JP2014513531A - 粘度の表現型が変化した糸状菌 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、共に2011年4月22日に出願された米国仮出願第61/478,160号、同第61/478,162号に対する優先権を主張し、これらの全文を参照により本明細書に援用する。
本発明の菌株及び方法は、生育特性が変化した菌株変異体を生じさせる、糸状菌における遺伝子突然変異に関する。このような変異体は、(例えば、商業的用途のための酵素及び他のタンパク質又は代謝物の大量生産のための)深部培養での生育に非常に好適である。
本発明の菌株及び方法は、形態及び生育特性に影響する遺伝子改変のなされた糸状菌細胞の変異菌株に関する。変異細胞を深部培養で生育した場合、これらは、親菌株の細胞を含む細胞ブロスと比較して、異なるレオロジー特性を有する細胞ブロスを生成する。これらの変異菌株のうちの一部は、酵素及び他の商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に好適である。
本発明の菌株及び方法を詳細に説明するのに先立ち、明確性のために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連技術において使用されるように、それらの通常の意味に従うべきである。
一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Seb1タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含む、変異菌株を提供する。変異菌株の細胞は、続いて、深部培養における好気性発酵の間に親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、又は親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。
MDGMMSQAMGQQAFYFYNHNHDHKMARQAIFAQQMAAYQMVPTLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSRKHMMLDAEFGDNPYFPSTPPLSTSGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAMKEAVDTTESLVVDWASIVSPPLSPVYFQSQVSRVPSPTSSPSDILSTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLTGLAEDLKGEQLSTAQHTFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSNLVNLGEVNPIDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEELSFEDNDAFGFNSLPSPTSSIDFSDVHQDKRRKKEKKDIKPIMNTAASGSPSGNEQIGATPAASAASDSNASSASEDPSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHAGGAIVMNLIEDGSEVPAFDGSMMTGPVGDDYNTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGDQSKKKRKRSD
アスペルギルス・クラバーツスのSeb1タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号2として示す:
MDTTYTMVGTPVQGQPSFAYYTTNDSQSRQQHFTSHPSEMQAFYGQMQPYPQQQQQTCMPDQQSIYAAQPMLNMHQMATANAFRGALSMTPIVSPQPTHLKPTIIVQQDSPMLMPLDTRFVSSDYYAFPSTPPLSTSGSTISSPPSSGRSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHSELLANADWSRSDSPPLTPVFIHPPSLTASQSSDLLSAHSSCPSLSPSPSPVSSTFIAPPHSGLSVEPSGTDFCDPRQLTVESSVDSSTELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHESLSPAYTSSTEDPLGSLPTFDSFTDLDSEDEFVNNLVDFHPGGNPYFLGDKRQRLGSYLLEEDEFLSDRSFDDLDDHEAFAHSGLPSLEPSELISVQGDVAEVSEEMRSKKRTTSRRTLKRTNSSDSSSESLATSGKRTQASANGRSGHSEATSSSAQQSTTPSRQNSTANASSSSEAPSAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCTLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNASLQASYEEREPRLLGAALYEAANAAANKSTTSDSSDGTISDTSSVEGRPIKKRRREDHA
アスペルギルス・フミガーツスAf93のSeb1タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号3として示す:
MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPFEMQYYGQVSSYPQQQAQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQDSPALMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTDWSRSDSPPLTPVFIQPQSLTASQSSDLLSAQIPCPSLSPSPSPDSATFISHPQSILSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFQGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESTDFLAVEGDATQSTEEMSSKKRVTSRRSLKKASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSDTTSTVQQSTASSRQNSTANTSNSESPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNSSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV
ネオサルトリア・フィシェリNRRL 181のSeb1タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号4として示す:
MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPSEMQYYGQVPPYPQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQQDSPVLMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTGWSRSDSPPLTPVFIQPPSLTASQSSDLLSAHMSCPSLSPSPSPDSTTFISHPQSVLSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFLGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESSDFLAAEGDATQNTEEMSSKKRVTSRRSLKRASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSETTSTVQQSTASSRQNSTANTSSSGSPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNGSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV
トリコデルマ・リーゼイのSeb1タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号5として示す:
MDGMMSQPMGQQAFYFYNHEHKMSPRQVIFAQQMAAYQMMPSLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSSRKPMLVDTEFGDNPYFPSTPPLSASGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAIKDSIDATESLVLDWASIASPPLSPVYLQSQTSSGKVPSLTSSPSDMLSTTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLLADDIKGEPLPTAAQPSFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSSLVNLGEINPVDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEDLSFDDEAFHFPSLPSPTSSVDFCDVHQDKRQKKDRKEAKPVMNSAAGGSQSGNEQAGATEAASAASDSNASSASDEPSSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHSGGAIVMNLIEESSEVPAYDGSMMAGPVGDDYSTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGEQGKKKRKRSD
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルで変化したSeb1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1、2、3、4、又は5のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号1、2、3、4、又は5に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は更には少なくとも約99%の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するBLASTサーチから同定することができる。
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、Seb1生成又はMpg1及びSeb1生成に影響を与える遺伝子変化を、Sfb3生成に影響を与える遺伝子変化と組合せる。Sfb3遺伝子(Lst1としても知られる)は、かつては、出芽酵母(すなわち、サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae))において前に特徴付けられていたが、この遺伝子は、小胞体からゴルジ体へタンパク質を運搬する輸送小胞を囲むCOPIIタンパク質に関連するタンパク質をコード化する。Sfb3及びSfb2は、Sec24のホモログであり、これらの遺伝子は全て、小胞の中に特定の積荷タンパク質をパッケージングすることと関連する。
MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFMRDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKEGDGEATAVMANFAGLRPAYW
アスペルギルス・オリザエRIB40のSfb3アミノ酸配列(GI:83766074;配列番号7):
MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKLFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRETGYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCVVSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYFSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYW
アスペルギルス・ニガーのSfb3アミノ酸配列(配列番号8)
MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWLHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMLVEDRNNEAQSSVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYW
ペニシリウム・フニクロスムのSfb3アミノ酸配列(配列番号9)
MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDVGDLATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKAGDKTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYW
ペニシリウム・クリゾゲナムのSfb3アミノ酸配列(配列番号10)
MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQPQQQSQFLNTGLNQHADRPVSPAVGLVSGQSVAAIPGIQSGAGSVPTSGRIDPEHIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMDQHLPPPAAIPFVAQDQGNSSPKYARLTLNNIPSASDFLTSTGLPLGMILQPLAPLDPGEQPIPVLDFGDVGPPRCRRCRTYINPFMSFRSGGSKFVCNMCTFPNDTPPEYFAPLDPSGARVDRMQRPELLMGTVEFTVPKEYWNKEPVGLQTLFLIDVSRESVHRGFLKGVCAGIKDALYGDDDKASEGTEGDGSSRKLPVGAKVGIVTYDKEVHFYNLAAALDQAQMMVMTDLDEPFVPLSEGLFVDPYESKSVITSLLSRIPKIFSSIKNPESALLPTLNSALSALQATGGKIVCAVASLPTCGPGHLAIREDPKVHGTDAERKLFTTENPAWKKTASKLAEAGVGLDLFMAAPGGTYLDVATIGHVSSLTGGETFFYPNFHAPRDLLKLRKEIAHAVTRETGYQTLMKVRCSNGLQVSAYHGNFVQHTLGADLEIAGVDADKAVGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSADGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFVDQDAVVSVIAKEAASKTLDKNLKDIRASISEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLVKSRAFKAGPESSDRRIHDMRLIRSMGCTEMALYLYPRIIPVHNMQPEDGFANEHGQLQIPPTMRASYSRIEDGGVYIVDNGQAILLWIHAQVSPNLLEDLFGPGHNSLQGLNPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKSVTIQLARQGLDGAEYEFARLLLEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEEGGEGALASLSAMRTPYW
ネウロスポラ・クラッサのSfb3アミノ酸配列(配列番号11)
MADYTMYHALGQGETLDPNDPNRTTQPAPPQFQPPVAPNPYHPGAEYNAPGQQQQQQQQYGQQYGQQYGQQYGQQQYGQEYGHQQQQQQQQQYGAPSPYGAPPAHSPVSPMDDVGLAAQMGGMSLGAGAGAADHHGRKKKKDRHAFHTVEAPAGSSQPFNGMPPAGIPATQFLNADPSLAGRIPGPGHGQFPMPASPAFGPVPTSAADFAARDATQGVGSGVFAAGGPQGGKPSPDDTPSVPLSRDAVQPYFHTNVYPTFERLVPPPAVTSFVALDQGNSSPKFARLTMTNLPASAEGLKSTGLPLGLLLQPLAETQPGELPIPVLDFGEQGPPRCHRCRAYMNPFMMFKAGGNKFVCNLCTYANDTPPEYFCALSPQGVRVDRDQRPELTRGTVEFVVPKEYWTKEPVGMRYLFVIDVTQESYNKGFLESFCEGILSALYGGSEEGEDQDETGEPKRKIPAGAKVGFVTFDQEIHFYNVSPALEQAQMIVMPDIEDPFLPLSDGLFVDPYESKAVISSLLTRLPQMFSNIKNPEPALLSALNSAVAALEKTGGKVFCSLAALPTWGPGRLFMRDDGKHPGGEPDKKLFTTEHPGWRKLAEKMVSLGVGADFFMASPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFFYPNFVVQRDSTKLSLEIHHAVRRETGYAALMKVRCSNGLQVNAYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKALAVTFGYDGKLDSKLDAHFQAALLYTTASGQRRVRCINVIAGVSDLARDCMKYIDQDAIVSILAKEASTKLSTTSANLKEVRSSLTEKTIDILALYRKNHLAVPHPPQQLVMPERLKEFTMYVLGMLKCRAFKGGNETTDRRVHDMRLIRSMGARELSLYLYPRIIPLHSLQPEDGYPDATTGHLRMPSTMRASFARVEPGGVYLVDNGQVCLLWMHAQTAPALIQDLFGEDKTTLQSLDPYTSTIPVLETHLNAQTRNIIEYMRTVRGSKGLTIQLARQGIDGAEFEFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHVHKGVQLELAGQRKREDGESHSALGSFTGLRPAYW
フザリウム・オキシスポラムのSfb3アミノ酸配列(配列番号12)
MADYAQYHALGQGEVIDPNDPNRTSQPSAQQFQPPIAPSPYQQQASPYGAPQYLGGQQAPPPMTGSPAPAPGYGYAPPQAQAPPGQAPPSQDATLAAQLGGMNLGDGHGTARRKKKDRHAYHTVEPTGSSQAFNGMPPQGTSATQFLDSVPGGPGFGGQFGSPQGTPQMQSQSQFSAPVNPAFGPGPVAGTPGVGEGLGTASVSTSGPKGVSPDDMPSVPASRDAIQQYYLKNVYPTFERHVPPPSTVSFVAYDQGNSSPKYTRLTLNNIPTTQDALQATGLSLGLLLQPLAPLQAGEAEIPVLDFGEAGPPRCRRCRAYMNPFMMFRSGGNKFVCNLCAYPNDTPPEYFSATNPQGVRVDRDTRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFLIDVTQESYNKGYVEAFCEGIRVALYGGEDQELDENGEPKRRIPEGAKVGFVTYDKDIHFYNVNPALDQAQMMIMPDLEDPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLTRLPDMFSTIKNPEPALLAALNSALAALEATGGKVVASCSALPTWGPGRLFMRDNGNHPGGEIDKKLYTTEHPAWKKVAEKMAASGVGADFFLAAPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFYYPNFIAARDSRKLSLEISHAVTRETGFQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKAMGVSFSYDGKLDPKLDAHFQSALLYTTASGERRVRCSNVIASVTETSKESGAREQGIRECLKFVDQDAVIGMLAKEASTKLATTSSNLKDIRHWLSEKAIDVLACYRKHAAQQHPPGQLVMPERLKEYCMYLLGLLKCRALKGGVENSDRRVHEMRMLRSMGALELSLYLYPRMIPIHNLAPEEGFADPETGHLKMPPAIRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHSQTSPNLISDLFGEDKDSLKSLDPYTSALPLLETHLNAQVRNIIEFLRTMRGSKGLTIQLARQGIDGAEFDFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHKGVQLELSGQRKKEGEEHTAASLSNFAGLRPAYW
