALE反復単位を含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5のTALE反復単位〜約14.5のTALE反復単位を含む。
特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、BCL11A遺伝子中のポリヌクレオチド配列と結合する。
特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、配列番号26に示されるポリヌクレオチド配列と結合する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号27に示されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
ある特定の実施形態において、ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
一部の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス性自己切断型2Aペプチドおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を有する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号20〜21のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号20に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号21に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号22〜23のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号22に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号23に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ヒトBCL11A遺伝子を、配列番号25または配列番号27に示されるポリヌクレオチド配列において切断する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするmRNAを企図する。
特定の実施形態において、mRNAは、配列番号36〜37のいずれか1つに示される配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするcDNAを企図する。
追加の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。
さらなる実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドを含む細胞を企図する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を企図する。
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるベクターを含む細胞を企図する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入される1つ以上のゲノム修飾を含む細胞を企図する。
ある特定の実施形態において、細胞は造血細胞である。
特定の実施形態において、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
一部の実施形態において、細胞はCD34+細胞である。
特定の実施形態において、細胞はCD133+細胞である。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるゲノム編集した細胞を含む組成物を企図する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるゲノム編集した細胞と生理学的に許容される担体とを含む組成物を企図する。
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出される。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、この破断は、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される。
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとドナー修復鋳型とを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、このドナー修復鋳型は、二本鎖破断(DSB)の部位における相同組換え修復(HDR)によって、BCL11A遺伝子に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、細胞は造血細胞である。
さらなる実施形態において、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
一部の実施形態において、細胞はCD34+細胞である。
特定の実施形態において、細胞はCD133+細胞である。
さらなる実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、mRNAである。
特定の実施形態において、5´−3´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、細胞に導入される。
ある特定の実施形態において、Trex2またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、細胞に導入される。
追加の実施形態において、ドナー修復鋳型は、DSBのBCL11A遺伝子配列5´に相同である5´相同アームと、DSBのBCL11A遺伝子配列3´に相同である3´相同アームとを含む。
一部の実施形態において、5´相同アームおよび3´相同アームの長さは、独立して、約100bp〜約2500bpから選択される。
追加の実施形態において、5´相同アームおよび3´相同アームの長さは、独立して、約600bp〜約1500bpから選択される。
一部の実施形態において、5´相同アームは約1500bpであり、3´相同アームが約1000bpである。
さらなる実施形態において、5´相同アームは約600bpであり、3´相同アームは約600bpである。
一部の実施形態において、ウイルスベクターを使用して、ドナー修復鋳型を細胞に導入する。
追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである。
特定の実施形態において、rAAVは、AAV2由来の1つ以上のITRを有する。
さらなる実施形態において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する。
ある特定の実施形態において、rAAVは、AAV2血清型またはAAV6血清型を有する。
さらなる実施形態において、レトロウイルスはレンチウイルスである。
一部の実施形態において、レンチウイルスはインテグラーゼ欠乏レンチウイルス(IDLV)である。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、異常ヘモグロビン症の少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態において、対象は、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
ある特定の実施形態において、その量の組成物は、対象の輸血を減少させるのに有効である。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、サラセミアの少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
一部の実施形態において、対象は、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
特定の実施形態において、対象は、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
ある特定の実施形態において、対象は、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、鎌状赤血球症の少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態において、対象は、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、対象のγ−グロビンの量を増加させる方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、対象の胎児ヘモグロビン(HbF)の量を増加させる方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態において、対象は、異常ヘモグロビン症を有する。
一部の実施形態において、対象は、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
さらなる実施形態において、対象は、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
特定の実施形態において、対象は、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
ある特定の実施形態において、対象は、鎌状赤血球症、またはそれと関連付けられる状態を有する。
特定の実施形態において、対象は、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
配列識別名の簡単な説明
配列番号1は、野生型I−OnuI LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)のアミノ酸配列である。
配列番号2は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列である。
配列番号3は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号4は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号5は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号6〜19は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するように再プログラムされたI−OnuI LHEバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号20は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号21は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号22は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTAL−Trex2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号23は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTAL−Trex2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号24は、GATA−1モチーフをヒトBCL11A遺伝子のDNA超感受性部位58に含むポリヌクレオチドである。
配列番号25は、ヒトBCL11A遺伝子中のI−OnuI LHEバリアント標的部位である。
配列番号26は、ヒトBCL11A遺伝子中のTALE DNA結合ドメイン標的部位である。
配列番号27は、ヒトBCL11A遺伝子中のmegaTAL標的部位である。
配列番号28は、I−OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号29は、I−OnuI LHEバリアントC末端ドメイン標的部位である。
配列番号30は、I−SmaMI LHE標的部位である。
配列番号31は、ヒトCCR5遺伝子中のI−OnuI LHEバリアント標的部位である。
配列番号32は、ヒトCCR5遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのためのI−OnuI LHEバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号33は、ヒトCCR5遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのための中央4アレイ(central 4 array)についてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号34は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのためのI−OnuI LHEバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号35は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのための中央4アレイについてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号36は、ヒトBCL11A遺伝子を切断するmegaTALをコードするmRNA配列である。
配列番号37は、ヒトBCL11A遺伝子を切断するmegaTAL−Trex2融合物をコードするmRNA配列である。
配列番号38は、マウスTrex2をコードするmRNA配列である。
配列番号39は、マウスTrex2をコードするアミノ酸配列である。
配列番号40〜50は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号51〜75は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、野生型I−OnuI LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)のアミノ酸配列である。
配列番号2は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列である。
配列番号3は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号4は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号5は、野生型I−OnuI LHEのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号6〜19は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するように再プログラムされたI−OnuI LHEバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号20は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号21は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号22は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTAL−Trex2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号23は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するmegaTAL−Trex2融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号24は、GATA−1モチーフをヒトBCL11A遺伝子のDNA超感受性部位58に含むポリヌクレオチドである。
配列番号25は、ヒトBCL11A遺伝子中のI−OnuI LHEバリアント標的部位である。
配列番号26は、ヒトBCL11A遺伝子中のTALE DNA結合ドメイン標的部位である。
配列番号27は、ヒトBCL11A遺伝子中のmegaTAL標的部位である。
配列番号28は、I−OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号29は、I−OnuI LHEバリアントC末端ドメイン標的部位である。
配列番号30は、I−SmaMI LHE標的部位である。
配列番号31は、ヒトCCR5遺伝子中のI−OnuI LHEバリアント標的部位である。
配列番号32は、ヒトCCR5遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのためのI−OnuI LHEバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号33は、ヒトCCR5遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのための中央4アレイ(central 4 array)についてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号34は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのためのI−OnuI LHEバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号35は、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するI−OnuI LHEバリアントのための中央4アレイについてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号36は、ヒトBCL11A遺伝子を切断するmegaTALをコードするmRNA配列である。
配列番号37は、ヒトBCL11A遺伝子を切断するmegaTAL−Trex2融合物をコードするmRNA配列である。
配列番号38は、マウスTrex2をコードするmRNA配列である。
配列番号39は、マウスTrex2をコードするアミノ酸配列である。
配列番号40〜50は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号51〜75は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
前述の配列中、Xは、存在する場合、任意のアミノ酸、またはアミノ酸の不在を指す。
A.概説
本開示は、概して、ひとつには、向上したゲノム編集組成物およびその使用方法に関する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、細胞中の胎児ヘモグロビンの量を増加させて、様々な異常ヘモグロビン症と関連付けられる症状を治療、予防、または改善するために使用される。このため、本明細書で企図される組成物は、根治的である可能性のある解決策を、異常ヘモグロビン症を有する対象に提供する。
本開示は、概して、ひとつには、向上したゲノム編集組成物およびその使用方法に関する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、細胞中の胎児ヘモグロビンの量を増加させて、様々な異常ヘモグロビン症と関連付けられる症状を治療、予防、または改善するために使用される。このため、本明細書で企図される組成物は、根治的である可能性のある解決策を、異常ヘモグロビン症を有する対象に提供する。
正常な成人のヘモグロビンは、2つのアルファ−(α)グロビンタンパク質と2つのベータ−(β−)グロビンタンパク質との四量体複合体を含む。発達過程において、胎児は、2つのβ−グロビンタンパク質の代わりに2つのガンマ−(γ)グロビンタンパク質を含む胎児ヘモグロビン(HbF)を産生する。周産期発生中のある時点で、赤血球が、γ−グロビン発現を下方調節し、β−グロビンを主に産生するように切り替わる、「グロビンスイッチング」が生じる。この切り替えは、主に、γ−グロビン遺伝子の転写の減少およびβ−グロビン遺伝子の転写の増加に起因する。GATA結合タンパク質−1(GATA−1)は、グロビンスイッチングに影響する転写因子である。GATA−1は、β−グロビン遺伝子発現を直接的に転写活性化し、BCL11A発現の転写活性化を通して、γ−グロビン遺伝子発現を間接的に抑圧または抑制する。スイッチングの薬理学的または遺伝子的な操作は、β−グロビン遺伝子中の突然変異に起因するβ−サラセミアまたは鎌状赤血球疾患に罹患した患者にとって魅力的な治療戦略を示す。
様々な実施形態において、赤血球細胞中のBCL11A遺伝子機能および/または発現を撹乱するヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子修飾された細胞、ならびにそれらの使用方法が企図される。赤血球コンパートメント中のBCL11A発現は、コンセンサスGATA−1結合モチーフWGATAA(配列番号24)をBCL11A遺伝子の第2のイントロンに含む赤血球エンハンサーに大きく依存する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、赤血球細胞中のBCL11A発現をGATA−1結合部位のゲノム編集によって低減または排除することで、γ−グロビン遺伝子発現の再活性化または抑圧解除、およびβ−グロビン遺伝子発現の減少が生じ、それによりHbF発現が増加して、異常ヘモグロビン症を有する対象と関連付けられる1つ以上の症状を効果的に治療および/または改善することが企図される。
様々な実施形態において企図されるゲノム編集方法は、B細胞CLL/リンパ腫11A遺伝子(BCL11A)中の転写因子結合部位に結合してそれを切断するように設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における2本鎖破断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチド鋳型、例えば、ドナー修復鋳型の非存在下で非相同末端結合(NHEJ)によって、またはドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復(HDR)、すなわち相同組換えによって、修復され得る。ある特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復鋳型の存在下で細胞の塩基除去修復(BER)機構または相同組換えを用いて修復され得る、1本鎖DNA切断を生成する。NHEJは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用の鋳型として相同DNAを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対する相同性を保持する配列が両側に隣接した、標的部位における所望の配列を含有するドナーDNAの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。
1つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトBCL11A遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALを含む。
DNA破断がBCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー中で生成される、種々の実施形態において、切断されたゲノム配列の両端のNHEJにより、BCL11A発現が減少した細胞、および好ましくは、機能的BCL11A発現が欠如したまたは実質的に欠如した、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制する能力が欠如し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化する能力が欠如した、赤血球細胞が生じ得る。
切断されたBCL11Aゲノム配列の修復用のドナー鋳型が提供される、種々の他の実施形態において、DSBは、DNA破断部位における相同組換えによって鋳型の配列を用いて修復される。好ましい実施形態において、修復鋳型は、標的とするゲノム配列とは異なるポリヌクレオチド配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、NHEJまたはHDR効率を増大させるためにヌクレアーゼバリアントおよび1つ以上の末端プロセシング酵素を含む。
1つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトBCL11A遺伝子および末端プロセシング酵素、例えば、Trex2を標的とする、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALを含む。
様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、赤血球細胞系列中の内在性BCL11A発現が減少している。ゲノム編集された赤血球細胞は、γ−グロビン発現が増加し、β−グロビン発現が減少している。
したがって、本明細書で企図される方法および組成物は、異常ヘモグロビン症の治療のための既存の遺伝子編集戦略と比較して、飛躍的な向上を示す。
特定の実施形態の実践は、特に別段の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で以下に記載される。かかる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)、Maniatisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008)、Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience、Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)、Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)、Annual Review of Immunology、およびAdvances in Immunologyなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
B.定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
冠詞「a」、「an」、および「the」は、その冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つよりも多く(すなわち、少なくとも1つ、または1つ以上)を指すように本明細書で使用される。例として、「(an)要素」は、1つの要素または1つ以上の要素を意味する。
二者択一(例えば、「または」)の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
「および/または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、という用語「約」または「およそ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
一実施形態において、範囲、例えば、1〜5、約1〜5、または約1〜約5は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、1つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「1〜5」は、1、2、3、4、5、または1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0、または1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、もしくは5.0という表現と同等である。
本明細書で使用される、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含むこと(comprising)」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる(consisting of)」とは、何であれ「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。故に、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。故に、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通した種々の箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、1つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件を最小限に変化させた生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約24時間であるが、状況に応じて最大48もしくは72時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、生物の内部で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞ゲノムは、インビボで操作、編集、または修飾される。
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより高い応答(すなわち、生理的応答)を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、γ−グロビン発現の増加、HbF発現の増加、および/または輸血非依存の増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生み出される応答の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれを超える倍率(例えば、500、1000倍)(それらの間の、かつ1を超える全ての整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含む)である増加を含み得る。
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより低い応答(すなわち、生理的応答)を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、内在性β−グロビン、輸血依存、RBC鎌状化などの減少が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、または対照によって生み出される応答(参照応答)の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれを超える倍率(例えば、500、1000倍)(それらの間の、かつ1を超える全ての整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含む)である減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に同様のまたは同等の生理的応答(すなわち、下流作用)を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。同等の応答は、参照応答と有意に異なるまたは測定可能な異なる(measurable different)ことはないものである。
本明細書で使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での1つの分子の、別の分子への結合、例えば、ポリペプチドのDNA結合ドメインの、DNAへの結合を説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約105M−1以上の親和性またはKa(すなわち、1/Mの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数)で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約106M−1、107M−1、108M−1、109M−1、1010M−1、1011M−1、1012M−1、または1013M−1以上のKaで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも107M−1、少なくとも108M−1、少なくとも109M−1、少なくとも1010M−1、少なくとも1011M−1、少なくとも1012M−1、少なくとも1013M−1、またはそれを超えるKaを有する結合ドメインを指す。
代替的に、親和性は、Mの単位での特定の結合相互作用(例えば、10−5M〜10−13M、またはそれ未満)の平衡解離定数(Kd)として定義されてもよい。特定の実施形態で企図されるDNA標的部位に対する1つ以上のDNA結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表層提示を使用して、または結合会合、もしくは標識されたリガンドを使用する置換アッセイによって、容易に決定することができる。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約2倍高い、バックグラウンド結合よりも約5倍高い、バックグラウンド結合よりも約10倍高い、バックグラウンド結合よりも約20倍高い、バックグラウンド結合よりも約50倍高い、バックグラウンド結合よりも約100倍高い、もしくはバックグラウンド結合よりも約1000倍高い、またはそれを超える。
「選択的に結合する」または「選択的に結合した」または「選択的結合性」または「選択的に標的とする」という用語は、および1つの分子が複数の目的標的外(off−target)分子の存在下で標的分子に優先的に結合することを説明する。特定の実施形態において、HEまたはmegaTALは、HEまたはmegaTALが目的標的外DNA標的結合部位に結合する頻度の約5、10、15、20、25、50、100、または1000倍の頻度で、目的標的DNA結合部位に選択的に結合する。
「目的標的(on−target)」は、標的部位配列を指す。
「目的標的外(off−target)」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。
「標的部位」または「標的配列」は、結合および/または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合するおよび/または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。標的部位または標的配列の1本の鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列または配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合および/または切断される標的部位または標的配列は、二本鎖であり、参照配列およびその相補体を含むことが理解される。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトBCL11A遺伝子中の配列である。
「組換え」は、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換えによるドナーキャプチャを含むがこれらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換プロセスを指す。本開示において、「相同組換え(HR)」は、例えば、相同組換え修復(HDR)機構を介した細胞における2本鎖破断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を鋳型として使用して「標的」分子(すなわち、2本鎖破断を経験したもの)を修復し、それがドナーから標的への遺伝情報の伝播につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、かかる伝播は、破損した標的とドナーとの間でのヘテロ2本鎖DNAのミスマッチ補正、および/またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、および/または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なHRはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化をもたらす。
「NHEJ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の非存在下での二本鎖破断の解決を指す。NHEJにより、破断部位に挿入および欠失が生じ得る。NHEJは、いくつかの下位経路によって媒介され、これらの経路の各々は、個別の突然変異結果を有する。古典的NHEJ経路(cNHEJ)は、KU/DNA−PKcs/Lig4/XRCC4複合体を必要とし、最低限の処理によって両端部をライゲーションして元に戻し、多くの場合に破断の正確な修復をもたらす。代替的NHEJ経路(altNHEJ)も、dsDNA破断の解決に活性があるが、これらの経路は、変異原性がはるかに高く、多くの場合に挿入および欠失を特徴とする破断の不正確な修復をもたらす。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Trex2など、末端プロセシング酵素によるdsDNA破断の修飾により、修復がaltNHEJ経路に引き寄せされ得ることが企図される。
