JP2019528691A - ゲノム編集エンハンサー - Google Patents
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Abstract
本発明は、多数の疾患、障害、および状態の治療、予防、または寛解のための遺伝子治療組成物用の改善された組成物を提供する。細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。【選択図】図8
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2016年8月19日に出願された米国仮特許出願第62/377,357号の利益を米国特許法第119条の下で主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2016年8月19日に出願された米国仮特許出願第62/377,357号の利益を米国特許法第119条の下で主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に関連付けられる配列リストは、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列リストが含まれるテキストファイルの名称は、BLBD_074_01WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、4KBであり、2017年8月18日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webにより電子的に提出される。
本出願に関連付けられる配列リストは、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列リストが含まれるテキストファイルの名称は、BLBD_074_01WO_ST25.txtである。本テキストファイルは、4KBであり、2017年8月18日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webにより電子的に提出される。
技術分野
背景
本発明は概して、改善された遺伝子治療組成物およびそれを作成する方法に一部関する。より具体的には、本発明は、改善されたゲノム編集組成物および遺伝子治療薬ならびにそれを作製する方法に関する。
背景
本発明は概して、改善された遺伝子治療組成物およびそれを作成する方法に一部関する。より具体的には、本発明は、改善されたゲノム編集組成物および遺伝子治療薬ならびにそれを作製する方法に関する。
関連技術の記載
3000個のヒト遺伝子における突然変異が既に疾患表現型(www.omim.org/statistics/geneMap)と関連付けられており、より多くの疾患に関連する遺伝的変異が驚くほど急速に明らかにされている。しかしながら、医薬品開発における妥当な治療的仮説および多大な努力にもかかわらず、強い遺伝的寄与を示す疾患を治療するための小分子の使用における成功はごくわずかである。一遺伝子性の、浸透性の高い疾患の治療のためのメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連ヌクレアーゼCas9等のプログラム可能なヌクレアーゼに基づく、新たに出現するゲノム編集ストラテジーの巨大な可能性は、未だに実現されていない。ヌクレアーゼに基づくゲノム編集ストラテジーを実行するための具体的な障害として、限定されないが、ゲノム編集効率の低さ、ヌクレアーゼ特異性、および送達の困難性が挙げられる。ほとんどのゲノム編集ストラテジーに関する当該技術分野の現状は、これらの基準のいくつかまたは全てを達成できていない。
3000個のヒト遺伝子における突然変異が既に疾患表現型(www.omim.org/statistics/geneMap)と関連付けられており、より多くの疾患に関連する遺伝的変異が驚くほど急速に明らかにされている。しかしながら、医薬品開発における妥当な治療的仮説および多大な努力にもかかわらず、強い遺伝的寄与を示す疾患を治療するための小分子の使用における成功はごくわずかである。一遺伝子性の、浸透性の高い疾患の治療のためのメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連ヌクレアーゼCas9等のプログラム可能なヌクレアーゼに基づく、新たに出現するゲノム編集ストラテジーの巨大な可能性は、未だに実現されていない。ヌクレアーゼに基づくゲノム編集ストラテジーを実行するための具体的な障害として、限定されないが、ゲノム編集効率の低さ、ヌクレアーゼ特異性、および送達の困難性が挙げられる。ほとんどのゲノム編集ストラテジーに関する当該技術分野の現状は、これらの基準のいくつかまたは全てを達成できていない。
発明の簡単な要旨
本発明は概して、より安全かつより有効な遺伝子治療薬を開発するために、改善されたゲノム編集組成物およびそれを使用する方法に一部関する。
本発明は概して、より安全かつより有効な遺伝子治療薬を開発するために、改善されたゲノム編集組成物およびそれを使用する方法に一部関する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
特定の実施形態において、細胞集団は、幹細胞を含む。
いくつかの実施形態において、細胞集団は、造血細胞を含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、CD34+細胞、CD133+細胞、CD34+CD133+細胞、またはCD34+CD38LoCD90+CD45RA−細胞を含む。
特定の実施形態において、細胞集団は、免疫エフェクター細胞を含む。
追加の実施形態において、細胞集団は、CD3+、CD4+、CD8+細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
ある特定の実施形態において、細胞集団は、T細胞を含む。
さらなる実施形態において、細胞集団は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞を含む。
いくつかの実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
種々の実施形態において、本発明は、一部、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、DNAインターカレーターである。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、単官能性DNAインターカレーター、二官能性DNAインターカレーター、または多官能性DNAインターカレーターからなる群から選択される。
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、1,8−ナフタルイミド、4’6−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン(actinodaphnidine)、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、BOBO−1、BOBO−3、ボルジン、BO−PRO−1、BO−PRO−3、ブブロカプニン(bublocapnine)、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、DAPI、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、GelStar、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、JOJO−1、JO−PRO−1、キネチンリボシド、コクサイニン(kokusainine)、ロベリン、LOLO−1、LO−PRO−1、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、OliGreen、パルマチン、フェナントリジン、PicoGreen、ピラルビシン、ポリピリジル、POPO−1、POPO−3、PO−PRO−1、PO−PRO−3、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、RiboGreen、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、SYBR DX、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTO−11、SYTO−12、SYTO−13、SYTO−14、SYTO−15、SYTO−16、SYTO−17、SYTO−20、SYTO−21、SYTO−22、SYTO−23、SYTO−24、SYTO−25、SYTO−40、SYTO−41、SYTO−42、SYTO−43、SYTO−44、SYTO−45、SYTO−59、SYTO−60、SYTO−61、SYTO−62、SYTO−63、SYTO−64、SYTO−80、SYTO−81、SYTO−82、SYTO−83、SYTO−84、SYTO−85、SYTOX blue、SYTOX green、SYTOX orange、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、TO−PRO−1、TO−PRO−3、TO−PRO−5、TOTO−1、TOTO−3、ウサンバレンシン、YO−PRO−1、YO−PRO−3、YOYO−1、YOYO−3、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、およびハルミンからなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
いくつかの実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン(9−アミノアクリジン)である。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
特定の実施形態において、本発明は、一部、細胞、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
追加の実施形態において、本発明は、一部、細胞、9−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
ある特定の実施形態において、本発明は、一部、細胞、9−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
いくつかの実施形態において、本発明は、一部、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
さらなる実施形態において、本発明は、一部、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
特定の実施形態において、本発明は、一部、9−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、9−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物を企図する。
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)から遺伝子操作される。
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される。
いくつかの実施形態において、メガTALは、TALE DNA結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態において、TALE結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、TALENは、TALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
追加の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される。
さらなる実施形態において、ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む。
追加の実施形態において、ZFNは、TALE結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される。
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、CRISPR/Casヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態において、Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である。
追加の実施形態において、Casヌクレアーゼは、1つ以上のTALE DNA結合ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、tracrRNAと、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のcrRNAと、をさらに含む。
特定の実施形態において、組成物は、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のsgRNAをさらに含む。
追加の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性である。
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、Trex2またはその生物学的に活性な断片の3−5’エキソヌクレアーゼ活性である。
ある特定の実施形態において、組成物は、末端プロセシング酵素、または末端プロセシング酵素をコードするmRNAをさらに含む。
追加の実施形態において、末端プロセシング酵素は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す。
いくつかの実施形態において、末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、組成物は、βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む。
ある特定の実施形態において、組成物は、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;ホルモン;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
追加の実施形態において、組成物は、人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法であって、細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含み、ゲノム編集エンハンサーの存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させる方法を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団における相同組み換え修復(HDR)を増大させる方法であって、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、標的部位に二本鎖切断(DSB)を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団にドナー修復鋳型を導入することと、を含み、ゲノム編集エンハンサーおよびドナー修復鋳型の存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、相同組み換え修復(HDR)による標的部位におけるドナー修復鋳型の組み込みの頻度を増加させる方法を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団における非相同末端結合(NHEJ)を増加させる方法であって、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、標的部位に二本鎖切断(DSB)を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、を含み、ゲノム編集エンハンサーの存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、標的部位におけるNHEJの頻度を増加させる方法を企図する。
さらなる実施形態において、細胞は造血細胞である。
追加の実施形態において、細胞は免疫エフェクター細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、CD3+、CD4+、CD8+、またはそれらの組み合わせである。
特定の実施形態において、細胞はT細胞である。
追加の実施形態において、細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である。
さらなる実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
ある特定の実施形態において、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
さらなる実施形態において、細胞はCD34+細胞である。
特定の実施形態において、細胞はCD133+細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞はCD34+CD38LoCD90+CD45RA−細胞である。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはDNAインターカレーターである。
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、単官能性DNAインターカレーター、二官能性DNAインターカレーター、または多官能性DNAインターカレーターからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、1,8−ナフタルイミド、4’6−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン(actinodaphnidine)、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、BOBO−1、BOBO−3、ボルジン、BO−PRO−1、BO−PRO−3、ブブロカプニン(bublocapnine)、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、DAPI、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、GelStar、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、JOJO−1、JO−PRO−1、キネチンリボシド、コクサイニン(kokusainine)、ロベリン、LOLO−1、LO−PRO−1、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、OliGreen、パルマチン、フェナントリジン、PicoGreen、ピラルビシン、ポリピリジル、POPO−1、POPO−3、PO−PRO−1、PO−PRO−3、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、RiboGreen、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、SYBR DX、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTO−11、SYTO−12、SYTO−13、SYTO−14、SYTO−15、SYTO−16、SYTO−17、SYTO−20、SYTO−21、SYTO−22、SYTO−23、SYTO−24、SYTO−25、SYTO−40、SYTO−41、SYTO−42、SYTO−43、SYTO−44、SYTO−45、SYTO−59、SYTO−60、SYTO−61、SYTO−62、SYTO−63、SYTO−64、SYTO−80、SYTO−81、SYTO−82、SYTO−83、SYTO−84、SYTO−85、SYTOX blue、SYTOX green、SYTOX orange、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、TO−PRO−1、TO−PRO−3、TO−PRO−5、TOTO−1、TOTO−3、ウサンバレンシン、YO−PRO−1、YO−PRO−3、YOYO−1、YOYO−3、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
追加の実施形態において、編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、およびハルミンからなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはアミナクリン(9−アミノアクリジン)である。
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される。
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)から遺伝子操作される。
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、メガTALは、TALE DNA結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態において、TALE結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される。
いくつかの実施形態において、TALENは、TALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
さらなる実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される。
ある特定の実施形態において、ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む。
ある特定の実施形態において、ZFNは、TALE結合ドメインを含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む。
さらなる実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される。
追加の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、CRISPR/Casヌクレアーゼを含む。
いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である。
ある特定の実施形態において、Casヌクレアーゼは、1つ以上のTALE DNA結合ドメインをさらに含む。
特定の実施形態において、組成物は、tracrRNAと、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のcrRNAと、をさらに含む。
追加の実施形態において、組成物は、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のsgRNAをさらに含む。
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む。
いくつかの実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性である。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、Trex2またはその生物学的に活性な断片の3−5’エキソヌクレアーゼ活性である。
特定の実施形態において、組成物は、末端プロセシング酵素、または末端プロセシング酵素をコードするmRNAをさらに含む。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す。
追加の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態において、方法は、βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む。
さらなる実施形態において、方法は、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;ホルモン;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
特定の実施形態において、方法は、人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で企図される方法によって生成される細胞を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で企図される細胞を含む組成物を企図する。
種々の実施形態において、本発明は、一部、薬学的に許容される担体および本明細書で企図される細胞を含む薬学的組成物を企図する。
配列識別子の簡単な説明
配列番号1〜11は、種々のリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号1〜11は、種々のリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号12〜14は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
詳細な説明
A.概要
遺伝子治療薬は、十分な治療遺伝子の発現を得るため、かつ/または、遺伝子治療の有効性に悪影響を及ぼすかもしくはその有効性を低減する遺伝子の発現を排除するために、ゲノム編集に一部依存し得る。ゲノム編集ストラテジーを実行する際の主な制約の1つは、ゲノム編集の効率が低いことである。改善された遺伝子治療薬を生成するために本明細書で企図されるゲノム編集ストラテジー、ならびにそれを作製および使用する方法は、当該技術分野が抱えるこれらおよび他の問題を解決する。
A.概要
遺伝子治療薬は、十分な治療遺伝子の発現を得るため、かつ/または、遺伝子治療の有効性に悪影響を及ぼすかもしくはその有効性を低減する遺伝子の発現を排除するために、ゲノム編集に一部依存し得る。ゲノム編集ストラテジーを実行する際の主な制約の1つは、ゲノム編集の効率が低いことである。改善された遺伝子治療薬を生成するために本明細書で企図されるゲノム編集ストラテジー、ならびにそれを作製および使用する方法は、当該技術分野が抱えるこれらおよび他の問題を解決する。