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したSfb3タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号6、7、8、9、10、11、又は12のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号6、7、8、9、10、11、又は12に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は更には少なくとも約99%の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するBLASTサーチから同定することができる。
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、Seb1生成又はSeb1及びSfb3生成に影響を与える遺伝子変化を、Mpg1生成に影響を与える遺伝子変化と組合せる。Kruszewskaら(1998)Cur.Genet.33:445〜50及びZakrzewskaら(2003)Applied and Enviromnetal Microbiology 69:4383〜89)に記載されている通り、トリコデルマ・リーゼイ由来のMpg1(PID 122551)は、GTP:アルファ−D−マンノース−1−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼをコード化する。mpg1遺伝子の過剰発現は、タンパク質のグリコシル化の初期段階で主な調節的役割を果たし得るGDP−マンノースレベルを上昇させる。しかし、Mpg1は、これまで形態変化、特に、低粘度表現型を生じさせる形態変化とは関連付けられていなかった。
MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLAERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIIM
ニューロスポラ・クラッサのMpg1タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号37として示す:
MKALILVGGFGTRLRPLTLTMPKPLVEFGNKRMILHQIEALAAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKYLAEYEKQFGINITISIESEPLGTAGPLKLAEDVLRKDDTPFFVLNSDVTCEYPFKELAAFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVQFVGNRINAGLYIFNPSVIDRVELRPTSIEQETFPAMVRDGQLHSFDLEGFWMDIGQPKDFLTGTCLYLSSLTKKGSKELAPTTLPYIHGGNVLIDPSAKIGKNCRIGPNVTIGPNVVVGDGVRLQRCVLLEGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGKWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSILPHKTIKANVDVPAIIM
アスペルギルス・オリザエのマンノース−1−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、以下に配列番号38として示す:
MKGVGGGTRRTTKVCNKMVHAVAAGVTDVAVNYRMKAYKMKAVGGGTRRTTKVGNRMHVSAAAGVTDVAVNYRDVMVSAKKYYNNSVSDTAGKARGKDDSVNSDVCDYKHKAHGDGTVVTKVYNVKSVSGTAGKAKGKDDSVNSDVCDYKAHKKHGDGTVVTKVDSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGMYNSVKRRTSKTAMVADNHSSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGYMNSVNRRTSTACKDGHSDGWMDVGKDSGTCYSSTKKGSKTTYVHGGNVMHSAKGKNCRGNVTGDGWMDVGKDSGTCYTSAKRNSKANSYVYGGNVMVDSAKGKNCRGNVVGDVVVGDGVRRCVKGSKVKDHAWVKSTVGWNSTVGRWARNVTVGDDVTGDYVNGGSVHNVVVGDGVRRCVNSKVKDHAWVKSTVGWNSSVGRWARNVTVGDDVTADVYVNGGSHKSKANVDVAMKSKNVDVAM
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したMpg1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号36、37、又は38のうちの少なくとも1つのアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号36、37、又は38に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は更には少なくとも約99%の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するBLASTサーチから同定することができる。
粘度を低下させる糸状菌株を使用した場合、深部培養時の酸素及び栄養素の分布が改善し、深部培養物を撹拌するのに必要とされるエネルギー量が低下し、培養物中に存在する細胞集団を増加させ、タンパク質生成を増加させることが知られている。更に、糸状菌の本変異菌株は、既に記載されている低粘度菌株よりも著しい効果を提供する。
(a)(i)深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び/又は、(ii)深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに
(b)
(a)における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する対象タンパク質をコード化する遺伝子、を含む、変異菌株を提供する。