「切断」は、DNA分子の共有結合性骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって開始され得る。1本鎖切断および2本鎖切断の両方が可能である。2本鎖切断は、2つの別々の1本鎖切断事象の結果として生じ得る。DNA切断は、平滑末端または段違い末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTALなどは、標的化された二本鎖DNA切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれのDNA鎖にあってもよい。
「外来性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、1つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞に導入される分子である。代表的な外来性分子には、有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの1つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外来性分子を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で知られており、脂質媒介移入(すなわち、中性および陽イオン性脂質を含む、リポソーム)、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、DEAE−デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で細胞内に通常存在するものである。追加の内在性分子には、タンパク質、例えば、内在性グロビンが含まれ得る。
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域、ならびに、調節配列がコードおよび/または転写配列に隣接するか否かに関わらず遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域を指す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、複製起源、基質結合部位、および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造的RNAまたは任意の他の種類のRNA)、またはmRNAの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるRNA、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、DNAまたはRNAの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体または染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム内の特定の部位に標的化されても標的化されなくてもよい。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復させる、補正する、撹乱する、かつ/または修飾する、細胞のゲノム内の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、および/または導入を指す。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位においてまたは標的部位に近接してDNA損傷を生成するために、任意選択でドナー修復鋳型の存在下で、1つ以上のヌクレアーゼバリアントを細胞に導入することを含む。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾する、または治療様ポリペプチドを発現させるための追加の遺伝子物質の細胞中の全遺伝子物質への導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾する、または治療用ポリペプチドを発現させるためのゲノム編集による遺伝子材料の細胞のゲノムへの導入は、遺伝子療法と見なされる。
C.ヌクレアーゼバリアント
BCL11A遺伝子中の標的部位のゲノム編集に好適な、本明細書の特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメイン(例えば、1つ以上のエンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼドメイン)、ならびに任意選択で、本明細書で企図される1つ以上のリンカーを含む。「再プログラムされたヌクレアーゼ」、「操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は、交換可能に使用され、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、BCL11A遺伝子、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)中で二本鎖DNA標的配列に結合し、それを切断するように、親または自然発生ヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。ヌクレアーゼバリアントは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前のヌクレアーゼバリアントから設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
BCL11A遺伝子中の標的部位のゲノム編集に好適な、本明細書の特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメイン(例えば、1つ以上のエンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼドメイン)、ならびに任意選択で、本明細書で企図される1つ以上のリンカーを含む。「再プログラムされたヌクレアーゼ」、「操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は、交換可能に使用され、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、BCL11A遺伝子、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)中で二本鎖DNA標的配列に結合し、それを切断するように、親または自然発生ヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。ヌクレアーゼバリアントは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前のヌクレアーゼバリアントから設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
BCL11A遺伝子中の標的配列に結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの実例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント(メガヌクレアーゼバリアント)およびmegaTALが挙げられるが、これらに限定されない。
1.ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)バリアント
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位に、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)に、二本鎖破断(DSB)を導入するように再プログラムされる。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、12〜45個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて5つのファミリー、すなわちLAGLIDADG、GIY−YIG、HNH、His−Cysボックス、およびPD−(D/E)XKに分類される、自然発生ヌクレアーゼを指す。
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位に、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)に、二本鎖破断(DSB)を導入するように再プログラムされる。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、12〜45個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて5つのファミリー、すなわちLAGLIDADG、GIY−YIG、HNH、His−Cysボックス、およびPD−(D/E)XKに分類される、自然発生ヌクレアーゼを指す。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたは自然界に見い出されるホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を増加させるように修飾されている野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラムされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ホーミングエンドヌクレアーゼは、BCL11A遺伝子中のDNA標的配列に結合し、それを切断するように、親または自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから、または別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから、設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントは、自然界に存在せず、組換えDNA技術によってまたはランダム突然変異誘発によって得ることができる。HEバリアントは、自然発生HEまたはHEバリアントにおいて、1つ以上のアミノ酸改変を作製する、例えば、1つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、HEバリアントは、DNA認識インターフェースに対する1つ以上のアミノ酸改変を含む。
特定の実施形態で企図されるHEバリアントは、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、HEバリアントは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素と共に、T細胞に導入される。HEバリアントおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「DNA認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するHEアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各HEに関して、DNA認識インターフェースは、側鎖−側鎖間および側鎖−DNA接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。故に、特定の核酸配列に対応するDNA認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の天然HEまたはHEバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図されるHEバリアントは、天然HE(または以前に生成されたHEバリアント)のDNA認識インターフェースに局在する1つ以上のアミノ酸残基が変化している、HEバリアントのライブラリを構築することによってもたらされてもよい。ライブラリは、切断アッセイを用いて、各々予測されるBCL11A標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい(例えば、Jarjour et al.,2009.Nuc.Acids Res.37(20):6871−6880を参照されたい)。
LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラDNAにおいてコードされ、最も高い全体的なDNA認識特異性を示す。LHEは、タンパク質鎖1つあたり1つまたは2つのLAGLIDADG触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または1本鎖単量体として機能する。LAGLIDADGタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みを特徴とする、高度に保存されたコア構造が特定され(Stoddard 2005)、このうちLAGLIDADGモチーフは、この折り畳みの第1のヘリックスに属する。LHEによる高度に効率的かつ特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようLHEを遺伝子操作することは、適切なLHE足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大3分の2でのそのDNA接触点および切断特異性を改変するためのLHEの大規模な改変を必要とする。
一実施形態において、再プログラムされたLHEまたはLHEバリアントが設計される元となり得るLHEとしては、I−CreIおよびI−SceIが挙げられるが、これらに限定されない。
再プログラムされたLHEまたはLHEバリアントが設計される元となり得るLHEの実例としては、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、再プログラムされたLHEまたはLHEバリアントは、I−CpaMIバリアント、I−HjeMIバリアント、I−OnuIバリアント、I−PanMIバリアント、およびI−SmaMIバリアントからなる群から選択される。
一実施形態において、再プログラムされたLHEまたはLHEバリアントはI−OnuIバリアントである。例えば、配列番号6〜19を参照されたい。
一実施形態において、BCL11A遺伝子を標的とする再プログラムされたI−OnuI LHEまたはI−OnuIバリアントは、天然のI−OnuIまたはその生物学的に活性な断片(配列番号1〜5)から生成された。好ましい実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子を標的とする再プログラムされたI−OnuI LHEまたはI−OnuIバリアントは、既存のI−OnuIバリアントから生成された。一実施形態において、再プログラムされたI−OnuI LHEは、配列番号25に示されるヒトBCL11A遺伝子標的部位に対して生成された。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断する再プログラムされたI−OnuI LHEまたはI−OnuIバリアントは、1個以上のアミノ酸置換をDNA認識インターフェースに含む。特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEは、I−OnuI(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)もしくは配列番号6〜19に示されるI−OnuI LHEバリアントまたはそのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースとの少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。
一実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEは、I−OnuI(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)もしくは配列番号6〜19に示されるI−OnuI LHEバリアントまたはそのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースとの少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、1個以上のアミノ酸置換または修飾を、配列番号1〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIのDNA認識インターフェースに含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、1個以上のアミノ酸置換または修飾を、I−OnuI(配列番号1〜5)、配列番号6〜19に示されるI−OnuIバリアント、またはそのさらなるバリアントのDNA認識インターフェース、特に、24位〜50位、68位〜82位、180位〜203位、および223位〜240位に位置するサブドメインに含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEは、DNA認識インターフェースにおける1個以上のアミノ酸置換または修飾を、 I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19に示されるI−OnuIバリアントまたはそのさらなるバリアントの19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEは、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、もしくは40個、またはそれ以上のアミノ酸置換または修飾を、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19に示されるI−OnuIバリアントまたはそのさらなるバリアントのDNA認識インターフェース、特に、24位〜50位、68位〜82位、180位〜203位、および223位〜240位に位置するサブドメインに含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、DNA認識インターフェースにおける5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、もしくは40個、またはそれ以上のアミノ酸置換または修飾を、I−OnuI配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19に示されるI−OnuIバリアントまたはそのさらなるバリアントの19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
一実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、1個以上のアミノ酸置換または修飾を、I−OnuI配列全体のどこにでも位置する追加の位置に含む。置換されかつ/または修飾され得る残基としては、核酸標的に接触する、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。1つの非限定的な例において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断する本明細書で企図されるI−OnuI LHEバリアントは、1個以上の置換および/または修飾、好ましくは少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも30個、さらにより好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個を、配列番号1〜19のいずれか1つに関して、26、28、30、32、34、35、36、37、40、41、42、44、68、70、72、76、78、80、82、138、143、159、178、180、184、186、189、190、191、192、193、195、201、203、207、223、225、227、232、236、238、および240からなる位置群から選択される少なくとも1個の位置に含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも40個、またはそれ以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜19に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の26、28、30、32、34、35、36、37、40、41、42、44、48、50、53、68、70、72、76、78、80、82、138、143、159、178、180、184、186、189、190、191、192、193、195、201、203、207、223、225、227、232、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
さらなる実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、L26R、L26Y、R28S、R28G、R30Q、R30H、N32R、N32S、N32K、N33S、K34D、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、E42R、G44T、G44R、T48I、T48G、T48V、H50R、D53E、V68K、V68R、A70N、A70E、A70N、A70Q、A70L、A70S、S72A、S72T、S72V、S72M、A76L、A76H、A76R、S78Q、K80R、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eのうちの少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも40個、またはそれ以上を含む。
ある特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72A、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
一部の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R30Q、N32S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32K、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
追加の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28G、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、H50R、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30H、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72T、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26R、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72TA76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26Y、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68R、A70E、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
一部の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、S72V、A76R、S78Q、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
ある特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70Q、S72M、A76R、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70L、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、I−OnuI(配列番号1〜5)もしくは配列番号6〜19のいずれか1つに示されるI−OnuIバリアント、その生物学的に活性な断片、および/またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48V、V68K、A70S、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む。
特定の実施形態において、ヒトBCL11A遺伝子に結合しそれを切断するI−OnuI LHEバリアントは、配列番号6〜19のいずれか1つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号6〜19のいずれか1つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号6に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号7に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号9に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号10に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号11に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号12に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号13に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号14に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号15に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号16に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号17に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号18に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号19に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
2.MegaTAL
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むmegaTALは、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位に、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)に、二本鎖破断(DSB)を導入するように再プログラムされる。「megaTAL」は、TALE DNA結合ドメインとBCL11A遺伝子中でDNA標的配列に結合しそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意選択で、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むmegaTALは、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位に、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)に、二本鎖破断(DSB)を導入するように再プログラムされる。「megaTAL」は、TALE DNA結合ドメインとBCL11A遺伝子中でDNA標的配列に結合しそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意選択で、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。
特定の実施形態において、megaTALは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素と共に、細胞に導入され得る。megaTALおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「TALE DNA結合ドメイン」は、植物のトランスクリプトームを操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター(TALEまたはTAL−エフェクター)のDNA結合部分である(例えば、Kay et al.,2007.Science 318:648−651を参照されたい)。特定の実施形態で企図されるTALE DNA結合ドメインは、デノボで、または自然発生TALE、例えば、Xanthomonas campestris pv.vesicatoria、Xanthomonas gardneri、Xanthomonas translucens、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas perforans、Xanthomonas alfalfa、Xanthomonas citri、Xanthomonas euvesicatoria、およびXanthomonas oryzae由来のAvrBs3から、ならびにRalstonia solanacearum由来のbrg11およびhpx17から、遺伝子操作される。DNA結合ドメインを誘導し、設計するためのTALEタンパク質の例示的な例は、米国特許第9,017,967号、および同特許で引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、megaTALは、TALE DNA結合ドメインの、その対応する標的DNA配列への結合に関与する1つ以上の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。単一の「反復単位」(「反復」とも称される)は、典型的に33〜35アミノ酸長である。各TALE DNA結合ドメイン反復単位は、典型的に反復の12位および/または13位に、反復可変Di−残基(Repeat Variable Di−Residue)(RVD)を構成する1つまたは2つのDNA結合残基を含む。これらのTALE DNA結合ドメインのDNA認識のための天然(標準的)コードは、12位および13位のHD配列がシトシン(C)への結合をもたらし、NGがTに結合し、NIがAに、NNがGまたはAに結合し、NGがTに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態においては、非標準的(非典型)RVDが企図される。
特定の実施形態で企図される特定のmegaTALにおいて使用するのに好適な非標準的RVDの例示的な例としては、グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN;アデニン(A)の認識のためのNI、KI、RI、HI、SI;チミン(T)の認識のためのNG、HG、KG、RG;シトシン(C)の認識のためのRD、SD、HD、ND、KD、YG;AまたはGの認識のためのNV、HN;およびAまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*[(*)は、13位のアミノ酸が不在であることを意味する]が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のmegaTALにおいて使用するのに好適なRVDの追加の例示的な例としては、米国特許第8,614,092号に開示されるものがさらに挙げられ、同特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3〜30個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、megaTALは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、5〜15個の反復単位、より好ましくは7〜15個の反復単位、より好ましくは9〜15個の反復単位、およびより好ましくは9、10、11、12、13、14、または15個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3〜30個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインと、1組のTALE反復単位のC末端に位置する20個のアミノ酸を含む追加の単一の切頭型TALE反復単位、すなわち、追加のC末端ハーフTALE DNA結合ドメイン反復単位(本明細書の他の箇所で開示される(下記を参照)Cキャップのアミノ酸−20〜−1)とを含む。故に、特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3.5〜30.5個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、megaTALは、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5個のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、5.5〜15.5個の反復単位、より好ましくは7.5〜15.5個の反復単位、より好ましくは9.5〜15.5個の反復単位、およびより好ましくは9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、または15.5個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、megaTALは、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドと、1つ以上のTALE反復ドメイン/単位と、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むTALエフェクター構造を含む。一部の実施形態において、NTD、TALE反復、および/またはCTDドメインは、同じ種に由来する。他の実施形態において、NTD、TALE反復、および/またはCTDドメインのうちの1つ以上は、異なる種に由来する。
本明細書で使用されるとき、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドという用語は、自然発生TALE DNA結合ドメインのN末端部分または断片に隣接する配列を指す。NTD配列は、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン反復単位がDNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも120個〜少なくとも140個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む(0は、最もN末端側の反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、または少なくとも140個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Xanthomonas TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約+1〜+122から少なくとも約+1〜+137のNTDポリペプチドを含む(0は、最もN末端側の反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Ralstonia TALEタンパク質の少なくともアミノ酸+1〜+121のNTDポリペプチドを含む(0は、最もN末端側の反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137個のアミノ酸を含む。