本明細書で企図される種々の実施形態は、概して、改善されたゲノム編集組成物に一部関する。ゲノム編集組成物は、一遺伝子性の障害、疾患、および状態、例えば、異常ヘモグロビン症、癌、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を治療するための遺伝子治療薬の生成における飛躍的改善を意味する。本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法を用いて製造される遺伝子治療薬は、治療薬を生成するための商品原価の低下、歴史的に低いゲノム編集効率を有する細胞に対する幅広い範囲の遺伝子治療薬、および遺伝子治療組成物の力価の増加を含むがこれらに限定されない、既存の遺伝子治療薬と比較して数多くの利点を提供する。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、遺伝子治療薬を製造するために使用されるヌクレアーゼに基づく遺伝子編集ストラテジーにおいて相同組み換え修復(HDR)および非相同末端結合(NHEJ)の速度を高めるゲノム編集エンハンサーを含む。
種々の実施形態は、ゲノム編集エンハンサーおよび人工ヌクレアーゼを含むゲノム編集組成物を企図する。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、好ましくは核酸インターカレーターであり、より好ましくは、ゲノム編集エンハンサーはDNAインターカレーターであり、さらにより好ましくは、ゲノム編集エンハンサーはアクリジンであり、さらにより好ましくは、ゲノム編集エンハンサーは9−アミノアクリジンである。
種々の他の実施形態が、核酸インターカレーターが導入されていない細胞と比較して、細胞におけるゲノム編集の頻度を増加させるのに十分な量および時間、細胞集団に人工ヌクレアーゼおよび核酸インターカレーターを導入することを含む、ゲノム編集効率を高めるための方法を企図する。
特定の実施形態の実施は、そうではないという明確な指示のない限り、当該技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは例示のために後述される。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991);Annual Review of Immunology;およびAdvances in Immunology等の学術雑誌の研究書を参照されたい。
B.定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および/または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、特定の実施形態の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態を以下に記載する。本開示の目的のために、以下の用語を次に定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および/または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、特定の実施形態の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態を以下に記載する。本開示の目的のために、以下の用語を次に定義する。
冠詞「a」、「an」、および「the」は、その冠詞の文法上の対象となる1つのまたは1つより多くの(すなわち、少なくとも1つまたは1つ以上)ものを指すために本明細書で使用される。例として「an element」は、1つの要素または1つ以上の要素を意味する。
選択肢(例えば、「または」)の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
用語「および/または」は、その選択肢のいずれか一方または両方を意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%だけことなる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、用語「約」または「およそ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、or±1%の範囲の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
一実施形態において、範囲、例えば、1〜5、約1〜5、または約1〜約5は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、非限定的かつ例示的であるに過ぎない一実施形態において、範囲「1〜5」は、1、2、3、4、5;または1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0;または1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、もしくは5.0という表現と同等である。
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ効果、例えば、生理学的効果をもたらす数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という語は、記載されるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を暗示するものではないことを理解されたい。「からなる」は、「からなる」という句に続くあらゆるものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列挙される要素が必要または必須であり、他の要素は存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」は、この句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という句は、列挙される要素は必要または必須であるが、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素は存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所に出現する上記の句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が、1つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされてもよい。また、一実施形態におけるある特徴についての肯定の記述は、特定の実施形態においてその特徴を排除する根拠となることも理解されたい。
用語「エクスビボ」は、生物の外部で起こる活動、例えば、好ましくは、自然の状態からの変化を最小限に抑えながら、生物の外部の人工環境で生体細胞の中または上で行われる実験または測定を一般的に指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から生体細胞または組織を取り出し、通常、無菌条件下で、典型的には数時間または最長24時間だが、状況に応じて48時間もしくは72時間、実験装置において培養または調節することを含む。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞を、採取して凍結させ、後にエクスビボ処理のために解凍することができる。生体細胞または組織を用いた数日よりも長く継続する培養実験または手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。
用語「インビボ」は、細胞の自己再生および細胞の増殖または増加等の、生物の内部で起こる活動を一般的に指す。一実施形態において、用語「インビボでの増加」は、細胞集団がインビボで数を増加させる能力を指す。一実施形態において、細胞はインビボで遺伝子操作または修飾される。
本明細書で使用される場合、用語「量」は、所望の結果、例えば、細胞集団においてゲノム編集の所望の速度を達成するのに十分な化合物、組成物、または処置の「効果的な量」または「有効量」を指す。
「増強する」または「促進する」または「増加させる」または「増大させる」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクルまたは対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答(すなわち、生理学的応答)を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。測定可能な応答は、HRまたはHDR効率の増加を含み得る。「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって産生される応答の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれ以上(例えば、500、1000倍)(中間のおよび1を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8等を含む)である増加を含むことができる。
「減少させる」または「減らす」または「低減させる」または「低下させる」または「弱める」または「除去する」または「抑制する」または「減弱する」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクルまたは対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より少ない生応答(すなわち、生理学的応答)を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。測定可能な応答は、内因性遺伝子の発現または機能の低下、免疫エフェクター細胞の消耗に関連するバイオマーカーの発現低下等を含み得る。「減少された」または「低下された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって産生される応答(参照応答)、または特定の細胞系統における応答の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれ以上(例えば、500、1000倍)(中間のおよび1を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8等を含む)である減少を含むことができる。
「維持する」または「保存する」または「維持」または「変化なし」または「実質的な変化なし」または「実質的な減少なし」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクル、対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系統における応答と比較して、細胞において実質的に同様または同程度の生理学的応答(すなわち、下流効果)を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。同程度の応答は、参照応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。
「小分子」、「有機小分子」、または「小分子化合物」は、約5kD未満、約4kD未満、約3kD未満、約2kD未満、約1kD未満、または約0.5kD未満の分子量を有する低分子量の化合物を指す。特定の実施形態において、小分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、他の小さな有機化合物または薬物等を含むことができる。真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物等の化学的混合物および/または生物学的混合物のライブラリーは当該技術分野で既知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、(Carell et al.,1994a;Carell et al.,1994b;Cho et al.,1993;DeWitt et al.,1993;Gallop et al.,1994;Zuckermann et al.,1994)に見出すことができる。
「組換え」は、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指し、非相同末端結合(NHEJ)によるドナー捕捉および相同組換えを含むが、これらに限定されない。本開示の目的のために、「相同組換え(HR)」は、例えば、相同組換え修復機構を介して細胞における二本鎖切断の修復中に起こるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子(すなわち、二本鎖切断を経験した分子)を修復するための鋳型として「ドナー分子」または「ドナー修復鋳型」を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング、および/または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なHRは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
「NHEJ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の非存在下における二本鎖切断の回復を指す。NHEJは、切断部位における挿入および欠失をもたらし得る。NHEJは、いくつかの副経路によって媒介され、それらの各々は、異なる変異結果を有する。古典的NHEJ経路(cNHEJ)は、KU/DNA−PKcs/Lig4/XRCC4複合体を必要とし、最小限のプロセシングにより末端を連結し直し、切断の正確な修復をもたらす。代替的NHEJ経路(altNHEJ)もまた、dsDNA切断の回復において活性であるが、これらの経路は変異原性が著しくより高く、挿入および欠失を特徴とする切断の不正確な修復をもたらす場合が多い。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、末端プロセシング酵素、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Trex2によるdsDNA切断の修飾は、修復をaltNHEJ経路に偏らせ得ることが企図される。
「切断(cleavage)」は、DNA分子の共有結合骨格の切断(breakage)を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断およぶ二本鎖切断のどちらも可能である。二本鎖切断は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。DNA切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、標的化二本鎖DNA切断に用いられる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合するおよび/または切断する核酸の一部を定義する染色体または染色体外の核酸配列であるが、但し、結合および/または切断に十分な条件が存在するものとする。
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、1つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入され得る分子である。例示的な外因性分子として、限定されないが、有機小分子、例えば、DNAインターカレーター、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記分子の1つ以上を含む任意の複合体が挙げられる。外因性分子を細胞に導入するための例示的な方法は、当業者に既知であり、脂質媒介形質移入(すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム)、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、DEAE−デキストラン媒介形質移入、およびウイルスベクター媒介形質移入を含むが、これらに限定されない。
「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域、および遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域(そのような調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず)を含む。遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列(リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等)、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAもしくは任意の他の種類のRNA)、またはmRNAの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたRNA、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集」は、遺伝子の発現を回復させ、修正し、かつ/もしくは修飾する、ならびに/または1つ以上の免疫力エンハンサー、免役抑制シグナルダンパー、および人工抗原受容体を発現する、細胞のゲノムの標的部位における遺伝子材料の置換、欠失、および/または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、任意選択的にドナー修復鋳型の存在下で、細胞のゲノムの標的部位にDNA損傷を生成するために、ゲノム編集エンハンサーおよび1つ以上の人工ヌクレアーゼ(またはそれをコードするmRNA)を細胞に導入することを含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」または「遺伝子組み換えされた」は、細胞内の全遺伝子材料にDNAまたはRNAの形態の余分な遺伝子材料を染色体または染色体外で付加することを指す。遺伝子組み換えは、細胞のゲノムの特定の部位を標的化してもまたは標的化しなくてもよい。一実施形態において、遺伝子組み換えは部位特異的である。一実施形態において、遺伝子組み換えは部位特異的ではない。
C.ゲノム編集エンハンサー
ゲノム編集ストラテジーを用いる際の制約の1つは、効率の低さである。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いることにより非効率的な編集の問題を解決する。本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集エンハンサー」は、相同組み換え修復(HDR)および/または誤りの多い非相同末端結合(NHEJ)を増加させる小分子または化合物を指す。特定の実施形態において企図される組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーとして、限定されないが、核酸挿入剤が挙げられる。
ゲノム編集ストラテジーを用いる際の制約の1つは、効率の低さである。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いることにより非効率的な編集の問題を解決する。本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集エンハンサー」は、相同組み換え修復(HDR)および/または誤りの多い非相同末端結合(NHEJ)を増加させる小分子または化合物を指す。特定の実施形態において企図される組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーとして、限定されないが、核酸挿入剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「挿入剤」または「インターカレーター」は、核酸二重鎖の塩基対間の非共有結合挿入が可能な化合物として当該技術分野で既知であり、この点に関して、「ヘアピンループ」等に形成された塩基対を有する一本鎖核酸の部分を含む核酸構造の二本鎖(ds)部分のみに特異的である。核酸構造は、dsDNA、dsRNA、またはDNA−RNAハイブリッドであり得る。用語「挿入剤」または「インターカレーター」は、二本鎖DNA(dsDNA)、またはある場合にはdsRNAの隣接する塩基対間の平面芳香族化合物または複素芳香族化合物の挿入を説明するためにも使用される。特定の実施形態において、ゲノム編集の有効性は、好ましくは、ゲノム編集エンハンサーを使用して、より好ましくは核酸インターカレーター、より好ましくはDNAインターカレーター、さらにより好ましくはアクリジン、さらにより好ましくは9−アミノアクリジンを使用して増加される。
本明細書で企図される特定の組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーの例示的な例として、限定されないが、単官能性挿入剤、二官能性挿入剤、および多官能性挿入剤が挙げられる。
本明細書で企図される特定の組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーの追加の例示的な例として、限定されないが、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、フェナントリジン、およびナフタルイミドが挙げられる。
特定の例示的実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、1,8−ナフタルイミド、4’6−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン(actinodaphnidine)、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、BOBO−1、BOBO−3、ボルジン、BO−PRO−1、BO−PRO−3、ブブロカプニン(bublocapnine)、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、DAPI、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、GelStar、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、JOJO−1、JO−PRO−1、キネチンリボシド、コクサイニン(kokusainine)、ロベリン、LOLO−1、LO−PRO−1、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、OliGreen、パルマチン、フェナントリジン、PicoGreen、ピラルビシン、ポリピリジル、POPO−1、POPO−3、PO−PRO−1、PO−PRO−3、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、RiboGreen、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、SYBR DX、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTO−11、SYTO−12、SYTO−13、SYTO−14、SYTO−15、SYTO−16、SYTO−17、SYTO−20、SYTO−21、SYTO−22、SYTO−23、SYTO−24、SYTO−25、SYTO−40、SYTO−41、SYTO−42、SYTO−43、SYTO−44、SYTO−45、SYTO−59、SYTO−60、SYTO−61、SYTO−62、SYTO−63、SYTO−64、SYTO−80、SYTO−81、SYTO−82、SYTO−83、SYTO−84、SYTO−85、SYTOX blue、SYTOX green、SYTOX orange、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、TO−PRO−1、TO−PRO−3、TO−PRO−5、TOTO−1、TOTO−3、ウサンバレンシン、YO−PRO−1、YO−PRO−3、YOYO−1、YOYO−3、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
特定の実施形態において、編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、およびハルミンからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
別の好ましい実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはアミナクリン(9−アミノアクリジン)である。
D.ヌクレアーゼ
細胞の1つ以上の標的部位を標的とする人工ヌクレアーゼは、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法に使用される。「人工ヌクレアーゼ」は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、該ヌクレアーゼは、DNA切断標的配列に隣接するDNA結合標的配列に結合するように設計および/または修飾されている。人工ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼからまたは以前に遺伝子操作されたヌクレアーゼから設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。
細胞の1つ以上の標的部位を標的とする人工ヌクレアーゼは、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法に使用される。「人工ヌクレアーゼ」は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、該ヌクレアーゼは、DNA切断標的配列に隣接するDNA結合標的配列に結合するように設計および/または修飾されている。人工ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼからまたは以前に遺伝子操作されたヌクレアーゼから設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。
特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、標的配列に一本鎖DNAニックまたは二本鎖DNA切断(DSB)を生成する。さらに、DSBは、一本鎖ニックを生成する2つのヌクレアーゼ(ニッカーゼ)の使用によって標的DNAにおいて達成され得る。それぞれのニッカーゼがDNAの1つの鎖を切断し、2つ以上のニッカーゼの使用により、標的DNA配列に二本鎖切断(例えば、ねじれ型の二本鎖切断)を形成することができる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼはドナー修復鋳型と組み合わせて使用され、DSBにおける相同組換えを介してDNA切断部位の標的配列に導入される。
