JP2021521101A - 遺伝子シグナル伝達ネットワークの標的調整を介した疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患を有する患者を治療するための方法及び組成物を提供する。遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することによって疾患関連遺伝子(複数可)を調整するための方法及び組成物も提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年4月6日出願の米国仮特許出願第62/653,760号に対する優先権及びその利益を主張し、その内容は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年4月6日出願の米国仮特許出願第62/653,760号に対する優先権及びその利益を主張し、その内容は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの、ニーズが満たされていない遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの、ニーズが満たされていない遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。
背景
継承遺伝性疾患は、致命的であり得るか、または重大な医療介入を必要とする状態をもたらし得る。継承遺伝性疾患の中で、稀な継承遺伝性疾患は、より大きな医学的課題を表している。現在、遺伝性疾患、特に稀な遺伝性疾患の療法にアプローチする能力は限られている。そのような疾患について、細胞シグナル伝達経路の制御は、魅力的な戦略を表す。疾患遺伝子を制御するシグナル伝達経路を操作することによって、遺伝子の発現は、所望の治療効果を達成するように変更され得るか、またはさらに微調整され得る。遺伝子発現の一見わずかな変化さえ、疾患に対して大きな影響を有することが示されている。
継承遺伝性疾患は、致命的であり得るか、または重大な医療介入を必要とする状態をもたらし得る。継承遺伝性疾患の中で、稀な継承遺伝性疾患は、より大きな医学的課題を表している。現在、遺伝性疾患、特に稀な遺伝性疾患の療法にアプローチする能力は限られている。そのような疾患について、細胞シグナル伝達経路の制御は、魅力的な戦略を表す。疾患遺伝子を制御するシグナル伝達経路を操作することによって、遺伝子の発現は、所望の治療効果を達成するように変更され得るか、またはさらに微調整され得る。遺伝子発現の一見わずかな変化さえ、疾患に対して大きな影響を有することが示されている。
したがって、本発明は、ニーズが満たされていない遺伝性疾患のための新規の治療方法を提供する。
概要
本発明は、多数の疾患関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワーク(複数可)のマッピング及び特定を開示する。遺伝子シグナル伝達ネットワーク(複数可)の構成成分を摂動させることによって、本発明者らは、そのような遺伝子の発現を調整するために利用され得る新規の標的、化合物及び/または方法を特定した。そのような方法及び組成物を使用して、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患のための様々な療法を開発することができる。
本発明は、多数の疾患関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワーク(複数可)のマッピング及び特定を開示する。遺伝子シグナル伝達ネットワーク(複数可)の構成成分を摂動させることによって、本発明者らは、そのような遺伝子の発現を調整するために利用され得る新規の標的、化合物及び/または方法を特定した。そのような方法及び組成物を使用して、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患のための様々な療法を開発することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、FN1遺伝子の発現を低減することができる表3からの化合物の有効量を対象に投与することによって、フィブロネクチン腎症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、FN1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表3からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のFN1遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、BGJ398、AZD2858、及びベシル酸アムロジピンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、CPOX遺伝子の発現を増加させることができる表4からの化合物の有効量を対象に投与することによって、遺伝性コプロポルフィリン症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、CPOX遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表4からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のCPOX遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、17−AAG、塩化コバルト、SKL2001、FICZ、及びプレドニゾンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、SERPINC1遺伝子の発現を増加させることができる表5、表14、表15、または表16からの化合物の有効量を対象に投与することによって、SERPINC1欠損症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、SERPINC1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表5、表14、表15、または表16からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のSERPINC1遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、OSI−027、PF04691502、CP−673451、エキノマイシン、及びパクリチニブ(SB1518)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、JAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の発現を増加させることができる表6からの化合物の有効量を対象に投与することによって、アラジール症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、JAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表6からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のJAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、メレスチニブ及びトルセトラピブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、SLC37A4遺伝子の発現を増加させることができる表7からの化合物の有効量を対象に投与することによって、糖原病1bを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、SLC37A4遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表7からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のSLC37A4遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、エキノマイシン、プレドニゾン、CP−673451、及び塩化コバルトからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、HMBS遺伝子の発現を増加させることができる表8からの化合物の有効量を対象に投与することによって、急性間欠性ポルフィリン症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、HMBS遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表8からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のHMBS遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ソトラスタウリンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、LECT2遺伝子の発現を低減することができる表9からの化合物の有効量を対象に投与することによって、LECT2アミロイドーシスを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、LECT2遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表9からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のLECT2遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、カルシトロール、17−AAG、及びリタオナビル(Ritaonavir)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、APOL1遺伝子の発現を低減することができる表10または表16からの化合物の有効量を対象に投与することによって、APOL1関連糸球体疾患を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、APOL1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表10または表16からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のAPOL1遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ニトロフラントイン、クリゾチニブ、モメロテニブ(Momelotenib)、及びモメロテニブ代謝産物M21からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、UGT1A1遺伝子の発現を増加させることができる表11からの化合物の有効量を対象に投与することによって、ジルベール症候群またはクリグラーナジャーII型を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、UGT1A1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表11からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のUGT1A1遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、FICZ、カルトゲニン、meBIO、CP−673451、BAM7、及びEW−7197からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、LDLR遺伝子の発現を増加させることならびに/あるいはANGPTL3遺伝子及び/またはPCSK9遺伝子の発現を低減することができる表12または表13からの化合物の有効量を対象に投与することによって、脂質異常症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ANGPTL3、LDLR、またはPCSK9遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表12または表13からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のANGPTL3、LDLR、及びPCSK9遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、WYE−125132、ピフィスリン−u、LY294002、SGI−1776、プレラデナント、及びCO−1686からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、MECP2遺伝子の発現を増加させることができる表15からの化合物の有効量を対象に投与する工程を含む、レット症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、MECP2遺伝子の発現を増加させることができる表15からの化合物の有効量を対象に投与する工程を含む、レット症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、17−AAGである。
ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
前述のならびに他の目的、特徴、及び利点は、付属の図面において図示されるように、本開示の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも原寸であるとは限らず、代わりに、本開示の様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれている。
詳細な説明
I.導入及び定義
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。具体的には、本開示は、FN1、CPOXなどの疾患関連遺伝子(複数可)の調整のための化合物及び関連する使用を提供する。
I.導入及び定義
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。具体的には、本開示は、FN1、CPOXなどの疾患関連遺伝子(複数可)の調整のための化合物及び関連する使用を提供する。
本開示はまた、遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)の変更、摂動、及び最終的な調節制御を包含する。そのような遺伝子シグナル伝達ネットワークは、生物系のゲノムの絶縁近傍内で見出されるゲノムシグナル伝達中心を含む。遺伝子発現を調整する化合物は、1つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調整することによって作用し得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子シグナル伝達ネットワーク」または「GSN」は、特定の遺伝子、例えば、遺伝子中心ネットワークからのシグナル伝達事象のうちのいずれかまたは全てに関連する生体分子のセットを含む。ヒトゲノム中に20,000を超えるタンパク質コード遺伝子が存在するため、少なくともこの多くの遺伝子シグナル伝達ネットワークが存在する。またいくつかの遺伝子が非コード遺伝子である範囲で、数は大幅に増加する。遺伝子シグナル伝達ネットワークは、標準タンパク質カスケード及びフィードバックループとしてマップされる正準シグナル伝達経路とは異なる。
伝統的に、シグナル伝達経路は、標準生化学技法を使用して特定され、大部分は、カスケード中の次のタンパク質生成物により駆動される事象をシグナル伝達する1つのタンパク質生成物を有する線形カスケードである。これらの経路は、二股に分かれ得るか、またはフィードバックループを有し得るが、焦点は、もっぱらタンパク質レベルに置かれている。
本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)は、タンパク質コード及び非タンパク質コードシグナル伝達分子、ゲノム構造、染色体占有率、染色体リモデリング、生物系の状態、ならびにそのような遺伝子シグナル伝達ネットワークを含む任意の生物系の摂動に関連する成果の範囲を考慮して、生物学的シグナル伝達を定義するための異なるパラダイムを表す。
ゲノムアーキテクチャは、静的ではないが、本開示のGSNのフレームワークを定義することにおいて重要な役割を果たす。そのようなアーキテクチャは、染色体組織化及び修飾の概念、位相関連ドメイン(TAD)、絶縁近傍(IN)、ゲノムシグナル伝達中心(GSC)、シグナル伝達分子及びそれらの結合モチーフまたは部位、ならびに当然のことながら、ゲノムアーキテクチャ内でエンコードされる遺伝子を含む。
「絶縁近傍」(IN)という用語は、本明細書で使用される場合、コヒーシンによって共占有されるCCCTC結合因子(CTCF)を含み、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、染色体配列中の2つの相互作用部位のルーピングによって形成される染色体構造を指す。
「ゲノムシグナル伝達中心」、すなわち「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、その絶縁近傍内または複数の絶縁近傍中の遺伝子の調節に関与するシグナル伝達分子/シグナル伝達タンパク質の状況特異的複合アセンブリに結合することができる領域を含む絶縁近傍内の領域を指す。
本開示は、疾患関連標的遺伝子(複数可)に関連するGSNの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患に対処するための微調整された機構を提供する。
ゲノムアーキテクチャ
細胞は、細胞シグナル伝達をゲノムのアーキテクチャに結合する数千のエレメントを使用して遺伝子発現を制御する。ゲノムシステムアーキテクチャは、DNA、RNA転写物、クロマチンリモデラー、及びシグナル伝達分子を含む。
細胞は、細胞シグナル伝達をゲノムのアーキテクチャに結合する数千のエレメントを使用して遺伝子発現を制御する。ゲノムシステムアーキテクチャは、DNA、RNA転写物、クロマチンリモデラー、及びシグナル伝達分子を含む。
染色体
染色体は、ヒトのDNAの大部分を含むゲノムアーキテクチャの最大サブユニットである。特定の染色体構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016に記載されるように、遺伝子対照において重要な役割を果たすことが観察された。イントロン(「非コード領域」)は、タンパク質結合部位及び他の調節構造を提供するが、エクソンは、非コード領域と相互作用して遺伝子発現を調節する転写因子などのシグナル伝達分子をエンコードする。染色体上の非コード領域内のDNA部位はまた、互いに相互作用して、ループ状構造を形成する。これらの相互作用は、発達を通して保存され、遺伝子活性化及び抑制において重要な役割を果たす染色体足場を形成する。相互作用は、染色体間でめったに起こらず、通常は染色体の同じドメイン内に存在する。
染色体は、ヒトのDNAの大部分を含むゲノムアーキテクチャの最大サブユニットである。特定の染色体構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016に記載されるように、遺伝子対照において重要な役割を果たすことが観察された。イントロン(「非コード領域」)は、タンパク質結合部位及び他の調節構造を提供するが、エクソンは、非コード領域と相互作用して遺伝子発現を調節する転写因子などのシグナル伝達分子をエンコードする。染色体上の非コード領域内のDNA部位はまた、互いに相互作用して、ループ状構造を形成する。これらの相互作用は、発達を通して保存され、遺伝子活性化及び抑制において重要な役割を果たす染色体足場を形成する。相互作用は、染色体間でめったに起こらず、通常は染色体の同じドメイン内に存在する。
原位置ハイブリダイゼーション技法及び顕微鏡は、個々の相間染色体が、核の小部分を占有する傾向があり、この細胞小器官全体に広がらないことを明らかにした。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Cremer and Cremer,Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2,a003889,2010を参照されたい。この小さい表面積の占有は、染色体間の相互作用を低減し得る。
位相関連ドメイン(TAD)
「位相関連ドメイン」(TAD)という用語は、本明細書で使用される場合、染色体のモジュラー組織化を表し、異なる細胞型の生物によって共有される境界を有する構造を指す。位相関連ドメイン(TAD)(あるいは位相ドメインとしても知られる)は、哺乳類染色体構造のサブユニットである階層ユニットである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Filippova et al.,Algorithms for Molecular Biology,9:14,2014、Gibcus and Dekker Molecular Cell,49(5):773−82,2013、Naumova et al.,Science,42(6161):948−53,2013を参照されたい。TADは、遺伝子及び調節エレメントが生産的DNA−DNA接触を成すのを可能にする微小環境を画定する、メガベースサイズの染色体領域である。TADは、DNA−DNA相互作用頻度によって定義される。TADの境界は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Nora et al.,Nature,485(7398):381−5,2012に記載されるように、比較的少ないDNA−DNA相互作用が起こる領域からなる。TADは、遺伝子発現調節因子として機能する構造的染色体ユニットを表す。
「位相関連ドメイン」(TAD)という用語は、本明細書で使用される場合、染色体のモジュラー組織化を表し、異なる細胞型の生物によって共有される境界を有する構造を指す。位相関連ドメイン(TAD)(あるいは位相ドメインとしても知られる)は、哺乳類染色体構造のサブユニットである階層ユニットである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Filippova et al.,Algorithms for Molecular Biology,9:14,2014、Gibcus and Dekker Molecular Cell,49(5):773−82,2013、Naumova et al.,Science,42(6161):948−53,2013を参照されたい。TADは、遺伝子及び調節エレメントが生産的DNA−DNA接触を成すのを可能にする微小環境を画定する、メガベースサイズの染色体領域である。TADは、DNA−DNA相互作用頻度によって定義される。TADの境界は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Nora et al.,Nature,485(7398):381−5,2012に記載されるように、比較的少ないDNA−DNA相互作用が起こる領域からなる。TADは、遺伝子発現調節因子として機能する構造的染色体ユニットを表す。
TADは、約7つ以上のタンパク質コード遺伝子を含有し、異なる細胞型によって共有される境界を有し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Smallwood et al.,Current Opinion in Cell Biology,25(3):387−94,2013を参照されたい。単一TAD内の遺伝子の発現は通常相関しているため、いくつかのTADは、活性遺伝子を含有し、他のものは抑制された遺伝子を含有する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Cavalli et al.,Nature Structural&Molecular Biology,20(3):290−9,2013を参照されたい。TAD内の配列は、互いを高頻度で見出し、一致したTADワイドヒストンクロマチンシグネチャー、発現レベル、DNA複製タイミング、ラミナ会合、及び染色中心会合を有する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Le Dily et al.,Genes Development,28:2151−62,2014、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Wijchers,Genome Research,25:958−69,2015を参照されたい。
TAD内の遺伝子ループ及び他の構造は、転写因子(TF)、コヒーシン、及び11−ジンクフィンガータンパク質(CTCF)、転写リプレッサーの活性に影響を及ぼす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Baranello et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences,111(3):889−9,2014を参照されたい。TAD内の構造は、エンハンサー結合TFが、順にプロモーター部位においてRNAポリメラーゼIIに結合する共因子、例えば、メディエーターに結合したときに産生されるコヒーシン関連エンハンサー・プロモーターループを含む。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Lee and Young,Cell,152(6):1237−51,2013、Lelli et al.,2012;Roeder,Annual Reviews Genetics 46:43−68,2005、Spitz and Furlong,Nature Reviews Genetics,13(9):613−26,2012、Dowen et al.,Cell,159(2):374−387,2014、Lelli et al.,Annual Review of Genetics,46:43−68,2012を参照されたい。コヒーシン負荷因子Nipped−B様タンパク質(NIPBL)は、メディエーターに結合し、これらのエンハンサー・プロモーターループにおいてコヒーシンを負荷する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kagey et al.,Nature,467(7314):430−5,2010を参照されたい。
TADは、調べた全てのヒト細胞型において同様の境界を有し、エンハンサー・遺伝子相互作用を拘束する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,518:331−336,2015、Dixon et al.,Nature,485:376−380,2012を参照されたい。ゲノムのこのアーキテクチャは、なぜ大部分のDNA接触がTAD内で起こり、エンハンサー・遺伝子相互作用が染色体間でめったに起こらないかを説明するのを助ける。しかしながら、TADは、TAD内で特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に影響を及ぼす分子機構に対する部分的な洞察を提供するにすぎない。
長期のゲノム接触は、TADを活性区画と非活性区画とに分離する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lieberman−Aiden et al.,Science,326:289−93,2009を参照されたい。TAD境界の間に形成されたループは、特定の配列対の間に安定して再現性よく形成された最長範囲の接触を表すと思われる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、TAD中に位置する遺伝子からの遺伝子発現を変更する。いくつかの実施形態では、TAD領域を修飾して、本明細書に定義されるように、または本明細書に記載される方法を使用して定義可能であるように、非正準経路の遺伝子発現を変更する。
絶縁近傍
本明細書に記載される場合、「絶縁近傍」(IN)は、染色体配列中の2つの相互作用部位のルーピングによって形成された染色体構造として特定される。これらの相互作用部位は、CCCTC結合因子(CTCF)を含み得る。これらのCTCF部位は、多くの場合、コヒーシンによって共占有される。これらのコヒーシン関連染色体構造の完全性は、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響する。「近傍遺伝子」は、絶縁近傍内に位置する遺伝子である。近傍遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。
本明細書に記載される場合、「絶縁近傍」(IN)は、染色体配列中の2つの相互作用部位のルーピングによって形成された染色体構造として特定される。これらの相互作用部位は、CCCTC結合因子(CTCF)を含み得る。これらのCTCF部位は、多くの場合、コヒーシンによって共占有される。これらのコヒーシン関連染色体構造の完全性は、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響する。「近傍遺伝子」は、絶縁近傍内に位置する遺伝子である。近傍遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。
絶縁近傍アーキテクチャは、一緒になって直接または間接的にDNAループを形成する少なくとも2つの境界によって定義される。任意の絶縁近傍の境界は、一次上流境界及び一次下流境界を含む。そのような境界は、任意の絶縁近傍の最も外側の境界である。しかしながら、任意の絶縁近傍ループ内では、二次ループが形成され得る。そのような二次ループは、存在する場合、一次絶縁近傍に対して、二次上流境界及び二次下流境界によって定義される。一次絶縁近傍が複数の内部ループを含有する場合、ループは、一次ループの一次上流境界に対して、例えば、二次ループ(一次ループ内の第1のループ)、三次ループ(一次ループ内の第2のループ)、四次ループ(一次ループ内の第3のループ)などと付番される。
絶縁近傍は、位相関連ドメイン(TAD)及び他の遺伝子ループ内に位置し得る。TADは、DNA−DNA相互作用頻度によって定義され、平均0.8Mbであり、およそ7タンパク質コード遺伝子を含有し、生物の異なる細胞型によって共有される境界を有する。Dowenによれば、TAD内の遺伝子の発現は、ある程度相関しており、したがっていくつかのTADは活性遺伝子を有する傾向があり、他のものは抑制された遺伝子を有する傾向がある。Dowen et al.,Cell.2014 Oct 9;159(2):374−387。
絶縁近傍は、染色体に沿って連続した実体として存在し得るか、または非絶縁近傍配列領域によって分離され得る。絶縁近傍は、DNAルーピング領域が接合された場合にのみ定義されるように線形に重複し得る。絶縁近傍は、3〜12遺伝子を含み得るが、それらは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13またはそれ以上の遺伝子を含有し得る。
「最小絶縁近傍」は、少なくとも1つの近傍遺伝子、ならびにプロモーター及び/またはエンハンサー及び/またはリプレッサー領域など、近傍遺伝子の発現もしくは抑制を促進する、関連した調節配列領域(複数可)(RSR)を有する絶縁近傍である。調節配列領域は、絶縁近傍境界と一致またはさらには重複し得ることが企図される。本明細書で使用される場合、調節配列領域としては、限定されないが、染色体に沿った領域、区分、部位または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」は、タンパク質、核酸(DNAもしくはRNA)、有機小分子、脂質、糖または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態である。調節配列領域(RSR)はまた、「ゲノムシグナル伝達中心」または「GSC」とも称され得る。
特殊化シグナル伝達分子の1つのカテゴリーは、転写因子である。「転写因子」は、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更するシグナル伝達分子である。
本開示に従い、近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する1つ以上、例えば、1、2、3、4またはそれ以上の上流及び/または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。
本開示は、遺伝子または遺伝子変異体の浸透度を変更する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「浸透度」は、その変異体遺伝子の関連した特性(表現型)も呈する遺伝子の特定の変異体(例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子または一般遺伝子型)を担持する個体の割合である。いくつかの疾患の状況において、疾患を引き起こす突然変異の浸透度は、臨床症状を呈する突然変異を有する個体の割合として測定した。結果として、任意の遺伝子または遺伝子変異体の浸透度は、連続体上に存在する。
絶縁近傍は、同じ制御機構下で遺伝子をグループ分けする機能的単位であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Dowen et al.,Cell,159:374−387(2014)に記載されている。絶縁近傍は、図1に示されるTADなどの、より高次の染色体構造の機構的背景を提供する。絶縁近傍は、図1に示されるコヒーシンによって共占有される2つの相互作用するCTCF部位のルーピングによって形成された染色体構造である。これらの構造の完全性は、局所遺伝子の適切な発現に重要である。一般に、1〜10の遺伝子は、各遺伝子内に3つの遺伝子の中央値を有する各近傍においてクラスター化される。同じ絶縁近傍によって制御される遺伝子は、DNAの二次元図から容易に明らかではない。ヒトにおいて、中央サイズが186kbである25kb〜940kbのサイズ範囲内に約13,801の絶縁近傍が存在する。絶縁近傍は、異なる細胞型の間で保存される。より大きなIN内で発生するより小さなINは、ネスト絶縁近傍(NIN)と称される。TADは、単一のINからなり得るか、または図2Bに示されるように1つのIN及び1つのNIN及び2つのNINからなり得る。
本明細書で使用される場合、「境界」という用語は、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。したがって、「絶縁近傍境界」は、染色体上の絶縁近傍の範囲を定める境界を指す。本開示に従い、絶縁近傍は、少なくとも2つの絶縁近傍境界、一次上流境界及び一次下流境界によって定義される。「一次上流境界」は、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。「一次下流境界」は、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。同様に、図2Bに示されるように二次ループが存在する場合、それらは、二次上流境界及び下流境界によって定義される。「二次上流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界であり、「二次下流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界である。二次境界の方向性は、一次絶縁近傍の方向性に従う。
絶縁近傍境界の構成成分は、2つの境界のルーピングを容易にするアンカー領域及び関連因子(例えば、CTCF、コヒーシン)においてDNA配列を含み得る。アンカー領域におけるDNA配列は、少なくとも1つのCTCF結合部位を含み得る。ChIP−exo技法を使用する実験は、4つのCTCF結合モジュールを含有する52bpのCTCF結合モチーフを明らかにした(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ong and Corces,Nature reviews Genetics,12:283−293,2011の図1を参照)。絶縁近傍境界におけるDNA配列は、絶縁体を含有し得る。場合によっては、絶縁近傍境界はまた、エンハンサー・プロモーター相互作用部位などの調節配列領域と一致または重複し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界における特定のDNA配列(例えば、CTCF結合部位)を変更することによって達成され得る。例えば、絶縁近傍境界における既存のCTCF結合部位は、欠失、突然変異、または逆転され得る。代替として、新たなCTCF結合部位は、新たな絶縁近傍を形成するために導入され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界におけるヒストン修飾(例えば、メチル化、脱メチル化)を変更することによって達成され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界へのCTCF及び/またはコヒーシンの結合を変更(例えば、ブロッキング)することによって達成され得る。絶縁近傍境界が調節配列領域と一致または重複する場合、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、調節配列領域(RSR)またはRSR関連シグナル伝達分子の結合を変更することによって達成され得る。
絶縁近傍からの発現を制御する:シグナル伝達中心
歴史的に、「シグナル伝達中心」という用語は、細胞環境の変化に反応する細胞の群を説明するために使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Guger et al.,Developmental Biology 172:115−125(1995)を参照されたい。同様に、「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子(例えば、転写因子)などの定義された生体分子のセットと相互作用して、遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する生存生物の定義された領域を指す。
歴史的に、「シグナル伝達中心」という用語は、細胞環境の変化に反応する細胞の群を説明するために使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Guger et al.,Developmental Biology 172:115−125(1995)を参照されたい。同様に、「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子(例えば、転写因子)などの定義された生体分子のセットと相互作用して、遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する生存生物の定義された領域を指す。
シグナル伝達中心は、絶縁近傍の活性を調節することが発見された。これらの領域は、ヒトゲノム中でどの遺伝子が発現されるか、及び発現のレベルを制御する。シグナル伝達中心の構造的完全性の喪失は、遺伝子発現の脱調節の一因となり、潜在的に疾患を引き起こす。
シグナル伝達中心は、転写因子の高度に状況特異的な複合アセンブリによって結合されたエンハンサーを含む。これらの因子は、細胞シグナル伝達を通して部位に動員される。シグナル伝達中心は、相互作用して三次元転写因子ハブマクロ複合体を形成する複数の遺伝子を含む。シグナル伝達中心は、一般に、生物学的機能によって組織化されたループ中の1〜4遺伝子に関連している。
各シグナル伝達中心の組成物は、転写因子のアセンブリ、転写装置、及びクロマチン調節因子を含む固有の組成物を有する。シグナル伝達中心は、高度に状況特異的であり、シグナル伝達経路を標的とすることによって薬物が反応を制御できるようにする。
複数のシグナル伝達中心は、相互作用して、同じ絶縁近傍内で異なる遺伝子の組み合わせを制御することができる。
シグナル伝達分子の結合部位
シグナル伝達分子について、一連のコンセンサス結合部位、または結合部位の結合モチーフは、本発明者によって特定された。これらのコンセンサス配列は、シグナル伝達分子の、または1つ以上のシグナル伝達分子を含む複合体の染色体、遺伝子、またはポリヌクレオチドに沿った結合部位を反映する。
シグナル伝達分子について、一連のコンセンサス結合部位、または結合部位の結合モチーフは、本発明者によって特定された。これらのコンセンサス配列は、シグナル伝達分子の、または1つ以上のシグナル伝達分子を含む複合体の染色体、遺伝子、またはポリヌクレオチドに沿った結合部位を反映する。
いくつかの実施形態では、結合部位は、複数のシグナル伝達分子または分子の複合体に関連している。
エンハンサー
「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、転写因子によって結合されたときに、関連遺伝子の転写を強化する調節DNA配列を指す。エンハンサーは、ヒトにおける細胞型特異的遺伝子発現プログラムを制御する遺伝子調節エレメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Buecker and Wysocka,Trends in genetics:TIG 28,276−284,2012、Heinz et al.,Nature reviews Molecular Cell Biology,16:144−154,2015、Levine et al.,Cell,157:13−25,2014、Ong and Corces,Nature reviews Genetics,12:283−293,2011、Ren and Yue,Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology,80:17−26,2015を参照されたい。エンハンサーは、一般に数百塩基対の長さであり、共活性化因子及びRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子を標的とする複数の転写因子によって占有されるDNAのセグメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Bulger and Groudine,Cell,144:327−339,2011、Spitz and Furlong,Nature reviews Genetics,13:613−626,2012、Tjian and Maniatis,Cell,77:5−8,1994を参照されたい。DNAのこれらの領域から転写されたエンハンサーRNA分子はまた、DNA及びRNAに結合することができる転写因子を「捕捉」する。複数のエンハンサーを有する領域は、「スーパーエンハンサー」である。「スーパーエンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞同一性を定義する遺伝子の発現を駆動する転写エンハンサーのクラスターを指す。
「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、転写因子によって結合されたときに、関連遺伝子の転写を強化する調節DNA配列を指す。エンハンサーは、ヒトにおける細胞型特異的遺伝子発現プログラムを制御する遺伝子調節エレメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Buecker and Wysocka,Trends in genetics:TIG 28,276−284,2012、Heinz et al.,Nature reviews Molecular Cell Biology,16:144−154,2015、Levine et al.,Cell,157:13−25,2014、Ong and Corces,Nature reviews Genetics,12:283−293,2011、Ren and Yue,Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology,80:17−26,2015を参照されたい。エンハンサーは、一般に数百塩基対の長さであり、共活性化因子及びRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子を標的とする複数の転写因子によって占有されるDNAのセグメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Bulger and Groudine,Cell,144:327−339,2011、Spitz and Furlong,Nature reviews Genetics,13:613−626,2012、Tjian and Maniatis,Cell,77:5−8,1994を参照されたい。DNAのこれらの領域から転写されたエンハンサーRNA分子はまた、DNA及びRNAに結合することができる転写因子を「捕捉」する。複数のエンハンサーを有する領域は、「スーパーエンハンサー」である。「スーパーエンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞同一性を定義する遺伝子の発現を駆動する転写エンハンサーのクラスターを指す。
絶縁近傍は、正常な遺伝子の活性化及び抑制の両方に極めて重要な特定のエンハンサー・遺伝子相互作用のための微小環境を提供する。転写エンハンサーは、20,000を超えるタンパク質コード遺伝子を制御して、全てのヒト細胞中の細胞型特異的遺伝子発現プログラムを維持する。数万のエンハンサーが、任意の所与のヒト細胞型で活性であると推定される。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ENCODE Project Consortium et al.,Nature,489,57−74,2012、Roadmap Epigenomics et al.,Nature,518,317−330,2015を参照されたい。エンハンサー及びそれらの関連因子は、これらの遺伝子のプロモーターにルーピングすることによって、上流または下流に位置する遺伝子の発現を調節し得る。細胞識別子の転写制御と染色体構造の制御との間の関係に関する洞察を得るために実行されたコヒーシンChIA−PET研究は、スーパーエンハンサー及びそれらの関連遺伝子の大部分が、コヒーシンによって共占有されたCTCF部位と相互作用することによって接続された大きなループ内で起こることを明らかにする。そのようなスーパーエンハンサードメイン(SD)は、通常、SD内の1つの遺伝子に対してループする1つのスーパーエンハンサーを含有し、SDは、SD内の遺伝子に対するスーパーエンハンサー活性を制限すると思われる。絶縁近傍中のスーパーエンハンサー及びそれらの標的遺伝子の正しい会合は、単一スーパーエンハンサーの誤標的が、疾患を引き起こすのに十分であるため、極めて重要である。Groschel et al.,Cell,157(2):369−81,2014を参照されたい。
疾患関連非コード変化の大部分は、エンハンサーの近位で起こり、したがってこれらのエンハンサー標的遺伝子に影響を及ぼし得る。したがって、エンハンサーに対する特異性を付与する特徴を解読することは、調整性遺伝子発現に重要である。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ernst et al.,Nature,473,43−49,2011、Farh et al.,Nature,518,337−343,2015、Hnisz et al.,Cell,155,934−947,2013、Maurano et al.,Science,337,1190−1195,2012を参照されたい。研究は、エンハンサー・遺伝子相互作用の特異性の一部が、エンハンサーにおけるDNA結合転写因子と、プロモーターにおける特定のパートナー転写因子との相互作用に起因し得ることを示唆する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Butler and Kadonaga,Genes&Development,15,2515−2519,2001、Choi and Engel,Cell,55,17−26,1988、Ohtsuki et al.,Genes&Development,12,547−556,1998を参照されたい。エンハンサー中及びプロモーター近位領域中のDNA配列は、単一細胞中で発現される様々な転写因子に結合する。これら2つの部位において結合される多様な因子は、大きな共因子複合体と相互作用し、互いに相互作用してエンハンサー・遺伝子特異性をもたらす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Zabidi et al.,Nature,518:556−559,2015を参照されたい。