A.概略
アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換を用いて、pyr4遺伝子を含有する核酸で、代表的な糸状菌、すなわち、トリコデルマ・リーゼイを形質転換することによって、糸状菌破壊ライブラリを調製した。この方法では、pyr4遺伝子は、選択マーカー及び遺伝子タグの両方として機能した。用いた具体的なA.ツメファシエンス菌株は、EHA 105であり、これは、強毒性であると考えられる(Hoodら,1993)。しかし、他のA.ツメファシエンス菌株、例えば、A136及びEHA 101も、T.リーゼイにおいて同様の形質転換効率が得られる。A.リゾゲネス菌株、例えば、ATCC 43057を用いてもよい。具体的な破壊ライブラリは、約50,000の形質転換体を含有していた。
破壊に用いたベクターは、PZP 100ベクターに基づいており、これは、左及び右のT−DNA境界領域、大腸菌(E. coli)からアグロバクテリウムへの移動のためのpBR322 bom部位、それぞれ、大腸菌及びアグロバクテリウムにおけるColE1及びpVS1プラスミド複製起点、並びにクロラムフェニコール耐性を付与するための細菌マーカーを含む(Hajdukiewiez,O.ら,1994)。ベクターの図を図1Bとして示すとともに、T−DNA破壊カセットの概略図を図1Aとして示す。
コンピテントなアグロバクテリウム細胞を以下の通り作製した。簡潔に述べると、28℃で約3日間LA培地において生育させることによって、アグロバクテリウム細胞を冷凍保存から再生した。次いで、コロニーを選択し、生育が明らかになるまで、28℃の250mL凹底フラスコ内にて0.1%グルコースを含有するLB培地(体積50mL)中で生育させた。あるいは、コロニーを5mLの培養管で開始し、生育が明らかになったら250mLのフラスコに移した。次いで、250mLのフラスコの体積の約10%を、同じ培地の入った新たなフラスコに移し、これをOD(600nm;OD600)が約0.4〜0.8になるまで生育させた(約5〜6時間生育)。10,000rpmで10分間冷たい遠心分離機で遠心分離することによって細胞を収集し、次いで、1Mの冷HEPES(pH 7.0)で3回洗浄した。次に、細胞を10%グリセロールを含む1mMの冷HEPESで1回洗浄し、次いで、アリコートを−70℃で冷凍した。細胞の生存率を求めた(典型的に、凍結後約1×109CFU/mL)。
250mLのフラスコにおいて、25mLの最少培地(2.05g/L K2HPO4、1.45g/L KH2PO4、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO4・7・H2O、0.1g/L CaCl2・6・H2O、0.0025g/L、FeSO4・7・H2O、0.5g/L(NH4)2SO4、及び2g/Lグルコースに、滅菌後25ppmのクロラムフェニコールを添加した)に、ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムの凍結ストックを又は新たなLAプレートから直接接種した。次いで、最少培地培養物を、曇るまで(一晩から数日間)振盪しながら28℃でインキュベートした。10mLの培養物を、250mLのフラスコ中の50mLの誘導培地(2.05g/L K2HPO4、1.45g/L KH2PO4、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO4・7・H2O、0.1g/L CaCl2・6・H2O、0.0025g/L、FeSO4・7・H2O、0.5g/L(NH4)2SO4、1.8g/Lグルコース、5g/Lグリセロール、40mM MES中で調製、pH 5.3、滅菌後1Mアセトシリンゴン200μLを添加)に移した。初期OD600は、約0.1であり、ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム細胞をOD600が約0.4〜0.8になるまで生育させた。
破壊ライブラリにおける形質転換体を、光学顕微鏡を用いて固体及び液体培地における形態変化についてスクリーニングした。形質転換後、コロニーピッカーを用いてニトロセルロースフィルタから個々の形質転換体を取り出し、ジャガイモデキストロース寒天を含有する96ウェルマイクロタイタープレート(CP−700,Norgren Systems LLC,Fairlea,WV,USA)に移した。あるいは、形質転換体に由来する胞子を合わせ、出芽させ、セルソーターを用いて単一胞子をマイクロタイタープレートに添加した。セルスプレッダーを用いて20mLの滅菌蒸留水中にVogel形質転換プレートに由来する胞子を懸濁させることによって胞子を収集した。50mLの最少培地を含有する250mLのフラスコに胞子を接種し、生殖系列が得られるまで24時間撹拌しながら28℃でインキュベートした。70μmのノズルを用いて15,000事象/秒の事象速度、414kPa(60psi)で、高速分別(MoFlo sorter,Cytomation,Fort Collins,CO,USA)を用いて、個々の生殖系列を、ジャガイモデキストロース寒天を含有するマイクロタイタープレート(Difco,Detroit,MI,USA)に広げた。上記方法のいずれかによって得られた形質転換体を含有するマイクロタイタープレートを28℃で7日間インキュベートした。個々の生殖系列胞子を、YEG(水1L当たり酵素抽出物5g、グルコース20g)を含有するガラス底を有する384ウェルの黒色sensoplate(Greiner Bio−one,Germany)に繰り返しプレーティングし、20℃で24時間インキュベートした。個々の形質転換体の形態を顕微鏡で調べた。
上記手順から得られた突然変異体F16は、プレート上において、次いで、液体培地において変化した形態を有することが観察された。PDAプレートでは、突然変異体F16は、T4親に比べて生育が制限されていた。液体培地では、F16は、T4親よりも短いフィラメントを有するようにみえた。菌株T4及びF16を深部(液体)培養にて同一条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部にバッフルを有する3Lフラスコ内の500mLの培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。振盪インキュベータ内で、培養物を最少培地中で48時間34℃にて生育させた。