標的配列に結合および切断するように遺伝子操作され得るヌクレアーゼの例示的な例として、限定されないが、ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)、メガTAL、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、ARCUSヌクレアーゼ、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/Casヌクレアーゼ系が挙げられる。
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、細胞の1つ以上の標的部位において一本鎖ニックまたは二本鎖切断(DSB)に結合して導入するように遺伝子操作される。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」と「メガヌクレアーゼ」は互換的に使用され、12〜45の塩基対切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼまたは人工メガヌクレアーゼを指し、配列および構造モチーフに基づいて一般的にLAGLIDADG、GIY−YIG、HNH、His−Cys box、およびPD−(D/E)XKの5つのファミリーにグループ化される。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、天然に見られる野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を高めるように修飾された野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラム化ホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼ変異体」、「人工メガヌクレアーゼ」、「再プログラム化メガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼ変異体」は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、該ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列に結合および切断するように親または天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼ変異体は、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼからまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼ変異体から設計および/または修飾されてもよい。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼ変異体は、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)変異体は、天然には存在せず、組換えDNA技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。HE変異体は、天然に存在するHEまたはHE変異体において1つ以上のアミノ酸改変を行うことによって、例えば、1つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって得られてもよい。特定の実施形態において、HE変異体は、DNA認識界面に対する1つ以上のアミノ酸改変を含む。
特定の実施形態において企図されるHE変異体は、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、HE変異体は、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリエキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性DNAポリメラーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりT細胞に導入される。HE変異体および3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはIRESエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
再プログラム化LHEまたはLHE変異体が設計され得るLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)の例示的な例として、限定されないが、I−CreIおよびI−SceIが挙げられる。
再プログラム化LHEまたはLHE変異体が設計され得るLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)の別の例示的な例として、限定されないが、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iが挙げられる。
一実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体は、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択される。
一実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体はI−OnuIである。
一実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体は、天然のI−OnuIから産生される。好ましい実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体は、以前に遺伝子操作されたI−OnuIから産生される。
特定の実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体は、DNA認識界面に1つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、I−OnuI LHEは、I−OnuIのDNA認識界面(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)または遺伝子操作されたI−OnuIの変異体と少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。
一実施形態において、再プログラム化LHEまたはLHE変異体は、I−OnuIのDNA認識界面(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)または遺伝子操作されたI−OnuIの変異体に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を含む。
種々の例示的実施形態は、1つ以上の標的部位の標的領域に結合して切断するメガTALヌクレアーゼを企図する。「メガTAL」は、人工TALE DNA結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含み、任意選択的に、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、メガTALは、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりT細胞に導入され得る。メガTALおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはIRESエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
「TALE DNA結合ドメイン」は、転写活性化因子様エフェクター(TALEまたはTALエフェクター)のDNA結合部分であり、植物の転写活性化因子を模倣して植物のトランスクリプトームを操作する(例えば、Kay et al.,2007.Science 318:648−651を参照されたい)。特定の実施形態において企図されるTALE DNA結合ドメインは、新規に、または天然に存在するTALEから、例えば、AvrBs3は、Xanthomonas campestris pv.vesicatoria、Xanthomonas gardneri、Xanthomonas translucens、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas perforans、Xanthomonas alfalfa、Xanthomonas citri、Xanthomonas euvesicatoria、およびXanthomonas oryzaeから、brg11およびhpx17は、Ralstonia solanacearumから遺伝子操作される。DNA結合ドメインを誘導および設計するためのTALEタンパク質の例示的な例は、米国特許第9,017,967号に開示されており、その中に列挙される参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、メガTALは、TALE DNA結合ドメインの対応する標的DNA配列への結合に関与する1つ以上の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。単一の「反復単位」(「反復」とも称される)は、典型的には、33〜35アミノ酸長である。各TALE DNA結合ドメイン反復単位は、反復の12位および/または13位で反復可変二残基(RVD)を構成する1個または2個のDNA結合残基を含む。これらのTALE DNA結合ドメインのDNA認識のための天然の(正準の)コードは、12位および13位のHD配列がシトシン(C)に結合し、NGがTに結合し、NIがAに、NNがGまたはAに結合し、NGがTに結合するように決定されている。ある特定の実施形態において、非正準(非定型)RVDが企図される。
特定の実施形態において企図される特定のメガTALにおける使用に適した非正準RVDの例示的な例として、限定されないが、グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN;アデニン(A)の認識のためのNI、KI、RI、HI、SI;チミン(T)の認識のためのNG、HG、KG、RG;シトシン(C)の認識のためのRD、SD、HD、ND、KD、YG;AまたはGの認識のためのNV、HN;およびAまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*が挙げられ、(*)は、13位のアミノ酸が存在しないことを意味する。特定の実施形態において企図される特定のメガTALにおける使用に適したRVDの追加の例示的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,614,092号に開示されるものをさらに含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、3〜30個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガTALは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、5〜13個の反復単位、より好ましくは7〜12個の反復単位、より好ましくは9〜11個の反復単位、およびより好ましくは9、10、または11個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、3〜30個の反復単位と、一連のTALE反復単位のC末端に位置する20アミノ酸を含む追加の単一の切断型TALE反復単位、すなわち、追加のC末端ハーフTALE DNA結合ドメイン反復単位(以下の本明細書の他の箇所に開示されるCキャップのアミノ酸−20〜−1)とを含むTALE DNA結合ドメインを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、3.5〜30.5個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガTALは、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5個のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、5.5〜13.5個の反復単位、より好ましくは7.5〜12.5個の反復単位、より好ましくは9.5〜11.5個の反復単位、およびより好ましくは9.5、10.5、または11.5個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、メガTALは、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチド、1つ以上のTALE反復ドメイン/単位、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチド、人工メガヌクレアーゼ、およびドメインを連結する1つ以上のリンカーペプチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドは、天然に存在するTALE DNA結合ドメインのN末端部分または断片に隣接する配列を指す。本明細書で使用される場合、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドは、天然に存在するTALE DNA結合ドメインのC末端部分または断片に隣接する配列を指す。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガTALは、約122アミノ酸〜137アミノ酸のNTD、約9.5、約10.5、または約11.5個の結合反復単位、約20アミノ酸〜約85アミノ酸のCTD、ならびにI−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択される人工I−OnuI LHE、好ましくはI−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMI、またはより好ましくはI−OnuIを含む。
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼはTALENである。「TALEN」は、人工TALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン(またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン)を含み、任意選択的に、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、TALENは、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりT細胞に導入され得る。TALENおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはIRESエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
特定の実施形態において企図されるTALENは、NTD、約3.5〜30.5個の反復単位、例えば、約3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5個の反復単位を含むTALE DNA結合ドメイン、CTD、およびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
一実施形態において、本明細書で企図されるTALENは、IIS型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。一実施形態において、IIS型制限エンドヌクレアーゼはFok Iである。
TALENおよびそれを作製する方法の例示的な例は、米国特許第8,586,526号、同第8,912,138号、および同第9,315,788号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌヌクレアーゼ(ZFN)である。「ZFN」は、1つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン(またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン)を含み、任意選択的に、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、ZFNは、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりT細胞に導入され得る。ZFNおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはIRESエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
特定の実施形態において、ZFNは、1,2,3,4,5,6,7、もしくは8個またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを有するジンクフィンガーDNA結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン(またはエンドヌクレアーゼハーフドメイン)とを含む。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは、約30アミノ酸長である。ジンクフィンガーモチーフは、正準C2H2ジンクフィンガーおよび非正準ジンクフィンガーの両方、例えば、C3HジンクフィンガーおよびC4ジンクフィンガーを含む。
ジンクフィンガー結合ドメインは、任意のDNA配列に結合するように遺伝子操作することができる。個々のジンクフィンガーモチーフは、3個または4個のヌクレオチド配列に結合する。所与の3bpのDNA標的配列に対するジンクフィンガーDNA結合ドメイン候補が同定されており、対応する複合DNA標的配列を標的とするマルチフィンガーペプチド中に複数のドメインを連結するためのモジュールアセンブリストラテジーが考案されている。当該技術分野で既知の他の適切な方法、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター/合理的設計、親和性選択、PCR、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築等も、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをコードする核酸を設計および構築するために使用することができる(例えば、米国特許第.5,786,538号;Wu et al.,PNAS 92:344−348(1995);Jamieson et al.,Biochemistry 33:5689−5695(1994);Rebar&Pabo,Science 263:671−673(1994);Choo&Klug,PNAS 91:11163−11167(1994);Choo&Klug,PNAS 91:11168−11172(1994);Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256−2260(1993);Desjarlais&Berg,PNAS 89:7345−7349(1992);Pomerantz et al.,Science 267:93−96(1995);Pomerantz et al.,PNAS 92:9752−9756(1995);Liu et al.,PNAS 94:5525−5530(1997);Griesman&Pabo,Science 275:657−661(1997);Desjarlais&Berg,PNAS 91:11−99−11103(1994)を参照されたい)。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるZNFは、2,3,4,5,6,7、もしくは8個またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーDNA結合ドメインと、少なくとも1つのIIS型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。一実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインは、Fok I IIS型制限エンドヌクレアーゼに由来する。
ZNFおよびそれを作製する方法の例示的な例は、米国特許公開第20030232410号、同第20050208489号、同第20050026157号、同第20050064474号、同第20060188987号、同第20060063231号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、CRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)/Cas(CRISPR関連)ヌクレアーゼ系は、1つ以上の標的部位において一本鎖ニックまたは二本鎖切断(DSB)に結合して導入するように遺伝子操作される。CRISPR/Casヌクレアーゼ系は、哺乳類のゲノム工学に使用することができる、細菌系に基づいて最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。例えば、Jinek et al.(2012)Science 337:816−821;Cong et al.(2013)Science 339:819−823;Mali et al.(2013)Science 339:823−826;Qi et al.(2013)Cell 152:1173−1183;Jinek et al.(2013),eLife 2:e00471;David Segal(2013)eLife 2:e00563;Ran et al.(2013)Nature Protocols 8(11):2281−2308;Zetsche et al.(2015)Cell 163(3):759−771を参照されたく、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、CRISPR/Casヌクレアーゼ系は、Casヌクレアーゼ、ならびにCasヌクレアーゼを標的部位に動員する1つ以上のRNA、例えば、トランス活性化cRNA(tracrRNA)およびCRISPR RNA(crRNA)、または単一ガイドRNA(sgRNA)を含む。crRNAおよびtracrRNAは、本明細書において「単一ガイドRNA」または「sgRNA」と称される1つのポリヌクレオチド配列に遺伝子操作することができる。
一実施形態において、Casヌクレアーゼは、二本鎖DNAエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼまたは触媒活性を伴わないCasとして遺伝子操作することができ、標的部位内に位置するプロトスペーサー標的配列の部位特異的DNA認識および部位特異的切断のためにcrRNAおよびtracrRNA、またはsgRNAと標的複合体を形成する。プロトスペーサーモチーフは、Cas/RNA複合体の動員において役割を果たす短いプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に接している。Casポリペプチドは、Casポリペプチドに特異的なPAMモチーフを認識する。したがって、CRISPR/Cas系を使用して、特定のCasポリペプチドに特異的な特定の3’PAM配列が隣接する二本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的とするおよび切断することができる。PAMは、バイオインフォマティクスを使用して、または実験的手法を使用して同定することができる。Esvelt et al.,2013,Nature Methods.10(11):1116−1121(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
種々の実施形態において、Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したCas9ポリペプチドの例示的な例として、限定されないが、Enterococcus faecium、Enterococcus italicus、Listeria innocua、Listeria monocytogenes、Listeria seeligeri、Listeria ivanovii、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus gallolyticus、Streptococcus macacae、Streptococcus mutans、Streptococcus pseudoporcinus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantarius、Streptococcus macedonicus、Streptococcus mitis、Streptococcus pasteurianus、Streptococcus suis、Streptococcus vestibularis、Streptococcus sanguinis、Streptococcus downei、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria meningitidis、Neisseria subflava、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium matruchotii、Campylobacter jejuni、Clostridium perfringens、Treponema vincentii、Treponema phagedenis、およびTreponema denticolaを含む細菌種から得ることができる。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したCpf1ポリペプチドの例示的な例は、限定されないが、特に、Francisella菌種、Acidaminococcus菌種、Prevotella菌種、Lachnospiraceae菌種を含む細菌種から得ることができる。