いくつかの実施形態では、エンハンサー領域を標的化して、遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)を変更または明確化することができる。
絶縁体
「絶縁体」という用語は、本明細書で使用される場合、エンハンサーが、それらの間に位置しているときに遺伝子を活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する調節エレメントを指す。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Chung et al.,Cell 74:505−514,1993、Geyer and Corces,Genes&Development 6:1865−1873,1992、Kellum and Schedl,Cell 64:941−950,1991、Udvardy et al.,Journal of molecular biology 185:341−358,1985を参照されたい。絶縁体は、転写因子CTCFによって結合されるが、全てのCTCF部位が絶縁体として機能するとは限らない。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Bell et al.,Cell 98:387−396,1999、Liu et al.,Nature biotechnology 33:198−203,2015を参照されたい。絶縁体として機能するCTCF部位のサブセットを区別する特徴は、以前に理解されていない。
「絶縁体」という用語は、本明細書で使用される場合、エンハンサーが、それらの間に位置しているときに遺伝子を活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する調節エレメントを指す。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Chung et al.,Cell 74:505−514,1993、Geyer and Corces,Genes&Development 6:1865−1873,1992、Kellum and Schedl,Cell 64:941−950,1991、Udvardy et al.,Journal of molecular biology 185:341−358,1985を参照されたい。絶縁体は、転写因子CTCFによって結合されるが、全てのCTCF部位が絶縁体として機能するとは限らない。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Bell et al.,Cell 98:387−396,1999、Liu et al.,Nature biotechnology 33:198−203,2015を参照されたい。絶縁体として機能するCTCF部位のサブセットを区別する特徴は、以前に理解されていない。
エンハンサー、プロモーター及び絶縁体に結合するタンパク質のゲノムワイドマップは、これらのエレメントの間で起こる物理的接触の知識とともに、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用を生じる機構の理解に対するさらなる洞察を提供する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Chepelev et al.,Cell research,22:490−503,2012、DeMare et al.,Genome Research,23:1224−1234,2013、Dowen et al.,Cell,159:374−387,2014、Fullwood et al.,Genes&Development 6:1865−1873,2009、Handoko et al.,Nature genetics 43:630−638,2011、Phillips−Cremins et al.,Cell,153:1281−1295,2013、Tang et al.,Cell 163:1611−1627,2015を参照されたい。エンハンサー結合タンパク質は、それらがこれらのCTCF−CTCFループ内の遺伝子のみと相互作用する傾向があるように制約される。したがって、これらのループアンカーを形成するCTCF部位のサブセットは、図2Bに示されるように、ループの外側のエンハンサー及び遺伝子から、ループ内のエンハンサー及び遺伝子を絶縁するように機能する。いくつかの実施形態では、絶縁体領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)を変更または明確化するために標的され得る。
コヒーシン及びCTCF関連ループ及びアンカー部位/領域
CTCF相互作用は、ループを形成する同じ染色体上の部位を結合し、それらは一般に、1Mb未満の長さである。転写は、ループ内及び外側の両方で起こるが、この転写の性質は、2つの領域間で異なる。研究は、エンハンサー関連転写が、ループ内でより顕著であることを示す。したがって、絶縁体状態は、CTCFループアンカーにおいて特異的に富化される。したがって、CTCFループは、遺伝子がループ内の中心に位置する傾向を有する遺伝子不良領域を包囲するか、またはCTCFループの外側の遺伝子密集領域を除外するかのいずれかである。CTCFループは、それらの隣接領域に対して低減したエクソン密度を呈する。遺伝子オントロジー分析は、CTCFループ内に位置する遺伝子が、刺激への反応のために、また細胞外血漿膜及び小嚢細胞局在のために富化されることを明らかにする。一方で、ループのちょうど外側の接する隣接領域内に存在する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と同様の発現パターンを呈する。すなわち、これらの遺伝子は、平均してループに包囲された遺伝子よりも高度に発現され、それらの発現パターンにおいてあまり細胞株特異的ではなく、細胞株にわたってそれらの発現レベルの変化が少ない。参照によりその全体が組み込まれる、Oti et al.,BMC Genomics,17:252,2016を参照されたい。
CTCF相互作用は、ループを形成する同じ染色体上の部位を結合し、それらは一般に、1Mb未満の長さである。転写は、ループ内及び外側の両方で起こるが、この転写の性質は、2つの領域間で異なる。研究は、エンハンサー関連転写が、ループ内でより顕著であることを示す。したがって、絶縁体状態は、CTCFループアンカーにおいて特異的に富化される。したがって、CTCFループは、遺伝子がループ内の中心に位置する傾向を有する遺伝子不良領域を包囲するか、またはCTCFループの外側の遺伝子密集領域を除外するかのいずれかである。CTCFループは、それらの隣接領域に対して低減したエクソン密度を呈する。遺伝子オントロジー分析は、CTCFループ内に位置する遺伝子が、刺激への反応のために、また細胞外血漿膜及び小嚢細胞局在のために富化されることを明らかにする。一方で、ループのちょうど外側の接する隣接領域内に存在する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と同様の発現パターンを呈する。すなわち、これらの遺伝子は、平均してループに包囲された遺伝子よりも高度に発現され、それらの発現パターンにおいてあまり細胞株特異的ではなく、細胞株にわたってそれらの発現レベルの変化が少ない。参照によりその全体が組み込まれる、Oti et al.,BMC Genomics,17:252,2016を参照されたい。
アンカー領域は、絶縁近傍の立体配座に影響を及ぼすCTCFの結合部位である。アンカー部位の欠失は、通常は転写的にサイレントである遺伝子の活性化をもたらし得、それによって疾患表現型をもたらす。実際に、体細胞突然変異は、発がん関連絶縁近傍のループアンカー部位において共通している。ループアンカー領域のCTCF DNA結合モチーフは、がん細胞の最も変更されたヒト転写因子結合配列であることが観察された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016を参照されたい。
アンカー領域は、細胞発達中に大部分が維持され、特にヒト及び霊長類の生殖系において保存されることが観察された。実際に、アンカー領域のDNA配列は、絶縁近傍の一部ではないCTCF結合部位よりもCTCFアンカー領域において保存される。したがって、コヒーシンをChIA−PETの標的として使用して、両方の位置を特定することができる。
コヒーシンはまた、ゲノムのCTCF結合領域と関連付けられ、これらのコヒーシン関連CTCF部位のうちのいくつかは、遺伝子活性化を促進するが、他のものは絶縁体として機能し得る。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Dixon et al.,Nature,485(7398):376−80,2012、Parelho et al.,Cell,132(3):422−33,2008、Phillips−Cremins and Corces,Molecular Cell,50(4):461−74,2013)、Seitan et al.,Genome Research,23(12):2066−77,2013、Wendt et al.,Nature,451(7180):796−801,2008)を参照されたい。コヒーシン及びCTCFは、TAD内の大きなループ下部構造と関連付けられ、コヒーシン及びメディエーターは、CTCF結合領域内で形成するより小さいループ構造と関連付けられる。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、de Wit et al.,Nature,501(7466):227−31,2013、Cremins et al.,Cell,153(6):1281−95,2013、Sofueva et al.,EMBO,32(24):3119−29,2013を参照されたい。いくつかの実施形態では、コヒーシン及びCTCF関連ループ及びアンカー部位/領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)を変更または明確化するために標的され得る。
遺伝子変異体
シグナル伝達中心内の遺伝子変異は、例えば、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016に記載されているように、染色体上のタンパク質結合を崩壊させることによって疾患の一因となることが知られている。絶縁近傍の形成を干渉するCTCFアンカー領域の配列の変異は、遺伝子活性化及び抑制の脱調節をもたらすことが観察される。様々な遺伝的機構及び後成的機構によって引き起こされるCTCF機能不全は、発病につながり得る。したがって、いくつかの実施形態では、1つ以上の前向きな治療結果をもたらすために、そのような変異体駆動型病因学と関連付けられる任意の1つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)を変更することが有益である。
シグナル伝達中心内の遺伝子変異は、例えば、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016に記載されているように、染色体上のタンパク質結合を崩壊させることによって疾患の一因となることが知られている。絶縁近傍の形成を干渉するCTCFアンカー領域の配列の変異は、遺伝子活性化及び抑制の脱調節をもたらすことが観察される。様々な遺伝的機構及び後成的機構によって引き起こされるCTCF機能不全は、発病につながり得る。したがって、いくつかの実施形態では、1つ以上の前向きな治療結果をもたらすために、そのような変異体駆動型病因学と関連付けられる任意の1つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)を変更することが有益である。
単一ヌクレオチド多型(SNP)
ほとんどの疾患関連SNPは、シグナル伝達中心の付近に位置する。例えば、SNPの94.2%が、シグナル伝達中心を含む非コード領域中で発生する。いくつかの実施形態では、SNPは、1つ以上のGSNからのシグナル伝達を研究及び/または変更するために変更される。
ほとんどの疾患関連SNPは、シグナル伝達中心の付近に位置する。例えば、SNPの94.2%が、シグナル伝達中心を含む非コード領域中で発生する。いくつかの実施形態では、SNPは、1つ以上のGSNからのシグナル伝達を研究及び/または変更するために変更される。
シグナル伝達分子
シグナル伝達分子は、正準であるか、または本明細書に定義される、もしくは本明細書に記載される方法を使用して定義可能である遺伝子シグナル伝達ネットワーク経路細胞かにかかわらず、細胞シグナル伝達経路において機能する任意のタンパク質を含む。転写因子は、シグナル伝達分子のサブセットである。シグナル伝達及びマスター転写因子のある特定の組み合わせをエンハンサー領域と関連付けて、遺伝子の発現に影響を及ぼす。マスター調節因子は、特定の組織中の転写因子を指向する。例えば、血液中では、GATA転写因子が、Wnt細胞シグナル伝達経路のTCF7L2を指向するマスター調節因子である。肝臓中では、HNG4が、系統組織及びパターンにおけるSMADを指向するマスター調節因子である。
シグナル伝達分子は、正準であるか、または本明細書に定義される、もしくは本明細書に記載される方法を使用して定義可能である遺伝子シグナル伝達ネットワーク経路細胞かにかかわらず、細胞シグナル伝達経路において機能する任意のタンパク質を含む。転写因子は、シグナル伝達分子のサブセットである。シグナル伝達及びマスター転写因子のある特定の組み合わせをエンハンサー領域と関連付けて、遺伝子の発現に影響を及ぼす。マスター調節因子は、特定の組織中の転写因子を指向する。例えば、血液中では、GATA転写因子が、Wnt細胞シグナル伝達経路のTCF7L2を指向するマスター調節因子である。肝臓中では、HNG4が、系統組織及びパターンにおけるSMADを指向するマスター調節因子である。
転写調節は、所与の遺伝子がどのくらいの頻度で転写されるかを制御するのを可能にする。転写因子は、転写開始の条件を多少好ましいものにすることによって転写物が産生される速度を変更する。転写因子は、シグナル伝達経路を選択的に変更し、これはシグナル伝達中心によって発現する遺伝子に影響を及ぼす。シグナル伝達中心は、転写調節因子の構成成分である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子は、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークのシグナル伝達を明確化または変更するために使用され、標的とされ得る。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、U.S.62/501,795の表18は、様々な細胞シグナル伝達経路において機能する転写因子(TF)及び/またはクロマチンリモデリング因子(CR)として作用するものを含む、シグナル伝達分子の一覧を提供する。本明細書に記載される方法を使用して、絶縁近傍内でエンコードされる一次近傍遺伝子の調節配列領域に関連する1つ以上のシグナル伝達分子の発現を阻害または活性化することができる。したがって、これらの方法は、未治療対照と比較して、治療剤による治療時に差次的に発現される1つ以上の一次近傍遺伝子のシグナル伝達シグネチャーを変更することができる。
転写因子
「転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更するシグナル伝達分子である。転写因子は、一般に、エンハンサーに結合し、共活性化因子及びRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子を標的とすることによって遺伝子発現を調節する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Whyte et al.,Cell,153(2):307−319,2013を参照されたい。転写因子は、「エンハンサー」に結合して、ゲノム全体に分散された調節エレメントに結合することによって細胞特異的転写プログラムを刺激する。
「転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更するシグナル伝達分子である。転写因子は、一般に、エンハンサーに結合し、共活性化因子及びRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子を標的とすることによって遺伝子発現を調節する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Whyte et al.,Cell,153(2):307−319,2013を参照されたい。転写因子は、「エンハンサー」に結合して、ゲノム全体に分散された調節エレメントに結合することによって細胞特異的転写プログラムを刺激する。
ヒトゲノム中に約1800の既知の転写因子が存在する。リボソームRNA複合体などのタンパク質または核酸分子の結合部位を提供する染色体のDNA上にエピトープが存在する。マスター調節因子は、上記の細胞シグナル伝達及び下記のDNAを通して転写因子の組み合わせを指向する。これらの特徴は、次のシグナル伝達中心の位置の決定を可能にする。いくつかの実施形態では、転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
マスター転写因子
マスター転写因子は、細胞型特異的エンハンサーを結合及び確立する。マスター転写因子は、追加のシグナル伝達タンパク質、例えば他の転写因子をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。233ヒト細胞型及び組織の候補マスターTFの地図は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、D′Alessio et al.,Stem Cell Reports 5,763−775(2015)に記載されている。いくつかの実施形態では、マスター転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
マスター転写因子は、細胞型特異的エンハンサーを結合及び確立する。マスター転写因子は、追加のシグナル伝達タンパク質、例えば他の転写因子をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。233ヒト細胞型及び組織の候補マスターTFの地図は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、D′Alessio et al.,Stem Cell Reports 5,763−775(2015)に記載されている。いくつかの実施形態では、マスター転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
シグナル伝達転写因子
シグナル伝達転写因子は、それらがそうすることを可能にするタンパク質ドメインを含むため、細胞間を移動するホメオタンパク質などの転写因子である。Engrailed、Hoxa5、Hoxb4、Hoxc8、Emx1、Emx2、Otx2及びPax6などのホメオタンパク質は、シグナル伝達転写因子として作用することができる。ホメオタンパク質Engrailedは、他のホメオタンパク質において同様に存在すると考えられる内在化及び分泌シグナルを有する。この特性は、転写因子であることに加えて、ホメオタンパク質がシグナル伝達分子として作用するのを可能にする。ホメオタンパク質は、特徴付けられた細胞外機能を欠いており、それらのパラクリン標的が細胞内であるという認識につながる。ホメオタンパク質が転写、及び場合によっては翻訳を調節する能力は、パラクリン作用に影響を及ぼす可能性が最も高い。Prochiantz and Joliot,Nature Reviews Molecular Cell Biology,2003を参照されたい。いくつかの実施形態では、シグナル伝達転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
シグナル伝達転写因子は、それらがそうすることを可能にするタンパク質ドメインを含むため、細胞間を移動するホメオタンパク質などの転写因子である。Engrailed、Hoxa5、Hoxb4、Hoxc8、Emx1、Emx2、Otx2及びPax6などのホメオタンパク質は、シグナル伝達転写因子として作用することができる。ホメオタンパク質Engrailedは、他のホメオタンパク質において同様に存在すると考えられる内在化及び分泌シグナルを有する。この特性は、転写因子であることに加えて、ホメオタンパク質がシグナル伝達分子として作用するのを可能にする。ホメオタンパク質は、特徴付けられた細胞外機能を欠いており、それらのパラクリン標的が細胞内であるという認識につながる。ホメオタンパク質が転写、及び場合によっては翻訳を調節する能力は、パラクリン作用に影響を及ぼす可能性が最も高い。Prochiantz and Joliot,Nature Reviews Molecular Cell Biology,2003を参照されたい。いくつかの実施形態では、シグナル伝達転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
クロマチン修飾
クロマチンリモデリングは、ヒストン修飾に関連する1000を超えるタンパク質によって調節される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ji et al.,PNAS,112(12):3841−3846(2015)を参照されたい。クロマチン調節因子は、修飾されたヒストンでマークされたゲノム領域に関連する特定のタンパク質のセットである。例えば、ヒストンは、ある特定のリジン残基:H3K20me3、H3K27ac、H3K4me3、H3K79me2、H3K36me3、H3K9me2、及びH3K9me3において修飾され得る。ある特定のヒストン修飾は、シグナル伝達分子によって結合するために使用可能であるゲノムの領域をマークする。例えば、以前の研究は、活性エンハンサー領域がH3K27acを有するヌクレオソームを含み、活性プロモーターがH3K27acを有するヌクレオソームを含むことを観察した。さらに、転写された遺伝子は、H3K79me2を有するヌクレオソームを含む。ChIP−MSを実施して、特定のヒストン修飾に関連するクロマチン調節因子タンパク質を特定することができる。ある特定の修飾されたヒストンに特異的な抗体を有するChIP−seqを使用して、シグナル伝達分子によって結合されたゲノムの領域を特定することもできる。いくつかの実施形態では、クロマチン修飾酵素またはタンパク質を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
クロマチンリモデリングは、ヒストン修飾に関連する1000を超えるタンパク質によって調節される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ji et al.,PNAS,112(12):3841−3846(2015)を参照されたい。クロマチン調節因子は、修飾されたヒストンでマークされたゲノム領域に関連する特定のタンパク質のセットである。例えば、ヒストンは、ある特定のリジン残基:H3K20me3、H3K27ac、H3K4me3、H3K79me2、H3K36me3、H3K9me2、及びH3K9me3において修飾され得る。ある特定のヒストン修飾は、シグナル伝達分子によって結合するために使用可能であるゲノムの領域をマークする。例えば、以前の研究は、活性エンハンサー領域がH3K27acを有するヌクレオソームを含み、活性プロモーターがH3K27acを有するヌクレオソームを含むことを観察した。さらに、転写された遺伝子は、H3K79me2を有するヌクレオソームを含む。ChIP−MSを実施して、特定のヒストン修飾に関連するクロマチン調節因子タンパク質を特定することができる。ある特定の修飾されたヒストンに特異的な抗体を有するChIP−seqを使用して、シグナル伝達分子によって結合されたゲノムの領域を特定することもできる。いくつかの実施形態では、クロマチン修飾酵素またはタンパク質を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
調節配列領域に由来するRNA
タンパク質コード遺伝子のエンハンサー、シグナル伝達中心、及びプロモーターなどの多くの活性調節配列領域(RSR)は、非コードRNAを産生することが知られている。活性調節配列領域またはその近位で産生される転写物は、付近の遺伝子の転写調節において実装されている。最近の報告は、エンハンサー関連RNA(eRNA)が、エンハンサー活性の強力な指標であることを実証した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Li et al.,Nat Rev Genet.2016 Apr;17(4):207−23を参照されたい)。さらに、活性調節配列領域からの非コードRNAは、これらの領域への転写因子の結合を促進することに関与することが示されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sigova et al.,Science.2015 Nov 20;350(6263):978−81)。これは、そのようなRNAが、シグナル伝達中心のアセンブリ及び近傍遺伝子の調節に重要であり得ることを示唆している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の調節配列領域に由来するRNAを使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
タンパク質コード遺伝子のエンハンサー、シグナル伝達中心、及びプロモーターなどの多くの活性調節配列領域(RSR)は、非コードRNAを産生することが知られている。活性調節配列領域またはその近位で産生される転写物は、付近の遺伝子の転写調節において実装されている。最近の報告は、エンハンサー関連RNA(eRNA)が、エンハンサー活性の強力な指標であることを実証した(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Li et al.,Nat Rev Genet.2016 Apr;17(4):207−23を参照されたい)。さらに、活性調節配列領域からの非コードRNAは、これらの領域への転写因子の結合を促進することに関与することが示されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sigova et al.,Science.2015 Nov 20;350(6263):978−81)。これは、そのようなRNAが、シグナル伝達中心のアセンブリ及び近傍遺伝子の調節に重要であり得ることを示唆している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の調節配列領域に由来するRNAを使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAは、エンハンサー関連RNA(eRNA)であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAは、プロモーター関連RNAであり得、プロモーター上流転写(PROMPT)、プロモーター関連長RNA(PALR)、及びプロモーター関連小RNA(PASR)が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、調節配列領域に由来するRNAとしては、転写開始部位(TSS)関連RNA(TSSa−RNA)、転写開始RNA(tiRNA)、及びターミネーター関連小RNA(TASR)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAは、長い非コードRNA(lncRNA)(すなわち、>200ヌクレオチド)であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAは、中間非コードRNA(すなわち、約50〜200ヌクレオチド)であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAは、短い非コードRNA(すなわち、約20〜50ヌクレオチド)であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物によって調整され得るeRNAは、以下の特徴のうちの1つ以上を特徴とし得る。(1)ヒストン3のリジン4上の高レベルのモノメチル化(H3K4me1)及びヒストン3のリジン4上の低レベルのトリメチル化(H3K4me3)を有する領域から転写される、(2)ヒストン3のリジン27上の高レベルのアセチル化(H3K27ac)を有するゲノム領域から転写される、(3)ヒストン3のリジン36上の低レベルのトリメチル化(H3K36me3)を有するゲノム領域から転写される、(4)RNAポリメラーゼII(Pol II)について富化されたゲノム領域から転写される、(5)p300共活性化因子などの転写共調節因子について富化されたゲノム領域から転写される、(6)低密度のCpG島を有するゲノム領域から転写される、(7)それらの転写がPol II結合部位から開始され、二方向に伸長される、(8)eRNAをエンコードする進化的に保存されたDNA配列、(9)短い半減期、(10)低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、(11)シグナル伝達時に動的に調節される、(12)mRNA発現付近のレベルに正に相関する、(13)極めて高い組織特異性、(14)選好的に核及びクロマチン結合される、及び/または(15)エキソソームによって分解される。
本明細書に記載される方法及び化合物によって調整され得るeRNAの非限定的な例としては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Djebali et al.,Nature.2012 Sep 6;489(7414)(例えば、図5aに関する補足データファイル)及びAndersson et al.,Nature.2014 Mar 27;507(7493):455−461(例えば、補足的な表S3、S12、S13、S15及び16)に記載されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法または化合物によって調整され得るプロモーター関連RNAは、以下の特徴のうちの1つ以上を特徴とし得る。(1)高レベルのH3K4me1及び低〜中レベルのH3K4me3を有する領域から転写される、(2)高レベルのH3K27acを有するゲノム領域から転写される、(3)H3K36me3を有しないか、または低レベルのH3K36me3を有するゲノム領域から転写される、(4)RNAポリメラーゼII(Pol II)について富化されたゲノム領域から転写される、(5)高密度のCpG島を有するゲノム領域から転写される、(6)それらの転写は、Pol II結合部位から開始され、センス鎖(すなわち、mRNA)から反対方向または二方向に伸長される、(7)短い半減期、(8)低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、(9)選好的に核結合及びクロマチン結合される、及び/または(10)エキソソームによって分解される。
本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、調節配列領域に由来するRNAを調整して、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するRNAの産生及び/または機能を阻害することができる。いくつかの実施形態では、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを使用して、RNA干渉(RNAi)もしくはRNase H媒介性切断を介して関心対象のRNAの活性を阻害するか、またはRNAへの様々なシグナル伝達分子の結合を物理的にブロックすることができる。例示的なハイブリダイジングオリゴヌクレオチドとしては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、U.S.9,518,261及びWO2014/040742に記載されるものを挙げることができる。ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたまたは未修飾のRNA、DNA、ロックド核酸(LNA)、またはRNA及びDNAの組み合わせ、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、CRISPR/Cas9などのゲノム編集ツールを使用して、RNAの転写を制御するか、またはRNA自体を分解する調節配列領域中の特定のDNAエレメントを削除することができる。他の実施形態では、触媒的に不活性なCRISPR/Cas9などのゲノム編集ツールを使用して、調節配列領域中の特定のエレメントに結合し、関心対象のRNAの転写をブロックすることができる。さらなる実施形態では、ブロモドメイン及び末端外ドメイン(BET)阻害剤(例えば、JQ1、I−BET)を使用して、BETタンパク質Brd4によるヒストンアセチル化の阻害を通してRNA転写を低減することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するRNAの産生及び/または機能を増加させることができる。いくつかの実施形態では、関心対象のRNAを模倣する外因性合成RNAは、細胞に導入され得る。合成RNAは、RNA、RNAをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、CRISPR/Cas9などのゲノム編集ツールを使用して、外因性合成RNAを調節配列領域中の特定部位につなぐことができる。そのようなRNAを、CRISPR/Cas9複合体のガイドRNAに融合することができる。
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAの調整は、標的遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するRNAの調整は、標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物によって調整されるRNAとしては、肝臓細胞(例えば、肝細胞)中の標的遺伝子の調節配列領域に由来するRNAが挙げられる。
ゲノム系の摂動
本明細書に記載される標的遺伝子に関連した遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)、ゲノムシグナル伝達中心(GSC)、及び/または絶縁近傍(IN)のうちの1つ以上の構成成分の挙動は、そのようなネットワーク、中心、及び/または近傍を含む系を摂動刺激と接触させることによって変更され得る。潜在的刺激としては、小分子、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪、核酸などの外因性生体分子、または放射線、pH、温度、イオン強度、音、光などの環境刺激を挙げることができる。
本明細書に記載される標的遺伝子に関連した遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)、ゲノムシグナル伝達中心(GSC)、及び/または絶縁近傍(IN)のうちの1つ以上の構成成分の挙動は、そのようなネットワーク、中心、及び/または近傍を含む系を摂動刺激と接触させることによって変更され得る。潜在的刺激としては、小分子、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪、核酸などの外因性生体分子、または放射線、pH、温度、イオン強度、音、光などの環境刺激を挙げることができる。
本開示は、より良く定義された遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)の明確化だけでなく、結果として生物系に関するより良い理解のための発見ツールとして役立つ。本開示は、潜在的な治療成果の演繹的な予測、遺伝性疾患、障害、または病態の治療、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性の欠失もしくは喪失、または薬物動態的もしくは薬力学的リスクなどの新たな薬物または既知の薬物に関連する1つ以上の治療不利益の低減または除去に関与したことがない新規の化合物または標的の特定を可能にする方法で、遺伝子レベルで遺伝子シグナル伝達を適切に定義する能力を可能にする。
正準細胞シグナル伝達経路の遺伝子発現を変更することによる疾患の治療は、有効であることが示されている。遺伝子発現の小さな変化でさえ、疾患に対して大きな影響を有し得る。例えば、細胞死抑制に影響を及ぼすシグナル伝達経路につながるシグナル伝達中心の変化が疾患に関連している。本開示は、GSNの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、遺伝性疾患を含む疾患に対処するための微調整された機構を提供する。疾患を治療する方法は、その疾患に関連する遺伝子に関与するシグナル伝達中心を修飾することを含み得る。そのような遺伝子は、本明細書に記載される方法を使用して明確化されることを除いて、現在は疾患に関連していない場合がある。
摂動刺激は、小分子、既知の薬物、生物学的刺激、ワクチン、薬草調製物、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド(例えば、siRNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチド)、遺伝子もしくは細胞療法製品、または他の治療製品であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、摂動刺激を加えて、標的遺伝子に関連するGSN、ゲノムシグナル伝達中心、及び/または絶縁近傍を摂動させることを含む。標的遺伝子発現の変化を引き起こす摂動刺激は、関連したGSNの結合性を通知し、関連疾患、障害または病態に対する潜在的な標的及び/または治療を提供することができる。
下流標的
ある特定の実施形態では、遺伝子シグナル伝達ネットワークの遺伝子の下流産生物を標的とする刺激が投与される。代替として、刺激は、少なくとも1つの下流標的の下流発現に影響を及ぼす遺伝子シグナル伝達ネットワークを崩壊させる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、表1に列挙される遺伝子である。
ある特定の実施形態では、遺伝子シグナル伝達ネットワークの遺伝子の下流産生物を標的とする刺激が投与される。代替として、刺激は、少なくとも1つの下流標的の下流発現に影響を及ぼす遺伝子シグナル伝達ネットワークを崩壊させる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、表1に列挙される遺伝子である。
mRNA
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)の摂動は、コヒーシンを含むアンカー部位の喪失に起因して、絶縁近傍の境界を変更することによって単一の遺伝子または複数の遺伝子セットの転写に影響を及ぼし得る。摂動刺激は、RNA発現及び/またはmRNA内の一次転写物中の配列、すなわち、エクソンもしくはスプライシングによって除去されるエクソン、すなわちイントロン間のRNA配列の修飾をもたらし得る。結果として、そのような変化は、遺伝子の遺伝子シグナル伝達ネットワーク内のシグナル伝達分子のセットのメンバーを変更することができ、それによって遺伝子シグナル伝達ネットワークの変異体を定義する。
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)の摂動は、コヒーシンを含むアンカー部位の喪失に起因して、絶縁近傍の境界を変更することによって単一の遺伝子または複数の遺伝子セットの転写に影響を及ぼし得る。摂動刺激は、RNA発現及び/またはmRNA内の一次転写物中の配列、すなわち、エクソンもしくはスプライシングによって除去されるエクソン、すなわちイントロン間のRNA配列の修飾をもたらし得る。結果として、そのような変化は、遺伝子の遺伝子シグナル伝達ネットワーク内のシグナル伝達分子のセットのメンバーを変更することができ、それによって遺伝子シグナル伝達ネットワークの変異体を定義する。
タンパク質
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワークの摂動は、単一の遺伝子またはゲノムシグナル伝達中心の一部である複数の遺伝子セット、ならびにゲノムシグナル伝達中心の下流にあるものの翻訳に影響を及ぼし得る。摂動は、翻訳されたタンパク質の阻害をもたらし得る。
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワークの摂動は、単一の遺伝子またはゲノムシグナル伝達中心の一部である複数の遺伝子セット、ならびにゲノムシグナル伝達中心の下流にあるものの翻訳に影響を及ぼし得る。摂動は、翻訳されたタンパク質の阻害をもたらし得る。
最近傍遺伝子
摂動刺激は、一次近傍遺伝子の上流または下流に位置し得る一次最近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用を引き起こし得る。近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する1つ以上、例えば、1、2、3、4またはそれ以上の上流及び/または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。
摂動刺激は、一次近傍遺伝子の上流または下流に位置し得る一次最近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用を引き起こし得る。近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する1つ以上、例えば、1、2、3、4またはそれ以上の上流及び/または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。
追加の定義
「類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物に構造的に関連し、基準化合物と共通の機能的活性を共有する化合物を指す。
「類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物に構造的に関連し、基準化合物と共通の機能的活性を共有する化合物を指す。
「生物学的」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物、植物、動物、またはヒト細胞などの様々な天然源から作製された医薬製品を指す。
「境界」という用語は、本明細書で使用される場合、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。
「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、単剤もしくはその薬学的に許容される塩、または生物活性剤もしくは薬物を指す。
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物とは構造が異なるが、基準分子の本質的特性を保持する。
「下流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の下流にある遺伝子を指す。
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物、例えば染色体のゲノムアーキテクチャの単位またはセグメントを指す。遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。遺伝子は、連続または非連続ポリヌクレオチドとしてエンコードされ得る。遺伝子は、DNAまたはRNAであり得る。
「ゲノム系アーキテクチャ」という用語は、本明細書で使用される場合、個体のゲノムの組織化を指し、染色体、位相関連ドメイン(TAD)、及び絶縁近傍を含む。
「マスター転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞型特異的エンハンサーを確立する、シグナル伝達分子を指す。マスター転写因子は、他の転写因子などの追加のシグナル伝達タンパク質をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。
「調整する」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子産生物の標的遺伝子及び/または活性の発現における変更(例えば、増加または減少)を指す。
「近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、絶縁近傍内に位置する遺伝子を指す。
「浸透度」という用語は、本明細書で使用される場合、その変異体遺伝子の関連した特性(表現型)も呈する遺伝子の特定の変異体(例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子、または一般遺伝子型)を担持する個体の割合を指し、いくつかの状況では、臨床症状を呈する、したがって連続体上に存在する突然変異を有する個体の割合として測定される。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される(天然または非天然の)アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約50アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長となる。
「一次近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子を指す。
「一次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。
「一次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を定義し、どのDNA鎖が転写されるかを示す転写の方向を定義するDNA配列を指す。
「調節配列領域」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、染色体に沿った領域、区分、または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。
「リプレッサー」という用語は、本明細書で使用される場合、DNAに結合する任意のタンパク質を指し、転写の速度を減少させることによって遺伝子の発現を調節する。
「二次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界を指す。
「二次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界を指す。
「シグナル伝達分子」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、核酸(DNAもしくはRNA)、有機小分子、脂質、糖、または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態を指す。
「シグナル伝達転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞−細胞シグナル伝達分子としても作用する、シグナル伝達分子を指す。
「小分子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、5000ダルトン未満の有機化合物を指す。
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本開示による組成物での治療が提供される動物を指す。
「治療剤」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を治癒するか、または疾患の症状を改善する能力を有する物質を指す。
「治療(therapeutic)または治療(treatment)成果」という用語は、本明細書で使用される場合、GSCまたはGSNの摂動の結果として生じる任意の結果または効果(正、負またはヌル)を指す。治療成果の例には、疾患もしくは障害に関連する望ましくない病態もしくは負の病態の改良もしくは改善、副作用もしくは症状の軽減、疾患もしくは障害の治癒、またはGSCもしくはGSNの摂動に関連する任意の改良が含まれるが、これらに限定されない。
「治療(therapeutic)または治療(treatment)不利益」という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない、有害である、または治療法の正の成果を軽減する治療または治療レジームに関連する特徴または特性を指す。治療不利益の例には、例えば、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性の欠失もしくは喪失、または薬物動態もしくは薬力学的リスクが含まれる。
