CN111971063A - 通过靶向调节基因信号传导网络治疗疾病 - Google Patents

通过靶向调节基因信号传导网络治疗疾病 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗患有遗传疾病如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等的患者的方法和组合物。还提供了用于通过改变基因信号传导网络来调节所述疾病相关基因的方法和组合物。

Description

通过靶向调节基因信号传导网络治疗疾病
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年4月6日提交的美国临时专利申请序列号62/653,760的优先权和权益，所述专利的内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开提供了用于治疗人中具有未满足需求的遗传疾病如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等的组合物和方法。
背景技术
遗传性遗传疾病可能是致命的，或导致需要大量医疗干预的情况。在遗传性遗传疾病中，罕见的遗传性遗传疾病代表了更大的医学挑战。目前对遗传性疾病，特别是罕见遗传性疾病的方法治疗能力有限。对于此类疾病，控制细胞信号传导通路代表了有吸引力的策略。通过操纵控制疾病基因的信号传导通路，可以改变或甚至微调基因的表达，以实现所希望的治疗效果。即使是基因表达中看似微小的变化，也已经被证明对疾病具有显著的影响。
因此，本发明为具有未满足需求的遗传疾病提供了新颖治疗方法。
发明内容
本发明公开了与许多疾病相关基因相关的基因信号传导网络的定位和鉴定。通过扰乱基因信号传导网络的组分，本发明人已经鉴定出可用于调节此类基因的表达的新颖靶标、化合物和/或方法。此类方法和组合物可以用于开发各种用于遗传疾病如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等的疗法。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有纤连蛋白肾小球病的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够降低FN1基因表达的来自表3的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式降低细胞中FN1基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述FN1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表3的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由smoothened激动剂、克唑替尼(Crizotinib)、BGJ398、AZD2858和氨氯地平苯磺酸盐组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有遗传性粪卟啉病的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加CPOX基因表达的来自表4的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中CPOX基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述CPOX基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表4的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由17-AAG、氯化钴、SKL2001、FICZ和泼尼松(prednisone)组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有SERPINC1缺乏症的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加SERPINC1基因表达的来自表5、表14、表15或表16的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中SERPINC1基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述SERPINC1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表5、表14、表15或表16的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由OSI-027、PF04691502、CP-673451、棘霉素和帕克替尼(pacritinib)(SB1518)组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有Alagille综合征的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加JAG1基因和/或NOTCH2基因表达的来自表6的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中JAG1基因和/或NOTCH2基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述JAG1基因和/或NOTCH2基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表6的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由美瑞替尼(Merestinib)和托彻普(Torcetrapib)组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有糖原贮积病1b的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加SLC37A4基因表达的来自表7的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中SLC37A4基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述SLC37A4基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表7的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由棘霉素、泼尼松、CP-673451和氯化钴组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有急性间歇性卟啉病的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加HMBS基因表达的来自表8的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中HMBS基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述HMBS基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表8的化合物。在一些实施方案中，所述化合物是索曲滔林(Sotrastaurin)。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有LECT2淀粉样变性的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够降低LECT2基因表达的来自表9的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式降低细胞中LECT2基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述LECT2基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表9的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由骨化三醇(calcitrol)、17-AAG和利托那韦(Ritaonavir)组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有APOL1相关肾小球疾病的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够降低APOL1基因表达的来自表10或表16的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式降低细胞中APOL1基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述APOL1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表10或表16的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由呋喃妥因(Nitrofurantoin)、克唑替尼、莫洛替尼(Momelotenib)和莫洛替尼代谢物M21组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有Gilbert综合征或Criggler Najjar II型的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加UGT1A1基因表达的来自表11的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式增加细胞中UGT1A1基因表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述UGT1A1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表11的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由FICZ、卡托吉宁(Kartogenin)、meBIO、CP-673451、BAM7和EW-7197组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式治疗患有血脂异常的受试者的方法：向所述受试者施用有效量的能够增加LDLR基因表达和/或降低ANGPTL3基因和/或PCSK9基因表达的来自表12或表13的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了通过以下方式调节细胞中选自由ANGPTL3、LDLR和PCSK9基因组成的组的至少一种表达的方法：向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述ANGPTL3、LDLR和PCSK9基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表12或表13的化合物。在一些实施方案中，所述化合物选自由WYE-125132、皮斐松(皮斐松)-u、LY294002、SGI-1776、普瑞迪南(Preladenant)和CO-1686组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有Rett综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加MECP2基因表达的来自表15的化合物。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有Rett综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加MECP2基因表达的来自表15的化合物。在一些实施方案中，所述化合物是17-AAG。
在某些实施方案中，所述受试者是人。
附图说明
根据如附图所示的以下对本公开的特定实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见。附图并非必定按比例；而是将重点放在说明本公开的各个实施方案的原则上。
图1展示了核中染色体的包装、染色体组织化成的局部拓扑结构域，TAD中的绝缘邻域以及最后是信号传导中心围绕特定疾病基因的布置的实例。
图2A和图2B展示了绝缘邻域的CTCF边界的线性和3D布置。
图3A和图3B展示了串联绝缘邻域和此类绝缘邻域中形成的基因环。
图4展示了包含在较大的绝缘邻域内的绝缘邻域的概念和可能发生在每个绝缘邻域中的信号传导。
图5展示了信号传导中心的组分，包括转录因子、信号传导蛋白和/或染色质调控子。
图6示出了在HU4282原代人肝细胞中由siRNA进行mTOR抑制72h后，相对于PPIA，SERPINC1 mRNA的倍数变化增加。
图7示出了相对于DMSO对照，在HU4282原代人肝细胞中用化合物308(OSI-027)和化合物309(PF04691502)处理72h后，SERPINC1 mRNA的剂量依赖性倍数变化增加。
图8示出了用10uM 17-AAG处理后，小鼠肝细胞中MECP2 mRNA的倍数变化增加。
图9示出了用10uM 17-AAG处理后，小鼠肝脏中MECP2 mRNA的倍数变化增加。
图10A示出了在以指定剂量用17-AAG或从供体1分离的肝细胞的DMSO处理后，人肝细胞中MECP2 mRNA的倍数变化增加。
图10B示出了在以指定剂量用17-AAG或从供体2分离的肝细胞的DMSO处理后，人肝细胞中MECP2 mRNA的倍数变化增加。
图11示出了用3.3uM莫洛替尼(Momelotinib)或DMSO处理后，原代人肝细胞中APOL1 mRNA的倍数变化。
图12示出了用3.3uM莫洛替尼(MMB)、M21莫洛替尼代谢物(M21)或DMSO处理后，原代人肝细胞中APOL1 MRNA的倍数变化。
具体实施方式
I.导言和定义
本公开提供了用于治疗人中的遗传疾病如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等的组合物和方法。具体地，本公开提供了用于调节疾病相关基因诸如FN1、CPOX等的化合物和相关用途。
本公开还包括对基因信号传导网络(GSN)的改变、扰乱和最终的调控。这种基因信号传导网络包括在生物系统的基因组的绝缘邻域内发现的基因组信号传导中心。调节基因表达的化合物可以通过调节一个或多个基因信号传导网络起作用。
如本文所用，“基因信号传导网络”或“GSN”包括与来自特定基因的任何或所有信号传导事件相关的生物分子的集合，例如，以基因为中心的网络。由于人基因组中有超过20,000个蛋白质编码基因，因此至少有这么多基因信号传导网络。并且在某些基因是非编码基因的意义上说，数量大大增加。基因信号传导网络不同于经典的信号传导通路，所述信号传导通路被作图为标准蛋白质级联和反馈环。
传统上，信号传导通路已经使用标准的生化技术鉴定出，并且大多数情况下是线性级联，其中一种蛋白质产物向级联中的下一个蛋白质产物驱动的事件传导信号。虽然这些通路可能分支或具有反馈环，但焦点几乎完全集中在蛋白质水平上。
本公开的基因信号传导网络(GSN)代表了定义生物学信号传导的不同范例—考虑到蛋白质编码和非蛋白质编码信号传导分子、基因组结构、染色体占位率、染色体重塑、生物系统的状态以及与包含此类基因信号传导网络的任何生物系统的扰乱相关的结局范围。
基因组架构虽然不是静态的，但是在定义本公开的GSN的框架方面起着重要的作用。这种架构包括染色体组构和修饰、拓扑相关结构域(TAD)、绝缘邻域(IN)、基因组信号传导中心(GSC)、信号传导分子及其结合基序或位点的概念，并且当然也包括基因组架构内编码的基因。
如本文所用，术语“绝缘邻域”(IN)是指由染色体序列中两个相互作用位点的环化形成的染色体结构，所述染色体结构可包含由黏连蛋白共同占据的CCCTC结合因子(CTCF)并影响绝缘邻域中的基因以及在绝缘邻域附近的那些基因的表达。
如本文所用，术语“基因组信号传导中心”，即“信号传导中心”是指绝缘邻域内的下述区，所述区包括能够结合参与调控该绝缘邻域内或多于一种绝缘邻域之间的基因的信号传导分子/信号传导蛋白的上下文特异性组合组件的区。
本公开通过阐明与疾病相关靶基因相关的GSN的一组更确定的连接性，提供了用于解决遗传疾病诸如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等的微调机制。
基因组架构
细胞使用数千种将细胞信号传导与基因组架构联系起来的元件来控制基因表达。基因组系统架构包括DNA、RNA转录物、染色质重塑剂和信号传导分子的区。
染色体
染色体是基因组架构中最大的亚单元，其含有人的大多数DNA。已经观察到特定的染色体结构在基因控制中起重要作用，如Hnisz等人,Cell 167,2016年11月17日中所述，将所述文献据此通过引用以其全文并入。内含子(“非编码区”)提供蛋白质结合位点和其他调控结构，而外显子编码信号传导分子(诸如转录因子)，与非编码区相互作用以调控基因表达。染色体上非编码区内的DNA位点也彼此相互作用形成环状结构。这些相互作用形成染色体支架，所述染色体支架在发育中得以保留，并在基因激活和阻遏中起重要作用。相互作用很少在染色体之间发生并且通常在染色体的相同结构域内。
原位杂交技术和显微镜检查已揭示，个体间期染色体倾向于占据细胞核的一小部分，并且不会在整个细胞器中扩散。参见，Cremer和Cremer,Cold Spring HarborPerspectives in Biology 2,a003889,2010，将所述文献据此通过引用以其全文并入。这种小的表面积占据可能会减少染色体之间的相互作用。
拓扑相关结构域(TAD)
如本文所用，术语“拓扑相关结构域”(TAD)是指代表染色质的模块化组构并且具有由生物的不同细胞类型共享的边界的结构。拓扑相关结构域(TAD)(可替代地称为拓扑结构域)是属于哺乳动物染色体结构的亚单元的分级单元。参见，Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012；Filippova等人,Algorithms for Molecular Biology,9:14,2014；Gibcus和Dekker Molecular Cell,49(5):773-82,2013；Naumova等人,Science,42(6161):948-53,2013；将所述文献据此通过引用以其全文并入。TAD是兆碱基大小的染色体区，其划分了允许基因和调控元件产生有用的DNA-DNA接触的微环境。TAD由DNA-DNA相互作用频率定义。TAD的边界由发生相对较少的DNA-DNA相互作用的区组成，如Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012；Nora等人,Nature,485(7398):381-5,2012中所述；将所述文献据此通过引用以其全文并入。TAD代表充当基因表达调控子的结构染色体单元。
TAD可以含有约7个或更多个蛋白质编码基因并且具有由不同细胞类型共享的边界。参见，Smallwood等人,Current Opinion in Cell Biology,25(3):387-94,2013，将所述文献据此通过引用以其全文并入。一些TAD含有活性基因，而其他TAD包含受阻遏的基因，因为单个TAD内的基因表达通常是相关的。参见，Cavalli等人,Nature Structural&Molecular Biology,20(3):290-9,2013，将所述文献据此通过引用以其全文并入。TAD内的序列以很高的频率发现彼此，并且具有一致的、全TAD范围内的组蛋白染色质标记、表达水平、DNA复制时间、核纤层(lamina)联合和染色中心联合。参见，Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012；Le Dily等人,Genes Development,28:2151–62,2014；Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012；Wijchers,Genome Research,25:958–69,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。
TAD内的基因环和其他结构影响转录因子(TF)、黏连蛋白和11-锌指蛋白(CTCF)(一种转录阻遏物)的活性。参见，Baranello等人,Proceedings of the National Academyof Sciences,111(3):889-9,2014，将所述文献据此通过引用以其全文并入。TAD内的结构包括黏连蛋白相关的增强子-启动子环，所述增强子-启动子环在增强子结合的TF结合辅因子(例如介体)，而辅因子又在启动子位点处结合RNA聚合酶II时产生。参见，Lee和Young,Cell,152(6):1237-51,2013；Lelli等人,2012；Roeder,Annual Reviews Genetics 46:43-68,2005；Spitz和Furlong,Nature Reviews Genetics,13(9):613-26,2012；Dowen等人,Cell,159(2):374–387,2014；Lelli等人,Annual Review of Genetics,46:43–68,2012，将所述文献据此通过引用以其全文并入。黏连蛋白加载因子Nipped-B样蛋白(NIPBL)结合介体(Mediator)，并且在这些增强子-启动子环上加载黏连蛋白。参见，Kagey等人,Nature,467(7314):430-5,2010，将所述文献据此通过引用以其全文并入。
TAD在所有检查的人细胞类型中具有相似的边界并且限制增强子-基因相互作用。参见，Dixon等人,Nature,518:331-336,2015；Dixon等人,Nature,485:376-380,2012，将所述文献据此通过引用以其全文并入。基因组的这种架构有助于解释为什么大多数DNA接触发生在TAD内以及增强子-基因相互作用很少发生在染色体之间。然而，TAD仅提供对影响TAD内的特定增强子-基因相互作用的分子机制的部分了解。
长范围基因组接触将TAD分离为有活性的区室和无活性的区室。参见，Lieberman-Aiden等人,Science,326:289–93,2009，将所述文献据此通过引用以其全文并入。TAD边界之间形成的环似乎代表了最长范围的接触，所述接触在特定序列对之间稳定且可重复地形成。参见，Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012，将所述文献据此通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，本公开的方法用于改变位于TAD中的基因的基因表达。在一些实施方案中，修饰TAD区以改变如本文定义或如使用本文描述的方法可定义的非经典通路的基因表达。
绝缘邻域
如本文所用，“绝缘邻域”(IN)被定义为由染色体序列中两个相互作用位点的成环而形成的染色体结构。这些相互作用位点可以包括CCCTC结合因子(CTCF)。这些CTCF位点通常被黏连蛋白共同占据。这些黏连蛋白相关染色体结构的完整性影响绝缘邻域中基因以及在绝缘邻域附近的那些基因的表达。“邻域基因”是位于绝缘邻域内的基因。邻域基因可以是编码的或非编码的。
绝缘邻域架构由至少两个边界限定，所述至少两个边界直接或间接地合在一起以形成DNA环。任何绝缘邻域的边界包括初级上游边界和初级下游边界。此类边界是任何绝缘邻域的最外边界。然而，在任何绝缘邻域环内，可以形成次级环。相对于初级绝缘邻域，此类次级环(当存在时)由次级上游边界和次级下游边界限定。在初级绝缘邻域含有多于一个内部环的情况下，所述环相对于初级环的初级上游边界进行编号，例如，次级环(初级环内的第一环)、三级环(初级环内的第二环、四级环(初级环内的第三环)，依此类推。
绝缘邻域可以位于拓扑相关结构域(TAD)和其他基因环内。TAD由DNA-DNA相互作用频率定义，并且平均为0.8Mb、含有大约7个蛋白质编码基因并且具有由生物体的不同细胞类型共享的边界。根据Dowen，TAD内的基因的表达一定程度地相关，并且因此一些TAD往往具有活性基因，而其他TAD往往具有受阻遏的基因。Dowen等人,Cell.2014年10月9日；159(2):374–387。
绝缘邻域可以沿着染色体作为连续实体存在，或者可以由非绝缘邻域序列分隔开。绝缘邻域可以线性重叠，其只有在DNA成环区连接后才能被限定。虽然绝缘邻域可包含3-12个基因，但是它们可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或更多个基因。
“最小绝缘邻域”是具有至少一个邻域基因和一个或多个有利于表达或阻遏邻域基因的一个或多个相关调控序列区(RSR)(如启动子和/或增强子和/或阻遏区等)的绝缘邻域。预期调控序列区可以与绝缘邻域边界重合或甚至重叠。如本文所用，调控序列区包括但不限于沿着染色体的区、区段、位点或区域，由此与信号传导分子发生相互作用以改变邻域基因的表达。如本文所用，“信号传导分子”是与染色体上的调控序列区直接或间接相互作用的任何实体，无论是蛋白质、核酸(DNA或RNA)、有机小分子、脂质、糖还是其他生物分子。调控序列区(RSR)也可以称为“基因组信号传导中心”或“GSC”。
一类特化的信号传导分子是转录因子。“转录因子”是那些改变(无论增加还是减少)靶基因例如邻域基因的转录的信号传导分子。
根据本公开，邻域基因可以沿着染色体具有任何数量的上游或下游基因。在任何绝缘邻域内，相对于初级邻域基因，可能存在一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个上游和/或下游邻域基因。“初级邻域基因”是最常见于沿着染色体的特定绝缘邻域内的基因。初级邻域基因的上游邻域基因可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。初级邻域基因的下游邻域基因可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。
本公开提供了改变基因或基因变体的外显率的方法。如本文所用，“外显率”是携带基因的特定变体(例如，突变、等位基因或通常是基因型，无论是否是野生型)、也表现出该变体基因的相关性状(表型)的个体的比例。在一些疾病情况中，致病突变的外显率以表现出临床症状的具有所述突变的个体的比例来测量。因此，任何基因或基因变体的外显率都存在于连续体上。
绝缘邻域是在相同控制机制下将基因分组的功能单元，这如Dowen等人,Cell,159:374-387(2014)中所述，将所述文献据此通过引用以其全文并入。绝缘邻域为高阶染色体结构(诸如TAD)提供了机械论背景，如图1中所示。绝缘邻域是由黏连蛋白共同占据的两个相互作用的CTCF位点的成环形成的染色体结构，如图1中所示。这些结构的完整性对于正确表达局部基因很重要。通常，每个邻域中聚集1至10个基因，每个邻域内有3个基因的中位数。由相同的绝缘邻域控制的基因从DNA的二维视图中并不容易显现出。在人中，在25kb-940kb的大小范围内有约13,801个绝缘邻域，中位大小为186kb。绝缘邻域在不同的细胞类型之间是保守的。发生在较大IN中的较小IN称为嵌套绝缘邻域(NIN)。TAD可以如图2B中所示那样由单一IN组成，或者由一个IN和一个NIN和两个NIN组成。
如本文所用，术语“边界”是指指示特征、元素或特性在何处结束或开始的点、界限或范围。因此，“绝缘邻域边界”是指界定染色体上的绝缘邻域的边界。根据本公开，绝缘邻域由至少两个绝缘邻域边界即初级上游边界和初级下游边界限定。“初级上游边界”是指位于初级邻域基因上游的绝缘邻域边界。“初级下游边界”是指位于初级邻域基因下游的绝缘邻域边界。类似地，当存在如图2B中所示的次级环时，它们由次级上游边界和次级下游边界定义。“次级上游边界”是初级绝缘邻域内的次级环的上游边界，而“次级下游边界”是初级绝缘邻域内的次级环的下游边界。次级边界的方向性遵循初级绝缘邻域边界的方向性。
绝缘邻域边界的组分可包含锚定区处的DNA序列和有利于环化两个边界的相关因子(例如CTCF，黏连蛋白)。锚定区的DNA序列可含有至少一个CTCF结合位点。使用ChIP-exo技术的实验揭示了52bp的CTCF结合基序，其含有四个CTCF结合模块(参见图1，Ong和Corces,Nature reviews Genetics,12:283-293,2011，将所述文献通过引用以其全文并入本文)。在绝缘邻域边界处的DNA序列可以含有绝缘子。在一些情况下，绝缘邻域边界也可能与调控序列区(诸如增强子-启动子相互作用位点)重合或重叠。
在本公开的一些实施方案中，可以通过改变边界处的特定DNA序列(例如，CTCF结合位点)来实现破坏或改变绝缘邻域边界。例如，可以缺失、突变或倒置在绝缘邻域边界处的现有CTCF结合位点。可替代地，可以引入新的CTCF结合位点以形成新的绝缘邻域。在其他实施方案中，可以通过改变边界处的组蛋白修饰(例如，甲基化、去甲基化)来实现破坏或改变绝缘邻域边界。在其他实施方案中，可以通过改变(例如，阻断)CTCF和/或黏连蛋白与边界的结合来实现破坏或改变绝缘邻域边界。在绝缘邻域边界与调控序列区重合或重叠的情况下，破坏或改变绝缘邻域边界可以通过改变调控序列区(RSR)或RSR相关信号传导分子的结合来实现。
控制来自绝缘邻域的表达：信号传导中心
在过去，术语“信号传导中心”已用于描述响应于细胞环境变化的一组细胞。参见，Guger等人,Developmental Biology 172:115-125(1995)，将所述文献通过引用以其全文并入本文。类似地，如本文所用，术语“信号传导中心”是指活生物体的下述限定区，所述限定区与限定的一组生物分子诸如信号传导蛋白或信号传导分子(例如，转录因子)相互作用以以上下文特异性方式调控基因表达。
已经发现信号传导中心可以调控绝缘邻域的活性。这些区控制在人基因组中表达哪些基因以及表达水平。信号传导中心结构完整性的丧失会导致基因表达失调并可能导致疾病。
信号转导中心包括由转录因子的高度上下文特异性的组合组件所结合的增强子。这些因子通过细胞信号传导被募集到该位点。信号传导中心包括相互作用以形成三维转录因子中心大复合物的多个基因。信号传导中心通常与通过生物学功能组织化的环中的1至4个基因相关。
每个信号传导中心的组成都有独特的组成，包括转录因子、转录装置和染色质调控子的组件。信号传导中心是高度上下文特定的，从而允许药物通过靶向信号通路来控制应答。
多个信号传导中心可以相互作用以控制相同绝缘邻域内的基因的不同组合。
用于信号传导分子的结合位点
本发明人已经鉴定了用于信号传导分子的一系列共有结合位点、或结合位点的结合基序。这些共有序列反映了用于信号传导分子或用于包括一个或多个信号传导分子的复合物的沿着染色体、基因或多核苷酸的结合位点。
在一些实施方案中，结合位点与多于一个的信号传导分子或分子的复合物相关。
增强子
如本文所用，术语“增强子”是指当被转录因子结合时增强相关基因的转录的调控性DNA序列。增强子是控制人中的细胞类型特异性基因表达程序的基因调控元件。参见，Buecker和Wysocka,Trends in genetics:TIG 28,276-284,2012；Heinz等人,Naturereviews Molecular Cell Biology,16:144-154,2015；Levine等人,Cell,157:13-25,2014；Ong和Corces,Nature reviews Genetics,12:283-293,2011；Ren和Yue,Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology,80:17-26,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。增强子是DNA的链段，其长度通常为几百个碱基对，并且被多个转录因子占据，所述转录因子将辅助激活因子和RNA聚合酶II募集到靶基因。参见，Bulger和Groudine,Cell,144:327-339,2011；Spitz和Furlong,Nature reviews Genetics,13:613-626,2012；Tjian和Maniatis,Cell,77:5-8,1994，将所述文献据此通过引用以其全文并入。从DNA的这些区转录的增强子RNA分子也“捕获”能够结合DNA和RNA的转录因子。具有多于一个增强子的区是“超级增强子”。如本文所用，术语“超级增强子”是指驱动限定细胞身份的基因的表达的转录增强子的簇。