Cas9オルソログの保存領域は、中心のHNHエンドヌクレアーゼドメインおよび分割されたRuvC/RNase Hドメインを含む。Cpf1オルソログは、RuvC/RNase Hドメインは有するが、識別可能なHNHドメインは有しない。HNHおよびRuvC様ドメインは、各々、二本鎖DNA標的配列の1つの鎖の切断に寄与する。Cas9ヌクレアーゼポリペプチドのHNHドメインは、tracrRNA:crRNAまたはsgRNAに相補的なDNA鎖を切断する。Cas9ヌクレアーゼのRuvC様ドメインは、tracrRNA:crRNAまたはsgRNAに非相補的なDNA鎖を切断する。Cpf1は、Cpf1の各RuvC様ドメインが標的部位の相補的または非相補的な鎖のいずれかを切断する二量体として作用することが予測される。特定の実施形態において、HNHまたはRuvC様エンドヌクレアーゼドメインに、変異体ドメインのヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除する1つ以上のアミノ酸付加、欠失、突然変異、または置換を含むCas9ヌクレアーゼ変異体(例えば、Cas9ニッカーゼ)が企図される。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除するCas9 HNH突然変異の例示的な例として、限定されないが、S.pyogenes(D10A);S.thermophilis(D9A);T.denticola(D13A);およびN.meningitidis(D16A)が挙げられる。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除するCas9 RuvC様ドメイン突然変異の例示的な例として、限定されないが、S.pyogenes(D839A、H840A、またはN863A);S.thermophilis(D598A、H599A、またはN622A);T.denticola(D878A、H879A、またはN902A);およびN.meningitidis(D587A、H588A、またはN611A)が挙げられる。
E.標的部位
特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、任意の適切な標的配列に結合するように設計することができ、天然に存在するヌクレアーゼと比較して新規結合特異性を有することができる。特定の実施形態において、標的部位は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーエレメント等を含む遺伝子の抑制領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライシング部位である。ある特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、遺伝子の発現を下方制御するまたは低減するように設計される。人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失するように設計することができる。いくつかの実施形態において、人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、遺伝子のコード配列もしくは制御領域の突然変異を修正するように、かつ/または遺伝子もしくはその制御領域によってコードされるポリペプチドに正常な機能を回復するように設計される。
特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、任意の適切な標的配列に結合するように設計することができ、天然に存在するヌクレアーゼと比較して新規結合特異性を有することができる。特定の実施形態において、標的部位は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーエレメント等を含む遺伝子の抑制領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライシング部位である。ある特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、遺伝子の発現を下方制御するまたは低減するように設計される。人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失するように設計することができる。いくつかの実施形態において、人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、遺伝子のコード配列もしくは制御領域の突然変異を修正するように、かつ/または遺伝子もしくはその制御領域によってコードされるポリペプチドに正常な機能を回復するように設計される。
適切な標的配列の例示的な例として、以下の遺伝子が挙げられる:βグロビン、δグロビン、γグロビン、B細胞リンパ腫/白血病11(BCL11A)、クルッペル様因子1(KLF1)、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)、ハンチンチン(Htt)、スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)、C9orf72、TARDBP、FUS、ロドプシン(RHO)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、肺サーファクタントタンパク質B(SFTPB)、T細胞受容体α(TRAC)、T細胞受容体β(TRBC)、プログラム細胞死1(PD1)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)、ヒト白血球抗原(HLA)A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、抗原ペプチド輸送体(TAP)1、TAP2、タパシン(TAPBP)、主要組織適合抗原II型トランス活性化因子(CIITA)、ジストロフィン(DMD)、グルココルチコイド受容体(GR)、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、およびEPSPS。
治療用導入遺伝子をコードするドナー鋳型の挿入に適した標的部位の追加の例示的な例として、限定されないが、「セーフハーバー遺伝子座」、例えば、AAVS1、HPRT、アルブミン、およびCCR5遺伝子が挙げられる。
F.ドナー修復鋳型
特定の実施形態において企図される細胞に基づく組成物は、人工ヌクレアーゼ、ゲノム編集エンハンサーを用いたゲノム編集、および1つ以上のドナー修復鋳型の導入によって生成される。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞における1つ以上の人工ヌクレアーゼの発現は、標的部位で一本鎖または二本鎖DNA切断を生成し、ゲノム編集エンハンサーおよびドナー修復鋳型の存在下におけるヌクレアーゼ発現および切断の生成は、相同組換えにより標的部位での鋳型の挿入または組み込みをもたらし、それによって切断を修復することが企図される。
特定の実施形態において企図される細胞に基づく組成物は、人工ヌクレアーゼ、ゲノム編集エンハンサーを用いたゲノム編集、および1つ以上のドナー修復鋳型の導入によって生成される。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞における1つ以上の人工ヌクレアーゼの発現は、標的部位で一本鎖または二本鎖DNA切断を生成し、ゲノム編集エンハンサーおよびドナー修復鋳型の存在下におけるヌクレアーゼ発現および切断の生成は、相同組換えにより標的部位での鋳型の挿入または組み込みをもたらし、それによって切断を修復することが企図される。
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、1つ以上の相同性アームを含む。
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、DSB部位に隣接する1つ以上の相同性アームを含む。
本明細書で使用される場合、用語「相同性アーム」は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されたDNA切断に隣接するDNA配列と同一またはほぼ同一のドナー修復鋳型の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、DNA切断部位のDNA配列5´と同一またはほぼ同一のドナー修復鋳型の核酸配列を含む5´相同性アームを含む。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、DNA切断部位のDNA配列3´と同一またはほぼ同一の核酸配列を含む3´相同性アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型は、5´相同性アームおよび3´相同性アームを含む。ドナー修復鋳型は、DSB部位に直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはDSB部位由来の任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、約5bp、約10bp、約25bp、約50bp、約100bp、約250bp、約500bp、約1000bp、約2500bp、約5000bp、約10000bpまたはそれ以上のゲノム配列に対して相同である核酸配列を含む(その間の全ての長さの相同配列を含む)。
特定の実施形態において企図される相同性アームの適切な長さの例示的な例は、独立して選択され得、限定されないが、約100bp、約200bp、約300bp、約400bp、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約1100bp、約1200bp、約1300bp、約1400bp、約1500bp、約1600bp、約1700bp、約1800bp、約1900bp、約2000bp、約2100bp、約2200bp、約2300bp、約2400bp、約2500bp、約2600bp、約2700bp、約2800bp、約2900bp、または約3000bp、またはそれよりも長い相同性アームが挙げられる(その間の全ての長さの相同性アームを含む)。
適切な相同性アーム長さの追加の例示的な例として、限定されないが、約100bp〜約3000bp、約200bp〜約3000bp、約300bp〜約3000bp、約400bp〜約3000bp、約500bp〜約3000bp、約500bp〜約2500bp、約500bp〜約2000bp、約750bp〜約2000bp、約750bp〜約1500bp、または約1000bp〜約1500bpが挙げられる(その間の全ての長さの相同性アームを含む)。
特定の実施形態において、5´および3´相同性アームの長さは、約500bp〜約1500bpから独立して選択される。一実施形態において、5´相同性アームは約1500bpであり、3´相同性アームは約1000bpである。一実施形態において、5´相同性アームは約600bpであり、3´相同性アームは約600bpである。
ドナー修復鋳型は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、本明細書の他の箇所で企図されるプロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、リボソーム内部進入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終止シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグをさらに含み得る。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、5´相同性アーム、RNAポリメラーゼIIプロモーター、治療遺伝子またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子または選択可能なマーカー、および3´相同性アームを含む。
種々の実施形態において、標的部位は、5´相同性アーム、治療遺伝子またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子または選択可能なマーカー、および3´相同性アームを含むドナー修復鋳型で修飾される。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、治療遺伝子もしくはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子、または選択可能なマーカーを含む。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、限定されないが、βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、およびEPSPSを含む、治療遺伝子もしくはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子、または選択可能なマーカーを含む。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、ホルモン、ヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、黄体ホルモン(LH)、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン(TPO)、神経成長因子、例えば、NGF−β、血小板成長因子、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、例えば、TGF−αおよびTGF−β;インスリン様増殖因子IおよびII、エリスロポエチン(EPO)、骨誘導因子、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、β、およびγ、コロニー刺激因子(CSF)、例えば、マクロファージ−CSF(M−CSF)、顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF)、および顆粒球−CSF(G−CSF)、インターロイキン(IL)、例えば、IL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12;IL−15、腫瘍壊死因子、例えば、TNF−αまたはTNF−β、ならびにLIFおよび(KL)を含む他のポリペプチド因子からなる群から選択される治療遺伝子またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、ならびに人工抗原受容体(例えば、人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体)からなる群から選択される遺伝子または導入遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「人工TCR」は、T細胞受容体を指し、例えば、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有するαβTCRを指す。人工TCRは、選択され、クローニングされ、続いて養子免疫療法に使用されるT細胞の集団に導入することができる。人工TCRは、通常は特定のTCRを発現しないT細胞に導入されるため、外因性TCRである。人工TCRの本質的側面は、主要組織適合抗原(MHC)または同様の免疫学的成分によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有するということである。人工TCRとは対照的に、CARは、MHC非依存的様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
本明細書で使用される場合、用語「CAR」は、キメラ抗原受容体を指す。CARの例示的な例は、PCT公開第WO2015/164759号、同第WO2015/188119号、および同第WO2016/014789号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「Daric受容体」は、多鎖人工抗原受容体を指す。Daric構造およびその成分の例示的な例は、PCT公開第WO2015/017214号および米国特許公開第20150266973号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「キメラサイトカイン受容体」または「ゼータカイン」は、細胞外ドメインを細胞表面、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインに繋ぎ止めることができる支持領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体を指す。ゼータカインの例示的な例は、米国特許第7,514,537号、同第8,324,353号、同第8,497,118号、および同第9,217,025号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
G.ゲノム編集細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集細胞は、改善された遺伝子治療組成物を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いて達成される高いゲノム編集効率に起因して、より強力なゲノム編集細胞組成物を提供すると考えられる。
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集細胞は、改善された遺伝子治療組成物を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いて達成される高いゲノム編集効率に起因して、より強力なゲノム編集細胞組成物を提供すると考えられる。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集細胞は、自家/自律(「自己」)または非自家(「非自己」、例えば、同種、同系、または異種)であり得る。「自家」は、本明細書で使用される場合、同じ対象由来の細胞を指す。「同種」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは遺伝学的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞と遺伝学的に同一である異なる対象の細胞を指す。「異種」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞はヒト対象から得られる。
「単離された細胞」は、非天然起源の細胞、例えば、インビボ組織または器官から得られた、細胞外基質を実質的に含まない、天然には存在しない細胞、修飾された細胞、遺伝子操作された細胞等を指す。
本明細書で企図される組成物および方法を使用してゲノムを編集することができる細胞型の例示的な例として、限定されないが、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。
用語「幹細胞」は、(1)長期自己再生が可能な非分化細胞である細胞、または元の細胞の少なくとも1つの同一コピーで産生する能力、(2)複数の、また場合によっては唯一の、特殊な細胞型への単一細胞レベルでの分化、および(3)組織のインビボ機能再生を指す。幹細胞は、それらの発生能に応じて全能性、多能性、多分化能性および少能性/単能性に細分類される。「自己再生」は、不変の娘細胞を生成し、特殊な細胞型を産生する特異な能力(潜在力)を有する細胞を指す。自己再生は、2つの方式で達成され得る。非対称細胞分裂は、親細胞と同一の娘細胞を1つと、親細胞とは異なる、前駆細胞または分化細胞である娘細胞を1つ生成する。対称細胞分裂は、同一の娘細胞を2つ生成する。細胞の「増殖」または「増加」は、対称に分裂する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」は、自己再生して、より成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一の系統に沿って分化するが、非常に広範な増殖能を有し得る。
一実施形態において、ゲノム編集細胞は胚性幹細胞である。
一実施形態において、ゲノム編集細胞は、成人の幹細胞または前駆細胞である。
特定の実施形態において、ゲノム編集細胞は、中胚葉幹細胞または前駆細胞、内胚葉幹細胞または前駆細胞、および外胚葉幹細胞または前駆細胞からなる群から選択される幹細胞または前駆細胞である。
関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は中胚葉幹細胞または前駆細胞である。中胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、骨髄幹細胞または前駆細胞、臍帯幹細胞または前駆細胞、脂肪組織由来幹細胞または前駆細胞、造血幹細胞または前駆細胞(HSPC)、間葉系幹細胞または前駆細胞、筋肉幹細胞または前駆細胞、腎臓幹細胞または前駆細胞、造骨幹細胞または前駆細胞、軟骨幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
他の関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は外胚葉幹細胞または前駆細胞である。外胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、神経幹細胞または前駆細胞、網膜幹細胞または前駆細胞、皮膚幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
他の関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は内胚葉幹細胞または前駆細胞である。内胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、肝臓幹細胞または前駆細胞、膵臓幹細胞または前駆細胞、上皮幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
一実施形態において、ゲノム編集細胞は、骨細胞(bone cell)、骨細胞(osteocyte)、造骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系(CNS)細胞、末梢神経系(PNS)細胞、グリア細胞、星状膠細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、消化管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、上咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、膵臓実質細胞、膵臓導管細胞、膵臓島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、精巣細胞、造血細胞、リンパ球系細胞または骨髄系細胞である。
好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、免疫エフェクター細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞等を編集するために使用される。
造血細胞を得るための例示的な源として、限定されないが、臍帯血、骨髄または動員末梢血が挙げられる。
造血幹細胞(HSC)は、生物の生存期間にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを産生することができる重要な造血前駆細胞(HPC)をもたらす。用語「造血幹細胞」または「HSC」は、骨髄系統(例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)およびリンパ系統(例えば、T細胞、B細胞、NK細胞)、ならびに当該技術分野において既知である他の系統(Fei,R.らの米国特許第5,635,387号;McGlaveらの米国特許第5,460,964号;Simmons,P.らの米国特許第5,677,136号;Tsukamotoらの米国特許第5,750,397号;Schwartzらの米国特許第5,759,793号;DiGuistoらの米国特許第5,681,599号;Tsukamotoらの米国特許第5,716,827号を参照されたい)を含む、生物の全ての血液細胞型をもたらす多分化能性幹細胞を指す。致死的に照射された動物またはヒトに移植されると、造血幹細胞は、赤芽球プール、好中球−マクロファージプール、巨核球プールおよびリンパ造血細胞プールを再配置させることができる。
本明細書で企図される方法および組成物を用いた使用に適した造血幹細胞または前駆細胞の追加の例示的な例として、CD34+CD38LoCD90+CD45RA−である造血細胞、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38Lo/−、C−kit/CD117+、およびLin(−)である造血細胞、ならびにCD133+である造血細胞が挙げられる。
一実施形態において、造血細胞はCD34+CD133+細胞である。
造血の階層性を特徴付けるために種々の方法が存在する。特徴付けの方法の1つはSLAMコードである。SLAM(シグナル伝達リンパ球活性化分子)ファミリーは、第1染色体(マウス)上の単一の遺伝子座に大部分の遺伝子がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はT細胞刺激に関与すると考えられていた10分子未満の群である。このファミリーは、CD48、CD150、CD244等を含み、CD150が創始メンバーであるため、slamF1、すなわちSLAMファミリーメンバー1とも称される。造血の階層性に関する特徴的なSLAMコードは、造血幹細胞(HSC)−CD150+CD48−CD244−;多分化能性前駆細胞(MPP)−CD150−CD48−CD244+;系統制限前駆細胞(LRP)−CD150−CD48+CD244+;一般的な骨髄系前駆細胞(CMP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34+CD16/32mid;顆粒球マクロファージ前駆細胞(GMP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34+CD16/32hi;および巨核球・赤芽球前駆細胞(MEP)−lin−SCA−1−c−kit+CD34−CD16/32lowである。
一実施形態において、造血細胞はCD150+CD48−CD244−細胞である。
一実施形態において、造血細胞はCD34+造血細胞である。