「上流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の上流にある遺伝子を指す。
正準細胞シグナル伝達経路
当該技術分野において詳述される正準経路と本明細書に定義される遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)との間にいくらかの重複が存在し得、かつそうなる可能性が最も高いことが理解される。
当該技術分野において詳述される正準経路と本明細書に定義される遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)との間にいくらかの重複が存在し得、かつそうなる可能性が最も高いことが理解される。
正準経路は、経路をわたってある程度のメンバーの混乱(クロストーク)を許容するが、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークの(GSN)は、遺伝子レベルにおいて定義され、その遺伝子を発現する細胞、組織、臓器、または臓器系の任意の数の刺激または摂動に基づいて特徴付けられる。したがって、GSNの性質は、構造的(例えば、遺伝子)かつ状況的(例えば、機能、例えば、発現プロファイル)に定義される。また2つの異なる遺伝子シグナル伝達ネットワークは、メンバーを共有し得るが、依然として摂動の性質がそれらを区別し得ることにおいて固有である。したがって、治療的研究及び開発を支持する生物系の機能の明確化における遺伝子シグナル伝達ネットワークの価値。
正準経路と遺伝子シグナル伝達ネットワークとの間の関連付けが、これまで行われたことがないことを意図しないことを理解すべきであり、実際に、反対も同様である。さらなる化学的洞察のための2つのシグナル伝達パラダイムをつなげるために、正準シグナル伝達経路パラダイムを本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークと比較することは有益となるであろう。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、転写(STAT)経路のヤヌスキナーゼ(JAK)/シグナル伝達因子及び活性化因子を変更することを伴う。JAK/STAT経路は、多様なサイトカイン及び増殖因子の主要なメディエーターである。サイトカインは、免疫反応を調整する調節分子である。JAKは、通常はサイトカイン受容体などの細胞表面受容体と関連付けられる細胞内の非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。哺乳動物は、4つのJAK:JAK1、JAK2、JAK3、及びチロシンキナーゼ2(TYK2)を有することが知られている。細胞表面におけるサイトカインまたは増殖因子の、それぞれの受容体への結合は、JAKのトランスリン酸化を開始し、それが下流STATを活性化する。STATは、活性化されるまで細胞質中に常駐する潜伏性転写因子である。7つの哺乳類STAT:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(STAT5A及びSTAT5B)、ならびにSTAT6が存在する。活性化されたSTATは核に転位し、ここでそれらが他の核タンパク質と複合体化し、特定の配列に結合して標的遺伝子の発現を調節する。したがって、JAK/STAT経路は、細胞外シグナルを転写反応に翻訳する直接機序を提供する。JAK/STAT経路によって調節される標的遺伝子は、免疫性、増幅、分化、アポトーシス及び発がんに関与する。JAKの活性化はまた、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路を活性化することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路を変更することを伴う。MAPK経路は、細胞膜における受容体からのシグナルを核に伝達する細胞中のシグナル伝達分子(例えば、Ras、Raf、MEK、及びERK)の鎖を伴う。この経路は、上皮成長因子受容体(EGFR)、Trk A/B、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)及びPDGFRなどの受容体結合チロシンキナーゼによって活性化され得る。MAPKシグナル伝達経路は、細胞ストレス応答、細胞分化、細胞分裂、細胞増殖、炎症、代謝、運動及びアポトーシスを含む多数の細胞過程を調節する上で不可欠である。MAPKは、主要な経路標的:ERK1/2、ERK5、JNK、及びp38キナーゼと相互作用する。MAPKは、C−myc、CREB、及びC−Fosを含むいくつかの転写因子の活性を調節する。MAPKはまた、PI3Kネットワーク、NF−κB、及びJAK/STAT経路などの他の経路と相互作用する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)媒介性シグナル伝達経路を変更することを伴う。PDGFRは、血小板由来成長因子(PDGF)ファミリーのメンバーの細胞表面チロシンキナーゼ受容体である。PDGFRの2つのアイソフォーム、PDGFRα、及びPDGFRβが存在する。2つの受容体アイソフォームは、PDGF二量体に結合すると二量体化し、キナーゼの活性化につながる。PDGFRは、細胞増殖、細胞分化、細胞成長及び発達を調節するために重要である多数のシグナル伝達経路を媒介する。PDGFR媒介シグナル伝達経路の阻害は、PDGF、ang1/2、及びVEGF mRNAの発現の低減と相関している。PDGFは、PI3−K活性化のための既知の刺激であるため、PDGFRを阻害することは、PI3−Kシグナル伝達カスケードの活性化の低下につながり得る。生理学及び医学におけるPDGF及びPDGFRの役割は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Andrae et al.,Genes Dev.2008 May 15;22(10):1276−312でレビューされている。
本開示に従って変更され得る他の正準経路としては、2−アラキドノイルグリセロール生合成経路、2−オキソカルボン酸代謝経路、5HT1型受容体媒介シグナル伝達経路、5HT2型受容体媒介シグナル伝達経路、5HT3型受容体媒介シグナル伝達経路、5HT4型受容体媒介シグナル伝達経路、5−ヒドロキシトリプタミン生合成経路、5−ヒドロキシトリプタミン分解経路、アバカビル輸送及び代謝経路、ABCトランスポーター経路、ABCファミリータンパク質媒介輸送経路、ACE阻害剤経路、酢酸塩利用経路、アセチルコリン合成経路、依存性PKAの活性化経路、アクチビンベータシグナル伝達経路、アデニン及びヒポキサンチンサルベージ経路、アドヘレンスジャンクション経路、アディポサイトカインシグナル伝達経路、脂肪生成経路、アドレナリン及びノルアドレナリン生合成経路、心筋細胞中のアドレナリン作動性シグナル伝達経路、終末糖化産物(age/rage)経路、終末糖化産物受容体シグナル伝達経路、アフラトキシンb1代謝経路、age/rage経路、AHR経路、AKTシグナル伝達経路、アラニン及びアスパラギン酸塩代謝経路、アラニン生合成経路、アルドステロン合成及び分泌経路、アルドステロン調節ナトリウム再吸収経路、アラントイン分解経路、同種移植片拒絶経路、全トランス型レチノイン酸シグナル伝達経路、alp23bシグナル伝達経路、アルファ6ベータ4シグナル伝達経路、アルファアドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、アルファ6ベータ4インテグリン経路、アルファ−リノレン酸代謝経路、アルツハイマー病−アミロイドセクレターゼ経路、アルツハイマー病−プレセニリン経路、アミノ酸抱合経路、アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝経路、アミノアシル−tRNA生合成経路、アミノ酪酸塩分解経路、AMP活性化プロテインキナーゼ経路、AMPKシグナル伝達経路、アナンダミド生合成経路、アナンダミド分解経路、アンドロゲン受容体シグナル伝達経路、アンドロゲン/エストロゲン/プロゲステロン生合成経路、血管新生経路、アンジオポエチン−Tie2シグナル伝達経路、gタンパク質によるアンジオテンシンII刺激シグナル伝達及びベータ−アレスチン経路、MHCによる抗原プロセッシング及び提示経路、アポトーシス調整及びシグナル伝達経路、HSP70によるアポトーシス調整経路、アポトーシスシグナル伝達経路、細胞死受容体によるアポトーシス経路、アポトーシス実行段階経路、アラキドン酸エポキシゲナーゼ/エポキシドヒドロラーゼ経路、アラキドン酸代謝経路、アルギニン及びプロリン代謝経路、アルギニン生合成経路、アリピプラゾール代謝経路、アリールアミン代謝経路、アスコルビン酸塩及びアルダレート(aldarate)代謝経路、アスコルビン酸塩分解経路、アスパラギン及びアスパラギン酸塩生合成経路、アスパラギンN結合グリコシル化経路、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩代謝経路、RNAポリメラーゼ−II開始複合体のアセンブリ経路、ATM経路、ATP合成経路、軸索ガイダンス経路、ネトリン介在性の軸索ガイダンス経路、セマフォリン介在性の軸索ガイダンス経路、slit/robo介在性の軸索ガイダンス経路、B細胞活性化経路、B細胞受容体(BCR)経路、B細胞受容体シグナル伝達経路、上皮細胞の細菌侵入経路、基本転写因子経路、塩基除去修復経路、B細胞発生経路、B細胞受容体経路、B細胞受容体複合体経路、ベンゾ経路、ベータ1アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ2アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ3アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ−アラニン代謝経路、胆汁酸及び胆汁塩代謝経路、胆汁分泌経路、スカベンジャー受容体によるリガンドの結合及び取り込み経路、生体アミン合成経路、アミノ酸の生合成経路、不飽和脂肪酸の生合成経路、ビオチン生合成経路、ブレイクリー(blakely)ネットワーク経路、凝血カスケード経路、血液凝固経路、bmp/アクチビンシグナル伝達−ショウジョウバエ経路、骨形態形成タンパク質経路、脳由来神経栄養因子(BDNF)経路、BRCA1経路、ブプロピオン分解経路、ブタン酸塩代謝経路、ブチロシン及びネオマイシン生合成経路、酪酸塩誘発ヒストンアセチル化経路、カドヘリンシグナル伝達経路、カフェイン代謝経路、心細胞中のカルシウム調節経路、カルシウムシグナル伝達経路、cAMP経路、炭水化物消化及び吸収経路、炭素代謝経路、心筋収縮経路、心筋前駆細胞分化経路、カルニチン代謝経路、カスパーゼカスケード経路、哺乳動物フラビン含有モノオキシゲナーゼの触媒サイクル経路、CCKRシグナル伝達マップ経路、マクロファージ中のCCR5経路、CD4及びCD8 T細胞系統経路、CD40シグナル伝達経路、CDK5経路、細胞接着分子(cam)経路、細胞周期チェックポイント経路、細胞周期経路、細胞分化−メタ経路、細胞結合組織化経路、血管壁における細胞表面相互作用経路、CGMP−PKGシグナル伝達経路、化学発がん経路、ケモカインシグナル伝達経路、コレステロール生合成経路、コリン作動性シナプス経路、コリスミ酸塩生合成経路、クロマチンリモデリング経路、サーカディアンクロック系経路、サーカディアン同調経路、クエン酸回路(TCA回路)経路、c−met経路、コバラミン生合成経路、コデイン及びモルヒネ代謝経路、コエンザイムA生合成経路、コエンザイムA結合カルニチン代謝経路、コルヒチン代謝経路、集合管酸分泌経路、補体及び凝固カスケード経路、コリ回路経路、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)経路、CD28ファミリーによる共刺激経路、CREB経路、CTL媒介性アポトーシス経路、CTLA4シグナル伝達経路、シアノアミノ酸代謝経路、サイクリン及び細胞周期調節経路、システイン及びメチオニン代謝経路、システイン生合成経路、サイトカインネットワーク経路、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用経路、サイトカイン及び炎症反応経路、細胞質リボソームタンパク質経路、rho GTPaseによる細胞骨格調節経路、細胞質DNAセンシング経路、デノボプリン生合成経路、デノボピリミジンデオキシリボヌクレオチド生合成経路、デノボピリミジンリボヌクレオチド生合成経路、カルシウムチャネルの開口を誘発するシナプス前終末の脱分極経路、ジクロフェナク代謝経路、分化経路、難消化性炭水化物代謝経路、拡張型心筋症経路、フィブリン塊の溶解経路、サーカディアンオルソログで日中調節された遺伝子経路、div色なし(div no colors)経路、div経路、DNA損傷バイパス経路、DNA損傷反応経路、DNA損傷回復経路、DNAメチル化及び転写抑制経路、DNA修復機構経路、DNA複製経路、ドーパミン代謝経路、ドーパミン受容体媒介シグナル伝達経路、ドーパミン作動性シナプス経路、背腹軸形成経路、DPPシグナル伝達経路、DPP−SCWシグナル伝達経路、薬物代謝経路、薬物代謝−シトクロムp450経路、dscam相互作用経路、E2F/MIRHG1フィードバック−ループ欠失経路、EBV LMP1シグナル伝達経路、ECM受容体相互作用経路、一酸化窒素作用経路、pip2加水分解作用経路、EGF経路、EGF受容体シグナル伝達経路、エイコサノイド合成経路、電子伝達系経路、軟骨内骨化経路、内分泌及び他の因子調節性カルシウム再吸収経路、エンドサイトーシス経路、内胚葉分化経路、内因性カンナビノイドシグナル伝達経路、エンドセリン経路、エンドセリンシグナル伝達経路、エネルギー代謝経路、エンケファリン放出経路、enosシグナル伝達経路、エフリン−EPHRシグナル伝達経路、上皮成長因子受容体(EGFR)経路、helicobacter pylori感染における上皮細胞シグナル伝達経路、上皮密着結合経路、EPO受容体シグナル伝達経路、ERBBシグナル伝達経路、ERKシグナル伝達経路、エリスロポエチン経路、エストロゲンシグナル伝達経路、エーテル脂質代謝経路、真核生物転写開始経路、真核生物翻訳伸長経路、真核生物翻訳開始経路、真核生物翻訳終止経路、FAK1シグナル伝達経路、Fasシグナル伝達経路、脂肪消化及び吸収経路、脂肪酸経路、脂肪酸ベータ酸化経路、脂肪酸生合成経路、脂肪酸分解経路、脂肪酸伸長経路、脂肪酸代謝経路、脂肪酸オメガ酸化経路、FGF経路、FGFシグナル伝達経路、繊維芽細胞成長因子−1(FGF1)経路、フラビン生合成経路、FLT3シグナル伝達経路、フルオロピリミジン活性経路、接着斑経路、葉酸生合成経路、葉酸代謝経路、卵胞刺激ホルモン経路、フィブリン塊形成経路、ホルミルテトラヒドロギ酸生合成経路、Foxoシグナル伝達経路、フルクトースガラクトース代謝経路、Gタンパク質シグナル伝達経路、G1−S細胞周期制御経路、G13シグナル伝達経路、GABA合成経路、GABA−B受容体IIシグナル伝達経路、ガラクトース代謝経路、ガンマ−アミノ酪酸合成経路、ガングリオスフィンゴ脂質代謝経路、ギャップ結合トラフィッキング及び調節経路、胃酸分泌経路、ガストリン経路、GBBシグナル伝達経路、一般的転写経路、グレリン経路、グリア細胞分化経路、グロボスフィンゴ脂質代謝経路、グルコガンシグナル伝達経路、グルココルチコイド及びミネラルコルチコイド代謝経路、グルココルチコイド受容体シグナル伝達経路、グルコース恒常性経路、グルクロン酸抱合経路、グルタミン酸作動性シナプス経路、グルタミングルタミン酸塩変換経路、グルタチオン代謝経路、グリカン分解経路、グリセロ脂質代謝経路、グリセロリン脂質生合成経路、グリセロリン脂質代謝経路、グリシン代謝経路、グリコーゲン代謝経路、解糖/糖新生経路、グリコサミノグリカン生合成−ヘパラン硫酸/ヘパリン経路、グリコサミノグリカン生合成−ケラタン硫酸経路、グリコサミノグリカン分解経路、グリコサミノグリカン代謝経路、スフィンゴ糖脂質生合成−ガングリオ系経路、スフィンゴ糖脂質生合成−グロボ系経路、スフィンゴ糖脂質生合成−ラクト及びネオラクト系経路、グリオキシル酸及びジカルボン酸代謝経路、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体経路、GP1B−IX−V活性化シグナル伝達経路、GPCR経路、GPCR下流シグナル伝達経路、GPCRリガンド結合経路、GPVI媒介性活性化カスケード経路、顆粒球接着及び血管外遊出経路、グランザイム経路、成長ホルモンシグナル伝達経路、GSK 3シグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、多能性幹細胞からの造血経路、造血細胞系統経路、造血幹細胞分化経路、ヘム生合成経路、B型肝炎経路、C型肝炎経路、ヘテロ三量体Gタンパク質シグナル伝達−Giアルファ及びGsアルファ媒介性経路、ヘテロ三量体gタンパク質シグナル伝達−桿体外節光シグナル伝達経路、ヘキソース輸送経路、HGF経路、HIF−1シグナル伝達経路、hippoシグナル伝達経路、ヒスタミンh1受容体媒介シグナル伝達経路、ヒスタミンh2受容体媒介シグナル伝達経路、ヒスタミン合成経路、ヒスチジン生合成経路、ヒストン修飾経路、相同組換え経路、HTLV−I感染経路、ヒト補体系経路、hif活性化を介した低酸素応答経路、IDシグナル伝達経路、IGF1Rシグナル伝達経路、IL1及び肥満における巨核細胞経路、IL−1シグナル伝達経路、IL−10経路、IL17シグナル伝達経路、IL−2シグナル伝達経路、IL−22経路、IL−3シグナル伝達経路、IL−4シグナル伝達経路、IL−5シグナル伝達経路、IL−6経路、IL−7シグナル伝達経路、IL−9シグナル伝達経路、ILKシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインシグナル伝達によって媒介される炎症経路、Trpチャネルの炎症メディエーター調節経路、
炎症反応経路、A型インフルエンザウイルス感染経路、inosシグナル伝達経路、イノシトールリン酸代謝経路、インスリン受容体経路、インスリン抵抗性経路、インスリン分泌経路、インスリン/IGF−プロテインキナーゼbシグナル伝達カスケード経路、インスリン様成長因子−2 mRNA結合タンパク質経路、インテグリンアルファIIbベータ3シグナル伝達経路、インテグリン細胞シグナル伝達経路、インテグリン細胞表面相互作用経路、インテグリン媒介性細胞接着経路、インターフェロン経路、インターフェロンアルファ/ベータシグナル伝達経路、インターフェロン型Iシグナル伝達経路、インターフェロン−ガンマシグナル伝達経路、インターロイキンシグナル伝達経路、インターロイキン−1(IL−1)経路、インターロイキン−1プロセシング経路、インターロイキン−11シグナル伝達経路、インターロイキン−2(IL−2)経路、インターロイキン−3経路、インターロイキン−4(IL−4)経路、インターロイキン−5(IL−5)経路、インターロイキン−6(IL−6)経路、インターロイキン−7(IL−7)経路、インターロイキン−9(il−9)経路、細胞内カルシウムシグナル伝達経路、イオンチャネル型グルタミン酸受容体経路、IP3経路、イソロイシン生合成経路、JAK/STAT経路、JNK経路、キネシン経路、KIT受容体経路、アテローム形成におけるLDL酸化経路、レプチン(lep)経路、レプチンシグナル伝達経路、ロイシン生合成経路、白血球経内皮遊走経路、リノール酸代謝経路、脂質消化経路、リポ酸塩_生合成経路、寿命調節−哺乳動物経路、寿命調節−複数種経路、長期増強経路、リシン生合成経路、リシン分解経路、リソソーム経路、マンノース代謝経路、MAPKカスケード経路、MAPキナーゼによって媒介されるMAPK標的/核事象経路、マトリックスメタロプロテアーゼ経路、メラトニン代謝及び作用経路、メタ生体内変化経路、炭水化物の代謝経路、一酸化窒素の代謝経路、ヌクレオチドの代謝経路、ポルフィリンの代謝経路、水溶性ビタミン及び共因子の代謝経路、シトクロムp450による生体外物質の代謝経路、代謝型グルタミン酸受容体グループI経路、代謝型グルタミン酸受容体グループII経路、代謝型グルタミン酸受容体グループIII経路、メチオニン生合成経路、メチル化経路、メチルクエン酸回路経路、メチルマロニル経路、ミネラル吸収経路、miRNA生物発生経路、ミスマッチ修復経路、ミトコンドリアアポトーシス経路、ミトコンドリア遺伝子発現経路、ミトコンドリアlc−脂肪酸ベータ−酸化経路、有糸分裂G1−G1/S期経路、有糸分裂G2−G2/M期経路、モノアミンGPCR経路、モノアミン輸送経路、mRNAキャッピング経路、mRNA編集経路、mRNAプロセシング経路、mRNAスプライシング経路、mRNA監視経路、mTORシグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体1及び3シグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体2及び4シグナル伝達経路、筋形成経路、子宮筋弛緩及び収縮経路、N−アセチルグルコサミン代謝経路、NAD生合成II経路、ナノ物質誘発性アポトーシス経路、ナノ粒子誘起性オートファジー細胞死経路、ナノ粒子誘起性の調節されたネクローシス経路、ナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性経路、神経突起伸長のためのncamシグナル伝達経路、ネフリン相互作用経路、ネトリン−1シグナル伝達経路、神経堤分化経路、神経活性リガンド受容体相互作用経路、シナプス間隙における神経伝達物質クリアランス経路、神経伝達物質放出サイクル経路、グリア細胞における神経伝達物質取り込み及び代謝経路、神経栄養因子シグナル伝達経路、NFAT及び心肥大経路、NF−カッパbシグナル伝達経路、NF−カッパbシグナル伝達経路、NGF経路、原形質膜からのTRKAを介したNGFシグナル伝達経路、N−グリカン生合成経路、ニコチン酸塩及びニコチンアミド代謝経路、クロム親和性細胞上のニコチン活性経路、ドーパミン作動性ニューロン上のニコチン活性経路、ニコチン分解経路、ニコチン代謝経路、ニコチン薬力学的経路、ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル伝達経路、ニフェジピン活性経路、窒素代謝経路、NLRタンパク質経路、nod様受容体シグナル伝達経路、非相同末端結合経路、notchシグナル伝達経路、Nrf2経路、核受容体経路、ヌクレオソームアセンブリ経路、ヌクレオチド除去修復経路、ヌクレオチドGPCR経路、ヌクレオチド代謝経路、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン経路、o−抗原生合成経路、o−グリカン生合成経路、嗅覚伝達経路、オンコスタンチンmシグナル伝達経路、1炭素代謝経路、オピオイドプロダイノルフィン経路、オピオイドプロエンケファリン経路、オピオイドプロオピオメラノコルチン経路、オルニチン分解経路、骨芽細胞シグナル伝達経路、破骨細胞シグナル伝達経路、オステオポンチンシグナル伝達経路、卵巣ステロイド産生経路、シトクロムp450による酸化経路、酸化的リン酸化経路、酸化ストレス経路、オキシトシン受容体媒介シグナル伝達経路、オキシトシンシグナル伝達経路、p38 MAPKシグナル伝達経路、p53フィードバックループ1経路、p53フィードバックループ2経路、p53媒介性アポトーシス経路、p53シグナル伝達経路、pak経路、膵臓分泌経路、パントテン酸塩生合成経路、パーキン−ユビキチンプロテアソーム系経路、アクアポリンによる受動輸送経路、PDGFシグナル伝達経路、ペントース及びグルクロン酸相互変換経路、ペントースリン酸経路、ペプチドGPCR経路、ペプチドグリカン生合成経路、テトラコサノイル−coAのペルオキシゾームベータ−酸化経路、ペルオキシゾーム脂質代謝経路、百日咳経路、ファゴソーム経路、化合物の第I相機能化経路、第I相生体内変化経路、第II相抱合経路、フェニル酢酸分解経路、フェニルアラニン生合成経路、フェニルアラニン 代謝経路、フェニルエチルアミン分解経路、フェニルプロピオン酸分解経路、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系経路、ホスホリパーゼDシグナル伝達経路、光シグナル伝達経路、PI3キナーゼ経路、Bリンパ球におけるPI3Kシグナル伝達経路、PI3K−AKTシグナル伝達経路、PIP3活性化AKTシグナル伝達経路、プラスミノーゲン活性化カスケード経路、血小板活性化経路、露出したコラーゲンへの血小板接着経路、血小板凝集経路、血小板恒常性経路、ポリオール経路、ポルフィリン及びクロロフィル代謝経路、PPARシグナル伝達経路、一次胆汁酸生合成経路、原発性巣状分節性糸球体硬化症FSG経路、キャッピングされたイントロン含有プレmRNAのプロセッシング経路、キャッピングされたイントロン無しのプレmRNAのプロセッシング経路、プロゲステロン媒介性卵成熟経路、プロラクチンシグナル伝達経路、プロリン生合成経路、プロパン酸代謝経路、プロスタグランジン合成及び調節経路、プロテアソーム経路、プロテアソーム 分解経路、タンパク質消化及び吸収経路、タンパク質排出経路、タンパク質折り畳み経路、近位尿細管重炭酸再生経路、PRPP生合成経路、PTEN経路、プリン代謝経路、ピリドキサールリン酸サルベージ経路、ピリドキサール−5−リン酸生合成経路、ピリミジン代謝経路、ピルビン酸代謝経路、rac1経路、破骨細胞におけるrankシグナル伝達経路、rankl/rank経路、rap1シグナル伝達経路、rasシグナル伝達経路、Ras−RAF−MEK−ERK経路、核因子カッパ−bリガンドの受容体活性化因子(RANKL)経路、アクチン細胞骨格の調節経路、アポトーシスの調節経路、オートファジーの調節経路、DNA複製の調節経路、脂肪細胞における脂肪分解の調節経路、微小管細胞骨格の調節経路、toll様受容体シグナル伝達の調節経路、接着結合のリモデリング経路、レニン分泌経路、レニン−アンジオテンシン系経路、呼吸電子輸送経路、レチノール代謝経路、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達経路、RhoファミリーGTPase経路、Rhoa経路、真核生物におけるリボソーム生物発生経路、RIG−I様受容体シグナル伝達経路、RNA分解経路、RNAポリメラーゼI経路、RNAポリメラーゼII転写経路、RNA輸送経路、RNAi経路、s−アデノシルメチオニン生合成経路、唾液分泌経路、サルベージピリミジンデオキシリボヌクレオチド経路、サルベージピリミジンリボヌクレオチド経路、SCWシグナル伝達経路、セレン代謝及びセレノプロテイン経路、セレン微量栄養素ネットワーク経路、セレン化合物代謝経路、セマフォリン相互作用経路、セリン及びトレオニン代謝経路、セリングリシン生合成経路、セロトニン作動性シナプス経路、セロトニンhtr1グループ及びfos経路、セロトニン受容体2及びELK−SRF/gata4シグナル伝達経路、セロトニン受容体2及びSTAT3シグナル伝達経路、セロトニン受容体4/6/7及びNR3Cシグナル伝達経路、セロトニン輸送体活性経路、シグナル増幅経路、シグナル調節タンパク質経路、S1P受容体のシグナル変換経路、EGFRによるシグナル伝達経路、インスリン受容体によるシグナル伝達経路、PDGFによるシグナル伝達経路、rho GTPaseによるシグナル伝達経路、robo受容体によるシグナル伝達経路、VEGFによるシグナル伝達経路、ギャップ結合におけるシグナル伝達経路、肝細胞成長因子受容体のシグナル伝達経路、幹細胞のシグナル伝達調節多能性経路、膠芽腫におけるシグナル伝達経路、NGFによるシグナル伝達経路、SMADシグナル伝達ネットワーク経路、小リガンドGPCR経路、小胞輸送におけるSNARE相互作用経路、スフィンゴ脂質(SM)シグナル伝達経路、スフィンゴ脂質代謝経路、スプライセオソーム経路、デンプン及びスクロース代謝経路、statシグナル伝達経路、STAT3経路、スタチン経路、ステロイド生合成経路、ステロイドホルモン生合成経路、ステロール調節エレメント結合タンパク質経路、横紋筋収縮経路、コハク酸からプロピオン酸への変換経路、硫酸同化経路、硫酸化生体内変化反応経路、硫黄代謝経路、硫黄リレー系経路、sumo経路、シナプス小胞経路、ケトン体の合成及び分解経路、DNAの合成経路、T細胞受容体(TCR)経路、タモキシフェン代謝経路、tarbase経路、ラパマイシンの標的経路、味覚情報変換経路、タウリン及びヒポタウリン代謝経路、TCA及び尿素回路経路、T細胞抗原受容体経路、T細胞受容体及び共刺激シグナル伝達経路、テロメア維持経路、テルペノイド骨格生合成経路、テトラヒドロ葉酸生合成経路、心肥大に関連するTFS調節miRNA経路、TGF−ベータ経路、TGF−ベータ受容体シグナル伝達経路、THC分化経路、チアミン生合成経路、チアミン代謝経路、トレオニン生合成経路、胸腺間質性リンパ球新生因子経路、胸腺間質性リンパ球新生因子(tslp)経路、甲状腺刺激ホルモン(tsh)経路、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体シグナル伝達経路、tie2/tekシグナル伝達経路、密着結合経路、TNFアルファシグナル伝達経路、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子経路、TNFシグナル伝達経路、TNFスーパーファミリー経路、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子(tweak)経路、toll受容体シグナル伝達経路、toll様受容体経路、TP53ネットワーク経路、Traf経路、trail経路、bzip転写因子による転写調節経路、Nrf2による転写活性化経路、白血球の経内皮遊走経路、形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)受容体経路、翻訳因子経路、電気シナプスにわたる伝達経路、グルコース及び他の糖の輸送経路、アクアポリンによる脂肪細胞から肝臓へのグリセロールの輸送経路、ビタミンの輸送経路、トランス硫化経路、トランス硫化経路及び1炭素代謝経路、トリアシルグリセリド合成経路、トリアシルグリセロール代謝経路、tRNAアミノアシル化経路、トリプトファン生合成経路、トリプトファン代謝経路、腫瘍壊死因子(TNF)アルファ経路、
肝NK細胞の殺腫瘍作用経路、tweak経路、II型糖尿病経路、II型インターフェロンシグナル伝達経路、III型インターフェロンシグナル伝達経路、チロシン及びトリプトファン生合成経路、チロシン生合成経路、チロシン代謝経路、ユビキノン及び他のテルペノイド−キノン生合成経路、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路、ユビキチンプロテアソーム経路、折り畳まれていないタンパク質応答経路、アミノ基の尿素回路及び代謝経路、バリン生合成経路、血管平滑筋収縮経路、バソプレシン合成経路、バソプレシン調節水再吸収経路、VEGFシグナル伝達経路、ビタミンa及びカロテノイド代謝経路、ビタミンb12代謝経路、ビタミンb6生合成経路、ビタミンb6代謝経路、ビタミンd代謝経路、ビタミン消化及び吸収経路、Wntシグナル伝達経路、キサンチン及びグアニンサルベージ経路、ならびに/または亜鉛恒常性経路が挙げられるが、これらに限定されない。
炎症反応経路、A型インフルエンザウイルス感染経路、inosシグナル伝達経路、イノシトールリン酸代謝経路、インスリン受容体経路、インスリン抵抗性経路、インスリン分泌経路、インスリン/IGF−プロテインキナーゼbシグナル伝達カスケード経路、インスリン様成長因子−2 mRNA結合タンパク質経路、インテグリンアルファIIbベータ3シグナル伝達経路、インテグリン細胞シグナル伝達経路、インテグリン細胞表面相互作用経路、インテグリン媒介性細胞接着経路、インターフェロン経路、インターフェロンアルファ/ベータシグナル伝達経路、インターフェロン型Iシグナル伝達経路、インターフェロン−ガンマシグナル伝達経路、インターロイキンシグナル伝達経路、インターロイキン−1(IL−1)経路、インターロイキン−1プロセシング経路、インターロイキン−11シグナル伝達経路、インターロイキン−2(IL−2)経路、インターロイキン−3経路、インターロイキン−4(IL−4)経路、インターロイキン−5(IL−5)経路、インターロイキン−6(IL−6)経路、インターロイキン−7(IL−7)経路、インターロイキン−9(il−9)経路、細胞内カルシウムシグナル伝達経路、イオンチャネル型グルタミン酸受容体経路、IP3経路、イソロイシン生合成経路、JAK/STAT経路、JNK経路、キネシン経路、KIT受容体経路、アテローム形成におけるLDL酸化経路、レプチン(lep)経路、レプチンシグナル伝達経路、ロイシン生合成経路、白血球経内皮遊走経路、リノール酸代謝経路、脂質消化経路、リポ酸塩_生合成経路、寿命調節−哺乳動物経路、寿命調節−複数種経路、長期増強経路、リシン生合成経路、リシン分解経路、リソソーム経路、マンノース代謝経路、MAPKカスケード経路、MAPキナーゼによって媒介されるMAPK標的/核事象経路、マトリックスメタロプロテアーゼ経路、メラトニン代謝及び作用経路、メタ生体内変化経路、炭水化物の代謝経路、一酸化窒素の代謝経路、ヌクレオチドの代謝経路、ポルフィリンの代謝経路、水溶性ビタミン及び共因子の代謝経路、シトクロムp450による生体外物質の代謝経路、代謝型グルタミン酸受容体グループI経路、代謝型グルタミン酸受容体グループII経路、代謝型グルタミン酸受容体グループIII経路、メチオニン生合成経路、メチル化経路、メチルクエン酸回路経路、メチルマロニル経路、ミネラル吸収経路、miRNA生物発生経路、ミスマッチ修復経路、ミトコンドリアアポトーシス経路、ミトコンドリア遺伝子発現経路、ミトコンドリアlc−脂肪酸ベータ−酸化経路、有糸分裂G1−G1/S期経路、有糸分裂G2−G2/M期経路、モノアミンGPCR経路、モノアミン輸送経路、mRNAキャッピング経路、mRNA編集経路、mRNAプロセシング経路、mRNAスプライシング経路、mRNA監視経路、mTORシグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体1及び3シグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体2及び4シグナル伝達経路、筋形成経路、子宮筋弛緩及び収縮経路、N−アセチルグルコサミン代謝経路、NAD生合成II経路、ナノ物質誘発性アポトーシス経路、ナノ粒子誘起性オートファジー細胞死経路、ナノ粒子誘起性の調節されたネクローシス経路、ナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性経路、神経突起伸長のためのncamシグナル伝達経路、ネフリン相互作用経路、ネトリン−1シグナル伝達経路、神経堤分化経路、神経活性リガンド受容体相互作用経路、シナプス間隙における神経伝達物質クリアランス経路、神経伝達物質放出サイクル経路、グリア細胞における神経伝達物質取り込み及び代謝経路、神経栄養因子シグナル伝達経路、NFAT及び心肥大経路、NF−カッパbシグナル伝達経路、NF−カッパbシグナル伝達経路、NGF経路、原形質膜からのTRKAを介したNGFシグナル伝達経路、N−グリカン生合成経路、ニコチン酸塩及びニコチンアミド代謝経路、クロム親和性細胞上のニコチン活性経路、ドーパミン作動性ニューロン上のニコチン活性経路、ニコチン分解経路、ニコチン代謝経路、ニコチン薬力学的経路、ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル伝達経路、ニフェジピン活性経路、窒素代謝経路、NLRタンパク質経路、nod様受容体シグナル伝達経路、非相同末端結合経路、notchシグナル伝達経路、Nrf2経路、核受容体経路、ヌクレオソームアセンブリ経路、ヌクレオチド除去修復経路、ヌクレオチドGPCR経路、ヌクレオチド代謝経路、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン経路、o−抗原生合成経路、o−グリカン生合成経路、嗅覚伝達経路、オンコスタンチンmシグナル伝達経路、1炭素代謝経路、オピオイドプロダイノルフィン経路、オピオイドプロエンケファリン経路、オピオイドプロオピオメラノコルチン経路、オルニチン分解経路、骨芽細胞シグナル伝達経路、破骨細胞シグナル伝達経路、オステオポンチンシグナル伝達経路、卵巣ステロイド産生経路、シトクロムp450による酸化経路、酸化的リン酸化経路、酸化ストレス経路、オキシトシン受容体媒介シグナル伝達経路、オキシトシンシグナル伝達経路、p38 MAPKシグナル伝達経路、p53フィードバックループ1経路、p53フィードバックループ2経路、p53媒介性アポトーシス経路、p53シグナル伝達経路、pak経路、膵臓分泌経路、パントテン酸塩生合成経路、パーキン−ユビキチンプロテアソーム系経路、アクアポリンによる受動輸送経路、PDGFシグナル伝達経路、ペントース及びグルクロン酸相互変換経路、ペントースリン酸経路、ペプチドGPCR経路、ペプチドグリカン生合成経路、テトラコサノイル−coAのペルオキシゾームベータ−酸化経路、ペルオキシゾーム脂質代謝経路、百日咳経路、ファゴソーム経路、化合物の第I相機能化経路、第I相生体内変化経路、第II相抱合経路、フェニル酢酸分解経路、フェニルアラニン生合成経路、フェニルアラニン 代謝経路、フェニルエチルアミン分解経路、フェニルプロピオン酸分解経路、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系経路、ホスホリパーゼDシグナル伝達経路、光シグナル伝達経路、PI3キナーゼ経路、Bリンパ球におけるPI3Kシグナル伝達経路、PI3K−AKTシグナル伝達経路、PIP3活性化AKTシグナル伝達経路、プラスミノーゲン活性化カスケード経路、血小板活性化経路、露出したコラーゲンへの血小板接着経路、血小板凝集経路、血小板恒常性経路、ポリオール経路、ポルフィリン及びクロロフィル代謝経路、PPARシグナル伝達経路、一次胆汁酸生合成経路、原発性巣状分節性糸球体硬化症FSG経路、キャッピングされたイントロン含有プレmRNAのプロセッシング経路、キャッピングされたイントロン無しのプレmRNAのプロセッシング経路、プロゲステロン媒介性卵成熟経路、プロラクチンシグナル伝達経路、プロリン生合成経路、プロパン酸代謝経路、プロスタグランジン合成及び調節経路、プロテアソーム経路、プロテアソーム 分解経路、タンパク質消化及び吸収経路、タンパク質排出経路、タンパク質折り畳み経路、近位尿細管重炭酸再生経路、PRPP生合成経路、PTEN経路、プリン代謝経路、ピリドキサールリン酸サルベージ経路、ピリドキサール−5−リン酸生合成経路、ピリミジン代謝経路、ピルビン酸代謝経路、rac1経路、破骨細胞におけるrankシグナル伝達経路、rankl/rank経路、rap1シグナル伝達経路、rasシグナル伝達経路、Ras−RAF−MEK−ERK経路、核因子カッパ−bリガンドの受容体活性化因子(RANKL)経路、アクチン細胞骨格の調節経路、アポトーシスの調節経路、オートファジーの調節経路、DNA複製の調節経路、脂肪細胞における脂肪分解の調節経路、微小管細胞骨格の調節経路、toll様受容体シグナル伝達の調節経路、接着結合のリモデリング経路、レニン分泌経路、レニン−アンジオテンシン系経路、呼吸電子輸送経路、レチノール代謝経路、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達経路、RhoファミリーGTPase経路、Rhoa経路、真核生物におけるリボソーム生物発生経路、RIG−I様受容体シグナル伝達経路、RNA分解経路、RNAポリメラーゼI経路、RNAポリメラーゼII転写経路、RNA輸送経路、RNAi経路、s−アデノシルメチオニン生合成経路、唾液分泌経路、サルベージピリミジンデオキシリボヌクレオチド経路、サルベージピリミジンリボヌクレオチド経路、SCWシグナル伝達経路、セレン代謝及びセレノプロテイン経路、セレン微量栄養素ネットワーク経路、セレン化合物代謝経路、セマフォリン相互作用経路、セリン及びトレオニン代謝経路、セリングリシン生合成経路、セロトニン作動性シナプス経路、セロトニンhtr1グループ及びfos経路、セロトニン受容体2及びELK−SRF/gata4シグナル伝達経路、セロトニン受容体2及びSTAT3シグナル伝達経路、セロトニン受容体4/6/7及びNR3Cシグナル伝達経路、セロトニン輸送体活性経路、シグナル増幅経路、シグナル調節タンパク質経路、S1P受容体のシグナル変換経路、EGFRによるシグナル伝達経路、インスリン受容体によるシグナル伝達経路、PDGFによるシグナル伝達経路、rho GTPaseによるシグナル伝達経路、robo受容体によるシグナル伝達経路、VEGFによるシグナル伝達経路、ギャップ結合におけるシグナル伝達経路、肝細胞成長因子受容体のシグナル伝達経路、幹細胞のシグナル伝達調節多能性経路、膠芽腫におけるシグナル伝達経路、NGFによるシグナル伝達経路、SMADシグナル伝達ネットワーク経路、小リガンドGPCR経路、小胞輸送におけるSNARE相互作用経路、スフィンゴ脂質(SM)シグナル伝達経路、スフィンゴ脂質代謝経路、スプライセオソーム経路、デンプン及びスクロース代謝経路、statシグナル伝達経路、STAT3経路、スタチン経路、ステロイド生合成経路、ステロイドホルモン生合成経路、ステロール調節エレメント結合タンパク質経路、横紋筋収縮経路、コハク酸からプロピオン酸への変換経路、硫酸同化経路、硫酸化生体内変化反応経路、硫黄代謝経路、硫黄リレー系経路、sumo経路、シナプス小胞経路、ケトン体の合成及び分解経路、DNAの合成経路、T細胞受容体(TCR)経路、タモキシフェン代謝経路、tarbase経路、ラパマイシンの標的経路、味覚情報変換経路、タウリン及びヒポタウリン代謝経路、TCA及び尿素回路経路、T細胞抗原受容体経路、T細胞受容体及び共刺激シグナル伝達経路、テロメア維持経路、テルペノイド骨格生合成経路、テトラヒドロ葉酸生合成経路、心肥大に関連するTFS調節miRNA経路、TGF−ベータ経路、TGF−ベータ受容体シグナル伝達経路、THC分化経路、チアミン生合成経路、チアミン代謝経路、トレオニン生合成経路、胸腺間質性リンパ球新生因子経路、胸腺間質性リンパ球新生因子(tslp)経路、甲状腺刺激ホルモン(tsh)経路、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体シグナル伝達経路、tie2/tekシグナル伝達経路、密着結合経路、TNFアルファシグナル伝達経路、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子経路、TNFシグナル伝達経路、TNFスーパーファミリー経路、アポトーシスのTNF関連弱誘導因子(tweak)経路、toll受容体シグナル伝達経路、toll様受容体経路、TP53ネットワーク経路、Traf経路、trail経路、bzip転写因子による転写調節経路、Nrf2による転写活性化経路、白血球の経内皮遊走経路、形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)受容体経路、翻訳因子経路、電気シナプスにわたる伝達経路、グルコース及び他の糖の輸送経路、アクアポリンによる脂肪細胞から肝臓へのグリセロールの輸送経路、ビタミンの輸送経路、トランス硫化経路、トランス硫化経路及び1炭素代謝経路、トリアシルグリセリド合成経路、トリアシルグリセロール代謝経路、tRNAアミノアシル化経路、トリプトファン生合成経路、トリプトファン代謝経路、腫瘍壊死因子(TNF)アルファ経路、
肝NK細胞の殺腫瘍作用経路、tweak経路、II型糖尿病経路、II型インターフェロンシグナル伝達経路、III型インターフェロンシグナル伝達経路、チロシン及びトリプトファン生合成経路、チロシン生合成経路、チロシン代謝経路、ユビキノン及び他のテルペノイド−キノン生合成経路、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路、ユビキチンプロテアソーム経路、折り畳まれていないタンパク質応答経路、アミノ基の尿素回路及び代謝経路、バリン生合成経路、血管平滑筋収縮経路、バソプレシン合成経路、バソプレシン調節水再吸収経路、VEGFシグナル伝達経路、ビタミンa及びカロテノイド代謝経路、ビタミンb12代謝経路、ビタミンb6生合成経路、ビタミンb6代謝経路、ビタミンd代謝経路、ビタミン消化及び吸収経路、Wntシグナル伝達経路、キサンチン及びグアニンサルベージ経路、ならびに/または亜鉛恒常性経路が挙げられるが、これらに限定されない。
II.ニーズが満たされていない疾患
いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態は、満たされていない治療ニーズを有するものから選択され得る。表1は、治療ニーズが満たされていない疾患の例及び治療のために標的化するための提案された遺伝子を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態は、満たされていない治療ニーズを有するものから選択され得る。表1は、治療ニーズが満たされていない疾患の例及び治療のために標的化するための提案された遺伝子を提供する。
いくつかの実施形態では、ニーズが満たされていない疾患は鎌状赤血球症(SCD)であり、これは、治療オプションが限られた重症で稀な血液疾患である。SCDは、米国において約100,000人の患者及びヨーロッパにおいて約60,000人の患者の大きな希少疾病の指標を有する。この疾患は、血管閉塞、溶血性貧血、多臓器不全につながる炎症/血管損傷に起因する、平均寿命が20〜30年減少する壊滅的な罹患率及び死亡率を引き起こす。具体的には、脳において、脳卒中(梗塞または出血)が生じ、麻痺、神経認知欠損、または死亡を引き起こし得る。具体的には、肺において、急性胸部症候群、肺高血圧症、及び/または肺炎が生じ得る。具体的には、腎臓において、血尿、腎機能障害、及び/または腎不全が生じ得る。具体的には、骨及び関節において、骨髄梗塞、骨髄炎、及び無血管性壊死/骨壊死が生じ得る。具体的には、肝臓/胆嚢において、肝障害、胆石、及び/または肝不全が生じ得る。具体的には、眼において、出血、失明、網膜剥離、及び/または網膜症が生じ得る。具体的には、心臓において、心肥大及び/または心不全が生じ得る。具体的には、脾臓において、萎縮(自家脾臓摘出)が生じ得る。具体的には、皮膚上で、くるぶしのうっ血性潰瘍及び/または指炎が生じ得る。具体的には、男性において、持続勃起症が生じ得る。具体的には、女性において、有害な妊娠結果が生じ得る。
現在の治療としては、L−グルタミン及びヒドロキシ尿素が挙げられる。現在SCDの治療パイプラインにおいて主要な薬物としては、トリカグレロール(tricagrelor)、Sel−G1、GBT−440、及びレンチグロビンが挙げられる。HIF安定剤(stailizer)、トリコシック(trichosic)、HDAC−1/2阻害剤、PRMT−5阻害剤、EdX−17、LSD−1阻害剤、MBD阻害剤、PB−04及びパノビノスタットは、SCDの治療のためのHbF誘導の有望性を示している。Aes−107、PNQ−103、MX−1520及びSCD−101は、SCDの治療のための抗鎌状剤としての有望性を示している。PF−4447943は、SCDの治療のための抗付着剤としての有望性を示している。VBP−15及びNKTT−120は、SCDの治療のための抗炎症剤としての有望性を示している。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、上記に提供される化合物のうちの少なくとも1つ、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるU.S.62/501,795の表19〜表26、表28から選択される少なくとも1つの刺激を使用して、シグナル伝達中心及び/または絶縁近傍を調整することによって、SCDの治療を提供する。いくつかの実施形態では、選択された化合物または刺激は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるU.S.62/501,795の表1〜表9から選択される少なくとも1つの遺伝子を標的とし、SCDの表現型の救出をもたらす。
III.組成物及び方法
いくつかの実施形態では、本開示は、表1に列挙されるものなどの1つ以上の標的遺伝子の発現を調整するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、標的遺伝子(複数可)に関連する疾患、障害または病態を治療または予防することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子(複数可)に関連する疾患、障害または病態は、表1に列挙されるものである。
いくつかの実施形態では、本開示は、表1に列挙されるものなどの1つ以上の標的遺伝子の発現を調整するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、標的遺伝子(複数可)に関連する疾患、障害または病態を治療または予防することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子(複数可)に関連する疾患、障害または病態は、表1に列挙されるものである。
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本開示による組成物での治療が提供される動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、対象は、1つ以上の標的遺伝子に関連する疾患、障害または病態が診断されている可能性があるか、またはその症状を有し得る。他の実施形態では、対象は、1つ以上の標的遺伝子に関連する疾患、障害または病態にかかりやすい場合があるか、またはその危険性があり得る。
いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子内またはその付近に1つ以上の突然変異を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子の1つの機能的対立遺伝子及び1つの変異対立遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子の2つの変異対立遺伝子を有することができる。変異(複数可)は、標的遺伝子から産生されるタンパク質のレベルまたは活性を変化させ得る。
いくつかの実施形態では、対象は、健康な対象と比較して、標的遺伝子から産生されるタンパク質の欠損を有し得る。これは、タンパク質活性を損なうか、タンパク質安定性を低減するか、または遺伝子の発現を減少させる変異に起因し得る。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、関連する疾患、障害または病態の表現型を救出するために標的遺伝子の発現を増加させることができる。他の実施形態では、対象は、健康な対象と比較して、タンパク質の過剰な産生、または望ましくない活性を有するタンパク質の産生を有し得る。これは、機能獲得変異、分解過程の障害、または発現の誤調節によって引き起こされ得る。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、関連する疾患、障害または病態の表現型を救出するために標的遺伝子の発現を減少させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法を使用して、細胞中の標的遺伝子の発現を変更することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
遺伝子発現の変化は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される様々な技法、例えばRNA−seq、qRT−PCR、ウェスタンブロット、または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってRNAレベルまたはタンパク質レベルで評価され得る。遺伝子発現の変化は、治療した細胞または対象における標的遺伝子発現のレベルを、未治療または対照の細胞または対象における発現のレベルと比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約125%、少なくとも約150%、少なくとも約175%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約400%、少なくとも約500%、約25%〜約50%、約40%〜約60%、約50%〜約70%、約60%〜約80%、約80%〜約100%、約100%〜約125%、約100〜約150%、約150%〜約200%、約200%〜約300%、約300%〜約400%、約400%〜約500%、または500%超の標的遺伝子の発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約15倍、約18倍、約20倍、約25倍、または30倍超の標的遺伝子の発現の倍率変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、約25%〜約50%、約40%〜約60%、約50%〜約70%、約60%〜約80%、80%超、またはさらには90%、95%、もしくは99%超の標的遺伝子の発現の低減を引き起こす。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される標的遺伝子の発現の増加は、対象における関連する疾患、障害または病態の1つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される標的遺伝子の発現の低減は、対象における関連する疾患、障害または病態の1つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される遺伝子のセットの発現の変化は、対象における関連する疾患、障害または病態の1つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体2q35上のFN1遺伝子によってエンコードされる、フィブロネクチンの沈着によって引き起こされる、フィブロネクチン腎症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、FN1遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、フィブロネクチンのレベルを低減する。フィブロネクチンレベルの低減は、フィブロネクチン腎症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、FN1発現を低減することができる化合物は、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、BGJ398、AZD2858、ベシル酸アムロジピン、PHA−665752、OSU−03012、bms−986094(inx−189)、アファチニブ、LDN193189、ソトラスタウリン、SKL2001、チボザニブ、セジラニブ(cedirandib)、カルシトリオール、リモナバント、メレスチニブ、BMP4、及びGDF2(BMP9)から選択される。いくつかの実施形態では、スムーズンドアゴニストは、FN1の発現を低減するために、ヘッジホッグ/スムーズンド経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、FN1の発現を低減するために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BGJ398は、FN1の発現を低減するために、FGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、AZD2858は、FN1の発現を低減するために、GSK−3経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベシル酸アムロジピンは、FN1の発現を低減するために、カルシウムチャネル経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、PHA−665752は、FN1の発現を低減するために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、OSU−03012は、FN1の発現を低減するために、PDK−1経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アファチニブは、FN1の発現を低減するために、EGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、LDN193189は、FN1の発現を低減するために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、FN1の発現を低減するために、PKC経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、SKL2001は、FN1の発現を低減するために、WNT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、チボザニブは、FN1の発現を低減するために、タンパク質チロシンキナーゼ/RTK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、セジラニブは、FN1の発現を低減するために、タンパク質チロシンキナーゼ/RTK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、カルシトリオールは、FN1の発現を低減するために、ビタミンD受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リモナバントは、FN1の発現を低減するために、カンナビノイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、FN1の発現を低減するために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BMP4は、FN1の発現を低減するために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GDF2(BMP9)は、FN1の発現を低減するために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体3q11.2上のCPOX遺伝子によってエンコードされる、酵素コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼの欠損によって引き起こされる、遺伝性コプロポルフィリン症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、CPOX遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼのレベルを上昇させる。コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼのレベルの上昇は、遺伝性コプロポルフィリン症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、CPOX発現を増加させることができる化合物は、サリドマイド、グリコピロレート、MK−0752、ボスチニブ、ネファゾドン、コルチコステロン、デフェロキサミンメシル酸塩、GZD824ジメシル酸塩、XMU−MP−1、プレドニゾン、FICZ、SKL2001、塩化コバルト、及び17−AAG(タネスピマイシン)から選択される。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、CPOXの発現を増加させるために、NF−kB経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グリコピロレートは、CPOXの発現を増加させるために、アセチルコリン受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、MK−0752は、CPOXの発現を増加させるために、NOTCHシグナル伝達経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、CPOXの発現を増加させるために、Src経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ネファゾドンは、CPOXの発現を増加させるために、カルシウムシグナル伝達経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、CPOXの発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デフェロキサミンメシル酸塩は、CPOXの発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GZD824ジメシル酸塩は、CPOXの発現を増加させるために、ABL経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、XMU−MP−1は、CPOXの発現を増加させるために、Hippo経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、CPOXの発現を増加させるために、GRシグナル伝達経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、FICZは、CPOXの発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、SKL2001は、CPOXの発現を増加させるために、WNT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、塩化コバルトは、CPOXの発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、17−AAG(タネスピマイシン)は、CPOXの発現を増加させるために、細胞周期/DNA損傷;代謝酵素/プロテアーゼ経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体1q25.1上のSERPINC1遺伝子によってエンコードされる、アンチトロンビン(以前はアンチトロンビンIIIとして既知)の欠損によって引き起こされる、SERPINC1欠損症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、SERPINC1遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、アンチトロンビンのレベルを上昇させる。アンチトロンビンのレベルの上昇は、SERPINC1欠損症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、SERPINC1発現を増加させることができる化合物は、CP−673451、エキノマイシン、パクリチニブ、アムバチニブ、クレノラニブ、INNO−206(アルドキソルビシン)、モメロチニブ、サリドマイド、及びピフィスリン−μから選択される。いくつかの実施形態では、CP−673451は、SERPINC1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、SERPINC1の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、パクリチニブは、SERPINC1の発現を増加させるために、JAK−STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、SERPINC1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、SERPINC1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、INNO−206(アルドキソルビシン)は、SERPINC1の発現を増加させるために、細胞周期/DNA損傷経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、SERPINC1の発現を増加させるために、JAK/STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、SERPINC1の発現を増加させるために、NF−kB経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−μは、SERPINC1の発現を増加させるために、p53経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体20p12.2上のJAG1遺伝子及び染色体1p12上のNOTCH2遺伝子によってそれぞれエンコードされる、jagged 1リガンド及び/またはNotch2受容体の欠損によって引き起こされる、アラジール症候群の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。ほとんどのアラジール症候群患者は、jagged 1においてハプロ不全を有し、一部はNotch2の欠損も有する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、JAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、jagged 1及びNotch2のレベルを上昇させる。JAG1及び/またはNotch2のレベルの上昇は、アラジール症候群の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、JAG1及び/またはNOTCH2発現を増加させることができる化合物は、両方の遺伝子の発現を増加させるために、メレスチニブ及びトルセトラピブから選択される。ある特定の実施形態では、化合物は、LDN193189、LDN212854、サリドマイド、フェンホルミン、エンザスタウリン、GDF2(BMP9)、BMP2、INNO−206(アルドキソルビシン)、アムバチニブ、BMP4及びBAY 87−2243から選択されて、JAG1のシグナル伝達中心(複数可)を変更してJAG1の発現を増加させる。代替として、化合物は、ジボテンタン及び740Y−Pから選択されて、NOTCH2のシグナル伝達中心(複数可)を変更してNOTCH2発現を増加させる。いくつかの実施形態では、LDN193189は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、LDN−212854は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、NF−kB経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、フェンホルミンは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、AMPK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エンザスタウリンは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、エピジェネティクス;TGF−ベータ/Smad経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GDF2(BMP9)は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BMP2は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、INNO−206(アルドキソルビシン)は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、細胞周期/DNA損傷経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BMP4は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BAY 87−2243は、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ジボテンタンは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、GPCR/Gタンパク質経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、740Y−Pは、JAG1またはNOTCH2の発現を増加させるために、PI3K/AKT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体11q23.3上の遺伝子SLC37A4によってエンコードされる、グルコース−6−リン酸トランスロカーゼ(G6PT)の欠損によって引き起こされる、糖原病1bを治療または予防するための組成物及び方法を提供する。コード領域SLC37A4における変異は、部分的に機能的なタンパク質につながり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、SLC37A4遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、グルコース−6−リン酸トランスロカーゼのレベルを上昇させる。グルコース−6−リン酸トランスロカーゼ(G6PT)のレベルの上昇は、糖原病1bの表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、SLC37A4発現を増加させることができる化合物は、エキノマイシン、プレドニゾン、CP−673451、塩化コバルト、アムバチニブ、パクリチニブ、R788(フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物、GZD824ジメシル酸塩、コルチコステロン、デキサメタゾン、TNF−α(TNF−a)、サリドマイド、及びIGF−1から選択される。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、SLC37A4の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、SLC37A4の発現を増加させるために、GRシグナル伝達経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、CP−673451は、SLC37A4の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、塩化コバルトは、SLC37A4の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、SLC37A4の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、パクリチニブ(SB1518)は、SLC37A4の発現を増加させるために、JAK−STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、R788(フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物)は、SLC37A4の発現を増加させるために、タンパク質チロシンキナーゼ/RTK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GZD824ジメシル酸塩は、SLC37A4の発現を増加させるために、ABL経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、SLC37A4の発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、SLC37A4の発現を増加させるために、グルココルチコイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、TNF−aは、SLC37A4の発現を増加させるために、NF−kB、MAPK、アポトーシス経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、SLC37A4の発現を増加させるために、NF−kB経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、IGF−1は、SLC37A4の発現を増加させるために、IGF−1R/InsR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体11q23.3上のHMBS遺伝子によってエンコードされる、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)の欠損によって引き起こされる、急性間欠性ポルフィリン症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、HMBS遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、HMBSのレベルを上昇させる。HMBSのレベルの上昇は、急性間欠性ポルフィリン症の表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、HMBS発現を増加させることができる化合物は、ソトラスタウリンである。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、HMBSの発現を増加させるために、プロテインキナーゼC(PKC)シグナル伝達経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体5q31.1上のLECT2遺伝子によってエンコードされる、白血球走化性因子2(LECT2)タンパク質の沈着によって引き起こされる、LECT2アミロイドーシスの治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、LECT2遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、LECT2のレベルを低下させる。LECT2のレベルの低減は、LECT2アミロイドーシスの表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、LECT2発現を低減することができる化合物は、カルシトリオール、17−AAG(タネスピマイシン)、リトナビル、TFP、b−エストラジオール、リファンピシン、トルセトラピブ、ジボテンタン、リモナバント、OSU−03012、アファチニブ、NSC228155、グルコース、APS−2−79、ホルボール1213−ジブチラート、プレドニゾン、740 Y−P、ベシル酸アムロジピン、及びダラプラジブから選択される。いくつかの実施形態では、カルシトリオールは、LECT2の発現を低減するために、ビタミンD受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、17−AAG(タネスピマイシン)は、LECT2の発現を低減するために、細胞周期/DNA損傷;代謝酵素/プロテアーゼ経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、TFPは、LECT2の発現を低減するために、P53経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、b−エストラジオールは、LECT2の発現を低減するために、ER経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リファンピシンは、LECT2の発現を低減するために、PXR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ジボテンタンは、LECT2の発現を低減するために、GPCR/Gタンパク質経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リモナバントは、LECT2の発現を低減するために、カンナビノイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、OSU−03012は、LECT2の発現を低減するために、PDK−1経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アファチニブは、LECT2の発現を低減するために、EGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、NSC228155は、LECT2の発現を低減するために、EGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グルコースは、LECT2の発現を低減するために、代謝/解糖経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、APS−2−79は、LECT2の発現を低減するために、MAPK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ホルボール1213−ジブチラートは、LECT2の発現を低減するために、PKC経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、LECT2の発現を低減するために、GR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、740Y−Pは、LECT2の発現を低減するために、PI3K/AKT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベシル酸アムロジピンは、LECT2の発現を低減するために、カルシウムチャネル経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体22q12.3上のAPOL1遺伝子によってエンコードされる、アポリポタンパク質L1(APOL1)のリスク変異体によって引き起こされる、APOL1関連糸球体疾患の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、APOL1遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、UDP−グリクロノシルトランスフェラーゼ(glycuronosyltransferase)のレベルを低下させる。APOL1のレベルの低減は、APOL1関連糸球体疾患の表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、APOL1発現を低減することができる化合物は、ニトロフラントイン及びクリゾチニブから選択される。いくつかの実施形態では、ニトロフラントインは、APOL1の発現を低減するために、抗生物質経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、APOL1の発現を低減するために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体2q37.1上のUGT1A1遺伝子によってエンコードされる、ウリジン5’−二リン酸(UDP)−グリクロノシルトランスフェラーゼであるジルベール症候群及び/またはクリグラーナジャーII型の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、UGT1A1遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、UDP−グリクロノシルトランスフェラーゼのレベルを上昇させる。UDP−グリクロノシルトランスフェラーゼのレベルの上昇は、ジルベール症候群及び/またはクリグラーナジャーII型の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態において、化合物または刺激は、FICZ、カルトゲニン、meBIO、CP−673451、BAM7、EW−7197、パクリチニブ(SB1518)、ピフィスリン−a、LY294002、BMS−754807、ベキサロテン、クリゾチニブ、ARN−509、エキノマイシン、JNJ−38877605、オメプラゾール、RO4929097、モメロチニブ、BIRB796、AZD6738、セマガセスタット、グリメピリド、AZD1480、クリプトタンシノン、GW4064、LRH−1アンタゴニスト、PND−1186、クレノラニブ、EB1089、ソトラスタウリン、コルチコステロン、GZD824ジメシル酸塩、ネタルスジル、R788(フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物)、オキソグラウシン、エバセトラピブ、LY2584702、メレスチニブ、CI−4AS−1、ダサチニブ、ロロフィリン(KW−3902)、IWP−2、T0901317、リトナビル、BIO、アムバチニブ、FRAX597、抗ミュラー管ホルモン、Wnt3a、デセルノチニブ、ドルソモルフィン、エトミデート、及びGDC−0879から選択される。いくつかの実施形態では、FICZは、UGT1A1の発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、カルトゲニンは、UGT1A1の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、meBIOは、UGT1A1の発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、CP−673451は、UGT1A1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BAM7は、UGT1A1の発現を増加させるために、BCL2経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、EW−7197は、UGT1A1の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−aは、UGT1A1の発現を増加させるために、p53経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、LY294002は、UGT1A1の発現を増加させるために、PI3K/AKT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BMS−754807は、UGT1A1の発現を増加させるために、IGF−1R/InsR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベキサロテンは、UGT1A1の発現を増加させるために、RXR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ARN−509は、UGT1A1の発現を増加させるために、アンドロゲン受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、UGT1A1の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、JNJ−38877605は、UGT1A1の発現を増加させるために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、オメプラゾールは、UGT1A1の発現を増加させるために、プロトンポンプ経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、RO4929097は、UGT1A1の発現を増加させるために、NOTCH経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、JAK/STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BIRB 796は、UGT1A1の発現を増加させるために、MAPK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、AZD6738は、UGT1A1の発現を増加させるために、ATM/ATR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、セマガセスタットは、UGT1A1の発現を増加させるために、Notch、神経シグナル伝達;幹細胞/Wnt経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グリメピリドは、UGT1A1の発現を増加させるために、カリウムチャネル経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、AZD1480は、UGT1A1の発現を増加させるために、JAK/STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリプトタンシノンは、UGT1A1の発現を増加させるために、JAK/STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GW4064は、UGT1A1の発現を増加させるために、FXR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、LRH−1アンタゴニストは、UGT1A1の発現を増加させるために、LHR−1経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、PND−1186は、UGT1A1の発現を増加させるために、FAK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、EB1089は、UGT1A1の発現を増加させるために、ビタミンD受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、UGT1A1の発現を増加させるために、PKC経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、UGT1A1の発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GZD824ジメシル酸塩は、UGT1A1の発現を増加させるために、ABL経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ネタルスジルは、UGT1A1の発現を増加させるために、ROCK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、R788(フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物)は、UGT1A1の発現を増加させるために、タンパク質チロシンキナーゼ/RTK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、オキソグラウシンは、UGT1A1の発現を増加させるために、PI3K/AKT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、LY2584702は、UGT1A1の発現を増加させるために、S6K経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、c−MET経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、CI−4AS−1は、UGT1A1の発現を増加させるために、アンドロゲン受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、ABL経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、IWP−2は、UGT1A1の発現を増加させるために、WNT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、T0901317は、UGT1A1の発現を増加させるために、LXR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、BIOは、UGT1A1の発現を増加させるために、Pan−GSK−3経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、PDGFR経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、FRAX597は、UGT1A1の発現を増加させるために、PAK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、抗ミュラー管ホルモンは、UGT1A1の発現を増加させるために、TGF−B経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、Wnt3aは、UGT1A1の発現を増加させるために、WNT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デセルノチニブは、UGT1A1の発現を増加させるために、JAK/STAT経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ドルソモルフィンは、UGT1A1の発現を増加させるために、AMPK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エトミデートは、UGT1A1の発現を増加させるために、GABA作動性受容体経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、GDC−0879は、UGT1A1の発現を増加させるために、MAPK経路中の少なくとも1つの構成成分を摂動させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の欠陥、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)中の機能変異の増加、及びアンジオポエチン様3(ANGPTL3)の発現の増加と関連付けられている、脂質異常症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。LDLRは、染色体19p13.2上のLDLR遺伝子によってエンコードされ、PCSK9は、染色体1p32.3上のPCSK9遺伝子によってエンコードされ、ANGPTL3は、染色体1p31.3上のANGPTL3遺伝子によってエンコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、LDLR、PCSK9及び/またはANGPTL3遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、LDL受容体のレベルを上昇させ、かつ/またはPCSK9及び/もしくはANGPTL3のレベルを低下させる。LDL受容体のレベルの上昇ならびに/またはPCSK9及び/もしくはANGPTL3のレベルの低下は、高い総コレステロール、高いLDL−C、または高いトリグリセリドを含む、複数の異常をもたらすリポタンパク質代謝の障害を含む、脂質異常症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、LDLR発現を増加させること、ならびに/またはPCSK9及び/もしくはANGPTL3発現を減少させることができる化合物は、WYE−125132(WYE−132)及びピフィスリン−μから選択される。ある特定の実施形態では、化合物は、SGI−1776、プレラデナント及びCO−1686(ロシレチニブ)から選択されて、ANGPTL3を減少させ、LDLRを増加させる。代替として、化合物は、LDLRを増加させ、PCSK9を減少させるために、LY294002であってもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、メチル−CpG結合タンパク質2(MECP2)の欠陥と関連付けられている、レット症候群の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。MECP2は、染色体Xq28上のMECP2遺伝子によってエンコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも1つの化合物または方法は、MECP2の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心(複数可)を変更することによって、MECP2のレベルを上昇させる。MECP2のレベルの上昇は、レット症候群の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、MECP2発現を増加させることができる化合物は、17−AAG(タネスピマイシン)/KOS−953である。
小分子
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を調整するために使用される化合物は、小分子を含み得る。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、5000ダルトン未満の有機化合物を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの構成成分(例えば、転写因子、シグナル伝達タンパク質)と干渉させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、絶縁近傍の境界を変更、及び/または標的遺伝子に関連するシグナル伝達中心を崩壊させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を調整するために使用される化合物は、小分子を含み得る。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、5000ダルトン未満の有機化合物を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの構成成分(例えば、転写因子、シグナル伝達タンパク質)と干渉させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、絶縁近傍の境界を変更、及び/または標的遺伝子に関連するシグナル伝達中心を崩壊させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。
小分子スクリーニングを実施して、絶縁近傍のシグナル伝達中心を通して作用する小分子を特定して、標的遺伝子の発現を調整し得る遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することができる。例えば、既知のシグナル伝達アゴニスト/アンタゴニストが投与され得る。信用できるヒットは、シグナル伝達中心を通して作用し、標的遺伝子の発現を調整することが知られている小分子によって特定され、検証される。
ポリペプチド
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される(天然または非天然の)アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約50アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長となる。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産生物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ポリペプチドという用語はまた、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される(天然または非天然の)アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約50アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長となる。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産生物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ポリペプチドという用語はまた、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
抗体
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体断片、それらの変異体または誘導体を含む本開示の抗体は、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの少なくとも1つの構成成分と特異的に免疫反応性である。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体断片、それらの変異体または誘導体を含む本開示の抗体は、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの少なくとも1つの構成成分と特異的に免疫反応性である。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、少なくとも2つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体)、及びダイアボディなどの抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、主にアミノ酸系分子であるだけでなく、糖部分を有するなど、1つ以上の修飾も含み得る。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab′、F(ab′)2、及びFv断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片を産生する。残基「Fc」断片もまた産生され、その名前は、それが容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有しながら依然として抗原に架橋することができる、F(ab′)2断片が得られる。本開示の抗体は、これらの断片のうちの1つ以上を含み得る。本明細書の目的に関しては、「抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにFc領域を含み得る。