T.リーゼイのMorph 1.1(すなわち、「Morph」)突然変異体は、4つの主なセルラーゼ遺伝子(すなわち、cbhI、cbhII、eglI及びeglII)が欠失しており、これによって、セルラーゼのバックグラウンド活性の非存在下で他のタンパク質を発現させるのに有用である。ku80遺伝子は、Morphから欠失して、相同組み換えを増加させるので、seb1の配列特異的破壊に役立つ。pyr4遺伝子は、それを形質転換マーカーとして用いることができるように破壊した。約500bpの5’ seb1フランキング配列及び約500bpの3’ seb1フランキング配列と共に、前述のF16突然変異体から得られたDNAに由来する破壊されたseb1遺伝子を増幅させることによって、PCRによりseb1破壊カセットを調製した。Morph1.1 Δku80Δpyr4を、この欠失カセットと共にPEGを用いて形質転換して、菌株Morph1.1 Δku80Δpyr4Δseb1を生成した。上記の通り、この菌株は、文献(Peterbauer,C.ら,2002)に記載されているT.アトロビリデseb1欠失菌株と同様に浸透圧ストレス応答性を有していた。
A.Morph菌株TrGA #32
上記Morph菌株を、マーカーとしてamdsを用いて、CBH1プロモーターの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子(TrGA)で予め形質転換した。次いで、2つのタンドム(tandom)コピーのグルコアミラーゼ(TrGA 29−9)を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、粘度低下表現型に関連する形態の変化している細胞壁突然変異体(70H2)を得た。この粘度低下表現型は、後に、切頭型sfb3遺伝子の結果であることが求められた(データは示さない)。TrGAの更なるコピー(すなわち、TrGA #32)で形質転換された70H2菌株は、更に、TrGAを過剰発現させるために有用であった。
seb1破壊カセットプラスミドpRATT240(図6)を、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。このプラスミドは、菌株T4 F16で同定されたT−DNA挿入部位に対して(seb1転写に対して)直5’側のDNA配列に相同な3.3Kbの領域と、T−DNA挿入部位に対して直3’側のDNA配列に相同な3.3Kbの領域とを有するDNA配列を含んでいた。これら配列は、菌株T4 F16において同定された挿入部位に対して介在カセット配列を挿入することを標的とするように設計した。これら介在配列は、形質転換される菌株のゲノムにおける内因性のT.リーゼイpyr2に対する相同性を最小限に抑えるためにトリコデルマ・アトロビリデに由来するpyr2選択マーカーを含んでいた。pyr2選択マーカーの直上流は、マーカーの3’末端の直接反復複製であり、これは、マーカーのその後の喪失及び形質転換体/欠失体の有用なpyr2突然変異体誘導体の単離を促進した。この完全seb1破壊カセットを、プライマーRPG257及びRPG264(表2を参照)を用いてPCRによって増幅させた。複数のPCR反応物をプールし、後続工程で用いるために標準的な分子生物学的手順を用いて清浄化した。
PEG媒介形質転換を用いて菌株TrGA #32をseb1破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するVogel最少培地にプレーティングして、pyr2マーカーによって獲得されるウリジン原共に基づいて候補を選択した。Vogel最少培地に移すことによって、個々の形質転換体を単離した。PCR解析を用いて、相同組み換えによってseb1遺伝子座にseb1破壊カセットが挿入されている形質転換体を同定した。seb1遺伝子座におけるΔseb1破壊カセットの相同挿入は、2対のプライマーを用いて予測されるサイズのDNA断片を増幅することによって確認した。プライマー対RPG297及びRPG253は、破壊カセット領域の5’末端の外側から始まって3’領域内で終わるDNA断片を増幅した。プライマー対RPG296及びRPG273は、破壊カセット領域の5’領域内から始まって3’末端の外側で終わるDNA断片を増幅した。破壊と一致して、第3のプライマー対RPG133及びRPG220は、形質転換されていない親菌株由来のテンプレートDNAを用いて挿入部位にわたる1.6KbのDNA断片を増幅したが、seb1破壊菌株由来のテンプレートDNAを用いるこの断片の増幅には失敗した。seb1破壊カセットの相同挿入が確認され、生成された菌株をTrGA#32 Δseb1と命名した。
菌株TrGA#32及びTrGA#32 Δseb1を、実施例2に記載の通り深部(液体)培養において同一条件下で生育させ、その生育表現型を比較した。表3として示す通り、TrGA#32菌株からseb1遺伝子が欠失すると、(予め選択された溶存酸素のレベルを維持するために必要とされるrpmに基づいて)粘度を更に低下させる菌株が得られ、これは、seb1遺伝子の破壊及びsfb3遺伝子の破壊が形態及び粘度低下に対して更なる影響を有することを示唆する。タンパク質生成は、seb1欠失によって影響を受けなかった(図示せず)。
A.Morph菌株TrGA 77B7
上記Morph菌株を、マーカーとしてamdsを用いて、CBH1プロモータの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子(TrGA)で予め形質転換した。次いで、2つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ(TrGA 29−9)を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、突然変異体(77B7)を生成した。次いで、自然pyr2突然変異体誘導体を、5−フルオロ−オロチン酸(FOA)選択によって単離した。
トリコデルマ・リーゼイのmpg1(jgi|Trire2|122551)タンパク質配列を以下として示す(配列番号29):
MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLAERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIIM*
mpg1破壊カセットプラスミドpRATT249(図7)を、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。このプラスミドは、5’非翻訳領域の一部及び隣接する上流配列(左隣接領域)にわたるDNA配列に相同な2.5Kbの領域を有するDNA配列を含んでいた。また、プラスミド内には、mpg1遺伝子の4番目のエキソンの一部及び隣接する下流配列(右隣接領域)にわたるDNA配列に相同な3.3Kbの領域を有するDNA配列も含まれていた。これら配列は、mpg1遺伝子を標的とし、介在カセット配列で左隣接領域と右隣接領域との間のゲノムの領域を置換するよう設計した。これら介在配列は、形質転換される菌株のゲノムにおける内因性のT.リーゼイpyr2に対する相同性を最小限に抑えるためにトリコデルマ・アトロビリデに由来するpyr2選択マーカーを含んでいた。pyr2選択マーカーの直上流は、マーカーの3’末端の直接反復複製であり、これは、マーカーのその後の喪失及び形質転換体/欠失体の有用なpyr2突然変異体誘導体の単離を促進した。この完全mpg1破壊カセットを、プライマーRPG388及びRPG391を用いてPCRによって増幅させた。複数のPCR反応物をプールし、後続工程で用いるために標準的な分子生物学的手順を用いて清浄化した。