本明細書で使用されるとき、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドという用語は、自然発生TALE DNA結合ドメインのC末端部分または断片に隣接する配列を指す。CTD配列は、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン反復単位がDNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対してC末端側に少なくとも20〜少なくとも85またはそれよりも多くのアミノ酸を含む(最初の20個のアミノ酸は、最後のC末端完全反復単位に対してC末端側のハーフ反復単位である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対してC末端側に少なくとも約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、443、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、または少なくとも85アミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Xanthomonas TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約−20〜−1のCTDポリペプチドを含む(−20は、最後のC末端完全反復単位に対してC末端側のハーフ反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対してC末端側に少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Ralstonia TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約−20〜−1のCTDポリペプチドを含む(−20は、最後のC末端完全反復単位に対してC末端側のハーフ反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対してC末端側に少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたTALE DNA結合ドメインと、標的配列に結合し、それを切断するように再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意選択で、本明細書の他の箇所で企図される1つ以上のリンカーポリペプチドと任意選択で互いに接合されたNTDおよび/またはCTDポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを含む。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、TALE DNA結合ドメインと、任意選択でNTDおよび/またはCTDポリペプチドとを含むmegaTALは、リンカーポリペプチドに融合され、これがホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されることが、企図される。故に、TALE DNA結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのDNA結合ドメインが結合した標的配列から約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド以内離れているDNA標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるmegaTALは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
一実施形態において、megaTALは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約4、5、または6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチド上流の内にあるヌクレオチド配列に結合するTALE DNA結合ドメインとを含む。
一実施形態において、megaTALは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントによって結合および切断されるヌクレオチド配列(配列番号25)の6ヌクレオチド上流である、配列番号26に示されるヌクレオチド配列に結合するTALE DNA結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、megaTAL標的配列は配列番号27である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、1つ以上のTALE DNA結合反復単位と、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、I−Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはI−OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択される、LHEから設計または再プログラムされたLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、NTDと、1つ以上のTALE DNA結合反復単位と、CTDと、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、I−Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはI−OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択されるLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、NTDと、約9.5〜約15.5のTALE DNA結合反復単位と、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、I−Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはI−OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択されるLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、約122個のアミノ酸〜137個のアミノ酸のNTDと、約9.5、約10.5、約11.5、約12.5、約13.5、約14.5、または約15.5の結合反復単位と、約20個のアミノ酸〜約85個のアミノ酸のCTDと、I−OnuI LHEバリアントとを含む。特定の実施形態において、NTD、DNA結合ドメイン、およびCTDのうちのいずれか1つ、いずれか2つ、または全てを、同じ種または異なる種から好適な組み合わせで設計することができる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、配列番号20または21のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTAL−Trex2融合タンパク質は、配列番号22または23に示されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、megaTALは、TALE DNA結合ドメインを含み、I−OnuI LHEバリアントは、配列番号27に示されるヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
3.末端プロセシング酵素
特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一ポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、2A配列によって、またはIRES配列によって分離される、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、末端プロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一ポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、2A配列によって、またはIRES配列によって分離される、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、末端プロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。
「末端プロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の露出した末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA)、RNA、DNAおよびRNAの二本鎖ハイブリッド、ならびに合成DNA(例えば、A、C、G、およびT以外の塩基を含むもの)であってもよい。末端プロセシング酵素は、露出したポリヌクレオチド鎖末端を、1つ以上のヌクレオチドの付加、1つ以上のヌクレオチドの除去、リン酸基の除去もしくは修飾、および/またはヒドロキシル基の除去もしくは修飾によって修飾してもよい。末端プロセシング酵素は、末端を、エンドヌクレアーゼ切断部位で、または剪断(例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧)、電離放射、紫外線放射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤などの他の化学的もしくは機械的手段によって生成された末端で、修飾してもよい。
特定の実施形態において、特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、およびDNA末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。
「DNA末端プロセシング酵素」という用語は、DNAの露出した末端を修飾する酵素を指す。DNA末端プロセシング酵素は、平滑末端または粘着末端(5´または3´突出を有する末端)を修飾してもよい。DNA末端プロセシング酵素は、一本鎖または二本鎖DNAを修飾してもよい。DNA末端プロセシング酵素は、末端を、エンドヌクレアーゼ切断部位で、または剪断(例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧)、電離放射、紫外線放射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤などの他の化学的もしくは機械的手段によって生成された末端で、修飾してもよい。DNA末端プロセシング酵素は、露出したDNA末端を、1つ以上のヌクレオチドの付加、1つ以上のヌクレオチドの除去、リン酸基の除去もしくは修飾、および/またはヒドロキシル基の除去もしくは修飾によって修飾してもよい。
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なDNA末端プロセシング酵素としては、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、および鋳型非依存性DNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なDNA末端プロセシング酵素のさらなる実例としては、Trex2、Trex1、膜貫通ドメインを有しないTrex1、Apollo、Artemis、DNA2、Exo1、ExoT、ExoIII、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Sox、ワクシニアDNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7−エキソヌクレアーゼ遺伝子6、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス統合タンパク質(IN)、Bloom、アンタルチカ(Antartic)ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)、ApeI、マングビーンヌクレアーゼ、Hex1、TTRAP(TDP2)、Sgs1、Sae2、CUP、Polミュー、Polラムダ、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4、およびUL−12が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書で企図される細胞を編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALおよびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、3´末端または5´末端のいずれかでホスホジエステル結合を破断する加水分解反応によって、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なエキソヌクレアーゼの実例としては、hExoI、酵母ExoI、E.coli ExoI、hTREX2、マウスTREX2、ラットTREX2、hTREX1、マウスTREX1、ラットTREX1、およびラットTREX1が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、DNA末端プロセシング酵素は、3´または5´エキソヌクレアーゼ、好ましくはTrex1またはTrex2、より好ましくはTrex2、さらにより好ましくはヒトまたはマウスTrex2である。
D.標的部位
特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計することができ、自然発生ヌクレアーゼと比較して新規の結合特性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー要素等を含むがこれらに限定されない、遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節するかまたは減少させる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失させるように設計され得る。
特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計することができ、自然発生ヌクレアーゼと比較して新規の結合特性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー要素等を含むがこれらに限定されない、遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節するかまたは減少させる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失させるように設計され得る。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、B細胞CLL/リンパ腫11A(BCL11A)遺伝子中の標的配列に結合し、それを切断する。BCL11A遺伝子は、マウスBcl11a/Evi9タンパク質に類似したC2H2型ジンクフィンガー転写因子をコードする。BCL11Aは、グロビン遺伝子発現の調節に役割を果たす転写リプレッサーである。胎児発達において、BCL11Aの全長形態は発現されず、赤血球細胞は、α−グロビンと複合体化して胎児ヘモグロビン(HbF)を形成するγ−グロビンを産生する。出生周辺期に、BCL11A発現は、赤血球細胞中で増加し、γ−グロビンプロモーター中の転写要素に結合し、増加したβ−グロビン発現と関連付けられるγ−グロビン発現を抑制または抑圧する。γ−グロビンを犠牲にしたβ−グロビン発現の増加により、HbFからHbAへの(2つのβ−グロビン/2つのα−グロビン)「グロビンスイッチング」が生じる。しかしながら、異常ヘモグロビン症をもたらすβ−グロビン遺伝子中の1つ以上の突然変異を有する対象において、変異したβ−グロビン遺伝子発現を犠牲にしてγ−グロビン遺伝子発現のスイッチをオンにすることで、異常ヘモグロビン症が治療される可能性がある。1つの解決策は、BCL11A発現を減少させて、γ−グロビン遺伝子発現の抑圧解除を行い、変異したβ−グロビン遺伝子発現を減少させることである。
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALは、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位に、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)に、二本鎖破断(DSB)を導入する。特定の実施形態において、再プログラムされたヌクレアーゼまたはmegaTALは、コンセンサスGATA−1結合モチーフ(WGATAA)に相補的な鎖上の「TTAT」配列を切断することによって、BCL11A遺伝子の第2のイントロン中のGATA−1部位に二本鎖破断を導入する、I−OnuI LHEバリアントを含む。
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALは、二本鎖DNAを切断し、DSBを配列番号25または27に示されるポリヌクレオチド配列に導入する。
好ましい実施形態において、BCL11A遺伝子はヒトBCL11A遺伝子である。
E.ドナー修復鋳型
核酸バリアントを使用して、DSBを標的配列に導入してもよい。DSBは、1つ以上のドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復(HDR)機構を通して修復され得る。特定の実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、配列をゲノムに挿入する。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、ゲノム中のゲノム配列を欠失させるかまたは修復する。
核酸バリアントを使用して、DSBを標的配列に導入してもよい。DSBは、1つ以上のドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復(HDR)機構を通して修復され得る。特定の実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、配列をゲノムに挿入する。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、ゲノム中のゲノム配列を欠失させるかまたは修復する。
様々な実施形態において、ドナー修復鋳型を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、IDLVなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターを用いて、細胞を形質導入することによって、ドナー修復鋳型を、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に導入する。
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、DSB部位と隣接する1つ以上の相同アームを含む。
本明細書で使用されるとき、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるDNA破断と隣接するDNA配列と同一またはほぼ同一であるドナー修復鋳型中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、DNA破断部位のDNA配列5’と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む5’相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、DNA破断部位のDNA配列3’と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む3’相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型は、5’相同アームおよび3’相同アームを含む。ドナー修復鋳型は、DSB部位と直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはDSB部位から任意の塩基対数内のゲノム配列に対する相同性を含んでもよい。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、相同配列の任意の介在する長さを含む、約5bp、約10bp、約25bp、約50bp、約100bp、約250bp、約500bp、約1000bp、約2500bp、約5000bp、約10000bp、またはそれ以上、ゲノム配列と相同である核酸配列を含む。
特定の実施形態で企図される相同アームの好適な長さの実例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約100bp、約200bp、約300bp、約400bp、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約1100bp、約1200bp、約1300bp、約1400bp、約1500bp、約1600bp、約1700bp、約1800bp、約1900bp、約2000bp、約2100bp、約2200bp、約2300bp、約2400bp、約2500bp、約2600bp、約2700bp、約2800bp、約2900bp、または約3000bp、またはそれより長い相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な相同アーム長さの追加の実例としては、相同アームの全ての介在する長さを含む、約100bp〜約3000bp、約200bp〜約3000bp、約300bp〜約3000bp、約400bp〜約3000bp、約500bp〜約3000bp、約500bp〜約2500bp、約500bp〜約2000bp、約750bp〜約2000bp、約750bp〜約1500bp、または約1000bp〜約1500bpが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、5’および3’相同アームの長さは、独立して、約500bp〜約1500bpから選択される。一実施形態において、5’相同アームは約1500bpであり、3’相同アームは約1000bpである。一実施形態において、5´相同アームは約200bp〜約600bpであり、3´相同アームは約200bp〜約600bpである。一実施形態において、5´相同アームは約200bpであり、3´相同アームは約200bpである。一実施形態において、5´相同アームは約300bpであり、3´相同アームは約300bpである。一実施形態において、5´相同アームは約400bpであり、3´相同アームは約400bpである。一実施形態において、5´相同アームは約500bpであり、3´相同アームは約500bpである。一実施形態において、5´相同アームは約600bpであり、3´相同アームは約600bpである。
F.ポリペプチド
様々なポリペプチドが本明細書で企図され、これらのポリペプチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および融合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1〜23および39に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換えおよび/または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生および非自然発生両方の当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
様々なポリペプチドが本明細書で企図され、これらのポリペプチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および融合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1〜23および39に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換えおよび/または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生および非自然発生両方の当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
「単離タンパク質」、「単離ペプチド」、または「単離ポリペプチド」などは、本明細書で使用されるとき、細胞環境からの、および本細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロの合成、単離、および/または精製を指し、すなわち、これは、インビボ物質とは著しく関係していない。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドの実例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、末端プロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドは「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および/または挿入において自然発生ポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、天然であってもよく、あるいは例えば上述のポリペプチド配列の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって、合成によって生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、1つ以上の置換、欠失、付加、および/または挿入をポリペプチドに導入することによって、ヒトBCL11A遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、megaTAL、または同様のものの生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、ここでは、バリアントは参照配列の少なくとも1つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の実例としては、DNA結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、自然発生ポリペプチド活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、少なくとも20%、少なくとも10%、または少なくとも5%を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および/または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも5〜約1700アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に示されるポリペプチドは、「X」と示されるアミノ酸を1個以上含んでもよい。「X」は、アミノ酸配列番号中に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。1個以上の「X」残基は、本明細書で企図される特定の配列番号に示されるアミノ酸配列のN末端およびC末端に存在し得る。「X」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に示される残りのアミノ酸配列が、生物学的に活性な断片とみなされ得る。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片、例えば、配列番号3〜19、またはmegaTAL(配列番号20〜21)を含む。生物学的に活性な断片は、N末端切断短縮および/またはC末端切断短縮を含んでもよい。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの4個のN末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの2個のC末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含む。特定の好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの4個のN末端アミノ酸および2個のC末端アミノ酸の欠失を欠くかまたはそれらの欠失を含む。
特定の実施形態において、I−OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の以下のN末端アミノ酸の欠失:M、A、Y、M、S、R、R、E、および/または以下の1、2、3、4、もしくは5個のC末端アミノ酸の欠失:R、G、S、F、Vを含む。
特定の実施形態において、I−OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の以下のN末端アミノ酸の欠失もしくは置換:M、A、Y、M、S、R、R、E、および/または以下の1、2、3、4、もしくは5個のC末端アミノ酸の欠失もしくは置換:R、G、S、F、Vを含む。
特定の実施形態において、I−OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の以下のN末端アミノ酸の欠失:M、A、Y、M、S、R、R、E、および/または以下の1もしくは2個のC末端アミノ酸の欠失:F、Vを含む。
特定の実施形態において、I−OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の以下のN末端アミノ酸の欠失もしくは置換:M、A、Y、M、S、R、R、E、および/または以下の1もしくは2個のC末端アミノ酸の欠失もしくは置換:F、Vを含む。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む様々な方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、一般に当該技術分野で既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、DNAにおける変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列改変は、当該技術分野で公知である。例えば、Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488−492)、Kunkelら(1987,Methods in Enzymol,154:367−382)、米国特許第4,873,192号、Watson,J.D.ら(Molecular Biology of the Gene,Fourth Edition,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)、およびそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)のモデルにおいて見出され得る。
ある特定の実施形態において、バリアントは、1つ以上の保存的置換を含有することになる。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等のまたはさらに改良されたバリアントポリペプチドを作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが望ましいとき、当業者は、例えば、表1に従って、例えば、コードするDNA配列のコドンのうちの1つ以上を変化させることができる。
どのアミノ酸残基が、生物学的活性を無効にすることなく置換、挿入、または欠失され得るかを決定するための指針は、DNASTAR、DNA Strider、Geneious、Mac Vector、またはVector NTIソフトウェアなどの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの1つの置換を伴う。自然発生アミノ酸は、一般に、酸性(アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸という4つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときに芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく行われ得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する(例えば、Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224を参照されたい)。
一実施形態において、2個以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で開示するIRES配列によって分離することができる。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態において、2個以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される、1個以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、1個以上のDNA結合ドメインおよび1個以上のヌクレアーゼ、ならびに1個以上のリンカーおよび/または自己切断型ポリペプチドを含む。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント;リンカーまたは自己切断型ペプチド;ならびに5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、および3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)を含むがこれらに限定されない末端プロセシング酵素を含む。
融合ポリペプチドは、1つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン(CPP)、DNA結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ(例えば、マルトース結合タンパク質(「MBP」)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV−G、およびHA)、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。融合ポリペプチドは、C末端からC末端、N末端からN末端、またはN末端からC末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的に、C末端からN末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限りは、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または2つの部分間の化学結合によって産生することができるか、または一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたDNA配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
融合ポリペプチドは、任意選択で、1つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確保するのに十分な距離により、任意の2つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子:(1)可撓性延長配座をとることができないこと、(2)第1のおよび第2のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造とることができないこと、ならびに(3)ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基を欠くこと、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn、およびSer残基を含む。ThrおよびAlaなどの他の近い中性アミノ酸はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Maratea et al.,Gene 40:39−46,1985、Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258−8262,1986、米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用することができる非必須N末端アミノ酸領域を含むときには、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的に、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、1〜200アミノ酸長、1〜100アミノ酸長、または1〜50アミノ酸長であり得、これはその間の全ての整数値を含む。
例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列:グリシンポリマー(G)n、グリシン−セリンポリマー(G1−5S1−5)n(式中、nは、少なくとも1、2、3、4、または5の整数である)、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、GGG(配列番号40)、DGGGS(配列番号41)、TGEKP(配列番号42)(例えば、Liu et al.,PNAS 5525−5530(1997)を参照されたい)、GGRR(配列番号43)(Pomerantz et al.1995、上記を参照)、(GGGGS)n(式中、nは、1、2、3、4、または5である)(配列番号44)(Kim et al.,PNAS 93,1156−1160(1996)、EGKSSGSGSESKVD(配列番号45)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066−1070)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号46)(Bird et al.,1988,Science 242:423−426)、GGRRGGGS(配列番号47)、LRQRDGERP(配列番号48)、LRQKDGGGSERP(配列番号49)、LRQKD(GGGS)2ERP(配列番号50)が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、可撓性リンカーは、DNA結合部位とペプチド自体との両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラム(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256−2260(1993)、PNAS 91:11099−11103(1994)を使用して、またはファージディスプレイ方法によって、合理的に設計することができる。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。加えて、ポリペプチド切断部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位)、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる(deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8);616−26を参照されたい)。