「未変性抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン(VH)を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン(VL)を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」という用語は、配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される特定の抗体ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「Fv」という用語は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。
任意の脊椎動物種由来の抗体「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κとλと呼ばれる2つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体には5つの主要なクラス、すなわち:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2にさらに分けられ得る。
本明細書で使用される場合、「一本鎖Fv」または「scFv」は、VH及びVL抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは一緒に、単一のポリペプチド鎖に結合される。いくつかの実施形態では、Fvポリペプチドリンカーは、scFvが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。
「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメインVLに接続した重鎖可変ドメインVHを含む。同じ鎖上の2つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、2つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、及びHollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)にさらに詳述されており、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の抗体は、当該技術分野において既知の方法によって産生されるか、または本出願に記載されるポリクローナルまたはモノクローナルまたは組み換えであり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の細胞(またはクローン)の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び/または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体は除外され、そのような変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び/または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であるが、鎖(複数可)の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびにそのような抗体の断片が含まれる。
「ヒト化」型の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の抗体からの超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。
「超可変領域」という用語は、抗体を参照して本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む抗体の抗原結合ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、相補性決定領域(CDR)の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「CDR」は、その標的抗原またはエピトープに相補的である構造を含む抗体の領域を指す。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗体模倣体であり得る。「抗体模倣体」という用語は、抗体の機能または効果を模倣し、それらの分子標的に特異的に高い親和性で結合する任意の分子を指す。そのようなものとして、抗体模倣体は、ナノボディなどを含む。
いくつかの実施形態では、抗体模倣体は、当該技術分野において既知のものであり得、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、DARPin、Fynomer及びKunitz、ならびにドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体模倣体は、1つ以上の非ペプチド領域を含み得る。
本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、未変性抗体と比較してアミノ酸配列、組成物または構造にいくつかの相違を含む、構造及び/または機能において抗体に似ている生体分子を指す。
モノクローナルであるかポリクローナルであるかにかかわらず、抗体の調製は当該技術分野において既知である。抗体の産生のための技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Harlow and Lane″Antibodies,A Laboratory Manual″,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988 and Harlow and Lane″Using Antibodies:A Laboratory Manual″Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999に記載されている。
本開示の抗体は、それらの標的分子(複数可)、それらを生成するために使用される抗原、それらの機能(アゴニストとしてもしくはアンタゴニストとして)及び/またはそれらが機能する細胞ニッチを特徴とし得る。
抗体機能の測定は、インビトロまたはインビボで正常な生理的条件下、標準に対して行われ得る。測定はまた、抗体の存在または非存在に対して行われ得る。そのような測定方法には、血清または血液などの組織または流体中の標準測定、例えば、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、活性アッセイ、レポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アレイ、遺伝子アレイ、リアルタイム逆転写酵素(RT)PCRなどが含まれる。
本開示の抗体は、結合を介して(可逆的または不可逆的に)1つ以上の標的部位にそれらの効果を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、抗体の結合部位を表す標的部位は、最も多くの場合、タンパク質またはタンパク質ドメインまたは領域によって形成される。しかしながら、標的部位はまた、糖、脂質、核酸分子または任意の他の形態の結合エピトープなどの生体分子を含み得る。
代替として、または追加として、本開示の抗体は、結合またはコンジュゲートされた薬物ペイロードを特定の標的部位に送達または輸送するように作用する、リガンド模倣体または非伝統的なペイロードキャリアとして機能し得る。
本開示の抗体によって引き出される変化は、細胞中の新形態変化をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「新形態変化」は、新たなまたは異なる変化または変更である。そのような変化は、細胞外、細胞内及び細胞間シグナル伝達を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物または薬剤は、タンパク分解性事象を変更または制御するように作用する。そのような事象は、細胞内または細胞外であり得る。
本開示の抗体、ならびにそれらを生成するために使用される抗原は、主にアミノ酸系分子である。これらの分子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」であり得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、2〜50個以上のアミノ酸を有するアミノ酸系分子を指す。特別な指示語が、より小さいペプチドに適用され、「ジペプチド」は、2つのアミノ酸分子を指し、「トリペプチド」は、3つのアミノ酸分子を指す。50を超える連続アミノ酸を有するアミノ酸系分子は、ポリペプチドまたはタンパク質とみなされる。
「アミノ酸」及び「アミノ酸」という用語は、全て天然に存在するL−α−アミノ酸ならびに非天然に存在するアミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のような1文字または3文字のいずれかの指示語によって特定され:アスパラギン酸(Asp:D)、イソロイシン(Ile:I)、トレオニン(Thr:T)、ロイシン(Leu:L)、セリン(Ser:S)、チロシン(Tyr:Y)、グルタミン酸(Glu:E)、フェニルアラニン(Phe:F)、プロリン(Pro:P)、ヒスチジン(His:H)、グリシン(Gly:G)、リジン(Lys:K)、アラニン(Ala:A)、アルギニン(Arg:R)、システイン(Cys:C)、トリプトファン(Trp:W)、バリン(Val:V)、グルタミン(Gln:Q)、メチオニン(Met:M)、アスパラギン(Asn:N)、アミノ酸は、最初にそれぞれ3文字コード及び1文字コードによって挿入句的に列挙される。
ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション機構を介して機能するものを含むオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子、RNAi構築物(siRNA、saRNA、microRNAなどを含む)、アプタマー及びリボザイムなどの一本鎖または二本鎖にかかわらず、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更するために、または摂動刺激として使用され得る。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション機構を介して機能するものを含むオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子、RNAi構築物(siRNA、saRNA、microRNAなどを含む)、アプタマー及びリボザイムなどの一本鎖または二本鎖にかかわらず、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更するために、または摂動刺激として使用され得る。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド(例えば、siRNA)を使用して、標的遺伝子の発現を調節する経路に関与するシグナル伝達分子をノックダウンすることができ、それにより発現は、シグナル伝達分子の非存在下で変更される。例えば、経路が標的遺伝子の発現を負に調節することが特定されると、その経路の構成成分(例えば、受容体、プロテインキナーゼ、転写因子)は、RNAi剤(例えば、siRNA)でノックダウンされ、遺伝子の発現を強化することができる。同様に、経路が標的遺伝子の発現を正に調節することが特定されると、その経路の構成成分(例えば、受容体、プロテインキナーゼ、転写因子)は、RNAi剤(例えば、siRNA)でノックダウンされ、遺伝子の発現を低減することができる。
いくつかの実施形態では、2つ以上のハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを使用して、同じ経路において2つ以上の構成成分を標的とするか、または異なる経路からの2つ以上の構成成分を標的として、標的遺伝子発現を変更することができる。そのような複合療法は、標的遺伝子の発現を調節する複数のシグナル伝達分子及び/または経路を同時にブロックすることによって、付加的または相乗的効果を達成することができる。
そのようなオリゴヌクレオチドはまた、治療薬としても役立ち得るため、それらの治療負債及び治療成果は、それぞれ本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調べることによって改善または予測され得る。
ゲノム編集アプローチ
ある特定の実施形態では、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に関連する絶縁近傍(複数可)及び/またはゲノムシグナル伝達中心(複数可)を定義する染色体領域を変更することによって調整され得る。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に関連する絶縁近傍(複数可)及び/またはゲノムシグナル伝達中心(複数可)を定義する染色体領域を変更することによって調整され得る。
絶縁近傍に付随する遺伝子発現を変更する方法は、シグナル伝達中心を変更すること(例えば、CRISPR/Casを使用して、シグナル伝達中心結合部位を変化させるか、または突然変異した場合に修復/置換する)ことを含む。これらの変更は、早期の/不適切な細胞死経路の活性化(多くの免疫障害の鍵となる)、過少/過剰な遺伝子産生物の産生(可変抵抗器仮説としても知られる)、過少/過剰な酵素の細胞外分泌の産生、系統分化の防止、系統経路の切り替え、幹細胞性の促進、自己調節フィードバックループで開始または干渉、細胞代謝におけるエラーの開始、不適切な刷り込み/遺伝子サイレンシング、及び傷のあるクロマチン状態の形成を含む、様々な結果をもたらし得る。追加として、当該技術分野において周知のものを含むゲノム編集アプローチを使用して、コヒーシンネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすことによって新たなシグナル伝達中心を作成することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチは、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の特定の位置に一本鎖または二本鎖DNA切断を導入する方法を含み得る。そのような切断は、相同指向型修復(HDR)及び非相同末端接合(NHEJ)などの内因性細胞プロセスであり得、定期的に修復される。HDRは、本質的に、相同DNA配列の存在下で二本鎖DNA切断を修復する誤りのない機構である。HDRの最も一般的な形態は、相同組換えである。それは、特定のDNA配列を切断ポイントで挿入または置換するためのテンプレートとして、相同配列を利用する。相同DNA配列のテンプレートは、内因性配列(例えば、姉妹染色分体)または外因性もしくは供給された配列(例えば、プラスミドもしくはオリゴヌクレオチド)であり得る。そのようなものとして、HDRを利用して、所望の領域における置換または挿入などの精密な変更を導入することができる。対照的に、NHEJは、二本鎖切断から生じるDNA末端を直接接合する誤りがちな修復機構であり、切断部位においていくつかのヌクレオチドを喪失、付加または突然変異させる可能性がある。得られる小さな欠失または挿入(「インデル」と呼ばれる)または突然変異は、遺伝子発現を崩壊または強化し得る。追加として、同じDNA上に2つの切断が存在する場合、NHEJは、介在セグメントの欠失または逆転につながり得る。そのため、NHEJを利用して、切断部位に挿入、欠失または突然変異を導入することができる。
CRISPR/Cas系
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、CTCFアンカー部位を欠失し、そのアンカー部位に関連する絶縁近傍内の遺伝子発現を調整することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016を参照されたい。絶縁近傍の境界の崩壊は、関連したシグナル伝達中心の適切な機能に必要な相互作用を防止する。欠失した近傍境界に直ぐ隣接する発現遺伝子の変化もまた、そのような崩壊に起因して観察されている。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、CTCFアンカー部位を欠失し、そのアンカー部位に関連する絶縁近傍内の遺伝子発現を調整することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Hnisz et al.,Cell 167,November 17,2016を参照されたい。絶縁近傍の境界の崩壊は、関連したシグナル伝達中心の適切な機能に必要な相互作用を防止する。欠失した近傍境界に直ぐ隣接する発現遺伝子の変化もまた、そのような崩壊に起因して観察されている。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、既存のCTCFアンカー部位を修飾することができる。例えば、既存のCTCFアンカー部位は、CRISPR/Casヌクレアーゼ及び1つ以上のガイドRNAを有するNHEJを誘導することによって突然変異もしくは逆転され得るか、または触媒不活性のCRISPR/Cas酵素及び1つ以上のガイドRNAと標的結合することによってマスクされ得る。既存のCTCFアンカー部位の変更は、既存の絶縁近傍の形成を崩壊させ、これらの絶縁近傍内に位置する遺伝子の発現を変更し得る。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、新たなCTCFアンカー部位を導入することができる。CTCFアンカー部位は、CRISPR/Casヌクレアーゼ、1つ以上のガイドRNA、及びCTCFアンカー部位の配列を含有するドナーテンプレートを有する選択部位にHDRを誘導することによって導入され得る。新たなCTCFアンカー部位の導入は、新たな絶縁近傍を作成する、及び/または既存の絶縁近傍を変更することができ、それがこれらの絶縁近傍の隣に位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、シグナル伝達中心結合部位を変えることによってシグナル伝達中心を変更することができる。例えば、シグナル伝達中心結合部位が、関連した転写因子とのシグナル伝達中心のアセンブリに影響を及ぼす突然変異を含む場合、突然変異部位は、供給された訂正ドナーテンプレートの存在下でCRISPR/Casヌクレアーゼ及び1つ以上のガイドRNAを使用して、突然変異またはその付近に二本鎖DNA切断を導入することによって修復され得る。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、絶縁近傍(例えば、エンハンサー)内の領域に結合することによって近傍遺伝子の発現を調整し、転写をブロックすることができる。そのような結合は、シグナル伝達中心への転写因子の動員及び転写の開始を防止し得る。CRISPR/Cas系は、DNAを切断しない触媒不活性のCRISPR/Cas系であり得る。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、これらの遺伝子のコード領域における短い欠失の導入を介して近傍遺伝子の発現をノックダウンすることができる。修復されたとき、そのような欠失は、フレームシフトをもたらし、遺伝子によって産生されたmRNA中に早期停止コドン、続いてナンセンス変異依存分解機構を介してmRNA分解を導入する。これは、シグナル伝達経路の活性化及び抑制構成成分の発現の調整に有用であり得、表1に列挙されるものなどの疾患遺伝子を含むこれらの経路の制御下で、遺伝子発現の減少または増加をもたらす。
他の実施形態では、CRISPR/Cas系を使用して、結合ネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすこともできる。
CRISPR/Cas酵素
CRISPR/Cas系は、RNA誘導型エンドヌクレアーゼを利用して、特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び/または転写調整の分野における様々な適用における使用のために適応されている。当該技術分野において既知または本明細書に開示される酵素またはオルソログのうちのいずれかを、ゲノム編集のために本明細書における方法で利用することができる。
CRISPR/Cas系は、RNA誘導型エンドヌクレアーゼを利用して、特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び/または転写調整の分野における様々な適用における使用のために適応されている。当該技術分野において既知または本明細書に開示される酵素またはオルソログのうちのいずれかを、ゲノム編集のために本明細書における方法で利用することができる。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系は、II型CRISPR/Cas9系であり得る。Cas9は、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)及びCRISPR RNA(crRNA)と一緒に機能して、二本鎖DNAを切断するエンドヌクレアーゼである。2つのRNAを操作して、crRNAの3′端をtracrRNAの5′端にリンカーループを用いて接続することによって、単一分子ガイドRNAを形成することができる。Jinek et al.,Science,337(6096):816−821(2012)は、CRISPR/Cas9系は、RNAプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願第WO2013/176772は、部位特異的遺伝子編集のためのCRISPR/Casエンドヌクレアーゼ系の多くの例及び適用を提供し、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。例示的なCRISPR/Cas9系には、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus、Neisseria meningitidis、Treponema denticola、Streptococcus aureas、及びFrancisella tularensisに由来するものが含まれる。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系は、V型CRISPR/Cpf1系であり得る。Cpf1は、単一のRNA誘導型エンドヌクレアーゼであり、II型系と対照的にtracrRNAが欠如している。Cpf1は、4または5ヌクレオチド5′オーバーハングを有するねじれ型DNA二本鎖切断を産生する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Zetsche et al.Cell.2015 Oct 22;163(3):759−71は、ゲノム編集適用において使用され得るCpf1エンドヌクレアーゼの例を提供する。例示的なCRISPR/Cpf1系には、野兎病菌(Francisella tularensis)、アシダミノコッカス種(Acidaminococcus sp.)、及びラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)に由来するものが含まれる。
ある特定の実施形態では、1つまたは他のヌクレアーゼドメインを不活化するCRISPR/Casエンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体を使用して、CRISPR媒介性ゲノム編集の特異性を高めることができる。ニッカーゼは、HDR対NHEJを促進することが示されている。HDRは、個々のCasニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。
ある特定の実施形態では、触媒不活性のCRISPR/Cas系を使用して、標的領域(例えば、CTCFアンカー部位またはエンハンサー)に結合し、それらの機能を干渉し得る。Cas9及びCpf1などのCasヌクレアーゼは、2つのヌクレアーゼドメインを包含する。触媒部位における重要な残基を突然変異させることは、標的部位にのみ結合するが、切断をもたらさらない変異体を作成する。染色体領域(例えば、CTCFアンカー部位またはエンハンサー)への結合は、絶縁近傍またはシグナル伝達中心の適切な形成を崩壊させ、したがって標的領域の隣に位置する遺伝子の変化した発現につながり得る。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas系は、CRISPR/Cas酵素に融合された追加の機能的ドメイン(複数可)を含み得る。機能的ドメインは、転写活性化、転写抑制、DNAメチル化、ヒストン修飾、及び/またはクロマチンリモデリングを含むが、これらに限定されないプロセスに関与し得る。そのような機能的ドメインには、転写活性化ドメイン(例えば、VP64もしくはKRAB、SIDもしくはSID4X)、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、DNAメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性/制御可能ドメインまたは化学的誘導性/制御可能ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、CRISPR/Cas酵素は、以下のうちの1つまたは組み合わせとして細胞または患者に投与され得る:1つ以上のポリペプチド、ポリペプチドをエンコードする1つ以上のmRNA、またはポリペプチドをエンコードする1つ以上のDNA。
ガイド核酸
ある特定の実施形態では、ガイド核酸を使用して、関連したCRISPR/Cas酵素の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向することができる。ガイド核酸は、CRISPR/Cas酵素とのそれらの結合によって、ガイド核酸及びCRISPR/Cas複合体に対する標的特異性を提供し、したがってガイド核酸は、CRISPR/Cas酵素の活性を指向することができる。
ある特定の実施形態では、ガイド核酸を使用して、関連したCRISPR/Cas酵素の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向することができる。ガイド核酸は、CRISPR/Cas酵素とのそれらの結合によって、ガイド核酸及びCRISPR/Cas複合体に対する標的特異性を提供し、したがってガイド核酸は、CRISPR/Cas酵素の活性を指向することができる。
一態様では、ガイド核酸は、RNA分子であり得る。一態様では、ガイドRNAは、単一分子ガイドRNAであり得る。一態様では、ガイドRNAは、化学的に修飾され得る。
ある特定の実施形態では、複数のガイドRNAは、ゲノム内の異なる部位において複数のCRISPR/Cas媒介性活性を媒介するために提供され得る。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、1つ以上のRNA分子またはRNA配列をエンコードする1つ以上のDNAとして細胞または患者に投与され得る。
リボ核タンパク質複合体(RNP)
一実施形態では、CRISPR/Cas酵素及びガイド核酸は各々、細胞または患者に別個に投与され得る。
一実施形態では、CRISPR/Cas酵素及びガイド核酸は各々、細胞または患者に別個に投与され得る。
別の実施形態では、CRISPR/Cas酵素は、1つ以上のガイド核酸と予め複合体化され得る。次に、予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子(RNP)として知られている。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の使用を伴う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、DNA切断ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーDNA結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。典型的なDNA切断ドメインは、II型エンドヌクレアーゼFokIの触媒ドメインである。FokIは二量体としてのみ機能することから、ZFNの対は、対向DNA鎖上の同族の標的「半部位(half−site)」配列に対し、それら2つが触媒活性のFokIドメインが二量体化できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないFokIドメインが二量体化すると、ZFN半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのDNA二本鎖切断がもたらされる。
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の使用を伴う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、DNA切断ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーDNA結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。典型的なDNA切断ドメインは、II型エンドヌクレアーゼFokIの触媒ドメインである。FokIは二量体としてのみ機能することから、ZFNの対は、対向DNA鎖上の同族の標的「半部位(half−site)」配列に対し、それら2つが触媒活性のFokIドメインが二量体化できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないFokIドメインが二量体化すると、ZFN半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのDNA二本鎖切断がもたらされる。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の使用を伴う。TALENは、別のフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これはZFNと同様に、操作されたDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することによって生成され、同時並行的に作動して標的化されたDNA切断を達成する。ZFN中のDNA結合ドメインは、ジンクフィンガーモチーフからなるが、TALEN DNA結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)タンパク質に由来し、これは本来植物細菌性病原体Xanthomonas種において説明されている。TALEは、33〜35アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大20bpの標的DNA配列内で単一の塩基対を認識し、標的配列の全長は最大40bpとなる。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置12及び13にちょうど2つのアミノ酸を含む反復可変残基(RVD)によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ4つのRVD:Asn−Asn、Asn−Ile、His−Asp及びAsn−Glyによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもZFNと同様、TALENのタンパク質−DNA相互作用は特異性において絶対的ではないため、TALENも、FokIドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の使用を伴う。TALENは、別のフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これはZFNと同様に、操作されたDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することによって生成され、同時並行的に作動して標的化されたDNA切断を達成する。ZFN中のDNA結合ドメインは、ジンクフィンガーモチーフからなるが、TALEN DNA結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)タンパク質に由来し、これは本来植物細菌性病原体Xanthomonas種において説明されている。TALEは、33〜35アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大20bpの標的DNA配列内で単一の塩基対を認識し、標的配列の全長は最大40bpとなる。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置12及び13にちょうど2つのアミノ酸を含む反復可変残基(RVD)によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ4つのRVD:Asn−Asn、Asn−Ile、His−Asp及びAsn−Glyによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもZFNと同様、TALENのタンパク質−DNA相互作用は特異性において絶対的ではないため、TALENも、FokIドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。
IV.製剤及び送達
薬学的組成物
本開示に従い、組成物は薬学的組成物として調製され得る。そのような組成物は、1つ以上の活性成分、及び最も多くの場合、薬学的に許容される賦形剤を含む必要がある。
薬学的組成物
本開示に従い、組成物は薬学的組成物として調製され得る。そのような組成物は、1つ以上の活性成分、及び最も多くの場合、薬学的に許容される賦形剤を含む必要がある。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び/または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び/または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、0.1%〜99%(w/w)の活性成分を含み得る。例として、組成物は、0.1%〜100%、例えば0.5〜50%、1〜30%、5〜80%、少なくとも80%(w/w)の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、少なくとも1つのペイロードを含み得る。非限定例として、薬学的組成物は、1、2、3、4または5つのペイロードを含み得る。
本明細書に提供される薬学的組成物に関する説明は、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を主に対象としているが、そのような組成物が、一般に任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることは、当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投に好適にするためのヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣薬理学者は、存在する場合は単に通常の実験によって、そのような修飾を設計及び/または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び/または他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び/または七面鳥などの商業的に関連する鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物細胞に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
製剤
本開示の製剤には、限定されないが、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞(例えば、対象中への移動または移植のための)及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
本開示の製剤には、限定されないが、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞(例えば、対象中への移動または移植のための)及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、少なくとも1つの活性成分及び任意に1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を指す。
一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び/または1つ以上の他の補助成分と関連付けるステップを含む。
本明細書に記載される組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び/または1つ以上の他の補助成分と関連付け、その後、必要であれば、及び/または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形及び/または梱包するステップを含む。
本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び/または複数の単一単位用量として調製、梱包、及び/または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別量を指す。活性成分の量は、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び/または例えば、そのような投与量の半分もしくは3分の1などのそのような投与量の便利な画分にほぼ等しい。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び/または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び/または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、0.1%〜99%(w/w)の活性成分を含み得る。例として、組成物は、0.1%〜100%、例えば0.5〜50%、1〜30%、5〜80%、少なくとも80%(w/w)の活性成分を含み得る。
賦形剤及び希釈剤
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医用途の使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方(USP)、欧州薬局方(EP)、英国薬局方、及び/または国際薬局方の基準を満たし得る。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医用途の使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方(USP)、欧州薬局方(EP)、英国薬局方、及び/または国際薬局方の基準を満たし得る。
賦形剤には、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態に適するように、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤及びその組成物を調製するための技法は、当該技術分野において既知である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006を参照)。従来の賦形剤媒体の使用は、例えば任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害に相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と両立し得ない場合を除いて、本開示の範囲内で企図され得る。
例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖など、及び/またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
不活性成分
いくつかの実施形態では、薬学的組成物製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない1つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で使用され得る不活性成分のうちの全てまたはいくつかが、米国食品医薬品局(FDA)によって承認され得るか、どれも承認されない場合がある。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない1つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で使用され得る不活性成分のうちの全てまたはいくつかが、米国食品医薬品局(FDA)によって承認され得るか、どれも承認されない場合がある。
一実施形態では、薬学的組成物は、以下などであるがこれらに限定されない少なくとも1つの不活性成分を含む:1,2,6−ヘキサントリオール;1,2−ジミリストイル−Sn−グリセロ−3−(ホスホ−S−(1−グリセロール));1,2−ジミリストイル−Sn−グリセロ−3−ホスホコリン;1,2−ジオレオイル−Sn−グリセロ−3−ホスホコリン;1,2−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−3−(ホスホ−Rac−(1−グリセロール));1,2−ジステアロイル−Sn−グリセロ−3−(ホスホ−Rac−(1−グリセロール));1,2−ジステアロイル−Sn−グリセロ−3−ホスホコリン;1−O−トリルビグアニド;2−エチル−1,6−ヘキサンジオール;酢酸;氷酢酸;無水酢酸;アセトン;アセトン重亜硫酸ナトリウム;アセチル化ラノリンアルコール;アセチル化モノグリセリド;アセチルシステイン;DL−アセチルトリプトファン、;アクリレーツコポリマー;アクリル酸−アクリル酸イソオクチルコポリマー;アクリル系接着剤788;活性炭;Adcote 72A103;粘着テープ;アジピン酸;Aerotex樹脂3730;アラニン;凝集アルブミン;コロイド状アルブミン;ヒトアルブミン;アルコール;無水アルコール;変性アルコール;希釈アルコール;Alfadex;アルギン酸;アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン;アルキルアリールスルホン酸ナトリウム;アラントイン;アリル.アルファ.−イオノン;アーモンド油;アルファ−テルピネオール;アルファ−トコフェロール;Dl−酢酸アルファ−トコフェロール;Dl−アルファ−トコフェロール;酢酸アルミニウム;アルミニウムクロルヒドロキシアラントイネート;水酸化アルミニウム;水酸化アルミニウム−スクロース、水和物;水酸化アルミニウムゲル;水酸化アルミニウムゲルF 500;水酸化アルミニウムゲルF 5000;モノステアリン酸アルミニウム;酸化アルミニウム;アルミニウムポリエステル;ケイ酸アルミニウム;オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム;ステアリン酸アルミニウム;塩基性酢酸アルミニウム;無水硫酸アルミニウム;Amerchol C;Amerchol−Cab;アミノメチルプロパノール;アンモニア;アンモニア溶液;強アンモニア溶液;酢酸アンモニウム;水酸化アンモニウム;ラウリル硫酸アンモニウム;硫酸アンモニウムノノキシノール−4;C−12〜C−15の直鎖一級アルコールエトキシレートのアンモニウム塩;硫酸アンモニウム;Ammonyx;Amphoteric−2;Amphoteric−9;アネトール;無水クエン酸;無水デキストロース;無水ラクトース;無水クエン酸三ナトリウム;アニス油;Anoxid Sbn;消泡剤;アンチピリン;アパフルラン;杏仁油Peg−6エステル;アクアフォー;アルギニン;アラセル;アスコルビン酸;パルミチン酸アスコルビル;アスパラギン酸;バルサムペルー;硫酸バリウム;ミツロウ;合成ミツロウ;べへネス−10;ベントナイト;塩化ベンザルコニウム;ベンゼンスルホン酸;塩化ベンゼトニウム;臭化ベンゾドデシニウム;安息香酸;ベンジルアルコール;安息香酸ベンジル;塩化ベンジル;ベータデクス;ビバプシド;次没食子酸ビスマス;ホウ酸;ブロクリナト;ブタン;ブチルアルコール;メチルビニルエーテル/無水マレイン酸コポリマー(125000Mw)のブチルエステル;ステアリン酸ブチル;ブチル化ヒドロキシアニソール;ブチル化ヒドロキシトルエン;ブチレングリコール;ブチルパラベン;酪酸;C20〜40 Pareth−24;カフェイン;カルシウム;炭酸カルシウム;塩化カルシウム;グルセプト酸カルシウム;水酸化カルシウム;乳酸カルシウム;カルコブトロール;カルジアミドナトリウム;カルキセト酸三ナトリウム;カルテリドールカルシウム;カナダバルサム;カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド;カプリル酸/カプリン酸/ステアリン酸トリグリセリド;キャプタン;Captisol;カラメル;カルボマー1342;カルボマー1382;カルボマー934;カルボマー934p;カルボマー940;カルボマー941;カルボマー980;カルボマー981;B型カルボマーホモポリマー(架橋アリルペンタエリスリトール);C型カルボマーホモポリマー(架橋アリルペンタエリスリトール);二酸化炭素;カルボキシビニルコポリマー;カルボキシメチルセルロース;カルボキシメチルセルロースナトリウム;カルボキシポリメチレン;カラギーナン;カラギーナン塩;ひまし油;セダーリーフ油;セルロース;微結晶セルロース;セラシント−Se;セレシン;セテアレス−12;セテアレス−15;セテアレス−30;セテアリルアルコール/セテアレス−20;セテアリルエチルヘキサノエート;セテス−10;セテス−2;セテス−20;セテス−23;セトステアリルアルコール;塩化セトリモニウム;セチルアルコール;セチルエステルワックス;パルミチン酸セチル;塩化セチルピリジニウム;クロロブタノール;クロロブタノール半水和物;無水クロロブタノール;クロロクレゾール;クロロキシレノール;コレステロール;コレス;コレス−24;クエン酸塩;クエン酸;クエン酸一水和物;クエン酸水和物;コカミドエーテル硫酸塩;酸化コカミン;ココベタイン;ココジエタノールアミド;ココモノエタノールアミド;ココアバター;ココ−グリセリド;ココナッツ油;水添ココナッツ油;水添ココナッツ油/パーム核油グリセリド;ココイルカプリロカプラート;コラエキス;コラーゲン;顔料懸濁液;トウモロコシ油;綿実油;クリーム基材;クレアチン;クレアチニン;クレゾール;クロスカルメロースナトリウム;クロスポビドン;硫酸銅;無水硫酸銅;シクロメチコン;シクロメチコン/ジメチコンコポリオール;システイン;システイン塩酸塩;無水システイン塩酸塩;Dl−システイン;D&CレッドNo.28;D&CレッドNo.33;D&CレッドNo.36;D&CレッドNo.39;D&CイエローNo.10;ダルファムプリジン;Daubert 1−5 Pestr(Matte)164z;デシルメチルスルホキシド;Dehydag Wax Sx;デヒドロ酢酸;Dehymuls E;安息香酸デナトニウム;デオキシコール酸;デキストラン;デキストラン40;デキストリン;デキストロース;デキストロース一水和物;デキストロース溶液;ジアトリゾ酸;ジアゾリジニル尿素;ジクロロベンジルアルコール;ジクロロジフルオロメタン;ジクロロテトラフルオロエタン;ジエタノールアミン;ピロカルボン酸ジエチル;セバシン酸ジエチル;ジエチレングリコールモノエチルエーテル;フタル酸ジエチルヘキシル;アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム;ジイソプロパノールアミン;アジピン酸ジイソプロピル;ジリノール酸ジイソプロピル;ジメチコン350;ジメチコンコポリオール;ジメチコンMdx4−4210;ジメチコン医療用流体360;ジメチルイソソルビド;ジメチルスルホキシド;ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー;ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト;ジメチルシロキサン/メチルビニルシロキサンコポリマー;ジノセブアンモニウム塩;Dl−ジパルミトイルホスファチジルグリセロール;ジプロピレングリコール;ココアンホジ酢酸二ナトリウム;スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム;スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム;スルホサリチル酸二ナトリウム;ジソフェニン;ジビニルベンゼンスチレンコポリマー;Dmdmヒダントイン;ドコサノール;ドクサートナトリウム;Duro−Tak 280−2516;Duro−Tak 387−2516;Duro−Tak 80−1196;Duro−Tak 87−2070;Duro−Tak 87−2194;Duro−Tak 87−2287;Duro−Tak 87−2296;Duro−Tak 87−2888;Duro−Tak 87−2979;エデト酸カルシウム二ナトリウム;エデト酸二ナトリウム;無水エデト酸二ナトリウム;エデト酸ナトリウム;エデト酸;卵リン脂質;エントスホン;エントスホンナトリウム;エピラクトース;エピテトラサイクリン塩酸塩;エッセンスブーケ9200;エタノールアミン塩酸塩;酢酸エチル;オレイン酸エチル;エチルセルロース;エチレングリコール;エチレン酢酸ビニルコポリマー;エチレンジアミン;エチレンジアミン二塩酸塩;エチレン−プロピレンコポリマー;エチレン−酢酸ビニルコポリマー(28%酢酸ビニル);エチレン−酢酸ビニルコポリマー(9%酢酸ビニル);ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル;エチルパラベン;ユーカリプトール;エキサメタジン;食用脂;硬質脂;脂肪酸エステル;脂肪酸ペンタエリスリトールエステル;脂肪酸;クエン酸脂肪アルコール;脂肪アルコール;Fd&CブルーNo.1;Fd&CグリーンNo.3;Fd&CレッドNo.4;Fd&CレッドNo.40;Fd&CイエローNo.10(リストから除外);Fd&CイエローNo.5;Fd&CイエローNo.6;塩化第二鉄;酸化第二鉄;香料89−186;香料89−259;香料Df−119;香料Df−1530;風味増強剤;イチジク香料827118;ラズベリー香料Pfc−8407;香料Rhodia Pharmaceutical No.Rf 451;フルオロクロロ炭化水素;ホルムアルデヒド;ホルムアルデヒド溶液;分画ココナッツ油;芳香剤3949−5;芳香剤520a;芳香剤6.007;芳香剤91−122;芳香剤9128−Y;芳香剤93498g;バルサムパイン芳香剤No.5124;ブーケ芳香剤10328;ケモデルム芳香剤6401−B;ケモデルム芳香剤6411;クリーム芳香剤No.73457;芳香剤Cs−28197;芳香剤Felton 066m;芳香剤Firmenich 47373;芳香剤Givaudan Ess 9090/1c;芳香剤H−6540;ハーブ芳香剤10396;芳香剤Nj−1085;芳香剤P O Fl−147;芳香剤Pa 52805;芳香剤Pera Derm D;芳香剤Rbd−9819;芳香剤Shaw Mudge U−7776;芳香剤Tf 044078;芳香剤Ungerer Honeysuckle K 2771;芳香剤Ungerer N5195;フルクトース;酸化ガドリニウム;ガラクトース;ガンマシクロデキストリン;ゼラチン;架橋ゼラチン;ゼルフォームスポンジ;ゲランガム(低級アシル);ゲルバ737;ゲンチジン酸;ゲンチジン酸エタノールアミド;グルセプト酸ナトリウム;グルセプト酸ナトリウム二水和物;グルクロノラクトン;グルクロン酸;Dl−グルタミン酸,;グルタチオン;グリセリン;水素化ロジンのグリセロールエステル;クエン酸グリセリル;イソステアリン酸グリセリル;ラウリル酸グリセリル;モノステアリン酸グリセリル;オレイン酸グリセリル;オレイン酸グリセリル/プロピレングリコール;パルミチン酸グリセリル;リシノール酸グリセリル;ステアリン酸グリセリル;ステアリン酸グリセリル−ラウレス−23;ステアリン酸グリセリル/ステアリン酸Peg;ステアリン酸グリセリル/ステアリン酸Peg−100;ステアリン酸グリセリル/ステアリン酸Peg−40;ステアリン酸グリセリル−ステアラミドエチルジエチルアミン;トリオレイン酸グリセリル;グリシン;グリシン塩酸塩;ジステアリン酸グリコール;ステアリン酸グリコール;グアニジン塩酸塩;グアーガム;ヘアコンディショナー(18n195−1m);ヘプタン;ヘタスターチ;へキシレングリコール;高密度ポリエチレン;ヒスチジン;ヒトアルブミンマイクロスフェア;ヒアルロン酸ナトリウム;炭化水素;可塑化炭化水素ゲル;塩酸;希釈塩酸;ヒドロコルチゾン;ヒドロゲルポリマー;過酸化水素;水添ひまし油;水添パーム油;水添パーム/パーム核油Peg−6エステル;水素化ポリブテン635−690;