PEG媒介形質転換を用いて菌株Morph TrGA 77B7をmpg1破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するVogel最少培地にプレーティングして、pyr2マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。個々の形質転換体を単離し、Vogel最少培地に移すことによって増殖させた。相同組み換えによってmpg1遺伝子座にmpg1破壊カセットが挿入されている形質転換体を同定するためにPCR解析を用いた。mpg1遺伝子座におけるΔmpg1破壊カセットの相同挿入は、2対のプライマーを用いて予測されるサイズのDNA断片を増幅させることによって確認した。プライマー対RPG394及びRPG253は、破壊カセット領域の5’末端の外側から始まって3’領域内で終わるDNA断片を増幅した。プライマー対RPG395及びRPG273は、破壊カセット領域の5’領域内から始まって破壊カセットの3’末端の外側で終わるDNA断片を増幅した。mpg 1破壊カセットの相同挿入が確認され、生成された菌株をTrGA 77B7 Δmpg1と命名した。
TrGA 77B7 Δmpg1からのseb1の欠失を実施例3に記載の通り実施して、菌株TrGA 77B7 Δmpg1 Δseb1を作製した。
菌株Morph TrGA 77B7 Δmpg1及びTrGA 77B7 Δmpg1 Δseb1を、実施例2に記載の通り深部(液体)培養において同一条件下で生育させ、その生育表現型を比較した。表5として示す通り、Morph TrGA 77B7 Δmpg1菌株からのseb1遺伝子の欠失により、TrGA 77B7 Δmpg1 Δseb1が高い細胞質量であるにもかかわらず、粘度が更に低下し、これは、mpg1及びseb1遺伝子の破壊が、形態及び粘度低下に対して更なる影響を有することを示唆する。TrGA 77B7 Δmpg1 Δseb1のタンパク質生成は、Morph TrGA 77B7及びMorph TrGA 77B7Δmpg1の少なくとも85%以上であった。
A.破壊されたgas1における粘度低下
菌類のβ(1,3)−グルカノシルトランスフェラーゼのGel/Gas/Phrファミリーは、主成分であるβ(1,3)−グルカンを加工することによって細胞壁の生合成において重要な役割を果たす(Popoloら,2008)。gas1(PID 22914)は、β−1,3−グルカンを破壊及び接合することができるGPI(及び/又はグルカン)アンカー型タンパク質であるβ−1,3−グルカノシルトランスフェラーゼをコード化する。5つを有するT.リーゼイを含む多くの真菌類のゲノムには複数のパラログが存在する。別の研究では、gas1遺伝子(又はアスペルギルス・フミガーツフにおいて知られているgel1遺伝子)の突然変異が、真菌類の細胞壁構造に影響を与え、また、形態変化、並びにカルコフロールホワイト、コンゴレッド、及びドデシル硫酸ナトリウムに対する過敏性を導き得ることが示されている(Schirawski,J.ら2005,Mouyna,I.ら2005)。
真菌では、カルシニューリン媒介Ca2+シグナル伝達が、多くの生物において生育、発生、及び毒性に必要であることが示されている。高カチオンレベル及びアルカリ性pHを含む多様な環境条件に適応することが必須である。遺伝子crz1は、カルシニューリンによって制御される転写因子をコード化する。Crz1p転写因子は、ホスファターゼカルシニューリンがCa2+/カルモジュリンによって活性化されたときに脱リン酸化される。次いで、それは核に入り、多数の遺伝子の発現を誘導するが、そのうち多くは、細胞壁に関連する機能を有するタンパク質をコード化する(Yoshimotoら,2002;Lagorceら,2003;Garciaら,2004;Karababaら,2006;Pardiniら,2006,Munro,C.ら2009)。crz1又はホモログの欠失によって、菌糸の形態が変化する場合がある(Kothe,G.及びFree,S.1998,Prokisch,H.ら1997)。
遺伝子tps2は、二糖類であるトレハロースの合成に関与するトレハロース−ホスフェートホスファターゼをコード化する。トレハロースは、細胞質及びERにおける変性したタンパク質のリフォールディングを緩衝する、ストレスによって誘導される糖である(Singer,Mら1998,Simola,Mら2000)。この二糖類は、様々なストレスに応答して多様な生物によって大量に生成される。酵母では、トレハロースは、高温においてタンパク質を安定化させ、熱で損傷したタンパク質のリフォールディングに役立つ(Simola,Mら2000)。
以下の参考文献及び本明細書に引用される追加の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。
Roberg,K.J.ら(1999)J.Cell.Biol.145:659〜72。
Claims (38)
- 親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Seb1タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に(i)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び/又は、(ii)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異菌株。
- 機能性Seb1タンパク質の前記変更された量が、減少された量であり、前記変異菌株が、深部培養における好気性発酵の間に、(i)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び/又は、(ii)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記遺伝子変化が、前記親菌株中に存在するseb1遺伝子の破壊を含む、請求項1又は2に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である、請求項3に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子を含むゲノムDNAの一部の欠失の結果である、請求項3に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子の突然変異誘発の結果である、請求項3に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、部位特異的組み換えを用いて行われる、請求項3〜6のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、請求項3〜7のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、機能性Seb1タンパク質を生成しない、請求項1〜8のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、Seb1タンパク質を生成しない、請求項1〜8のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の変異菌株。