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に既知である(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699−722、Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589−594を参照されたい)。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、ポチウイルスNIaプロテアーゼ(例えば、タバコetchウイルスプロテアーゼ)、ポチウイルスHCプロテアーゼ、ポチウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)NIaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA−2コードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(イネツングロスフェリカルウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Xa因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、TEV(タバコetchウイルス)プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号51)、例えば、ENLYFQG(配列番号52)およびENLYFQS(配列番号53)(式中、Xは、任意のアミノ酸を表す)(TEVによる切断は、QとGまたはQとSとの間に生じる)が好ましい。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、2Aまたは2A様部位、配列またはドメインを含む(Donnelly et al.,2001.J.Gen.Virol.82:1027−1041)。特定の実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、アフトウイルス2Aペプチド、ポチウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
一実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2Aペプチド、ゾーシーアシグナウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテッショウウイルス−1(PTV−1)2Aペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、および脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
2A部位の実例を表2に提供する。
G.ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、末端プロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、かつ組換え、合成、または単離されたもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーRNA(プレ−mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短干渉RNA(siRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(−))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000またはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、6、7、8、9などの、101、102、103などの、151、152、153などの、201、202、203などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、末端プロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、かつ組換え、合成、または単離されたもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーRNA(プレ−mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短干渉RNA(siRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(−))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000またはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、6、7、8、9などの、101、102、103などの、151、152、153などの、201、202、203などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。本明細書で使用されるとき、「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性、および/または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響する因子としては、(i)2つ以上の生物、もしくは遺伝子、もしくは合成によって構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変化、(ii)生物、遺伝子、もしくは遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変化、(iii)コンテクストを含むコドンの体型的変化、(iv)コドンの解読tRNAに従うコドンの変化、(v)トリプレットの全体または1つの位置のいずれかにおけるGC%に従うコドンの変化、(vi)参照配列、例えば、自然発生配列に対する類似性の程度の変化、(vii)コドン頻度カットオフの変化、(viii)DNA配列から転写されたmRNAの構造的特性、(ix)コドン置換セットの設計の基になるDNA配列の機能についての予備知識、および/または(x)各アミノ酸に対するコドンセットの体系的変化、および/または(xi)疑似翻訳開始部位の単離された除去のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、リン酸化された糖とのN−グリコシド連結における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および多種多様な当該技術分野で認識されている修飾された塩基を含むことが理解される。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の1´位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸(RNA)中、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸(DNA)中、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基が欠如した糖である。例示的な天然窒素塩基としては、プリン、アデノシン(A)、およびグアニジン(G)、ならびにピリミジン、シチジン(C)、およびチミジン(T)(またはRNAの背景ではウラシル(U))が挙げられる。デオキシリボースのC−1原子は、ピリミジンのN−1またはプリンのN−9に結合される。ヌクレオチドは、通常、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩である。ヌクレオチドは、修飾されていなくてもよく、あるいは糖、リン酸、および/または塩基部分で修飾されていてもよい(交換可能に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、WO92/07065およびWO93/15187を参照されたい)。修飾された核酸塩基の例は、Limbach et al.,(1994,Nucleic Acids Res.22,2183−2196)によって概説されている。
ヌクレオチドは、エステル化が糖のC−5に付着したヒドロキシル基上で生じる、ヌクレオシドのリン酸エステルとも見なされ得る。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」は、糖とのN−グリコシド連結における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、天然塩基を含むこと、および周知の修飾された塩基も含むことが当該技術分野では認識されている。かかる塩基は、一般に、ヌクレオシド糖部分の1´位に位置する。ヌクレオシドは、一般に、塩基、糖、および糖類を含む。ヌクレオシドは、修飾されていなくてもよく、あるいは糖および/または塩基部分で修飾されていてもよい(交換可能に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾されたヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、および非標準ヌクレオシドとも称される)。上にも記載したように、修飾された核酸塩基の例は、Limbach et al.,(1994,Nucleic Acids Res.22,2183−2196)によって概説されている。
ポリヌクレオチドの実例としては、配列番号1〜19および39をコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号20〜38に示されるポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、末端プロセシング酵素、融合ポリペプチド、および発現ベクターをコードするポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ならびに本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列でハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドで実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、1つ以上のヌクレオチドが、付加または欠失され、または修飾される、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の改変が、参照ポリヌクレオチドに行われ得、それによって、改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野で十分に理解される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびpHで、特定の配列について、熱融解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度下で)である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは、プローブの50%が、平衡状態で占有されている。
本明細書で使用される、「配列同一性」または例えば「〜と50%同一である配列」を含むという記述は、比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。故に、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の2つのの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ(すなわち、ウィンドウサイズ)中の位置の総数で割り、その結果に100を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。典型的に、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも12個、しばしば、15〜18個、多くの場合、少なくとも25個のモノマー単位である。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、および(2)2つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るので、2つ(またはそれ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」上の2つのポリヌクレオチドを比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、2つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも6個の連続した位置、一般的には約50〜約100個、より一般的には約100〜約150個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、2つの配列の最適なアライメントのために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して約20%以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Drive(Madison,WI,USA)のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータ実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント(すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること)によって行うことができる。例えば、Altschul et al.,1997,Nucl.Acids Res.25:3389によって開示されるようなプログラムのBLASTファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994−1998,Chapter 15のユニット19.3に見出すことができる。
本明細書で使用される、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているDNA断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、天然で存在せず、人間の手によって作製された、相補的DNA(cDNA)、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない本明細書で企図されるポリペプチドをコードするmRNAを含む。ある特定の実施形態において、mRNAは、キャップ、1つ以上のヌクレオチド、およびポリ(A)尾部を含む。
本明細書で使用されるとき、「5´キャップ」または「5´キャップ構造」または「5´キャップ部分」という用語は、mRNAの5´末端に組み込まれている化学修飾を指す。5´キャップは、核外輸送、mRNA安定性、および翻訳に関与する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5´−末端転写センスヌクレオチドとの間に5´−ppp−5´−トリホスフェート連結を含む5´キャップを含む。この5´−グアニル酸キャップは、続いてメチル化されて、N7−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。
本明細書で企図されるmRNAポリヌクレオチドの特定の実施形態における使用に好適な5´キャップの実例としては、メチル化されていない5´キャップ類似体、例えば、G(5´)ppp(5´)G、G(5´)ppp(5´)C、G(5´)ppp(5´)A;メチル化された5´キャップ類似体、例えば、m7G(5´)ppp(5´)G、m7G(5´)ppp(5´)C、およびm7G(5´)ppp(5´)A;ジメチル化された5´キャップ類似体、例えば、m2,7G(5´)ppp(5´)G、m2,7G(5´)ppp(5´)C、およびm2,7G(5´)ppp(5´)A;トリメチル化された5´キャップ類似体、例えば、m2,2,7G(5´)ppp(5´)G、m2,2,7G(5´)ppp(5´)C、およびm2,2,7G(5´)ppp(5´)A;ジメチル化された対称性5´キャップ類似体、例えば、m7G(5´)pppm7(5´)G、m7G(5´)pppm7(5´)C、およびm7G(5´)pppm7(5´)A;ならびにアンチリバース(anti−reverse)5´キャップ類似体、例えば、3´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)G、2´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)G、2´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)C、2´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)A、m72´d(5´)ppp(5´)G、m72´d(5´)ppp(5´)C、m72´d(5´)ppp(5´)A、3´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)C、3´O−Me−m7G(5´)ppp(5´)A、m73´d(5´)ppp(5´)G、m73´d(5´)ppp(5´)C、m73´d(5´)ppp(5´)Aと称される、アンチリバースキャップ類似体(Anti−Reverse Cap Analog(ARCA))キャップ、ならびにそれらのテトラホスフェート誘導体)が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Jemielity et al.,RNA,9:1108−1122(2003)を参照されたい)。
特定の実施形態において、mRNAは、第1の転写ヌクレオチドの5´末端にトリホスフェート架橋を介して連結した7−メチルグアニル酸(「m7G」)である5´を含み、その結果、m7G(5´)ppp(5´)Nとなり、ここで、Nは任意のヌクレオシドである。
一部の実施形態において、mRNAは、5´キャップを含み、このキャップは、キャップ0構造(キャップ0構造は塩基1および塩基2に付着したリボースの2´−O−メチル残基を欠く)、キャップ1構造(キャップ1構造は塩基2で2´−O−メチル残基を有する)、またはキャップ2構造(キャップ2構造は塩基2と塩基3との両方に付着した2´−O−メチル残基を有する)である。
一実施形態において、mRNAは、m7G(5´)ppp(5´)Gキャップを含む。
一実施形態において、mRNAは、ARCAキャップを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、プソイドウリジン、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチル−プソイドウリジン、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、5−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、プソイドウリジン、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチル−プソイドウリジン、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、および4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、5−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、および4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、および2−メトキシ−アデニンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、イノシン、1−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上のプソイドウリジン、1つ以上の5−メチル−シトシン、および/または1つ以上の5−メチル−シチジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上のプソイドウリジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上の5−メチル−シチジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上の5−メチル−シトシンを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、mRNAをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、mRNAを安定させ、翻訳を促進するために、ポリ(A)尾部を含む。ある特定の実施形態において、mRNAは、3´ポリ(A)尾部構造を含む。
特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、少なくとも約10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、もしくは少なくとも約500個、またはそれ以上のアデニンヌクレオチド、あるいは任意の介在数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、少なくとも約125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、もしくは275個、またはそれ以上のアデニンヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、約10〜約500個のアデニンヌクレオチド、約50〜約500個のアデニンヌクレオチド、約100〜約500個のアデニンヌクレオチド、約150〜約500個のアデニンヌクレオチド、約200〜約500個のアデニンヌクレオチド、約250〜約500個のアデニンヌクレオチド、約300〜約500個のアデニンヌクレオチド、約50〜約450個のアデニンヌクレオチド、約50〜約400個のアデニンヌクレオチド、約50〜約350個のアデニンヌクレオチド、約100〜約500個のアデニンヌクレオチド、約100〜約450個のアデニンヌクレオチド、約100〜約400個のアデニンヌクレオチド、約100〜約350個のアデニンヌクレオチド、約100〜約300個のアデニンヌクレオチド、約150〜約500個のアデニンヌクレオチド、約150〜約450個のアデニンヌクレオチド、約150〜約400個のアデニンヌクレオチド、約150〜約350個のアデニンヌクレオチド、約150〜約300個のアデニンヌクレオチド、約150〜約250個のアデニンヌクレオチド、約150〜約200個のアデニンヌクレオチド、約200〜約500個のアデニンヌクレオチド、約200〜約450個のアデニンヌクレオチド、約200〜約400個のアデニンヌクレオチド、約200〜約350個のアデニンヌクレオチド、約200〜約300個のアデニンヌクレオチド、約250〜約500個のアデニンヌクレオチド、約250〜約450個のアデニンヌクレオチド、約250〜約400個のアデニンヌクレオチド、約250〜約350個のアデニンヌクレオチド、もしくは約250〜約300個のアデニンヌクレオチド、または任意の介在範囲のアデニンヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語には、5´(通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端)および3´(通常、遊離ヒドロキシル(OH)基を有するポリヌクレオチドの末端)が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、5´から3´の方向または3´から5´の方向で注記され得る。DNAおよびmRNAについて、5´から3´の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、プレメッセンジャー(プレmRNA)の配列と同一(DNAのチミン(T)の代わりのRNAのウラシル(U)を除いて)であるからである。DNAおよびmRNAについては、RNAポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な3´から5´の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、3´から5´の方向で書かれた5´から3´の配列または5´から3´の方向で書かれた3´から5´の配列を指す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、DNA配列5´ A G T C A T G 3´の相補的鎖は、3´ T C A G T A C 5´である。後者の配列は、左に5´末端および右に3´末端を有する逆相補鎖、5´ C A T G A C T 3´として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
本明細書で使用される、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、RNAを発現し、その後ポリペプチドを発現することができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子(複数可)、例えば、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含む。別の実施形態において、核酸カセットは、1つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ(A)配列、および目的となる遺伝子(複数可)、例えば、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含む。ベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がRNAに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画にトランスロケーションされ得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合させたその3´および5´末端を有し、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットを除去し、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含む。本明細書で使用されるとき、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図される、阻害性ポリヌクレオチドの転写のための鋳型として機能するポリペプチドまたは融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
さらに、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で企図されるポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなる天然遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性しか有しない。それにもかかわらず、コドン使用における相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび/または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1つ以上の突然変異の結果として改変される内在性ポリヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復鋳型を含む。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、siRNA、miRNA、shRNA、リボザイム、または別の阻害性RNAが挙げられるがこれらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、阻害性RNAを含むドナー修復鋳型は、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構成的なpol III、例えば、ヒトもしくはマウスU6 snRNAプロモーター、ヒトおよびマウスH1 RNAプロモーター、またはヒトtRNA−valプロモーター、または強力な構成的なpol IIプロモーターなどの1つ以上の調節配列を含む。
コード配列それ自体の長さに関わらず、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるまたは当該技術分野で既知であるように、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、Kozak配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム進入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、ならびに自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のDNA配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えDNAプロトコルにおける使用によって制限されることが特定の実施形態で企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知であり利用可能である様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および/または送達することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。所望のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするmRNAを細胞に送達することによっても発現させることができる。
ベクターの実例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、および転位性要素、例えば、Sleeping Beauty、PiggyBacが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの追加の実例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1由来の人工染色体(PAC)などの人工染色体、ラムダファージまたはM13ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの実例としては、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス(例えば、SV40)が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターの実例としては、哺乳動物細胞における発現のためのpClneoベクター(Promega)、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのpLenti4/V5−DEST(商標)、pLenti6/V5−DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5−GW/lacZ(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションすることができる。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソーム性ベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体DNA内に組み込むことなく、また宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外でまたはエピソームとして複製することも意味する。
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(Shine Dalgarno配列またはKozak配列)イントロン、翻訳後調節要素、ポリアデニル化配列、5´および3´非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用することができる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない、ベクターを含む。ベクターは、1つ以上の外因性、内在性、または異種制御配列、例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。「内在性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー/プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段(すなわち、分子生物学的技法)により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作された細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、もう1つの内在性および/もしくは外因性配列、ならびに/または特定の療法のための最適なプロモーターおよび/またはエンハンサー活性を提供することがインビトロもしくはインシリコで決定された配列の要素を含んでもよい。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)の認識部位を指す。RNAポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞中で作動性であるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ25〜30塩基上流に位置するATリッチな領域、および/または転写の開始から70〜80塩基上流に見出される別の配列であるCNCAAT領域を含み、ここで、Nは任意のヌクレオチドであってよい。
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるDNAのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび/または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するDNAのセグメントを指す。
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列(プロモーター、および/またはエンハンサーなど)と第2のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列により、第2の配列に対応する核酸の転写が指向される機能的連結を指す。
本明細書で使用されるとき、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーであってもよく、あるいは多様性が制限された細胞および組織型における発現をそれぞれ可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーであってもよい。
特定の実施形態での使用に好適な例示的な遍在発現制御配列としては、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、Moloneyマウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーター、ワクシニアウイルスからのH5、P7.5、およびP11プロモーター、短伸長因子1−アルファ(EF1a−短)プロモーター、長伸長因子1−アルファ(EF1a−長)プロモーター、初期増殖応答1(EGR1)、フェリチンH(FerH)、フェリチンL(FerL)、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、真核生物翻訳開始因子4A1(EIF4A1)、熱ショック70kDaタンパク質5(HSPA5)、熱ショックタンパク質90kDaベータ、メンバー1(HSP90B1)、熱ショックタンパク質70kDa(HSP70)、β−キネシン(β−KIN)、ヒトROSA 26遺伝子座(Irions et al.,Nature Biotechnology 25,1477−1482(2007))、ユビキチンCプロモーター(UBC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域の欠失した、dl587revプライマー結合部位が置換された(MND)プロモーター(Challita et al.,J Virol.69(2):748−55(1995))が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために(例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、または組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階で発現させるために)、細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