水酸化物イオン;ヒドロキシエチルセルロース;ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸;ヒドロキシメチルセルロース;ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート;ヒドロキシプロピルセルロース;ヒドロキシプロピルメチルセルロース2906;ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン;ヒプロメロース2208(15000Mpa.S);ヒプロメロース2910(15000Mpa.S);ヒプロメロース;イミド尿素;ヨウ素;ヨードキサム酸;イオフェタミン塩酸塩;アイルランド苔エキス;イソブタン;イソセテス−20;イソロイシン;イソオクチルアクリレート;イソプロピルアルコール;イソステアリン酸イソプロピル;ミリスチン酸イソプロピル;ミリスチン酸イソプロピル−ミリスチルアルコール;パルミチン酸イソプロピル;ステアリン酸イソプロピル;イソステアリン酸;イソステアリルアルコール;等張塩化ナトリウム溶液; Jelene;カオリン;Kathon Cg;Kathon Cg II;乳酸塩;乳酸;Dl−乳酸;L−乳酸;ラクトビオン酸;ラクトース;ラクトース一水和物;ラクトース水和物;ラネス;ラノリン;ラノリンアルコール−鉱油;ラノリンアルコール;無水ラノリン;ラノリンコレステロール;ラノリンノニオン誘導体;エトキシル化ラノリン;水添ラノリン;塩化ラウラコニウム;酸化ラウルアミン;ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン;ラウレス硫酸塩;ラウレス−2;ラウレス−23;ラウレス−4;ラウリン酸ジエタノールアミド;ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド;ラウロイルサルコシン;乳酸ラウリル;硫酸ラウリル;ラベンダーの開花先端部分;レシチン;未漂白レシチン;卵レシチン;水添レシチン;水添ダイズレシチン;ダイズレシチン;レモン油;ロイシン;レブリン酸;リドフェニン;軽油;軽油(85 Ssu);リモネン(+/−)−、リポコールSc−15;リジン;酢酸リジン;リジン一水和物;ケイ酸マグネシウムアルミニウム;ケイ酸アルミウニムマグネシウム水和物;塩化マグネシウム;硝酸マグネシウム;ステアリン酸マグネシウム;マレイン酸;マンニトール;マプロフィックス;メブロフェニン;改良型医療用接着剤S−15;医療用消泡エマルションA−F;メドロン酸二ナトリウム;メドロン酸;メグルミン;メントール;メタクレゾール;メタリン酸;メタンスルホン酸;メチオニン;メチルアルコール;メチルグルセス−10;メチルグルセス−20;メチルグルセス−20セスキステアレート;メチルグルコースセスキステアレート;ラウリル酸メチル;メチルピロリドン;サリチル酸メチル;ステアリン酸メチル;メチルボロン酸;メチルセルロース(4000Mpa.S);メチルセルロース;メチルクロロイソチアゾリノン;メチレンブルー;メチルイソチアゾリノン;メチルパラベン;微結晶ワックス;鉱油;モノ及びジグリセリド;クエン酸モノグリセリド;モノチオグリセロール;マルチステロールエキス;ミリスチルアルコール;乳酸ミリスチル;ミリスチル−.ガンマ.−塩化ピコリニウム;N−(カルバモイル−メトキシPeg−40)−1,2−ジステアロイル−セファリンナトリウム;N,N−ジメチルアセトアミド;ナイアシンアミド;ニオキシム;硝酸;窒素;ノノキシノールヨウ素;ノノキシノール−15;ノノキシノール−9;ノルフルラン;オートミール;オクタデセン−1/マレイン酸コポリマー;オクタン酸;オクチサレート;オクトキシノール−1;オクトキシノール−40;オクトキシノール−9;オクチルドデカノール;オクチルフェノールポリメチレン;オレイン酸;オレス−10/オレス−5;オレス−2;オレス−20;オレイルアルコール;オレイン酸オレイル;オリーブ油;オキドロネート二ナトリウム;オキシキノリン;パーム核油;パルミタミンオキシド;パラベン;パラフィン;白色軟質パラフィン;Parfum Creme 45/3;ピーナッツ油;精製ピーナッツ油;ペクチン; ステアリン酸/ステアリン酸Peg6−32グリコール;Peg植物油;ステアリン酸Peg−100;ラウリン酸Peg−12グリセリル;ステアリン酸Peg−120グリセリル;ジオレイン酸Peg−120メチルグルコース;Peg−15コカミン;ジステアリン酸Peg−150;ステアリン酸Peg−2;イソステアリン酸Peg−20ソルビタン;Peg−22メチルエーテル/ドデシルグリコールコポリマー;ステアリン酸Peg−25プロピレングリコール;ジラウリン酸Peg−4;ラウリン酸Peg−4;Peg−40ひまし油;ジイソステアリン酸Peg−40ソルビタン;Peg−45/ドデシルグリコールコポリマー;オレイン酸Peg−5;ステアリン酸Peg−50;Peg−54水添ひまし油;イソステアリン酸Peg−6;Peg−60ひまし油;Peg−60水添ひまし油;Peg−7メチルエーテル;Peg−75ラノリン;ラウリン酸Peg−8;ステアリン酸Peg−8;ステアリン酸ペグオキソール7;ペンタデカラクトン;ココ酸ペンタエリスリトール;ペンテト酸五ナトリウム;ペンテト酸カルシウム三ナトリウム;ペンテト酸;ペパーミント油;パーフルトレン;香水(Perfume)25677;香水ブーケ;香水E−1991;香水Gd5604;香水Tana 90/42 Scba;香水W−1952−1;ワセリン;白色ワセリン;石油蒸留物;フェノール;液状フェノール;フェノニップ;フェノキシエタノール;フェニルアラニン;フェニルエチルアルコール;酢酸フェニル水銀;硝酸フェニル水銀;卵ホスファチジルグリセロール;リン脂質;卵リン脂質;ホスフォリポン90g;リン酸;パインニードル油(Pinus Sylvestris);ピペラジン六水和物;プラスチベース−50w;ポラクリリン;塩化ポリドロニウム;ポロキサマー124;ポロキサマー181;ポロキサマー182;ポロキサマー188;ポロキサマー237;ポロキサマー407;ポリ(ビス(P−カルボキシフェノキシ)無水プロパン):セバシン酸;末端ブロック化ポリ(ジメチルシロキサン/メチルビニルシロキサン/メチル水素シロキサン)ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル;ポリ(Dl−乳酸−コ−グリコール酸)、(50:50;ポリ(Dl−乳酸−コ−グリコール酸)、末端化エチルエステル(50:50;ポリアクリル酸(250000Mw);ポリブテン(1400Mw);ポリカルボフィル;ポリエステル;ポリエステルポリアミンコポリマー;ポリエステルレーヨン;ポリエチレングリコール1000;ポリエチレングリコール1450;ポリエチレングリコール1500;ポリエチレングリコール1540;ポリエチレングリコール200;ポリエチレングリコール300;ポリエチレングリコール300−1600;ポリエチレングリコール3350;ポリエチレングリコール400;ポリエチレングリコール4000;ポリエチレングリコール540;ポリエチレングリコール600;ポリエチレングリコール6000;ポリエチレングリコール8000;ポリエチレングリコール900;酸化鉄黒(1%未満)を含有する高密度ポリエチレン;硫酸バリウム(20〜24%)を含有する低密度ポリエチレン;ポリエチレンT;ポリエチレンテレフタレート;ポリガラクチン;オレイン酸ポリグリセリル−3、オレイン酸ポリグリセリル−4、ポリヒドロキシエチルメタクリレート;ポリイソブチレン;ポリイソブチレン(1100000Mw);ポリイソブチレン(35000Mw);ポリイソブチレン178−236;ポリイソブチレン241−294;ポリイソブチレン35−39;低分子量ポリイソブチレン;中分子量ポリイソブチレン;ポリイソブチレン/ポリブテン接着剤;ポリラクチド;ポリオール;ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン1800;ポリオキシエチレンアルコール;ポリオキシエチレン脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンプロピレン;ポリオキシル20セトステアリルエーテル;ポリオキシル35ひまし油;ポリオキシル40水添ひまし油;ステアリン酸ポリオキシル40;ステアリン酸ポリオキシル400;パルミトステアリン酸ポリオキシル6及びポリオキシル32;ジステアリン酸ポリオキシル;ステアリン酸ポリオキシルグリセリル;ポリオキシルラノリン;パルミチン酸ポリオキシル;ステアリン酸ポリオキシル;ポリプロピレン;ポリプロピレングリコール;ポリクオタニウム−10;ポリクオタニウム−7(70/30 アクリルアミド/Dadmac;ポリシロキサン;ポリソルベート20;ポリソルベート40;ポリソルベート60;ポリソルベート65;ポリソルベート80;ポリウレタン;ポリ酢酸ビニル;ポリビニルアルコール;ポリ塩化ビニル;ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー;ポリビニルピリジン;けし油;カリ;酢酸カリウム;カリウムミョウバン;重炭酸カリウム;重亜硫酸カリウム;塩化カリウム;クエン酸カリウム;水酸化カリウム;メタ重亜硫酸カリウム;二塩基性リン酸カリウム;一塩基性リン酸カリウム;カリウム石鹸;ソルビン酸カリウム;ポビドンアクリレートコポリマー;ポビドンヒドロゲル;ポビドンK17;ポビドンK25;ポビドンK29/32;ポビドンK30;ポビドンK90;ポビドンK90f;ポビドン/エイコセンコポリマー;ポビドン;Ppg−12/Smdiコポリマー;Ppg−15ステアリルエーテル;ジステアリン酸Ppg−20メチルグルコースエーテル;オレイン酸Ppg−26;Product Wat;プロリン;プロムルゲンD;プロムルゲンG;プロパン;Propellant A−46;没食子酸プロピル;炭酸プロピレン;プロピレングリコール;二酢酸プロピレングリコール;ジカプリル酸プロピレングリコール;モノラウリル酸プロピレングリコール;モノパルミトステアリン酸プロピレングリコール;パルミトステアリン酸プロピレングリコール;リシノール酸プロピレングリコール;プロピレングリコール/ジアゾリジニル尿素/メチルパラベン/プロピルパラベン;プロピルパラベン;硫酸プロタミン;タンパク質加水分解物;Pvm/Maコポリマー;クオタニウム−15;Cis型クオタニウム−15;クオタニウム−52;Ra−2397;Ra−3011;サッカリン;サッカリンナトリウム;無水サッカリンナトリウム;ベニバナ油;Sdアルコール3a;Sdアルコール40;Sdアルコール40−2;Sdアルコール40b;セピネオP600;セリン;ゴマ油;シアバター;シラスティックブランド医療グレードチューブ;シリコーンA型シラスティック医療用接着剤;歯科用シリカ;シリコン;二酸化ケイ素;コロイド状二酸化ケイ素;シリコーン;シリコーン接着剤4102;シリコーン接着剤4502;シリコーン接着剤Bio−Psa Q7−4201;シリコーン接着剤Bio−Psa Q7−4301;シリコーンエマルション;シリコーン/ポリエステルフィルムストリップ;シメチコン;シメチコンエマルション;シポンLs 20np;ソーダ灰;酢酸ナトリウム;無水酢酸ナトリウム;アルキル硫酸ナトリウム;アスコルビン酸ナトリウム;安息香酸ナトリウム;重炭酸ナトリウム;重硫酸ナトリウム;重亜硫酸ナトリウム;ホウ酸ナトリウム;ホウ酸ナトリウム十水和物;炭酸ナトリウム;炭酸ナトリウム十水和物;炭酸ナトリウム一水和物;セトステアリル硫酸ナトリウム;塩素酸ナトリウム;塩化ナトリウム;塩化ナトリウム注射液;静菌性塩化ナトリウム注射液;コレステリル硫酸ナトリウム;クエン酸ナトリウム;ココイルサルコシン酸ナトリウム;デスオキシコール酸ナトリウム;亜ジチオン酸ナトリウム;ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム;ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム;グルコン酸ナトリウム;水酸化ナトリウム;次亜塩素酸ナトリウム;ヨウ化ナトリウム;乳酸ナトリウム;L−乳酸ナトリウム;ラウレス−2硫酸ナトリウム;ラウレス−3硫酸ナトリウム;ラウレス−5硫酸ナトリウム;ラウロイルサルコシン酸ナトリウム;ラウリル硫酸ナトリウム;ラウリルスルホ酢酸ナトリウム;
メタ重亜硫酸ナトリウム;硝酸ナトリウム;リン酸ナトリウム;リン酸ナトリウム二水和物;二塩基性リン酸ナトリウム;二塩基性無水リン酸ナトリウム;二塩基性リン酸ナトリウム二水和物;二塩基性リン酸ナトリウム七水和物;一塩基性リン酸ナトリウム;一塩基性無水リン酸ナトリウム;一塩基性リン酸ナトリウム二水和物;一塩基性リン酸ナトリウム一水和物;ポリアクリレートナトリウム(2500000Mw);ピロリン酸ナトリウム;カルボン酸ナトリウムピロリドン;グリコール酸ナトリウムデンプン;コハク酸ナトリウム六水和物;硫酸ナトリウム;無水硫酸ナトリウム;硫酸ナトリウム十水和物;亜硫酸ナトリウム;スルホコハク酸化ウンデシル酸ナトリウムモノアルキロールアミド;酒石酸ナトリウム;チオグリコール酸ナトリウム;チオリンゴ酸ナトリウム;チオ硫酸ナトリウム;無水チオ硫酸ナトリウム;トリメタリン酸ナトリウム;キシレンスルホン酸ナトリウム;Somay 44;ソルビン酸;ソルビタン;イソステアリン酸ソルビタン;モノラウリル酸ソルビタン;モノオレイン酸ソルビタン;モノパルミチン酸ソルビタン;モノステアリン酸ソルビタン;セスキオレイン酸ソルビタン;トリオレイン酸ソルビタン;トリステアリン酸ソルビタン;ソルビトール;ソルビトール溶液;ダイズ粉;ダイズ油;スペアミント油;鯨ロウ;スクアラン;安定化オキシクロロ錯体;2−エチルヘキサン酸第一スズ;塩化第一スズ;無水塩化第一スズ;フッ化第一スズ;酒石酸第一スズ;デンプン;アルファデンプン1500;トウモロコシデンプン;塩化ステラルコニウム;ヘクトライト/炭酸プロピレンステラルコニウム;ステアルアミドエチルジエチルアミン;ステアレス−10;ステアレス−100;ステアレス−2;ステアレス−20;ステアレス−21;ステアレス−40;ステアリン酸;ステアリン酸ジエタノールアミド;ステアルオキシトリメチルシラン;ステアルトリモニウム加水分解動物コラーゲン;ステアリルアルコール;吸入用滅菌水;スチレン/イソプレン/スチレンブロックコポリマー;サクシマー;コハク酸;スクラロース;スクロース;ステアリン酸スクロース;スクロースポリエステル;スルファセタミドナトリウム;スルホブチルエーテル.ベータ.−シクロデキストリン;二酸化硫黄;硫酸;スルファクトールQ;D−タガトース;タルク;トール油;牛脂グリセリド;酒石酸;Dl−酒石酸;テノックス;テノックス−2;Tert−ブチルアルコール;Tert−ブチル過酸化水素;Tert−ブチルヒドロキノン;テトラキス(2−メトキシイソブチルイソシアニド)銅(I)テトラフルオロホウ酸塩;オルトケイ酸テトラプロピル;テトロホスミン;テオフィリン;チメロサール;トレオニン;チモール;スズ;二酸化チタン;トコフェロール;トコフェルソラン;高カロリー輸液、脂質エマルション;トリアセチン;トリカプリリン;トリクロロモノフルオロメタン;トリデセス−10;ラウリル硫酸トリエタノールアミン;トリフルオロ酢酸;中鎖トリグリセリド;トリヒドロキシステアリン;リン酸トリラネス−4;リン酸トリラウレス−4;クエン酸三ナトリウム二水和物;Hedta三ナトリウム;トリトン720;トリトンX−200;トロラミン;トロマンタジン;トロメタミン(TRIS);トリプトファン;チロキサポール;チロシン;ウンデシレン酸;ユニオン76 Amsco−Res 6038;尿素;バリン;植物油;水添植物油グリセリド;水添植物油;ベルセタミド;ビスカリン;ビスコース/コットン;ビタミンE;乳化ワックス;Wecobee Fs;白色セレシンワックス;白色ワックス;キサンタンガム;亜鉛、酢酸亜鉛;炭酸亜鉛;塩化亜鉛;及び酸化亜鉛。
水酸化物イオン;ヒドロキシエチルセルロース;ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸;ヒドロキシメチルセルロース;ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート;ヒドロキシプロピルセルロース;ヒドロキシプロピルメチルセルロース2906;ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン;ヒプロメロース2208(15000Mpa.S);ヒプロメロース2910(15000Mpa.S);ヒプロメロース;イミド尿素;ヨウ素;ヨードキサム酸;イオフェタミン塩酸塩;アイルランド苔エキス;イソブタン;イソセテス−20;イソロイシン;イソオクチルアクリレート;イソプロピルアルコール;イソステアリン酸イソプロピル;ミリスチン酸イソプロピル;ミリスチン酸イソプロピル−ミリスチルアルコール;パルミチン酸イソプロピル;ステアリン酸イソプロピル;イソステアリン酸;イソステアリルアルコール;等張塩化ナトリウム溶液; Jelene;カオリン;Kathon Cg;Kathon Cg II;乳酸塩;乳酸;Dl−乳酸;L−乳酸;ラクトビオン酸;ラクトース;ラクトース一水和物;ラクトース水和物;ラネス;ラノリン;ラノリンアルコール−鉱油;ラノリンアルコール;無水ラノリン;ラノリンコレステロール;ラノリンノニオン誘導体;エトキシル化ラノリン;水添ラノリン;塩化ラウラコニウム;酸化ラウルアミン;ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン;ラウレス硫酸塩;ラウレス−2;ラウレス−23;ラウレス−4;ラウリン酸ジエタノールアミド;ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド;ラウロイルサルコシン;乳酸ラウリル;硫酸ラウリル;ラベンダーの開花先端部分;レシチン;未漂白レシチン;卵レシチン;水添レシチン;水添ダイズレシチン;ダイズレシチン;レモン油;ロイシン;レブリン酸;リドフェニン;軽油;軽油(85 Ssu);リモネン(+/−)−、リポコールSc−15;リジン;酢酸リジン;リジン一水和物;ケイ酸マグネシウムアルミニウム;ケイ酸アルミウニムマグネシウム水和物;塩化マグネシウム;硝酸マグネシウム;ステアリン酸マグネシウム;マレイン酸;マンニトール;マプロフィックス;メブロフェニン;改良型医療用接着剤S−15;医療用消泡エマルションA−F;メドロン酸二ナトリウム;メドロン酸;メグルミン;メントール;メタクレゾール;メタリン酸;メタンスルホン酸;メチオニン;メチルアルコール;メチルグルセス−10;メチルグルセス−20;メチルグルセス−20セスキステアレート;メチルグルコースセスキステアレート;ラウリル酸メチル;メチルピロリドン;サリチル酸メチル;ステアリン酸メチル;メチルボロン酸;メチルセルロース(4000Mpa.S);メチルセルロース;メチルクロロイソチアゾリノン;メチレンブルー;メチルイソチアゾリノン;メチルパラベン;微結晶ワックス;鉱油;モノ及びジグリセリド;クエン酸モノグリセリド;モノチオグリセロール;マルチステロールエキス;ミリスチルアルコール;乳酸ミリスチル;ミリスチル−.ガンマ.−塩化ピコリニウム;N−(カルバモイル−メトキシPeg−40)−1,2−ジステアロイル−セファリンナトリウム;N,N−ジメチルアセトアミド;ナイアシンアミド;ニオキシム;硝酸;窒素;ノノキシノールヨウ素;ノノキシノール−15;ノノキシノール−9;ノルフルラン;オートミール;オクタデセン−1/マレイン酸コポリマー;オクタン酸;オクチサレート;オクトキシノール−1;オクトキシノール−40;オクトキシノール−9;オクチルドデカノール;オクチルフェノールポリメチレン;オレイン酸;オレス−10/オレス−5;オレス−2;オレス−20;オレイルアルコール;オレイン酸オレイル;オリーブ油;オキドロネート二ナトリウム;オキシキノリン;パーム核油;パルミタミンオキシド;パラベン;パラフィン;白色軟質パラフィン;Parfum Creme 45/3;ピーナッツ油;精製ピーナッツ油;ペクチン; ステアリン酸/ステアリン酸Peg6−32グリコール;Peg植物油;ステアリン酸Peg−100;ラウリン酸Peg−12グリセリル;ステアリン酸Peg−120グリセリル;ジオレイン酸Peg−120メチルグルコース;Peg−15コカミン;ジステアリン酸Peg−150;ステアリン酸Peg−2;イソステアリン酸Peg−20ソルビタン;Peg−22メチルエーテル/ドデシルグリコールコポリマー;ステアリン酸Peg−25プロピレングリコール;ジラウリン酸Peg−4;ラウリン酸Peg−4;Peg−40ひまし油;ジイソステアリン酸Peg−40ソルビタン;Peg−45/ドデシルグリコールコポリマー;オレイン酸Peg−5;ステアリン酸Peg−50;Peg−54水添ひまし油;イソステアリン酸Peg−6;Peg−60ひまし油;Peg−60水添ひまし油;Peg−7メチルエーテル;Peg−75ラノリン;ラウリン酸Peg−8;ステアリン酸Peg−8;ステアリン酸ペグオキソール7;ペンタデカラクトン;ココ酸ペンタエリスリトール;ペンテト酸五ナトリウム;ペンテト酸カルシウム三ナトリウム;ペンテト酸;ペパーミント油;パーフルトレン;香水(Perfume)25677;香水ブーケ;香水E−1991;香水Gd5604;香水Tana 90/42 Scba;香水W−1952−1;ワセリン;白色ワセリン;石油蒸留物;フェノール;液状フェノール;フェノニップ;フェノキシエタノール;フェニルアラニン;フェニルエチルアルコール;酢酸フェニル水銀;硝酸フェニル水銀;卵ホスファチジルグリセロール;リン脂質;卵リン脂質;ホスフォリポン90g;リン酸;パインニードル油(Pinus Sylvestris);ピペラジン六水和物;プラスチベース−50w;ポラクリリン;塩化ポリドロニウム;ポロキサマー124;ポロキサマー181;ポロキサマー182;ポロキサマー188;ポロキサマー237;ポロキサマー407;ポリ(ビス(P−カルボキシフェノキシ)無水プロパン):セバシン酸;末端ブロック化ポリ(ジメチルシロキサン/メチルビニルシロキサン/メチル水素シロキサン)ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル;ポリ(Dl−乳酸−コ−グリコール酸)、(50:50;ポリ(Dl−乳酸−コ−グリコール酸)、末端化エチルエステル(50:50;ポリアクリル酸(250000Mw);ポリブテン(1400Mw);ポリカルボフィル;ポリエステル;ポリエステルポリアミンコポリマー;ポリエステルレーヨン;ポリエチレングリコール1000;ポリエチレングリコール1450;ポリエチレングリコール1500;ポリエチレングリコール1540;ポリエチレングリコール200;ポリエチレングリコール300;ポリエチレングリコール300−1600;ポリエチレングリコール3350;ポリエチレングリコール400;ポリエチレングリコール4000;ポリエチレングリコール540;ポリエチレングリコール600;ポリエチレングリコール6000;ポリエチレングリコール8000;ポリエチレングリコール900;酸化鉄黒(1%未満)を含有する高密度ポリエチレン;硫酸バリウム(20〜24%)を含有する低密度ポリエチレン;ポリエチレンT;ポリエチレンテレフタレート;ポリガラクチン;オレイン酸ポリグリセリル−3、オレイン酸ポリグリセリル−4、ポリヒドロキシエチルメタクリレート;ポリイソブチレン;ポリイソブチレン(1100000Mw);ポリイソブチレン(35000Mw);ポリイソブチレン178−236;ポリイソブチレン241−294;ポリイソブチレン35−39;低分子量ポリイソブチレン;中分子量ポリイソブチレン;ポリイソブチレン/ポリブテン接着剤;ポリラクチド;ポリオール;ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン1800;ポリオキシエチレンアルコール;ポリオキシエチレン脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンプロピレン;ポリオキシル20セトステアリルエーテル;ポリオキシル35ひまし油;ポリオキシル40水添ひまし油;ステアリン酸ポリオキシル40;ステアリン酸ポリオキシル400;パルミトステアリン酸ポリオキシル6及びポリオキシル32;ジステアリン酸ポリオキシル;ステアリン酸ポリオキシルグリセリル;ポリオキシルラノリン;パルミチン酸ポリオキシル;ステアリン酸ポリオキシル;ポリプロピレン;ポリプロピレングリコール;ポリクオタニウム−10;ポリクオタニウム−7(70/30 アクリルアミド/Dadmac;ポリシロキサン;ポリソルベート20;ポリソルベート40;ポリソルベート60;ポリソルベート65;ポリソルベート80;ポリウレタン;ポリ酢酸ビニル;ポリビニルアルコール;ポリ塩化ビニル;ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー;ポリビニルピリジン;けし油;カリ;酢酸カリウム;カリウムミョウバン;重炭酸カリウム;重亜硫酸カリウム;塩化カリウム;クエン酸カリウム;水酸化カリウム;メタ重亜硫酸カリウム;二塩基性リン酸カリウム;一塩基性リン酸カリウム;カリウム石鹸;ソルビン酸カリウム;ポビドンアクリレートコポリマー;ポビドンヒドロゲル;ポビドンK17;ポビドンK25;ポビドンK29/32;ポビドンK30;ポビドンK90;ポビドンK90f;ポビドン/エイコセンコポリマー;ポビドン;Ppg−12/Smdiコポリマー;Ppg−15ステアリルエーテル;ジステアリン酸Ppg−20メチルグルコースエーテル;オレイン酸Ppg−26;Product Wat;プロリン;プロムルゲンD;プロムルゲンG;プロパン;Propellant A−46;没食子酸プロピル;炭酸プロピレン;プロピレングリコール;二酢酸プロピレングリコール;ジカプリル酸プロピレングリコール;モノラウリル酸プロピレングリコール;モノパルミトステアリン酸プロピレングリコール;パルミトステアリン酸プロピレングリコール;リシノール酸プロピレングリコール;プロピレングリコール/ジアゾリジニル尿素/メチルパラベン/プロピルパラベン;プロピルパラベン;硫酸プロタミン;タンパク質加水分解物;Pvm/Maコポリマー;クオタニウム−15;Cis型クオタニウム−15;クオタニウム−52;Ra−2397;Ra−3011;サッカリン;サッカリンナトリウム;無水サッカリンナトリウム;ベニバナ油;Sdアルコール3a;Sdアルコール40;Sdアルコール40−2;Sdアルコール40b;セピネオP600;セリン;ゴマ油;シアバター;シラスティックブランド医療グレードチューブ;シリコーンA型シラスティック医療用接着剤;歯科用シリカ;シリコン;二酸化ケイ素;コロイド状二酸化ケイ素;シリコーン;シリコーン接着剤4102;シリコーン接着剤4502;シリコーン接着剤Bio−Psa Q7−4201;シリコーン接着剤Bio−Psa Q7−4301;シリコーンエマルション;シリコーン/ポリエステルフィルムストリップ;シメチコン;シメチコンエマルション;シポンLs 20np;ソーダ灰;酢酸ナトリウム;無水酢酸ナトリウム;アルキル硫酸ナトリウム;アスコルビン酸ナトリウム;安息香酸ナトリウム;重炭酸ナトリウム;重硫酸ナトリウム;重亜硫酸ナトリウム;ホウ酸ナトリウム;ホウ酸ナトリウム十水和物;炭酸ナトリウム;炭酸ナトリウム十水和物;炭酸ナトリウム一水和物;セトステアリル硫酸ナトリウム;塩素酸ナトリウム;塩化ナトリウム;塩化ナトリウム注射液;静菌性塩化ナトリウム注射液;コレステリル硫酸ナトリウム;クエン酸ナトリウム;ココイルサルコシン酸ナトリウム;デスオキシコール酸ナトリウム;亜ジチオン酸ナトリウム;ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム;ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム;グルコン酸ナトリウム;水酸化ナトリウム;次亜塩素酸ナトリウム;ヨウ化ナトリウム;乳酸ナトリウム;L−乳酸ナトリウム;ラウレス−2硫酸ナトリウム;ラウレス−3硫酸ナトリウム;ラウレス−5硫酸ナトリウム;ラウロイルサルコシン酸ナトリウム;ラウリル硫酸ナトリウム;ラウリルスルホ酢酸ナトリウム;
メタ重亜硫酸ナトリウム;硝酸ナトリウム;リン酸ナトリウム;リン酸ナトリウム二水和物;二塩基性リン酸ナトリウム;二塩基性無水リン酸ナトリウム;二塩基性リン酸ナトリウム二水和物;二塩基性リン酸ナトリウム七水和物;一塩基性リン酸ナトリウム;一塩基性無水リン酸ナトリウム;一塩基性リン酸ナトリウム二水和物;一塩基性リン酸ナトリウム一水和物;ポリアクリレートナトリウム(2500000Mw);ピロリン酸ナトリウム;カルボン酸ナトリウムピロリドン;グリコール酸ナトリウムデンプン;コハク酸ナトリウム六水和物;硫酸ナトリウム;無水硫酸ナトリウム;硫酸ナトリウム十水和物;亜硫酸ナトリウム;スルホコハク酸化ウンデシル酸ナトリウムモノアルキロールアミド;酒石酸ナトリウム;チオグリコール酸ナトリウム;チオリンゴ酸ナトリウム;チオ硫酸ナトリウム;無水チオ硫酸ナトリウム;トリメタリン酸ナトリウム;キシレンスルホン酸ナトリウム;Somay 44;ソルビン酸;ソルビタン;イソステアリン酸ソルビタン;モノラウリル酸ソルビタン;モノオレイン酸ソルビタン;モノパルミチン酸ソルビタン;モノステアリン酸ソルビタン;セスキオレイン酸ソルビタン;トリオレイン酸ソルビタン;トリステアリン酸ソルビタン;ソルビトール;ソルビトール溶液;ダイズ粉;ダイズ油;スペアミント油;鯨ロウ;スクアラン;安定化オキシクロロ錯体;2−エチルヘキサン酸第一スズ;塩化第一スズ;無水塩化第一スズ;フッ化第一スズ;酒石酸第一スズ;デンプン;アルファデンプン1500;トウモロコシデンプン;塩化ステラルコニウム;ヘクトライト/炭酸プロピレンステラルコニウム;ステアルアミドエチルジエチルアミン;ステアレス−10;ステアレス−100;ステアレス−2;ステアレス−20;ステアレス−21;ステアレス−40;ステアリン酸;ステアリン酸ジエタノールアミド;ステアルオキシトリメチルシラン;ステアルトリモニウム加水分解動物コラーゲン;ステアリルアルコール;吸入用滅菌水;スチレン/イソプレン/スチレンブロックコポリマー;サクシマー;コハク酸;スクラロース;スクロース;ステアリン酸スクロース;スクロースポリエステル;スルファセタミドナトリウム;スルホブチルエーテル.ベータ.−シクロデキストリン;二酸化硫黄;硫酸;スルファクトールQ;D−タガトース;タルク;トール油;牛脂グリセリド;酒石酸;Dl−酒石酸;テノックス;テノックス−2;Tert−ブチルアルコール;Tert−ブチル過酸化水素;Tert−ブチルヒドロキノン;テトラキス(2−メトキシイソブチルイソシアニド)銅(I)テトラフルオロホウ酸塩;オルトケイ酸テトラプロピル;テトロホスミン;テオフィリン;チメロサール;トレオニン;チモール;スズ;二酸化チタン;トコフェロール;トコフェルソラン;高カロリー輸液、脂質エマルション;トリアセチン;トリカプリリン;トリクロロモノフルオロメタン;トリデセス−10;ラウリル硫酸トリエタノールアミン;トリフルオロ酢酸;中鎖トリグリセリド;トリヒドロキシステアリン;リン酸トリラネス−4;リン酸トリラウレス−4;クエン酸三ナトリウム二水和物;Hedta三ナトリウム;トリトン720;トリトンX−200;トロラミン;トロマンタジン;トロメタミン(TRIS);トリプトファン;チロキサポール;チロシン;ウンデシレン酸;ユニオン76 Amsco−Res 6038;尿素;バリン;植物油;水添植物油グリセリド;水添植物油;ベルセタミド;ビスカリン;ビスコース/コットン;ビタミンE;乳化ワックス;Wecobee Fs;白色セレシンワックス;白色ワックス;キサンタンガム;亜鉛、酢酸亜鉛;炭酸亜鉛;塩化亜鉛;及び酸化亜鉛。
本明細書に開示される薬学的組成物製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg+、及びそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。非限定例として、製剤は、ポリマー及び金属カチオンとの複合体を含み得る(例えば、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,265,389号及び同第6,555,525号を参照)。
製剤はまた、1つ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、本化合物は、既存の酸または塩基部分を(例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって)その塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の好物または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸などが含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩化水素塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ性土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。
溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水(例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物)、N−メチルピロリジノン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N′−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N′−ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン(DMEU)、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2−(1H)−ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩などである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。
V.投与及び投薬
投与
「投与する」及び「導入する」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞または対象への薬学的組成物の送達を指す。対象への送達の場合、薬学的組成物は、肝細胞などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって送達され、それにより所望の効果(複数可)がもたらされる。
投与
「投与する」及び「導入する」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞または対象への薬学的組成物の送達を指す。対象への送達の場合、薬学的組成物は、肝細胞などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって送達され、それにより所望の効果(複数可)がもたらされる。
方法の一態様では、薬学的組成物は、限定されないが、経腸(腸の中)、胃腸、硬膜外(epidural)(硬膜の中)、経口(口を介して)、経皮、硬膜外(peridural)、脳内(大脳の中)、脳室内(脳室の中)、上皮(皮膚の上に適用)、皮内(皮膚自体の中)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を通して)、静脈内(静脈の中)、静脈内ボーラス、点滴、動脈内(動脈の中)、筋内(筋肉の中)、心内(心臓の中)、骨内注入(骨髄の中)、髄腔内(脊柱管の中)、腹腔内(腹腔の中に注入または注射)、膀胱内注入、硝子体内(眼を通して)、空洞内注射(病理的空洞の中)、腔内(陰茎の基部の中)、膣内投与、子宮内、羊水外投与、経皮(全身分配のための無傷の皮膚を通した拡散)、経粘膜(粘膜を通した拡散)、経腟、吹送(スノーティング)、舌下、口唇下、坐薬、点眼薬(結膜の上)、点耳薬中、耳(耳の中または耳を介して)、頬(頬に向かって指向される)、結膜、皮膚、歯(1本または複数の歯に)、電気浸透、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹部内、羊水内、動脈内、胆管内、気管支内、髄液嚢内、軟骨内(軟骨内)、仙骨内(馬尾内)、槽内(大槽小脳延髄槽内)、角膜間(角膜内)、歯冠内、冠内(冠状動脈内)、海綿体内(陰茎の海綿体の膨張性空間内)、円板内(ディスク内)、管内(腺管内)、十二指腸内(十二指腸内)、硬膜内(硬膜内または硬膜下)、上皮内(上皮へ)、食道内(食道へ)、胃内(胃内)、歯肉内(歯肉内)、回腸内(省庁の遠位部分内)、病変内(局在化病変内または直接導入)、腔内(管の腔内)、リンパ内(リンパ内)、髄内(骨の髄腔内)、髄膜内(髄膜内)、心筋内(心筋内)、眼内(目内)、卵巣内(卵巣内)、心膜内(心膜内)、胸膜内(胸膜内)、前立腺内(前立腺内)、肺内(肺またはその気管支内)、鼻腔内(鼻または眼窩腔内)、脊髄内(脊柱内)、関節滑液嚢内(関節の滑液腔内)、腱内(腱内)、精巣内(精巣内)、髄腔内(任意のレベルの脳脊髄軸での脳脊髄液内)、胸腔内(胸郭内)、管内(臓器の管内)、腫瘍内(腫瘍内)、鼓室内(中耳内)、血管内(1本または複数の血管内)、心室内(心室内)、イオン泳動(可溶性塩のイオンが身体の組織中に移行する電流によって)、灌水(開放創または体腔を浸すまたは洗い流す)、喉頭(咽頭の上に直接)、鼻腔胃(鼻を通して胃の中に)、密封包帯法(後に領域を密封する包帯によって被覆される局所経路投与)、眼部(外眼部に)、中咽頭(口及び咽頭に直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸(局所または全身効果のために経口的または経鼻的に吸入することによって気道内)、眼球後(脳端の後ろまたは眼球の後ろ)、心筋内(心筋に入る)、軟組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤(胎盤を通るかまたは胎盤全体)、経気管(気管の壁を通る)、経鼓膜(鼓室全体または鼓室を通る)、尿管(尿管へ)、尿道(尿道へ)、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス及び脊柱などの経路を介して投与され得る。
投与様式には、注射、注入、点滴、及び/または摂取が含まれる。「注射」には、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。いくつかの例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与を行うことができる。
細胞は、全身的に投与することができる。「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、または臓器に直接ではない形で投与することを指し、それにより、代わりに対象の循環系に侵入し、したがって代謝及び他の類似プロセスに供される。
投薬
「有効量」という用語は、特定の疾患及び/または病態の少なくとも1つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な活性成分の量を指し、所望の効果を提供するための組成物の十分な量に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分である活性成分を含む、活性成分または組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更(例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること)、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
「有効量」という用語は、特定の疾患及び/または病態の少なくとも1つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な活性成分の量を指し、所望の効果を提供するための組成物の十分な量に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分である活性成分を含む、活性成分または組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更(例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること)、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
薬学的、診断的、または予防的組成物は、疾患、障害及び/または病態を予防、治療、管理、または診断するために有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なり得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。組成物は典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために単一剤形で製剤化される。しかしながら、総1日使用量は、合理的な医療判断の範囲内で担当医師により決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の個体についての具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度;用いられる具体的なペイロードの活性;用いられる具体的な組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事;投与の時間及び投与の経路;治療の期間;活性成分と組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、1日あたり対象の体重の約0.01mg/kg〜約100mg/kg、約0.01mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.05mg/kg〜約0.5mg/kg、約0.01mg/kg〜約50mg/kg、約0.1mg/kg〜約40mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、または約1mg/kg〜約25mg/kgを、1日1回以上送達して、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために十分な投与量レベルで投与され得る。
組成物の所望の投与量は、1回のみ、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、毎週、2週間ごと、3週間ごと、または4週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、多回投与(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14回、またはそれ以上の投与)を使用して送達され得る。多回投与を用いる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または全日用量の2用量以上への分割、例えば「単一単位用量」の2回以上の投与である。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、1用量/1回/単一経路/単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療約の用量である。
フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患の治療のためのゲノムシグナル伝達中心(GSC)または全体遺伝子シグナル伝達ネットワーク(GSN)の摂動のための組成物及び方法が、本明細書に記載される。本開示の1つ以上の実施形態の詳細が、添付の以下の記載で説明される。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の材料及び方法を本開示の実践または試験において使用することもできるが、好ましい材料及び方法は、これから説明される。本開示の他の特徴、目的及び利点は、その説明から明らかになるであろう。この説明において、単数形は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が制御する。
本開示はさらに、以下の非限定的な実施例によって例示される。
VII.実施例
実施例1.実験手順
A.ヒト肝細胞細胞培養
ヒト肝細胞は、Massachusetts General Hospitalからの2名のドナー(すなわち、MGH54及びMGH63)、ならびにLonzaからの1名のドナー(すなわちHUM4111B)から取得した。凍結保存した肝細胞を、平板培地中で16時間培養し、維持培地に4時間移した。無血清培地上で2時間培養し、次いで化合物を添加した。遺伝子発現分析の前に、肝細胞を無血清培地上で16時間維持した。一次ヒト肝細胞を、液体窒素冷凍庫(約−130℃)の気相中で保存した。
実施例1.実験手順
A.ヒト肝細胞細胞培養
ヒト肝細胞は、Massachusetts General Hospitalからの2名のドナー(すなわち、MGH54及びMGH63)、ならびにLonzaからの1名のドナー(すなわちHUM4111B)から取得した。凍結保存した肝細胞を、平板培地中で16時間培養し、維持培地に4時間移した。無血清培地上で2時間培養し、次いで化合物を添加した。遺伝子発現分析の前に、肝細胞を無血清培地上で16時間維持した。一次ヒト肝細胞を、液体窒素冷凍庫(約−130℃)の気相中で保存した。