绝缘邻域为特定的增强子-基因相互作用提供了微环境，这对于正常基因激活和阻遏两者都是至关重要的。转录增强子控制超过20,000个蛋白质编码基因，以维持所有人细胞中特定于细胞类型的基因表达程序。据估计，成千上万的增强子在任何给定的人细胞类型中均具有活性。参见，ENCODE Project Consortium等人,Nature,489,57-74,2012；Roadmap Epigenomics等人,Nature,518,317-330,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。增强子及其相关因子可通过环化到这些基因的启动子来调控位于上游或下游的基因的表达。所进行的以深入了解细胞身份的转录控制与染色体结构的控制之间的关系的黏连蛋白ChIA-PET研究揭示，大多数超级增强子及其相关基因出现在通过由被黏连蛋白共占据的相互作用的CTCF位点连接的大环内。此类超级增强子结构域(SD)通常含有一个环化到SD内一个基因的超级增强子，并且SD似乎将超级增强子活性限制于SD内的基因上。在绝缘邻域中超级增强子与其靶基因的正确关联非常重要，因为单个超级增强子的错误靶向足以导致疾病。参见Groschel等人,Cell,157(2):369-81,2014。
大多数疾病相关的非编码变异都发生在增强子的附近，并且因此可能会影响这些增强子靶基因。因此，译解赋予增强子特异性的特征对于调节基因表达很重要。参见，Ernst等人,Nature,473,43-49,2011；Farh等人,Nature,518,337-343,2015；Hnisz等人,Cell,155,934-947,2013；Maurano等人,Science,337,1190-1195,2012，将所述文献据此通过引用以其全文并入。研究表明，增强子-基因相互作用的某些特异性可能是由于增强子上的DNA结合转录因子与启动子上的特异性伴侣转录因子之间的相互作用。参见，Butler和Kadonaga,Genes&Development,15,2515-2519,2001；Choi和Engel,Cell,55,17-26,1988；Ohtsuki等人,Genes&Development,12,547-556,1998，将所述文献据此通过引用以其全文并入。增强子中和启动子近侧区中的DNA序列与单一细胞中表达的多种转录因子结合。结合在这两个位点处的各种不同的因子与大的辅因子复合物相互作用，并且彼此相互作用以产生增强子-基因特异性。参见，Zabidi等人,Nature,518:556-559,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。
在一些实施方案中，增强子区可被靶向以改变或阐明基因信号传导网络(GSN)。
绝缘子
如本文所用，术语“绝缘子”是指下述调控元件，当增强子位于它们之间时，它们阻断增强子激活基因的能力并有助于特定的增强子-基因相互作用。参见，Chung等人,Cell74:505-514,1993；Geyer和Corces,Genes&Development 6:1865-1873,1992；Kellum和Schedl,Cell 64:941-950,1991；Udvardy等人,Journal of molecular biology 185:341-358,1985，将所述文献据此通过引用以其全文并入。绝缘子由转录因子CTCF结合，但并非所有CTCF位点都充当绝缘子。参见，Bell等人,Cell 98:387-396,1999；Liu等人,Naturebiotechnology 33:198-203,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。以前尚未了解区分充当绝缘子的CTCF位点的子集的特征。
结合增强子、启动子和绝缘子的蛋白质的全基因组图谱连同在这些元件之间发生的物理接触的知识提供了对产生特定的增强子-基因相互作用的机制的进一步了解。参见，Chepelev等人,Cell research,22:490-503,2012；DeMare等人,Genome Research,23:1224-1234,2013；Dowen等人,Cell,159:374-387,2014；Fullwood等人,Genes&Development6:1865-1873,2009；Handoko等人,Nature genetics 43:630-638,2011；Phillips-Cremins等人,Cell,153:1281-1295,2013；Tang等人,Cell 163:1611-1627,2015，将所述文献据此通过引用以其全文并入。结合增强子的蛋白质受到限制，由此使得它们往往仅与这些CTCF-CTCF环内的基因相互作用。形成这些环锚点的CTCF位点的子集因此起到使环内的增强子和基因与环外的增强子和基因绝缘的作用，如图2B所示。在一些实施方案中，绝缘子区可被靶向以改变或阐明基因信号传导网络(GSN)。
黏连蛋白和CTCF相关的环和锚定位点/区
CTCF相互作用连接相同染色体形成环上的位点，所述位点的长度通常小于1Mb。转录在环内和环外发生，但是该转录的性质在两个区之间不同。研究显示，增强子相关转录在环内更为突出。因此，绝缘子状态特别在CTCF环锚点处富集。因此，CTCF环封闭基因贫乏区，以使基因趋于集中在环内，或者将基因密集区留在CTCF环外。CTCF环相对于其侧翼区表现出降低的外显子密度。基因本体分析揭示，位于CTCF环内的基因对于刺激应答以及对于细胞外、质膜和囊泡细胞定位是富集的。另一方面，存在于恰好在环外的侧翼区内的基因表现出与管家基因相似的表达模式，即这些基因的平均表达比环封闭基因高得多，在其表达模式方面细胞系特异性较低，并且在其细胞系之间的表达水平差异较小。参见Oti等人,BMCGenomics,17:252,2016，将所述文献通过引用以其全文并入。
锚定区是CTCF的结合位点，其影响绝缘邻域的构象。锚定位点的缺失可导致通常在转录上沉默的基因的激活，从而导致疾病表型。实际上，体细胞突变在癌基因相关的绝缘邻域的环锚定位点中是常见的。已经观察到环锚定区的CTCF DNA结合基序是癌细胞中变化最大的人转录因子结合序列。参见，Hnisz等人,Cell 167,2016年11月17日，将所述文献通过引用以其全文并入。
已经观察到锚定区在细胞发育过程中得到了很大的保持，并且在人和灵长类动物的种系中尤其保守。实际上，锚定区的DNA序列在CTCF锚定区中比在不是绝缘邻域的一部分的CTCF结合位点处更保守。因此，黏连蛋白可以用作ChIA-PET的靶标以鉴定两者的位置。
黏连蛋白也变得与基因组的CTCF结合区相关，并且这些黏连蛋白相关的CTCF位点中的一些有利于基因激活，而其他一些可以充当绝缘子。参见，Dixon等人,Nature,485(7398):376-80,2012；Parelho等人,Cell,132(3):422-33,2008；Phillips-Cremins和Corces,Molecular Cell,50(4):461-74,2013)；Seitan等人,Genome Research,23(12):2066-77,2013；Wendt等人,Nature,451(7180):796-801,2008)，将所述文献据此通过引用以其全文并入。黏连蛋白和CTCF与TAD内的大环亚结构相关，而黏连蛋白和介体与在CTCF边界区内形成的较小的环结构相关。参见，de Wit等人,Nature,501(7466):227-31,2013；Cremins等人,Cell,153(6):1281-95,2013；Sofueva等人,EMBO,32(24):3119-29,2013，将所述文献据此通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，黏连蛋白和CTCF相关的环和锚定位点/区可被靶向以改变或阐明基因信号传导网络(GSN)。
基因变体
已知信号传导中心内的基因变异会因为破坏染色体上的蛋白质结合而促成疾病，如Hnisz等人,Cell 167,2016年11月17日中所述。观察到干扰绝缘邻域的形成的CTCF锚定区序列的变化导致基因激活和阻遏的失调。由各种遗传和表观遗传机制引起的CTCF机能失常可能导致发病。因此，在一些实施方案中，有益的是改变与这种变体驱动的病因相关的任何一种或多种基因信号传导网络(GSN)，以实现一种或多种阳性的治疗结局。
单核苷酸多态性(SNP)
大多数疾病相关的SNP位于信号传导中心附近。例如，94.2％的SNP发生在非编码区(包括信号传导中心)内。在一些实施方案中，改变SNP以便研究和/或改变来自一种或多种GSN的信号传导。
信号传导分子
信号传导分子包括在细胞信号传导通路(无论是经典的还是本文定义的或能够使用本文所述方法定义的基因信号传导网络通路)中起作用的任何蛋白质。转录因子是信号传导分子的子集。信号传导转录因子和主转录因子的某些组合与增强子区联合以影响基因的表达。主调控子指导特定组织中的转录因子。例如，在血液中，GATA转录因子是指导Wnt细胞信号传导通路的TCF7L2的主调控子。在肝脏中，HNG4是指导谱系组织和模式中的SMAD的主调控子。
转录调控允许控制给定基因被转录的频率。转录因子通过使转录起始条件或多或少有利来改变转录物的产生速率。转录因子选择性地改变信号传导通路，这进而影响由信号传导中心表达的基因。信号传导中心是转录调控子的组分。在一些实施方案中，信号传导分子可以被使用、靶向以阐明或改变本公开的基因信号传导网络的信号传导。
U.S.62/501,795的表18(将其据此通过引用以其全文并入)提供了信号传导分子的列表，包括充当在各种细胞信号传导通路中起作用的转录因子(TF)和/或染色质重塑因子(CR)的那些。本文所述的方法可用于抑制或激活与在绝缘邻域内编码的初级邻域基因的调控序列区相关的一个或多个信号传导分子的表达。因此，所述方法可改变与未治疗的对照相比在用治疗剂治疗后差异表达的一个或多个初级邻域基因的信号传导标记。
转录因子
如本文所用，术语“转录因子”是指改变(无论增加还是减少)靶基因例如邻域基因的转录的信号传导分子。转录因子通常通过与增强子结合并且将共激活因子和RNA聚合酶II募集到靶基因来调控基因表达。参见Whyte等人,Cell,153(2):307–319,2013，将所述文献通过引用以其全文并入。转录因子结合“增强子”以通过结合分布在整个基因组中的调控元件来刺激细胞特异性转录程序。
人基因组中有约1800种已知的转录因子。染色体的DNA上有一些表位，其为蛋白质或核酸分子(如核糖体RNA复合物)提供结合位点。主调控子通过上方的细胞信号传导和下方的DNA指导转录因子的组合。这些特征允许确定下一个信号传导中心的位置。在一些实施方案中，转录因子可以被使用或靶向以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。
主转录因子
主转录因子结合并建立细胞类型特异性增强子。主转录因子将额外的信号传导蛋白，诸如其他转录因子募集到增强子以形成信号传导中心。针对233种人细胞类型和组织的候选主TF的图册描述于D’Alessio等人,Stem Cell Reports 5,763-775(2015)中，将所述文献据此通过引用以其全文并入。在一些实施方案中，主转录因子可以被使用或靶向以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。
信号传导转录因子
信号传导转录因子是下述转录因子，诸如同源异型蛋白，所述转录因子在细胞之间传播，因为它们含有允许它们这样做的蛋白质结构域。同源异型蛋白诸如Engrailed、Hoxa5、Hoxb4、Hoxc8、Emx1、Emx2、Otx2和Pax6能够充当信号传导转录因子。同源异型蛋白Engrailed具有内化和分泌信号，据信所述信号也存在于其他同源异型蛋白中。该特性使同源异型蛋白除了是转录因子外，还可以充当信号传导分子。同源异型蛋白缺乏已表征的细胞外功能，导致人们认为它们的旁分泌靶标是细胞内的。同源异型蛋白调控转录以及在一些情况下调控翻译的能力最有可能影响旁分泌作用。参见Prochiantz和Joliot,NatureReviews Molecular Cell Biology,2003。在一些实施方案中，信号传导转录因子可以被使用或靶向以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。
染色质修饰
染色质重塑受与组蛋白修饰相关的超过一千种蛋白质的调控。参见，Ji等人,PNAS,112(12):3841-3846(2015)，将所述文献据此通过引用以其全文并入。染色质调控子是与用经修饰组蛋白标记的基因组区相关的特定蛋白质组。例如，组蛋白可以在某些赖氨酸残基处被修饰：H3K20me3、H3K27ac、H3K4me3、H3K79me2、H3K36me3、H3K9me2和H3K9me3。某些组蛋白修饰标记可用于信号传导分子结合的基因组区。例如，先前的研究已经观察到，活性增强子区包含具有H3K27ac的核小体，而活性启动子包含具有H3K27ac的核小体。此外，转录的基因包含具有H3K79me2的核小体。可以进行ChIP-MS以鉴定与特定组蛋白修饰相关的染色质调控蛋白。使用对某些经修饰的组蛋白具有特异性的抗体的ChIP-seq也可用于鉴定基因组中由信号传导分子结合的区。在一些实施方案中，染色质修饰酶或蛋白质可以被使用或靶向以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。
衍生自调控序列区的RNA
已知许多活性的调控序列区(RSR)(诸如蛋白质编码基因的增强子、信号传导中心和启动子)都会产生非编码RNA。在活性调控序列区处或其附近产生的转录物已牵涉到近邻基因的转录调控。最近的报告证明，增强子相关RNA(eRNA)是增强子活性的有力指标(参见Li等人,Nat Rev Genet.2016年4月；17(4):207-23，将所述文献据此通过引用以其全文并入)。此外，已显示来自活性调控序列区的非编码RNA参与促进转录因子与这些区的结合(Sigova等人,Science.2015年11月20日；350(6263):978-81，将所述文献据此通过引用以其全文并入)。这表明此类RNA对于信号传导中心的组装和邻域基因的调控可能是重要的。在一些实施方案中，衍生自靶基因的调控序列区的RNA可以被使用或靶向以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。
在一些实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以是增强子相关RNA(eRNA)。在一些实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以是启动子相关RNA，包括但不限于启动子上游转录物(PROMPT)、启动子相关长RNA(PALR)和启动子相关小RNA(PASR)。在进一步的实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以包括但不限于转录起始位点(TSS)相关RNA(TSSa-RNA)、转录起始RNA(tiRNA)和终止子相关小RNA(TASR)。
在一些实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以是长的非编码RNA(lncRNA)(即，＞200个核苷酸)。在一些实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以是中间的非编码RNA。(即，约50至200个核苷酸)。在一些实施方案中，衍生自调控序列区的RNA可以是短的非编码RNA(即，约20至50个核苷酸)。
在一些实施方案中，可以通过本文所述的方法和化合物调节的eRNA可以通过以下特征中的一个或多个来表征：(1)从组蛋白3的赖氨酸4的单甲基化(H3K4me1)水平高而组蛋白3的赖氨酸4的三甲基化(H3K4me3)水平低的区转录；(2)从组蛋白3的赖氨酸27的乙酰化水平(H3K27ac)高的基因组区转录；(3)从组蛋白3的赖氨酸36的三甲基化(H3K36me3)水平低的基因组区转录；(4)从富含RNA聚合酶II(Pol II)的基因组区转录；(5)从富含转录共调控因子(诸如p300共激活因子)的基因组区转录；(6)从CpG岛密度低的基因组区转录；(7)它们的转录从Pol II结合位点开始并且是双向延长的；(8)进化保守的DNA序列编码eRNA；(9)半衰期短；(10)剪接和聚腺苷酸水平降低；(11)在信号传导后动态调控；(12)与近邻mRNA表达水平呈正相关；(13)组织特异性极高；(14)优先与核和染色质结合；和/或(15)被外来体降解。
可以通过本文所述的方法和化合物调节的eRNA的非限制性实例包括Djebali等人,Nature.2012年9月6日；489(7414)(例如，对于图5a的补充数据文件)和Andersson等人,Nature.2014年3月27日；507(7493):455-461(例如，补充表S3、S12、S13、S15和16)中所述的那些，将所述文献通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可以通过本文所述的方法或化合物调节的启动子相关RNA可以通过以下特征中的一个或多个来表征：(1)从H3K4me1水平高和H3K4me3水平低至中等的区转录；(2)从H3K27ac水平高的基因组区转录；(3)从无H3K36me3或H3K36me3水平低的基因组区转录；(4)从富含RNA聚合酶II(Pol II)的基因组区转录；(5)从CpG岛密度高的基因组区转录；(6)它们的转录从Pol II结合位点开始的并且在与有义链(即mRNA)相反的方向上或双向延伸；(7)半衰期短；(8)剪接和聚腺苷酸化水平降低；(9)优先与核和染色质结合；和/或(10)被外来体降解。
本文所述的方法和组合物可以用于调节衍生自调控序列区的RNA，以改变或阐明本公开的基因信号传导网络。在一些实施方案中，本文所述的方法和化合物可用于抑制衍生自调控序列区的RNA的产生和/或功能。在一些实施方案中，可使用杂交寡核苷酸诸如siRNA或反义寡核苷酸以经由RNA干扰(RNAi)或RNA酶H介导的裂解来抑制目的RNA的活性，或物理上阻断各种信号传导分子与RNA的结合。示例性杂交寡核苷酸可以包括U.S.9,518,261和WO2014/040742中描述的那些，将所述文献据此通过引用以其全文并入。杂交寡核苷酸可以经化学修饰或未经修饰的RNA、DNA、锁核酸(LNA)、或RNA和DNA的组合、编码杂交寡核苷酸的核酸载体、或携带这种载体的病毒的形式提供。在其他实施方案中，基因组编辑工具诸如CRISPR/Cas9可用于缺失控制RNA的转录或降解RNA本身的调控序列区中的特定DNA元件。在其他实施方案中，基因组编辑工具诸如无催化活性的CRISPR/Cas9可用于结合调控序列区中的特定元件并阻断目的RNA的转录。在进一步的实施方案中，布罗莫结构域和额外末端结构域(BET)抑制剂(例如，JQ1、I-BET)可用于通过抑制BET蛋白Brd4的组蛋白乙酰化来减少RNA转录。
在一些实施方案中，本文所述的方法和化合物可以用于增加衍生自调控序列区的RNA的产生和/或功能。在一些实施方案中，可以将模拟目的RNA的外源合成RNA引入到细胞中。合成RNA可以RNA、编码RNA的核酸载体、或携带这种载体的病毒的形式提供。在其他实施方案中，基因组编辑工具诸如CRISPR/Cas9可用于将外源合成RNA拴系到调控序列区中的特定位点。此类RNA可与CRISPR/Cas9复合物的指导RNA融合。
在一些实施方案中，对衍生自调控序列区的RNA的调节增加了靶基因的表达。在一些实施方案中，对衍生自调控序列区的RNA的调节降低了靶基因的表达。
在一些实施方案中，由本文所述化合物调节的RNA包括衍生自肝细胞(例如，肝细胞)中靶基因的调控序列区的RNA。
基因组系统的扰乱
如本文所述的与靶基因相关的基因信号传导网络(GSN)、基因组信号传导中心(GSC)和/或绝缘邻域(IN)中的一个或多个组分的行为可以通过将含有此类网络、中心和/或邻域的系统与扰乱刺激接触来进行改变。潜在的刺激可包括外源生物分子，诸如小分子、抗体、蛋白质、肽、脂质、脂肪、核酸等；或环境刺激，诸如辐射、pH、温度、离子强度、声音、光等。
本公开用作不仅阐明更好定义的基因信号传导网络(GSN)，而且最终还更好地理解生物学系统的发现工具。本公开实现以这样的方式在基因水平上适当地定义基因信号传导的能力，所述方式允许先验地预测潜在的治疗结果、鉴定可能从未牵涉到治疗遗传疾病、病症或病状的新颖化合物或靶标、减少或消除与新药或已知药物相关的一种或多种治疗缺点(诸如毒性、半衰期差、生物利用度差、功效不足或丧失或药代动力学或药效动力学风险)。
通过改变经典的细胞信号传导通路的基因表达来治疗疾病已被证明是有效的。即使基因表达的微小变化也可能对疾病产生重大影响。例如，导致影响细胞自杀抑制的信号传导通路的信号传导中心的变化与疾病相关。本公开通过阐明一组更确定的GSN连通性提供了一种微调的机制来解决包括遗传疾病的疾病。治疗疾病的方法可以包括修饰与该疾病相关的基因所涉及的信号传导中心。除非使用本文所述的方法阐明，否则此类基因目前可能与疾病不相关。
扰乱刺激可以是小分子、已知药物、生物制剂、疫苗、草本植物制品、杂交寡核苷酸(例如siRNA和反义寡核苷酸)、基因或细胞疗法产物或其他治疗产物。
在一些实施方案中，本公开的方法包括施加扰乱刺激以扰乱与靶基因相关的GSN、基因组信号传导中心和/或绝缘邻域。引起靶基因表达变化的扰乱刺激可以告知相关GSN的连通性，并且为相关疾病、病症或病状提供潜在的靶标和/或治疗方法。
下游靶标
在某些实施方案中，施用靶向基因信号传导网络的基因的下游产物的刺激。可替代地，所述刺激破坏了影响至少一个下游靶标的下游表达的基因信号传导网络。在一些实施方案中，所述基因是表1中列出的基因。
mRNA
对与单个绝缘邻域相关的或跨多个绝缘邻域的单个或多个基因信号传导网络(GSN)的扰乱可通过由于包含黏连蛋白的锚定位点的丢失而改变绝缘邻域的边界来影响单个基因或多组基因的转录。扰乱刺激可导致RNA表达和/或mRNA内初级转录物中的序列的修饰，所述mRNA内初级转录物中的序列即外显子或通过剪接除去的外显子之间的RNA序列即内含子。因此，此类改变可以改变基因的基因信号传导网络内的信号传导分子组的成员，从而定义了基因信号传导网络的变体。
蛋白质
对与单个绝缘邻域相关的或跨多个绝缘邻域的单个或多个基因信号传导网络的扰乱可影响作为基因组信号传导中心的一部分的单个基因或多组基因，以及基因组信号传导中心下游的基因的翻译。扰乱可能导致对翻译蛋白的抑制。
最近邻基因
扰乱刺激可引起与信号传导分子发生相互作用，以改变可位于初级邻域基因上游或下游的最近初级邻域基因的表达。邻域基因可以沿着染色体具有任何数量的上游或下游基因。在任何绝缘邻域内，相对于初级邻域基因，可能存在一个或多个，例如一个、两个、三个、四个或更多个上游和/或下游邻域基因。“初级邻域基因”是最常见于沿着染色体的特定绝缘邻域内的基因。初级邻域基因的上游邻域基因可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。初级邻域基因的下游邻域基因可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。
附加定义
如本文所用，术语“类似物”是指与参考化合物在结构上相关并且与参考化合物具有共同的功能活性的化合物。
如本文所用，术语“生物的”是指由多种天然来源诸如微生物、植物、动物或人细胞制成的医疗产品。
如本文所用，术语“边界”是指指示特征、元素或特性在何处结束或开始的点、界限或范围。
如本文所用，术语“化合物”是指单一剂或其药学上可接受的盐，或生物活性剂或药物。
如本文所用，术语“衍生物”是指结构与参考化合物不同但保留参考分子的基本特性质的化合物。
如本文所用，术语“下游邻域基因”是指初级邻域基因的下游的基因，其可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。
如本文所用，术语“基因”是指生物体的基因组架构例如染色体的单元或链段。基因可以是编码的或非编码的。基因可以被编码为连续的或不连续的多核苷酸。基因可以是DNA或RNA。
如本文所用，术语“基因组系统架构”是指个体的基因组的组构并且包括染色体、拓扑相关结构域(TAD)和绝缘邻域。
如本文所用，术语“主转录因子”是指改变(无论增加还是减少)靶基因例如邻域基因的转录并且建立细胞类型特异性增强子的信号传导分子。主转录因子将额外的信号传导蛋白，诸如其他转录因子募集至增强子以形成信号传导中心。
如本文所用，术语“调节”是指靶基因的表达和/或基因产物的活性的改变(例如，增加或减少)。
如本文所用，术语“邻域基因”是指位于绝缘邻域内的基因。
如本文所用，术语“外显率”是指携带基因的特定变体(例如，突变、等位基因或通常是基因型，无论是否是野生型)、也表现出该变体基因的相关性状(表型)的个体的比例并且在一些情况下以表现出临床症状的具有所述突变的个体的比例来测量，从而存在于连续体上。
如本文所用，术语“多肽”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，并且然后将所述多肽称为肽。如果多肽是肽，则其长度为至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。
如本文所用，术语“初级邻域基因”是指最常见于沿着染色体的特定绝缘邻域内的基因。
如本文所用，术语“初级下游边界”是指位于初级邻域基因下游的绝缘邻域边界。
如本文所用，术语“初级上游边界”是指位于初级邻域基因上游的绝缘邻域边界。
如本文所用，术语“启动子”是指下述DNA序列，其限定了RNA聚合酶在何处开始基因的转录并限定了指示要转录哪条DNA链的转录方向。
如本文所用，术语“调控序列区”包括但不限于沿着染色体的区、区段或区域，由此与信号传导分子发生相互作用以改变邻域基因的表达。
如本文所用，术语“阻遏物”是指与DNA结合并因此通过降低转录速率来调控基因表达的任何蛋白质。
如本文所用，术语“次级下游边界”是指在初级邻域基因内的次级环的下游边界。
如本文所用，术语“次级上游边界”是指在初级邻域基因内的次级环的上游边界。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指与染色体上的调控序列区直接或间接相互作用的任何实体，无论是蛋白质、核酸(DNA或RNA)、有机小分子、脂质、糖还是其他生物分子。
如本文所用，术语“信号传导转录因子”是指改变(无论增加还是减少)靶基因例如邻域基因的转录并且还充当细胞-细胞信号传导分子的信号传导分子。
如本文所用，术语“小分子”是指可以有助于调控生物过程的低分子量的药物，即＜5000道尔顿的有机化合物。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指向其提供用根据本公开的组合物的治疗的动物。
如本文所用，术语“治疗剂”是指具有治愈疾病或改善疾病症状的能力的物质。
如本文所用，术语“治疗剂或治疗结局”是指由于GSC或GSN的扰乱而产生的任何结果或效果(无论是阳性、阴性还是无效)。治疗剂结局的实例包括但不限于改良或改善与疾病或病症相关的不良或阴性情况、减轻副作用或症状、治愈疾病或病症或与扰乱GSC或GSN相关的任何改善。
如本文所用，术语“治疗剂或治疗缺点”是指与治疗或治疗方案相关的不希望的、有害的或减轻疗法的阳性结局的特征或特性。治疗缺点的实例包括例如毒性、半衰期差、生物利用度差、功效不足或丧失或药代动力学或药效动力学风险。
如本文所用，术语“上游邻域基因”是指初级邻域基因的上游的基因，其可位于与初级邻域基因相同的绝缘邻域内。
经典细胞信号传导通路
应当理解，在本领域详述的经典通路与本文定义的基因信号传导网络(GSN)之间可能并且很可能存在一些重叠。
尽管经典通路允许成员跨通路有一定程度的混杂(串扰)，但是本公开的基因信号传导网络(GSN)在基因水平上定义，并且基于对表达该基因的细胞、组织、器官或器官系统的任何数量的刺激或扰乱来表征。因此，在结构(例如基因)上和在情境(例如，功能，例如，表达谱)上都定义了GSN的性质。另外，虽然两个不同的基因信号传导网络可以共享成员，但是它们的独特之处还在于扰乱的性质可以区分它们。因此，基因信号传导网络在阐明生物系统功能方面的价值支持治疗研究和开发。
应当理解，并不旨在绝不在经典通路与基因信号传导网络之间进行连接；实际上，情况恰恰相反。为了桥接两个信号传导范例以获得进一步的科学见解，将经典信号传导通路范例与本公开的基因信号传导网络进行比较将是有益的。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及改变Janus激酶(JAK)/信号转导子和转录通路的激活子(STAT)。JAK/STAT通路是广泛的细胞因子和生长因子的主要介体。细胞因子是调节免疫应答的调控分子。JAK是典型地与细胞表面受体(诸如细胞因子受体)相关的细胞内非受体酪氨酸激酶家族。已知哺乳动物具有4种JAK：JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2(TYK2)。细胞因子或生长因子与其在细胞表面处的对应受体的结合引发JAK的转磷酸化，从而激活下游STAT。STAT是在激活之前一直存在于细胞质中的潜伏转录因子。存在七种哺乳动物STAT：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(STAT5A和STAT5B)和STAT6。激活的STAT易位至细胞核，在此处它们与其他核蛋白复合并结合特定序列以调控靶基因的表达。因此，JAK/STAT通路提供了将细胞外信号翻译成转录应答的直接机制。由JAK/STAT通路调控的靶基因参与免疫、增殖、分化、细胞凋亡和肿瘤发生。JAK的激活还可能激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和分裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及改变分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路。MAPK通路涉及细胞中的一系列信号传导分子(例如，Ras、Raf、MEK和ERK)，其将信号从细胞膜上的受体传达至细胞核。该通路可通过受体连接的酪氨酸激酶(诸如表皮生长因子受体(EGFR)、Trk A/B、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和PDGFR)激活。MAPK信号传导通路在调节许多细胞过程(包括细胞应激反应、细胞分化、细胞分裂、细胞增殖、炎症、新陈代谢、运动性和细胞凋亡)中是至关重要的。MAPK与以下主要通路靶标相互作用：ERK1/2、ERK5、JNK和p38激酶。MAPK调节包括C-myc、CREB和C-Fos的几种转录因子的活性。MAPK还与其他通路(诸如PI3K网络、NF-κB和JAK/STAT通路)相互作用。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及改变血小板衍生生长因子受体(PDGFR)介导的信号通路。PDGFR是血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员的细胞表面酪氨酸激酶受体。PDGFR有两种同种型，PDGFRα和PDGFRβ。这两种受体同种型在结合PDGF二聚体时二聚化，从而导致激酶的激活。PDGFR介导许多对调节细胞增殖、细胞分化、细胞生长和发育重要的信号传导通路。PDGFR介导的信号传导通路的抑制与PDGF、ang1/2和VEGF mRNA的表达减少有关。由于PDGF是PI3-K激活的已知刺激，因此抑制PDGFR可能导致PI3-K信号传导级联的激活减少。PDGF和PDGFR在生理学和医学中的作用综述于Andrae等人,Genes Dev.2008年5月15日；22(10):1276-312中，将所述文献据此通过引用以其全文并入。