種々の実施形態において、造血細胞は免疫エフェクター細胞である。「免疫エフェクター細胞」は、1つ以上のエフェクター機能(例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ADCCおよび/またはCDCの誘導)を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、特に、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、TIL、およびヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む。
用語「T細胞」または「Tリンパ球」は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブTリンパ球、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含む。T細胞は、Tヘルパー(Th)細胞、例えば、Tヘルパー1(Th1)またはTヘルパー2(Th2)細胞であり得る。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)CD4+T細胞、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(TIL;CD8+T細胞)、CD4+CD8+T細胞、CD4−CD8−T細胞、または任意の他のT細胞のサブセットであり得る。一実施形態において、T細胞はNKT細胞である。特定の実施形態における使用に適したT細胞の他の例示的な集団は、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞を含む。
「強力なT細胞」および「若いT細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用されており、分化においてT細胞が増殖および付随して減少することができるT細胞表現型を指す。特定の実施形態において、若いT細胞は「ナイーブT細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、若いT細胞は、以下の生物学的マーカーの1つ以上または全てを含む:CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、およびCD38。一実施形態において、若いT細胞は、以下の生物学的マーカーの1つ以上または全てを含む:CD62L、CD127、CD197、およびCD38。一実施形態において、若いT細胞は、CD57、CD244、CD160、PD−1、CTLA4、TIM3およびLAG3の発現が欠如している。
T細胞は、限定されないが、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多数の源から得ることができる。
H.ポリペプチド
限定されないが、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工抗原受容体、治療ポリペプチド、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターを含む種々のポリペプチドが本明細書で企図される。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、そうではないという規定のない限り、互換的に、かつ従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他の変異体を含む。ポリペプチドは、さまざまな周知の組換えおよび/または合成技術のいずれかを用いて調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含むことができ、天然起源および非天然起源の両方の、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾も含むことができる。
限定されないが、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工抗原受容体、治療ポリペプチド、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターを含む種々のポリペプチドが本明細書で企図される。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、そうではないという規定のない限り、互換的に、かつ従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他の変異体を含む。ポリペプチドは、さまざまな周知の組換えおよび/または合成技術のいずれかを用いて調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含むことができ、天然起源および非天然起源の両方の、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾も含むことができる。
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」等は、本明細書で使用される場合、細胞環境からの、および細胞の他の成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロでの単離および/または精製を指す:すなわち、これはインビボ物質と有意に関連していない。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例として、限定されないが、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工TCR、CAR、Darics、治療ポリペプチドおよび融合ポリペプチド、ならびにそれらの変異体が挙げられる。
ポリペプチドは「ポリペプチド変異体」を含む。「ポリペプチド変異体」は、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加および/または挿入において天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。そのような変異体は天然に存在してもよいか、または例えば、上記ポリペプチド配列の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドに1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入を導入することによって人工ヌクレアーゼ、人工TCR、CAR、Daric等の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに少なくとも約65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、変異体は、参照配列の少なくとも1つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチド変異体は、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性な断片」または「最小限に生物学的に活性な断片」は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、少なくとも20%、少なくとも10%、または少なくとも5%を維持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換えによって生成されるポリペプチドの1つ以上のアミノ酸のアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および/または内部欠失もしくは置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも5〜約1700アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700またはそれ以上のアミノ酸長であることを理解されたい。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。
特定の実施形態において企図される融合タンパク質の例示的な例として、限定されないが、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工抗原受容体、および他のポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
融合ポリペプチドは、任意選択的に、1つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを結合するために使用することができるリンカーを含んでもよい。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、各ポリペプチドがその適切な二次構造および三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な距離だけ、任意の2つ以上のポリペプチド成分を分離するように用いられ得る。
例示的なリンカーとして、限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる:グリシンポリマー(G)n;グリシン−セリンポリマー(G1−5S1−5)n(式中、nは、少なくとも1、2、3、4、または5の整数である);グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー;GGG(配列番号1);DGGGS(配列番号2);TGEKP(配列番号3)(例えば、Liu et al.,PNAS 5525−5530(1997)を参照されたい);GGRR(配列番号4)(Pomerantz et al.1995、上記参照);(GGGGS)n(式中、n=1、2、3、4または5)(配列番号5)(Kim et al.,PNAS 93,1156−1160(1996.);EGKSSGSGSESKVD(配列番号6)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066−1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号7)(Bird et al.,1988,Science 242:423−426)、GGRRGGGS(配列番号8);LRQRDGERP(配列番号9);LRQKDGGGSERP(配列番号10);LRQKD(GGGS)2ERP(配列番号11)。代替として、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256−2260(1993),PNAS 91:11099−11103(1994)、またはファージディスプレイ方法によって、可撓性リンカーを合理的に設計することができる。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間、または内因性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドとの間に、ポリペプチド切断シグナルをさらに含んでよい。さらに、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位)、および自己切断ウイルスオリゴペプチド等のポリペプチド切断認識部位を含む(deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8);616−26を参照されたい)。
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは当業者に既知である(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699−722;Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589−594を参照されたい)。例示的なプロテアーゼ切断部位として、限定されないが、ポティウイルスNIaプロテアーゼ(例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ)、ポティウイルスHCプロテアーゼ、ポティウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)NIaプロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)RNA−2にコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(イネツングロ球状ウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Xa因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。切断ストリンジェンシーが高いことに起因して、TEV(タバコエッチ病ウイルス)プロテアーゼ切断部位、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号12)、例えば、ENLYFQG(配列番号13)およびENLYFQS(配列番号14)(式中、Xは任意のアミノ酸を表す)が、一実施形態において好ましい(TEVによる切断は、QとGの間またはQとSの間で起こる)。
ある特定の実施形態において、自己切断ポリペプチド部位は、2Aまたは2A様部位、配列、またはドメインを含む(Donnelly et al.,2001.J.Gen.Virol.82:1027−1041)。特定の実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、口蹄疫ウイルス2Aペプチド、ポティウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
I.ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のメガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工TCR、CAR、Darics、治療ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のメガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工TCR、CAR、Darics、治療ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドは、限定されないが、プレメッセンジャーRNA(プレmRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、合成RNA、ゲノムRNA(gRNA)、+鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(−))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補性DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAを含む。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態の、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、もしくは少なくとも15000またはそれよりも長いヌクレオチド長、およびその中間の全ての長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、引用される値の間の任意の長さ、例えば、6、7、8、9等、101、102、103等;151、152、153等;201、202、203等を意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは変異体は、参照配列に対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%,76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはコドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性および/または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」等は、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的に配列相同性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾により参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」は、1つ以上のヌクレオチドが付加された、または欠失された、または修飾された、または異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。これに関連して、突然変異、付加、欠失および置換を含むある特定の改変が参照ポリヌクレオチドに対して行われてもよく、それによって、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当該技術分野において十分に理解されている。
「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でこれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、DNA断片に通常近接する配列から除去されたDNA断片を指す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然には存在しない、人の手によって作製された、相補的DNA(cDNA)、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、RNAおよびその後にポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝的配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的の遺伝子(複数可)、例えば、目的のポリヌクレオチド(複数可)を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、1つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ(A)配列、および目的の遺伝子(複数可)、例えば、目的のポリヌクレオチド(複数可)を含有する。特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、1つ以上の核酸カセットを含む。
本明細書で使用される場合、用語「目的のポリヌクレオチド(複数可)」は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、発現ベクターに挿入されたポリペプチド(すなわち、目的のポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを指す。
ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、限定されないが、crRNA、tracrRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、siRNA、miRNA、shRNA、リボザイムまたは別の阻害性RNAを含む阻害性ポリヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のDNA配列、例えば、本明細書の他の箇所で企図されるかまたは当該技術分野で既知である、プロモーターおよび/もしくはエンハンサー、未翻訳領域(UTR)、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、リボソーム内部進入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終止シグナル、転写後応答エレメント、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わされてもよく、そのため、それらの全体的な長さが著しく異なり得る。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片が用いられ得ることが企図され、全長は、好ましくは、意図する組換えDNAプロトコルにおける調製および使用し易さによって限定される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知および利用可能なさまざまな十分に確立された技術のいずれかを用いて調製する、操作する、発現させる、および/または送達することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。
特定の実施形態において、ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体DNAに組み込まれることなく、また、分裂する宿主細胞から漸進的に喪失することなく複製することができるベクターを指し、該ベクターが染色体外にまたはエピソームに複製することも意味する。
ベクターの例示的な例として、限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、Sleeping Beauty、PiggyBacが挙げられる。
追加の例示的なベクターの例として、限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1由来の人工染色体(PAC)、ラムダファージまたはM13ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域−複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列)イントロン、ポリアデニル化配列、5’および3’非翻訳領域−である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性において異なり得る。用いられるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用され得る。
用語「作動可能に連結した」は、記載される成分が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列(プロモーターおよび/またはエンハンサー等)と第2のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結を指し、発現制御配列は、第2の配列に対応する核酸の転写を導く。
用語「ベクター」は、別の核酸分子を導入または輸送することが可能な核酸分子を指すために本明細書において使用される。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよいか、または宿主細胞DNAへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のポリヌクレオチドを細胞に送達するために非ウイルスベクターが使用される。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを送達する例示的な方法として、限定されないが、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、DEAE−デキストラン媒介形質移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられる。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したポリヌクレオチド送達系の例示的な例として、限定されないが、Amaxa Biosystems,Maxcyte,Inc.、 BTX Molecular Delivery Systems、およびCopernicus Therapeutics Inc.によって提供されるものが挙げられる。リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。効率的なポリヌクレオチドの受容体認識リポフェクションに適したカチオン脂質および中性脂質は文献に記載されている。例えば、Liu et al.(2003)Gene Therapy.10:180−187およびBalazs et al.(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1−12を参照されたい。抗体を標的とする、最近由来の、非生体ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
1つ以上の治療ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ウイルス法によって標的細胞に導入され得る。
J.ウイルスベクター
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、またさらにより好ましくはレンチウイルスベクターを用いて標的細胞に導入される。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、またさらにより好ましくはレンチウイルスベクターを用いて標的細胞に導入される。
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の導入もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子(例えば、導入プラスミド)、または、核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、核酸(複数可)に加えて、種々のウイルス成分、および時には宿主細胞成分も含む。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、典型的には、後述するように全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内への点滴)または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達され得る。代替として、例えば、個々の患者から外植された細胞(例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等)、または普遍的ドナー造血幹細胞等の細胞に、ベクターをエクスビボで送達して、その後、細胞を患者に再移植することができる。