一次ヒト肝細胞を播種するために、細胞のバイアルをLN2冷凍庫から回収し、37℃の水浴中で解凍し、氷のかけらのみが残るまで優しく旋回させた。10mLの血清学的ピペットを使用して、細胞をバイアルから優しく分注し、20mLの冷解凍培地を含有する50mLのコニカルチューブの側面下に優しく分注した。バイアルを約1mLの解凍培地ですすぎ、リンスをコニカルチューブに添加した。最大2バイアルを、20mLの解凍培地の1つのチューブに添加することができる。
コニカルチューブ(複数可)を優しく2〜3回反転させ、4℃で10分間100gで制動力を低減して(例えば、9のうち4)遠心分離した。解凍培地をゆっくりゆっくり吸引して、ペレットを避ける。4mLの冷平板培地を、側面の下にゆっくり添加し(2バイアルを1つのチューブに複合する場合、8mL)、バイアルを優しく数回反転させて細胞を再懸濁した。
100μLの十分に混合された細胞が400μLの希釈トリパンブルーに添加されるまで、細胞を氷上で保持し、優しく反転させることによって混合した。血球計数器(またはCellometer)を使用して細胞をカウントし、生存性及び1mLあたりの生細胞を記録した。細胞を所望の濃度に希釈し、コラーゲンIで被覆したプレート上に播種した。細胞をゆっくり優しくプレートの上に、一度に1〜2ウェルのみに分注した。残りの細胞を、優しく反転させることによって頻繁にチューブ内で混合した。細胞を、6mLの冷平板培地(10cm)中にプレートあたり約8.5×106細胞で播種した。代替として、6ウェルプレートの場合、ウェルあたり約1.5×106(1mL培地/ウェル)、12ウェルプレートの場合、ウェルあたり7×105(0.5mL/ウェル)、または24ウェルプレートの場合、ウェルあたり3.75×105(0.5mL/ウェル)で細胞を播種した。
全ての細胞及び培地をプレートに添加した後、プレートをインキュベーターに移し(37℃、5%のCO2、約90%の湿度)、前後に、次いで左右に各々数回揺らして、細胞をプレートまたはウェル全体に均一に分布させた。プレート(複数可)をプレーティング後最初の1時間にわたって15分ごとに再度揺らした。プレーティングの約4時間後(または細胞を午後にプレーティングした場合は朝一番に)、細胞をPBSで1回洗浄し、完全維持培地を添加した。一次ヒト肝細胞を維持培地中で維持し、毎日新鮮な培地に移した。
B.ヒト肝細胞の枯渇及び化合物処理
上記のように培養したヒト肝細胞を、24ウェルフォーマットでプレーティングし、500μLの量の平板培地中にウェルあたり375,000細胞を添加した。治療の4時間前に、細胞をPBSで洗浄し、培地を新鮮な遺伝培地(完全)または修飾された維持培地のいずれかに変えた。
上記のように培養したヒト肝細胞を、24ウェルフォーマットでプレーティングし、500μLの量の平板培地中にウェルあたり375,000細胞を添加した。治療の4時間前に、細胞をPBSで洗浄し、培地を新鮮な遺伝培地(完全)または修飾された維持培地のいずれかに変えた。
化合物ストックを、1000×最終濃度で調製し、2段階希釈で培地に添加して、細胞に添加したときに化合物が溶液から沈殿するリスクを低減し、妥当なピペット量を保証した。1つずつ、各化合物を温かい(約37℃)修飾された維持培地中で最初に10倍希釈し(初期希釈=ID)、ボルテックスすることによって混合し、IDを細胞培養物中に100倍希釈した(例えば、0.5mLの培地を含有する24プレートの1ウェル中に5.1μL)。プレートを慎重に旋回させることによって混合し、全てのウェルを処理した後、インキュベーターに一晩戻した。所望される場合、別個のプレート/ウェルをビヒクルのみの対照及び/または正の対照で処理した。マルチウェルプレートを使用する場合、対照を各プレート上に含めた。約18時間後、細胞をさらなる分析、例えば、ChIP−seq、RNA−seq、ATAC−seqなどのために採取した。
C.マウス肝細胞細胞培養及び化合物処理
雌C57BL/6マウスの肝細胞(F005152冷凍保存)を、45ドナーのプールとしてBioreclamationIVTから購入した。細胞を、0.5mL培地中200K細胞/ウェルで24時間、コラーゲンで被覆した24ウェルプレート上のInvitroGRO CP齧歯類培地(Z990028)及びTorpedo齧歯類抗生物質ミックス(Z99027)中にプレーティングした。10mMのDMSO中の化合物ストックを、10μMに(1%のDMSOの最終濃度で)希釈し、生物学的三重複で細胞上に適用した。20時間後に培地を取り除き、細胞をさらなる分析、例えば、qRT−PCRのために処理した。
雌C57BL/6マウスの肝細胞(F005152冷凍保存)を、45ドナーのプールとしてBioreclamationIVTから購入した。細胞を、0.5mL培地中200K細胞/ウェルで24時間、コラーゲンで被覆した24ウェルプレート上のInvitroGRO CP齧歯類培地(Z990028)及びTorpedo齧歯類抗生物質ミックス(Z99027)中にプレーティングした。10mMのDMSO中の化合物ストックを、10μMに(1%のDMSOの最終濃度で)希釈し、生物学的三重複で細胞上に適用した。20時間後に培地を取り除き、細胞をさらなる分析、例えば、qRT−PCRのために処理した。
D.培地組成
解凍培地は、6mLの等張パーコール及び14mLの高グルコースDMEM(Invitrogen#11965または同様のもの)を含有していた。平板培地は、100mLのWilliams E培地(Invitrogen#A1217601、フェノールレッドなし)、ならびに5mLのFBS、10μLのデキサメタゾン、及び3.6mLのプレーティング/維持カクテルを含有するThermoFisher平板培地からの補足パック#CM3000を含有していた。ストックトリパンブルー(0.4%、Invitrogen#15250)を、PBS中で1:5に希釈した。Normocinを、解凍培地及び平板培地の両方に1:500で添加した。
解凍培地は、6mLの等張パーコール及び14mLの高グルコースDMEM(Invitrogen#11965または同様のもの)を含有していた。平板培地は、100mLのWilliams E培地(Invitrogen#A1217601、フェノールレッドなし)、ならびに5mLのFBS、10μLのデキサメタゾン、及び3.6mLのプレーティング/維持カクテルを含有するThermoFisher平板培地からの補足パック#CM3000を含有していた。ストックトリパンブルー(0.4%、Invitrogen#15250)を、PBS中で1:5に希釈した。Normocinを、解凍培地及び平板培地の両方に1:500で添加した。
ThermoFisher完全維持培地は、補足パック#CM4000(1μLのデキサメタゾン及び4mLの維持カクテル)ならびに100mLのWilliams E(Invitrogen#A1217601、フェノールレッドなし)を含有していた。
修飾された維持培地は、刺激因子(デキサメタゾン、インスリンなど)を有しておらず、100mLのWilliams E(Invitrogen#A1217601、フェノールレッドなし)、2mMまで1mLのL−グルタミン(Sigma#G7513)、15mMまで1.5mLのHEPES(VWR#J848)、及び各々50U/mLの最終濃度まで0.5mLのペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen#15140)を含有していた。
E.DNA精製
DNA精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ji et al.,PNAS,112(12):3841−3846(2015)補助情報に記載されるように行った。1ミリリットルの2.5Mグリシンを、固定細胞の各プレートに添加し、5分間インキュベートしてホルムアルデヒドをクエンチした。細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を4℃で5分間、1,300gでペレット化した。次いで、4×107細胞を各チューブ内に収集した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する1mLの氷冷Nonidet P−40溶解緩衝液で、氷上で5分間優しく溶解した(緩衝液レシピは以下に提供される)。細胞溶解物を、Nonidet P−40溶解緩衝液中の24%(wt/vol)スクロースで形成された2.5量のスクロースクッションの上に積層した。この試料を4℃で10分間、18,000gで遠心分離して、核ペレットを単離した(上澄みは、細胞質画分を表していた)。核ペレットをPBS/1mM EDTAで1回洗浄した。核ペレットを0.5mLのグリセロール緩衝液で優しく再懸濁し、続いて等量の核溶解緩衝液で氷上で2分間インキュベートした。この試料を4℃で2分間、16,000gで遠心分離して、クロマチンペレットを単離した(上澄みは、核可溶性画分を表していた)。クロマチンペレットをPBS/1mM EDTAで2回洗浄した。クロマチンペレットを−80℃で保存した。
DNA精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ji et al.,PNAS,112(12):3841−3846(2015)補助情報に記載されるように行った。1ミリリットルの2.5Mグリシンを、固定細胞の各プレートに添加し、5分間インキュベートしてホルムアルデヒドをクエンチした。細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を4℃で5分間、1,300gでペレット化した。次いで、4×107細胞を各チューブ内に収集した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する1mLの氷冷Nonidet P−40溶解緩衝液で、氷上で5分間優しく溶解した(緩衝液レシピは以下に提供される)。細胞溶解物を、Nonidet P−40溶解緩衝液中の24%(wt/vol)スクロースで形成された2.5量のスクロースクッションの上に積層した。この試料を4℃で10分間、18,000gで遠心分離して、核ペレットを単離した(上澄みは、細胞質画分を表していた)。核ペレットをPBS/1mM EDTAで1回洗浄した。核ペレットを0.5mLのグリセロール緩衝液で優しく再懸濁し、続いて等量の核溶解緩衝液で氷上で2分間インキュベートした。この試料を4℃で2分間、16,000gで遠心分離して、クロマチンペレットを単離した(上澄みは、核可溶性画分を表していた)。クロマチンペレットをPBS/1mM EDTAで2回洗浄した。クロマチンペレットを−80℃で保存した。
Nonidet P−40溶解緩衝液は、10mMのTris・HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、及び0.05%のNonidet P−40を含有していた。グリセロール緩衝液は、20mMのTris・HCl(pH7.9)、75mMのNaCl、0.5mMのEDTA、0.85mMのDTT、及び50%(vol/vol)グリセロールを含有していた。核溶解緩衝液は、10mMのHepes(pH7.6)、1mMのDTT、7.5mMのMgCl2、0.2mMのEDTA、0.3MのNaCl、1Mの尿素、及び1%のNonidet P−40を含有していた。
F.クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP−seq)
一次肝細胞及びHepG2細胞について以下のプロトコルを使用してChIP−seqを実施して、組成物を決定し、シグナル伝達中心の位置を確認した。
一次肝細胞及びHepG2細胞について以下のプロトコルを使用してChIP−seqを実施して、組成物を決定し、シグナル伝達中心の位置を確認した。
i.細胞架橋
2×107細胞を、ChIP−seqの各実行に使用した。2mLの新鮮な11%ホルムアルデヒド(FA)溶液を、15cmプレート上の20mLの培地に添加して、1.1%の最終濃度に到達させた。プレートを短時間旋回させ、室温(RT)で15分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、FAを、1mLの2.5Mグリシンをプレートに添加し、室温で5分間インキュベートすることによってクエンチした。培地を1Lビーカーに破棄し、細胞を20mLの氷冷PBSで2回洗浄した。PBS(10mL)をプレートに添加し、細胞をプレートから掻き落とした。細胞を15mLのコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置いた。プレートを、追加の4mLのPBSで洗浄し、15mLのチューブ内で細胞と複合した。チューブを5分間、1,500rpm、4℃で卓上遠心分離機で遠心分離した。PBSを吸引し、細胞を液体窒素中で急速冷凍した。ペレットを、使用準備が整うまで−80℃で保存した。
2×107細胞を、ChIP−seqの各実行に使用した。2mLの新鮮な11%ホルムアルデヒド(FA)溶液を、15cmプレート上の20mLの培地に添加して、1.1%の最終濃度に到達させた。プレートを短時間旋回させ、室温(RT)で15分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、FAを、1mLの2.5Mグリシンをプレートに添加し、室温で5分間インキュベートすることによってクエンチした。培地を1Lビーカーに破棄し、細胞を20mLの氷冷PBSで2回洗浄した。PBS(10mL)をプレートに添加し、細胞をプレートから掻き落とした。細胞を15mLのコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置いた。プレートを、追加の4mLのPBSで洗浄し、15mLのチューブ内で細胞と複合した。チューブを5分間、1,500rpm、4℃で卓上遠心分離機で遠心分離した。PBSを吸引し、細胞を液体窒素中で急速冷凍した。ペレットを、使用準備が整うまで−80℃で保存した。
ii.予ブロック磁気ビーズ
30μLのプロテインGビーズ(反応あたり)を、1.5mLのProtein LoBindエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを、磁気分離によって室温で30秒間収集した。ビーズを、4℃で10分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、1mLのブロッキング溶液で3回洗浄した。5μgの抗体を、ブロッキング溶液中の250μLのビーズに添加した。混合物を透明なチューブに移し、4℃で一晩回転させた。翌日に、抗体を含有する緩衝液を取り除き、ビーズを、4℃で10分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、1.1mLのブロッキング溶液で3回洗浄した。ビーズを、50μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、使用準備が整うまで氷上で保持した。
30μLのプロテインGビーズ(反応あたり)を、1.5mLのProtein LoBindエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを、磁気分離によって室温で30秒間収集した。ビーズを、4℃で10分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、1mLのブロッキング溶液で3回洗浄した。5μgの抗体を、ブロッキング溶液中の250μLのビーズに添加した。混合物を透明なチューブに移し、4℃で一晩回転させた。翌日に、抗体を含有する緩衝液を取り除き、ビーズを、4℃で10分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、1.1mLのブロッキング溶液で3回洗浄した。ビーズを、50μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、使用準備が整うまで氷上で保持した。
iii.細胞溶解、ゲノム断片化、及びクロマチン免疫沈降
COMPLETE(登録商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルを、使用前に溶解緩衝液1(LB1)に添加した。50x溶液の場合、1錠を1mLのH2Oに溶解した。カクテルを−20℃でアリコート中に保存した。細胞を各チューブ内での8mLのLB1中に再懸濁し、4℃で10分間、回転器上でインキュベートした。核を、4℃で5分間、1,350gで遠心沈殿した。LB1を吸引し、細胞を、各チューブ内での8mLのLB2中に再懸濁し、4℃で10分間、回転器上でインキュベートした。
COMPLETE(登録商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルを、使用前に溶解緩衝液1(LB1)に添加した。50x溶液の場合、1錠を1mLのH2Oに溶解した。カクテルを−20℃でアリコート中に保存した。細胞を各チューブ内での8mLのLB1中に再懸濁し、4℃で10分間、回転器上でインキュベートした。核を、4℃で5分間、1,350gで遠心沈殿した。LB1を吸引し、細胞を、各チューブ内での8mLのLB2中に再懸濁し、4℃で10分間、回転器上でインキュベートした。
COVARIS(登録商標)E220EVOLUTION(商標)超音波処理器を、高細胞数についての製造元の推奨に従ってプログラムした。HepG2細胞を12分間音波処理し、一次肝細胞試料を10分間音波処理した。溶解物を清潔な1.5mLエッペンドルフチューブに移し、チューブを4℃で10分間、20,000gで遠心分離して残屑をペレット化した。上澄みを、予め結合された抗体を有する予めブロックされたプロテインGビーズを含有する2mLのProtein LoBindエッペンドルフチューブに移した。50μLの上澄みをインプットとして保存した。インプット材料を、使用準備が整うまで−80℃で保持した。チューブを4℃で一晩、ビーズで回転させた。
iv.洗浄、溶出、及び架橋逆転
全ての洗浄ステップは、チューブを4℃で5分間回転させることによって実施した。洗浄ステップごとに、ビーズを清潔なProtein LoBindエッペンドルフチューブに移した。ビーズを、磁石を使用して1.5mLのエッペンドルフチューブ内で収集した。ビーズを1.1mLの音波処理緩衝液で2回洗浄した。磁気スタンドを使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを1.1mLの洗浄緩衝液2で2回洗浄し、磁気スタンドを再度使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを1.1mLの洗浄緩衝液3で2回洗浄した。全ての残留洗浄緩衝液3を取り除き、ビーズを1.1mLのTE+0.2%のTriton X−100緩衝液で1回洗浄した。残留TE+0.2%のTriton X−100緩衝液を取り除き、ビーズをTE緩衝液で毎回30秒間にわたって2回洗浄した。残留TE緩衝液を取り除き、ビーズを300μLのChIP溶出緩衝液中に再懸濁した。250μLのChIP溶出緩衝液を、50μLのインプットに添加し、チューブを65℃で1時間、ビーズで回転させた。インプット試料を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移した。溶出液を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
全ての洗浄ステップは、チューブを4℃で5分間回転させることによって実施した。洗浄ステップごとに、ビーズを清潔なProtein LoBindエッペンドルフチューブに移した。ビーズを、磁石を使用して1.5mLのエッペンドルフチューブ内で収集した。ビーズを1.1mLの音波処理緩衝液で2回洗浄した。磁気スタンドを使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを1.1mLの洗浄緩衝液2で2回洗浄し、磁気スタンドを再度使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを1.1mLの洗浄緩衝液3で2回洗浄した。全ての残留洗浄緩衝液3を取り除き、ビーズを1.1mLのTE+0.2%のTriton X−100緩衝液で1回洗浄した。残留TE+0.2%のTriton X−100緩衝液を取り除き、ビーズをTE緩衝液で毎回30秒間にわたって2回洗浄した。残留TE緩衝液を取り除き、ビーズを300μLのChIP溶出緩衝液中に再懸濁した。250μLのChIP溶出緩衝液を、50μLのインプットに添加し、チューブを65℃で1時間、ビーズで回転させた。インプット試料を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移した。溶出液を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
v.クロマチン抽出及び沈降
インプット及び免疫沈降(IP)試料を新鮮なチューブに移し、300μLのTE緩衝液をIP及びインプット試料に添加して、SDSを希釈した。RNase A(20mg/mL)をチューブに添加し、チューブを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、3μLの1MのCaCl2及び7μLの20mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、55℃で1.5時間インキュベートした。MaXtract高密度2mLゲルチューブ(Qiagen)を、室温で30秒間、全速での遠心分離によって調製した。600μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを各プロテイナーゼK反応に添加し、約1.2mLの混合物中でMaXtractチューブに移した。チューブを室温で5分間、16,000gで回転させた。水相を2つの清潔なDNA LoBindチューブに移し(各チューブに300μL)、1.5μLのグリコーゲン、30μLの3M酢酸ナトリウム、及び900μLのエタノールを添加した。混合物を−20℃で一晩または−80℃で1時間沈降させ、4℃で20分間、最大速度で遠心沈殿させた。エタノールを取り除き、チューブを4℃で5分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを1mLの75%エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させた。25μLのH2Oを各免疫沈降(IP)及びインプットペレットに添加し、5分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのDNAを組み合わせ、各試料について50μLのIP及び50μLのインプットDNAを得た。1μLのこのDNAを使用し、Qubit dsDNA HSアッセイ(ThermoFisher、#Q32854)を使用してプルダウンDNAの量を測定した。免疫沈降材料の全量は、数ng(TFの場合)〜数百ng(クロマチン修飾の場合)の範囲であった。6μLのDNAをqRT−PCRを使用して分析して、富化を決定した。必要に応じてDNAを希釈した。富化が良好であった場合、残りをDNAシーケンシングのためのライブラリー調製に使用した。
インプット及び免疫沈降(IP)試料を新鮮なチューブに移し、300μLのTE緩衝液をIP及びインプット試料に添加して、SDSを希釈した。RNase A(20mg/mL)をチューブに添加し、チューブを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、3μLの1MのCaCl2及び7μLの20mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、55℃で1.5時間インキュベートした。MaXtract高密度2mLゲルチューブ(Qiagen)を、室温で30秒間、全速での遠心分離によって調製した。600μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを各プロテイナーゼK反応に添加し、約1.2mLの混合物中でMaXtractチューブに移した。チューブを室温で5分間、16,000gで回転させた。水相を2つの清潔なDNA LoBindチューブに移し(各チューブに300μL)、1.5μLのグリコーゲン、30μLの3M酢酸ナトリウム、及び900μLのエタノールを添加した。混合物を−20℃で一晩または−80℃で1時間沈降させ、4℃で20分間、最大速度で遠心沈殿させた。エタノールを取り除き、チューブを4℃で5分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを1mLの75%エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させた。25μLのH2Oを各免疫沈降(IP)及びインプットペレットに添加し、5分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのDNAを組み合わせ、各試料について50μLのIP及び50μLのインプットDNAを得た。1μLのこのDNAを使用し、Qubit dsDNA HSアッセイ(ThermoFisher、#Q32854)を使用してプルダウンDNAの量を測定した。免疫沈降材料の全量は、数ng(TFの場合)〜数百ng(クロマチン修飾の場合)の範囲であった。6μLのDNAをqRT−PCRを使用して分析して、富化を決定した。必要に応じてDNAを希釈した。富化が良好であった場合、残りをDNAシーケンシングのためのライブラリー調製に使用した。
vi.DNAシーケンシングのためのライブラリー調製
Illumina用のNEBNext Multiplex Oligos(NEB、#6609S)を使用するIllumina用のNEBNext Ultra II DNAライブラリー調製キット(NEB、#E7645)を使用して、製造元の指示に従い、以下の修正とともにライブラリーを調製した。ライブラリー調製のための残りのChIP試料(約43μL)及び1μgのインプット試料を、プロトコルの末端修復部分の前に50μLの量にした。接着プレートシール(ThermoFisher、#AB0558)で密封し、少なくとも1つの空のウェルを異なる試料の間に残した96ウェルの半スカート状PCRプレート(ThermoFisher、#AB1400)において、加熱した蓋を有するPCRマシンで末端修復反応を実行した。未希釈のアダプターをインプット試料に使用し、1:10に希釈したアダプターを5〜100ngのChIP材料に使用し、1:25に希釈したアダプターを5ng未満のChIP材料に使用した。加熱した蓋を取り外したPCRマシンで連結反応を実行した。アダプター連結されたDNAを、清潔なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移し、H2Oを使用して量を96.5μLにした。
Illumina用のNEBNext Multiplex Oligos(NEB、#6609S)を使用するIllumina用のNEBNext Ultra II DNAライブラリー調製キット(NEB、#E7645)を使用して、製造元の指示に従い、以下の修正とともにライブラリーを調製した。ライブラリー調製のための残りのChIP試料(約43μL)及び1μgのインプット試料を、プロトコルの末端修復部分の前に50μLの量にした。接着プレートシール(ThermoFisher、#AB0558)で密封し、少なくとも1つの空のウェルを異なる試料の間に残した96ウェルの半スカート状PCRプレート(ThermoFisher、#AB1400)において、加熱した蓋を有するPCRマシンで末端修復反応を実行した。未希釈のアダプターをインプット試料に使用し、1:10に希釈したアダプターを5〜100ngのChIP材料に使用し、1:25に希釈したアダプターを5ng未満のChIP材料に使用した。加熱した蓋を取り外したPCRマシンで連結反応を実行した。アダプター連結されたDNAを、清潔なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移し、H2Oを使用して量を96.5μLにした。
SPRIselect磁気ビーズ(Beckman Coulter、#B23317)を使用して、200〜600bpのChIP断片を選択した。30μLのビーズを96.5μLのChIP試料に添加して、600bpより長い断片に結合させた。より短い断片を新鮮なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移した。15μLのビーズを添加して、200bpより長いDNAに結合し、新鮮に調製された75%エタノールを使用して、ビーズをDNAで2回洗浄した。17μLの0.1X TE緩衝液を使用して、DNAを溶出した。約15μLを収集した。
3μLのサイズ選択されたインプット試料及びChIP試料の全て(15μL)をPCRに使用した。サイズ選択されたDNAの量は、Qubit dsDNA HSアッセイを使用して測定した。約5〜10ngのサイズ選択されたDNAを有するインプット試料及びChIP試料については7サイクル、及び5ng未満のサイズ選択されたDNAを有する場合は12サイクルにわたってPCRを実行した。PCR産生物(25μL)の半分を、製造元の指示に従い、22.5μLのAMPure XPビーズ(Beckman Coulter、#A63880)で精製した。PCR産生物を、17μLの0.1X TE緩衝液で溶出し、PCT産生物の量をQubit dsDNA HSアッセイを使用して測定した。5ng未満のPCR産生物を有する試料の残りの半分について、追加の4サイクルのPCRを実行し、DNAを22.5μLのAMPure XPビーズを使用して精製した。濃度を測定して、収率の増加が存在したかどうかを決定した。両方の半分を複合し、H2Oを使用して量を最大50μLにした。
2回目のDNAの精製は、17μLの0.1X TE中の45μLのAMPure XPビーズを使用して実行し、Qubit dsDNA HSアッセイを使用して、最終収率を測定した。このプロトコルは、20ngから1mgのPCR産生物を産生する。ライブラリーの質を、必要に応じて、製造元の推奨に基づいて高感度BioAnalyzer DNAキット(Agilent、#5067−4626)を使用し、1μLの各試料をH2Oで希釈することによって検証した。
vii.試薬
11%のホルムアルデヒド溶液(50mL)は、14.9mLの37%ホルムアルデヒド(最終濃度11%)、1mLの5M NaCl(最終濃度0.1M)、100μLの0.5MのEDTA(pH8)(最終濃度1mM)、50μLの0.5M EGTA(pH8)(最終濃度0.5mM)、及び2.5mLの1M Hepes(pH7.5)(最終濃度50mM)を含有していた。
11%のホルムアルデヒド溶液(50mL)は、14.9mLの37%ホルムアルデヒド(最終濃度11%)、1mLの5M NaCl(最終濃度0.1M)、100μLの0.5MのEDTA(pH8)(最終濃度1mM)、50μLの0.5M EGTA(pH8)(最終濃度0.5mM)、及び2.5mLの1M Hepes(pH7.5)(最終濃度50mM)を含有していた。
ブロッキング溶液は、PBS中の0.5%のBSA(w/v)及び100mLのPBS中の500mgのBSAを含有していた。ブロッキング溶液は、使用の最大約4日前に調製してもよい。
溶解緩衝液1(LB1)(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、14mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの100%グリセロール溶液、25mLの10%NP−40、及び12.5mLの10%Triton X−100を含有していた。pHを7.5に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
溶解緩衝液2(LB2)(1000mL)は、10mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、40mLの5M NaCl、2mLの0.5M EDTA(pH8.0)、及び2mLの0.5M EGTA(pH8.0)を含有していた。pHを8.0に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
音波処理緩衝液(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、14mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%Triton X−100、10mLの5%Na−デオキシコール酸塩、及び5mLの10%SDSを含有していた。pHを7.5に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
プロテイナーゼ阻害剤は、LB1、LB2、及び音波処理緩衝液に含まれていた。
洗浄緩衝液2(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、35mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%Triton X−100、10mLの5%Na−デオキシコール酸塩、及び5mLの10%SDSを含有していた。pHを7.5に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
洗浄緩衝液3(500mL)は、10mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、125mLの1M LiCl溶液、25mLの10%NP−40、及び50mLの5%Na−デオキシコール酸塩を含有していた。pHを8.0に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
ChIP溶出緩衝液(500mL)は、25mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、10mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%SDS、及び415mLのddH2Oを含有していた。pHを7.5に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
G.ChIP−seq結果の分析
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、デフォルトオプションを有するtrim_galore 0.4.4を使用して配列決定アダプターでトリミングした。トリミングした読み出し値を、デフォルトパラメーターを有するbwaバージョン0.7.15(Li(2013)arXiv:1303.3997v1)を使用して、ヒトゲノム(hs38d1/GCA_000786075.2とマージしたアセンブリGRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析セット)に対してマップした。整列した読み出し重複を、picard 2.9.0(http://broadinstitute.hithub.io/picard)を使用して評価し、MAPQ<20またはそれらの適合している標準SAMフラグ0x1804を有する読み出し値を破棄した。標準QC(読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス)を適用して、不満足な試料を除去した。MACS2バージョン2.1.0を使用して、試料を全細胞抽出物対照と比較することによって、濃縮ChIP−seqピークを同定し(Zhang et al.,Genome Biol.(2008)9(9):R137)、有意なピークを0.01未満の調節したp値を有するものとして選択した。既知の重複する既知の反復的な「ブラックリスト」領域(ENCODE Project Consortium,Nature(2012)489(7414:57−74)を破棄した。また、ChIP−seqシグナルを読み出し深さによって正規化し、UCSCブラウザーを使用して可視化した。
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、デフォルトオプションを有するtrim_galore 0.4.4を使用して配列決定アダプターでトリミングした。トリミングした読み出し値を、デフォルトパラメーターを有するbwaバージョン0.7.15(Li(2013)arXiv:1303.3997v1)を使用して、ヒトゲノム(hs38d1/GCA_000786075.2とマージしたアセンブリGRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析セット)に対してマップした。整列した読み出し重複を、picard 2.9.0(http://broadinstitute.hithub.io/picard)を使用して評価し、MAPQ<20またはそれらの適合している標準SAMフラグ0x1804を有する読み出し値を破棄した。標準QC(読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス)を適用して、不満足な試料を除去した。MACS2バージョン2.1.0を使用して、試料を全細胞抽出物対照と比較することによって、濃縮ChIP−seqピークを同定し(Zhang et al.,Genome Biol.(2008)9(9):R137)、有意なピークを0.01未満の調節したp値を有するものとして選択した。既知の重複する既知の反復的な「ブラックリスト」領域(ENCODE Project Consortium,Nature(2012)489(7414:57−74)を破棄した。また、ChIP−seqシグナルを読み出し深さによって正規化し、UCSCブラウザーを使用して可視化した。
H.RNA−seq
このプロトコルは、以下のプロトコルの修飾バージョンである。MagMAX mirVana Total RNA単離キットユーザーガイド(Applied Biosystems#MAN0011131 Rev B.0)、NEBNext Poly(A)mRNA磁気単離モジュール(E7490)、及びIllumina用NEBNext Ultra Directional RNAライブラリー調製キット(E7420)(New England Biosystems#E74901)。
このプロトコルは、以下のプロトコルの修飾バージョンである。MagMAX mirVana Total RNA単離キットユーザーガイド(Applied Biosystems#MAN0011131 Rev B.0)、NEBNext Poly(A)mRNA磁気単離モジュール(E7490)、及びIllumina用NEBNext Ultra Directional RNAライブラリー調製キット(E7420)(New England Biosystems#E74901)。
MagMax mirVanaキット指示書(14〜17頁の「細胞からRNAを単離する」と題されるセクション)を、培養物中の細胞から全RNAを単離するために使用した。接着細胞を含有するマルチウェルプレート(通常は24ウェルプレート)のウェルあたり200μLの溶解結合混合物を使用した。
mRNA単離及びライブラリー調製のために、NEBNext Poly(A)mRNA磁気単離モジュール及びDirectional Prepキットを使用した。上記の細胞から単離されたRNAを定量化し、50μLのヌクレアーゼ不含水中500μgの各試料中で調製した。このプロトコルは、微量遠心管または96ウェルプレート中で実行することができる。
80%エタノールを新たに調製し、全ての溶出を0.1X TE緩衝液中で行う。Ampure XPビーズを必要とするステップの場合、ビーズを使用前に室温にした。試料の量を最初に測定し、ビーズを分注した。セクション1.9B(1.9Aではない)を、Illumina用のNEBNext Multiplex Oligos(#E6609)に使用した。PCR富化を開始する前に、Qubit(DNA高感度キット、ThermoFisher#Q32854)を使用して、cDNAを定量化した。PCR反応を12サイクルにわたって実行した。
PCR反応の精製(ステップ1.10)後、Qubit DNA高感度キットを使用して、ライブラリーを定量化した。1μLの各試料を1〜2ng/μLに希釈して、BioAnalyzer(DNA高感度キット、Agilent#5067−4626)上で実行した。Bioanalyzerが清浄でなかった場合(およそ300bpの1つの狭いピーク)、0.9Xまたは1.0Xのビーズ:試料比を使用して、AMPure XPビーズクリーンアップステップを繰り返した。次いで、試料をQubitで再度定量化し、Bioanalyzer上で再度実行した(1〜2ng/μL)。
INTACT精製された核または新皮質核全体からの核RNAを、cDNAに変換し、Nugen Ovation RNA−seq System V2で増幅させた。ライブラリーをIllumina HiSeq2500を使用してシーケンシングした。
I.RNA−seqデータ分析
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、STARバージョン2.5.3a(アラインメントパラメータalignIntronMin=20;alignIntronMax=1000000;outFilterMismatchNmax=999;outFilterMismatchNoverLmax=0.05;outFilterType=BySJout;outFilterMultimapNmax=20;alignSJoverhangMin=8;alignSJDBoverhangMin=1;alignMatesGapMax=1000000)を介した2つのパスマッピングを使用して、ヒトゲノム(hs38d1/GCA_000786075.2とマージしたアセンブリGRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析セット)に対してマップした(Dobin et al., Bioinformatics(2012)29(1):15−21)。ヒトGENCODE遺伝子セットリリース24からの参照転写注釈に基づいて、ゲノムアラインメントをトランスクリプトームアラインメントに変換した(Harrow et al.,Genome Res.(2012)22(9):1760−1774)。独自のマルチマップされたトランスクリプトームアラインメントを使用して、遺伝子レベルの存在量推定値を、鎖認識の様式のRSEMバージョン1.3.0(Li and Dewey,BMC Bioinformatics(2011)12:323)を使用して、かつ信頼区間サンプリング計算を含んで計算して、基礎となるベイズモデルからの存在量(カウント及び正規化FPKM−百万個のマップされた断片あたりのエクソンのキロベースあたりの断片)の事後平均推定値(PME)に到達した。標準QC(読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス)を適用して、不満足な試料を除去した。DESeq2バージョン1.16.1によって実行した負の二項モデルを使用して、差次的遺伝子発現を計算した(Love et al.,Genome Biol.(2014)15(12):550)。PMEカウントデータ(明示的にモデル化した複製対汎実験(pan−experiment)対照)、正規化した中央値比を使用して、最大事後確率ではなく最尤推定を使用して、かつ許容可能な調節したp値を決定するときに、クックの距離カットオフの使用を無効にして、Log2倍率変化及び有意値を計算した。有意に差次的な遺伝子を、0.01未満の調節したp値、1以上または−1以下のlog2倍率変化、及び1以上のPME FPKMを有する少なくとも1つの複製を有する遺伝子として割り当てた。また、RNA−seqシグナルを読み出し深さによって正規化し、UCSCブラウザーを使用して可視化した。
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、STARバージョン2.5.3a(アラインメントパラメータalignIntronMin=20;alignIntronMax=1000000;outFilterMismatchNmax=999;outFilterMismatchNoverLmax=0.05;outFilterType=BySJout;outFilterMultimapNmax=20;alignSJoverhangMin=8;alignSJDBoverhangMin=1;alignMatesGapMax=1000000)を介した2つのパスマッピングを使用して、ヒトゲノム(hs38d1/GCA_000786075.2とマージしたアセンブリGRCh38/GCA_000001405.15“no alt”分析セット)に対してマップした(Dobin et al., Bioinformatics(2012)29(1):15−21)。ヒトGENCODE遺伝子セットリリース24からの参照転写注釈に基づいて、ゲノムアラインメントをトランスクリプトームアラインメントに変換した(Harrow et al.,Genome Res.(2012)22(9):1760−1774)。独自のマルチマップされたトランスクリプトームアラインメントを使用して、遺伝子レベルの存在量推定値を、鎖認識の様式のRSEMバージョン1.3.0(Li and Dewey,BMC Bioinformatics(2011)12:323)を使用して、かつ信頼区間サンプリング計算を含んで計算して、基礎となるベイズモデルからの存在量(カウント及び正規化FPKM−百万個のマップされた断片あたりのエクソンのキロベースあたりの断片)の事後平均推定値(PME)に到達した。標準QC(読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス)を適用して、不満足な試料を除去した。DESeq2バージョン1.16.1によって実行した負の二項モデルを使用して、差次的遺伝子発現を計算した(Love et al.,Genome Biol.(2014)15(12):550)。PMEカウントデータ(明示的にモデル化した複製対汎実験(pan−experiment)対照)、正規化した中央値比を使用して、最大事後確率ではなく最尤推定を使用して、かつ許容可能な調節したp値を決定するときに、クックの距離カットオフの使用を無効にして、Log2倍率変化及び有意値を計算した。有意に差次的な遺伝子を、0.01未満の調節したp値、1以上または−1以下のlog2倍率変化、及び1以上のPME FPKMを有する少なくとも1つの複製を有する遺伝子として割り当てた。また、RNA−seqシグナルを読み出し深さによって正規化し、UCSCブラウザーを使用して可視化した。
J.ATAC−seq
肝細胞を一晩播種し、次いで血清及び他の因子を取り除いた。2〜3時間後、細胞を化合物で処理し、一晩インキュベートした。細胞を採取し、核を転位反応のために調製した。50,000ビーズ結合した核を、Mo et al.,2015,Neuron 86,1369−1384(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、)に記載されるように、Tn5トランスポザーゼ(Illumina FC−121−1030)を使用して転位させた。9〜12サイクルのPCR増幅後、ライブラリーをIllumina HiSeq 2000上でシーケンシングした。伸長を有するバーコード化されたプライマーを使用して、72℃で5分間PCRを実施し、次いで最終PCR産生物をシーケンシングした。
肝細胞を一晩播種し、次いで血清及び他の因子を取り除いた。2〜3時間後、細胞を化合物で処理し、一晩インキュベートした。細胞を採取し、核を転位反応のために調製した。50,000ビーズ結合した核を、Mo et al.,2015,Neuron 86,1369−1384(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、)に記載されるように、Tn5トランスポザーゼ(Illumina FC−121−1030)を使用して転位させた。9〜12サイクルのPCR増幅後、ライブラリーをIllumina HiSeq 2000上でシーケンシングした。伸長を有するバーコード化されたプライマーを使用して、72℃で5分間PCRを実施し、次いで最終PCR産生物をシーケンシングした。
各試料から得られた全ての読み出し値を、データ分析にPhredスコア≧20及び読み出し長≧30を必要とするtrim_galore0.4.1を使用してトリミングした。トリミングした読み出し値を、Bowtie2(バージョン2.2.9)を使用し、パラメーター:−t−q−N1−L25−X2000 no−mixed no−discordantを用いて、ヒトゲノム(hg19ビルド)に対してマップした。全てのマップされていない読み出し値、固有にマップされていない読み出し値及びPCR重複を取り除いた。全てのATAC−seqピークを、MACS2を使用し、パラメーター:−−nolambda−nomodel−q 0.01−−SPMRを用いて呼び出した。ATAC−seqシグナルを、UCSCゲノムブラウザーにおいて可視化した。注釈の付いたプロモーター(RefSeq、Ensemble及びUCSC Known Geneデータベースの複合)から少なくとも2kb離れたATAC−seqピークを、遠位ATAC−seqピークとして選択した。