根据本公开还可以改变的其他典型通路包括但不限于：2-花生四烯酰甘油生物合成通路、2-氧代羧酸代谢通路、5HT1型受体介导的信号传导通路、5HT2型受体介导的信号传导通路、5HT3型受体介导的信号传导通路、5HT4型受体介导的信号传导通路、5-羟色胺生物合成通路、5-羟色胺降解通路、阿巴卡韦转运和代谢通路、ABC转运蛋白通路、ABC家族蛋白介导的转运通路、ACE抑制剂通路、乙酸盐利用通路、乙酰胆碱合成通路、环磷酸腺苷依赖性PKA通路的激活、激活素β信号传导通路、腺嘌呤和次黄嘌呤补救通路、粘附体连接通路、脂肪细胞因子信号传导通路、脂肪生成通路、肾上腺素和去甲肾上腺素生物合成通路、心肌细胞中肾上腺素能信号传导通路、晚期糖基化终产物(age/rage)通路、晚期糖基化终产物受体信号传导通路、黄曲霉毒素b1代谢通路、age/rage通路、AHR通路、AKT信号传导通路、丙氨酸和天冬氨酸代谢通路、丙氨酸生物合成通路、醛固酮合成和分泌通路、醛固酮调节的钠重吸收通路、尿囊素降解通路、同种异体移植排斥通路、全反式维甲酸信号传导通路、alp23b信号传导通路、α6β4信号传导通路、α肾上腺素能受体信号传导通路、α6β4整合素通路、α-亚麻酸代谢通路、阿尔茨海默病-淀粉样蛋白分泌酶通路、阿尔茨海默病-早老素通路、氨基酸缀合通路、氨基糖和核苷酸糖代谢通路、氨酰基-tRNA生物合成通路、氨基丁酸降解通路、AMP激活的蛋白激酶通路、AMPK信号传导通路、大麻素生物合成通路、大麻素降解通路、雄性激素受体信号传导通路、雄性激素/雌性激素/黄体酮生物合成通路、血管生成通路、血管生成素-Tie2信号传导通路、血管紧张素II刺激的信号传导通过g蛋白和β-抑制蛋白通路、MHC的抗原处理和呈递通路、细胞凋亡调节和信号传导通路、HSP70的细胞凋亡调节通路、细胞凋亡信号传导通路、通过死亡受体的细胞凋亡通路、凋亡执行阶段通路、花生四烯酸表氧化酶/环氧化物水解酶通路、花生四烯酸代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、精氨酸生物合成通路、阿立哌唑代谢通路、芳胺代谢通路、抗坏血酸盐和醛酸盐代谢通路、抗坏血酸盐降解通路、天冬酰胺和天冬氨酸生物合成通路、天冬酰胺N-连接的糖基化通路、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路、RNA聚合酶-II起始复合物的组装通路、ATM通路、ATP合成通路、轴突导向通路、由导蛋白介导的轴突导向通路、由臂板蛋介导的轴突导向通路、由slit/robo介导的轴突导向通路、B细胞激活通路、B细胞受体(BCR)通路、B细胞受体信号传导通路、细菌侵入上皮细胞通路、基础转录因子通路、碱基切除修复通路、B细胞发育通路、B细胞受体通路、B细胞受体复合物通路、苯并通路、β1肾上腺素能受体信号传导通路、β2肾上腺素能受体信号传导通路、β3肾上腺素能受体信号传导通路、β-丙氨酸代谢通路、胆汁酸和胆汁盐代谢通路、胆汁分泌通路、通过清除剂受体的配体结合和摄取通路、生物胺合成通路、氨基酸的生物合成通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路、生物素生物合成通路、blakely网络通路、凝血级联通路、血凝固通路、bmp/激活素信号传导-果蝇通路、成骨蛋白通路、脑源性神经营养因子(BDNF)通路、BRCA1通路、安非他酮降解通路、丁酸酯代谢通路、丁酰苷菌素和新霉素生物合成通路、丁酸盐诱导的组蛋白乙酰化通路、钙粘素信号传导通路、咖啡因代谢通路、心肌细胞中的钙调控通路、钙信号传导通路、cAMP通路、碳水化合物消化和吸收通路、碳代谢通路、心肌收缩通路、心脏祖细胞分化通路、肉碱代谢通路、半胱天冬酶级联通路、哺乳动物含黄素单加氧酶的催化循环通路、CCKR信号传导图通路、巨噬细胞中的CCR5通路、CD4和CD8T细胞谱系通路、CD40信号传导通路、CDK5通路、细胞粘附分子(cams)通路、细胞循环检查点通路、细胞循环通路、细胞分化-元通路、细胞连接组织通路、血管壁细胞表面相互作用通路、CGMP-PKG信号传导通路、化学致癌性通路、趋化因子信号传导通路、胆固醇生物合成通路、胆碱能突触通路、分支酸盐生物合成通路、染色质重塑通路、昼夜节律钟系统通路、昼夜节律夹带通路、柠檬酸循环(TCA循环)通路、c-met通路、钴胺素生物合成通路、可待因和吗啡代谢通路、辅酶A生物合成通路、辅酶A连接的肉碱代谢通路、秋水仙碱代谢通路、收集管酸分泌通路、补体和凝血级联通路、cori循环通路、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)通路、通过CD28家族进行的共刺激通路、CREB通路、CTL介导的细胞凋亡通路、CTLA4信号传导通路、氰基氨基酸代谢通路、细胞周期蛋白和细胞循环调控通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路、半胱氨酸生物合成通路、细胞因子网络通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、细胞因子和炎症反应通路、细胞质核糖体蛋白通路、由rho GTP酶调控的细胞支架通路、胞浆DNA传感通路、从头嘌呤生物合成通路、从头嘧啶脱氧核糖核苷酸生物合成通路、从头嘧啶核糖核苷酸生物合成通路、突触前末梢的去极化触发钙通道开放通路、双氯芬酸代谢通路、分化通路、抗消化碳水化合物代谢通路、扩张型心肌病通路、纤维蛋白凝块的溶解通路、具有昼夜节律直向同源物的在白天调节基因通路、div无颜色通路、div通路、DNA损伤旁路通路、DNA损伤反应通路、DNA损伤逆转通路、DNA甲基化和转录抑制通路、DNA修复机制通路、DNA复制通路、多巴胺代谢通路、多巴胺受体介导的信号传导通路、多巴胺能突触通路、多巴胺能轴形成通路、DPP信号传导通路、DPP-SCW信号传导通路、药物代谢通路、药物代谢-细胞色素p450通路、dscam相互作用通路、E2F/MIRHG1反馈-环-删除通路、EBV LMP1信号传导通路、ECM-受体相互作用通路、一氧化氮的作用通路、pip2水解的作用通路、EGF通路、EGF受体信号传导通路、类花生酸合成通路、电子转运链通路、软骨内骨化通路、内分泌和其他因子调节的钙重吸收通路、内吞作用通路、内胚层分化通路、内源性大麻素信号传导通路、内皮素通路、内皮素信号传导通路、能量代谢通路、脑啡肽释放通路、enos信号传导通路、肝配蛋白-EPHR信号传导通路、表皮生长因子受体(EGFR)通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导通路、上皮紧密连接通路、EPO受体信号传导通路、ERBB信号传导通路、ERK信号传导通路、红细胞生成素通路、雌激素信号传导通路、醚酯代谢通路、真核转录起始通路、真核翻译延长通路、真核翻译起始通路、真核翻译终止通路、FAK1信号传导通路、Fas信号传导通路、脂肪消化和吸收通路、脂肪酸通路、脂肪酸β氧化通路、脂肪酸生物合成通路、脂肪酸降解通路、脂肪酸延长通路、脂肪酸代谢通路、脂肪酸ω氧化通路、FGF通路、FGF信号传导通路、成纤维细胞生长因子-1(FGF1)通路、黄素生物合成通路、FLT3信号传导通路、氟嘧啶活性通路、局部粘附通路、叶酸生物合成通路、叶酸谢通路、卵泡刺激素通路、纤维蛋白凝块的形成通路、甲酰四氢甲酸盐生物合成通路、Foxo信号传导通路、果糖半乳糖代谢通路、G蛋白信号传导通路、G1至S细胞循环控制通路、G13信号传导通路、GABA合成通路、GABA-B受体II信号传导通路、半乳糖代谢通路、γ-氨基丁酸合成通路、神经节鞘代谢通路、缝隙连接转运和调控通路、胃酸分泌通路、胃泌素通路、GBB信号传导通路、通用转录通路、胃饥饿素通路、胶质细胞分化通路、球状鞘脂代谢通路、胰高血糖素信号传导通路、糖皮质激素和盐皮质激素代谢通路、糖皮质激素受体信号传导通路、葡萄糖稳态通路、葡萄糖醛酸化通路、谷氨酸能突触通路、谷氨酰胺谷氨酸转化通路、谷胱甘肽代谢通路、聚糖降解通路、甘油脂代谢通路、甘油磷脂生物合成通路、甘油磷脂代谢通路、甘氨酸代谢通路、糖原代谢通路、糖酵解/糖异生通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸角质素通路、糖胺聚糖降解通路、糖胺聚糖代谢通路、鞘糖脂生物合成-神经节系列通路、鞘糖脂生物合成-球状系列通路、鞘糖脂生物合成-乳和新乳系列通路、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢通路、促性腺激素-释放激素受体通路、GP1B-IX-V激活信号传导通路、GPCR通路、GPCR下游信号传导通路、GPCR配体结合通路、GPVI介导的激活级联通路、粒细胞粘附和血细胞渗出通路、颗粒酶通路、生长激素信号传导通路、GSK 3信号传导通路、刺猬信号传导通路、来自多能干细胞的造血作用通路、造血细胞谱系通路、造血干细胞分化通路、血红素生物合成通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、异源三聚体G蛋白信号传导-Giα和Gsα介导的通路、异源三聚体g蛋白信号传导-外节段光传导通路、己糖转运通路、HGF通路、HIF-1信号传导通路、河马信号传导通路、组胺h1受体介导的信号传导通路、组胺h2受体介导的信号传导通路、组胺合成通路、组氨酸生物合成通路、组蛋白修饰通路、同源重组通路、HTLV-I感染通路、人补体系统通路、经由hif激活的缺氧反应通路、ID信号传导通路、IGF1R信号传导通路、肥胖中的IL1和巨核细胞通路、IL-1信号传导通路、IL-10通路、IL17信号传导通路、IL-2信号传导通路、IL-22通路、IL-3信号传导通路、IL-4信号传导通路、IL-5信号传导通路、IL-6通路、IL-7信号传导通路、IL-9信号传导通路、ILK信号传导通路、由趋化因子和细胞因子信号传导介导的炎症通路、Trp通道的炎症介质调控通路、炎症反应通路、甲型流感病毒感染通路、诱导型一氧化氮合酶信号传导通路、肌醇磷酸代谢通路、胰岛素受体通路、胰岛素抗性通路、胰岛素分泌通路、胰岛素/IGF蛋白激酶b信号传导级联通路、胰岛素样生长因子-2mRNA结合蛋白通路、整合素αIIbβ3信号传导通路、整合素细胞信号传导通路、整合素细胞表面相互作用通路,整合素介导的细胞粘附通路、干扰素通路、干扰素α/β信号传导通路、干扰素I型信号传导通路、干扰素γ信号传导通路、白细胞介素信号传导通路、白细胞介素-1(IL-1)通路、白细胞介素-1加工通路、白细胞介素-11信号传导通路、白细胞介素-2(IL-2)通路、白细胞介素-3通路、白细胞介素-4(IL-4)通路、白细胞介素-5(IL-5)通路、白细胞介素-6(IL-6)通路、白细胞介素-7(IL-7)通路、白细胞介素-9(il-9)通路、细胞内钙信号传导通路、离子型谷氨酸受体通路、IP3通路、异亮氨酸生物合成通路、JAK/STAT通路、JNK通路、驱动蛋白通路、KIT受体通路、动脉粥样硬化形成中的LDL氧化通路、瘦素(lep)通路、瘦素信号传导通路、亮氨酸生物合成通路、白细胞跨内皮迁移通路、亚油酸代谢通路、脂质消化通路、硫辛酸_生物合成通路、寿命调节-哺乳动物通路、寿命调节-多物种通路、长时程增强通路、赖氨酸生物合成通路、赖氨酸降解通路、溶酶体通路、甘露糖代谢通路、MAPK级联通路、由MAP激酶介导的MAPK靶标/核事件通路、基质金属蛋白酶通路、褪黑激素代谢和效应通路、元生物转化通路、碳水化合物代谢通路、一氧化氮代谢通路、核苷酸代谢通路、卟啉代谢通路、水溶性维生素和辅因子代谢通路、通过细胞色素p450进行的异生物素代谢通路、代谢型谷氨酸受体I组通路、代谢型谷氨酸受体II组通路、代谢型谷氨酸受体III组通路、蛋氨酸生物合成通路、甲基化通路、柠檬酸甲酯循环通路、甲基丙二酰通路、矿物质吸收通路、miRNA生物发生通路、错配修复通路、线粒体凋亡通路、线粒体基因表达通路、线粒体lc-脂肪酸β-氧化通路、有丝分裂G1-G1/S期通路、有丝分裂G2-G2/M期通路、单胺GPCR通路、单胺转运通路、mRNA封顶通路、mRNA编辑通路、mRNA加工通路、mRNA剪接通路、mRNA监视通路、mTOR信号传导通路、毒蕈碱乙酰胆碱受体1和3信号传导通路、毒蕈碱乙酰胆碱受体2和4信号传导通路、肌生成通路、肌层松弛和收缩收缩通路、N-乙酰氨基葡萄糖代谢代谢通路、NAD生物合成II通路、纳米材料诱导的细胞凋亡通路、纳米颗粒触发的自噬细胞死亡通路、纳米颗粒触发的调节性坏死通路、自然杀伤细胞介导细胞毒性通路、神经突向外生长的神经细胞粘附分子信号传导通路、肾病蛋白相互作用通路、纺锤蛋白-1信号传导通路、神经嵴分化通路、神经活性配体-受体相互作用通路、突触间隙中的神经递质清除通路、神经递质释放循环通路、神经胶质细胞中的神经递质摄取和代谢通路、神经营养蛋白信号传导通路、NFAT和心脏肥大通路、NF-κb信号传导通路、NF-κb信号传导通路、NGF通路、经由来自质膜的TRKA的NGF信号传导通路、N-聚糖生物合成通路、烟酸盐和烟酰胺代谢通路、嗜铬细胞上的烟碱活性通路、多巴胺能神经元上的烟碱活性通路、烟碱降解通路、烟碱代谢通路、烟碱药效学通路、烟碱乙酰胆碱受体信号传导通路硝苯地平活性通路、氮代谢通路、NLR蛋白通路、nod样受体信号传导通路、非同源末端连接通路、notch信号传导通路、Nrf2通路、核受体通路、核小体组装通路、核苷酸切除修复通路、核苷酸GPCR通路、核苷酸代谢通路、核苷酸结合寡聚结构域通路、o-抗原生物合成通路、o-聚糖生物合成通路、嗅觉转导通路、制瘤素m信号传导通路、一碳代谢通路、阿片前强啡肽通路、阿片前脑啡肽通路、阿片阿黑皮素原通路、鸟氨酸降解通路、成骨细胞信号传导通路、破骨细胞信号传导通路、骨桥蛋白信号传导通路、卵巢类固醇通路、通过细胞色素p450的氧化通路、氧化磷酸化通路、氧化应激通路、催产素受体介导的信号传导通路、催产素信号传导通路、p38 MAPK信号传导通路、p53反馈环1通路、p53反馈环2通路、p53介导的细胞凋亡通路、p53信号传导通路、pak通路、胰腺分泌通路、泛酸盐生物合成通路、parkin-泛素蛋白酶体系统通路、通过水通道蛋白的被动转运通路、PDGF信号传导通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化通路、戊糖磷酸通路、肽GPCR通路、肽聚糖生物合成通路、二十四碳酰-辅酶A的过氧化物酶体β氧化通路、过氧化物酶体脂质代谢通路、百日咳通路、吞噬体通路、化合物的第1阶段功能化通路、第I阶段生物转化通路、第II阶段缀合通路、苯乙酸盐降解通路、苯丙氨酸生物合成通路、苯丙氨酸代谢通路、苯乙胺降解通路、苯丙酸盐降解通路、磷脂酰肌醇信号传导系统通路、磷脂酶D信号传导通路、光传导通路、PI3激酶通路、B淋巴细胞中的PI3K信号传导通路、PI3K-AKT信号传导通路、PIP3激活AKT信号传导通路、纤溶酶原激活级联通路、血小板激活通路、血小板与暴露胶原粘附通路、血小板聚集通路、血小板稳态通路、多元醇通路、卟啉和叶绿素代谢通路、PPAR信号传导通路、初级胆汁酸生物合成通路、初级局灶性节段性肾小球硬化FSGs通路、加帽的含内含子的前mRNA的加工通路、加帽的无内含子的前mRNA的加工通路、黄体酮介导的卵母细胞成熟通路、催乳素信号传导通路、脯氨酸生物合成通路、丙酸酯代谢通路、前列腺素合成和调控通路、蛋白酶体通路、蛋白酶体降解通路、蛋白质消化和吸收通路、蛋白质输出通路、蛋白质折叠通路、近端小管碳酸氢盐回收通路、PRPP生物合成通路、PTEN通路、嘌呤代谢通路、吡哆醛磷酸盐补救通路、吡哆醛-5-磷酸盐生物合成通路、嘧啶代谢通路、丙酮酸盐代谢通路、rac1通路、破骨细胞中的rank信号传导通路、rankl/rank通路、rap1信号传导通路、ras信号传导通路、Ras-RAF-MEK-ERK通路、核因子κ-b配体的受体激活剂(RANKL)通路、肌动蛋白细胞骨架的调控通路、细胞凋亡的调控通路、自体吞噬的调控通路、DNA复制的调控通路、脂肪细胞中的脂解的调控通路、微管细胞骨架的调控通路、toll样受体信号传导的调控通路、粘附体连接的重塑通路、肾素分泌通路、肾素-血管紧张素系统通路、呼吸电子转运通路、视黄醇代谢通路、逆行内源性大麻素信号传导通路、Rho家族GTP酶通路、Rhoa通路、真核生物中的核糖体生物发生通路、RIG-I样受体信号传导通路、RNA降解通路、RNA聚合酶I通路、RNA聚合酶II转录通路、RNA转运通路、RNAi通路、s-腺苷蛋氨酸生物合成通路、唾液分泌通路、补救嘧啶脱氧核糖核苷酸通路、补救嘧啶核糖核苷酸通路、SCW信号传导通路、硒代谢和硒蛋白通路、硒微量营养素网络通路、硒化合物代谢通路、脑信号蛋白相互作用通路、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、丝氨酸甘氨酸生物合成通路、血清素能突触通路、血清素htr1组和fos通路、血清素受体2和ELK-SRF/gata4信号传导通路、血清素受体2和STAT3信号传导通路、血清素受体4/6/7和NR3C信号传导通路、血清素转运蛋白活性通路、信号放大通路、信号调节蛋白通路、S1P受体的信号转导通路、通过EGFR进行的信号传导通路、通过胰岛素受体进行的信号传导通路、通过PDGF进行的信号传导通路、通过rho 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II.具有未满足需求的疾病
在一些实施方案中，疾病、病症或病状可以选自具有未满足的治疗需求的那些。表1提供了具有未满足的治疗需求的疾病的实例并提出了针对治疗的基因。
表1.具有未满足需求的疾病
Figure BDA0002716199420000371
在一些实施方案中，具有未满足需求的疾病是镰状细胞病(SCD)，其是严重的、罕见的血液病，具有有限的治疗选择。SCD具有在美国为约100,000名患者而在欧洲为约60,000名患者的大型孤儿适应症。由于血管阻塞、溶血性贫血、炎症/血管损伤导致多器官功能衰竭，所述疾病导致毁灭性的发病率和预期寿命缩短20-30年的死亡率。具体地，在大脑中，可能会发生中风(梗塞或出血)，从而导致瘫痪、神经认知障碍或死亡。具体地，在肺中，可能会发生急性胸部综合症、肺动脉高压和/或肺炎。具体地，在肾脏中，可能会发生血尿、肾功能不全和/或肾衰竭。具体地，在骨骼和关节中，可能会发生骨髓梗塞、骨髓炎和缺血性坏死/骨坏死。具体地，在肝/胆囊中，可能会发生肝病、胆结石和/或肝衰竭。具体地，在眼睛中，可能会发生出血、失明、视网膜脱离和/或视网膜病。具体地，在心脏中，可能会发生心脏肥大和/或心力衰竭。具体地，在脾脏中，可能会发生萎缩(自体脾切除术)。具体地，在皮肤上，可能会发生脚踝溃疡和/或指炎。具体地，在男性中，可能会发生阴茎异常勃起。具体地，在女性中，可能会发生不良妊娠结局。
当前的治疗包括L-谷氨酰胺和羟基脲。目前在SCD治疗管道中的主要药物包括替格瑞洛、Sel-G1、GBT-440和LentiGlobin。HIF稳定剂、trichosic、HDAC-1/2抑制剂、PRMT-5抑制剂、EdX-17、LSD-1抑制剂、MBD抑制剂、PB-04和帕比司他已显示出HbF诱导治疗SCD的希望。Aes-107、PNQ-103、MX-1520和SCD-101已显示出作为治疗SCD的抗镰状化剂的希望。PF-4447943已显示出作为治疗SCD的抗粘剂的希望。VBP-15和NKTT-120已显示出作为治疗SCD的抗炎剂的希望。在一些实施方案中，本文的方法通过使用以上提供的化合物中的至少一种或选自U.S.62/501,795(所述文献据此通过引用以其全文并入)的表19-26、28的至少一种刺激调节信号传导中心和/或绝缘邻域来提供SCD的治疗。在一些实施方案中，所选择的化合物或刺激靶向选自U.S.62/501,795(所述文献据此通过引用以其全文并入)的表1-9的至少一种基因，从而导致SCD表型的挽救。
III.组合物和方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于调节一种或多种靶基因(诸如表1中列出的那些)的表达的组合物和方法。本文所述的组合物和方法可以用于治疗或预防与靶基因相关的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，与靶基因相关的疾病、病症或病状是表1中列出的一种。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指向其提供用根据本公开的组合物的治疗的动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，受试者可能已经被诊断为患有与一种或多种靶基因相关的疾病、病症或病状或具有其症状。在其他实施方案中，受试者可能易感与一种或多种靶基因相关的疾病、病症或病状或处于其风险中。
在一些实施方案中，受试者可能在靶基因内或附近携带一个或多个突变。在一些实施方案中，受试者可能携带靶基因的一个功能等位基因和一个突变等位基因。在一些实施方案中，受试者可能携带靶基因的两个突变等位基因。突变可以改变从靶基因产生的蛋白质的水平或活性。
在一些实施方案中，与健康受试者相比，受试者可能缺乏从靶基因产生的蛋白质。这可能是由于突变削弱了蛋白质的活性，降低了蛋白质的稳定性或降低了基因的表达。因此，本文所述的组合物和方法可以用于增加靶基因的表达以挽救相关疾病、病症或病状的表型。在其他实施方案中，与健康受试者相比，受试者可能从靶基因过量产生蛋白质，或产生具有不需要的活性的蛋白质。这可能是由功能获得性突变、降解过程受损或表达失调引起的。因此，本文所述的组合物和方法可以用于减少靶基因的表达以挽救相关疾病、病症或病状的表型。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法可以用于改变细胞中靶基因的表达。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是肝细胞。
可以通过本领域已知的和本文所述的各种技术诸如RNA-seq、qRT-PCR、蛋白质印迹、或酶联免疫吸附测定(ELISA)在RNA水平或蛋白质水平上评估基因表达的变化。基因表达的变化可以通过比较经治疗的细胞或受试者中的靶基因表达水平与未经治疗或对照细胞或受试者中的表达水平来确定。在一些实施方案中，本公开的组合物和方法引起靶基因的表达增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、约25％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、约80％至约100％、约100％至约125％、约100至约150％、约150％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％或多于500％。在一些实施方案中，本公开的组合物和方法引起靶基因的表达倍数变化约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约18倍、约20倍、约25倍或多于30倍。在一些实施方案中，本公开的组合物和方法引起靶基因的表达减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、约25％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、超过80％、或甚至超过90％、95％或99％。
在一些实施方案中，由本公开的组合物和方法诱导的靶基因表达的增加可以足以预防或减轻受试者中相关疾病、病症或病状的一种或多种体征或症状。在一些实施方案中，由本公开的组合物和方法诱导的靶基因表达的降低可以足以预防或减轻受试者中相关疾病、病症或病状的一种或多种体征或症状。在一些实施方案中，由本公开的组合物和方法诱导的一组基因表达的变化可以足以预防或减轻受试者中相关疾病、病症或病状的一种或多种体征或症状。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防纤连蛋白肾小球病的组合物和方法，所述纤连蛋白肾小球病归因于由染色体2q35上的FN1基因编码的纤连蛋白的沉积。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制FN1基因表达的信号传导中心来降低纤连蛋白的水平。纤连蛋白水平的降低可以足以挽救纤连蛋白肾小球病的表型。在某些实施方案中，能够降低FN1表达的化合物选自smoothened激动剂、克唑替尼、BGJ398、AZD2858、氨氯地平苯磺酸盐、PHA-665752、OSU-03012、bms-986094(inx-189)、阿法替尼(afatinib)、LDN193189、索曲滔林(sotrastaurin)、SKL2001、替伏扎尼(tivozanib)、西地尼布(cedirandib)、骨化三醇(calcitriol)、利莫那班(rimonabant)、美瑞替尼、BMP4和GDF2(BMP9)。在一些实施方案中，smoothened激动剂扰乱刺猬/Smoothened通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，克唑替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，BGJ398扰乱FGFR通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，AZD2858扰乱GSK-3通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，氨氯地平苯磺酸盐扰乱钙通道通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，PHA-665752扰乱c-MET通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，OSU-03012扰乱PDK-1通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，阿法替尼扰乱EGFR通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，LDN193189扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，索曲滔林扰乱PKC通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，SKL2001扰乱WNT通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，替伏扎尼扰乱蛋白酪氨酸激酶/RTK通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，西地尼布扰乱蛋白酪氨酸激酶/RTK通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，骨化三醇扰乱维生素D受体通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，利莫那班扰乱大麻素受体通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，美瑞替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，BMP4扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。在一些实施方案中，GDF2(BMP9)扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以降低FN1的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防遗传性粪卟啉病的组合物和方法，所述遗传性粪卟啉病归因于由染色体3q11.2上的CPOX基因编码的酶粪卟啉原氧化酶的缺乏。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制CPOX基因表达的信号传导中心来增加粪卟啉原氧化酶的水平。粪卟啉原氧化酶水平的增加可以足以挽救遗传性粪卟啉病的表型。在某些实施方案中，能够增加CPOX表达的化合物选自萨力多胺(thalidomide)、胃长宁(Glycopyrrolate)、MK-0752、博舒替尼(Bosutinib)、奈法唑酮(Nefazodone)、皮质酮(Corticosterone)、去铁胺甲磺酸盐、GZD824二甲磺酸盐、XMU-MP-1、泼尼松、FICZ、SKL2001、氯化钴和17-AAG(他司匹霉素(Tanespimycin))。在一些实施方案中，萨力多胺扰乱NF-kB通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，胃长宁扰乱乙酰胆碱受体通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，MK-0752扰乱NOTCH信号传导通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，博舒替尼扰乱Src通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，奈法唑酮扰乱钙信号传导通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，皮质酮扰乱盐皮质激素受体通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，去铁胺甲磺酸盐扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，GZD824二甲磺酸盐扰乱ABL通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，XMU-MP-1扰乱Hippo通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，泼尼松扰乱GR信号传导通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，FICZ扰乱芳烃受体通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，SKL2001扰乱WNT通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，氯化钴扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。在一些实施方案中，17-AAG(他司匹霉素)扰乱细胞周期/DNA损伤；代谢酶/蛋白酶通路中的至少一种组分以增加CPOX的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防SERPINC1缺乏症的组合物和方法，所述SERPINC1缺乏症归因于由染色体1q25.1上的SERPINC1基因编码的抗凝血酶(先前称为抗凝血酶III)的缺乏。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制SERPINC1基因表达的信号传导中心来增加抗凝血酶的水平。抗凝血酶水平的增加可以足以挽救SERPINC1缺乏症的表型。在某些实施方案中，能够增加SERPINC1表达的化合物选自CP-673451、棘霉素、帕克替尼、阿木替尼(amuvatinib)、克瑞拉尼(crenolanib)、INNO-206(奥多柔比星(aldoxorubicin))、莫洛替尼、萨力多胺和皮斐松-μ。在一些实施方案中，CP-673451扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，棘霉素扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，帕克替尼扰乱JAK-STAT通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，阿木替尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，克瑞拉尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，INNO-206(奥多柔比星)扰乱细胞周期/DNA损伤通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，莫洛替尼扰乱JAK/STAT通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，萨力多胺扰乱NF-kB通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。在一些实施方案中，皮斐松-μ扰乱p53通路中的至少一种组分以增加SERPINC1的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防Alagille综合征的组合物和方法，所述Alagille综合征归因于分别由染色体20p12.2上的JAG1基因和染色体1p12上的NOTCH2基因编码的jagged 1配体和/或Notch2受体的缺乏。大多数患有Alagille综合征的患者在jagged 1中具有单倍剂量不足，并且一些患者还缺乏Notch2。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制JAG1基因和/或NOTCH2基因表达的信号传导中心来增加jagged 1和Notch2的水平。