一実施形態において、人工ヌクレアーゼおよび/またはドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボで細胞を形質導入するために生物に直接投与される。代替として、ネイキッドDNAを投与することができる。投与は、限定されないが、注射、点滴、局所適用および電気穿孔を含む、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるように導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与するのに適した方法は、当業者に利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために1つより多くの経路が使用されてもよいが、多くの場合、特定の経路が別の経路より迅速かつより効果的な反応を提供することができる。
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の例示的な例として、限定されないが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
種々の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)で細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。AAVは、小さい(約26nm)、複製欠損性の、主にエピソームの非エンベロープウイルスである。AAVは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。組換えAAV(rAAV)は、典型的には、最小限の導入遺伝子およびその調製配列、ならびに5’および3’AAV逆方向末端反復(ITR)からなる。ITR配列は、約145bpの長さである。特定の実施形態において、rAAVは、ITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10から単離されたカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラrAAVが使用され、ITR配列が1つのAAV血清型から単離され、カプシド配列が異なるAAV血清型から単離される。例えば、AAV2由来のITR配列およびAAV6由来のカプシド配列を有するrAAVは、AAV2/AAV6と称される。特定の実施形態において、rAAVベクターは、AAV2由来のITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のいずれか1つに由来のカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2由来のITR配列およびAAV6由来のカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作および選択方法は、AAVカプシドが目的の細胞を形質導入し易くするようにそれらに適用することができる。rAAVベクターの構築、その生成および精製は、例えば、米国特許第9,169,494号、同第9,169,492号、同第9,012,224号、同第8,889,641号、同第8,809,058号、および同第8,784,799号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、レトロウイルス、例えば、1つ以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムRNAを直鎖状の二本鎖DNAコピーに逆転写し、その後、そのゲノムDNAを宿主ゲノムに共有結合によって組み込むRNAウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した例示的なレトロウイルスとして、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(M−MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳房腫瘍ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV))ならびにレンチウイルスが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルス」は、複合レトロウイルスの群(または属)を指す。例示的なレンチウイルスとして、これらに限定されないが、:HIV(ヒト免疫不全ウイルス;HIV1型およびHIV2型を含む);ビスナ・マエディウイルス(VMV)ウイルス;ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV);ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV);ネコ免疫不全ウイルス(FIV);ウシ免疫不全ウイルス(BIV);およびサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられる。一実施形態において、HIVに基づくベクター骨格(すなわち、HIVシス作用性配列エレメント)が好ましい。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、1つ以上のLTR、およびcPPT/FLAP、Psi(Ψ)パッケージングシグナル、輸送エレメント、ポリ(A)配列のアクセサリーエレメントの1つ以上または全てを含み、任意選択的に、本明細書の他の箇所で論じされるような、WPREまたはHPRE、インスレーターエレメント、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み型または非組み込み型または組み込み欠損レンチウイルスであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「組み込み欠損レンチウイルス」は、宿主細胞のゲノムにウイルスゲノムを組み込む能力を欠いたインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み不能ウイルスベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許出願第WO2006/010834号に記載されている。
インテグラーゼ活性を低減するのに適したHIV−1 pol遺伝子における例示的な突然変異として、限定されないが、H12N、H12C、H16C、H16V、S81 R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221 L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263AおよびK264Hが挙げられる。
用語「長い末端反復(LTR)」は、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然配列に関して、直接反復であり、U3、RおよびU5領域を含有する。
本明細書で使用される場合、用語「FLAPエレメント」または「cPPT/FLAP」は、その配列に、レトロウイルス、例えば、HIV−1またはHIV−2の中心ポリプリントラクトおよび中心終止配列(cPPTおよびCTS)を含む核酸を指す。適切なFLAPエレメントは、米国特許第6,682,907号およびZennouらの2000,Cell,101:173に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」とは、ウイルスRNAのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要である、レトロウイルスゲノム内に位置するPsi[Ψ]配列を指す。例えば、Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4;pp.2101−2109を参照されたい。
用語「輸送エレメント」は、細胞の核から細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節因子を指す。RNA輸送因子の例として、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)rev応答エレメント(RRE)(例えば、例えば、Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053;and Cullen et al.,1991.Cell 58:423を参照されたい)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HPRE)が挙げられる。
特定の実施形態において、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意選択的に、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって、ウイルスベクターにおける異種配列の発現を増加させる。さまざまな転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Zufferey et al.,1999,J.Virol.,73:2886);B型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント(HPRE)(Huang et al.,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等が、タンパク質で異種核酸の発現を増加させることができる(Liu et al.,1995,Genes Dev.,9:1766)。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、LTRを修飾した結果として、いくつかの安全性強化部を含む。「自己不活性化」(SIN)ベクターは、最初のラウンドのウイルス複製を超えるウイルス転写を防止するために、U3領域として知られる右側(3’)LTRエンハンサー−プロモーター領域が修飾された(例えば、欠失または置換によって)複製欠損ベクターを指す。追加の安全性強化部は、ウイルス粒子の生成中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、異種プロモーターで5’LTRのU3領域を置換することによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例として、例えば、ウイルス性サルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、最初期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが挙げられる。
用語「シュードタイプ」または「シュードタイピング」は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特徴を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、HIVエンベロープタンパク質(env遺伝子によってコードされる)は、通常、ウイルスをCD4+提示細胞に標的化するため、HIVを水疱性口内炎ウイルスGタンパク質(VSV−G)エンベロープタンパク質でシュードタイピングすることができ、そうすることによりHIVがより広い範囲の細胞に感染することができる。
ある特定の実施形態において、既知の方法に従ってレンチウイルスベクターが生成される。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10;Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
本明細書で企図されるある特定の特異的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てがレンチウイルス、例えば、HIV−1に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび/またはレンチウイルス配列の多くの異なる源が使用されてもよいかまたは組み合わされてもよく、レンチウイルス配列のいくつかにおける多数の置換および改変は、本明細書に記載される機能を実行する導入ベクターの能力を損なうことなく適応され得ることを理解されたい。さらに、さまざまなレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Naldini et al.,(1996a,1996b,and1998);Zufferey et al.,(1997);Dull et al.,1998,米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは導入プラスミドを産生するように適合させることができる。
種々の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能にし、また細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いると、高い力価および高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純な系で大量に生成することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1b、および/またはE3遺伝子を置換し、その後、複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞で増殖するように遺伝子操作される。Adベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるもの等の非分裂性の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のAdベクターは、高い運搬能を有する。
複製欠損性である現在のアデノウイルスベクターの産生および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する、293と名付けられた特有のヘルパー細胞株を用いることができる(Graham et al.,1977)。E3領域はアデノウイルスゲノムには不要であるため(Jones and Shenk,1978)、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1領域、D3領域のいずれかまたは両方に外来DNAを担持する(Graham and Prevec,1991)。アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現(Levrero et al.,1991;Gomez−Foix et al.,1992)およびワクチン開発(Grunhaus&Horwitz,1992;Graham and Prevec,1992)に用いられてきた。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する研究は、気管滴下(Rosenfeld et al.,1991;Rosenfeld et al.,1992)、筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈注射(Herz and Gerard,1993)、および脳への定位接種(Le Gal La Salle et al.,1993)を含む。臨床試験におけるAdベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍ワクチン接種のためのポリヌクレオチド治療を含んでいた(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083−9(1998))。
種々の実施形態において、単純ヘルペスウイルス、例えば、1つ以上のポリヌクレオチドを含むHSV−1、HSV−2で細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび/またはドナー修復鋳型をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
成熟したHSVビリオンは、152kbの直鎖状の二本鎖DNA分子からなるウイルスゲノムを有する包被された正二十面体のカプシドからなる。一実施形態において、HSVに基づくウイルスベクターは、1つ以上の必須または非必須のHSV遺伝子が欠損している。一実施形態において、HSVに基づくベクターは複製欠損性である。ほとんどの複製欠損HSVベクターは、複製を妨げるために、1つ以上の最初期、初期または後期HSV遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、HSVベクターは、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。HSVベクターの利点は、長期のDNA発現をもたらし得る潜伏段階に入るその能力と、最大25kbの外来性DNAインサートを収容し得るその大型ウイルスDNAゲノムである。HSVに基づくベクターは、例えば、米国特許第5,837,532号、同第5,846,782号、および同第5,804,413号、ならびに国際特許出願第WO91/02788号、同第WO96/04394号、同第WO98/15637号、および同第WO99/06583号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
K.組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに本明細書において企図されるようなゲノム編集組成物およびゲノム編集細胞組成物を含み得る。
特定の実施形態において企図される組成物は、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに本明細書において企図されるようなゲノム編集組成物およびゲノム編集細胞組成物を含み得る。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞集団を編集するのに有用である。本明細書で使用される場合、用語「細胞集団」は、本明細書の他の箇所に記載されるような任意の数および/または組み合わせの同種または異種の細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、細胞集団は、形質導入される標的細胞型の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%を含み得る。
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ゲノム編集エンハンサーおよび人工ヌクレアーゼを含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子等によって細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。本組成物は、ゲノム編集エンハンサーを欠く組成物と比較して、誤りの多いNHEJによってゲノム編集の割合が増加されたまたは高められた、増強されたゲノム編集細胞集団を生成するために用いられ得る。
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼを含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子等によって細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。本組成物は、ゲノム編集エンハンサーを欠く組成物と比較して、誤りの多いHDRによってゲノム編集の割合が増加されたまたは高められた、増強されたゲノム編集細胞集団を生成するために用いられ得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、人工ヌクレアーゼ、および任意選択的に、ドナー修復鋳型を含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法によって細胞に導入されるmRNAの形態であってもよい。
特定の実施形態において、細胞集団は、限定されないが、造血幹細胞、造血前駆細胞、およびT細胞を含む造血細胞を含む。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、好ましくは核酸インターカレーターであり、より好ましくはDNAインターカレーターであり、さらにより好ましくはアクリジンであり、さらにより好ましくは9−アミノアクリジンである。
組成物は、限定されないが、薬学的組成物を含む。「薬学的組成物」は、単独で、または1つ以上の他の治療法と組み合わせて細胞または動物に投与するために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に配合された組成物を指す。また、組成物は、必要に応じて他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されたい。組成物中に同時に含まれ得る他の成分には実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤は、意図する治療を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。
「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な利益/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために本明細書において使用される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、限定されないが、米国食品医薬品局によってヒトまたは家畜動物における使用に許容されるという認可を受けている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素/着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体として、限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース;トラガント;麦芽;ゼラチン;タルク;カカオバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛;油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油;グリコール、例えば、プロピレングリコール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;発熱物質不含水;等張性食塩水;リンゲル液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;ならびに医薬製剤に用いられる任意の他の適合する物質が挙げられる。
特定の実施形態において、組成物は、ゲノム編集エンハンサーを含む、本明細書で企図される方法によって製造されるある量のゲノム編集細胞を含む。好ましい実施形態において、薬学的な細胞組成物は、ゲノム編集エンハンサーを使用して編集されていない細胞集団と比較して増加した割合のゲノム編集細胞を含む細胞集団を含む。
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーを使用して製造される薬学的細胞組成物は、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、もしくは約96%、97%、98%、または99%のゲノム編集細胞を含む細胞集団を含む。
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集細胞を含む薬学的組成物は、約102〜約1010細胞/体重Kg、約105〜約109細胞/体重Kg、約105〜約108細胞/体重Kg、約105〜約107細胞/体重Kg、約107〜約109細胞/体重Kg、または約107〜約108細胞/体重Kg(これらの範囲内の全ての整数値を含む)の投与量で投与され得ると概括的に述べることができる。細胞の数は、組成物中のゲノム編集細胞のパーセンテージ、組成物が意図される最終用途、およびその中に含まれる細胞の種類に依存する。本明細書に提供される使用のために、細胞は概して、1リットルまたはそれより少ない体積であり、500mL以下、さらには250mLもしくは100mLまたはそれより少なくてもよい。したがって、所望の細胞密度は、約106細胞/mLよりも大きく、通常約107細胞/mLよりも大きく、通常約108細胞/mLよりも大きく、またはそれよりも大きい。臨床的に関連する細胞数は、約105、106、107、108、109、1010、1011、または1012細胞と累積的に等しいかまたはそれを上回る複数の輸液に分配することができる。
いくつかの実施形態において、特に、細胞集団に高い割合のゲノム編集細胞が存在するため、106/キログラム(患者当たり106〜1011)の範囲のより少ない数の細胞が、これらの範囲内の投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、治療を受ける患者にとって同種、同系、異種、または自家であり得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される薬学的組成物は、ある量のゲノム編集T細胞を、1つ以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集細胞を含む薬学的組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン;抗酸化剤;キレート剤、例えば、EDTAまたはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態において企図される組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内(静脈内または動脈内)、腹腔内または筋肉内投与のために製剤化される。
液体の薬学的組成物は、それらが溶液、懸濁物、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの1つ以上を含んでもよい:滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド等の不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒;ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤;酢酸、クエン酸またはリン酸等の緩衝液、および、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース等。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。注射用薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は無血清培地である。