本明細書で使用される、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大もしくは減少を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
誘導性プロモーター/系の実例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど(対応するホルモンで処理することによって誘導される)、メタロチオネイン(metallothionine)プロモーター(種々の重金属で処理することによって誘導される)、MX−1プロモーター(インターフェロンによって誘導される)、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、クメート(cumate)誘導性遺伝子スイッチ(WO2002/088346)、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
条件発現はまた、部位特異的DNAリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも1つの(典型的に、2つの)部位(複数可)を含む。本明細書で使用されるとき、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上)が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子、もしくは関連するタンパク質(Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993)を参照されたい)、またはそれらの変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはそれらの断片を含む融合タンパク質)、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、およびParAが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための1つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みのために必要な任意の部位(複数可)とは別であることが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Creリコンビナーゼのための1つの組換え部位は、8塩基対コア配列と隣接した2つの13塩基対の逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす)を含む34塩基対の配列であるloxPである(Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521−527(1994)の図1を参照されたい)。他の代表的なloxP部位としては、lox511(Hoessら、1996、BethkeおよびSauer、1997)、lox5171(LeeおよびSaito、1998)、lox2272(LeeおよびSaito、1998)、m2(Langerら、2002)、lox71(Albertら、1995)、およびlox66(Albertら、1995)が挙げられるが、これらに限定されない。
FLPリコンビナーゼのための好適な認識部位としては、FRT(McLeodら、1996)、F1、F2、F3(SchlakeおよびBode、1994)、F4、F5(SchlakeおよびBode、1994)、FRT(LE)(Senecoffら、1988)、FRT(RE)(Senecoffら、1988)が挙げられるが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、attB、attP、attL、およびattR配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、phi−c31によって認識される。φC31 SSRは、ヘテロタイプの部位attB(長さ34bp)とattP(長さ39bp)との間の組換えのみを媒介する(Grothら、2000)。attBおよびattPは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φC31ホモ二量体が結合する可能性が高い不完全な逆方向反復を含有する(Grothら、2000)。産物の部位であるattLおよびattRは、さらなるφC31媒介性組換えに対して有効に不活性であり(Beltekiら、2003)、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのattP部位へのattBを有するDNAの挿入が、ゲノムのattB部位へのattP部位の挿入よりも容易であることが見出されている(Thyagarajanら、2001、Beltekiら、2003)。故に、典型的な戦略では、相同組換えによってattPを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置付け、次いでそれを挿入のために、attBを有する入ってくる配列とパートナーにする。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復鋳型ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復鋳型ポリヌクレオチドは、LoxP部位、FRT部位、またはatt部位に隣接する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする1つ以上のIRES配列またはポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
本明細書で使用されるとき、「内部リボソーム進入部位」または「IRES」は、ATGなどの開始コドンへのシストロン(タンパク質をコードする領域)の直接内部リボソーム進入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Jackson et al.,1990.Trends Biochem Sci 15(12):477−83)およびJackson and Kaminski.1995.RNA 1(10):985−1000を参照されたい。当業者によって一般に用いられるIRESの例は、米国特許第6,692,736号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「IRES」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるIRES(Jackson et al.,1990)およびウイルスまたは細胞mRNA源から得られるIRES、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管上皮成長因子(VEGF)(Huez et al.1998.Mol.Cell.Biol.18(11):6178−6190)、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)、およびインスリン様成長因子(IGFII)、翻訳開始因子eIF4G、ならびに酵母転写因子TFIIDおよびHAP4、Novagenから市販の脳心筋炎(encephelomycarditis)ウイルス(EMCV)(Duke et al.,1992.J.Virol 66(3):1602−9)、およびVEGF IRES(Huez et al.,1998.Mol Cell Biol 18(11):6178−90)が挙げられるが、これらに限定されない。IRESはまた、Picornaviridae、Dicistroviridae、およびFlaviviridae種のウイルスゲノム、ならびにHCV、Friendマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびMoloneyマウス白血病ウイルス(MoMLV)において報告されている。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに使用されるIRESは、EMCV IRESである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスKozak配列を有し、かつ所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Kozak配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するmRNAの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスKozak配列は、(GCC)RCCATGG(配列番号76)であり、ここで、Rは、プリン(AまたはG)である(Kozak,1986.Cell.44(2):283−92、およびKozak,1987.Nucleic Acids Res.15(20):8125−48)。
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素により、異種遺伝子の発現が増加する。転写終止シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列3’を含む。本明細書で使用される「polyA部位」、「polyA配列」、「poly(A)部位」、または「poly(A)配列」という用語は、RNAポリメラーゼIIによって発生期のRNA転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するDNA配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリ(A)尾部をコード配列の3’末端に付加することによってmRNAの安定性を促進し、その結果、転写効率の増加に寄与し得る。組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましく、これは、ポリ(A)尾部を欠いている転写物が不安定であり、急速に分解されるためである。ベクターに使用され得るポリ(A)シグナルの実例には、理想的なポリ(A)配列(例えば、AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、ウシ成長ホルモンポリ(A)配列(BGHpA)、ウサギβ−グロビンポリ(A)配列(rβgpA)、または当該技術分野で既知である別の好適な異種または内在性ポリ(A)配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞は、直接毒性および/または制御されていない増殖のリスクを低減するために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−9またはカスパーゼ−8またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−9は、特定の二量化の化学誘導物質(CID)を使用して活性化され得る。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書で企図される遺伝子修飾細胞をインビボでの陰性選択に対して感受性にする、遺伝子セグメントを含む。「陰性選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として除去され得る注入された細胞を指す。陰性選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。陰性選択遺伝子は、当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV−I TK)遺伝子、細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾細胞は、インビトロで陰性選択可能な表現型の細胞の選択を可能にする陽性マーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。陽性選択可能なマーカーは、宿主細胞へ導入されたとき、その遺伝子を有する細胞の陽性選択を許容する優性表現型を発現する遺伝子であってもよい。この型の遺伝子は当該技術分野で既知であり、ハイグロマイシンBに対する耐性を与えるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neoまたはaph)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子(ADA)、および多剤耐性(MDR)遺伝子を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、陽性選択可能なマーカーおよび陰性選択可能な要素は、陰性選択可能な要素の消失が必ず陽性選択可能なマーカーの消失も伴うように連結される。特定の実施形態において、陽性および陰性選択可能なマーカーは、一方の消失が義務的に他方の消失をもたらすように、融合される。上記の所望の陽性選択特徴および陰性選択特徴の両方を付与するポリペプチドを発現産物として生じる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子(HyTK)である。この遺伝子の発現は、インビトロでの陽性選択のためのハイグロマイシンB耐性、およびインビボでの陰性選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを生じる。優性の陽性選択可能なマーカーを陰性選択可能なマーカーと融合することから導出される二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用について記載する、S.D.LuptonによるPCT US91/08442およびPCT/US94/05601の公開も参照されたい。
好ましい陽性選択可能なマーカーは、hph、nco、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい陰性選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV−I TK、VZV TK、HPRT、APRT、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態で企図される例示的な二機能性の選択可能な融合遺伝子としては、陽性選択可能なマーカーがhphまたはneoに由来し、陰性選択可能なマーカーが、シトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子または選択可能なマーカーに由来する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、1つ以上のメホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、末端プロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルス的方法およびウイルス的方法の両方によって、造血細胞、例えば、CD34+細胞に導入されてもよい。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復鋳型の送達は、同じ方法によってまたは異なる方法によって、および/または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含んでもよいか、または宿主細胞DNAへの組込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される1つ以上のポリヌクレオチドをCD34+細胞に送達するために使用される。
非ウイルスベクターの実例としては、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質:核酸共役体、裸のDNA、人工ビリオン、DEAE−デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される特定の実施形態における使用に好適なポリヌクレオチド送達系の実例としては、Amaxa Biosystems,Maxcyte,Inc.、BTX Molecular Delivery Systems、およびCopernicus Therapeutics Incによって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Liu et al.(2003)Gene Therapy.10:180−187、およびBalazs et al.(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1−12を参照されたい。抗体を標的とする、バクテリア由来の非生物ナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態で企図される。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入)または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターを、細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞(例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など)にエクスビボで送達するか、または万能ドナー造血幹細胞に送達し、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸のDNAまたはmRNAを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最大に接触させるために通常用いられる任意の経路により、これらの経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない。かかる核酸を投与する好適な方法は、当該技術分野において利用可能でかつ当業者に周知であり、1つを超える経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもさらに即時的かつさらに有効な反応を提供し得る場合が多い。
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なウイルスベクター系の実例としては、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に、その細胞を1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)で形質導入することによって、導入される。
AAVは、小さくて(約26nm)複製欠損の主にエピソーム性の非エンベロープウイルスである。AAVは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えAAV(rAAV)は、典型的には、最低限でも、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに5´および3´AAV逆方向末端反復(ITR)から構成される。ITR配列は、長さが約145bpである。特定の実施形態において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10から単離されたITRおよびカプシド配列を含む。
一部の実施形態において、キメラrAAVが使用され、ITR配列は1つのAAV血清型から単離され、カプシド配列は異なるAAV血清型から単離される。例えば、AAV2に由来するITR配列およびAAV6に由来するカプシド配列を有するrAAVは、AAV2/AAV6と称される。特定の実施形態において、rAAVベクターは、AAV2に由来するITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のうちのいずれか1つに由来するカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2に由来するITR配列およびAAV6に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2に由来するITR配列およびAAV2に由来するカプシド配列を含む。
一部の実施形態において、遺伝子操作法および選択法をAAVカプシドに適用して、それらが目的となる細胞を形質導入する可能性を高めることができる。
rAAVベクターの構築、その産生および精製は、例えば、米国特許第9,169,494号、同第9,169,492号、同第9,012,224号、同第8,889,641号、同第8,809,058号、および同第8,784,799号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に、その細胞を1つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで形質導入することによって、導入される。一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型は、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に、その細胞をインテグラーゼ欠乏レンチウイルスで形質導入することによって、導入される。
本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムRNAを直鎖2本鎖DNAコピーに逆転写し、その後、そのゲノムDNAを宿主ゲノムに共有的に一体化させるRNAウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、Moloneyマウス白血病ウイルス(M−MuLV)、Moloneyマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、Harveyマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプマウイルス、Friendマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)、およびRous肉腫ウイルス(RSV))およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群(または族)を指す。例示的なレンチウイルスとしては、HIV(ヒト免疫不全ウイルス、HIV1型およびHIV2型を含む)、ビスナ−マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、HIVベースのベクター骨格(すなわち、HIVシス作用配列要素)が、好ましい。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で論じられるように、1つ以上のLTR、および以下の補助要素:cPPT/FLAP、プシー(Ψ)パッケージングシグナル、輸出要素、ポリ(A)配列のうちの1つ以上または全てを含み、任意選択で、WPREまたはHPRE、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組込みまたは非組込みまたは組込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用されるとき、「組込み欠損レンチウイルス」または「IDLV」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組込み能力のないウイルスベクターは、特許出願WO2006/010834に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を低減するのに好適なHIV−1 pol遺伝子における例示的な突然変異としては、H12N、H12C、H16C、H16V、S81 R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221 L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A、およびK264Hが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、HIV−1インテグラーゼ欠乏pol遺伝子は、D64V、D116I、D116A、E152G、またはE152A突然変異、D64V、D116I、およびE152G突然変異、またはD64V、D116A、およびE152A突然変異を含む。
一実施形態において、HIV−1 インテグラーゼ欠乏pol遺伝子は、D64V突然変異を含む。
「長い末端反復(LTR)」という用語は、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指し、これは、その天然の配列の状況では、直接反復であり、U3、R、およびU5領域を含有する。
本明細書で使用されるとき、「FLAP要素」または「cPPT/FLAP」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、HIV−1またはHIV−2の中央ポリプリン区域および中央終止配列(cPPTおよびCTS)を含む核酸を指す。好適なFLAP要素は、米国特許第6,682,907号およびZennou,et al.,2000,Cell,101:173に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPTおよび/またはCTS要素に1つ以上の突然変異を有するFLAP要素を含有する。また別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPT要素またはCTS要素のいずれかを含む。また別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPT要素もCTS要素も含まない。
本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスRNAの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー[Ψ]配列を指す。例えば、Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4;pp.2101−2109を参照されたい。
「輸送要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。RNA輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)rev応答要素(RRE)(例えば、Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053、およびCullen et al.,1991.Cell 58:423を参照されたい)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節要素(HPRE)が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意選択で転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増大する。様々な転写後調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE;Zufferey et al.,1999,J.Virol.,73:2886)、B型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素(HPRE)(Huang et al.,Mol.Cell.Biol.,5:3864)、および同様のもの(Liu et al.,1995,Genes Dev.,9:1766)が、タンパク質における異種核酸の発現を増大させることができる。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、LTRの修飾の結果としていくつかの安全性の増強を含む。「自己不活性化」(SIN)ベクターは、例えば、1回目のウイルス複製を超えてウイルスが転写されることを防ぐために、U3領域として知られる右側(3´)のLTRエンハンサー−プロモーター領域が修飾されている(例えば、欠失または置換によって)複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の増強は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆動するために、5´LTRのU3領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、最初期)、Moloneyマウス白血病ウイルス(MoMLV)、Rous肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、HIVは、水疱性口内炎ウイルスG−タンパク質(VSV−G)エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、HIVエンベロープタンパク質(env遺伝子によってコードされる)は通常ウイルスをCD4+提示細胞に標的化させるため、HIVがより多様な細胞を感染させることが可能になる。
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
本明細書で企図されるある種の特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、HIV−1に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび/またはレンチウイルス配列の多くの異なる源を用いることができるか、またはある特定のレンチウイルス配列における組み合わせられた多数の置換および改変を、移入ベクターが本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させ得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知である。Naldiniら(1996a、1996b、および1998)、Zuffereyら(1997)、Dullら、1998、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを生成するために採用され得る。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に、その細胞を1つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで形質導入することによって、導入される。
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要しない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。大部分のアデノウイルスベクターを、導入遺伝子がAd E1a、E1b、および/またはE3遺伝子を置き換えるように遺伝子操作し、その後、複製欠損性ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞中で増殖させる。Adベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のAdベクターは、高い輸送能力を有する。
複製欠損性である現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、E1タンパク質を構成的に発現する293と呼ばれる特有のヘルパー細胞株を利用し得る(Grahamら、1977)。E3領域は、アデノウイルスゲノムから可欠であるため(Jones&Shenk、1978)、現行のアデノウイルスベクターは、293細胞を利用して、E1領域、D3領域、またはそれらの両方の領域に外来DNAを運搬する(Graham&Prevec、1991)。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現(Levreroら、1991、Gomez−Foixら、1992)およびワクチン開発(Grunhaus&Horwitz、1992、Graham&Prevec、1992)に使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴(Rosenfeldら、1991、Rosenfeldら、1992)、筋肉注射(Ragotら、1993)、末梢静脈内注入(Herz&Gerard,1993)、および脳内への定位接種(Le Gal La Salleら、1993)が含まれる。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083−9(1998))。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中に、その細胞を、1つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV−1、HSV−2で形質導入することによって、導入される。
成熟HSVビリオンは、152kbである直鎖2本鎖DNA分子からなるウイルスゲノムを有する、エンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、HSVベースのウイルスベクターは、1つ以上の必須または非必須HSV遺伝子が欠損している。一実施形態において、HSVベースのウイルスベクターは、複製欠損性である。大部分の複製欠損性HSVベクターは、1つ以上の最初期、初期、または後期HSV遺伝子を除去して複製を防止するために、欠失を含む。例えば、HSVベクターは、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子が欠損していてもよい。HSVベクターの利点は、長期間のDNA発現をもたらすことができる潜伏期に入る能力、および最大25kbの外因性DNA挿入を受け入れることができるその大きなウイルスDNAゲノムである。HSVベースのベクターは、例えば、米国特許第5,837,532号、同第5,846,782号、および同第5,804,413号、ならびに国際特許出願WO91/02788、WO96/04394、WO98/15637、およびWO99/06583に記載されており、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
H.ゲノム編集された細胞
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の治療のための向上した細胞ベースの治療法を提供する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、胎児グロビンスイッチングを取り入れて、異常ヘモグロビン症を治療するために、またいくつかの実施形態において可能性としてそれを治癒するために使用され得るより頑丈なゲノム編集された細胞の組成物を提供すると考えられる。
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の治療のための向上した細胞ベースの治療法を提供する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、胎児グロビンスイッチングを取り入れて、異常ヘモグロビン症を治療するために、またいくつかの実施形態において可能性としてそれを治癒するために使用され得るより頑丈なゲノム編集された細胞の組成物を提供すると考えられる。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集された細胞は、自家/自律(「自己(self)」)または非自家(「非自己」、例えば、同種、同系、または異種)であってもよい。本明細書で使用される「自家」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される「自律」は、比較される細胞とは遺伝子的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される「同系」は、比較される細胞と遺伝子的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される「異種」は、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意選択で非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外基質を実質的に含まない、非自然発生細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾された細胞、遺伝子操作された細胞等を指す。
本明細書で企図される組成物および方法を使用してゲノムを編集することができる細胞型の実例としては、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