JAG1和/或Notch2水平的增加可以足以挽救Alagille综合征的表型。在某些实施方案中，能够增加JAG1和/或NOTCH2表达的化合物选自美瑞替尼和托彻普以增加两种基因的表达。在某些实施方案中，所述化合物选自LDN193189、LDN212854、萨力多胺、苯乙福明(phenformin)、恩扎滔林(enzastaurin)、GDF2(BMP9)、BMP2、INNO-206(奥多柔比星)、阿木替尼、BMP4和BAY 87-2243以改变JAG1的信号传导中心，从而增加JAG1的表达。可替代地，所述化合物选自齐泊腾坦(Zibotentan)和740Y-P以改变NOTCH2的信号传导中心，从而增加NOTCH2表达。在一些实施方案中，LDN193189扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，LDN-212854扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，萨力多胺扰乱NF-kB通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，苯乙福明扰乱AMPK通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，恩扎滔林扰乱表观遗传学；TGF-β/Smad通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，GDF2(BMP9)扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，BMP2扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，INNO-206(奥多柔比星)扰乱细胞周期/DNA损伤通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，美瑞替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，阿木替尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，BMP4扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，BAY 87-2243扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，齐泊腾坦扰乱GPCR/G蛋白质通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。在一些实施方案中，740Y-P扰乱PI3K/AKT通路中的至少一种组分以增加JAG1或NOTCH2的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防糖原贮积病1b的组合物和方法，所述糖原贮积病1b归因于由染色体11q23.3上的基因SLC37A4编码的葡萄糖-6-磷酸移位酶(G6PT)的缺乏。编码区SLC37A4中的突变可导致部分功能性蛋白质。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制SLC37A4基因表达的信号传导中心来增加葡萄糖-6-磷酸移位酶的水平。葡萄糖-6-磷酸移位酶(G6PT)水平的增加可以足以挽救糖原贮积病1b的表型。在某些实施方案中，能够增加SLC37A4表达的化合物选自棘霉素、泼尼松、CP-673451、氯化钴、阿木替尼、帕克替尼、R788(福坦替尼(fostamatinib)、二钠六水合物、GZD824二甲磺酸盐、皮质酮、地塞米松(dexamethasone)、TNF-α(TNF-a)、萨力多胺和IGF-1。在一些实施方案中，棘霉素扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，泼尼松扰乱GR信号传导通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，CP-673451扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，氯化钴扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，阿木替尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，帕克替尼(SB1518)扰乱JAK-STAT通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，R788(福坦替尼，二钠六水合物)扰乱蛋白酪氨酸激酶/RTK通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，GZD824二甲磺酸盐扰乱ABL通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，皮质酮扰乱盐皮质激素受体通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，地塞米松扰乱糖皮质激素受体通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，TNF-a扰乱NF-kB、MAPK、细胞凋亡通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，萨力多胺扰乱NF-kB通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。在一些实施方案中，IGF-1扰乱IGF-1R/InsR通路中的至少一种组分以增加SLC37A4的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防急性间歇性卟啉病的组合物和方法，所述急性间歇性卟啉病归因于由染色体11q23.3上的HMBS基因编码的羟甲基胆素合酶(HMBS)的缺乏。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制HMBS基因表达的信号传导中心来增加HMBS的水平。HMBS水平的增加可以足以挽救急性间歇性卟啉病的表型。在一些实施方案中，能够增加HMBS表达的化合物是索曲滔林。在一些实施方案中，索曲滔林扰乱蛋白激酶C(PKC)信号传导通路中的至少一种组分以增加HMBS的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防LECT2淀粉样变性的组合物和方法，所述LECT2淀粉样变性归因于由染色体5q31.1上的LECT2基因编码的白细胞趋化因子2(LECT2)蛋白的沉积。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制LECT2基因表达的信号传导中心来减少LECT2的水平。LECT2水平的降低可以足以挽救LECT2淀粉样变性的表型。在一些实施方案中，能够降低LECT2表达的化合物选自骨化三醇、17-AAG(他司匹霉素)、利托那韦(Ritonavir)、TFP、b-雌二醇(b-Estradiol)、利福平(Rifampicin)、托彻普、齐泊腾坦、利莫那班、OSU-03012、阿法替尼、NSC228155、葡萄糖、APS-2-79、佛波醇1213-二丁酸酯、泼尼松、740Y-P、氨氯地平苯磺酸盐和达雷拉迪(Darapladib)。在一些实施方案中，骨化三醇扰乱维生素D受体通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，17-AAG(他司匹霉素)扰乱细胞周期/DNA损伤；代谢酶/蛋白酶通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，TFP扰乱P53通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，b-雌二醇扰乱ER通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，利福平扰乱PXR通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，齐泊腾坦扰乱GPCR/G蛋白质通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，利莫那班扰乱大麻素受体通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，OSU-03012扰乱PDK-1通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，阿法替尼扰乱EGFR通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，NSC228155扰乱EGFR通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，葡萄糖扰乱代谢/糖酵解通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，APS-2-79扰乱MAPK通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，佛波醇1213-二丁酸酯扰乱PKC通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，泼尼松扰乱GR通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，740Y-P扰乱PI3K/AKT通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。在一些实施方案中，氨氯地平苯磺酸盐扰乱钙通道通路中的至少一种组分以降低LECT2的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防APOL1相关肾小球疾病的组合物和方法，所述APOL1相关肾小球疾病归因于由染色体22q12.3上的APOL1基因编码的载脂蛋白L1(APOL1)的风险变体。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制APOL1基因表达的信号传导中心来减少UDP-葡糖醛酸转移酶的水平。APOL1水平的降低可以足以挽救APOL1相关肾小球疾病的表型。在一些实施方案中，能够降低APOL1表达的化合物选自呋喃妥因和克唑替尼。在一些实施方案中，呋喃妥因扰乱抗生素通路中的至少一种组分以降低APOL1的表达。在一些实施方案中，克唑替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以降低APOL1的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防Gilbert综合征和/或CrigglerNajjar II型的组合物和方法，所述Gilbert综合征和/或Criggler Najjar II型归因于由染色体2q37.1上的UGT1A1基因编码的尿苷5′-二磷酸(UDP)-葡糖醛酸转移酶的活性降低。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制UGT1A1基因表达的信号传导中心来增加UDP-葡糖醛酸转移酶的水平。UDP-葡糖醛酸转移酶水平的增加可以足以挽救Gilbert综合征和/或Criggler Najjar II型的表型。在某些实施方案中，所述化合物或刺激选自FICZ、卡托吉宁、meBIO、CP-673451、BAM7、EW-7197、帕克替尼(SB1518)、皮斐松-a、LY294002、BMS-754807、蓓萨罗丁(Bexarotene)、克唑替尼、ARN-509、棘霉素、JNJ-38877605、奥美拉唑、RO4929097、莫洛替尼、BIRB 796、AZD6738、司马西特(Semagacestat)、格列美脲(Glimepiride)、AZD1480、隐丹参醌(Cryptotanshinone)、GW4064、LRH-1拮抗剂、PND-1186、克瑞拉尼、EB1089、索曲滔林、皮质酮、GZD824二甲磺酸盐、奈他地尔(Netarsudil)、R788(福坦替尼二钠六水合物)、氧海罂粟碱(Oxoglaucine)、依伐西曲匹(Evacetrapib)、LY2584702、美瑞替尼、CI-4AS-1、达沙替尼(Dasatinib)、洛罗茶碱(Rolofylline)(KW-3902)、IWP-2、T0901317、利托那韦、BIO、阿木替尼、FRAX597、抗穆勒氏管激素、Wnt3a、得克替尼(Decernotinib)、德索莫啡(Dorsomorphin)、依托咪酯(Etomidate)和GDC-0879。在一些实施方案中，FICZ扰乱芳烃受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，卡托吉宁扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，meBIO扰乱芳烃受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，CP-673451扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，BAM7扰乱BCL2通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，EW-7197扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，皮斐松-a扰乱p53通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，LY294002扰乱PI3K/AKT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，BMS-754807扰乱IGF-1R/InsR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，蓓萨罗丁扰乱RXR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，克唑替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，ARN-509扰乱雄性激素受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，棘霉素扰乱缺氧激活通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，JNJ-38877605扰乱c-MET通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，奥美拉唑扰乱质子泵通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，RO4929097扰乱NOTCH通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，莫洛替尼扰乱JAK/STAT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，BIRB 796扰乱MAPK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，AZD6738扰乱ATM/ATR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，司马西特扰乱Notch、神经元信号传导；干细胞/Wnt通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，格列美脲扰乱钾通道通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，AZD1480扰乱JAK/STAT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，隐丹参醌扰乱JAK/STAT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，GW4064扰乱FXR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，LRH-1拮抗剂扰乱LHR-1通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，PND-1186扰乱FAK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，克瑞拉尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，EB1089扰乱维生素D受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，索曲滔林扰乱PKC通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，皮质酮扰乱盐皮质激素受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，GZD824二甲磺酸盐扰乱ABL通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，奈他地尔扰乱ROCK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，R788(福坦替尼，二钠六水合物)扰乱蛋白酪氨酸激酶/RTK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，氧海罂粟碱扰乱PI3K/AKT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，LY2584702扰乱S6K通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，美瑞替尼扰乱c-MET通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，CI-4AS-1扰乱雄性激素受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，达沙替尼扰乱ABL通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，IWP-2扰乱WNT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，T0901317扰乱LXR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，BIO扰乱泛GSK-3通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，阿木替尼扰乱PDGFR通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，FRAX597扰乱PAK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，抗穆勒氏管激素扰乱TGF-B通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，Wnt3a扰乱WNT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，得克替尼扰乱JAK/STAT通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，德索莫啡扰乱AMPK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，依托咪酯扰乱GABA能受体通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。在一些实施方案中，GDC-0879扰乱MAPK通路中的至少一种组分以增加UGT1A1的表达。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防血脂异常的组合物和方法，所述血脂异常与低密度脂蛋白受体(LDLR)的缺陷、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)的功能突变增加和血管生成素样3(ANGPTL3)的表达增加相关。LDLR由染色体19p13.2上的LDLR基因编码；PCSK9由染色体1p32.3上的PCSK9基因编码；并且ANGPTL3由染色体1p31.3上的ANGPTL3基因编码。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制LDLR、PCSK9和/或ANGPTL3表达的信号传导中心来增加LDL受体的水平和/或减少PCSK9和/或ANGPTL3的水平。LDL受体水平的增加和/或PCSK9和/或ANGPTL3(可以是ANGPTL3)水平的降低可以足以挽救血脂异常的表型，所述血脂异常包括导致多种异常的脂蛋白代谢紊乱，包括：高总胆固醇、高LDL-C或高甘油三酯。在某些实施方案中，能够增加LDLR表达和/或减少PCSK9和/或ANGPTL3表达的化合物选自WYE-125132(WYE-132)和皮斐松-μ。在某些实施方案中，所述化合物选自SGI-1776、普瑞迪南和CO-1686(洛来替尼(rociletinib))，以减少ANGPTL3并增加LDLR。可替代地，所述化合物可以是LY294002以增加LDLR并减少PCSK9。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防Rett综合征的组合物和方法，所述Rett综合征与甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)的缺陷相关。MECP2由染色体Xq28上的MECP2基因编码。在一些实施方案中，本文教导的至少一种化合物或方法通过改变负责控制MECP2表达的信号传导中心来增加MECP2的水平。MECP2水平的增加可以足以挽救Rett综合征的表型。在某些实施方案中，能够增加MECP2表达的化合物是17-AAG(他司匹霉素)/KOS-953。
小分子
在一些实施方案中，用于调节靶基因表达的化合物可以包括小分子。如本文所用，术语“小分子”是指可以有助于调控生物过程的低分子量的药物，即＜5000道尔顿的有机化合物。在一些实施方案中，将本文所述的小分子化合物应用于基因组系统，以干扰与靶基因相关的基因信号传导网络的组分(例如，转录因子、信号传导蛋白)，从而调节靶基因的表达。在一些实施方案中，将本文所述的小分子化合物应用于基因组系统，以改变绝缘邻域的边界和/或破坏与靶基因相关的信号传导中心，从而调节靶基因的表达。
可以进行小分子筛选以鉴定通过绝缘邻域的信号传导中心起作用以改变可以调节靶基因表达的基因信号传导网络的小分子。例如，可以施用已知的信号传导激动剂/拮抗剂。通过已知通过信号传导中心起作用并调节靶基因表达的小分子鉴定和验证可信的命中点。
多肽
在一些实施方案中，用于改变靶基因表达的化合物包括多肽。如本文所用，术语“多肽”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，并且然后将所述多肽称为肽。如果多肽是肽，则其长度为至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单一分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽并且可以进行缔合或连接。术语多肽还可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
抗体
在一些实施方案中，用于改变靶基因表达的化合物包括抗体。在一个实施方案中，包括本文所述的抗体、抗体片段、其变体或衍生物的本公开的抗体与和靶基因相关的基因信号传导网络中的至少一种组分是特异性免疫反应性的。
如本文所用，术语“抗体”以最广义使用并且具体地涵盖各个实施方案，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体)和抗体片段诸如双体，只要它们表现出所需的生物活性。抗体主要是基于氨基酸的分子，但是也可以包含一种或多种修饰，诸如具有糖部分。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单一抗原结合位点。还产生残余的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。本公开的抗体可包含这些片段中的一种或多种。出于本文的目的，“抗体”可以包含重链和轻链可变结构域以及Fc区。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成。每条轻链都借助一个共价二硫键连接到一条重链，但不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数量不同。每条重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，之后为多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)且在它的另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
如本文所用，术语“可变结构域”是指这样的特定抗体结构域，其在抗体间的序列广泛不同并且用于各特定抗体对它的特定抗原的结合和特异性。如本文所用，术语“Fv”是指含有完整的抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。此区由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。
基于它们恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的抗体“轻链”分配到两种清楚区分的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可分配到不同的类别。存在五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的若干种可以进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
如本文所用，“单链Fv”或“scFv”是指VH和VL抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域连接在一起成为单一多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头使scFv能够形成抗原结合所需的结构。
术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与相同多肽链中的轻链可变结构域VL连接的重链可变结构域VH。通过使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体更充分描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中，将每一个所述文献的内容通过引用以其全文并入本文。
本公开的抗体可以是通过本领域已知的方法或如在本申请中描述的方法产生的多克隆或单克隆或重组抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由实质上同源细胞(或克隆)的群体获得的抗体，即除可在产生单克隆抗体期间出现的可能变体(所述变体一般以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
修饰语“单克隆”表明抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源。
“人源化”形式的非人(例如鼠类)抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的抗体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的抗体的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基替换。
当在本文中关于抗体使用时，术语“高变区”是指抗体的抗原结合结构域内的区，所述区包含负责抗原结合的氨基酸残基。存在于高变区内的氨基酸决定了互补决定区(CDR)的结构。如本文所用，“CDR”是指包含与其靶抗原或表位互补的结构的抗体区。
在一些实施方案中，本公开的组合物可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或作用并且与它们的分子靶标特异性且以高亲和力结合的任何分子。这样，抗体模拟物包括纳米抗体等。
在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域中已知的那些，包括但不限于亲合体(affibody)分子、affilin、affitin、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer和Kunitz和结构域肽。在其他实施方案中，抗体模拟物可包括一个或多个非肽区。
如本文所用，术语“抗体变体”是指在结构和/或功能上类似于抗体，其氨基酸序列、组成或结构与天然抗体相比具有一些差异的生物分子。
抗体(无论是单克隆还是多克隆)的制备是本领域已知的。用于产生抗体的技术是本领域熟知的并且例如描述于Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",ColdSpring Harbor Laboratory Press,1988以及Harlow和Lane“Using Antibodies:ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999。
本公开的抗体的特征可以在于它们的靶分子、用于产生它们的抗原、它们的功能(无论是作为激动剂还是拮抗剂)和/或它们在其中起作用的细胞生态位。
可以在体外或体内在正常生理条件下相对于标准品进行抗体功能的测量。也可以相对于抗体的存在或不存在进行测量。此类测量方法包括在组织或流体(诸如血清或血液)中进行标准测量，诸如蛋白质印迹、，酶联免疫吸附测定(ELISA)、活性测定、报告基因测定、荧光素酶测定、聚合酶链反应(PCR)阵列、基因阵列、实时逆转录酶(RT)PCR等。
本公开的抗体经由(可逆或不可逆地)结合至一个或多个靶位点而发挥其作用。虽然不希望受到理论的束缚，但是代表抗体结合位点的靶位点最通常是由蛋白质或蛋白质结构域或区形成的。然而，靶位点也可以包括生物分子，诸如糖、脂质、核酸分子或任何其他形式的结合表位。
可替代地或另外地，本公开的抗体可以充当配体模拟物或非传统有效载荷载体，用于将结合的或缀合的药物有效载荷递送或运送至特定的靶位点。
由本公开的抗体引起的变化可以导致细胞的新生形变化。如本文所用，“新生形变化”是新的或不同的变化或改变。此类变化包括细胞外、细胞内和跨细胞信号传导。
在一些实施方案中，本公开的化合物或剂用于改变或控制蛋白水解事件。此类事件可以是细胞内或细胞外的。
本公开的抗体以及用于产生它们的抗原主要是基于氨基酸的分子。这些分子可以是“肽”、“多肽”或“蛋白质”。
如本文所用，术语“肽”是指具有2至50个或更多个氨基酸的基于氨基酸的分子。专用指示词适用于较小的肽，其中“二肽”是指两个氨基酸的分子，并且“三肽”是指三个氨基酸的分子。具有超过50个连续氨基酸的基于氨基酸的分子被认为是多肽或蛋白质。
术语“一个氨基酸”和“多个氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸以及非天然存在的氨基酸。氨基酸可通过如下的一个字母或三个字母名称来标识:天冬氨酸(Asp:D)、异亮氨酸(Ile:I)、苏氨酸(Thr:T)、亮氨酸(Leu:L)、丝氨酸(Ser:S)、酪氨酸(Tyr:Y)、谷氨酸(Glu:E)、苯丙氨酸(Phe:F)、脯氨酸(Pro:P)、组氨酸(His:H)、甘氨酸(Gly:G)、赖氨酸(Lys:K)、丙氨酸(Ala:A)、精氨酸(Arg:R)、半胱氨酸(Cys:C)、色氨酸(Trp:W)、缬氨酸(Val:V)、谷氨酰胺(Gln:Q)蛋氨酸(Met:M)、天冬酰胺(Asn:N)，其中首先列出氨基酸，然后在括号里分别是三个字母代码和一个字母代码。