無血清培地は、単純化されたより良好に定義された組成、混入物の程度が低いこと、感染病原体の潜在的な源の排除、およびより低いコストを含む、血清含有培地に勝るいくつかの利点を有する。種々の実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択的にタンパク質を含まない場合がある。任意選択的に、培地は、生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地は、その成分が非動物性の源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地において天然タンパク質の代わりとなり、栄養分は、合成の植物性または微生物性の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、タンパク質を実質的に含まないものとして定義される。
特定の組成物に使用される無血清培地の例示的な例として、限定されないが、QBSF−60(Quality Biological,Inc.)、StemPro−34(Life Technologies)、およびX−VIVO 10が挙げられる。
好ましい一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、PlasmaLyte Aを含む溶液中に製剤化される。
別の好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液中に製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地が、解凍後の高い細胞生存率の成績を維持するために使用されてもよい。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例として、限定されないが、CryoStor CS10、CryoStor CS5、およびCryoStor CS2が挙げられる。
より好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、50:50のPlasmaLyte AおよびCryoStor CS10を含む溶液中に製剤化される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、有効量のゲノム編集細胞組成物を単独で、または1つ以上の治療剤と組み合わせて含む。したがって、組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光ダイナミック療法等の他の既知の治療と組み合わせて投与され得る。また、組成物は、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。そのような治療剤は、特定の癌等の、本明細書に記載される特定の病状のための標準的治療として当該技術分野で許容され得る。特定の実施形態において企図される例示的な治療剤は、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性および補助的な薬剤を含む。
L.ゲノム編集方法
種々の実施形態において、細胞集団のゲノムを編集する方法が企図される。細胞のゲノムを編集するためのゲノム編集組成物およびその使用方法は、高いゲノム編集効率を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物におけるゲノム編集エンハンサーの使用は、集団におけるゲノム編集細胞の数を有意に増加させることが企図される。
種々の実施形態において、細胞集団のゲノムを編集する方法が企図される。細胞のゲノムを編集するためのゲノム編集組成物およびその使用方法は、高いゲノム編集効率を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物におけるゲノム編集エンハンサーの使用は、集団におけるゲノム編集細胞の数を有意に増加させることが企図される。
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、ゲノム編集エンハンサーを使用せずに製造された集団におけるゲノム編集細胞の数と比較して、集団におけるゲノム編集細胞の割合を約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約200%、またはそれ以上増加させる。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、ゲノム編集エンハンサーを使用せずに製造された集団におけるゲノム編集細胞の数と比較して、集団におけるゲノム編集細胞の割合を約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍、もしくは約10倍またはそれ以上増加させる。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集方法は、標的部位でDSBを形成するために、本明細書で企図される1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーを細胞集団に導入することと、任意選択的に、誤りの多いNHEJによる切断の修復の速度または頻度を増加させるために、末端プロセシング酵素、例えば、3´−5´エキソヌクレアーゼまたはその生物学的に活性な断片、例えば、Trex2を細胞に導入することと、を含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集方法は、標的部位でDSBを形成するために、本明細書で企図される1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーを細胞集団に導入することと、その後、相同組換えによってDSBで細胞のゲノムに組み込まれる細胞集団に1つ以上のドナー修復鋳型を導入することと、を含む。
一実施形態において、細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法は、細胞に人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させるために細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
一実施形態において、細胞集団における相同組み換え修復(HDR)を増大させる方法は、細胞に人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型することと、細胞集団におけるHDRの頻度を増加させるために細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
一実施形態において、細胞集団における非相同末端結合(NHEJ)を増加させる方法は、人工ヌクレアーゼおよび任意選択的に末端プロセシング酵素、例えば、3´−5´エキソヌクレアーゼ(Trex2、Exo1、TdTetc.)を細胞に導入することと、細胞集団におけるNHEJの頻度を増加させるために該細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
ゲノム編集の速度または効率が増加する限り、ゲノム編集エンハンサーは、特定の実施形態において任意の好適な濃度で使用することができる。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、約0.01μM〜約200μM、約0.01μM〜約100μM、約0.01μM〜約10μM、約0.01μM〜約1.0μM、約0.1μM〜約200μM、約0.1μM〜約100μM、約0.1μM〜約10μM、約0.1μM〜約1.0μM、約1.0μM〜約200μM、約1.0μM〜約100μM、約1.0μM〜約10μM、または約0.01μM、約0.1μM、約0.2μM、約0.3μM、約0.4μM、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約1.0μM、約2.0μM、約3.0μM、約4.0μM、約5.0μM、約6.0μM、約7.0μM、約8.0μM、約9.0μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM、約50μM、約60μM、約70μM、約80μM、約90μM、もしくは約100μMまたはそれ以上の濃度、およびその間の任意の濃度でゲノム編集を増大させるために使用される。
特定の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、ベクターを用いて細胞に導入される。他の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、好ましくはmRNAとして細胞に導入される。ヌクレアーゼは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、DEAE−デキストラン媒介形質移入等によって細胞に導入されてもよい。
特定の実施形態において、1つ以上のドナー鋳型は、治療遺伝子もしくはその断片、導入遺伝子、または選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、限定されないが、βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、およびEPSPS;二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;ホルモン;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、および人工抗原受容体(例えば、人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体)を含む遺伝子またはその断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
ドナー鋳型は、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、DEAE−デキストラン媒介形質移入等によって細胞に導入されてもよい。
好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によって細胞に導入され、1つ以上のドナー修復鋳型は、ウイルス形質導入によって細胞に導入される。
別の好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によって細胞に導入され、1つ以上のドナー修復鋳型は、AAV形質導入によって細胞に導入される。AAVベクターは、AAV2由来のITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のいずれか1つに由来の血清型を含み得る。好ましい実施形態において、AAVベクターは、AAV2由来のITR、およびAAV2またはAAV6由来の血清型を含み得る。
別の好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によって細胞に導入され、1つ以上のドナー修復鋳型は、レンチウイルス形質導入によって細胞に導入される。レンチウイルスベクター骨格は、HIV−1、HIV−2、ビスナ・マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、またはサル免疫不全ウイルス(SIV)に由来してもよい。
細胞集団は、1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型が細胞に導入される前、間、または後に、ゲノム編集エンハンサーと接触させることができる。1つ以上のドナー修復鋳型は、1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーが細胞に導入される前、それと同時に、またはその後に送達されてもよい。ある特定の実施形態において、1つ以上のドナー修復鋳型は、1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーと同時に送達される。他の実施形態において、1つ以上のドナー修復鋳型は、例えば、限定されないが、1つ以上の人工ヌクレアーゼの約1分〜約30分、約1分〜約60分、約1分〜約90分、約1時間〜約24時間前、または1つ以上の人工ヌクレアーゼの24時間よりも前を含む、1つ以上のドナー修復鋳型の数秒から数時間から数日前に、1つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーの前に送達される。ある特定の実施形態において、1つ以上のドナー修復鋳型は、ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーの後に、好ましくは約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8時間以内に、より好ましくは約1、2、3、もしくは4時間以内に、またはより好ましくは約4時間以内に送達される。
1つ以上のドナー修復鋳型は、1つ以上の人工ヌクレアーゼと同じ送達系を用いて送達されてもよい。非限定的な例として、同時に送達される場合、ドナー修復鋳型および人工ヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、IDLVレンチウイルスベクターまたはAAVベクター(例えば、AAV6)によってコードされ得る。特定の好ましい実施形態において、人工ヌクレアーゼ(複数可)はmRNA電気穿孔によって送達され、ドナー修復鋳型はAAVベクターを用いた形質導入によって送達される。
特定の実施形態において、細胞の標的部位を修飾するためにCRISPR/Casヌクレアーゼ系が使用される場合、CasヌクレアーゼはmRNA電気穿孔によって細胞に導入され、ゲノムおよびドナー修復鋳型において編集される部位付近に結合するtracrRNA:crRNAまたはsgRNAをコードする発現カセットは、IDLVレンチウイルスベクターまたはAAVベクターを用いた形質導入によって送達される。
特定の実施形態において、細胞の標的部位を修飾するためにCRISPR/Casヌクレアーゼ系が使用される場合、Casヌクレアーゼ、およびゲノムにおいて編集される部位付近に結合するtracrRNA:crRNAまたはsgRNAは、mRNA電気穿孔によって細胞に導入され、ドナー修復鋳型は、IDLVレンチウイルスベクターまたはAAVベクターを用いた形質導入によって送達される。
一実施形態において、tracrRNA:crRNAまたはsgRNAは、化学的に保護された5および3’末端を有する化学的に合成されたRNAである。
別の実施形態において、Cas9は、化学的に合成されたtracrRNA:crRNAまたはsgRNAと複合体を形成したタンパク質として送達される。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図および例によってある程度詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変更および修正を行うことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるに過ぎない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得るさまざまな重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
実施例1
小分子スクリーニングで遺伝子編集エンハンサーを同定する
小分子スクリーニング(図1)を行って、初代ヒトT細胞のTCR遺伝子座においてゲノム編集の効率を調整することができる可溶性因子候補を同定する。
小分子スクリーニングで遺伝子編集エンハンサーを同定する
小分子スクリーニング(図1)を行って、初代ヒトT細胞のTCR遺伝子座においてゲノム編集の効率を調整することができる可溶性因子候補を同定する。
端的に述べると、精製したCD3+初代ヒトT細胞をCD3/CD28磁気ビーズで活性化し、IL−2添加完全RPMI培地で48時間培養してからビーズを除去した。ビーズの除去後、T細胞を洗浄し、メガTAL−Trex2融合mRNAを標的とするT細胞受容体α(TCRα)をコードするインビトロ転写mRNAを用いて電気穿孔した。次いで、細胞を384ウェルフォーマットに分配し、約2000個の既知の薬物、天然産物、および他の生理活性成分のライブラリー(Microsource Discovery System’s Spectrum Collection)と接触させた:各薬物の最終濃度は10μMとした。細胞を37℃で24時間化合物とともに培養し、次いで洗浄し、さらに3日間培養した。次いで、細胞をCD3、CD4、およびCD8表面マーカーについて染色し、ハイスループット体積フローサイトメトリー分析に供した。メガTALによって媒介されるTCRα遺伝子の破壊をCD3染色の損失によって検出した。
各化合物の存在下におけるメガTALの編集効率を、CD3染色が陰性であったCD4/CD8+細胞の割合として定量化した。FSC/SSCプロファイルの「ライブ」ゲートにおけるフローサイトメトリー事象の数を細胞収量の尺度として用いた。フローサイトメトリー分析時の細胞収量に与える影響に応じたランク順に(図2A)、CD3陰性細胞の頻度に応じたランク順に(図2B)化合物をプロットすることにより、またCD3陰性細胞の頻度を2000個の化合物全ての細胞収量の関数として(図2C)プロットすることにより、ゲノム編集に対する各化合物の影響を分析した。10個の最も活性な化合物の収量およびメガTAL活性を表1に示す。
実施例2
チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)およびハルミンは、メガTALによって媒介される初代T細胞における遺伝子破壊を増強する
実施例1に記載されるようにT細胞を精製し、活性化し、TAL−Trex2融合物を標的とするTCRαをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、30℃または37℃のいずれかで、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)およびハルミンを用いて24時間培養した。次いで、細胞を洗浄して残りの化合物を除去し、さらに3日間培養した。3日間の培養後、細胞をCD4、CD8およびCD3で染色し、実施例1に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。
チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)およびハルミンは、メガTALによって媒介される初代T細胞における遺伝子破壊を増強する
実施例1に記載されるようにT細胞を精製し、活性化し、TAL−Trex2融合物を標的とするTCRαをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、30℃または37℃のいずれかで、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)およびハルミンを用いて24時間培養した。次いで、細胞を洗浄して残りの化合物を除去し、さらに3日間培養した。3日間の培養後、細胞をCD4、CD8およびCD3で染色し、実施例1に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。
CD3陰性細胞の割合によって決定されるように、各化合物の濃度とTCRα破壊の効率との間に正相関が観察された。図3Aおよび図3B。遺伝子破壊における濃度依存性の増加に加えて、各化合物がT細胞の生存率および収率に対して濃度依存性の影響を示した。図3Cおよび図3D。アミナクリンは、細胞生存率に最小限の影響を与え、遺伝子破壊を大幅に増強した。
実施例3
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のT細胞受容体α(TCRα)遺伝子座への相同組換えを増強する
プロモーターと、蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子と、ポリアデニル化シグナルとを含む導入遺伝子カセットを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを設計および構築した。AAV ITRエレメントの完全性は、XmaIによる消化で確認した。導入遺伝子発現カセットをTCRα遺伝子のエクソン1内の2つの相同性領域の間に配置し、メガTALを標的とするTCRαを用いた相同組換え(AAV標的ベクター)による標的化を可能にした。5´および3´相同性領域は、それぞれ、約1500bpおよび約1000bpの長さであり、いずれの相同性領域も相補性メガTAL標的部位を含有していなかった。導入遺伝子発現カセットは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと、負の制御領域の欠失と、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたdl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターとを含有していた。発現カセットは、SV40後期ポリアデニル化シグナルも含有していた。
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のT細胞受容体α(TCRα)遺伝子座への相同組換えを増強する
プロモーターと、蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子と、ポリアデニル化シグナルとを含む導入遺伝子カセットを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを設計および構築した。AAV ITRエレメントの完全性は、XmaIによる消化で確認した。導入遺伝子発現カセットをTCRα遺伝子のエクソン1内の2つの相同性領域の間に配置し、メガTALを標的とするTCRαを用いた相同組換え(AAV標的ベクター)による標的化を可能にした。5´および3´相同性領域は、それぞれ、約1500bpおよび約1000bpの長さであり、いずれの相同性領域も相補性メガTAL標的部位を含有していなかった。導入遺伝子発現カセットは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと、負の制御領域の欠失と、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたdl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターとを含有していた。発現カセットは、SV40後期ポリアデニル化シグナルも含有していた。
組換えAAV−6(rAAV)は、必要な複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントを提供する1つ以上のプラスミドでHEK 293T細胞を一過性にコトランスフェクトすることにより調製した。イオジキサノール勾配で超遠心分離を用いて、コトランスフェクトしたHEK 293T細胞培養物からrAAVを精製した。
メガTAL誘導性の相同組み換え修復(HDR)を、CD3およびCD28で活性化し、IL−2を添加した完全培地で培養した初代ヒトT細胞において評価した。3日後、T細胞を洗浄し、メガTALを標的とするTCRαをコードするインビトロ転写mRNAを用いて電気穿孔し、その後、MND−GFP導入遺伝子カセットをコードする精製された組換えAAVで形質導入した。対照は、メガTALまたはrAAV標的ベクターを単独で含有するT細胞を含んでいた。2つの異なる用量のアミナクリンの存在下または非存在下で、30℃で一晩、細胞を培養した。電気穿孔の5日後、GFP+T細胞の頻度をフローサイトメトリーにより測定した。メガTALによって媒介されるTCRα遺伝子の破壊をCD3染色の損失によって検出した。
メガTALのトランスフェクションに続いてT細胞にアミナクリンを添加したときに(18%対36%GFP+および10μMアミナクリン)、HDR事象の頻度(GFP+細胞の%)に濃度依存性の増加が観察されたのに対し、AAV単独で処理した試料には最小限のGFP発現が観察されたのみであった。図4および表2。
実施例4
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のBCL11A赤血球エンハンサー領域への相同組換えを増強する
プロモーター、GFPまたはBFPリポーター導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを設計、構築、および検証した。導入遺伝子は1.3kbおよび1.0kbいずれかの相同性アームによってDHS58のBCL11A赤血球エンハンサー遺伝子座に隣接していた(Bauer et al.,Science.342(6155):253−7(2013))。実施例3に記載されるように、HEK293T細胞の一過性トランスフェクションによりrAAVを生成した。
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のBCL11A赤血球エンハンサー領域への相同組換えを増強する
プロモーター、GFPまたはBFPリポーター導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを設計、構築、および検証した。導入遺伝子は1.3kbおよび1.0kbいずれかの相同性アームによってDHS58のBCL11A赤血球エンハンサー遺伝子座に隣接していた(Bauer et al.,Science.342(6155):253−7(2013))。実施例3に記載されるように、HEK293T細胞の一過性トランスフェクションによりrAAVを生成した。
初代ヒト末梢血由来CD34+細胞をサイトカイン添加培地で72時間培養した。細胞を洗浄し、ヒトBCL11A赤血球エンハンサー領域に特異的なメガTALをコードするmRNA、またはヒトCCR5遺伝子座を標的とするメガTALのいずれかを用いて電気穿孔した。次いで、0μM、0.3μM、1.0μM、および3.0μMの濃度のアミナクリンを用いてまたは用いずに、細胞をAAVベクターとともに24時間インキュベートし、洗浄し、サイトカイン添加培地で培養した。フローサイトメトリーにより規則的な時点にHDRを分析し、BFPの蛍光を測定した。
アミナクリンは、BCL11A遺伝子座においてCD34+細胞のHDR頻度(BFP+細胞の%)に濃度依存性の増加を誘導した。図5。CD34+細胞における非相同性によって促進されるNHEJ経路を介した鋳型の捕捉はアミナクリンによって増加されなかった。CCR5特異的メガTALをBCL11A標的化AAV鋳型と組み合わせた場合、アミナクリンの添加によってBFP+細胞の割合は有意に増加しなかった。Id.