- sfb3遺伝子の破壊を更に含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の変異菌株。
- sfb3遺伝子、mpg1遺伝子、gas1遺伝子、crz1遺伝子、及びtps2遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の破壊を更に含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量、またはそれ以上のタンパク質を生成する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌が、チャワンタケ亜門(Pezizomycotina)の種である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ属(Trichoderma)の種である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の変異菌株。
- 糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、
遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Seb1タンパク質の生成量を変更させる、該工程、それにより、
深部培養における好気性発酵の間に(i)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び/又は、(ii)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する工程、
を含む、方法。 - 前記遺伝子変化が、機能性Seb1タンパク質の生成を低下させるか又は防ぎ、それにより、深部培養における好気性発酵の間に(i)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び/又は、(ii)前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する、請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子変化が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞のseb1遺伝子を破壊することを含む、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記遺伝子変化が、遺伝子操作を用いて親糸状菌細胞においてseb1遺伝子を欠失させることを含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子変化が、部位特異的遺伝子組み換えを用いて行われる、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、sfb3遺伝子の破壊と共に行われる、請求項18〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、sfb3遺伝子、mpg1遺伝子、gas1遺伝子、crz1遺伝子、及びtps2遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の破壊と共に行われる、請求項18〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する、請求項18〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状菌が、チャワンタケ亜門の種である、請求項18〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ属の種である、請求項18〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイである、請求項18〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親菌株が、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項18〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象タンパク質をコード化する遺伝子が、機能性Seb1タンパク質の生成を低下させるか又は抑制する遺伝子変化を導入する前に前記親菌株内に存在する、請求項30に記載の方法。
- 請求項11に記載の変異菌株により生成される、対象タンパク質。
- 請求項18〜31のいずれか一項に記載の方法により生成される、糸状菌の変異菌株。
- 親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
(a)(i)深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び/又は、(ii)深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに
(b)(a)における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する対象タンパク質をコード化する遺伝子、
を含む、変異菌株。 - 前記遺伝子変化が、前記親菌株中に存在するseb1遺伝子の破壊を含む、請求項34に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、前記seb1遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、請求項35に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、sfb3遺伝子、mpg1遺伝子、gas1遺伝子、crz1遺伝子、及びtps2遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の破壊と共に行われる、請求項35又は36に記載の変異菌株。
- 前記seb1遺伝子の破壊が、mpg1遺伝子の破壊と共に行われる、請求項35〜37のいずれか一項に記載の変異菌株。
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