杂交寡核苷酸
在一些实施方案中，寡核苷酸可以用于改变与靶基因相关的基因信号传导网络或作为所述基因信号传导网络的扰乱刺激，所述寡核苷酸包括经由杂交机制起作用的那些，无论是单链还是双链的，诸如反义分子、RNAi构建体(包括siRNA、saRNA、microRNA等)、适体和核酶。
在一些实施方案中，杂交寡核苷酸(例如，siRNA)可以用于敲低参与调控靶基因表达的通路的信号传导分子，由此使得在不存在信号传导分子的情况下改变所述表达。例如，一旦鉴定出负向调控靶基因表达的通路，就可以用RNAi剂(例如siRNA)敲低所述通路的组分(例如受体、蛋白激酶、转录因子)以增强所述基因的表达。类似地，一旦鉴定出正向调控靶基因表达的通路，就可以用RNAi剂(例如siRNA)敲低所述通路的组分(例如受体、蛋白激酶、转录因子)以降低所述基因的表达。
在一些实施方案中，多于一种杂交寡核苷酸可以用于靶向同一通路中的多于一种组分，或来自不同通路的多于一种组分，以改变靶基因表达。此类组合疗法可以通过同时阻断调控靶基因表达的多个信号传导分子和/或通路来实现叠加或协同作用。
由于此类寡核苷酸也可以用作治疗剂，因此可以分别通过询问本公开的基因信号传导网络来改善或预测它们的治疗缺点和治疗结局。
基因组编辑方法
在某些实施方案中，可以通过改变限定与靶基因相关的绝缘邻域和/或基因组信号传导中心的染色体区来调节靶基因的表达。
改变伴随着绝缘邻域的基因表达的方法包括改变信号传导中心(例如，使用CRISPR/Cas来改变信号传导中心结合位点或在突变时进行修复/替换)。这些改变可能导致各种结果，包括：过早/不适当地激活细胞死亡通路(许多免疫性病症的关键)、产生过少/过多的基因产物(也称为变阻假说)、产生过少/过多的细胞外酶分泌、防止谱系分化、转换谱系通路、促进干性、起始或干扰自动调控反馈环、引发细胞代谢错误、不适当的印迹/基因沉默以及形成有缺陷的染色质状态。另外，基因组编辑方法(包括本领域众所周知的那些)可用于通过改变黏连蛋白项链或移动基因和增强子来创建新的信号传导中心。
在某些实施方案中，本文描述的基因组编辑方法可包括使用位点特异性核酸酶在基因组内特定位置引入单链或双链DNA断裂的方法。此类断裂可通过内源性细胞过程(诸如同源性定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ))进行修复以及通过所述内源性细胞过程定期修复。HDR本质上是一种无错误的机制，其可在存在同源DNA序列的情况下修复双链DNA断裂。HDR的最常见形式是同源重组。它利用同源序列作为模板以在断裂点处插入或替换特定的DNA序列。同源DNA序列的模板可以是内源序列(例如姐妹染色单体)、或外源或提供的序列(例如质粒或寡核苷酸)。这样，可以利用HDR在所需区域引入精确的改变，诸如替换或插入。相比之下，NHEJ是一种容易出错的修复机制，其可将由双链断裂产生的DNA末端直接连接，并可能在裂解位点丢失、添加或突变一些核苷酸。产生的小缺失或插入(称为“插入缺失”)或突变可能破坏或增强基因表达。另外，如果同一DNA上有两个断裂，NHEJ可能导致插入链段的缺失或倒置。因此，可以利用NHEJ在裂解位点处引入插入、缺失或突变。
CRISPR/Cas系统
在某些实施方案中，可以使用CRISPR/Cas系统缺失CTCF锚定位点以调节与该锚定位点相关的绝缘邻域内的基因表达。参见，Hnisz等人,Cell167,2016年11月17日，将所述文献据此通过引用以其全文并入。破坏绝缘邻域边界阻止了相关信号传导中心正常运行所必需的相互作用。由于这种破坏，也已经观察到与缺失的邻域边界紧邻的表达基因的变化。
在某些实施方案中，可以使用CRISPR/Cas系统来修饰现有的CTCF锚定位点。例如，可以通过以下方式来突变或倒置现有的CTCF锚定位点：用CRISPR/Cas核酸酶和一种或多种指导RNA诱导NHEJ，或与无催化活性的CRISPR/Cas酶和一种或多种指导RNA的靶向结合来掩蔽。现有CTCF锚定位点的改变可能破坏现有绝缘邻域的形成，并且改变位于这些绝缘邻域内的基因的表达。
在某些实施方案中，可以使用CRISPR/Cas系统来引入新的CTCF锚定位点。可以通过用CRISPR/Cas核酸酶、一个或多个指导RNA和包含CTCF锚定位点序列的供体模板在选定位点处诱导HDR来引入CTCF锚定位点。引入新的CTCF锚定位点可以创建新的绝缘邻域和/或改变现有的绝缘邻域，这可以影响位于这些绝缘邻域附近的基因的表达。
在某些实施方案中，可以使用CRISPR/Cas系统来通过改变信号传导中心结合位点而改变信号传导中心。例如，如果信号传导中心结合位点含有影响信号传导中心与相关转录因子组装的突变，则可以通过使用CRISPR/Cas核酸酶和一个或多个指导RNA在提供的校正供体模板存在下在突变处或附近诱导双链DNA断裂来修复突变位点。
在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统可用于通过结合至绝缘邻域内的区(例如，增强子)来调节邻域基因的表达并阻断转录。这种结合可以防止将转录因子募集到信号传导中心和起始转录。CRISPR/Cas系统可以是不裂解DNA的无催化活性的CRISPR/Cas系统。
在某些实施方案中，可以使用CRISPR/Cas系统来经由在邻域基因的编码区中引入短缺失来敲低这些基因的表达。修复时，此类缺失将导致移码和/或在基因产生的mRNA中引入过早终止密码子，随后经由无义介导的衰变使mRNA降解。这对于调节信号传导通路的激活和阻遏组分的表达可能是有用的，所述信号传导通路的激活和阻遏组分将导致在这些通路控制下的基因(包括疾病基因，诸如表1中列出的那些)的表达减少或增加。
在其他实施方案中，CRISPR/Cas系统也可以用于改变凝聚项链或移动基因和增强子。
CRISPR/Cas酶
CRISPR/Cas系统是细菌适应性免疫系统，其利用RNA指导的核酸内切酶靶向特定序列并降解靶核酸。它们已经适应在基因组编辑和/或转录调节领域的各种应用中使用。本领域已知的或本文公开的任何酶或直系同源物均可用于本文用于基因组编辑方法中。
在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统可以是II型CRISPR/Cas9系统。Cas9是一种核酸内切酶，可与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)一起作用来裂解双链DNA。通过使用接头环将crRNA的3'端与tracrRNA的5'端相连接，可以将这两个RNA工程化以形成单分子指导RNA。Jinek等人,Science,337(6096):816-821(2012)显示CRISPR/Cas9系统可用于RNA可编程基因组编辑，并且国际专利申请WO2013/176772提供了CRISPR/Cas核酸内切酶系统用于位点特异性编辑的多种实例和应用，将所述文献通过引用以其全文并入本文。示例性CRISPR/Cas9系统包括衍生自以下的那些：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、金黄色链球菌(Streptococcusaureas)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)。
在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统可以是V型CRISPR/Cpf1系统。Cpf1是一种单一RNA指导的核酸内切酶，其与II型系统相比缺少tracrRNA。Cpf1产生交错的DNA双链断裂，具有4或5个核苷酸的5'突出端。Zetsche等人Cell.2015年10月22日；163(3):759-71提供了可用于基因组编辑应用中的Cpf1核酸内切酶的实例，将所述文献通过引用以其全文并入本文。示例性CRISPR/Cpf1系统包括衍生自以下的那些：土拉弗朗西斯菌、氨基酸球菌属物(Acidaminococcus sp.)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌。
在某些实施方案中，使一个或另一个核酸酶结构域失活的CRISPR/Cas核酸内切酶的切口酶变体可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。切口酶已显示出相比于NHEJ促进HDR。HDR可以由单独Cas切口酶或使用侧接靶区域的切口酶对进行指导。
在某些实施方案中，无催化活性的CRISPR/Cas系统可用于与靶区(例如，CTCF锚定位点或增强子)结合并干扰其功能。Cas核酸酶(诸如Cas9和Cpf1)包含两个核酸酶结构域。突变催化位点处的关键残基产生仅与靶位点结合而不会导致裂解的变体。与染色体区(例如CTCF锚定位点或增强子)的结合可以破坏绝缘邻域或信号传导中心的适当形成，并且因此导致位于靶区附近的基因表达发生改变。
在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统可以包含与CRISPR/Cas酶融合的额外的功能结构域。功能结构域可以参与包括但不限于以下的过程：转录激活、转录抑制、DNA甲基化、组蛋白修饰和/或染色质重塑。此类功能结构域包括但不限于转录激活结构域(例如VP64或KRAB、SID或SID4X)、转录阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂、DNA甲基转移酶、隐花色素、光诱导性/可控结构域或化学诱导性/可控结构域。
在某些实施方案中，可以将CRISPR/Cas酶作为以下中的一种或组合施用给细胞或患者：一种或多种多肽、一种或多种编码多肽的mRNA或一种或多种编码多肽的DNA。
指导核酸
在某些实施方案中，指导核酸可用于将相关的CRISPR/Cas酶的活性指导至靶核酸内的特定靶序列。指导核酸凭借它们与CRISPR/Cas酶的缔合而提供了对引导核酸和CRISPR/Cas复合物的靶特异性，并且因此指导核酸可以指导CRISPR/Cas酶的活性。
在一个方面，指导核酸可以是RNA分子。在一方面，指导RNA可以是单分子指导RNA。在一方面，指导RNA可以是经化学修饰的。
在某些实施方案中，可以提供超过一个的指导RNA以介导在基因组内的不同位点处的多种CRISPR/Cas介导的活性。
在某些实施方案中，指导RNA可以作为一种或多种RNA分子或一种或多种编码RNA序列的DNA施用给细胞或患者。
核糖核蛋白复合物(RNP)
在一个实施方案中，可以将CRISPR/Cas酶和指导核酸各自分别施用给细胞或患者。
在另一个实施方案中，可以将CRISPR/Cas酶与一个或多个指导核酸预复合。然后可以将预复合物质施用给细胞或患者。这种预复合物质被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
锌指核酸酶
在某些实施方案中，本公开的基因组编辑方法涉及锌指核酸酶(ZFN)的使用。锌指核酸酶(ZFN)是模块化蛋白质，其由与DNA裂解结构域连接的工程化锌指DNA结合结构域组成。典型的DNA裂解结构域是II型核酸内切酶FokI的催化结构域。因为FokI仅作为二聚体起作用，所以必须要求对一对ZFN进行工程化以结合至相对DNA链上的同源靶“半位点”序列，并在它们之间具有精确的间隔，以使两者能够使催化活性的FokI结构域二聚化。在本身没有序列特异性的FokI结构域二聚化后，作为基因组编辑的起始步骤，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂。
转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)
在某些实施方案中，本公开的基因组编辑方法涉及转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)的使用。TALEN代表模块化核酸酶的另一种形式，类似于ZFN，其是通过将工程化的DNA结合结构域融合到核酸酶结构域而生成的，并且串联操作以实现靶向的DNA裂解。虽然ZFN中的DNA结合结构域由锌指基序组成，但TALEN DNA结合结构域衍生自转录激活因子样效应(TALE)蛋白，所述蛋白最初是在植物细菌病原体黄单胞菌属种(Xanthomonas sp.)中描述的。TALE由33-35个氨基酸重复序列的串联阵列组成，每个重复序列识别靶DNA序列中的单个碱基对，所述靶DNA序列通常长度至多20bp，从而得到至多40bp的总靶序列长度。每个重复序列的核苷酸特异性由重复序列可变二残基(RVD)决定，所述二残基仅在位置12和13处包含两个氨基酸。鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基主要被四个RVD识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成了比锌指要简单得多的识别码，并且因此代表了对于核酸酶设计比锌指具有优势。然而，与ZFN一样，TALEN的蛋白质-DNA相互作用在其特异性方面也不是绝对的，并且TALEN还受益于使用FokI结构域的专性异二聚体变体来降低脱靶活性。
IV.配制和递送
药物组合物
根据本公开，可以将组合物制备为药物组合物。应当理解，此类组合物必须包含一种或多种活性成分以及最通常地包含药学上可接受的赋形剂。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以根据所治疗受试者的身份、体型和/或疾患并且进一步根据所述组合物被施用的途径而变化。例如，组合物可以包含在0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间，例如介于.5与50％之间、介于1％-30％之间、介于5％-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含至少一个有效载荷。作为非限制性实例，药物组合物可含有1、2、3、4或5个有效载荷。
虽然本文提供的药物组合物的说明主要针对适合于施用给人的药物组合物，但是本领域的技术人员应理解的是此类组合物通常也适合于施用给任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使上述组合物适合于施用给多种动物，将适合于施用给人的药物组合物进行改良是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可以仅用普通实验(如果有的话)设计和/或进行此类改良。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关哺乳动物，诸如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠、大鼠；鸟类，包括商业相关鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用给人、人患者或受试者。
在一些实施方案中，将组合物施用给哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是肝细胞。
制剂
本公开的制剂可包括但不限于盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于转移或移植到受试者中)及其组合。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或今后开发的任何方法来制备。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分联合的步骤。
本文所述的组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或今后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分联合，并且然后如果必要和/或希望，将产物均分、成形和/或包装成所希望的单或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量进行制备、包装和/或批量出售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要向受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的合宜部分，例如像这种剂量的一半或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以根据所治疗受试者的身份、体型和/或疾患并且进一步根据所述组合物被施用的途径而变化。例如，组合物可以包含在0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间，例如介于0.5与50％之间、介于1％-30％之间、介于5％-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
赋形剂和稀释剂
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和兽医学用途。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以为药用级。在一些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
如本文所用的赋形剂包括但不限于适用于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；将所述文献通过引用以其全文并入本文)。可以考虑在本公开的范围内使用常规的赋形剂介质，除非任何常规的赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不希望的生物学作用或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
非活性成分
在一些实施方案中，药物组合物制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指对制剂中包含的药物组合物的活性成分的活性没有贡献的一种或多种试剂。在一些实施方案中，可以在本公开的制剂中使用的所有非活性成分、没有使用的非活性成分或使用的一些非活性成分可以由美国食品和药品管理局(FDA)批准。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种非活性成分，诸如但不限于1,2,6-己三醇；1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-S-(1-甘油))；1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二油酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二棕榈酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1,2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1,2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-邻甲苯双胍；2-乙基-1,6-己二醇；乙酸；冰乙酸；乙酸酐；丙酮；丙酮亚硫酸氢钠；乙酰化羊毛脂醇；乙酰化单甘油酯；乙酰半胱氨酸；DL-乙酰色氨酸；丙烯酸酯共聚物；丙烯酸-丙烯酸异辛酯共聚物；丙烯酸粘合剂788；活性炭；Adcote72A103；粘合带；己二酸；Aerotex树脂3730；丙氨酸；聚集的白蛋白；白蛋白胶体；人白蛋白；乙醇；脱水乙醇；变性乙醇；稀释乙醇；Alfadex；海藻酸；烷基铵磺酸甜菜碱；烷基芳基磺酸钠；尿囊素；烯丙基α-紫罗兰酮；杏仁油；α-松油醇；α-生育酚；Dl-α-生育酚乙酸酯；Dl-α-生育酚；乙酸铝；尿囊素氯羟基铝；氢氧化铝；水合氢氧化铝-蔗糖；氢氧化铝胶；氢氧化铝凝胶F 500；氢氧化铝胶F 5000；单硬脂酸铝；氧化铝；铝聚酯；硅酸铝；淀粉辛烯基琥珀酸铝；硬脂酸铝；亚乙酸铝；无水硫酸铝；Amerchol C；Amerchol-Cab；氨基甲基丙醇；氨；氨溶液；浓的氨溶液；乙酸铵；氢氧化铵；月桂基硫酸铵；壬苯醇醚-4硫酸铵；C-12-C-15线性伯醇乙氧基化物的铵盐；硫酸铵；Ammonyx；两性(Amphoteric)-2；两性-9；茴香脑；无水柠檬酸；无水右旋糖；无水乳糖；无水柠檬酸三钠；大茴香油；Anoxid Sbn；消泡剂；安替比林；阿帕氟烷(Apaflurane)；野杏仁油6酯；阿夸弗尔；精氨酸；Arlacel；抗坏血酸；棕榈酸抗坏血酸酯；天冬氨酸；秘鲁香脂；硫酸钡；蜂蜡；合成蜂蜡；山嵛醇聚醚-10；膨润土；苯扎氯铵；苯磺酸；苄索氯铵；苄度溴铵；苯甲酸；苯甲醇；苯甲酸苄酯；氯化苄；Betadex；二聚阿普西肽(Bibapcitide)；碱式没食子酸铋；硼酸；溴克利那(Brocrinat)；丁烷；丁基醇；乙烯基甲基醚的丁基酯/马来酸酐共聚物(125000Mw)；硬脂酸丁酯；丁基羟基茴香醚；丁羟甲苯；丁二醇；对羟基苯甲酸丁酯；丁酸；C20-40链烷醇聚醚-24；咖啡因；钙；碳酸钙；氯化钙；葡庚糖酸钙；氢氧化钙；乳酸钙；考布曲钙(Calcobutrol)；卡地胺钠(Caldiamide Sodium)；钙塞酸三钠(Caloxetate Trisodium)；钙立醇钙；加拿大香脂；辛酸/癸酸甘油三酯；辛酸/癸酸/硬脂酸甘油三酯；克菌丹(Captan)；Captisol；焦糖；卡波姆1342；卡波姆1382；卡波姆934；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆941；卡波姆980；卡波姆981；B型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联的)；C型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联的)；二氧化碳；羧基乙烯基共聚物；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素钠；羧基聚亚甲基角；角叉菜胶；角叉菜胶盐；蓖麻油；雪松叶油；纤维素；微晶纤维素；Cerasynt-Se；地蜡；鲸蜡硬脂醇聚醚-12；鲸蜡硬脂醇聚醚-15；鲸蜡硬脂醇聚醚-30；鲸蜡硬脂醇/鲸蜡硬脂醇聚醚-20；乙基己酸鲸蜡硬脂酯；鲸蜡醇聚醚-10；鲸蜡醇聚醚-2；鲸蜡醇聚醚-20；鲸蜡醇聚醚-23；鲸蜡硬脂醇；西曲氯铵；鲸蜡醇；鲸蜡酯蜡；棕榈酸鲸蜡酯；西吡氯铵；氯丁醇；氯丁醇半水合物；无水氯丁醇；氯甲酚；氯二甲苯酚；胆固醇；胆甾醇聚醚；胆甾醇聚醚-24；柠檬酸盐；柠檬酸；柠檬酸一水合物；含水柠檬酸；椰油酰胺醚硫酸盐；椰油胺氧化物；椰油基甜菜碱；椰油基二乙醇酰胺；椰油基单乙醇酰胺；可可脂；椰油甘油酯；椰子油；氢化椰子油；氢化椰子油/棕榈仁油甘油酯；椰油酰基辛酰癸酸酯；光亮可乐果(ColaNitida)种子提取物；胶原；着色悬浮液；玉米油；棉籽油；膏基；肌酸；肌酸；甲酚；交联羧甲基纤维素钠；交聚维酮；硫酸铜；无水硫酸铜；环聚二甲基硅氧烷；环聚二甲基硅氧烷/二甲聚硅氧烷共聚多元醇；半胱氨酸；盐酸半胱氨酸；无水盐酸半胱氨酸；半胱氨酸，Dl-；D&C红色28号；D&C红色33号；D&C红色36号；D&C红色39号；D&C黄色10号；达伐吡啶(Dalfampridine；)；Daubert 1-5Pestr(哑光)164z；癸基甲基亚砜；Dehydag Wax Sx；脱氢乙酸；Dehymuls E；苯甲酸地那铵；脱氧胆酸；右旋糖酐；右旋糖酐40；糊精；右旋糖；右旋糖一水合物；右旋糖溶液；泛影酸；重氮烷基脲；二氯苄醇；二氯二氟甲烷；二氯四氟乙烷；二乙醇胺；焦碳酸二乙酯；癸二酸二乙酯；二乙二醇单乙基醚；邻苯二甲酸二乙基己酯；氨基乙酸二羟基铝；二异丙醇胺；己二酸二异丙酯；二亚油酸二异丙酯；聚二甲基硅氧烷350；聚二甲基硅氧烷共聚多元醇；聚二甲基硅氧烷Mdx4-4210；聚二甲基硅氧烷医学流体360；二甲基异山梨醇；二甲基亚砜；甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；二甲基双十八烷基铵膨润土；二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物；地乐酚铵盐；Dl-二棕榈酰磷脂酰甘油；二丙二醇；椰油酰两性基二乙酸二钠；月桂醇聚醚磺基琥珀酸二钠；月桂基磺基琥珀酸二钠；磺基水杨酸二钠；地索苯宁(Disofenin)；二乙烯基苯苯乙烯共聚物；Dmdm乙内酰脲；二十二烷醇；多库酯钠；Duro-Tak 280-2516；Duro-Tak 387-2516；Duro-Tak80-1196；Duro-Tak 87-2070；Duro-Tak 87-2194；Duro-Tak 87-2287；Duro-Tak 87-2296；Duro-Tak 87-2888；Duro-Tak 87-2979；乙二胺四乙酸钙二钠；乙二胺四乙酸二钠；无水乙二胺四乙酸二钠；乙二胺四乙酸钠；依地酸；鸡蛋磷脂；辛苯氧磺(Entsufon)；辛苯氧磺钠；表乳糖(Epilactose)；盐酸表四环素；Essence花束9200；乙醇胺盐酸盐；乙酸乙酯；油酸乙酯；乙基纤维素；乙二醇；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；乙二胺；乙二胺二盐酸盐；乙烯-丙烯共聚物；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(28％乙酸乙烯酯)；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(9％乙酸乙烯酯)；羟基硬脂酸乙基己酯；对羟基苯甲酸乙酯；桉油醇；依沙美肟(Exametazime)；可食用脂肪；硬脂肪；脂肪酸酯；脂肪酸季戊四醇酯；脂肪酸；脂肪醇柠檬酸盐；脂肪醇；Fd&C蓝色1号；Fd&C绿色3号；Fd&C红色4号；F&C红色40号；Fd&C黄色10号(已退市)；Fd&C黄色5号；Fd&C黄色6号；氯化铁；氧化铁；风味剂89-186；风味剂89-259；风味剂Df-119；风味剂Df-1530；风味增强剂；风味无花果827118；风味覆盆子Pfc-8407；风味剂Rhodia Pharmaceutical Rf 451号；氟氯烃；甲醛；甲醛溶液；分馏椰子油；芳香剂3949-5；芳香剂520a；芳香剂6.007；芳香剂91-122；芳香剂9128-Y；芳香剂93498g；芳香剂松香脂5124号；芳香剂花束10328；芳香剂Chemoderm 6401-B；芳香剂Chemoderm 6411；芳香剂膏73457号；芳香剂Cs-28197；芳香剂Felton 066m；芳香剂Firmenich 47373；芳香剂Givaudan Ess 9090/1c；芳香剂H-6540；芳香剂草本10396；芳香剂Nj-1085；芳香剂PO Fl-147；芳香剂Pa 52805；芳香剂Pera Derm D；芳香剂Rbd-9819；芳香剂Shaw Mudge U-7776；芳香剂Tf 044078；芳香剂Ungerer金银花K2771；芳香剂Ungerer N5195；果糖；氧化钆；半乳糖；γ环糊精；明胶；交联明胶；明胶海绵；结冷胶(低酰基)；Gelva 737；龙胆酸；龙胆酸乙醇酰胺；葡庚糖酸钠；葡庚糖酸钠二水合物；葡糖酸内酯；葡萄糖醛酸；Dl-谷氨酸；谷胱甘肽；甘油；氢化松香甘油酯；柠檬酸甘油酯；异硬脂酸甘油酯；月桂酸甘油酯；单硬脂酸甘油酯；油酸甘油酯；油酸甘油酯/丙二醇；棕榈酸甘油酯；蓖麻油甘油酯；硬脂酸甘油酯；硬脂酸甘油酯-月桂醇聚醚-23；硬脂酸甘油酯/聚乙二醇硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯/Peg-100硬脂酸酯；甘油硬脂酸酯/Peg-40硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯-硬脂酰胺基乙基二乙胺；三油酸甘油酯；甘氨酸；甘氨酸盐酸盐；二硬脂酸乙二醇酯；硬脂酸乙二醇酯；胍盐酸盐；瓜尔胶；护发素(18n195-1m)；庚烷；羟乙基淀粉；己二醇；高密度聚乙烯；组氨酸；人白蛋白微球；透明质酸钠；烃；增塑的烃凝胶；盐酸；稀盐酸；氢化可的松；水凝胶聚合物；过氧化氢；氢化蓖麻油；氢化棕榈油；氢化棕榈/棕榈仁油Peg-6酯；氢化聚丁烯635-690；氢氧根离子；羟乙基纤维素；羟乙基哌嗪乙烷磺酸；羟甲基纤维素；羟基硬脂酸羟基二十八烷醇酯；；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素2906；羟丙基-β-环糊精；羟丙甲纤维素2208(15000Mpa.S)；羟丙甲纤维素2910(15000Mpa.S)；羟丙甲纤维素；咪脲；碘；碘沙酸；碘非他胺盐酸盐；爱尔兰苔藓提取物；异丁烷；异鲸蜡醇聚醚-20；异亮氨酸；丙烯酸异辛酯；异丙醇；异硬脂酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯-肉豆蔻醇；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；异硬脂酸；异硬脂醇；等渗氯化钠溶液；耶琳；高岭土；Kathon Cg；Kathon Cg II；乳酸盐；乳酸；Dl-乳酸；L-乳酸；乳糖酸；乳糖；乳糖一水合物；含水乳糖；羊毛脂醇聚醚；羊毛脂；羊毛脂醇-矿物油；羊毛脂醇；无水羊毛脂；羊毛脂胆固醇；羊毛脂非离子衍生物；乙氧基化羊毛脂；氢化羊毛脂；劳拉氯铵(Lauralkonium Chloride)；月桂基胺氧化物；月桂基二甲基铵水解动物胶原蛋白；月桂醇聚醚硫酸盐；月桂醇聚醚-2；月桂醇聚醚-23；月桂醇聚醚-4；月桂酸二乙醇酰胺；月桂酸肉豆蔻二乙醇酰胺；月桂酰肌氨酸；乳酸月桂酯；月桂基硫酸盐；薰衣草(Lavandula Angustifolia)花顶部；卵磷脂；未漂白的卵磷脂；鸡蛋卵磷脂；氢化卵磷脂；氢化大豆卵磷脂；大豆卵磷脂；柠檬油；亮氨酸；乙酰丙酸；利多苯宁(Lidofenin)；轻质矿物油；轻质矿物油(85Ssu)；(+/-)-柠檬烯；Lipocol Sc-15；赖氨酸；赖氨酸乙酸盐；赖氨酸一水合物；硅酸铝镁；硅酸铝镁水合物；氯化镁；硝酸镁；硬脂酸镁；马来酸；甘露醇；Maprofix；甲溴菲宁(Mebrofenin)；医用胶粘剂改性的S-15；医用消泡A-F乳剂；亚甲膦酸二钠(Medronate Disodium)；亚甲膦酸；葡甲胺；薄荷醇；间甲酚；偏磷酸；甲磺酸；蛋氨酸；甲醇；甲基葡糖醇聚醚-10；甲基葡糖醇聚醚-20；甲基葡糖醇聚醚-20倍半硬脂酸酯；甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯；月桂酸甲酯；甲基吡咯烷酮；水杨酸甲酯；硬脂酸甲酯；甲基硼酸；甲基纤维素(4000Mpa.S)；甲基纤维素；甲基氯异噻唑啉酮；亚甲蓝；甲基异噻唑啉酮；对羟基苯甲酸甲酯；微晶蜡；矿物油；甘油单酯和甘油二酯；柠檬酸单硬脂酯；单硫代甘油；多甾醇提取物；肉豆蔻醇；乳酸肉豆蔻酯；肉豆蔻基-γ-甲基吡啶氯化物；N-(氨基甲酰基-甲氧基Peg-40)-1,2-二硬脂酰基-脑磷脂钠；N,N-二甲基乙酰胺；烟酰胺；镍肟(Nioxime)；硝酸；氮；壬苯醇醚碘；壬苯醇醚-15；壬苯醇醚-9；诺氟烷(Norflurane)；燕麦片；十八碳烯-1/马来酸共聚物；辛酸；辛水杨酯；辛苯聚醇-1；辛苯聚醇-40；辛苯聚醇-9；辛基十二烷醇；辛基酚聚亚甲基；油酸；油醇聚醚-10/油醇聚醚-5；油醇聚醚-2；油醇聚醚-20；油烯醇；油酸油烯酯；橄榄油；奥昔膦酸二钠；羟基喹啉；棕榈仁油；棕榈胺氧化物；对羟基苯甲酸酯；石蜡；白色柔软石蜡；Parfum Creme 45/3；花生油；精制花生油；果胶；Peg 6-32硬脂酸酯/硬脂酸乙二醇酯；Peg植物油；Peg-100硬脂酸酯；Peg-12月桂酸甘油酯；Peg-120硬脂酸甘油酯；Peg-120甲基葡萄糖二油酸酯；Peg-15椰油胺；Peg-150二硬脂酸酯；Peg-2硬脂酸酯；Peg-20山梨糖醇异硬脂酸酯；Peg-22甲醚/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-25丙二醇硬脂酸酯；Peg-4二月桂酸酯；Peg-4月桂酸酯；Peg-40蓖麻油；Peg-40山梨聚糖二异硬脂酸酯；Peg-45/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-5油酸酯；Peg-50硬脂酸酯；Peg-54氢化蓖麻油；Peg-6异硬脂酸酯；Peg-60蓖麻油；Peg-60氢化蓖麻油；Peg-7甲醚；Peg-75羊毛脂；Peg-8月桂酸酯；Peg-8硬脂酸酯；Pegoxol 