実施例5
アミナクリン処理は有害な影響を与えない
造血幹細胞または前駆細胞の生存率
遺伝子修復を増強するために小分子を使用することの潜在的な注意点は、造血幹細胞または前駆細胞の細胞生存率への影響である。メチルセルロースコロニー形成アッセイを用いて、アミナクリン処理がインビトロでの造血幹細胞または前駆細胞の生存率に与える影響を判定した。実施例4に記載されるように、ヒト末梢血CD34+細胞をサイトカイン添加培地で培養し、BCL11A特異的メガTALをコードするmRNAを用いて電気穿孔し、BCL11A−HDR AAVベクターで形質導入した。
アミナクリン処理は有害な影響を与えない
造血幹細胞または前駆細胞の生存率
遺伝子修復を増強するために小分子を使用することの潜在的な注意点は、造血幹細胞または前駆細胞の細胞生存率への影響である。メチルセルロースコロニー形成アッセイを用いて、アミナクリン処理がインビトロでの造血幹細胞または前駆細胞の生存率に与える影響を判定した。実施例4に記載されるように、ヒト末梢血CD34+細胞をサイトカイン添加培地で培養し、BCL11A特異的メガTALをコードするmRNAを用いて電気穿孔し、BCL11A−HDR AAVベクターで形質導入した。
電気穿孔後の最初の24時間の間、アミナクリンの存在下または非存在下で細胞を培養した。この電気穿孔後の回収ステップに続いて、細胞を計数し、メチルセルロース培地に播種した。
メチルセルロース培地で14日後、赤芽球バースト形成単位(BFU)および造血コロニー形成単位(CFU)を頻度および形態に基づいてスコア化した。メガTAL単独で、メガTALおよびrAAVで、アミナクリンを用いてまたは用いずに処理したCD34+細胞は、同様の系統結果をもたらし、対照電気穿孔細胞と比較しても明白な系統の歪みを示さなかった。図6。
アミナクリンによる処理が初代ヒト造血幹細胞および前駆細胞由来のメチルセルロースコロニーにおいてHDR率の増加をもたらすことができるかどうかを判定するために、コロニーを回収してフローサイトメトリーによって分析した。メガTALベクターおよびrAAVベクターの両方で処理した試料におけるフローサイトメトリーによって測定されるように、アミナクリン処理はHDRを受ける細胞の割合を増加させた。図7。
実施例6
アミナクリンはバルクHSC集団においてHDRを増大させる
初代ヒト末梢血由来CD34+細胞をサイトカイン添加培地で48時間培養した。細胞を洗浄し、ヒトBCL11A赤血球エンハンサー領域に特異的なメガTALをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。次いで、1.0μMの濃度のアミナクリンを用いてまたは用いずに、細胞をAAVベクターとともに24時間インキュベートし、洗浄し、サイトカイン添加培地で培養した。フローサイトメトリーにより規則的な時点にHDRを分析し、BFPの蛍光を測定した。
アミナクリンはバルクHSC集団においてHDRを増大させる
初代ヒト末梢血由来CD34+細胞をサイトカイン添加培地で48時間培養した。細胞を洗浄し、ヒトBCL11A赤血球エンハンサー領域に特異的なメガTALをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。次いで、1.0μMの濃度のアミナクリンを用いてまたは用いずに、細胞をAAVベクターとともに24時間インキュベートし、洗浄し、サイトカイン添加培地で培養した。フローサイトメトリーにより規則的な時点にHDRを分析し、BFPの蛍光を測定した。
アミナクリンは、BCL11A遺伝子座においてCD34+細胞のHDR頻度(BFP+細胞の%)を増加させた。図8。
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の権利が与えられる均等物の全範囲に加えて全ての可能な実施形態を包含するものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
Claims (118)
- 細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 前記細胞集団は、幹細胞を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 前記前記細胞集団は、造血細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞集団は、CD34+細胞、CD133+細胞、CD34+CD133+細胞、またはCD34+CD38LoCD90+CD45RA−細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞集団は、免疫エフェクター細胞を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 前記細胞集団は、CD3+、CD4+、CD8+細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 細胞集団は、T細胞を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 前記細胞集団は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、DNAインターカレーターである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、単官能性DNAインターカレーター、二官能性DNAインターカレーター、または多官能性DNAインターカレーターからなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、1,8−ナフタルイミド、4’6−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン(actinodaphnidine)、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、BOBO−1、BOBO−3、ボルジン、BO−PRO−1、BO−PRO−3、ブブロカプニン(bublocapnine)、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、DAPI、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、GelStar、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、JOJO−1、JO−PRO−1、キネチンリボシド、コクサイニン(kokusainine)、ロベリン、LOLO−1、LO−PRO−1、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、OliGreen、パルマチン、フェナントリジン、PicoGreen、ピラルビシン、ポリピリジル、POPO−1、POPO−3、PO−PRO−1、PO−PRO−3、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、RiboGreen、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、SYBR DX、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTO−11、SYTO−12、SYTO−13、SYTO−14、SYTO−15、SYTO−16、SYTO−17、SYTO−20、SYTO−21、SYTO−22、SYTO−23、SYTO−24、SYTO−25、SYTO−40、SYTO−41、SYTO−42、SYTO−43、SYTO−44、SYTO−45、SYTO−59、SYTO−60、SYTO−61、SYTO−62、SYTO−63、SYTO−64、SYTO−80、SYTO−81、SYTO−82、SYTO−83、SYTO−84、SYTO−85、SYTOX blue、SYTOX green、SYTOX orange、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、TO−PRO−1、TO−PRO−3、TO−PRO−5、TOTO−1、TOTO−3、ウサンバレンシン、YO−PRO−1、YO−PRO−3、YOYO−1、YOYO−3、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、およびハルミンからなる群から選択される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン(9−アミノアクリジン)である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 細胞、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 細胞、9−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 細胞、9−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 9−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 9−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに/または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、組成物。
- 前記人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)から遺伝子操作される、請求項29に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項29または請求項30に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される、請求項29〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記メガTALは、TALE DNA結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記TALE結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項33に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項33または請求項34に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項33〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される、請求項33〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記TALENは、TALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項38に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項38または請求項39に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される、請求項38〜40のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項39に記載の組成物。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項42に記載の組成物。
- 前記ZFNは、TALE結合ドメインを含む、請求項42または請求項43に記載の組成物。
- 前記TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項44に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項42〜45のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される、請求項42〜46のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記人工ヌクレアーゼは、CRISPR/Casヌクレアーゼを含む、請求項39に記載の組成物。
- 前記Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である、請求項48に記載の組成物。
- 前記Casヌクレアーゼは、1つ以上のTALE DNA結合ドメインをさらに含む、請求項48または請求項49に記載の組成物。
- 前記組成物は、tracrRNAと、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のcrRNAと、をさらに含む、請求項48〜50のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のsgRNAをさらに含む、請求項48〜50のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記末端プロセシング酵素活性は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性である、請求項53に記載の組成物。
- 前記末端プロセシング酵素活性は、Trex2またはその生物学的に活性な断片の3−5’エキソヌクレアーゼ活性である、請求項54に記載の組成物。
- 前記組成物は、末端プロセシング酵素、または前記末端プロセシング酵素をコードするmRNAをさらに含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記末端プロセシング酵素は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す、請求項56に記載の組成物。
- 前記末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項56または請求項57に記載の組成物。
- βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;ホルモン;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法であって、
(a)細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、
(b)前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーの存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、前記細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させる、方法。 - 細胞集団における相同組み換え修復(HDR)を増大させる方法であって、
(a)前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、
(b)標的部位に二本鎖切断(DSB)を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、
(b)前記細胞集団にドナー修復鋳型を導入することと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーおよび前記ドナー修復鋳型の存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、相同組み換え修復(HDR)による前記標的部位における前記ドナー修復鋳型の組み込みの頻度を増加させる、方法。 - 細胞集団における非相同末端結合(NHEJ)を増加させる方法であって、
(a)前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、
(b)標的部位に二本鎖切断(DSB)を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、
(a)細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーの存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、前記標的部位におけるNHEJの頻度を増加させる、方法。 - 前記細胞は造血細胞である、請求項62〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は免疫エフェクター細胞である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、CD3+、CD4+、CD8+、またはそれらの組み合わせである、請求項62〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞はT細胞である、請求項62〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、請求項62〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項62〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞はCD34+細胞である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞はCD133+細胞である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞はCD34+CD38LoCD90+CD45RA−細胞である、請求項62〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーはDNAインターカレーターである、請求項62〜74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、単官能性DNAインターカレーター、二官能性DNAインターカレーター、または多官能性DNAインターカレーターからなる群から選択される、請求項62〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される、請求項62〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、1,8−ナフタルイミド、4’6−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン(actinodaphnidine)、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、BOBO−1、BOBO−3、ボルジン、BO−PRO−1、BO−PRO−3、ブブロカプニン(bublocapnine)、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、DAPI、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、GelStar、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、JOJO−1、JO−PRO−1、キネチンリボシド、コクサイニン(kokusainine)、ロベリン、LOLO−1、LO−PRO−1、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、OliGreen、パルマチン、フェナントリジン、PicoGreen、ピラルビシン、ポリピリジル、POPO−1、POPO−3、PO−PRO−1、PO−PRO−3、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、RiboGreen、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、SYBR DX、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYTO−11、SYTO−12、SYTO−13、SYTO−14、SYTO−15、SYTO−16、SYTO−17、SYTO−20、SYTO−21、SYTO−22、SYTO−23、SYTO−24、SYTO−25、SYTO−40、SYTO−41、SYTO−42、SYTO−43、SYTO−44、SYTO−45、SYTO−59、SYTO−60、SYTO−61、SYTO−62、SYTO−63、SYTO−64、SYTO−80、SYTO−81、SYTO−82、SYTO−83、SYTO−84、SYTO−85、SYTOX blue、SYTOX green、SYTOX orange、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、TO−PRO−1、TO−PRO−3、TO−PRO−5、TOTO−1、TOTO−3、ウサンバレンシン、YO−PRO−1、YO−PRO−3、YOYO−1、YOYO−3、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項62〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される、請求項62〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム(臭化エチジウム)、およびハルミンからなる群から選択される、請求項62〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである、請求項62〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン(9−アミノアクリジン)である、請求項62〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項62〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)から遺伝子操作される、請求項83に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項83または請求項84に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される、請求項84〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メガTALは、TALE DNA結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記TALE結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項87または請求項88に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEから遺伝子操作される、請求項87〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから遺伝子操作される、請求項87〜90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TALENは、TALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項92に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項92〜93に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される、請求項92〜94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項96に記載の方法。
- 前記ZFNは、TALE結合ドメインを含む、請求項96または請求項97に記載の方法。
- 前記TALE DNA結合ドメインは、約9.5個のTALE反復単位〜約11.5個のTALE反復単位を含む、請求項98に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項96〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼドメインは、FokIから単離される、請求項96〜100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記人工ヌクレアーゼは、CRISPR/Casヌクレアーゼを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である、請求項102に記載の方法。
- 前記Casヌクレアーゼは、1つ以上のTALE DNA結合ドメインをさらに含む、請求項102または請求項103に記載の方法。
- 前記組成物は、tracrRNAと、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のcrRNAと、をさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物は、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする1つ以上のsgRNAをさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む、請求項62〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素活性は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性である、請求項107に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素活性は、Trex2またはその生物学的に活性な断片の3−5’エキソヌクレアーゼ活性である、請求項108に記載の方法。
- 前記組成物は、末端プロセシング酵素、または前記末端プロセシング酵素をコードするmRNAをさらに含む、請求項62〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素は、5−3’エキソヌクレアーゼ、5−3’アルカリエキソヌクレアーゼ、3−5’エキソヌクレアーゼ、5’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性DNAポリメラーゼの活性を示す、請求項110に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項110または請求項111に記載の方法。
- βグロビン、δグロビン、γグロビン、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、アルブミン、第VIII因子、第IX因子、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA−4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag−1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項62〜112のいずれか一項に記載の方法。
- 二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子;ホルモン;サイトカイン(例えば、IL−2、インスリン、IFN−γ、IL−7、IL−21、IL−10、IL−12、IL−15、およびTNF−α)、ケモカイン(例えば、MIP−1α、MIP−1β、MCP−1、MCP−3、およびRANTES)、細胞毒(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL−2受容体、IL−7受容体、IL−12受容体、IL−15受容体、およびIL−21受容体)、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項62〜112のいずれか一項に記載の方法。
- 人工T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項62〜112のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項62〜115のいずれか一項に記載の方法によって生成される、細胞。
- 請求項116による細胞を含む、組成物。
- 薬学的に許容される担体および請求項116による細胞を含む、薬学的組成物。
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