「幹細胞」という用語は、(1)長期の自己複製、または元の細胞の少なくとも1つの同一コピーを生成する能力、(2)複数の、また一部の場合には1つのみの特殊化した細胞型への単一細胞レベルにおける分化、および(3)インビボでの組織の機能的再生を行うことができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、その発生能に従って、全能性、多能性(pluripotent)、多能性(multipotent)、および寡能性/単能性として亜分類される。「自己複製」は、改変されていない娘細胞を産生する特有の能力、および特殊化した細胞型(効力)を生成する特有の能力を有する細胞を指す。自己複製は2つの方法で達成され得る。非対称性細胞分裂手順により、親細胞と同一である娘細胞が1つ、親細胞とは異なる、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が1つ得られる。対称性細胞分裂手順により、同一の娘細胞が2つ得られる。細胞の「増殖」または「拡大」は、対称に分裂している細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、「前駆」または「前駆細胞」は、細胞が自己複製する能力およびより成熟した細胞に分化する能力を有することを指す。多くの前駆細胞は、単一の系列に従って分化するが、極めて広範な増殖能を有してもよい。
特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される「初代細胞」という用語は、組織から単離されており、インビトロまたはエクスビボでの成長のために確立されている細胞を指すように当該技術分野で知られている。対応する細胞は、集団倍加を、あったとしてもごくわずかしか受けていないので、連続細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な機能的構成要素をよりよく代表するものであり、故に、インビボ状態に対するより代表的なモデルを表す。様々な組織から試料を得る方法および初代細胞株を確立する方法は、当該技術分野で周知である(例えば、Jones and Wise,Methods Mol Biol.1997を参照されたい)。本明細書で企図される方法において使用するための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員された末梢血、および骨髄に由来する。一実施形態において、初代細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、胚性幹細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、成体幹細胞または前駆細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、初代細胞である。
好ましい実施形態において、ゲノム編集された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、赤血球細胞、または造血細胞を含む細胞集団である。
本明細書で使用されるとき、「細胞の集団」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、任意の数および/または組み合わせの同質細胞型または異質細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞の形質導入のために、臍帯血、胎盤血、骨髄、または動員された末梢血から細胞の集団を単離または取得することができる。細胞の集団は、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%の編集される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、造血幹細胞または造血前駆細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して異質細胞の集団から単離または精製されてもよい。
造血細胞を得るための例示的なソースとしては、臍帯血、骨髄、または動員された末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
造血幹細胞(HSC)は、生物の寿命にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを生成することができ、それに深く関与する造血前駆細胞(HPC)を生じる。「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、骨髄(例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)、およびリンパ系(例えば、T細胞、B細胞、NK細胞)、および当該技術分野で既知の他のもの(Fei,R.ら、米国特許第5,635,387号;McGlaveら、米国特許第5,460,964号;Simmons,P.ら、米国特許第5,677,136号;Tsukamotoら、米国特許第5,750,397号;Schwartzら、米国特許第5,759,793号;DiGuistoら、米国特許第5,681,599号;Tsukamotoら、米国特許第5,716,827号)を含む生物の全ての血液細胞型を生じる、多能性幹細胞を指す。造血幹細胞および造血前駆細胞は、致死的な放射線を浴びた動物またはヒトに移植された場合、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ球造血細胞プールを再ポピュレートすることができる。
本明細書で企図される方法および組成物と共に使用するのに好適な造血幹細胞または造血前駆細胞の追加の実例としては、CD34+CD38LoCD90+CD45RA−である造血細胞、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38Lo/−、C−kit/CD117+、およびLin(−)である造血細胞、ならびにCD133+である造血細胞が挙げられる。
好ましい実施形態において、CD133+CD90+である造血細胞。
好ましい実施形態において、CD133+CD34+である造血細胞。
好ましい実施形態において、CD133+CD90+CD34+である造血細胞。
造血階層制の特性評価を行うために、様々な方法が存在する。1つの特性評価の方法は、SLAMコードである。SLAM(シグナル伝達リンパ球活性化分子)ファミリーは、遺伝子が染色体1(マウス)の単一遺伝子座に主に縦列で位置し、全て免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、もともとはT細胞刺激に関与すると考えられている10個超の分子の群である。このファミリーには、CD48、CD150、CD244などが含まれ、CD150は、創始メンバーであるため、slamF1、すなわち、SLAMファミリーメンバー1とも称される。造血階層制についての特徴的なSLAMコードは、造血幹細胞(HSC)−CD150+CD48−CD244−;多能性前駆細胞(MPP)−CD150−CD48−CD244+;系列制限された前駆細胞(LRP)−CD150−CD48+CD244+;共通骨髄性前駆細胞(CMP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34+CD16/32mid;顆粒球−マクロファージ前駆細胞(GMP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34+CD16/32hi;および巨核球−赤血球前駆細胞(MEP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34−CD16/32lowである。
本明細書で企図される組成物および方法を用いて編集される好ましい標的細胞型としては、造血細胞、好ましくはヒト造血細胞、より好ましくはヒト造血幹細胞および造血前駆細胞、ならびにさらにより好ましくはCD34+ヒト造血幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される「CD34+細胞」という用語は、CD34タンパク質を細胞表面で発現している細胞を指す。本明細書で使用される「CD34」は、細胞間接着因子として作用することが多い細胞表面糖タンパク質(例えば、シアロムチンタンパク質)を指す。CD34+は、造血幹細胞と造血前駆細胞との両方の細胞表面マーカーである。
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、CD150+CD48−CD244−細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、CD34+CD133+細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、CD133+細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、CD34+細胞である。
特定の実施形態において、造血幹細胞および造血前駆細胞(HSPC)を含む造血細胞の集団は、編集されたBCL11A遺伝子を含み、この編集は、NHEJによるDSBの修復である。編集は、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位における編集であってもよい。
特定の実施形態において、造血幹細胞および造血前駆細胞(HSPC)を含む造血細胞の集団は、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)における、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個、またはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失(INDEL)を含む、編集されたBCL11A遺伝子を含み、これにより、BCL11A発現を減少させるか、低下させるか、または除去する。
一実施形態において、編集は、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)における、1個のヌクレオチドの挿入、または約1、2、3、もしくは4個のヌクレオチドの欠失であり、これにより、BCL11A発現を減少させるか、低下させるか、または除去する。
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、赤血球細胞を含む。
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、β−グロビン遺伝子中の1つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、サラセミアを生じるβ−グロビン遺伝子中の1つ以上の1つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、サラセミアはα−サラセミアである。一実施形態において、サラセミアはβ−サラセミアである。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、鎌状赤血球症を生じるβ−グロビン遺伝子中の1つ以上の1つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択される。
I.組成物および製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、これらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞の組成物を含んでもよい。特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団におけるヒトBCL11A遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物を使用して、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中のBCL11A遺伝子を編集する。
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、これらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞の組成物を含んでもよい。特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団におけるヒトBCL11A遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物を使用して、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはCD34+細胞中のBCL11A遺伝子を編集する。
様々な実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択で末端プロセシング酵素、例えば、3´−5´エキソヌクレアーゼ(Trex2)を含む。ヌクレアーゼバリアントは、上で開示したポリヌクレオチド送達方法、例えば、エレクトロポレーション、脂質ナノ粒子などを介して細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALをコードするmRNAと、任意選択で3´−5´エキソヌクレアーゼとを含む組成物は、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入される。本組成物は、ゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団をエラープローンNHEJによって生成するために使用され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、末端プロセシング酵素、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。ヌクレアーゼバリアントおよび/または末端プロセシング酵素は、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、3´−5´エキソヌクレアーゼ、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および/または3´−5´エキソヌクレアーゼは、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。
特定の実施形態において、細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、CD133+細胞、およびCD34+細胞を含むがこれらに限定されない、遺伝子修飾された造血細胞を含む。
組成物としては、薬学的組成物が挙げられるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の1つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。必要に応じて、組成物は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤とも組み合わせて投与され得ることも理解されよう。組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加の薬剤が組成物に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または妥当な利益/リスク比に釣り合った他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に好適である、化合物、物質、組成物、および/または剤形を指すように本明細書で使用される。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療用細胞が共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の実例は、滅菌液、例えば、細胞培地、水、および油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などといった、石油、動物、植物、または合成起源の油であり得る。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。特定の実施形態において好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロール、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、ピロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。任意の従来の培地または薬剤が活性成分と互換性でない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
一実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内(静脈内または動脈内)、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、心室内、髄腔内、またはくも膜下投与に好適である。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液、細胞培地、または分散液を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が形質導入細胞と互換性でない場合を除き、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、遺伝子修飾された造血幹細胞および/または造血前駆細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む。本明細書で企図される細胞ベースの組成物を含む組成物は、所望の治療目標を達成するために、腸内もしくは非経口投与方法によって別々に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
薬学的に許容される担体は、本担体を治療されるヒト対象に投与するのに好適とするのために十分に純度が高く、かつ十分に毒性が低い必要がある。担体はさらに、組成物の安定性を維持するかまたは増大させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体であっても固体であってもよく、計画されている投与様式を考慮して、組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望の嵩、密度などを提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、非限定的に、結合剤(例えば、事前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、増量剤(例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)、崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)であり得る。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体としては、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
かかる担体溶液は、緩衝液、希釈液、および他の好適な添加剤も含有し得る。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、化学組成により、pHの著しい変化を伴わずに酸または塩基が中和される、溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝液の例としては、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リンゲル液、水中5%のデキストロース(D5W)、通常の食塩水/生理食塩水(0.9%のNaCl)が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される担体は、組成物のpHを約7に維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、pHが、約6.8〜約7.4の範囲、例えば、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、および7.4である。また別の実施形態において、組成物は、pHが約7.4である。
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含んでもよい。組成物は懸濁液であってもよい。本明細書で使用される「懸濁液」という用語は、細胞が固体支持体に付着しない非接着性条件を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌されるかまたはかき混ぜられてもよく、培養皿などの支持体に接着しない。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここでは、ゲノム編集された造血幹細胞および/または造血前駆細胞が、点滴(IV)袋または同様のものの中で、許容される液体培地または溶液、例えば、食塩水または無血清培地に分散される。許容される希釈剤としては、水、PlasmaLyte、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム(食塩水)溶液、無血清細胞培地、および極低温貯蔵に好適な培地、例えば、Cryostor(登録商標)培地が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞、例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞の集団を含む組成物の貯蔵に好適である。治療用組成物は、ヒト患者への投与が意図されるため、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培地で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培地は、無血清培地である。
無血清培地は、血清含有培地と比較して、簡易化されより良好に定義された組成物、低減された度合いの汚染物質、可能性のある病原体源の排除、およびより低い費用を含むいくらかの利点を有する。様々な実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択でタンパク質を含まない場合がある。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有てもよい。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質を置き換え、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
特定の組成物中で使用される無血清培地の実例としては、QBSF−60(Quality Biological,Inc.)、StemPro−34(Life Technologies)、およびX−VIVO 10が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む組成物は、PlasmaLyte中で製剤化される。
様々な実施形態において、造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後に、高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中で使用される凍結保存培地の実例としては、CryoStor CS10、CryoStor CS5、およびCryoStor CS2が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、組成物は、PlasmaLyte AとCryoStor CS10とを50:50で含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物汚染を実質的に含まない。エンドトキシンについて「実質的に含まない」とは、細胞の用量あたりのエンドトキシンが、生物製剤についてFDAによって許可されているものよりも少ないことを意味し、この許可されているエンドトキシンは、1日あたり体重1kgあたり5EUの合計エンドトキシンであり、平均的な70kgの人の場合、細胞の合計用量あたり350EUとなる。特定の実施形態において、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入した造血幹細胞または造血前駆細胞を含む組成物は、約0.5EU/mL〜約5.0EU/mL、または約0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL、もしくは5.0EU/mLを含有する。
ある特定の実施形態において、1つ以上の再プログラムされたヌクレアーゼをコードする1つ以上のmRNA、および任意選択で末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤が企図される。
エクスビボ送達のための例示的な製剤は、当該技術分野で既知である様々なトランスフェクション剤、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、および様々なリポソーム製剤(すなわち、脂質媒介性トランスフェクション)の使用も含み得る。以下でさらに詳述するリポソームは、少量の水性流体を封入する脂質二重層である。DNAは、カチオン性リポソームの外表面に自発的に会合し(その電荷を理由とする)、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用することになる。
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、心室内、脳内、頭蓋内、髄腔内、くも膜下、骨髄内の投与および製剤を含む、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載の特定の組成物を使用するために好適な投薬および治療レジメンの開発も同様である。本明細書で企図される特定の実施形態には、他の製剤、例えば、薬学分野で周知のもの、および例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington:The Science and Practice of Pharmacy,volume I and volume II.22nd Edition.Edited by Loyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:Pharmaceutical Press;2012に記載されているものが含まれ得ることが、当業者には理解される。
J.ゲノム編集された細胞による療法
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の予防、治療、および改善、または異常ヘモグロビン症、もしくはβ−グロビン遺伝子中の異常ヘモグロビン症性突然変異を有する対象と関連付けられる少なくとも1つの症状の予防、治療、もしくは改善に使用するための向上した薬物製品を提供する。本明細書で使用されるとき、「薬物製品」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して製造された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、この薬物製品は、遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、CD34+細胞を含む。遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞により、γ−グロビン遺伝子発現が増加した成熟赤血球細胞が得られ、インビボでのγ−グロビン遺伝子の発現がほとんどまたは全くない対象の治療が可能となるため、ゲノム編集された細胞による療法を、これまではこの種の治療が実行可能な治療選択肢ではなかった対象に届ける機会が大幅に拡大される。
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の予防、治療、および改善、または異常ヘモグロビン症、もしくはβ−グロビン遺伝子中の異常ヘモグロビン症性突然変異を有する対象と関連付けられる少なくとも1つの症状の予防、治療、もしくは改善に使用するための向上した薬物製品を提供する。本明細書で使用されるとき、「薬物製品」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して製造された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、この薬物製品は、遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、CD34+細胞を含む。遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞により、γ−グロビン遺伝子発現が増加した成熟赤血球細胞が得られ、インビボでのγ−グロビン遺伝子の発現がほとんどまたは全くない対象の治療が可能となるため、ゲノム編集された細胞による療法を、これまではこの種の治療が実行可能な治療選択肢ではなかった対象に届ける機会が大幅に拡大される。
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーが非機能的であるかもしくは撹乱されているか、除去されているか、または欠失しているため、赤血球細胞中の機能的BCL11A発現、例えば、不十分なBCL11A発現を低減または排除して、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化し、それにより赤血球細胞中のγ−グロビン遺伝子発現を増加させる。
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、BCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、好ましくはBCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位、より好ましくはBCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位、さらにより好ましくは配列番号25に示される標的部位(その補体はコンセンサスGATA−1モチーフWGATARを含む)が非機能的であるかもしくは撹乱されているか、除去されているか、または欠失しているため、赤血球細胞中の機能的BCL11A発現を低減または排除し、その結果、赤血球細胞中のγ−グロビン遺伝子発現を増加させる。
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、単一遺伝子疾患、障害、もしくは状態、または造血系の疾患、障害、もしくは状態、例えば、異常ヘモグロビン症を有すると診断されたかまたはそれが疑われる対象に、根治的、予防的、または緩和的療法を提供する。
本明細書で使用されるとき、「造血」は、前駆細胞からの血液細胞の形成および発達、ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成を指す。血液細胞としては、赤血球(erythrocyte)または赤血球(red blood cell(RBC))、網状赤血球、単球、好中球、巨核球、好酸球、好塩基球、B細胞、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、血小板、および白血球が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「異常ヘモグロビン症」または「異常ヘモグロビン症病態」という用語は、ヘモグロビンの構造および/または合成の変化に起因する異常なヘモグロビン分子の存在が関与する遺伝性血液障害の多様な群を指す。通常、ヘモグロビンは、β−グロビンの2つのサブユニットとα−グロビンの2つのサブユニットとの4つのタンパク質サブユニットからなる。これらのタンパク質サブユニットの各々は、ヘムと称される鉄含有分子に付着(結合)し、各ヘムは、中心に、1つの酸素分子に結合することができる鉄分子を含有する。赤血球内のヘモグロビンは、肺中で酸素原子に結合する。その後、これらの細胞は、血流に乗って移動し、酸素を身体全体の組織に送達する。
ヘモグロビンA(HbA)は、出生後に存在する正常なヘモグロビンの呼称である。ヘモグロビンAは、2本のアルファ鎖および2本のベータ鎖(α2β2)を有する四量体である。ヘモグロビンA2は、出生後に赤血球に見い出されるヘモグロビンの微量成分であり、2本のアルファ鎖および2本のデルタ鎖(α2δ2)からなる。ヘモグロビンA2は、一般に、全赤血球ヘモグロビンの3%未満を構成する。ヘモグロビンF(HbF)は、胎児発達中に主要なヘモグロビンである。この分子は、2本のアルファ鎖および2本のガンマ鎖(α2γ2)の四量体である。好ましい実施形態において、対象は、γ−グロビン遺伝子発現が増加し、かつ/または異常ヘモグロビン症性β−グロビン遺伝子発現が減少し、それにより対象のHbFの量を増加させる赤血球細胞を生む、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞の投与を受ける。
最も一般的な異常ヘモグロビン症としては、鎌状赤血球症、β−サラセミア、およびα−サラセミアが挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、鎌状赤血球症を有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」という用語は、赤血球細胞の鎌状化に起因する任意の症候性貧血状態を含むように、本明細書では定義される。鎌状赤血球症(SCD)の一般的な形態である鎌状赤血球貧血βS/βSは、ヘモグロビンS(HbS)によって生じる。HbSは、Glu6ValまたはE6Vと記される、β−グロビン中の6位でグルタミン酸(E)がバリン(V)で置き換えられることによって生成される。グルタミン酸がバリンで置き換えられることで、異常なHbSサブユニットが互いに繋がりあうようになり、赤血球を鎌状(三日月状)の形状に曲げる長い剛性の分子を形成する。鎌状赤血球は未熟な段階で死滅し、これにより赤血球不足(貧血)が生じ得る。加えて、鎌状赤血球は、剛性であり、微小血管を閉塞させて、激しい痛みおよび臓器障害を引き起こし得る。
β−グロビン遺伝子中のさらなる突然変異により、他の種類の鎌状赤血球症につながるβ−グロビン中の他の異常も生じ得る。これらのβ−グロビンの異常型は、アルファベットの文字またはときには名称で指定されることが多い。これらの鎌状赤血球症の他の種類において、一方のβ−グロビンサブユニットは、HbSで置き換えられ、他方のβ−グロビンサブユニットは、異なる異常なバリアント、例えば、ヘモグロビンC(HbC;βCと記されるβ−グロビン対立遺伝子)またはヘモグロビンE(HbE;βEと記されるβ−グロビン対立遺伝子)で置き換えられる。
ヘモグロビンSC(HbSC)疾患では、β−グロビンサブユニットは、HbSおよびHbCで置き換えられる。HbCは、β−グロビン遺伝子中の突然変異から生じ、HbC疾患(α2βC 2)を有する人々において見い出される主要なヘモグロビンである。HbCは、アミノ酸のリジンがアミノ酸のグルタミン酸をβ−グロビン中の6位で置き換えるときに生じ、これは、Glu6LysまたはE6Kと記される。HbC疾患は、比較的良性であり、軽度の溶血性貧血および脾腫を生じさせる。HbSC疾患の重症度は様々であるが、鎌状赤血球貧血と同程度に重症となり得る。
HbEは、アミノ酸のグルタミン酸がアミノ酸のリジンをβ−グロビン中の26位で置き換えるときに生じ、これは、Glu26LysまたはE26Kと記される。HbE疾患を有する人々は、.軽度の溶血性貧血および軽度の脾腫を有する。HbEは、東南アジアで極めて一般的であり、一部の地域では頻度がヘモグロビンAと同等である。一部の事例では、HbE突然変異はHbSで存在する。これらの場合、人は、疼痛、貧血、および脾臓機能異常の発生など、鎌状赤血球貧血と関連付けられるより重症の兆候および症状を有し得る。
ヘモグロビン鎌状−β−サラセミア(HbSBetaThal)として知られる他の状態は、ヘモグロビンSを産生する突然変異とβ−サラセミアを産生する突然変異とが共に発生するときに生じる。鎌状赤血球症をベータ−ゼロ(β0;β−グロビン産生を防ぐ遺伝子突然変異)サラセミアと組み合わせる突然変異が重症の疾患をもたらす一方、ベータ−プラス(β+;β−グロビン産生)サラセミアと組み合わさった鎌状赤血球症はより軽症である。
本明細書で使用されるとき、「サラセミア」は、ヘモグロビンの産生不全を特徴とする遺伝病を指す。サラセミアの例としては、α−サラセミアおよびβ−サラセミアが挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、β−サラセミアを有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。β−サラセミアは、β−グロビン鎖における突然変異によって引き起こされ、重症型または軽症型で生じ得る。β−グロビン遺伝子中の400個近い突然変異が、β−サラセミアを引き起こすものとして見い出されている。これらの突然変異の大部分は、β−グロビン遺伝子内またはその付近で単一DNA構成単位(ヌクレオチド)の変化を伴う。他の突然変異は、β−グロビン遺伝子中の少数のヌクレオチドの挿入または欠失を行う。上述のように、β−グロビン産生を減少させるβ−グロビン遺伝子突然変異により、ベータ−プラス(β+)サラセミアと称される種類の状態が生じる。細胞によるあらゆるベータ−グロビンの産生を防ぐ突然変異により、ベータ−ゼロ(β0)サラセミアが生じる。β−サラセミアの重症型では、小児は、出生時には正常であるが、生後1年の間に貧血を発症する。β−サラセミアの軽症型は、小さな赤血球を産生する。軽症型サラセミアは、片方の親のみから欠損遺伝子を受け継ぐ場合に生じる。この型の疾患を有する人々は、疾患のキャリアであり、通常は症状を有しない。