7硬脂酸酯；十五内酯；季戊四醇椰油酸酯；喷替酸五钠(Pentasodium Pentetate)；喷替酸钙三钠；喷替酸；薄荷油；Perflutren；香料25677；香料花束；香料E-1991；香料Gd 5604；香料Tana 90/42 Scba；香料W-1952-1；石油；白色石油；石油馏分；苯酚；液化苯酚；Phenonip；苯氧乙醇；苯丙氨酸；苯乙醇；乙酸苯汞；硝酸苯汞；鸡蛋磷脂酰甘油；磷脂；鸡蛋磷脂；磷脂90g；磷酸；松针油(Pinus Sylvestris)；哌嗪六水合物；Plastibase-50w；波拉克林(Polacrilin)；泊利氯铵(Polidronium Chloride)；泊洛沙姆124；泊洛沙姆181；泊洛沙姆182；泊洛沙姆188；泊洛沙姆237；泊洛沙姆407；聚(双(对-羧苯氧基)丙烷酸酐)：癸二酸；聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)二甲基乙烯基或二甲基羟基或三甲基封端；聚(Dl-乳酸-共-乙醇酸)，(50:50；聚(Dl-乳酸-共-乙醇酸)，乙酯封端，(50:50；聚丙烯酸(250000Mw)；聚丁烯(1400Mw)；聚卡波非；聚酯；聚酯多胺共聚物；聚酯人造丝；聚乙二醇1000；聚乙二醇1450；聚乙二醇1500；聚乙二醇1540；聚乙二醇200；聚乙二醇300；聚乙二醇300-1600；聚乙二醇3350；聚乙二醇400；聚乙二醇4000；聚乙二醇540；聚乙二醇600；聚乙二醇6000；聚乙二醇8000；聚乙二醇900；含氧化铁黑(<1％)的高密度聚乙烯；含硫酸钡(20-24％)的低密度聚乙烯；聚乙烯T；聚对苯二甲酸乙二酯；Polyglactin；聚甘油基-3油酸酯；聚甘油基-4油酸酯；聚甲基丙烯酸羟乙酯；聚异丁烯；聚异丁烯(1100000Mw)；聚异丁烯(35000Mw)；聚异丁烯178-236；聚异丁烯241-294；聚异丁烯35-39；聚异丁烯低分子量；聚异丁烯中等分子量；聚异丁烯/聚丁烯粘合剂；聚丙交酯；多元醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯1800；聚氧乙烯醇；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯丙烯；聚氧基20鲸蜡硬脂基醚；聚氧基35蓖麻油；聚氧基40氢化蓖麻油；聚氧基40硬脂酸酯；聚氧基400硬脂酸酯；聚氧基6和聚氧基32棕榈酰硬脂酸酯；聚氧基二硬脂酸酯；聚氧基甘油基硬脂酸酯；聚氧基羊毛脂；聚氧基棕榈酸酯；聚氧基硬脂酸酯；聚丙烯；丙二醇；聚季铵盐-10；聚季铵盐-7(70/30丙烯酰胺/Dadmac；聚硅氧烷；聚山梨酯20；聚山梨酯40；聚山梨酯60；聚山梨酯65；聚山梨酯80；聚氨酯；聚乙酸乙烯酯；聚乙烯醇；聚氯乙烯；聚氯乙烯-聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯基吡啶；罂粟籽油；钾碱；乙酸钾；钾明矾；碳酸氢钾；亚硫酸氢钾；氯化钾；柠檬酸钾；氢氧化钾；焦亚硫酸钾；磷酸氢二钾；磷酸二氢钾；钾皂；山梨酸钾；聚维酮丙烯酸酯共聚物；聚维酮水凝胶；聚维酮K17；聚维酮K25；聚维酮K29/32；聚维酮K30；聚维酮K90；聚维酮K90f；聚维酮/二十碳烯共聚物；聚维酮；Ppg-12/Smdi共聚物；Ppg-15硬脂基醚；Ppg-20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯；Ppg-26油酸盐；产品Wat；脯氨酸；Promulgen D；Promulgen G；丙烷推进剂A-46；没食子酸丙酯；碳酸丙烯酯；丙二醇；二乙酸丙二醇酯；二辛酸丙二醇酯；单月桂酸丙二醇酯；单棕榈酰硬脂酸丙二醇酯；棕榈酰硬脂酸丙二醇酯；蓖麻酸丙二醇酯；丙二醇/重氮烷基脲/对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯；对羟基苯甲酸丙酯；鱼精蛋白硫酸盐；蛋白质水解物；Pvm/Ma共聚物；季铵盐-15；季铵盐-15顺式；季铵盐-52；Ra-2397；Ra-3011；糖精；糖精钠；无水糖精钠；红花油；Sd醇3a；Sd醇40；Sd醇40-2；Sd醇40b；Sepineo P 600；丝氨酸；芝麻油；牛油树脂(Shea Butter)；硅橡胶牌医用级管；硅橡胶医用胶合剂，硅酮A型；二氧化硅，牙科；硅；二氧化硅；胶体二氧化硅；硅酮；硅酮粘合剂4102；硅酮粘合剂4502；硅酮粘合剂Bio-Psa Q7-4201；硅酮粘合剂Bio-Psa Q7-4301；硅酮乳液；硅酮/聚酯薄膜带；二甲基硅油；二甲基硅油乳液；Sipon Ls 20np；苏打粉；乙酸钠；无水乙酸钠；烷基硫酸钠；抗坏血酸钠；苯甲酸钠；碳酸氢钠；硫酸氢钠；亚硫酸氢钠；硼酸钠；十水合硼酸钠；碳酸钠；碳酸钠十水合物；碳酸钠一水合物；鲸蜡硬脂基硫酸钠；氯酸钠；氯化钠；氯化钠注射液；抑菌的氯化钠注射液；胆固醇硫酸钠；柠檬酸钠；椰油酰肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；连二亚硫酸钠；十二烷基苯磺酸钠；甲醛次硫酸钠；葡萄糖酸钠；氢氧化钠；次氯酸钠；碘化钠；乳酸钠；L-乳酸钠；月桂醇聚醚-2硫酸钠；月桂醇聚醚-3硫酸钠；月桂醇聚醚-5硫酸钠；月桂酰肌氨酸钠；月桂基硫酸钠；月桂基磺基乙酸钠；焦亚硫酸钠；硝酸钠；磷酸钠；磷酸钠二水合物；磷酸氢二钠；无水磷酸氢二钠；磷酸氢二钠二水合物；磷酸氢二钠十二水合物；磷酸氢二钠七水合物；磷酸二氢钠；无水磷酸二氢钠；磷酸二氢钠二水合物；磷酸二氢钠一水合物；聚丙烯酸钠(2500000Mw)；焦磷酸钠；吡咯烷酮羧酸钠；淀粉乙醇酸钠；琥珀酸钠六水合物；硫酸钠；无水硫酸钠；硫酸钠十水合物；亚硫酸钠；磺基琥珀酸化十一碳烯单烷基醇酰胺钠；酒石酸钠；硫代乙醇酸钠；硫代苹果酸钠；硫代硫酸钠；无水硫代硫酸钠；三偏磷酸钠；二甲苯磺酸钠；Somay 44；山梨酸；山梨聚糖；山梨糖醇异硬脂酸酯；山梨酸单月桂酸酯；山梨醇单油酸酯；山梨糖单棕榈酸酯；山梨糖醇单硬脂酸酯；山梨醇倍半油酸酯；山梨酸三油酸酯；山梨酸三硬脂酸酯；山梨糖醇；山梨糖醇溶液；大豆粉；大豆油；绿薄菏油；鲸脑油；角鲨烷；稳定的氧氯配合物；2-乙基己酸亚锡；氯化亚锡；无水氯化亚锡；氟化亚锡；酒石酸亚锡；淀粉；预胶化淀粉1500；玉米淀粉；司拉氯铵(Stearalkonium Chloride)；司拉氯铵水辉石/碳酸丙烯酯；硬脂酰胺基乙基二乙胺；硬脂醇聚醚-10；硬脂醇聚醚-100；硬脂醇聚醚-2；硬脂醇聚醚-20；硬脂醇聚醚-21；硬脂醇聚醚-40；硬脂酸；硬脂酸二乙醇酰胺；硬脂氧基三甲基硅烷；硬脂基三甲基铵水解动物胶原蛋白；硬脂醇；吸入用无菌水；苯乙烯/异戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物；二巯基琥珀酸；琥珀酸；三氯蔗糖；蔗糖；蔗糖二硬脂酸酯；蔗糖聚酯；磺乙酰胺钠；磺丁基醚β-环糊精；二氧化硫；硫酸；亚硫酸表面活性剂Qs；D-塔格糖；滑石；妥尔油；牛油甘油酯；酒石酸；Dl-酒石酸；Tenox；Tenox-2；叔丁基醇；叔丁基氢过氧化物；叔丁基氢醌；四(2-甲氧基异丁基异氰化物)铜(I)四氟硼酸酯；四丙基原硅酸盐；替曲膦(Tetrofosmin)；茶碱；硫柳汞；苏氨酸；百里酚；锡；二氧化钛；生育酚；托可索仑(Tocophersolan)；整个总肠胃外营养脂乳剂；三醋精；三辛精；三氯一氟甲烷；十三烷醇聚醚-10；三乙醇胺月桂基硫酸盐；三氟乙酸；中链甘油三酸酯；三羟基硬脂精；三羊毛脂醇聚醚-4磷酸酯；三羊毛脂醇聚醚-4磷酸酯；柠檬酸三钠二水合物；Hedta三钠；Triton 720；Triton X-200；三乙醇胺；曲金刚胺；氨丁三醇(TRIS)；色氨酸；泰洛沙泊；酪氨酸；十一碳烯酸；Union 76 Amsco-Res 6038；尿素；缬氨酸；植物油；氢化植物油甘油酯；氢化植物油；维塞胺(Versetamide)；Viscarin；纤维胶/棉；维生素E；乳化蜡；Wecobee Fs；白地蜡；白蜡；黄原胶；锌；乙酸锌；碳酸锌；氯化锌和氧化锌。
本文公开的药物组合物制剂可包含阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包含金属阳离子，例如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可包含具有金属阳离子的聚合物和络合物(参见，例如，美国专利号6,265,389和6,555,525，将所述专利通过引用以其全文并入本文)。
制剂还可以包含一种或多种药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)而对母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。
可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备溶剂化物。合适溶剂的实例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物称为“水合物”。
V.施用和给药
施用
术语“施用”和“引入”在本文可互换使用，并且是指将药物组合物递送到细胞或受试者中。在递送至受试者的情况下，药物组合物通过导致引入的细胞至少部分地定位在所需位点(诸如肝细胞)的方法或途径来递送，由此使得产生所需的作用。
在所述方法的一方面、药物组合物可以经由以下的途径施用，所述途径诸如但不限于肠内(进入肠)、胃肠道、硬脑膜外(进入硬脑膜)、口服(借助口腔)、透皮、硬膜外、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用于皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻给药(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内快速浓注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入脊髓管)、腹膜内(输注或注射至腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵体内注射(进入病理性腔)、腔内(进入阴茎基部)、阴道内给药、子宫内、羊膜外给药、透皮(通过完整皮肤扩散以便全身分布)、透粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入(鼻子吸入)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(到结膜上)、滴耳剂、经耳(在耳内或借助耳)、经颊(指向面颊)、结膜、皮肤、牙齿(到一颗或多颗牙齿上)、电渗、子宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、粘液囊内(intrabursal)、软骨内(软骨内部)、尾椎内(马尾内部)、脑池内(小脑延髓池cerebellomedularis内部)、角膜内(角膜内部)、牙冠内、冠状动脉内(冠状动脉内)、海绵体内(阴茎海绵体的可膨大间隙内部)、椎间盘内(椎间盘内部)、导管内(腺体导管内部)、十二指肠内(十二指肠内部)、硬膜内(硬膜内部或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食道)、胃内(胃内部)、齿龈内(齿龈内部)、回肠内(小肠远端部分内部)、病灶内(局部病灶内部或直接引入到局部病灶)、管腔内(管的管腔内部)、淋巴内(淋巴内部)、髓内(骨的骨髓腔内部)、脑膜内(脑膜内部)、心肌内(心肌内部)、眼内(眼内部)、卵巢内(卵巢内部)、心包内(心包膜内部)、胸膜内(胸膜内部)、前列腺内(前列腺内部)、肺内(肺或其支气管内部)、窦内(鼻窦或眶周窦内部)、椎管内(脊柱内部)、滑膜内(关节的滑膜腔内部)、腱内(腱内部)、睾丸内(睾丸内部)、鞘内(在脑脊髓轴的任何层级处的脑脊液内部)、胸腔内(胸腔内部)、小管内(器官的小管内部)、肿瘤内(肿瘤内部)、鼓室内(中耳内部)、血管内(一根或多根血管内部)、心室内(心室内部)、离子导入(借助电流、其中可溶性盐的离子迀移入身体的组织)、冲洗(浸泡或冲洗开放伤口或体腔)、喉部(直接到喉上)、鼻胃(经鼻并入胃)、封闭敷裹技术(局部施用途径、其随后由封闭所述区域的敷料覆盖)、眼科(至外眼)、口咽(直接至口腔和咽)、肠胃外、透皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸道(为了局部或全身效果、通过口腔或鼻吸入而在呼吸道内部)、眼球后(脑桥后或眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(穿过或跨过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(跨过或穿过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断性、神经阻滞、胆管灌注、心脏灌注、光分离置换和脊柱。
施用模式包括注射、输注、滴注和/或摄取。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实例中，途径是静脉内的。对于递送细胞，可以通过注射或输注进行施用。
可以全身性地施用细胞。短语“全身性施用”、“全身性地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指除了直接进入靶位点、组织或器官之外的施用，以使它反而进入受试者的循环系统并因此会经历新陈代谢和其他类似过程。
给药
术语“有效量”是指预防或减轻特定疾病和/或疾患的至少一种或多种体征或症状所需的活性成分的量，并且涉及足以提供所需效果的组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用给典型受试者时足以促进特定效果的活性成分或包含活性成分的组合物的量。有效量将还包括足以预防或延迟疾病症状发展、改变疾病症状的过程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)、或逆转疾病症状的量。应当理解，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员使用常规实验方法确定。
药物、诊断或预防组合物可以使用有效预防、治疗、控制或诊断疾病、病症和/或病状的任何量和任何施用途径施用给受试者。所需的确切量将在各个受试者之间不同，这取决于受试者的物种、年龄和一般情况、疾病的严重程度、具体组合物、其施用模式、其活性模式等。受试者可以是人、哺乳动物、或动物。组合物典型地配制为单位剂型以方便施用和实现剂量均一性。然而，应理解的是，日总剂量可以通过主治医生在正确医学判断的范围内进行决定。用于任何特定个体的具体治疗有效、预防有效或适当诊断的剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用具体有效载荷的活性；所用具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间和施用途径；治疗的持续时间；与活性成分组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。
在某些实施方案中，药物组合物可以下述剂量水平施用，所述剂量水平足以每天、一天一次或多次递送约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约0.05mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、或从约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重，以获得所希望的治疗、诊断或预防效果。
组合物的所希望剂量可以仅一次、一天三次、一天两次、一天一次、隔一天一次、每三天一次、一周一次、两周一次、三周一次或四周一次地递送。在某些实施方案中，所希望的剂量可以使用多次施用进行递送(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)。当采用多次施用时，可以使用分次的给药方案，诸如本文所述的那些。如本文所用，“分次剂量”是将“单一单位剂量”或总日剂量分成两个或多个剂量，例如两次或多次施用“单一单位剂量”。如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/一次/单一途径/单一接触点，即单次施用事件施用的任何治疗剂的剂量。
本文描述了用于扰乱基因组信号传导中心(GSC)或整个基因信号传导网络(GSN)以治疗遗传疾病(诸如纤连蛋白肾小球病、遗传性粪卟啉病等)的组合物和方法。本公开的一个或多个实施方案的细节在下文的随附描述中进行阐述。尽管在本公开的实施或测试中可以使用任何相似于或等效于本文所述那些的材料和方法，但现在描述优选的材料和方法。本公开的其他特征、目标和优点将根据所述描述显而易知。在描述中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本发明的描述为准。
由以下非限制性实施例进一步说明本公开。
VII.实施例
实施例1.实验程序
A.人肝细胞培养
人肝细胞获自Massachusetts General Hospital的两种供体，即MGH54和MGH63，以及一种来自Lonza的供体，即HUM4111B。将冷冻保存的肝细胞在平板培养基中培养16小时，转移到维持培养基持续4小时。在无血清培养基上培养2小时，然后添加化合物。在基因表达分析之前，将肝细胞在无血清培养基上维持16小时。将原代人肝细胞储存在液氮冷冻机的气相中(约-130℃)。
为了接种原代人肝细胞，从LN2冷冻机中取出细胞的小瓶，在37℃水浴中解冻，并且轻轻旋转直到只剩下少量冰。使用10ml血清吸管，将细胞轻轻吸移出小瓶，并且沿着含有20mL冷解冻培养基的50mL锥形管的侧面向下轻轻吸移。用约1mL的解冻培养基冲洗小瓶，并将冲洗液添加到锥形管。一管20mL解冻培养基中最多可添加2小瓶。
将锥形管轻轻翻转2-3次，并在减少制动的情况下(例如，9次中有4次)在4℃下以100g的速度离心10分钟。缓慢吸出解冻的培养基以避免沉淀物。沿着侧面缓慢向下添加4mL冷铺板培养基(如果将2个小瓶合并到1个管中则为8mL)，并且将小瓶轻轻翻转几次以重悬细胞。
将细胞保持在冰上，直到将100μl充分混合的细胞添加到400μl稀释的台盼蓝中并且通过轻轻翻转进行混合。使用血细胞计数器(或Cellometer)对它们进行计数，并记录生活力和活细胞/mL。将细胞稀释至所需浓度并且接种在I型胶原蛋白包被的板上。将细胞缓慢且轻轻地吸移到板上，一次仅1-2个孔。将剩余的细胞频繁地通过轻轻翻转而在管中混合。将细胞以每板约8.5x106个细胞接种在6mL冷铺板培养基(10cm)中。可替代地，对于6孔板，将细胞以每孔约1.5x106个(1mL培养基/孔)接种；对于12孔板，每孔7x105个(0.5mL/孔)；或对于24孔板，每孔3.75x105个(0.5mL/孔)
在将所有细胞和培养基添加到板中后，将板转移到培养箱(37℃，5％CO2，约90％湿度)，并且前后、然后左右摇动数次以使细胞均匀地分布于板或孔。在铺板后的前一小时，将板每15分钟再次摇动一次。接种后约4个小时(如果晚上接种细胞，则为早晨的第一件事)，将细胞用PBS洗涤一次并且添加完全的维持培养基。将原代人肝细胞维持在维持培养基中并且每天转移到新鲜培养基。
B.对人肝细胞的饥饿和化合物处理
将如上所述培养的人肝细胞以24孔形式铺板，每孔在500ul铺板培养基的体积中添加375,000个细胞。处理前四小时，将细胞用PBS洗涤，并且将培养基更换为：新鲜维持培养基(完全)或改良型维持培养基。
以1000x终浓度制备化合物储备液，并且将其以2步稀释法添加到培养基中，以降低添加到细胞中时化合物从溶液中沉淀出来的风险并确保合理的吸移体积。每次一种，将每种化合物首先在温热(约37℃)改良型维持培养基中稀释10倍(初始稀释度＝ID)，通过涡旋混合，并且将ID 100倍稀释至细胞培养物中(例如将5.1μl稀释到含有0.5mL培养基的24孔板的1个孔中)。通过小心旋转将板混合，并且然后将所有孔处理并返回到培养箱过夜。如果需要，将单独的板/孔用单独媒介物对照和/或阳性对照处理。如果使用多孔板，则每个板上均包括对照。约18小时后，收获细胞以进行进一步分析，例如ChIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq等。
C.小鼠肝细胞培养和化合物处理
雌性C57BL/6小鼠肝细胞(F005152-冷冻保存的)作为45个供体的汇集物购自BioreclamationIVT。将细胞在胶原蛋白包被的24孔板上的InvitroGRO CP啮齿动物培养基(Z990028)和Torpedo啮齿动物抗生素混合物(Z99027)中在0.5mL培养基中以200K个细胞/孔铺板24小时。将10mM DMSO中的化合物储备液稀释至10uM(终浓度为1％DMSO)，并且以生物学一式三份应用于细胞。20小时后除去培养基，并且处理细胞以用于进一步分析，例如qRT-PCR。
D.培养基组成
解冻培养基含有6mL等渗的percoll和14mL高葡萄糖DMEM(Invitrogen#11965或类似产品)。铺板培养基含有100mL Williams E培养基(Invitrogen#A1217601，无酚红)和来自ThermoFisher铺板培养基的补充物包#CM3000，所述补充物包含有5mL FBS、10μl地塞米松和3.6mL铺板/维护混合物。将台盼蓝储备液(0.4％，Invitrogen#15250)在PBS中进行1:5稀释。将Normocin以1:500添加到解冻培养基和铺板培养基中。
ThermoFisher完全维持培养基含有补充物包#CM4000(1μl地塞米松和4mL维持混合物)和100mL Williams E(Invitrogen#A1217601，无酚红)。
改良型维持培养基没有刺激因子(地塞米松、胰岛素等)，并且含有100mLWilliams E(Invitrogen#A1217601，无酚红)、至2mM的1mL L-谷氨酰胺(Sigma#G7513)、至15mM的1.5mL HEPES(VWR#J848)，和至终浓度各为50U/mL的0.5mL青霉素/链霉素(Invitrogen#15140)。
E.DNA纯化
DNA纯化如Ji等人,PNAS 112(12):3841-3846(2015)支持信息中所述那样进行，将所述文献据此通过引用以其全文并入。将一毫升的2.5M甘氨酸添加到每个固定细胞板中，并且孵育5分钟以淬灭甲醛。将细胞用PBS洗涤两次。将细胞在4℃下以1,300g沉淀5分钟。然后，在每个管中收集4×107个细胞。用1mL含蛋白酶抑制剂的冰冷Nonidet P-40裂解缓冲液在冰上轻轻裂解细胞5分钟(在下文提供缓冲液配方)。将细胞裂解液分层置于2.5体积的蔗糖垫上，所述蔗糖垫由Nonidet P-40裂解缓冲液中的24％(重量/体积)蔗糖组成。将该样品在4℃下以18,000g离心10分钟以分离细胞核沉淀物(上清液代表细胞质级分)。将细胞核沉淀物用PBS/1mM EDTA洗涤一次。用0.5mL甘油缓冲液轻轻重悬细胞核沉淀物，然后在冰上与等体积的细胞核裂解缓冲液孵育2分钟。将样品在4℃下以16,000g离心2分钟以分离染色质沉淀物(上清液代表核可溶性级分)。将染色质沉淀物用PBS/1 mM EDTA洗涤两次。将染色质沉淀物储存在-80℃下。
Nonidet P-40裂解缓冲液含有10mM Tris·HCl(pH 7.5)、150mM NaCl和0.05％Nonidet P-40。甘油缓冲液含有20mM Tris·HCl(pH 7.9)、75mM NaCl、0.5mM EDTA、0.85mMDTT和50％(体积/体积)甘油。细胞核裂解缓冲液含有10mM Hepes(pH 7.6)、1mM DTT、7.5mMMgCl2、0.2mM EDTA、0.3M NaCl、1M尿素和1％Nonidet P-40。
F.染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)
使用以下方案对原代肝细胞和HepG2细胞进行ChIP-seq，以确定组成并确认信号传导中心的位置。
i.细胞交联
对于ChIP-seq的每次运行，使用2x 107个细胞。将2ml新鲜的11％甲醛(FA)溶液添加到15cm板上的20ml培养基，以达到1.1％的最终浓度。将板短暂旋转并在室温(RT)下孵育15分钟。在孵育结束时，通过向板中添加1ml 2.5M甘氨酸并在RT下孵育5分钟来淬灭FA。将培养基丢弃到1L烧杯中，并且用20ml冰冷的PBS洗涤细胞两次。将PBS(10ml)添加到板中，并且从板上刮下细胞。将细胞转移到15ml锥形管中，并且将管置于冰上。用另外的4ml PBS洗涤板，并且与在15ml管中的细胞合并。将管在台式离心机中在4℃下以1,500rpm离心5分钟。吸去PBS，并且将细胞在液氮中快速冷冻。将沉淀物储存在-80℃下直至准备使用。
ii.预封闭磁珠
将30μl蛋白质G珠粒(每个反应)添加到1.5ml蛋白质LoBind Eppendorf管中。通过在RT下磁分离30秒来收集珠粒。通过以下方式用1ml封闭溶液洗涤珠粒3次：将珠粒在4℃下在旋转器上孵育10分钟并且用磁体收集珠粒。将5μg抗体添加到250μl封闭溶液中的珠粒中。将混合物转移到干净管中，并且在4℃下旋转过夜。第二天，除去含有抗体的缓冲液，并且通过以下方式用1.1ml封闭溶液洗涤珠粒3次：将珠粒在4℃下在旋转器上孵育10分钟并且用磁体收集珠粒。将珠粒重悬于50μl的封闭溶液中并且保持在冰上直至准备使用。
iii.细胞裂解、基因组片段化和染色质免疫沉淀
在使用前，将
Figure BDA0002716199420000791
蛋白酶抑制剂混合物添加到裂解缓冲液1(LB1)中。将一粒片剂溶解于1ml H2O中，得到50x溶液。将混合物以等份式样储存在-20℃下。将细胞重悬于每个管中的8ml LB1中，并且在4℃下在旋转器上孵育10分钟。将细胞核在4℃下以1,350g旋转沉降5分钟。吸去LB1，并且将细胞重悬于每个管中的8ml LB2中，并且在4℃下在旋转器上孵育10分钟。
根据制造商对高细胞数的建议，对
Figure BDA0002716199420000792
E220EVOLUTIONTM超声仪进行编程。将HepG2细胞超声处理12分钟，并且将原代肝细胞样品超声处理10分钟。将裂解液转移到干净的1.5ml Eppendorf管中，并且将管在4℃下以20,000g离心10分钟以沉淀出碎片。将上清液转移到2ml蛋白质LoBind Eppendorf管中，所述管中含有带有预结合抗体的预封闭的蛋白G珠粒。将50μl上清液保存为input。将Input物质保持在-80℃下直至准备使用。将管与珠粒在4℃下旋转过夜。
iv.洗涤、洗脱和交联逆转
通过在4℃下旋转管5分钟来进行所有洗涤步骤。在每个洗涤步骤中，将珠粒转移到干净的蛋白质LoBind Eppendorf管中。使用磁体将珠粒收集在1.5ml Eppendorf管中。将珠粒用1.1ml超声缓冲液洗涤两次。使用磁力架收集磁珠。用1.1ml的洗涤缓冲液2将珠粒洗涤两次，并且再次使用磁力架收集磁珠。将珠粒用1.1ml的洗涤缓冲液3洗涤两次。除去所有残余的洗涤缓冲液3，并且用1.1ml TE+0.2％Triton X-100缓冲液洗涤珠粒一次。除去残余的TE+0.2％Triton X-100缓冲液，并且用TE缓冲液洗涤珠粒两次，每次30秒。除去残余的TE缓冲液，并且将珠粒重悬于300μl ChIP洗脱缓冲液中。将250μl ChIP洗脱缓冲液添加到50μl input中，并且将具有珠粒的管在65℃下旋转1小时。将Input样品在65℃烘箱中孵育过夜而不旋转。将具有珠粒的管置于磁体上，并且将洗脱液转移到新鲜的DNA LoBindEppendorf管中。将洗脱液在65℃烘箱中孵育过夜而不旋转
v.染色质提取和沉淀
将Input和免疫沉淀物(IP)样品转移到新鲜管中，并且将300μl TE缓冲液添加到IP和珠粒中以稀释SDS。将RNA酶A(20mg/ml)添加到管中，并且将管在37℃下孵育30分钟。孵育后，添加3μl 1M CaCl2和7μl 20mg/ml蛋白酶K，并且在55℃下孵育1.5小时。通过在RT下以全速离心30秒来制备MaXtract高密度2ml凝胶管(Qiagen)。将600μl苯酚/氯仿/异戊醇添加到每个蛋白酶K反应中，并且以约1.2ml混合物转移到MaXtract管中。将管在RT下以16,000g旋转5分钟。将水相转移到两个干净的DNA LoBind管中(每个管中300μl)，并且添加1.5μl糖原、30μl 3M乙酸钠和900μl乙醇。将混合物在-20℃下沉淀过夜，或在-80℃下沉淀1小时，并且在4℃下以最大速度旋转沉降20分钟。除去乙醇，并且通过在4℃下以最大速度将管旋转沉降5分钟，用1ml的75％乙醇洗涤沉淀物。除去乙醇残余物，并且将沉淀物在RT下干燥5min。向每种免疫沉淀物(IP)和input沉淀物中添加25μl H2O，静置5分钟，并短暂涡旋。将来自两个管中的DNA合并以对于每个样品获得50μl的IP和50μl的input DNA。将1μl这种DNA用于使用Qubit dsDNA HS测定(ThermoFisher，#Q32854)来测量下拉DNA的量。免疫沉淀物质的总量范围为从几ng(对于TF)到几百ng(对于染色质修饰)。使用qRT-PCR分析6μl DNA，以确定其富集度。如果需要，将DNA稀释。如果富集令人满意，则将其余部分用于供DNA测序的文库制备。
vi.供DNA测序的文库制备
使用用于Illumina的NEBNext Ultra II DNA库制备试剂盒(NEB，#E7645)、使用用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸(NEB，#6609S)根据制造商的说明书在伴有以下修改的情况下制备文库。在方案的末端修复部分之前，将用于文库制备的剩余ChIP样品(约43μl)和1μg input样品的体积调至50μl。在带有加热盖的PCR机中，在用粘合板密封件(ThermoFisher，#AB0558)密封(从而在不同样品之间留下至少一个孔)的96孔半裙边PCR板(ThermoFisher，#AB1400)中进行末端修复反应。将未稀释的衔接子用于input样品，将1:10稀释的衔接子用于5-100ng的ChIP物质，并且将1:25稀释的衔接子用于小于5ng的ChIP物质。使连接反应在加热盖关闭的情况下在PCR机中进行。将衔接子连接的DNA转移到干净的DNA LoBind Eppendorf管中，并且使用H2O将体积调整为96.5μl。
使用SPRIselect磁珠(Beckman Coulter，#B23317)选择200-600bp ChIP片段。将30μl珠粒添加到96.5μl的ChIP样品中，以结合长于600bp的片段。将较短的片段转移到新鲜的DNA LoBind Eppendorf管中。添加15μl珠粒以结合长于200bp的DNA，并且使用新鲜制备的75％乙醇用DNA洗涤珠粒两次。使用17μl的0.1X TE缓冲液洗脱DNA。收集到约15μl。
将3μl经大小选择的Input样品和所有(15μl)ChIP样品用于PCR。使用Qubit dsDNAHS测定测量经大小选择的DNA的量。对于Input样品和ChIP样品，在约5-10ng经大小选择的DNA的情况下运行7个循环的PCR，并且在经大小选择的DNA少于5ng的情况下运行12个循环的PCR。根据制造商的说明书，用22.5μl AMPure XP珠粒(Beckman Coulter，#A63880)纯化一半的PCR产物(25μl)。用17μl的0.1X TE缓冲液洗脱PCR产物，并且使用Qubit dsDNA HS测定测量PCT产物的量。对于第二半样品，在PCR产物少于5ng的情况下再运行4个PCR循环，使用22.5μl的AMPure XP珠粒纯化DNA。测量浓度以确定产量是否增加。将两半合并，并且使用H2O将体积调至50μl。
使用在17μl 0.1X TE中的45μl AMPure XP珠粒运行第二轮DNA纯化，并且使用Qubit dsDNA HS测定测量最终产量。该方案产生20ng至1mg的PCR产物。通过用H2O稀释1μl各样品(如果需要)、基于制造商的建议使用高灵敏度生物分析仪DNA试剂盒(Agilent，#5067-4626)来验证文库的质量。
vii.试剂
11％甲醛溶液(50mL)含有14.9ml 37％甲醛(终浓度为11％)、1ml 5M NaCl(终浓度为0.1M)、100μl 0.5M EDTA(pH 8)(终浓度为1mM)、50μl 0.5M EGTA(pH 8)(终浓度为0.5mM)和2.5ml 1M Hepes(pH 7.5)(终浓度为50mM)。
封闭溶液含有在PBS中的0.5％BSA(w/v)和在100ml PBS中的500mg BSA。封闭溶液可以在使用前长达约4天制备。
裂解缓冲液1(LB1)(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；14ml 5M NaCl；1ml0.5M EDTA，pH 8.0；50ml 100％甘油溶液；25ml 10％NP-40；和12.5ml 10％Triton X-100。将pH值调节至7.5。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
裂解缓冲液2(LB2)(1000ml)含有10ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；40ml5M NaCl；2ml0.5M EDTA，pH 8.0；和2ml 0.5M EGTA，pH 8.0。将pH值调节至8.0。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
超声处理缓冲液(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；14ml 5M NaCl；1ml0.5M EDTA，pH 8.0；50ml 10％Triton X-100；10ml 5％脱氧胆酸钠；和5ml 10％SDS。将pH值调节至7.5。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
在LB1、LB2和超声处理缓冲液中包含蛋白酶抑制剂。
洗涤缓冲液2(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；35ml 5M NaCl；1ml 0.5MEDTA，pH 8.0；50ml 10％Triton X-100；10ml 5％脱氧胆酸钠；和5ml 10％SDS。将pH值调节至7.5。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
洗涤缓冲液3(500ml)含有10ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；1ml 0.5M EDTA，pH 8.0；125ml 1M LiCl溶液；25ml 10％NP-40；和50ml 5％脱氧胆酸钠。将pH值调节至8.0。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
ChIP洗脱缓冲液(500ml)含有25ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；10ml 0.5M EDTA，pH8.0；50ml 10％SDS；和415ml ddH2O。将pH值调节至7.5。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
G.ChIP-seq结果的分析
使用trim_galore 0.4.4和默认选项，对来自每个样品的所有通过过滤器读段进行测序适配器的修整。使用bwa版本0.7.15(Li(2013)arXiv:1303.39 97v1)用缺省参数，将经修整的读段相对于人基因组(与hs38d1/GCA_0007 86075.2合并的组装GRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析集)进行作图。使用picard 2.9.0(http://broadinstitute.hithub.io/picard)评估对齐的读段副本，并丢弃MAPQ<20或匹配标准SAM标志0x1804的读段。将标准QC应用(读段完整性、映射统计、文库复杂性、片段偏差)于去除不满意的样品。通过使用MACS2版本2.1.0将样品与全细胞提取物对照进行比较来鉴定富集的ChIP-seq峰(Zhang等人,Genome Biol.(2008)9(9):R137)，其中选择显著峰作为经调整p值<0.01的峰。丢弃与已知重复“黑名单”区域(ENCODE联合体，Nature(2012)489(7414:57-74)重叠的峰。还通过读取深度归一化ChIP-seq信号，并使用UCSC浏览器可视化。
H.RNA-seq
该方案是以下方案的修改版本：MagMAX mirVana总RNA分离试剂盒用户指南(Applied Biosystems#MAN0011131 Rev B.0)，NEBNext多聚(A)mRNA磁性分离模块(E7490)和用于Illumina的NEBNext Ultra方向性RNA文库制备试剂盒(E7420)(New EnglandBiosystems#E74901)。
使用MagMAX mirVana试剂盒说明书(第14-17页上标题为“从细胞中分离RNA”部分)从培养物中的细胞中分离总RNA。含有粘附细胞的多孔板(通常为24孔板)的每个孔使用200μl裂解结合混合物。
对于mRNA分离和文库制备，使用NEBNext多聚(A)mRNA磁性分离模块和方向性制备试剂盒。对从上述细胞中分离的RNA进行定量，并且以500μg每个样品在50μl无核酸酶的水中进行制备。该方案可以在微量离心管或96孔板中运行。
新鲜制备80％乙醇，并且所有洗脱均在0.1X TE缓冲液中进行。对于需要AmpureXP珠粒的步骤，在使用前将珠粒置于室温。首先测量样品体积并吸移珠粒。对于用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸(#E6609)，使用1.9B部分(不是1.9A部分)。在开始PCR富集之前，使用Qubit(DNA高灵敏度试剂盒，ThermoFisher#Q32854)对cDNA进行定量。将PCR反应运行12个循环。
在纯化PCR反应(步骤1.10)之后，使用Qubit DNA高灵敏度试剂盒对文库进行定量。将1μl各样品稀释至1-2ng/μl以在生物分析仪(DNA高灵敏度试剂盒，Agilent#5067-4626)上运行。如果生物分析仪峰不干净(一个窄峰在300bp附近)，则使用0.9X或1.0X的珠粒:样品比率重复AMPure XP珠粒清除步骤。然后，将样品再次用Qubit定量，并且再次在生物分析仪(1-2ng/μl)上运行。
将来自INTACT纯化的细胞核或整个新皮层细胞核的核RNA转化成cDNA，并用NugenOvation RNA-seq系统V2扩增。使用Illumina HiSeq 2500对文库进行测序。
I.RNA-seq数据分析
使用两个通过作图经由STAR版本2.5.3a(对齐参数alignIntronMin＝20；alignIntronMax＝1000000；outFilterMismatchNmax＝999；outFilterMismatchNoverLmax＝0.05；outFilterType＝BySJout；outFilterMultimapNmax＝20；alignSJoverhangMin＝8；alignSJDBoverhangMin＝1；alignMatesGapMax＝1000000)将来自每个样品的所有通过过滤器读段相对于人基因组(与hs38d1/GCA_000786075.2合并的组装GRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析集)进行作图(Dobin等人,Bioinformatics(2012)29(1):15-21)。基于来自人GENCODE基因集发布24的参考转录注释，将基因组对齐转换为转录组对齐(Harrow等人,Genome Res.(2012)22(9):1760-1774)。使用独特的和多标记的转录组对齐，使用RSEM版本1.3.0(Li和Dewey,BMC Bioinformatics(2011)12:323)以链感知的方式计算基因水平丰度估计值，并包括置信区间抽样计算，以从基础Bayesian模型得出丰度的后验均值估计值(PME)(计数和归一化FPKM-每百万个作图片段的外显子每千碱基片段)。将标准QC应用(读段完整性、映射统计、文库复杂性、片段偏差)于去除不满意的样品。使用由DESeq2版本1.16.1实现的负二项式模型计算差异基因表达(Love等人,Genome Biol.(2014)15(12):550)。使用PME计数数据(具有显式建模的复制与泛实验对照)、中值比归一化，使用最大似然估计而不是最大后验来计算Log2倍数变化和显著性值，并在确定可接受的经调整p值时禁止使用Cook的距离截止值。显著差异的基因被指定为经调整p值<0.01，log2倍数变化>＝1或<＝-1，以及至少一个复制PME FPKM>＝1的那些基因。还通过读取深度归一化RNA-seq信号，并使用UCSC浏览器可视化。
J.ATAC-seq
将肝细胞接种过夜，然后除去血清和其他因素。2-3小时后，将细胞用化合物处理并孵育过夜。收获细胞并且制备细胞核以进行转座反应。使用Tn5转座酶转座50,000个珠粒结合的细胞核(Illumina FC-121-1030)，如Mo等人,2015,Neuron 86,1369-1384中所述，将所述文献据此通过引用以其全文并入。在PCR扩增9-12个循环后，将文库在Illumina HiSeq2000上测序。使用条形编码引物进行PCR，其中在72℃下延伸5分钟，PCR，然后对最终的PCR产物进行测序。
使用trim_galore 0.4.1修整从每个样品获得的所有读段，要求Phred分数≥20并且读段长度≥30以便数据分析。使用Bowtie2(2.2.9版)用参数-t-q-N1-L 25-X 2000no-mixed no-discordant将经修整的读段相对于人基因组(hg19构建)进行作图。除去所有未作图的读段、非唯一作图的读段和PCR重复。使用MACS2用参数--nolambda–nomodel-q0.01--SPMR调用所有ATAC-seq峰。将ATAC-seq信号在UCSC基因组浏览器中可视化。将远离注释的启动子(组合的RefSeq、Ensemble和UCSC已知基因数据库)至少2kb的ATAC-seq峰选择为远侧ATAC-seq峰。
K.qRT-PCR
qRT-PCR如North等人,PNAS,107(40)17315-17320(2010)中所述那样进行，将所述文献据此通过引用以其全文并入。在进行qRT-PCR分析之前，除去细胞培养基并用RLT缓冲液替换以进行RNA提取(Qiagen RNeasy 96 QIAcube HT试剂盒目录号74171)。处理细胞以使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen目录号74182)提取RNA。对于Taqman qPCR分析，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific目录号：4368813或4368814)根据制造商的说明书合成cDNA。使用来自BioRad的iQ5多色rtPCR检测系统对cDNA进行qRT-PCR，伴有60℃退火。使用来自ThermoFisher的Taqman探针扩增样品。
对如通过qRT-PCR测量的表达倍数变化的分析使用以下技术进行。对照是DMSO，并且处理是经选择的化合物(CPD)。内部对照是GAPDH或B-肌动蛋白(或另有说明)，并且目的基因是靶标。首先，计算以下4种条件的平均值以进行标准化：DMSO:GAPDH、DMSO:靶标、CPD:GAPDH和CPD:靶标。接下来，使用(DMSO:靶标)-(DMSO:GAPDH)＝ΔCT对照和(CPD:靶标)-(CPD:GAPDH)＝ΔCT实验计算对照和治疗两者的ΔCT以相对于内部对照(GAPDH)标准化。然后，通过ΔCT实验-ΔCT对照来计算ΔΔCT。通过2-(ΔΔCT)计算表达倍数变化(RQ)(通过本文提供的RNA-Seq结果示出2倍表达变化)。
在一些实施例中，还报告了RQ Min和RQ Max值。RQ Min和RQ Max分别是测试样品中基因表达的最小相对水平和最大相对水平。使用分析设置中设置的置信水平来计算它们，并且将置信水平设置为一个标准偏差(SD)。这些值使用标准偏差计算如下：RQ Min＝2-(ΔΔCT-SD)；并且RQ Max＝2-(ΔΔCT+SD)。
L.通过配对末端标签测序进行的染色质相互作用分析(ChIA-PET)
ChIA-PET如以下文献中所述那样进行：Chepelev等人(2012)Cell Res.22,490-503；Fullwood等人(2009)Nature 462,58-64；Goh等人(2012)J.Vis.Exp.,http://dx.doi.org/10.3791/3770；Li等人(2012)Cell 148,84-98；和Dowen等人(2014)Cell 159,374-387，将所述文献各自据此通过引用以其全文并入。简而言之，将胚胎干(ES)细胞(最多至1x108个细胞)在室温下用1％甲醛处理20分钟，并且然后使用0.2M甘氨酸中和。将交联的染色质通过超声处理片段化成300-700bp的大小长度。将抗SMC1抗体(Bethyl，A300-055A)用于富集SMC1结合的染色质片段。从抗体包被的珠粒上洗脱一部分ChIP DNA，以进行浓度定量和使用定量PCR进行富集分析。对于ChIA-PET文库构建，使用T4 DNA聚合酶(NEB)对ChIP DNA片段进行末端修复。将ChIP DNA片段分为两个等份试样，并且将接头A或接头B连接到片段末端。这两个接头的区别在于用作核苷酸条形码的两个核苷酸(接头A具有CG；接头B具有AT)。在接头连接后，将两个样品合并，并且通过在20ml体积中稀释以最小化不同DNA-蛋白质复合物之间的连接来准备进行邻位连接。用T4 DNA连接酶(Fermentas)进行邻位连接反应，并且在22℃下在不摇动的情况下孵育20小时。在邻位连接期间，具有相同接头序列的DNA片段被连接在相同的染色质复合物中，这产生具有同二聚体接头组成的连接产物。然而，在来自不同染色质复合物的DNA片段之间也可能发生嵌合连接，从而产生具有异二聚体接头组成的连接产物。将这些异二聚体接头产物用于评估非特异性连接的频率，并且然后将其除去。
i.第1天
如对于ChIP所述，使细胞交联。将冷冻的细胞沉淀物储存在-80℃冷冻机中，直至准备使用。该方案需要在6个15ml Falcon管中冷冻的至少3x108个细胞(每管5000万个细胞)。将6种100μl蛋白G Dynabeads(针对每个ChIA-PET样品)添加到在冰上的6个1.5mlEppendorf管中。将珠粒用1.5ml封闭溶液洗涤3次，并且在每个洗涤步骤之间于4℃下颠倒孵育10分钟，以实现有效封闭。将蛋白G Dynabeads重悬于6个管中的每一个中的250μl封闭溶液中，并且将10μg SMC1抗体(Bethyl A300-055A)添加到每个管中。将珠粒-抗体混合物在4℃下颠倒孵育过夜。
ii.第2天
将珠粒用1.5ml封闭溶液洗涤3次以除去未结合的IgG，并且在4℃下颠倒孵育，每次10分钟。将Smc1结合的珠粒重悬于100μl的封闭溶液中并且储存在4℃下。通过向裂解缓冲液1(LB1)(1:50)中添加50x蛋白酶抑制剂混合物溶液来制备最终裂解缓冲液1(每个样品8ml)。将8ml的最终裂解缓冲液1添加到每个冷冻细胞沉淀物中(每个样品8毫升x 6)。通过上下吸移将细胞彻底重悬并在冰上解冻。将细胞悬液在4℃下再次颠倒孵育10分钟。将悬浮液以1,350g在4℃下离心5分钟。同时，通过向裂解缓冲液2(LB2)(1:50)中添加50x蛋白酶抑制剂混合物溶液来制备最终裂解缓冲液2(每个样品8ml)
离心后，弃去上清液，并且通过上下吸移将细胞核彻底重悬于8ml最终裂解缓冲液2中。将细胞悬液在4℃下颠倒孵育10分钟。将悬浮液以1,350g在4℃下离心5分钟。在孵育和离心过程中，通过向超声处理缓冲液(1:50)中添加50x蛋白酶抑制剂混合物溶液来制备最终的超声处理缓冲液(每个样品15ml)。弃去上清液，并且通过上下吸移将细胞核充分重悬于15ml最终超声处理缓冲液中。将核提取物提取到在冰上的15个1ml Covaris EvolutionE220超声处理管中。用10μl等分试样检查凝胶上未超声处理的染色质的大小。
根据制造商的说明书对Covaris超声波仪进行编程(每2000万个细胞12分钟＝12x15＝3小时)。如上所述将样品依序测序。目标是将染色质DNA断裂成200-600bp。如果超声处理片段太大，则假阳性变得更加频繁。将超声处理的核提取物分配到1.5ml Eppendorf管中。将1.5ml样品在4℃下全速离心10分钟。将上清液(SNE)汇集到新的预冷却的50mlFalcon管中，并且用超声处理缓冲液调至18ml的体积。取两管的50μl作为input并检查片段的大小。添加250μl ChIP洗脱缓冲液，并且在烘箱中在65℃下发生逆转交联过夜在交联逆转后，在凝胶上测定超声处理片段的大小。
在6个干净的15ml Falcon管中的每一个中，将3ml超声提取物添加到100μl带有SMC1抗体的蛋白G珠粒中。将含有SNE-珠粒混合物的管在4℃下颠倒孵育过夜(14至18小时)
iii.第3天
将SNE-珠粒混合物的一半体积(1.5ml)添加到6个预冷管中的每一个中，并且使用磁体除去SNE。将管如下进行依序洗涤：1)添加1.5ml超声处理缓冲液，将珠粒重悬并在4℃下旋转5分钟以进行结合，然后除去液体(步骤进行两次)；2)添加1.5ml高盐超声处理缓冲液，并且将珠粒重悬并在4℃下旋转5分钟以进行结合，然后除去液体(步骤进行两次)；3)添加1.5ml高盐超声处理缓冲液，并且将珠粒重悬并在4℃下旋转5分钟以进行结合，然后除去液体(步骤进行两次)；4)添加1.5ml LiCl缓冲液，并且将细胞重悬并颠倒孵育5分钟以进行结合，然后除去液体(步骤进行两次)；5)使用1.5ml 1X TE+0.2％Triton X-100洗涤细胞持续5分钟以进行结合，然后除去液体；以及用1.5ml冰冷的TE缓冲液洗涤细胞持续30秒以进行结合，然后除去液体(步骤进行两次)。将来自所有6个管中的珠粒依序重悬于一个1,000ul管中的1X冰冷的TE缓冲液中的珠粒中。
使用以下方案定量ChIP-DNA。使用磁体将10％的珠粒(按体积计)或100μl转移到新的1.5ml管中。将珠粒重悬于300μl ChIP洗脱缓冲液中，并且将具有珠粒的管在65℃下旋转1小时。将具有珠粒的管置于磁体上，并且将洗脱液转移到新鲜的DNA LoBind Eppendorf管中。将洗脱液在65℃烘箱中孵育过夜而不旋转。将免疫沉淀的样品转移到新的管中，并且将300μl TE缓冲液添加到免疫沉淀物和Input样品中以进行稀释。添加5μl的RNA酶A(20mg/ml)，并且将管在37℃下孵育30分钟。
孵育后，将3μl 1M CaCl2和7μl 20mg/ml蛋白酶K添加到管中，并且在55℃下孵育1.5小时。通过在RT下以全速离心它们30秒来制备MaXtract高密度2ml凝胶管(Qiagen)。向每个蛋白酶K反应中添加600μl苯酚/氯仿/异戊醇。将约1.2ml的混合物转移到MaXtract管中。将管在RT下以16,000g旋转5分钟。将水相转移到两个干净的DNA LoBind管中(每个管中300μl)，并且添加1μl糖原、30μl 3M乙酸钠和900μl乙醇。使混合物在-20℃下沉淀过夜或在-80℃下沉淀1小时。
将混合物在4℃下以最大速度旋转沉降20分钟，除去乙醇，并且通过将管在4℃下以最大速度旋转沉降5分钟，用1ml的75％乙醇洗涤沉淀物。除去所有的乙醇残余物，并且将沉淀物在RT下干燥5分钟。将H2O添加到每个管中。将每个管静置5分钟，并短暂涡旋。将来自两个管的DNA合并以获得50μl IP和100μl Input DNA。
使用Qubit(Invitrogen#Q32856)通过ChIP对收集的DNA量进行定量。将1μl嵌入染料与每个1μl测量样品组合。使用了随附试剂盒的两种标准。仅测量了来自10％珠粒的DNA。在900μl珠粒悬浮液中获得了约400ng的染色质，并在增强子和启动子上具有良好的富集性，如通过qPCR测量的。
iv.第3或4天
使用以下方案在珠粒上进行ChIP-DNA的末端钝化。通过吸移将剩余的染色质/珠粒分开，并且将450μl的珠粒悬浮液等分到2个管中。将珠粒收集在磁体上。除去上清液，并且然后将珠粒重悬于以下反应混合物中：70μl 10X NEB缓冲液2.1(NEB，M0203L)、7μl 10mMdNTP、615.8μl dH20和7.2μl 3U/μl T4 DNA聚合酶(NEB，M0203L)。将珠粒在37℃下在旋转下孵育40分钟。用磁体收集珠粒，然后将珠粒用1ml冰冷的ChIA-PET洗涤缓冲液洗涤3次(每次洗涤30秒)。
通过制备如下所述的Klenow(3′至5′外切-)主混合物来进行珠粒上加A尾：70μl10X NEB缓冲液2、7μl 10mM dATP、616μl dH20和7μl 3U/μl Klenow(3′至5′外切-)(NEB，M0212L)。将混合物在37℃下在旋转下孵育50分钟。用磁体收集珠粒，然后将珠粒用1ml冰冷的ChIA-PET洗涤缓冲液洗涤3次(每次洗涤30秒)。
将接头在冰上轻轻解冻。通过吸移将接头与水充分混合，然后与PEG缓冲液充分混合，然后轻轻涡旋。然后，每个管添加1394μl主混合物和6μl连接酶并且通过翻转混合。将石蜡膜放在管上，并且将管在16℃下在旋转下孵育过夜(至少16小时)。通过建立以下反应混合物并按顺序添加试剂，将生物素化的接头与珠粒上的ChIP-DNA连接：1110μl dH20、4μl200ng/μl生物素化的桥连接物、280μl具有PEG的5X T4 DNA连接酶缓冲液(Invitrogen)和6μl 30U/μl T4 DNA连接酶(Fermentas)。
v.第5天
使用以下方案进行核酸外切酶λ/核酸外切酶I珠上消化。用磁体收集珠粒并且将其用1ml冰冷的ChIA-PET洗涤缓冲液洗涤3次(每次洗涤30秒)。将洗涤缓冲液从珠粒上除去，然后重悬于以下反应混合物中：70μl 10Xλ核酸酶缓冲液(NEB，M0262L)、618μl无核酸酶的dH20、6μl 5U/μlλ核酸外切酶(NEB，M0262L)和6μl核酸外切酶I(NEB，M0293L)。将反应液在37℃下旋转孵育1小时。用磁体收集珠粒，并且将珠粒用1ml冰冷的ChIA-PET洗涤缓冲液洗涤3次(每次洗涤30秒)。
通过除去所有残余的缓冲液并将珠粒重悬于300μl ChIP洗脱缓冲液中，将染色质复合物从珠粒上洗脱下来。将具有珠粒的管在65℃下旋转1小时。将管置于磁体上，并且将洗脱液转移到新鲜的DNA LoBind Eppendorf管中。将洗脱液在烘箱中在65℃下孵育过夜而不旋转。
vi.第6天
将洗脱的样品转移到新鲜的管中并且添加300μl TE缓冲液以稀释SDS。将3μl的RNA酶A(30mg/ml)添加到管中，并且将混合物在37℃下孵育30分钟。孵育后，添加3μl 1MCaCl2和7μl 20mg/ml蛋白酶K，并且将管再次在55℃下孵育1.5小时。使用MaXtract高密度2ml凝胶管(Qiagen)，并通过在RT下以全速离心管30秒来使材料沉淀和成团粒。将600μl苯酚/氯仿/异戊醇添加到每个蛋白酶K反应中，并且将约1.2ml混合物转移到MaXtract管中。将管在RT下以16,000g旋转5分钟。
将水相转移到两个干净的DNA LoBind管中(每个管中300μl)，并且添加1μl糖原、30μl 3M乙酸钠和900μl乙醇。将混合物在-80℃下沉淀1小时。将管在4℃下以最大速度旋转沉降30分钟，并且除去乙醇。通过在4℃下以最大速度将管旋转沉降5分钟，用1ml的75％乙醇洗涤沉淀物。除去乙醇残余物，并且将沉淀物在RT下干燥5分钟。将30μl H2O添加到沉淀物中并使其静置5分钟。将沉淀物混合物短暂涡旋，并且旋转沉降以收集DNA。
进行Qubit和DNA高灵敏度ChIP来定量和评估邻位连接的DNA产物的质量。获得约120ng的产物。
vii.第7天
然后制备用于Nextera标签化的组分。将100ng DNA分为四个25μl反应，所述反应含有12.5μl 2X标签化缓冲液(Nextera)、1μl无核酸酶dH20、2.5μl Tn5酶(Nextera)和9μlDNA(25ng)。在生物分析仪上分析每个反应的片段以进行质量控制。
将反应在55℃下孵育5分钟，然后在10℃下孵育10分钟。添加25μl H2O，并且使用Zymo柱纯化标签化的DNA。将350μl结合缓冲液添加到样品中，并且将混合物装入柱中并以13,000rpm旋转30秒。重新施加流通液并且再次旋转柱。用200μl洗涤缓冲液将柱洗涤两次并且旋转1分钟以干燥膜。将柱转移到干净的Eppendorf管中，并且添加25μl洗脱缓冲液。将管旋转沉降1分钟。再用25μl洗脱缓冲液重复此步骤。将所有标签化的DNA合并到一个管中。
使用以下步骤将ChIA-PET固定化在链霉亲和素珠粒上。如下制备2X B&W缓冲液(40ml)以用于偶联核酸：400μl 1M Tris-HCl pH 8.0(10mM最终的)、80μl 1M EDTA(1mM最终的)、16ml 5M NaCl(2M最终的)和23.52ml dH2O。通过将20ml dH2O添加到20ml的2X B&W缓冲液中来制备1X B&W缓冲液(总共40ml)。
将MyOne链霉亲和素Dynabead M-280达到室温持续30分钟，并且将30μl珠粒转移到新的1.5ml管中。将珠粒用150μl 2X B&W缓冲液洗涤两次。将珠粒重悬于100μl iBlock缓冲液(Applied Biosystems)中并混合。将混合物在RT下在旋转器上孵育45分钟。
将I-BLOCK试剂制备为含有：0.2％I-Block试剂(0.2g)、1X PBS或1X TBS(10ml10X PBS或10X TBS)、0.05％吐温-20(50μl)和H2O至100ml。将10X PBS和I-BLOCK试剂添加到H2O中，并且将混合物微波处理40秒(不允许沸腾)，然后搅拌。在溶液冷却后添加吐温-20。溶液保持不透明，但颗粒溶解。将溶液冷却至RT以供使用。
在珠粒的孵育期间，将500ng剪切的基因组DNA添加到50μl H2O和50μl 2X B&W缓冲液中。当珠粒与iBLOCK缓冲液一起完成孵育后，将其用200μl 1X B&W缓冲液洗涤两次。弃去洗涤缓冲液，并且添加100μl剪切的基因组DNA。将混合物在RT下旋转孵育30分钟。将珠粒用200μl 1X B&W缓冲液洗涤两次。将标签化的DNA与等体积的2X B&W缓冲液添加到珠粒中，并且在RT下在旋转下孵育45分钟。将珠粒用500μl 2xSSC/0.5％SDS缓冲液洗涤5次(每次30秒)，然后用500ml 1X B&W缓冲液洗涤2次并且每次洗涤后在RT下在旋转下孵育5分钟。通过将珠粒轻轻重悬并将管放在磁体上，将珠粒用来自Qiagen Kit的100μl洗脱缓冲液(EB)洗涤一次。将上清液从珠粒中除去，并且将它们重悬于30μl EB中。
使用以下方案在珠粒上构建配对的末端测序文库。通过具有10个扩增循环的PCR测试10μl珠粒。50μl PCR混合物含有：10μl珠粒DNA、15μl NPM混合物(来自IlluminaNextera试剂盒)、5μl PPC PCR引物、5μl索引引物(Index Primer)1(i7)、5μl索引引物2(i5)和10μl H2O。使用以下循环条件进行PCR：将DNA在72℃下变性3分钟，然后进行10-12个循环，其中98℃下持续10秒，63℃下持续30秒和72℃下持续50秒，以及72℃下的最后延伸持续5分钟。调整循环次数，以用四个25μl反应获得约300ng DNA。PCR产物可以在4℃下无限期保存。
使用AMPure珠粒清除PCR产物。使用前，使珠粒达到RT持续30分钟。将50μl PCR反应物转移到新的低结合管中，并且添加(1.8x体积)90μl AMPure磁珠。将混合物充分吸移并且在RT下孵育5分钟。经3分钟用磁体收集珠粒并取出上清液。将300μl新鲜制备的80％乙醇添加到磁体上的珠粒中，并且小心地弃去乙醇。重复洗涤，并且然后除去所有乙醇。将珠粒在磁力架上干燥10分钟。将10μl EB添加到珠粒中，充分混合，并在RT下孵育5分钟。收集洗脱液，并且将1μl洗脱液用于Qubit和生物分析仪。
使用以下方案克隆文库以验证复杂性。将1μl文库以1:10稀释。如下所述进行PCR反应。选择与Illumina衔接子退火的引物(Tm＝52.2℃)。PCR反应混合物(总体积：50μl)含有以下物质：10μl 5X GoTaq缓冲液、1μl 10mM dNTP、5μl 10μM引物混合物、0.25μl GoTaq聚合酶、1μl稀释模板DNA和32.75μl H2O。使用以下循环条件进行PCR：将DNA在95℃下变性2分钟和在以下条件下进行20个循环：95℃下持续60秒，50℃下持续60秒并且72℃下持续30秒，以及在72℃下最终延伸持续5分钟。PCR产物可以在4℃下无限期保存。
将PCR产物用
Figure BDA0002716199420000942
T-Easy载体(Promega)方案连接。将5μl 2X T4快速连接酶缓冲液、1μl
Figure BDA0002716199420000941
T-Easy载体、1μl T4连接酶、1μl PCR产物和2μl H2O合并至10μl的总体积。将产物在RT下孵育1小时并且使用2μl转化星状感受态细胞。将200μl 500μl细胞铺板在SOC培养基中。第二天，选择20个菌落用于使用T7启动子引物的Sanger测序。60％克隆具有完整衔接子，而15％的具有部分衔接子。
viii.试剂
用于10个样品的蛋白G Dynabead来自Invitrogen Dynal，目录号10003D。封闭溶液(50ml)含有溶解于50ml ddH2O(0.5％BSA，w/v)中的0.25g BSA，并且在使用前在4℃下储存2天。
裂解缓冲液1(LB1)(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；14ml 5M NaCl；1ml0.5M EDTA，pH 8.0；50ml 100％甘油溶液；25ml 10％NP-40；和12.5ml 10％Triton X-100。将pH值调节至7.5。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。裂解缓冲液2(LB2)(1000ml)含有10ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；40ml 5M NaCl；2ml 0.5M EDTA，pH 8.0；和2ml 0.5M EGTA，pH 8.0。将pH值调节至8.0。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
超声处理缓冲液(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；14ml 5M NaCl；1ml0.5M EDTA，pH 8.0；50ml 10％Triton X-100；10ml 5％脱氧胆酸钠；和5ml 10％SDS。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。高盐超声处理缓冲液(500ml)含有25ml 1M Hepes-KOH，pH 7.5；35ml 5M NaCl；1ml 0.5M EDTA，pH 8.0；50ml10％Triton X-100；10ml 5％脱氧胆酸钠；和5ml 10％SDS。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
LiCl洗涤缓冲液(500ml)含有10ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；1ml 0.5M EDTA，pH8.0；125ml 1M LiCl溶液；25ml 10％NP-40；和50ml 5％脱氧胆酸钠。将pH值调节至8.0。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
用于定量ChIP DNA的量的洗脱缓冲液(500ml)含有25ml 1M Tris-HCL，pH 8.0；10ml 0.5M EDTA，pH 8.0；50ml 10％SDS；和415ml ddH2O。将pH值调节至8.0。缓冲液是无菌过滤的，并且储存在4℃下。在临使用之前重新检查pH。
ChIA-PET洗涤缓冲液(50ml)含有500μl 1M Tris-HCl，pH 8.0(最终10mM)；100μl0.5M EDTA，pH 8.0(最终1mM)；5ml 5M NaCl(最终500mM)；和44.4ml dH20。
M.HiChIP
作为ChIA-PET的替代方案，将HiChIP用于分析染色质相互作用和构象。与ChIA-PET相比，HiChIP需要更少的细胞。
i.细胞交联
将细胞如以上ChIP方案中所述交联。将交联的细胞以沉淀物形式储存在-80℃下或在将细胞快速冷冻后立即用于HiChIP。