HbE/β−サラセミアは、HbEとβ−サラセミアとの組み合わせ(βE/β0、βE/β+)から生じ、HbEの特徴またはβ−サラセミアの特徴のいずれかで見られる状態よりも重症の状態をもたらす。この障害は、中間型サラセミアの分類に入る中等症のサラセミアとして現れる。HbE/β−サラセミアは、東南アジア出身の人々に最も一般的である。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、α−サラセミアを有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。α−サラセミアは、世界中でごく一般的な血液疾患である。Hb Bart症候群およびHbH疾患を有する乳児は、毎年何千人も出生しており、特に東南アジアで多い。α−サラセミアは、地中海諸国、北米、中東、インド、および中央アジアの人々においても頻繁に発生する。α−サラセミアは、典型的には、HBA1遺伝子およびHBA2遺伝子が関与する欠失に起因する。これらの遺伝子の両方は、ヘモグロビンの構成要素(サブユニット)であるα−グロビンと称されるタンパク質を作製するための指示を与える。人間は、HBA1遺伝子の2つのコピーとHBA2遺伝子の2つのコピーとを各細胞内に有する。異なる型のα−サラセミアは、HBA1対立遺伝子およびHBA2対立遺伝子のいくつかまたは全ての喪失に起因する。
α−サラセミアの最重症型であるHb Bart症候群は、4つ全てのアルファ−グロビン対立遺伝子の喪失に起因する。HbH疾患は、4つのα−グロビン対立遺伝子のうちの3つの喪失によって引き起こされる。これらの2つの状態では、α−グロビンの不足により、細胞による正常なヘモグロビンの作製が妨げられる。その代わりに、細胞は、ヘモグロビンBart(Hb Bart)またはヘモグロビンH(HbH)と称される異常型のヘモグロビンを産生する。これらの異常ヘモグロビン分子は、酸素を身体の組織に効率的に運搬することができない。正常なヘモグロビンがHb BartまたはHbHで置換されることで、貧血、およびα−サラセミアと関連付けられる他の深刻な健康問題が生じる。
α−サラセミアの2つのさらなる変形は、α−グロビン量の低下に関係する。細胞は依然としていくらかの正常なヘモグロビンを産生するので、これらの変形は、ほとんどまたは全く健康問題を引き起こさない傾向にある。4つのα−グロビン対立遺伝子のうちの2つの喪失により、α−サラセミアの特徴が生じる。α−サラセミアの特徴を有する人々は、以上に小さく色の薄い赤血球および軽度の貧血を有し得る。1つのα−グロビン対立遺伝子の喪失が、α−サラセミア無症状キャリアにおいて見られる。これらの個体は、典型的には、サラセミアに関係する兆候または症状を有しない。
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、ヘモグロビンC疾患、ヘモグロビンE疾患、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球症(SCD)、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミア、ヘモグロビンBart症候群、およびヘモグロビンH疾患からなる群から選択される異常ヘモグロビン症を治療、予防、または改善するために使用される。
様々な実施形態において、ゲノム編集組成物は、インビボで、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または臓器、例えば骨髄に直接注射することによって投与される。様々な他の実施形態において、細胞は、本明細書で企図される再プログラムされたヌクレアーゼによってインビトロまたはエクスビボで編集され、任意選択でエクスビボで増殖される。その後、ゲノム編集された細胞は、療法を必要とする対象に投与される。
本明細書で企図されるゲノム編集方法において使用するのに好ましい細胞には、自家/自律(「自己」)細胞、好ましくは、造血細胞、より好ましくは造血幹細胞または造血前駆細胞、さらにより好ましくはCD34+細胞が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「個体」および「対象」という用語は、交換可能に使用されることが多く、再プログラムされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法用ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る異常ヘモグロビン症の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象(例えば、患者)には、実験動物(マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど)、家畜、および飼育動物またはペット(ネコまたはイヌなど)が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト対象が含まれる。典型的な対象には、異常ヘモグロビン症を有する、そうであると診断された、またはそれを有する危険性があるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、再プログラムされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法用ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る異常ヘモグロビン症と診断された対象を指す。
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」は、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の症状または病理に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の症状の1つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療には、任意選択で、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の進行を遅延させることが関わり得る。「治療」は必ずしも、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
本明細書で使用されるとき、「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった同様の語は、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の発生または再発の可能性を予防する、阻害する、または低減するための手法を指す。それはまた、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の発症もしくは再発を遅延させること、または異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」および同様の語は、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の発症または再発前に異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の強度、影響、症状、および/または負荷を低減することも含む。
本明細書で使用されるとき、「〜の少なくとも1つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療を受けている異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態、例えば、サラセミア、鎌状赤血球症などの1つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態は、β−サラセミアであり、ここで、改善される1つ以上の症状としては、衰弱、疲労、血色不良、黄疸、顔面骨変形、成長遅延、腹部腫脹、暗色尿、鉄欠乏(輸血がない場合)、頻繁な輸血の必要が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、治療される異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態は、鎌状赤血球症(SCD)であり、ここで、改善される1つ以上の症状としては、貧血;疼痛、例えば、腹部、胸部、骨、または関節の疼痛の原因不明の出現;手または足の腫脹;腹部腫脹;発熱;頻繁な感染;皮膚または爪床の血色不良;黄疸;成長遅延;視覚障害;脳卒中の兆候または症状;鉄欠乏(輸血がない場合)、頻繁な輸血の必要が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の予防結果または治療結果を達成するための「有効量(amount effective)」または「有効量(effective amount)」を指す。
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必然的ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて異なり得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、いずれの毒性効果または有害効果も上回るものでもある。「治療有効量」という用語は、対象(例えば、患者)を「治療」するのに有効である量を含む。治療的量が指示されるとき、特定の実施形態で企図される組成物の、投与されるべき精確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者(対象)の年齢、重量、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個体差を考慮して決定され得る。
ゲノム編集された細胞は、骨髄切除療法を受けたまたは受けていない個体において骨髄または臍帯血移植の一部として投与されてもよい。一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、化学的切除(chemoablative)または放射線切除(radioablative)骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与される。
一実施形態において、ある用量のゲノム編集された細胞が対象に静脈内送達される。好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞が対象に静脈内投与される。
1つの例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、少なくとも2×106細胞/kg、少なくとも3×106細胞/kg、少なくとも4×106細胞/kg、少なくとも5×106細胞/kg、少なくとも6×106細胞/kg、少なくとも7×106細胞/kg、少なくとも8×106細胞/kg、少なくとも9×106細胞/kg、もしくは少なくとも10×106細胞/kg、またはそれ以上の細胞/kgである。
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、約2×106細胞/kg、約3×106細胞/kg、約4×106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約6×106細胞/kg、約7×106細胞/kg、約8×106細胞/kg、約9×106細胞/kg、もしくは約10×106細胞/kg、またはそれ以上の細胞/kgである。
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、約2×106細胞/kg〜約10×106細胞/kg、約3×106細胞/kg〜約10×106細胞/kg、約4×106細胞/kg〜約10×106細胞/kg、約5×106細胞/kg〜約10×106細胞/kg、2×106細胞/kg〜約6×106細胞/kg、2×106細胞/kg〜約7×106細胞/kg、2×106細胞/kg〜約8×106細胞/kg、3×106細胞/kg〜約6×106細胞/kg、3×106細胞/kg〜約7×106細胞/kg、3×106細胞/kg〜約8×106細胞/kg、4×106細胞/kg〜約6×106細胞/kg、4×106細胞/kg〜約7×106細胞/kg、4×106細胞/kg〜約8×106細胞/kg、5×106細胞/kg〜約6×106細胞/kg、5×106細胞/kg〜約7×106細胞/kg、5×106細胞/kg〜約8×106細胞/kg、または6×106細胞/kg〜約8×106細胞/kgである。
いくらかの用量変動が治療される対象の状態に応じて生じるのは必然であろう。投与担当者は、いずれにしても、個々の対象に適した用量を決定することになる。
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、異常ヘモグロビン症またはそれと関連付けられる状態の治療、予防、または改善するために使用され、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的BCL11A発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なBCL11A発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位(配列番号24)に突然変異が導入されている。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、サラセミアまたはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用される。本明細書で企図されるゲノム編集された細胞によって治療可能なサラセミアとしては、α−サラセミアおよびβ−サラセミアが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、β−サラセミアまたはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用され、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的BCL11A発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なBCL11A発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位(配列番号24)に突然変異が導入されている。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、鎌状赤血球症またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用される。特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、鎌状赤血球症またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用され、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的BCL11A発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なBCL11A発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子中のGATA−1結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、BCL11A遺伝子の第2のイントロン中のコンセンサスGATA−1結合部位(配列番号24)に突然変異が導入されている。
様々な実施形態において、対象は、対象におけるγ−グロビンの発現を増加させるのに有効な、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むある量のゲノム編集された細胞の投与を受ける。特定の実施形態において、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むゲノム編集された細胞におけるγ−グロビン遺伝子発現の量は、ゲノム編集を受けていない細胞におけるγ−グロビン遺伝子発現と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、もしくは少なくとも約1000倍、またはそれ以上増加する。
様々な実施形態において、対象は、対象におけるHbFのレベルを増加させるのに有効な、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むある量のゲノム編集された細胞の投与を受ける。特定の実施形態において、BCL11A遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むゲノム編集された細胞におけるHbFの量は、ゲノム編集を受けていない細胞におけるHbFの量と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、もしくは少なくとも約1000倍、またはそれ以上増加する。
当業者であれば、通常の方法を使用して、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を含む有効量の組成物の適切な投与経路および適正な投薬を決定することができる。また、ある特定の療法において、療法が効果をもたらすには、本明細書で企図される薬学的組成物の複数回投与が必要とされ得ることを認識することは、当業者であれば分かるはずである。
ゲノム編集された造血幹細胞および造血前駆細胞による療法を用いた治療に適している対象を治療するために使用される主な方法のうちの1つは、輸血である。このため、本明細書で企図される組成物および方法の最大の目標のうちの1つは、輸血の回数を減少させるか、または輸血の必要を排除することである。
特定の実施形態において、本薬物製品は1回投与される。
ある特定の実施形態において、本薬物製品は、1年、2年、5年、10年、またはそれ以上かけて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回、またはそれ以上投与される。
本明細書において引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および例示によりある程度詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変更および修正を行ってもよいことが、当業者には容易に明らかとなろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定するものではない。本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
実施例1
BCL11A遺伝子における赤血球エンハンサー中の非標準的I−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位の特定
BCL11A遺伝子中に存在するコアGATA−1モチーフ(CTGnnnnnnnWGATAR;配列番号24参照;図1)は、標準的I−OnuI「セントラル4」切断性モチーフ:ATTC、TTTC、ATAC、ATAT、TTAC、およびATTTを含まない。
BCL11A遺伝子における赤血球エンハンサー中の非標準的I−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位の特定
BCL11A遺伝子中に存在するコアGATA−1モチーフ(CTGnnnnnnnWGATAR;配列番号24参照;図1)は、標準的I−OnuI「セントラル4」切断性モチーフ:ATTC、TTTC、ATAC、ATAT、TTAC、およびATTTを含まない。
驚くべきことに、発明者らは、I−OnuIが、GATA−1モチーフを標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALの開発に好適な出発足場であることを見い出した。標的部位「TTAT」(配列番号25参照)を選択し、これは、その逆相補体「ATAA」がBCL11A遺伝子中のコアGATA−1モチーフ(配列番号24参照)に存在するためである。標準的I−OnuI切断部位ではないものの、「TTAT」は、野生型I−SmaMI LHE(I−OnuIと約45%同一)のためのセントラル4配列(配列番号30)である。図2A。
加えて、CCR5遺伝子を標的とするI−OnuIバリアントHE(配列番号31)のセントラル4特異性を、ハイスループット酵母表層提示インビトロエンドヌクレアーゼアッセイを使用してプロファイリングした(Jarjour,West−Foyle et al.,2009)。CCR5を標的とするHE(配列番号32)をコードするプラスミドを、表層提示のためにS.cerevisiaeに形質転換した後、「TTAT」を含む256個の可能性のあるセントラル4配列の各々を含有するCCR5標的部位DNA配列(配列番号33)を含む、PCRによって生成した二本鎖DNA基質に対する切断活性について試験した。特異性プロファイルにより、再プログラムされたI−OnuIが、非標準的「TTAT」セントラル4配列を含む標的部位を切断できることが示された。図2B。
I−OnuIを、BCL11A中のGATA−1モチーフを標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALの開発のための出発骨格として選択した。
実施例2
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とさせるためのI−OnuIの再プログラム
DNA認識インターフェース中に可変のアミノ酸残基を含有するモジュールライブラリを構築することによって、I−OnuIを、BCLL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とするように再プログラムした。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して、縮重コドンをI−OnuI DNA結合ドメインに組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをPCR鋳型として使用して、酵母株S.cerevisiaeにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、N末端またはC末端いずれかのI−OnuI DNA認識ドメインにおよび、約107〜108個の固有の形質転換体を含有した。結果として得られた表層提示ライブラリを、対応するドメインの「半部位」を含む標的部位(配列番号28〜29)に対する切断活性について、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。.図3。
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とさせるためのI−OnuIの再プログラム
DNA認識インターフェース中に可変のアミノ酸残基を含有するモジュールライブラリを構築することによって、I−OnuIを、BCLL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とするように再プログラムした。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して、縮重コドンをI−OnuI DNA結合ドメインに組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをPCR鋳型として使用して、酵母株S.cerevisiaeにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、N末端またはC末端いずれかのI−OnuI DNA認識ドメインにおよび、約107〜108個の固有の形質転換体を含有した。結果として得られた表層提示ライブラリを、対応するドメインの「半部位」を含む標的部位(配列番号28〜29)に対する切断活性について、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。.図3。
N末端およびC末端ドメインを再プログラムしたI−OnuI HEを提示する酵母を生成し、プラスミドDNAを抽出した。PCR反応を行って、再プログラムされたドメインを増幅させ、これを続いてS.cerevisiaeに形質転換し、再プログラムされたドメインの組合わせのライブラリを創出した。BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフに存在する標的部位(配列番号25)全体を認識する完全に再プログラムされたI−OnuIバリアントをこのライブラリから特定し、精製した。
実施例3
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼ
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とする再プログラムされたI−OnuI HEの活性を、染色体に組み込まれた蛍光レポーター系を使用して測定した(Certoら、2011)。BCL11A標的配列に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたI−OnuI HEを哺乳動物発現プラスミドにクローニングした後、個別にトランスフェクションを行って、蛍光mCherryタンパク質をコードするアウトオブフレーム遺伝子の上流でBCL11A標的配列を含有するように再プログラムしたHEK 293T線維芽細胞株にした。HEによる埋め込まれた標的部位の切断、および非相同末端結合(NHEJ)経路を介したDNA修復によって生じる小さな挿入または欠失の後続の蓄積により、3つの修復された遺伝子座のうち約1つが蛍光レポーター遺伝子を「インフレーム」に戻す。このため、mCherry蛍光は、染色体に埋め込まれた標的配列でのエンドヌクレアーゼ活性の読出しである。BCL11A標的部位に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたI−OnuI HEは、遺伝子染色体の背景においてmCherry発現の中等度の効率を示した。図4A。
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼ
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを標的とする再プログラムされたI−OnuI HEの活性を、染色体に組み込まれた蛍光レポーター系を使用して測定した(Certoら、2011)。BCL11A標的配列に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたI−OnuI HEを哺乳動物発現プラスミドにクローニングした後、個別にトランスフェクションを行って、蛍光mCherryタンパク質をコードするアウトオブフレーム遺伝子の上流でBCL11A標的配列を含有するように再プログラムしたHEK 293T線維芽細胞株にした。HEによる埋め込まれた標的部位の切断、および非相同末端結合(NHEJ)経路を介したDNA修復によって生じる小さな挿入または欠失の後続の蓄積により、3つの修復された遺伝子座のうち約1つが蛍光レポーター遺伝子を「インフレーム」に戻す。このため、mCherry蛍光は、染色体に埋め込まれた標的配列でのエンドヌクレアーゼ活性の読出しである。BCL11A標的部位に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたI−OnuI HEは、遺伝子染色体の背景においてmCherry発現の中等度の効率を示した。図4A。
第2のI−OnuIバリアントライブラリを、最初のレポータースクリーニングで特定したBCL11A標的部位(BCL11.A.B4、配列番号6)を標的とする再プログラムされたI−OnuI HEのうちの1つのランダム突然変異誘発を行うことによって生成した。加えて、触媒効率が向上したバリアントを単離する目的で、提示ベースのフローソーティングを、よりストリンジェントな切断条件下(pHを7.2に調整)で行った。図4B。このプロセスにより、親I−OnuIバリアントと比較してDNA認識インターフェースに2つのアミノ酸突然変異を含有し、親I−OnuIバリアントよりも約3倍高い率のmCherry発現細胞を有するI−OnuIバリアントであるBCL11A.B4.A3(配列番号7)が特定された。図4C。図5は、代表的なI−OnuIの相対的アライメント、およびDNA認識インターフェースを含む残基の位置情報を示す。
第3のI−OnuIバリアントライブラリを、2次スクリーニングで特定したBCL11A標的部位(BCL11A.B4.A3、配列番号7)を標的とする再プログラムされたI−OnuI HEのうちの1つのランダム突然変異誘発を行うことによって生成した。加えて、結合特性が向上したバリアントを単離するために、提示ベースのフローソーティングを、よりストリンジェントな親和性条件下(50pM)で行った。このプロセスにより、以下のI−OnuIバリアントが特定された:BCL11A.B4.A3.C7(配列番号8)、BCL11A.B4.A3.E3(配列番号9)、BCL11A.B4.A3.B6(配列番号10)、BCL11A.B4.A3.H4(配列番号11)、BCL11A.B4.A3.B12(配列番号12)、BCL11A.B4.A3.A7(配列番号13)、BCL11A.B4.A3.C2(配列番号14)、BCL11A.B4.A3.G8(配列番号15)、BCL11A.B4.A3.A1(配列番号16)、BCL11A.B4.A3.A5(配列番号17)、BCL11A.B4.A3.B6.2(配列番号18)、およびBCL11A.B4.A3.B7(配列番号19)。
実施例4
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼの親和性および特異性
I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3のDNA結合親和性および切断特異性を特性評価した。再プログラム中に特定されたBCL11A.B4.A3バリアントをコードするプラスミド(配列番号34)を、表層提示のためにS.cerevisiaeに形質転換した。I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3の親和性を平衡結合滴定によって決定し、平衡解離定数を、I−OnuIサブファミリーにおけるいくつかの他の野生型HEの範囲内である約500pMと推定した(図6A)。
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたI−OnuIホーミングエンドヌクレアーゼの親和性および特異性
I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3のDNA結合親和性および切断特異性を特性評価した。再プログラム中に特定されたBCL11A.B4.A3バリアントをコードするプラスミド(配列番号34)を、表層提示のためにS.cerevisiaeに形質転換した。I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3の親和性を平衡結合滴定によって決定し、平衡解離定数を、I−OnuIサブファミリーにおけるいくつかの他の野生型HEの範囲内である約500pMと推定した(図6A)。
連続置換分析を使用して、切断特異性を決定した。切断活性をDNA基質のパネルにわたって評定し、ここでは、各標的部位の位置(配列番号25)を3つの交互塩基対の各々に突然変異させた。図6B。CTDは、NTDよりも高い程度の切断特異性を示した。
BCL11A.B4.A3の標的特異性も評定し、これは、BCL11A.B4.A3が、標的部位に非天然セントラル4配列を含有する配列を標的とするように再プログラムされた最初のホーミングエンドヌクレアーゼであるためである。BCL11A標的部位内に256個全ての可能性のあるセントラル4配列を含むDNA基質を生成した(配列番号35)。各基質を、酵母表層に提示されたI−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3に対してアッセイした(図7)。図2Bに提示したデータと同様に、I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3は、TTATモチーフを含むが、天然のI−OnuIセントラル4の特異性を保持したセントラル4プロファイルを示した。
実施例5
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフの効率的な撹乱
Boisselら、2013に記載されている方法を使用して、BCL11A標的部位(配列番号26)の上流で11塩基対TALアレイ標的部位に対応するN末端10.5 TALアレイ(例えば、配列番号21および36)を付加することによって、I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3をmegaTALとしてフォーマットした。図8A。megaTALの別のバージョンは、Trex2(例えば、配列番号23および37)へのC末端融合を含む。
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフの効率的な撹乱
Boisselら、2013に記載されている方法を使用して、BCL11A標的部位(配列番号26)の上流で11塩基対TALアレイ標的部位に対応するN末端10.5 TALアレイ(例えば、配列番号21および36)を付加することによって、I−OnuIバリアントBCL11A.B4.A3をmegaTALとしてフォーマットした。図8A。megaTALの別のバージョンは、Trex2(例えば、配列番号23および37)へのC末端融合を含む。
BCL11A megaTAL編集効率を初代ヒトCD34+細胞中で評定した。これは、細胞を、サイトカインを補充した培地中で48〜72時間事前刺激した後、BCL11A megaTAL(例えば、配列番号36)および任意選択でTrex2融合タンパク質としてフォーマットしたmegaTAL(例えば、配列番号37)をコードするインビトロで転写したmRNAを用いて、細胞をエレクトロポレーションすることによって行った。エレクトロポレーションの後、細胞を、サイトカインを補充した培地中で1〜4日間培養し、その間、アリコートをゲノムDNA単離のために取り出した後、BCL11A標的部位にわたってPCR増幅を行った。
小さな挿入/欠失(インデル)事象の頻度を、Tracking of Indels by DEcomposition(TIDE、Brinkmanら、2014参照)、インビトロ切断アッセイ、およびコロニー配列決定を使用して測定した。図8Bは、アンプリコンインデルの代表的なTIDE分析を示し、BCL11A megaTALの標的部位における+1、−1、−2、−3、または−4のインデルの優位性を例示する。MegaTAL編集率を、BCL11A標的部位にわたるPCRアンプリコンが組換えBCL11Aホーミングエンドヌクレアーゼによって再切断されることが可能であるのかを試験することによって確認した。BCL11A megaTALまたはBCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質をコードするmRNAを用いた細胞の処理により、かなりの割合のアンプリコンが、組換えBCL11A megaTALによってもはや認識および切断されない程度にまで修飾された。図8C。インデルのスペクトルも、個々のコロニーのPCRアンプリコンをクローニングし配列決定することによって特性評価した。BCL11A megaTAL標的部位でのインデルのスペクトルを図8Dに示す。図8Eは、異なる初代CD34+ドナー細胞、様々な事前刺激ウィンドウ、細胞濃度、およびmRNA産生バッチを用いた複数の実験にたわるインデル分析を要約する。
DNA配列決定試験により、I−OnuIバリアントが、処理した細胞のかなり部分でGATA−1コンセンサスモチーフを撹乱することが示される。BCL11A megaTALの編集効率は、Trex2との融合によって向上した。
実施例6
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフでの効率的なHDR
BCL11A megaTAL mRNAを初代ヒトCD34+細胞にエレクトロポレーションして、BCL11A遺伝子中のGATA−1標的配列におけるAAVによって送達された導入遺伝子の相同組換え修復を評定した。BCL11A megaTAL標的部位に隣接する5´領域および3´領域に対してDNA相同性の配列間に配置されたBFPの発現を駆動する構成的プロモーターを含むAAV2/6ベクターを、標準的な方法を使用して調製した。図9A。初代ヒトCD34+細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、BCL11A megaTAL(例えば、配列番号36)をコードするmRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。細胞を、エレクトロポレーション前にまたはエレクトロポレーション後の回復ステップ中にAAVで形質導入した。細胞を、2〜10日間、サイトカインを補充した培地中で培養し、その間、アリコートを、相同組換え修復を測定するためのBFP発現のフローサイトメトリー分析のために取り出した。
BCL11A遺伝子中のGATA−1モチーフでの効率的なHDR