ii.裂解和限制性
将1500万个交联细胞重悬于500μL冰冷的Hi-C裂解缓冲液中，并且在4℃下旋转30分钟。对于量大于1500万的细胞，将沉淀物分成两半以便产生接触，并且然后再合并以进行超声处理。将细胞以2500g旋转沉降5分钟，并弃去上清液。将沉淀的细胞核用500μL冰冷的Hi-C裂解缓冲液洗涤一次。除去上清液，并且将沉淀物重悬于100μL的0.5％SDS中。将重悬液在62℃下孵育10分钟，并且然后添加285μL H2O和50μL 10％Triton X-100以淬灭SDS。将重悬液充分混合，并且在37℃下孵育15分钟。将50μL 10X NEB缓冲液2和375U MboI限制性酶(NEB，R0147)添加到混合物中，以在37℃下在旋转下消化染色质2小时。对于较低的起始物质，使用较少的限制性酶：对10-15百万个细胞使用15μL，对于500万个细胞使用8μL，以及对于100万个细胞使用4μL。利用加热(62℃下持续20分钟)来使MboI失活。
iii.生物素结合和邻位连接
为了填充限制性片段突出端并用生物素标记DNA末端，通过将以下合并来使52μL填充主混合物反应：37.5μL 0.4mM生物素-dATP(Thermo 19524016)；1.5μL 10mM dCTP、dGTP和dTTP；和10μL 5U/μL DNA聚合酶I，大(Klenow)片段(NEB，M0210)。将混合物在37℃下在旋转下孵育1小时。
添加948μL连接主混合物。连接主混合物含有具有10mM ATP(NEB，B0202)的150μL10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液；125μL 10％Triton X-100；3μL 50mg/mL BSA；10μL 400U/μL T4 DNA连接酶(NEB，M0202)；和660μL水。将混合物在室温下在旋转下孵育4小时。将细胞核以2500g沉淀5分钟，并去除上清液。
iv.超声处理
为了超声处理，将沉淀物在细胞核裂解缓冲液中调至1000μL。将样品转移到Covaris毫管中，并且使用
Figure BDA0002716199420000961
E220EvolutionTM利用制造商推荐参数剪切DNA。将每个管(1500万个细胞)在以下条件下超声处理4分钟：填充水平5；占空比5％；PIP 140；和循环数/突发200。
v.预清除、免疫沉淀、IP珠粒捕获和洗涤
在4℃下以16,100g将样品澄清15分钟。将样品分成2个各自约400μL的管，并且添加750μL ChIP稀释缓冲液。对于Smc1a抗体(Bethyl A300-055A)，将样品在ChIP稀释缓冲液中以1:2稀释，以实现0.33％的SDS浓度。每1000万个细胞在ChIP稀释缓冲液中洗涤60μL蛋白G珠粒。针对不同量的细胞起始物质，线性调整珠粒(用于预清除和捕获)和抗体的量。将蛋白G珠粒重悬于每管的50μL稀释缓冲液(每次HiChIP 100μL)中。将样品在4℃下旋转1小时。将样品放在磁体上，并且将上清液转移至新管中。每1000万个细胞添加7.5μg抗体，并将混合物在4℃下旋转孵育过夜。每1000万个细胞再添加在ChIP稀释缓冲液中的60μL蛋白G珠粒。将蛋白G珠粒重悬于50μL稀释缓冲液(每次HiChIP 100μL)中，添加到样品中，并且在4℃下旋转2小时。将珠粒分别用低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液和LiCl洗涤缓冲液洗涤3次。通过以下方式在室温下进行洗涤：添加500μL洗涤缓冲液，通过相对于磁体移动样品来回摆动珠粒两次，并且然后除去上清液
vi.ChIP DNA洗脱
将ChIP样品珠粒重悬于100μL新鲜的DNA洗脱缓冲液中。将样品珠粒在RT下在旋转下孵育10分钟，然后在37℃下在振荡下孵育3分钟。将ChIP样品放在磁体上，并且将上清液移取至新鲜的管中。再将100μL DNA洗脱缓冲液添加到ChIP样品中，并且重复孵育。再次移取ChIP样品上清液，并且转移到新管中。约有200μL ChIP样品。向每个样品中添加10μL蛋白酶K(20mg/ml)，并且在55℃下在振荡下孵育45分钟。将温度升至67℃，并且将样品在振荡下孵育至少1.5小时。对DNA进行Zymo纯化(Zymo Research，#D4014)并洗脱到10μL水中。对ChIP后DNA进行定量，以估计生成正确大小分布下的文库所需的Tn5量。这假定接触文库已适当生成，样品未过度超声处理，并且材料已被牢固捕获在链霉亲和素珠粒上。使用1000万个细胞的SMC1 HiChIP的预期ChIP后DNA产量为15ng–50ng。对于具有大于150ng的ChIP后DNA的文库，将材料挑出，并且将最大150ng用于生物素捕获步骤
vii.用于Illumina测序的生物素下拉和制备
为了准备用于生物素下拉，用吐温洗涤缓冲液洗涤5μL的链霉亲和素C-1珠粒。将珠粒重悬于10μL 2X生物素结合缓冲液中，并且添加到样品中。将珠粒在RT下在旋转下孵育15小时。将珠粒在磁体上分离，并且弃去上清液。通过添加500μL吐温洗涤缓冲液洗涤珠粒两次，并且在振荡的同时在55℃下孵育2分钟。将珠粒在100μL 1X(从2X稀释)TD缓冲液中洗涤。将珠粒重悬于25μL 2X TD缓冲液、2.5μL Tn5(对于各50ng ChIP后DNA)和水中至50μL的体积。
Tn5的最大量为4μL。例如，对于25ng DNA转座子，添加1.25μL Tn5，而对于125ngDNA转座子，使用4μL Tn5。使用正确量的Tn5会导致适当的大小分布。过度转座的样品具有较短的片段，并表现出较低的对齐率(当连接处靠近片段末端时)。转座不足的样品的片段太大以至于无法在Illumina测序仪上适当地聚类。将文库在5个循环中进行扩增，并且具有足够的复杂性以进行深度测序并实现适当的大小分布，而与文库的转座水平无关。
将珠粒在55℃下在间隔振荡下孵育10分钟。将样品放在磁体上，并且除去上清液。向样品中添加50mM EDTA，并且在50℃下孵育30分钟。然后将样品快速地放在磁体上，并且移取上清液。将样品在50℃下用50mM EDTA洗涤两次，持续3分钟，然后将其从磁体中快速移取。将样品在吐温洗涤缓冲液中在55℃下洗涤两次，持续2分钟，然后从磁体中快速移取。将样品用10mM Tris-HCl，pH 8.0洗涤。
viii.PCR和PCR后大小选择
将珠粒重悬于50μL PCR主混合物中(来自Illumina的Nextera XT DNA文库制备试剂盒，#15028212，其具有双-索引衔接子#15055289)。使用以下程序进行PCR。使用以下两种方法之一估计循环数：(1)在常规PCR上进行5个循环的第一次运行(72℃下持续5分钟，98℃下持续1分钟，98℃下持续15秒，63℃下持续30秒，72℃下持续1分钟)，并且然后从珠粒上除去产物。然后，添加0.25X SYBR绿，并且在qPCR上运行样品。在指数扩增开始时拉出样品；或(2)在PCR上进行反应，并且基于来自ChIP后Qubit的材料量估计循环数(大于50ng以5个循环运行，而大约50ng以6个循环运行，25ng以7个循环运行，12.5ng以8个循环运行，等等)。
将文库置于磁体上并洗脱到新管中。使用Zymo Research试剂盒纯化文库并且洗脱到10μL水中。使用AMPure XP珠粒进行双侧大小选择。在PCR后，将文库置于磁体上并洗脱到新管中。然后，添加25μL AMPure XP珠粒，并且保留上清液以捕获小于700bp的片段。将上清液转移到新管中，并且添加15μL新鲜珠粒以捕获大于300bp的片段。进行从Ampure XP珠粒到10μL水中的最终洗脱。使用生物分析仪验证文库质量。
ix.缓冲液
Hi-C Lysis缓冲液(10mL)含有100μL 1M Tris-HCl pH 8.0；20μL 5M NaCl；200μL10％NP-40；200μL 50X蛋白酶抑制剂；和9.68mL水。核裂解缓冲液(10mL)含有500μL 1MTris-HCl pH 7.5；200μL 0.5M EDTA；1mL 10％SDS；200μL 50X蛋白酶抑制剂；和8.3mL水。ChIP稀释缓冲液(10mL)含有10μL 10％SDS；1.1mL 10％Triton X-100；24μL 500mM EDTA；167μL 1M Tris pH 7.5；334μL 5M NaCl；和8.365mL水。低盐洗涤缓冲液(10mL)含有100μL10％SDS；1mL 10％Triton X-100；40μL 0.5M EDTA；200μL 1M Tris-HCl pH 7.5；300μL 5MNaCl；和8.36mL水。高盐洗涤缓冲液(10mL)含有100μL 10％SDS；1mL 10％Triton X-100；40μL 0.5M EDTA；200μL 1M Tris-HCl pH 7.5；1mL 5M NaCl；和7.66mL水。LiCl洗涤缓冲液(10mL)含有100μL 1M Tris pH 7.5；500μL 5M LiCl；1mL 10％NP-40；1mL 10％脱氧胆酸钠；20μL 0.5M EDTA；和7.38mL水。
DNA洗脱缓冲液(5mL)含有250μL新鲜的1M NaHCO3；500μL 10％SDS；和4.25mL水。吐温洗涤缓冲液(50mL)含有250μL 1M Tris-HCl pH 7.5；50μL 0.5M EDTA；10mL 5M NaCl；250μL 10％吐温-20；和39.45mL水。2X生物素结合缓冲液(10mL)含有100μL 1M Tris-HClpH 7.5；20μL 0.5M；4mL 5M NaCl；和5.88mL水。2X TD缓冲液(1mL)含有20μL 1M Tris-HClpH 7.5；10μL 1M MgCl2；200μL 100％二甲基甲酰胺；和770μL水。
N.用于施用给肝细胞的药物稀释液
在对肝细胞进行化合物处理之前，通过将DMSO中的0.1mM储备药物与0.9ml DMSO混合至1.0ml的最终体积，将DMSO中的100mM储备药物稀释至10mM。向每个孔中添加5μl稀释药物，并且向每个药物孔中添加0.5ml培养基。将每种药物以一式三份进行分析。通过将5μl药物添加到45μl培养基中，并且将50μl添加到细胞上的450μl培养基中，进行至1000x的稀释。
也将生物活性化合物施用给肝细胞。为了在1ml DMSO中获得1000x的生物活性化合物储备液，将0.1ml 10,000X储备液与0.9ml DMSO合并。
O.siRNA敲低
在24孔形式中使用RNAiMAX试剂(ThermoFisher目录号13778030)用6pmol siRNA用siRNA反向转染原代人肝细胞，每孔1μl。第二天早晨，除去培养基并用改良型维持培养基替换，再持续24小时。整个处理持续48小时，此时，除去培养基并用RLT缓冲液替换以进行RNA提取(Qiagen RNeasy 96QIAcube HT试剂盒目录号74171)。处理细胞以用于qRT-PCR分析，并且然后测量靶mRNA的水平。
siRNA是从Dharmacon获得的，并且是四个siRNA双链体的库，所有双链体都被设计为靶向特定感兴趣基因内的不同位点(“SMARTpool”)。
P.小鼠研究
通过口服管饲法向一组6只小鼠(C57BL/6J品系)(3只雄性和3只雌性)施用候选化合物，每日一次，持续连续四天。在第四天最后一次给药后4小时，处死小鼠。收集包括肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、血浆的器官。将小鼠肝组织在液氮中粉碎，并等分到小微型管中。将TRIzol(Invitrogen目录号15596026)添加到管中，以有利于组织样品中的细胞裂解。然后离心含有破坏组织的TRIzol溶液，并且收集上清液相。使用Qiagen RNA提取试剂盒(Qiagen目录号74182)从上清液中提取总RNA，并且使用qRT-PCR分析靶mRNA水平。
实施例2.用于经刺激的肝细胞的RNA-seq研究
为了鉴定调节靶基因表达的小分子，将原代人肝细胞制备为单一培养物，并且将至少一种小分子化合物施加于细胞。
进行RNA-seq以确定化合物对肝细胞中靶基因表达的影响。通过将已经被扰乱的细胞系统中的表达水平除以未扰乱的系统中的表达水平来计算倍数变化。p-值≤0.05的表达变化被认为是显著的。
用于扰乱肝细胞的信号传导中心的化合物包括表2中列出的至少一种化合物。在表中，列出了化合物及其ID、靶标、通路和药物作用。选择为扰乱信号的大多数化合物在本领域已知调节至少一种经典细胞通路。一些化合物选自因缺乏功效而未能通过III期临床评价的化合物。
表2.RNA-seq中使用的化合物
Figure BDA0002716199420001011
Figure BDA0002716199420001021
Figure BDA0002716199420001031
Figure BDA0002716199420001041
Figure BDA0002716199420001051
Figure BDA0002716199420001061
Figure BDA0002716199420001071
Figure BDA0002716199420001081
Figure BDA0002716199420001091
实施例3.疾病、病症和病状的治疗方法的鉴定
RNA-seq数据的分析揭示了引起靶基因表达显著变化的多种化合物。除CPOX之外，所有靶标的显著性定义为FPKM≥1，log2(倍数变化)≥0.5，且q值≤0.05。显著调节至少一个所选择靶基因的化合物的RNA-seq结果在表3-12中示出。
表3提供了被观察到显著减少FN1表达的化合物的log2倍数变化，所述FN1编码与纤连蛋白肾小球病相关的纤连蛋白。
表3.FN1的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001092
Figure BDA0002716199420001101
表4提供了被观察到显著增加CPOX表达的化合物的log2倍数变化，所述CPOX编码与遗传性粪卟啉病相关的粪卟啉原氧化酶。显著性定义为FPKM≥0.5log2(倍数变化)≥0.3，且q值≤0.05。
表4.CPOX的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001102
表5提供了被观察到显著增加SERPINC1表达的化合物的log2倍数变化，所述SERPINC1编码与SERPINC1缺乏症相关的抗凝血酶。
表5.SERPINC1的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001103
Figure BDA0002716199420001111
表6提供了被观察到显著增加JAG1和/或NOTCH2表达的化合物的log2倍数变化，所述JAG1和/或NOTCH2分别编码与Alagille综合征相关的jagged 1和Notch 2。粗体化合物代表显著调节JAG1和NOTCH2两者的那些化合物。
表6.JAG1和NOTCH2的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001112
如上所示，观察到LDN193189、LDN-212854、萨力多胺、苯乙福明、恩扎滔林、GDF2(BMP9)、BMP2、阿木替尼、BMP4和BAY 87-2243以及INNO-206(奥多柔比星)仅显著调节JAG1；并且观察到齐泊腾坦和740 Y-P仅显著调节NOTCH2。观察到美瑞替尼和托彻普显著调节JAG1和NOTCH2两者。
表7提供了被观察到显著增加SLC37A4表达的化合物的log2倍数变化，所述SLC37A4编码与糖原贮积病1b相关的葡萄糖-6-磷酸移位酶(G6PT)。
表7.SLC37A4的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001121
表8提供了被观察到显著增加HMBS表达的化合物的log2倍数变化，所述HMBS编码与急性间歇性卟啉病相关的羟甲基胆素合酶。
表8.HMBS的RNA-seq结果
化合物 倍数变化(Log2)
索曲滔林 0.78
表9提供了被观察到显著减少LECT2表达的化合物的log2倍数变化，所述LECT2编码与LECT2淀粉样变性相关的白细胞衍生趋化因子2。
表9.LECT2的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001122
Figure BDA0002716199420001131
表10提供了被观察到显著减少APOL1表达的化合物的log2倍数变化，所述APOL1编码与APOL1相关肾小球疾病相关的载脂蛋白L1。
表10.APOL1的RNA-seq结果
化合物 倍数变化(Log2)
呋喃妥因 -0.60
克唑替尼 -0.56
表11提供了被观察到显著增加UGT1A1表达的化合物的log2倍数变化，所述UGT1A1编码与Gilbert综合征和Criggler Najjar II型相关的UDP葡糖醛酸转移酶家族1成员A1。
表11.UGT1A1的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001132
Figure BDA0002716199420001141
Figure BDA0002716199420001151
表12提供了被观察到显著增加LDLR表达和/或减少ANGPTL3和/或PCSK9表达的化合物的log2倍数变化，所述LDLR编码低密度脂蛋白受体，并且所述ANGPTL3和/或PCSK9分别编码血管生成素样3和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型，它们与血脂异常相关。
表12.ANGPTL3、LDLR和PCSK9的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001152
表13提供了被观察到显著减少ANGPTL3表达的化合物的log2倍数变化，所述ANGPTL3编码与血脂异常相关的血管生成素样3。
表13.ANGPTL3的RNA-seq结果
Figure BDA0002716199420001153
Figure BDA0002716199420001161
Figure BDA0002716199420001171
Figure BDA0002716199420001181
本文的结果提供了以下证据：表3-13中所示的具有显著治疗效果的化合物可以用于挽救与靶基因相关的疾病的表型。与靶基因在同一通路内或由同一信号传导中心控制的另外的基因也可以由表3-13中的化合物调节。
实施例4：肝细胞中SERPINC1的上调
在肝细胞中测试化合物对SERPINC1mRNA的上调，以鉴定SERPINC1/AT III缺乏症的潜在治疗方法。表14-16示出了用所选择化合物处理的原代人肝细胞和小鼠肝细胞的定量PCR结果，以及用所选择化合物处理的MGH54细胞的RNA seq结果。图6示出了相对于非靶向对照siRNA(NTC)，用靶向mTOR和NFKB的siRNA处理72h后，SERPINC1 mRNA的上调。图7示出了相对于DMSO对照，响应于用化合物308(OSI-027)和化合物309(PF04691502)的治疗，SERPINC1的剂量依赖性上调。
表14
Figure BDA0002716199420001191
表15
Figure BDA0002716199420001192
Figure BDA0002716199420001201
表16
Figure BDA0002716199420001202
实施例5：通过所选择化合物上调MECP2。
在肝细胞中测试了17-AAG对MECP2 mRNA的上调。如通过qPCR检测，相对于DMSO对照，用17-AAG进行处理导致小鼠肝细胞(图8)和小鼠肝(图9)中MECP2 mRNA增加。当用17-AAG处理时，来自两个供体的原代人肝细胞展现出MECP2 mRNA的剂量依赖性增加(图10A和10B)。测试了另外的化合物在人肝细胞中对MECP2 mRNA的诱导(表17-19)。
表17
Figure BDA0002716199420001203
Figure BDA0002716199420001211
表18
Figure BDA0002716199420001212
Figure BDA0002716199420001221
表19
Figure BDA0002716199420001222
实施例6：通过所选择化合物下调APOL表达。
在用3.3uM莫洛替尼(图11)或莫洛替尼代谢物M21(图12)治疗后，在原代人肝细胞中观察到APOL mRNA的下调。如上所述通过RNAseq鉴定出在10uM剂量下展现出APOL mRNA的下调的另外的化合物(表20)。
表20
Figure BDA0002716199420001223
Figure BDA0002716199420001231
等效案和范围
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的根据本公开的具体实施方案的许多等效案。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求中所阐述。
在权利要求中，除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则冠词诸如“一个/种(a/an)”以及“所述”可以意指一个/种或多于一个/种。除非相反地指出或另外从上下文明显看出，否则如果给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于一个、超过一个或全部组成员的话，则认为满足了在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述。本公开包括了其中在给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于组中的恰好一个成员的实施方案。本公开包括了其中在给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于超过一个、或整个组成员的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放性的并且允许但不要求包括另外的要素或步骤。当术语“包含”在本文中使用时，因此还涵盖和公开了术语“由......组成”。在给出范围时，端点被包括在内。
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应理解，除非另外指出或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解明显看出，否则表示为范围的值可假定为所陈述范围内的任何特定值或子范围(在本公开的不同实施方案中)到所述范围的下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
此外，应当理解，在现有技术之内的本公开的任何具体的实施方案可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为此类实施例被视为对于本领域的技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本公开的组合物的任何具体的实施方案(例如，任何抗生素、治疗剂或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等等)都可出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，而无论是否与现有技术的存在有关。
应当理解，已经使用的字词是描述性的而不是限制性的字词，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而在其更广泛的方面不脱离本公开的真实范围和精神。
虽然已经相对于若干个所描述的实施方案相当详细地且以一些特殊性描述了本公开，但是并不旨在将本发明限于任何此类细节或实施方法或任何具体的实施方案，而应是参照所附权利要求书来解释，以鉴于现有技术提供对此类权利要求书的尽可能广泛的解释，并因此有效地涵盖本发明的预期范围。

Claims (34)

1.一种治疗患有纤连蛋白肾小球病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够降低FN1基因表达的来自表3的化合物。
2.一种降低细胞中FN1基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述FN1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表3的化合物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述化合物选自由smoothened激动剂、克唑替尼、BGJ398、AZD2858和氨氯地平苯磺酸盐组成的组。
4.一种治疗患有遗传性粪卟啉病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加CPOX基因表达的来自表4的化合物。
5.一种增加细胞中CPOX基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述CPOX基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表4的化合物。
6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述化合物选自由17-AAG、氯化钴、SKL2001、FICZ和泼尼松组成的组。
7.一种治疗患有SERPINC1缺乏症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加SERPINC1基因表达的来自表5的化合物。
8.一种增加细胞中SERPINC1基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述SERPINC1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表5、表14、表15或表16的化合物。
9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述化合物选自由OSI-027、PF04691502、CP-673451、棘霉素和帕克替尼(SB1518)组成的组。
10.一种治疗患有Alagille综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加JAG1基因和/或NOTCH2基因表达的来自表6的化合物。
11.一种增加细胞中JAG1基因和/或NOTCH2基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述JAG1基因和/或NOTCH2基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表6的化合物。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述化合物选自由美瑞替尼和托彻普组成的组。
13.一种治疗患有糖原贮积病1b的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加SLC37A4基因表达的来自表7的化合物。
14.一种增加细胞中SLC37A4基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述SLC37A4基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表7的化合物。
15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述化合物选自由棘霉素、泼尼松、CP-673451和氯化钴组成的组。
16.一种治疗患有急性间歇性卟啉病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加HMBS基因表达的来自表8的化合物。
17.一种增加细胞中HMBS基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述HMBS基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表8的化合物。
18.如权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述化合物是索曲滔林。
19.一种治疗患有LECT2淀粉样变性的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够降低LECT2基因表达的来自表9的化合物。
20.一种降低细胞中LECT2基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述LECT2基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表9的化合物。
21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述化合物选自由骨化三醇、17-AAG和利托那韦组成的组。
22.一种治疗患有APOL1相关肾小球疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够降低APOL1基因表达的来自表10或表16的化合物。
23.一种降低细胞中APOL1基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述APOL1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表10或表16的化合物。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述化合物选自由呋喃妥因、克唑替尼、莫洛替尼和莫洛替尼代谢物M21组成的组。
25.一种治疗患有Gilbert综合征或Criggler Najjar II型的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加UGT1A1基因表达的来自表11的化合物。
26.一种增加细胞中UGT1A1基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述UGT1A1基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表11的化合物。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述化合物选自由FICZ、卡托吉宁、meBIO、CP-673451、BAM7和EW-7197组成的组。
28.一种治疗患有血脂异常的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加LDLR基因表达和/或降低ANGPTL3基因和/或PCSK9基因表达的来自表12的化合物。
29.一种在细胞中调节选自由ANGPTL3、LDLR和PCSK9基因组成的组的至少一种基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的能够改变与所述ANGPTL3、LDLR和PCSK9基因的调控序列区(RSR)或其部分相关的一种或多种信号传导分子的来自表12或表13的化合物。
30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述化合物选自由WYE-125132、皮斐松-u、LY294002、SGI-1776、普瑞迪南和CO-1686组成的组。
31.一种治疗患有Rett综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加MECP2基因表达的来自表17、表18或表19的化合物。
32.一种治疗患有Rett综合征的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够增加MECP2基因表达的来自表17、表18或表19的化合物。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述化合物是17-AAG。
34.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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