BCL11A megaTAL mRNAを初代ヒトCD34+細胞にエレクトロポレーションして、BCL11A遺伝子中のGATA−1標的配列におけるAAVによって送達された導入遺伝子の相同組換え修復を評定した。BCL11A megaTAL標的部位に隣接する5´領域および3´領域に対してDNA相同性の配列間に配置されたBFPの発現を駆動する構成的プロモーターを含むAAV2/6ベクターを、標準的な方法を使用して調製した。図9A。初代ヒトCD34+細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、BCL11A megaTAL(例えば、配列番号36)をコードするmRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。細胞を、エレクトロポレーション前にまたはエレクトロポレーション後の回復ステップ中にAAVで形質導入した。細胞を、2〜10日間、サイトカインを補充した培地中で培養し、その間、アリコートを、相同組換え修復を測定するためのBFP発現のフローサイトメトリー分析のために取り出した。
BFP+細胞のかなりの頻度が、単剤対照試料と比較して、megaTALおよびAAVの試料中で観察された。図9B。データにより、過渡的エピソーム性AAVゲノムからのBFP発現が、形質導入後、培養の2〜4日間にわたり消失するため、BFP含有導入遺伝子によるBCL11A標的配列の相同組換え修復からの安定なBFP発現が示される。
メチルセルロースアッセイを行って、megaTALベースのNHEJまたはHDRによって初代CD34+細胞の系列特性が改変されたかどうかを決定した。初代ヒトCD34+細胞を、エレクトロポレーション後の回復ステップの後に細胞を計数し、メチルセルロース培地に14日間プレートしたことを除き、本実施例の前段落に記載したとおりに処理した。14日間培養した後、コロニーを頻度および形態について採点した。BCL11A megaTALで処理した試料は、対照試料と同等の成熟コロニー表現型頻度を示し、BCL11A遺伝子座のイントロン2中のGATA−1部位におけるゲノム編集と関連付けられる明白な系列の歪みの証拠を示さなかった。図10A。
加えて、BCL11A megaTALおよびAAVで処理した試料は、2連の培養において30%および29.8%のBFP+細胞を示した一方、CCR5 megaTALに露出させたかまたはヌクレアーゼに露出させていない細胞は、1%未満のBFP+細胞しかもたらさなかった。図10B。これらの結果は、未分化造血幹細胞および造血前駆細胞中のBCL11A megaTALによって媒介される顕著な相同組換え修復と一致した。
実施例7
BCL11A標的化MegaTALで編集されたCD34+細胞によりHbFレベルが上方調節される
初代ヒトCD34+細胞中のBCL11A遺伝子中のGATA−1配列を効率的に撹乱するMegaTALにより、編集された細胞中のHbFレベルが増加した。初代ヒトCD34+細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、BCL11A megaTALとTrex2との融合物(例えば、配列番号37)の存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、培養されたCD34+細胞のあいだで赤血球分化を促進する、血清、rhSCF、rhIL−3、およびrhEPOを含有するIMDM系培地中で5〜7日間培養した。分化赤血球細胞中のHbFレベルを、直接共役させた抗HbF抗体を使用する染色およびフローサイトメトリーによって、またはグロブリン鎖のHPLC分析によって分析した。
BCL11A標的化MegaTALで編集されたCD34+細胞によりHbFレベルが上方調節される
初代ヒトCD34+細胞中のBCL11A遺伝子中のGATA−1配列を効率的に撹乱するMegaTALにより、編集された細胞中のHbFレベルが増加した。初代ヒトCD34+細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、BCL11A megaTALとTrex2との融合物(例えば、配列番号37)の存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、培養されたCD34+細胞のあいだで赤血球分化を促進する、血清、rhSCF、rhIL−3、およびrhEPOを含有するIMDM系培地中で5〜7日間培養した。分化赤血球細胞中のHbFレベルを、直接共役させた抗HbF抗体を使用する染色およびフローサイトメトリーによって、またはグロブリン鎖のHPLC分析によって分析した。
フローサイトメトリーによるHbF+細胞の頻度は、対照の培養細胞と比較して、BCL11A megaTAL−Trex2融合物をコードするmRNAによってエレクトロポレーションした細胞中で増加した。図11A。HPLCによるHbF+細胞中の大幅な増加も、対照の培養細胞と比較して、BCL11A megaTAL−Trex2融合物をコードするmRNAによってエレクトロポレーションした細胞中で観察された。図11B。これらのデータにより、BCL11A遺伝子中のGATA−1部位を標的とするBCL11A megaTALがγ−グロビン遺伝子発現の抑圧を解除することで、β−グロビン発現遺伝子に対するγ−グロビンの割合が増加し、それにより、編集された赤血球細胞中のHbFレベルが増加することが示される。
実施例8
異種移植モデルにおけるヒト初代長期的NSG再ポピュレーション細胞中の耐久性のあるゲノム編集
導入
ヒト初代CD34+細胞を、megaTALによってエレクトロポレーションし、NSGマウスに移植して、移植後の造血系の長期的再構成に寄与する、長期的再ポピュレーション造血幹細胞中のゲノム編集の耐久性を決定した。
異種移植モデルにおけるヒト初代長期的NSG再ポピュレーション細胞中の耐久性のあるゲノム編集
導入
ヒト初代CD34+細胞を、megaTALによってエレクトロポレーションし、NSGマウスに移植して、移植後の造血系の長期的再構成に寄与する、長期的再ポピュレーション造血幹細胞中のゲノム編集の耐久性を決定した。
方法
新たなヒト動員末梢血(mPB)CD34+細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター(5%のCO2)においてサイトカイン含有培地(SCF、TPO、FLT3−L)中で48時間事前刺激した。事前刺激の後、細胞を採取し、数え上げた。細胞を、25×106細胞の6つの群に分け、400μLのエレクトロポレーション緩衝液に懸濁させた。ビヒクルを用いるか、またはBCL11A megaTAL、BCL11A megaTAL−Trex2、CCR5 megaTAL、およびCCR5 megaTAL−Trex2をコードするmRNAを100μg/mLの濃度で用いて、MaxCyteエレクトロポレーションデバイスおよびOC400キュベットを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞をフラスコに移し、サイトカイン含有培地(SCF、TPO、FLT3−L、IL−3)によって2×106細胞/mLに希釈し、約20時間30℃でインキュベートした。エレクトロポレーションの翌日、細胞を移植の前に凍結保存した。
新たなヒト動員末梢血(mPB)CD34+細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター(5%のCO2)においてサイトカイン含有培地(SCF、TPO、FLT3−L)中で48時間事前刺激した。事前刺激の後、細胞を採取し、数え上げた。細胞を、25×106細胞の6つの群に分け、400μLのエレクトロポレーション緩衝液に懸濁させた。ビヒクルを用いるか、またはBCL11A megaTAL、BCL11A megaTAL−Trex2、CCR5 megaTAL、およびCCR5 megaTAL−Trex2をコードするmRNAを100μg/mLの濃度で用いて、MaxCyteエレクトロポレーションデバイスおよびOC400キュベットを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞をフラスコに移し、サイトカイン含有培地(SCF、TPO、FLT3−L、IL−3)によって2×106細胞/mLに希釈し、約20時間30℃でインキュベートした。エレクトロポレーションの翌日、細胞を移植の前に凍結保存した。
細胞を解凍し、洗浄し、二等分に分け、2mLのSCGM+サイトカインまたは赤血球分化培地に懸濁させ、標準的な12ウェルの非接着性組織培養プレートに移した。SCGM+サイトカイン中で培養した細胞を、最大でさらに6日間、標準的な加湿組織培養インキュベーター(5%のCO2)中で維持し、細胞を、増殖曲線を確立する目的で培養にわたって数え上げた。加えて、5日間培養した後、以下で詳述するインデル頻度の分析のために細胞のサブセットを収集した。赤血球分化培地中で培養した細胞を、最大で3週間、または細胞の少なくとも30%が赤血球分化のマーカーであるグリコホリンA+およびCD71+となるまで培養した。十分なレベルの赤血球分化が決定されたら、細胞を洗浄し、水中に再懸濁させ、ドライアイス上で瞬間冷凍した。その後、抽出したタンパク質を、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(IE−HPLC)によってヘモグロビン含有量について分析した。
洗浄した細胞を、200μLのSCGMに再懸濁させた後、サイトカインを補充したメチルセルロース(例えば、Methocult M4434 Classic)の3mLのアリコートに移した。次に、1.1mLを、先の丸い16ゲージの針を使用して平行な35mm組織培養皿に移した。皿を、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で14〜16日間維持し、コロニーを、サイズ、形態、および細胞構成について採点した。
ゲノムDNAを細胞から抽出し、PCR増幅を行って、目的となる領域を増幅させた。PCRのクリーニング後、アンプリコンをMiseq分析に取り入れ、標的化アンプリコン再配列決定によって挿入および欠失事象について分析した。
遺伝子編集がヒト長期造血幹細胞に与える影響を評定するために、対照およびmegaTALで処理した細胞を、解凍し、洗浄した後、部分的に骨髄破壊した成体NSGマウスの尾静脈に移植した。マウスは、標準的IACUC動物愛護ガイドラインに従って無菌環境に収容した。末梢血(PB)および骨髄(BM)を、それぞれ移植後2カ月および4カ月で採取し、インデル頻度、抗hCD45抗体(BD#561864)を用いた染色とその後のフローサイトメトリー分析によるヒト細胞の生着、および赤血球分化後のHbF誘導について分析した。
TAL処理によるHbF誘導の評定を目的として、Miltenyi小規模カラムを使用して、BMをCD34+富化した。次に、CD34+細胞を、最大で3週間、または細胞の少なくとも30%がCD71+およびGPA+となるまで、赤血球分化培養に置いた。その後、細胞を、IE−HPLCによってヘモグロビン含有量について分析した。
結果
megaTALエレクトロポレーションはCFC形成に影響しない
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。各処理群から500個の細胞をMethoCult(H4434)に移し、半固体培養を開始した。2週間培養した後、造血コロニーを、STEMVision(Stemcell Technologies)を使用して撮像し、数え上げた。megaTAL mRNAを用いてエレクトロポレーションした細胞は、コロニー形成、群あたりのコロニーの総数、または骨髄、赤血球、および幹細胞様表現型の歪みにおける差を示さなかった。図12。
megaTALエレクトロポレーションはCFC形成に影響しない
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。各処理群から500個の細胞をMethoCult(H4434)に移し、半固体培養を開始した。2週間培養した後、造血コロニーを、STEMVision(Stemcell Technologies)を使用して撮像し、数え上げた。megaTAL mRNAを用いてエレクトロポレーションした細胞は、コロニー形成、群あたりのコロニーの総数、または骨髄、赤血球、および幹細胞様表現型の歪みにおける差を示さなかった。図12。
megaTAL−Trex2融合タンパク質は編集率を増加させる
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。次に、細胞を5日間サイトカイン含有培地中で培養した後、インデル頻度分析を行った。CCR5またはBCL11Aのいずれかに向けられたhCD34+細胞megaTALの処理により、約10%のインデルが生成された。CCR5またはBCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質により、編集率は、約30〜35%のインデルへとそれぞれ2.9倍および4.1倍増加した。バックグラウンド編集率は1%未満であった。図13。
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。次に、細胞を5日間サイトカイン含有培地中で培養した後、インデル頻度分析を行った。CCR5またはBCL11Aのいずれかに向けられたhCD34+細胞megaTALの処理により、約10%のインデルが生成された。CCR5またはBCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質により、編集率は、約30〜35%のインデルへとそれぞれ2.9倍および4.1倍増加した。バックグラウンド編集率は1%未満であった。図13。
BCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質は胎児ヘモグロビン(HbF)を誘導する
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物を解凍し、数え上げ、赤血球分化培養に置いた。約3週間培養した後、赤血球分化のマーカー、細胞を採取し、洗浄し、水に,溶解させた。タンパク質を、IE−HPLCによってヘモグロビン含有量について分析した。この細胞ロットにおけるHbFのバックグラウンドレベルは約18%であった。細胞に、CCR5 megaTAL、CCR5 megaTAL−Trex2 megaTAL融合タンパク質、またはBCL11A megaTALをコードするmRNAを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、BCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質を用いてエレクトロポレーションした細胞は、処理していない細胞と比較して、HbFを64%増加させ、約28%のHbFを達成した。
凍結保存した対照およびmegaTALで処理した小規模薬物を解凍し、数え上げ、赤血球分化培養に置いた。約3週間培養した後、赤血球分化のマーカー、細胞を採取し、洗浄し、水に,溶解させた。タンパク質を、IE−HPLCによってヘモグロビン含有量について分析した。この細胞ロットにおけるHbFのバックグラウンドレベルは約18%であった。細胞に、CCR5 megaTAL、CCR5 megaTAL−Trex2 megaTAL融合タンパク質、またはBCL11A megaTALをコードするmRNAを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、BCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質を用いてエレクトロポレーションした細胞は、処理していない細胞と比較して、HbFを64%増加させ、約28%のHbFを達成した。
長期的再ポピュレーション細胞における編集頻度
編集率、またはインデルの頻度を、グラフト(前)、移植後2カ月のPB分析(2カ月のPBL)、および4カ月のBM編集分析(4カ月のBM)の間で比較した。PCR増幅をTAL標的部位にわたって行い、アンプリコンを、次世代配列決定を使用して配列決定した。ゲノム編集率は、BCL11A−Trex2 megaTALを用いてエレクトロポレーションしたCD34+細胞において4カ月の時点で20%超のままであった。図15。
編集率、またはインデルの頻度を、グラフト(前)、移植後2カ月のPB分析(2カ月のPBL)、および4カ月のBM編集分析(4カ月のBM)の間で比較した。PCR増幅をTAL標的部位にわたって行い、アンプリコンを、次世代配列決定を使用して配列決定した。ゲノム編集率は、BCL11A−Trex2 megaTALを用いてエレクトロポレーションしたCD34+細胞において4カ月の時点で20%超のままであった。図15。
BCL11A megaTAL−Trex2融合タンパク質は長期的再ポピュレーション細胞中のHbFを増加させる
NSG BMから生じた赤血球分化ヒトCD34+富化細胞をIE−HPLCによって分析した。結果として得られるHbFレベルは、移植片のHbFレベルを映す。これらの培養物におけるバックグラウンドHbFレベルは約11%であった。細胞に、CCR5 megaTAL、CCR5 megaTAL−Trex2 megaTAL融合タンパク質、またはBCL11A megaTALをコードするmRNAを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、BCL11A−Trex2 megaTALを用いた治療により、HbF産生は約18%増加した。これは、対照細胞と比較して50%を超える増加である。
NSG BMから生じた赤血球分化ヒトCD34+富化細胞をIE−HPLCによって分析した。結果として得られるHbFレベルは、移植片のHbFレベルを映す。これらの培養物におけるバックグラウンドHbFレベルは約11%であった。細胞に、CCR5 megaTAL、CCR5 megaTAL−Trex2 megaTAL融合タンパク質、またはBCL11A megaTALをコードするmRNAを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、BCL11A−Trex2 megaTALを用いた治療により、HbF産生は約18%増加した。これは、対照細胞と比較して50%を超える増加である。
結論
BCL11A megaTALは、移植された細胞の編集されたCD34+集団内の長期的な再ポピュレーション造血幹細胞集団の耐久性のあるゲノム編集と一致して、高いゲノム編集率を生成する。
BCL11A megaTALは、移植された細胞の編集されたCD34+集団内の長期的な再ポピュレーション造血幹細胞集団の耐久性のあるゲノム編集と一致して、高いゲノム編集率を生成する。
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を有する等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
Claims (109)
- ヒトB細胞リンパ腫/白血病11A(BCL11A)遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントを含む、ポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)バリアントである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記HEバリアントの生物学的に活性な断片を含む、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠く、請求項3に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、4個のN末端アミノ酸を欠く、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、8個のN末端アミノ酸を欠く、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠く、請求項3に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、C末端アミノ酸を欠く、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、2個のC末端アミノ酸を欠く、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択される、LHEのバリアントである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択される、LHEのバリアントである、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、I−OnuI LHEバリアントである、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、1個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を、配列番号1〜19に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の26、28、30、32、34、35、36、37、40、41、42、44、48、50、53、68、70、72、76、78、80、82、138、143、159、178、180、184、186、189、190、191、192、193、195、201、203、207、223、225、227、232、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、L26R、L26Y、R28S、R28G、R30Q、R30H、N32R、N32S、N32K、N33S、K34D、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、E42R、G44T、G44R、T48I、T48G、T48V、H50R、D53E、V68K、V68R、A70N、A70E、A70N、A70Q、A70L、A70S、S72A、S72T、S72V、S72M、A76L、A76H、A76R、S78Q、K80R、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eのうちの少なくとも5個、少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72A、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R30Q、N32S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32K、K34N、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、T48I、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28G、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42R、G44T、H50R、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30H、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72T、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26R、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、V68K、A70N、S72TA76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26Y、R28S、R30Q、N32R、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68R、A70E、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、D53E、V68K、A70N、S72T、A76L、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、S72V、A76R、S78Q、K80V、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70Q、S72M、A76R、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48G、V68K、A70L、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号1〜5に示されるI−OnuI LHEアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換:L26V、R28S、R30Q、N32R、N33S、K34D、S35Y、S36A、V37T、S40R、T41I、E42H、G44R、T48V、V68K、A70S、S72V、A76H、S78Q、K80R、T82Y、L138M、T143N、S159P、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、およびT240Eを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号6〜19のいずれか1項に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号6に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号7に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号9に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号10に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号11に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号12に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号13に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号14に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号15に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号16に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号17に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号18に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記HEバリアントが、配列番号19に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- DNA結合ドメインをさらに含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記DNA結合ドメインが、TALE DNA結合ドメインおよびジンクフィンガーDNA結合ドメインからなる群から選択される、請求項46に記載のポリペプチド。
- 前記TALE DNA結合ドメインが、約9.5のTALE反復単位〜約15.5のTALE反復単位を含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- 前記TALE DNA結合ドメインが、前記BCL11A遺伝子中のポリヌクレオチド配列と結合する、請求項47または請求項48に記載のポリペプチド。
- 前記TALE DNA結合ドメインが、配列番号26に示されるポリヌクレオチド配列と結合する、請求項47〜48のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項47に記載のポリペプチド。
- ペプチドリンカーおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項1〜51のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ウイルス性自己切断型2Aペプチドおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項1〜52のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼ、または鋳型非依存性DNAポリメラーゼ活性を有する、請求項52または請求項53に記載のポリペプチド。
- 前記末端プロセシング酵素が、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項52〜54のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記ヒトBCL11A遺伝子を、配列番号25または配列番号27に示されるポリヌクレオチド配列において切断する、請求項1〜55のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、mRNA。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、cDNA。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
- 請求項60に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドによって導入される1個以上のゲノム修飾を含む、細胞。
- 前記細胞が造血細胞である、請求項61〜64のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項61〜65のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞がCD34+細胞である、請求項61〜66のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞がCD133+細胞である、請求項61〜67のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項61〜68のいずれか1項に従う細胞を含む、組成物。
- 請求項61〜68のいずれか1項に従う細胞および生理学的に許容される担体を含む、組成物。
- BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、前記BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出される、方法。
- BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、前記BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、前記破断が、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、方法。
- BCL11A遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項1〜56のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとドナー修復鋳型とを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、BCL11A遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、前記ドナー修復鋳型が、前記二本鎖破断(DSB)の部位における相同組換え修復(HDR)によって、前記BCL11A遺伝子に組み込まれる、方法。
- 前記細胞が造血細胞である、請求項71〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項71〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD34+細胞である、請求項71〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD133+細胞である、請求項71〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがmRNAである、請求項71〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 5´−3´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが前記細胞に導入される、請求項71〜78のいずれか1項に記載の方法。
- Trex2またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが前記細胞に導入される、請求項71〜79のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー修復鋳型が、前記DSBのBCL11A遺伝子配列5´に相同である5´相同アームと、前記DSBのBCL11A遺伝子配列3´に相同である3´相同アームと、を含む、請求項73〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記5´相同アームおよび3´相同アームの長さが、独立して、約100bp〜約2500bpから選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記5´相同アームおよび3´相同アームの長さが、独立して、約600bp〜約1500bpから選択される、請求項81または請求項82に記載の方法。
- 前記5´相同アームが約1500bpであり、前記3´相同アームが約1000bpである、請求項81〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記5´相同アームが約600bpであり、前記3´相同アームが約600bpである、請求項81〜84のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルスベクターを使用して、前記ドナー修復鋳型を前記細胞に導入する、請求項73〜85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである、請求項86に記載の方法。
- 前記rAAVが、AAV2由来の1個以上のITRを有する、請求項87に記載の方法。
- 前記rAAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する、請求項87または請求項88に記載の方法。
- 前記rAAVが、AAV2血清型またはAAV6血清型を有する、請求項87〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項87に記載の方法。
- 前記レンチウイルスがインテグラーゼ欠乏レンチウイルス(IDLV)である、請求項91に記載の方法。
- 異常ヘモグロビン症の少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、対象に有効量の請求項69または請求項70に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項93に記載の方法。
- 前記組成物の前記量が、前記対象の輸血を減少させるのに有効である、請求項93または94に記載の方法。
- サラセミアの少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、前記対象に有効量の請求項69または請求項70に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項96に記載の方法。
- 前記対象が、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項96に記載の方法。
- 前記対象が、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項98に記載の方法。
- 鎌状赤血球症の少なくとも1つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、前記対象に有効量の請求項69または請求項70に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項100に記載の方法。
- 対象におけるγ−グロビンの量を増加させる方法であって、前記対象に有効量の請求項69または請求項70の組成物を投与することを含む、方法。
- 対象における胎児ヘモグロビン(HbF)の量を増加させる方法であって、前記対象に有効量の請求項69または請求項70の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が異常ヘモグロビン症を有する、請求項102または請求項103に記載の方法。
- 前記対象が、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項104に記載の方法。
- 前記対象が、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項104に記載の方法。
- 前記対象が、βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+、またはβ+/β+からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項106に記載の方法。
- 前記対象が、鎌状赤血球症、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項104に記載の方法。
- 前記対象が、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS、またはβS/βSからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項108に記載の方法。
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