K.qRT−PCR
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、North et al.,PNAS,107(40)17315−17320(2010)に記載されるように、qRT−PCRを実施した。qRT−PCR分析の前に、細胞培地を取り除き、RNA抽出のためにRLT緩衝液(Qiagen RNeasy96 QIAcube HTキットカタログ番号74171)と置き換えた。RNeasy96キット(Qiagenカタログ番号74182)を使用し、RNA抽出のために細胞を処理した。Taqman qPCR分析の場合、製造元の指示に従い、高容量cDNA逆転写キット(ThermoFisher Scientificカタログ:4368813または4368814)を使用してcDNAを合成した。qRT−PCRを、60℃のアニーリングを用いたBioRadからのiQ5 Multicolor rtPCR検出システムを使用して、cDNAで実施した。ThermoFisherからのTaqmanプローブを使用して、試料を増幅させた。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、North et al.,PNAS,107(40)17315−17320(2010)に記載されるように、qRT−PCRを実施した。qRT−PCR分析の前に、細胞培地を取り除き、RNA抽出のためにRLT緩衝液(Qiagen RNeasy96 QIAcube HTキットカタログ番号74171)と置き換えた。RNeasy96キット(Qiagenカタログ番号74182)を使用し、RNA抽出のために細胞を処理した。Taqman qPCR分析の場合、製造元の指示に従い、高容量cDNA逆転写キット(ThermoFisher Scientificカタログ:4368813または4368814)を使用してcDNAを合成した。qRT−PCRを、60℃のアニーリングを用いたBioRadからのiQ5 Multicolor rtPCR検出システムを使用して、cDNAで実施した。ThermoFisherからのTaqmanプローブを使用して、試料を増幅させた。
qRT−PCRによって測地される発現の倍率変化の分析を、以下の技法を使用して実施した。対照はDMSOであり、処理は選択された化合物(CPD)であった。内部対照は、GAPDHまたはB−アクチン(もしくは別途示される)であり、関心対象の遺伝子は標的である。最初に、正規化のために以下4つの条件:DMSO:GAPDH、DMSO:標的、CPD:GAPDH、及びCPD:標的の平均を計算した。次に、(DMSO:標的)−(DMSO:GAPDH)=ΔCT対照及び(CPD:標的)−(CPD:GAPDH)=ΔCT実験を使用して対照及び処理の両方のΔCTを計算して、内部対照(GAPDH)に対して正規化した。次いで、ΔCT実験−ΔCT対照によってΔΔCTを計算した。2−(ΔΔCT)によって発現倍率変化を計算した(本明細書に提供されるRNA−Seq結果によって2倍発現変化が示された)。
いくつかの例では、RQ最小値及びRQ最大値もまた報告される。RQ最小及びRQ最大は、それぞれ試験試料中の遺伝子発現の最小及び最大相対レベルである。それらは分析設定における信頼レベルセットを使用して計算され、信頼レベルは1標準偏差(SD)に設定された。これらの値は、以下のように標準偏差を使用して計算した:RQ最小=2−(ΔΔCT−SD)、及びRQ最大=2−(ΔΔCT+SD)
L.ペアエンドタグシーケンシング(ChIP−PET)によるクロマチン相互作用分析
ChIA−PETは、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Chepelev et al.(2012)Cell Res.22,490−503、Fullwood et al.(2009)Nature 462,58−64、Goh et al.(2012)J.Vis.Exp.http://dx.doi.org/10.3791/3770、Li et al.(2012)Cell 148,84−98、及びDowen et al.(2014)Cell 159,374−387において以前に記載されているように実施される。手短に言えば、胚幹(ES)細胞(最大1×108細胞)を、室温で20分間1%ホルムアルデヒドで処理し、次いで0.2Mグリシンを使用して中和する。架橋クロマチンは、音波処理によって300〜700bpのサイズ長に断片化される。抗SMC1抗体(Bethyl、A300−055A)を使用して、SMC1結合されたクロマチン断片を富化する。ChIP DNAの部分を、濃度定量化のため、及び定量的PCRを使用する富化分析のために抗体で被覆されたビーズから溶出される。ChIA−PETライブラリー構築の場合、ChIP DNA断片は、T4 DNAポリメラーゼ(NEB)を使用して末端修復される。ChIP DNA断片を2アリコートに分割し、リンカーAまたはリンカーBのいずれかを断片端部に連結する。2つのリンカーは、ヌクレオチドバーコードとして使用される2つのヌクレオチドが異なる(リンカーAはCG、リンカーBはAT)。リンカー連結後、2つの試料を複合し、20mL量で希釈して、異なるDNA−タンパク質複合体間の連結を最小化することによって近位連結のために調製される。近位連結反応は、T4 DNAリガーゼ(Fermentas)で実施し、22℃で20時間揺らすことなくインキュベートする。近位連結中に、同じリンカー配列を有するDNA断片は、同じクロマチン複合体内で連結され、これがホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を生成した。しかしながら、異なるクロマチン複合体からDNA断片間のキメラ連結もまた起こり得、したがってホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を産生する。これらのホモ二量体リンカー産生物を使用して、非特異的連結の頻度を評価し、次いで取り除かれる。
ChIA−PETは、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Chepelev et al.(2012)Cell Res.22,490−503、Fullwood et al.(2009)Nature 462,58−64、Goh et al.(2012)J.Vis.Exp.http://dx.doi.org/10.3791/3770、Li et al.(2012)Cell 148,84−98、及びDowen et al.(2014)Cell 159,374−387において以前に記載されているように実施される。手短に言えば、胚幹(ES)細胞(最大1×108細胞)を、室温で20分間1%ホルムアルデヒドで処理し、次いで0.2Mグリシンを使用して中和する。架橋クロマチンは、音波処理によって300〜700bpのサイズ長に断片化される。抗SMC1抗体(Bethyl、A300−055A)を使用して、SMC1結合されたクロマチン断片を富化する。ChIP DNAの部分を、濃度定量化のため、及び定量的PCRを使用する富化分析のために抗体で被覆されたビーズから溶出される。ChIA−PETライブラリー構築の場合、ChIP DNA断片は、T4 DNAポリメラーゼ(NEB)を使用して末端修復される。ChIP DNA断片を2アリコートに分割し、リンカーAまたはリンカーBのいずれかを断片端部に連結する。2つのリンカーは、ヌクレオチドバーコードとして使用される2つのヌクレオチドが異なる(リンカーAはCG、リンカーBはAT)。リンカー連結後、2つの試料を複合し、20mL量で希釈して、異なるDNA−タンパク質複合体間の連結を最小化することによって近位連結のために調製される。近位連結反応は、T4 DNAリガーゼ(Fermentas)で実施し、22℃で20時間揺らすことなくインキュベートする。近位連結中に、同じリンカー配列を有するDNA断片は、同じクロマチン複合体内で連結され、これがホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を生成した。しかしながら、異なるクロマチン複合体からDNA断片間のキメラ連結もまた起こり得、したがってホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を産生する。これらのホモ二量体リンカー産生物を使用して、非特異的連結の頻度を評価し、次いで取り除かれる。
i.1日目
ChIPについて記載されるように細胞を架橋した。冷凍細胞ペレットを、使用準備が整うまで−80℃の冷凍庫で保存した。このプロトコルは、6つの15mLのFalconチューブ中で冷凍された少なくとも3×108細胞(チューブあたり5000万細胞)を必要とした。6つの100μLプロテインG Dynabeads(各ChIA−PET試料について)を、氷上の6つの1.5mLエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを1.5mLのブロッキング溶液で3回洗浄し、各洗浄ステップの間に4℃で10分間回転させながらインキュベートして、効率的なブロッキングを可能にした。プロテインG Dynabeadsを、6つのチューブの各々において250μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、10μgのSMC1抗体(Bethyl A300−055A)を各チューブに添加した。ビーズ−抗体混合物を、4℃で回転させながら一晩インキュベートした。
ChIPについて記載されるように細胞を架橋した。冷凍細胞ペレットを、使用準備が整うまで−80℃の冷凍庫で保存した。このプロトコルは、6つの15mLのFalconチューブ中で冷凍された少なくとも3×108細胞(チューブあたり5000万細胞)を必要とした。6つの100μLプロテインG Dynabeads(各ChIA−PET試料について)を、氷上の6つの1.5mLエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを1.5mLのブロッキング溶液で3回洗浄し、各洗浄ステップの間に4℃で10分間回転させながらインキュベートして、効率的なブロッキングを可能にした。プロテインG Dynabeadsを、6つのチューブの各々において250μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、10μgのSMC1抗体(Bethyl A300−055A)を各チューブに添加した。ビーズ−抗体混合物を、4℃で回転させながら一晩インキュベートした。
ii.2日目
ビーズを1.5mLのブロッキング溶液で3回洗浄して、未結合のIgGを取り除き、毎回4℃で10分間、回転させながらインキュベートした。Smc1結合されたビーズを、100μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、4℃で保存した。最終溶解緩衝液1(試料あたり8mL)を、50xプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液1(LB1)(1:50)に添加することによって調製した。8mLの最終溶解緩衝液1を、各冷凍細胞ペレット(試料あたり8mL×6)に添加した。細胞を完全に再懸濁し、上下にピペットすることによって氷上で解凍した。細胞懸濁液を、4℃で10分間回転させながら再度インキュベートした。懸濁液を4℃で5分間、1,350gで遠心分離した。同時に、最終溶解緩衝液2(試料あたり8mL)を、50xプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液2(LB2)(1:50)に添加することによって調製した。
ビーズを1.5mLのブロッキング溶液で3回洗浄して、未結合のIgGを取り除き、毎回4℃で10分間、回転させながらインキュベートした。Smc1結合されたビーズを、100μLのブロッキング溶液中に再懸濁し、4℃で保存した。最終溶解緩衝液1(試料あたり8mL)を、50xプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液1(LB1)(1:50)に添加することによって調製した。8mLの最終溶解緩衝液1を、各冷凍細胞ペレット(試料あたり8mL×6)に添加した。細胞を完全に再懸濁し、上下にピペットすることによって氷上で解凍した。細胞懸濁液を、4℃で10分間回転させながら再度インキュベートした。懸濁液を4℃で5分間、1,350gで遠心分離した。同時に、最終溶解緩衝液2(試料あたり8mL)を、50xプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液2(LB2)(1:50)に添加することによって調製した。
遠心分離後、上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を8mLの最終溶解緩衝液2中に完全に再懸濁した。細胞懸濁液を、4℃で10分間回転させながらインキュベートした。懸濁液を4℃で5分間、1,350gで遠心分離した。インキュベーション及び遠心分離中に、最終溶解緩衝液(試料あたり15mL)を、50xプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を音波処理緩衝液(1:50)に添加することによって調製した。上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を15mLの最終音波処理緩衝液中に完全に再懸濁した。核抽出物を、氷上の15の1mL Covaris Evolution E220音波処理チューブに抽出した。10μLのアリコートを使用して、ゲル上の音波処理されていないクロマチンのサイズをチェックした。
Covaris音波処理器を、製造元の指示に従ってプログラムした(2000万細胞あたり12分=12×15=3時間)。試料を上記のように順次シーケンシングした。目標は、クロマチンDNAを200〜600bpに切断することであった。音波処理断片が大きすぎた場合、擬陽性がより頻繁になった。音波処理された核抽出物を、1.5mLのエッペンドルフチューブ中に分注した。1.5mLの試料を4℃で10分間、完全速度で遠心分離した。上澄み(SNE)を新しい予め冷却された50mLのFalconチューブ中にプールし、音波処理緩衝液で18mLの量にした。2つの50μLのチューブを、インプットとして、また断片のサイズをチェックするために取った。250μLのChIP溶出緩衝液を添加し、逆架橋は65℃で一晩、オーブン内で起こる。架橋の逆転後、音波処理断片のサイズをゲル上で決定した。
3mLの音波処理抽出物を、6つの清潔な15mLのFalconチューブの各々において、SMC1抗体を有する100μLのプロテインGビーズに添加した。SNE−ビーズ混合物を含有するチューブを、4℃で一晩回転させながらインキュベートした(14〜18時間)。
iii.3日目
SNE−ビーズ混合物の量の半分(1.5mL)を、6つの予め冷却されたチューブの各々に添加し、磁石を使用してSNEを取り除いた。チューブを以下のように順次洗浄した。1)1.5mLの音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);2)1.5mLの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);3)1.5mLの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);4)1.5mLのLiCl緩衝液を添加し、細胞を再懸濁して、結合するために5分間回転させながらインキュベートした後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);5)1.5mLの1X TE+0.2%Triton X−100を使用して、結合するために5分間細胞を洗浄した後、液体を取り除き、1.5mLの氷冷TE緩衝液を使用して、結合するために30秒間細胞を洗浄した後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した)。6つのチューブ全てからのビーズを、1X氷冷TE緩衝液の1つの1,000μLチューブ中で順次再懸濁した。
SNE−ビーズ混合物の量の半分(1.5mL)を、6つの予め冷却されたチューブの各々に添加し、磁石を使用してSNEを取り除いた。チューブを以下のように順次洗浄した。1)1.5mLの音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);2)1.5mLの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);3)1.5mLの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために4℃で5分間回転させた後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);4)1.5mLのLiCl緩衝液を添加し、細胞を再懸濁して、結合するために5分間回転させながらインキュベートした後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した);5)1.5mLの1X TE+0.2%Triton X−100を使用して、結合するために5分間細胞を洗浄した後、液体を取り除き、1.5mLの氷冷TE緩衝液を使用して、結合するために30秒間細胞を洗浄した後、液体を取り除いた(ステップを2回実施した)。6つのチューブ全てからのビーズを、1X氷冷TE緩衝液の1つの1,000μLチューブ中で順次再懸濁した。
ChIP−DNAを以下のプロトコルを使用して定量化した。ビーズの10(体積)パーセントまたは100μLを、磁石を使用して新たな1.5mLチューブに移した。ビーズを300μLのChIP溶出緩衝液に再懸濁し、チューブを65℃で1時間、ビーズで回転させた。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移した。溶出液を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。免疫沈降試料を新鮮なチューブに移し、300μLのTE緩衝液を免疫沈降及びインプット試料に添加して希釈した。5μLのRNase A(20mg/mL)を添加し、チューブを37℃で30分間インキュベートした。
インキュベーションに続いて、3μLの1M CaCl2及び7μLの20mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、55℃で1.5時間インキュベートした。MaXtract高密度2mLゲルチューブ(Qiagen)を、室温で30秒間、全速でそれらを遠心分離することによって調製した。600μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを、核プロテイナーゼK反応に添加した。約1.2mLの混合物をMaXtractチューブに移した。チューブを室温で5分間、16,000gで回転させた。水相を2つの清潔なDNA LoBindチューブに移し(各チューブに300μL)、1μLのグリコーゲン、30μLの3M酢酸ナトリウム、及び900μLのエタノールを添加した。混合物を−20℃で一晩または−80℃で1時間沈降させた。
混合物を4℃で20分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除き、チューブを4℃で5分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを1mLの75%エタノールで洗浄した。エタノールの残余を全て取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させた。H2Oを各チューブに添加する。各チューブを5分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのDNAを組み合わせ、50μLのIP及び100μLのインプットDNAを得た。
収集されたDNAの量を、Qubit(Invitrogen#Q32856)を使用してChIPによって定量化した。1μLのインターカレーター色素を各測定1μLの試料と複合した。キットに付随する2つの標準物を使用した。ビーズのわずか10%からのDNAを測定した。900μLのビーズ懸濁液中の約400ngのクロマチンを、qPCRによって測定されるエンハンサー及びプロモーターにおける良好な富化によって得た。
iv.3日目または4日目
ChIP−DNAの末端鈍化を、以下のプロトコルを使用してビーズ上で実施した。残りのクロマチン/ビーズを、ピペットによって分割し、450μLのビーズ懸濁液を2つのチューブに分注した。ビーズを磁石上で収集した。上澄みを取り除き、次いでビーズを以下の反応混合物中に再懸濁した:70μLの10X NEB緩衝液2.1(NEB、M0203L)、7μLの10mM dNTP、615.8μLのdH20、及び7.2μLの3U/μLのT4 DNAポリメラーゼ(NEB、M0203L)。ビーズを37℃で40分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄した(各洗浄あたり30秒)。
ChIP−DNAの末端鈍化を、以下のプロトコルを使用してビーズ上で実施した。残りのクロマチン/ビーズを、ピペットによって分割し、450μLのビーズ懸濁液を2つのチューブに分注した。ビーズを磁石上で収集した。上澄みを取り除き、次いでビーズを以下の反応混合物中に再懸濁した:70μLの10X NEB緩衝液2.1(NEB、M0203L)、7μLの10mM dNTP、615.8μLのdH20、及び7.2μLの3U/μLのT4 DNAポリメラーゼ(NEB、M0203L)。ビーズを37℃で40分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄した(各洗浄あたり30秒)。
ビーズ上A−テーリングを、下記のようにKlenow(3´〜5´エキソ−)マスターミックスを調製することによって実施した:70μLの10X NEB緩衝液2、7μLの10mM dATP、616μLのdH20、及び7μLの3U/μLのKlenow(3´〜5´エキソ−)(NEB、M0212L)。混合物を37℃で50分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄した(各洗浄あたり30秒)。
リンカーを氷上で優しく解凍した。リンカーを、優しくピペットすることによって水と、次いでPEG緩衝液と十分混合した後、優しくボルテックスした。次いで、チューブあたり1394μLのマスターミックス及び6μLのリガーゼを添加し、反転によって混合した。パラフィルムをチューブ上に置き、チューブを16℃で一晩(少なくとも16時間)回転させながらインキュベートした。ビオチン化リンカーを、以下の反応混合物を設定し、試薬を以下の順に添加することによって、ビーズ上でChIP−DNAに連結した。1110μLのdH20、4μLの200ng/μLのビオチン化架橋リンカー、PEG(Invitrogen)を有する280μLの5X T4 DNAリガーゼ緩衝液、及び6μLの30U/μLのT4 DNAリガーゼ(Fermentas)。
v.5日目
エキソヌクレアーゼλ/エキソヌクレアーゼI On−Bead消化を、以下のプロトコルを使用して実施した。ビーズを磁石で収集し、1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄する(各洗浄あたり30秒)。洗浄緩衝液をビーズから取り除き、次いで以下の反応混合物中に再懸濁した:70μLの10X λヌクレアーゼ緩衝液(NEB、M0262L)、618μLのヌクレアーゼ不含dH20、6μLの5U/μL λエキソヌクレアーゼ(NEB、M0262L)、及び6μLのエキソヌクレアーゼI(NEB、M0293L)。反応物を37℃で1時間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、ビーズを1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄した(各洗浄あたり30秒)。
エキソヌクレアーゼλ/エキソヌクレアーゼI On−Bead消化を、以下のプロトコルを使用して実施した。ビーズを磁石で収集し、1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄する(各洗浄あたり30秒)。洗浄緩衝液をビーズから取り除き、次いで以下の反応混合物中に再懸濁した:70μLの10X λヌクレアーゼ緩衝液(NEB、M0262L)、618μLのヌクレアーゼ不含dH20、6μLの5U/μL λエキソヌクレアーゼ(NEB、M0262L)、及び6μLのエキソヌクレアーゼI(NEB、M0293L)。反応物を37℃で1時間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、ビーズを1mLの氷冷ChIA−PET洗浄緩衝液で3回洗浄した(各洗浄あたり30秒)。
全ての残留緩衝液を取り除き、ビーズを300μLのChIP溶出緩衝液中に再懸濁することによって、クロマチン複合体をビーズから溶出した。ビーズを含むチューブを65℃で1時間回転させた。チューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なDNA LoBindエッペンドルフチューブに移した。溶出液を65℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
vi.6日目
溶出された試料を新鮮なチューブに移し、300μLのTE緩衝液を添加してSDSを希釈した。3μLのRNase A(30mg/mL)をチューブに添加し、混合物を37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、3μLの1M CaCl2及び7μLの20mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、チューブを55℃で1.5時間再度インキュベートした。MaXtract高密度2mLゲルチューブ(Qiagen)を使用し、室温で30秒間、全速でチューブを遠心分離することによって、材料を沈降させ、ペレット化(pellated)した。600μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを各プロテイナーゼK反応に添加し、約1.2mLの混合物中でMaXtractチューブに移した。チューブを室温で5分間、16,000gで回転させた。
溶出された試料を新鮮なチューブに移し、300μLのTE緩衝液を添加してSDSを希釈した。3μLのRNase A(30mg/mL)をチューブに添加し、混合物を37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、3μLの1M CaCl2及び7μLの20mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、チューブを55℃で1.5時間再度インキュベートした。MaXtract高密度2mLゲルチューブ(Qiagen)を使用し、室温で30秒間、全速でチューブを遠心分離することによって、材料を沈降させ、ペレット化(pellated)した。600μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを各プロテイナーゼK反応に添加し、約1.2mLの混合物中でMaXtractチューブに移した。チューブを室温で5分間、16,000gで回転させた。
水相を2つの清潔なDNA LoBindチューブに移し(各チューブに300μL)、1μLのグリコーゲン、30μLの3M酢酸ナトリウム、及び900μLのエタノールを添加した。混合物を−80℃で1時間沈降させた。チューブを4℃で30分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除いた。チューブを4℃で5分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを1mLの75%エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させた。30μLのH2Oをペレットに添加し、5分間放置する。ペレット混合物を短時間ボルテックスし、遠心沈降させてDNAを収集した。
Qubit及びDNA高感度ChIPを実施して、近位連結されたDNA産生物を定量化し、その質を評価した。約120ngの産生物が得られた。
vii.7日目
次いで、Nextera断片化(tagmentation)の構成成分を調製した。100ngのDNAを、12.5μLの2X断片化緩衝液(Nextera)、1μLのヌクレアーゼ不含dH2O、2.5μLのTn5酵素(Nextera)、及び9μLのDNA(25ng)を含有する4つの25μL反応物中に分割した。反応物の各々の断片化を、品質管理のためにBioanalyzer上で分析した。
次いで、Nextera断片化(tagmentation)の構成成分を調製した。100ngのDNAを、12.5μLの2X断片化緩衝液(Nextera)、1μLのヌクレアーゼ不含dH2O、2.5μLのTn5酵素(Nextera)、及び9μLのDNA(25ng)を含有する4つの25μL反応物中に分割した。反応物の各々の断片化を、品質管理のためにBioanalyzer上で分析した。
反応物を55℃で5分間、次いで10℃で10分間インキュベートした。25μLのH2Oを添加し、断片化されたDNAをZymoカラムを使用して精製した。350μLの結合緩衝液を試料に添加し、混合物をカラム中に装填して、13,000rpmで30秒間回転させた。フロースルーを再適用し、カラムを再度回転させた。カラムを200μLの洗浄緩衝液で2回洗浄し、1分間回転させて膜を乾燥させた。カラムを清潔なエッペンドルフチューブに移し、25μLの溶出緩衝液を添加した。チューブを1分間遠心沈降させた。このステップを別の25μLの溶出緩衝液で繰り返した。全ての断片化されたDNAを1つのチューブに複合した。
ChIA−PETを、以下のステップを使用してストレプトアビジンビーズ上で固定化した。2X B&W緩衝液(40mL)を、核酸のカップリングのために以下のように調製した:400μLの1M Tris−HCl(pH8.0)(10mM最終)、80μLの1M EDTA(1mM最終)、16mLの5M NaCl(2M最終)、及び23.52mLのdH2O。1X B&W緩衝液(40mL全量)を、20mLのdH2Oを20mLの2X B&W緩衝液に添加することによって調製した。
MyOneストレプトアビジンDynabeads M−280を30分間室温にし、30μLのビーズを新たな1.5mLチューブに移した。ビーズを150μLの2X B&W緩衝液で2回洗浄した。ビーズを100μLのiBlock緩衝液(Applied Biosystems)中に再懸濁し、混合した。混合物を室温で45分間、回転器上でインキュベートした。
I−BLOCK試薬を、0.2%のI−Block試薬(0.2g)、1X PBSまたは1X TBS(10mLの10X PBSまたは10X TBS)、0.05%Tween−20(50μL)、及びH2Oを100mLまで含有するように調製した。10X PBS及びI−BLOCK試薬をH2Oに添加し、混合物を40秒間マイクロ波処理した(沸騰させない)後、撹拌した。溶液を冷却した後、Tween−20を添加した。溶液は不透明なままであったが、粒子は溶解された。使用するために溶液を室温に冷却した。
ビーズのインキュベーション中に、500ngの剪断ゲノムDNAを50μLのH2O及び50μLの2X B&W緩衝液に添加した。ビーズがiBLOCK緩衝液でのインキュベーションを終えたとき、それらを200μLの1X B&W緩衝液で2回洗浄した。洗浄緩衝液を破棄し、100μLの剪断ゲノムDNAを添加した。混合物を室温で30分間回転させながらインキュベートした。ビーズを200μLの1X B&W緩衝液で2回洗浄した。断片化DNAを、等量の2X B&W緩衝液とともにビーズに添加し、室温で45分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを500μLの2xSSC/0.5%SDS緩衝液(毎回30秒)で5回洗浄し、続いて500mLの1X B&W緩衝液で2回洗浄し、各洗浄後に室温で5分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを優しく再懸濁し、チューブを磁石上に置くことによって、Qiagenキットからの100μLの溶出緩衝液(EB)で1回洗浄した。上澄みをビーズから取り除き、それらを30μLのEB中に再懸濁した。
ペアエンドシーケンシングライブラリーを、以下のプロトコルを使用してビーズ上に構築した。10μLのビーズを、10サイクルの増幅でPCRにより試験した。50μLのPCR混合物は、10μLのビーズDNA、15μLのNPM混合物(Illumina Nexteraキットから)、5μLのPPC PCRプライマー、5μLのIndexプライマー1(i7)、5μLのIndexプライマー2(i5)、及び10μLのH2Oを含有した。以下のサイクル条件を使用して、PCRを実施した:72℃で3分間、次いで98℃で10秒間、63℃で30秒間、及び72℃で50秒間の10〜12サイクル、ならびに72℃で5分間の最終延長でDNAを変性させる。サイクルの数を調整して、4つの25μLの反応物とともに合計約300ngのDNAを得た。PCR産生物は、不明確な量の時間にわたって4℃で保持され得る。
PCR産生物を、AMPureビーズを使用してクリーンアップした。ビーズを使用する前に30分間室温にさせた。50μLのPCR反応物を新たなLow−Bindチューブに移し、(1.8x量)90μLのAMPureビーズを添加した。混合物を十分にピペットし、室温で5分間インキュベートした。磁石を3分間使用してビーズを収集し、上澄みを取り除いた。300μLの新鮮に調製された80%エタノールを磁石上のビーズに添加し、エタノールを慎重に破棄した。洗浄を繰り返し、次いで全てのエタノールを取り除いた。ビーズを磁石ラック上で10分間乾燥させた。10μLのEBをビーズに添加し、十分に混合して、室温で5分間インキュベートした。溶出液を収集し、1μLの溶出液をQubit及びBioanalyzerに使用した。
ライブラリーをクローン化して、以下のプロトコルを使用して複雑性を検証した。1μLのライブラリーを1:10で希釈した。PCR反応を下記のように実施した。Illuminaアダプターにアニールするプライマーを選択した(Tm=52.2℃)。PCR反応混合物(全量:50μL)は、以下を含有した:10μLの5X GoTaq緩衝液、1μLの10mM dNTP、5μLの10μMプライマーミックス、0.25μLのGoTaqポリメラーゼ、1μLの希釈したテンプレートDNA、及び32.75μLのH2O。以下のサイクル条件を使用して、PCRを実施した:95℃で2分間、及び以下の条件で20サイクル、DNAを変性させる:95℃で60秒間、50℃で60秒間、及び72℃で30秒間、72℃で5分間の最終延長。PCR産生物は、不明確な量の時間にわたって4℃で保持され得る。
PCR産生物を、pGEM(登録商標)T−Easyベクター(Promega)プロトコルで連結した。5μLの2X T4 Quickリガーゼ緩衝液、1μLのpGEM(登録商標)T−Easyベクター、1μLのT4リガーゼ、1μLのPCR産生物、及び2μLのH2Oを、全量10μLまで複合した。産生物を室温で1時間インキュベートし、2μLを使用して星コンピテント細胞を形質転換した。200μLの500μLの細胞をSOC培地にプレーティングした。翌日、T7プロモータープライマーを使用して、Sangerシーケンシングのための20コロニーを選択する。60%クローンは、完全なアダプターを有し、15%が部分的アダプターを有していた。
viii.試薬
10試料のプロテインG Dynabeadsは、Invitrogen Dynalカタログ番号10003Dからのものであった。ブロッキング溶液(50mL)は、50mLのddH2Oに溶解された0.25gのBSA(0.5%のBSA、w/v)を含有し、使用前に4℃で2日間保存した。
10試料のプロテインG Dynabeadsは、Invitrogen Dynalカタログ番号10003Dからのものであった。ブロッキング溶液(50mL)は、50mLのddH2Oに溶解された0.25gのBSA(0.5%のBSA、w/v)を含有し、使用前に4℃で2日間保存した。
溶解緩衝液1(LB1)(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、14mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの100%グリセロール溶液、25mLの10%NP−40、及び12.5mLの10%Triton X−100を含有した。pHを7.5に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。溶解緩衝液2(LB2)(1000mL)は、10mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、40mLの5M NaCl、2mLの0.5M EDTA(pH8.0)、及び2mLの0.5M EGTA(pH8.0)を含有した。pHを8.0に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
音波処理緩衝液(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、14mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%Triton X−100、10mLの5%Na−デオキシコール酸塩、及び5mLの10%SDSを含有した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。高塩音波処理緩衝液(500mL)は、25mLの1M Hepes−KOH(pH7.5)、35mLの5M NaCl、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%Triton X−100、10mLの5%Na−デオキシコール酸塩、及び5mLの10%SDSを含有した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
LiCl洗浄緩衝液(500mL)は、10mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、1mLの0.5M EDTA(pH8.0)、125mLの1M LiCl溶液、25mLの10%NP−40、及び50mLの5%Na−デオキシコール酸塩を含有した。pHを8.0に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
ChIP DNAの量を定量化するために使用した溶出緩衝液(500mL)は、25mLの1M Tris−HCL(pH8.0)、10mLの0.5M EDTA(pH8.0)、50mLの10%SDS、及び415mLのddH2Oを含有した。pHを8.0に調節した。緩衝液を無菌濾過し、4℃で保存した。pHを使用直前に再チェックした。
ChIA−PET洗浄緩衝液(50mL)は、500μLの1M Tris−HCl(pH8.0)(最終10mM)、100μLの0.5M EDTA(pH8.0)(最終1mM)、5mLの5M NaCl(最終500mM)、及び44.4mLのdH2Oを含有した。
M.HiChIP
ChIA−PETの代替として、HiChIPを使用して、クロマチン相互作用及び立体配座を分析した。HiChIPは、ChIA−PETよりも少ない細胞を必要とする。
ChIA−PETの代替として、HiChIPを使用して、クロマチン相互作用及び立体配座を分析した。HiChIPは、ChIA−PETよりも少ない細胞を必要とする。
i.細胞架橋
上のChIPプロトコルに記載されるように細胞を架橋した。架橋した細胞を、−80℃でペレットとして保存するか、または細胞を急速冷凍した直後にHiChIPに使用した。
上のChIPプロトコルに記載されるように細胞を架橋した。架橋した細胞を、−80℃でペレットとして保存するか、または細胞を急速冷凍した直後にHiChIPに使用した。
ii.溶解及び制限
1500万個の架橋細胞を500μLの氷冷Hi−C溶解緩衝液中に再懸濁し、4℃で30分間回転させた。1500万より多くの細胞量の場合、ペレットを接触生成のために半分に分割し、次いで音波処理のために組み合えた。細胞を2500gで5分間遠心沈降し、上澄みを破棄した。ペレット化した核を、500μLの氷冷Hi−C溶解緩衝液で1回洗浄した。上澄みを取り除き、ペレットを100μLの0.5%SDS中に再懸濁した。再懸濁液を62℃で10分間インキュベートし、次いで285μLのH2O及び50μLの10%Triton X−100を添加して、SDSをクエンチした。再懸濁液を十分に混合し、37℃で15分間インキュベートした。50μLの10X NEB緩衝液2及び375UのMboI制限酵素(NEB、R0147)を混合物に添加して、37℃で2時間回転させることによってクロマチンを消化した。より下位の出発物質の場合、より少ない制限酵素を使用し、15μLを1000〜1500万細胞、8μLを500万細胞、及び4μLを100万細胞に使用した。熱(62℃で20分間)を使用して、MboIを不活化した。
1500万個の架橋細胞を500μLの氷冷Hi−C溶解緩衝液中に再懸濁し、4℃で30分間回転させた。1500万より多くの細胞量の場合、ペレットを接触生成のために半分に分割し、次いで音波処理のために組み合えた。細胞を2500gで5分間遠心沈降し、上澄みを破棄した。ペレット化した核を、500μLの氷冷Hi−C溶解緩衝液で1回洗浄した。上澄みを取り除き、ペレットを100μLの0.5%SDS中に再懸濁した。再懸濁液を62℃で10分間インキュベートし、次いで285μLのH2O及び50μLの10%Triton X−100を添加して、SDSをクエンチした。再懸濁液を十分に混合し、37℃で15分間インキュベートした。50μLの10X NEB緩衝液2及び375UのMboI制限酵素(NEB、R0147)を混合物に添加して、37℃で2時間回転させることによってクロマチンを消化した。より下位の出発物質の場合、より少ない制限酵素を使用し、15μLを1000〜1500万細胞、8μLを500万細胞、及び4μLを100万細胞に使用した。熱(62℃で20分間)を使用して、MboIを不活化した。
iii.ビオチン組み込み及び近位連結
制限断片オーバーハングを満たし、DNA端部をビオチンでマークするために、37.5μLの0.4mMビオチン−dATP(Thermo19524016)、1.5μLの10mM dCTP、dGTP、及びdTTP、ならびに10μLの5U/μL DNAポリメラーゼI、大きな(Klenow)断片(NEB、M0210)を複合することによって、52μLの充填マスターミックスを反応させた。混合物を、37℃で1時間回転させながらインキュベートした。
制限断片オーバーハングを満たし、DNA端部をビオチンでマークするために、37.5μLの0.4mMビオチン−dATP(Thermo19524016)、1.5μLの10mM dCTP、dGTP、及びdTTP、ならびに10μLの5U/μL DNAポリメラーゼI、大きな(Klenow)断片(NEB、M0210)を複合することによって、52μLの充填マスターミックスを反応させた。混合物を、37℃で1時間回転させながらインキュベートした。
948μLの連結マスターミックスを添加した。連結マスターミックスは、10mM ATPを含む150μLの10X NEB T4 DNAリガーゼ緩衝液(NEB、B0202)、125μLの10%Triton X−100、3μLの50mg/mL BSA、10μLの400U/μL T4 DNAリガーゼ(NEB、M0202)、及び660μLの水を含有した。混合物を、室温で4時間回転させながらインキュベートした。核を2500gで5分間ペレット化し、上澄みを取り除いた。
iv.音波処理
音波処理の場合、ペレットを核溶解緩衝液中で最大1000μLにした。試料をCovarisミリチューブに移し、DNAを製造元の推奨するパラメーターでCovaris(登録商標)E220Evolution(商標)を使用して剪断した。各チューブ(1500万細胞)を以下の条件下で4分間音波処理した。充填レベル5、デューティサイクル5%、PIP140、及びサイクル/バースト200。
音波処理の場合、ペレットを核溶解緩衝液中で最大1000μLにした。試料をCovarisミリチューブに移し、DNAを製造元の推奨するパラメーターでCovaris(登録商標)E220Evolution(商標)を使用して剪断した。各チューブ(1500万細胞)を以下の条件下で4分間音波処理した。充填レベル5、デューティサイクル5%、PIP140、及びサイクル/バースト200。
v.プレクリアリング、免疫沈降、IPビーズ捕捉、及び洗浄
試料を4℃で15分間、16,100gで清澄化した。試料を各々約400μLの2つのチューブに分割し、750μLのChIP希釈緩衝液を添加した。Smc1a抗体(Bethyl A300−055A)の場合、試料をChIP希釈緩衝液中で1:2に希釈して、0.33%のSDS濃度を達成した。60μLのプロテインGビーズを、ChIP希釈緩衝液中1000万細胞ごとに洗浄した。ビーズ(プレクリアリング及び捕捉のため)及び抗体の量を、異なる量の細胞出発物質について直線的に調節した。プロテインGビーズをチューブあたり50μL(HiChIPあたり100μL)の希釈緩衝液中に再懸濁した。試料を4℃で1時間回転させた。試料を磁石上に置き、上澄みを新たなチューブに移した。7.5μgの抗体を1000万細胞ごとに添加し、混合物を4℃で一晩回転させながらインキュベートした。別の60μLのプロテインGビーズを、ChIP希釈緩衝液中1000万細胞ごとに添加した。プロテインGビーズを、50μLの希釈緩衝液(HiChIPあたり100μL)中に再懸濁し、試料に添加して、4℃で2時間回転させた。ビーズを低塩洗浄緩衝液、高塩洗浄緩衝液、及びLiCl洗浄緩衝液で各々3回洗浄した。500μLの洗浄緩衝液を添加し、試料を磁石に対して動かすことによってビーズを前後に2回振り、次いで上澄みを取り除くことによって、磁石上で室温で洗浄を実施した。
試料を4℃で15分間、16,100gで清澄化した。試料を各々約400μLの2つのチューブに分割し、750μLのChIP希釈緩衝液を添加した。Smc1a抗体(Bethyl A300−055A)の場合、試料をChIP希釈緩衝液中で1:2に希釈して、0.33%のSDS濃度を達成した。60μLのプロテインGビーズを、ChIP希釈緩衝液中1000万細胞ごとに洗浄した。ビーズ(プレクリアリング及び捕捉のため)及び抗体の量を、異なる量の細胞出発物質について直線的に調節した。プロテインGビーズをチューブあたり50μL(HiChIPあたり100μL)の希釈緩衝液中に再懸濁した。試料を4℃で1時間回転させた。試料を磁石上に置き、上澄みを新たなチューブに移した。7.5μgの抗体を1000万細胞ごとに添加し、混合物を4℃で一晩回転させながらインキュベートした。別の60μLのプロテインGビーズを、ChIP希釈緩衝液中1000万細胞ごとに添加した。プロテインGビーズを、50μLの希釈緩衝液(HiChIPあたり100μL)中に再懸濁し、試料に添加して、4℃で2時間回転させた。ビーズを低塩洗浄緩衝液、高塩洗浄緩衝液、及びLiCl洗浄緩衝液で各々3回洗浄した。500μLの洗浄緩衝液を添加し、試料を磁石に対して動かすことによってビーズを前後に2回振り、次いで上澄みを取り除くことによって、磁石上で室温で洗浄を実施した。
vi.ChIP DNA溶出
ChIP試料ビーズを100μLの新鮮なDNA溶出緩衝液中に再懸濁した。試料ビーズを室温で10分間回転させながらインキュベートし、続いて37℃で3分間振とうさせながらインキュベートした。ChIP試料を磁石上に置き、上澄みを新鮮なチューブに取り除いた。別の100μLのDNA溶出緩衝液をChIP試料に添加し、インキュベーションを繰り返した。ChIP試料の上澄みを再度取り除き、新たなチューブに移した。約200μLのChIP試料が存在していた。10μLのプロテイナーゼK(20mg/mL)を各試料に添加し、55℃で45分間振とうさせながらインキュベートした。温度を67℃に高め、試料を少なくとも1.5時間振とうさせながらインキュベートした。DNAをZymo精製し(Zymo Research、#D4014)、10μLの水に溶出した。ポストChIP DNAを定量化して、ライブラリーを正しいサイズ分布で生成するために必要とされるTn5の量を推定した。これは、接触ライブラリーを適切に生成し、試料を過剰に音波処理せず、材料をストレプトアビジンビーズ上で頑強に捕捉したと推測した。1000万細胞でのSMC1 HiChIPは、15ng〜50ngのポストChIP DNAの予想収率を有していた。150ngより多くのポストChIP DNAを有するライブラリーの場合、材料を除外し、最大150ngをビオチン捕捉ステップに取り入れた。
ChIP試料ビーズを100μLの新鮮なDNA溶出緩衝液中に再懸濁した。試料ビーズを室温で10分間回転させながらインキュベートし、続いて37℃で3分間振とうさせながらインキュベートした。ChIP試料を磁石上に置き、上澄みを新鮮なチューブに取り除いた。別の100μLのDNA溶出緩衝液をChIP試料に添加し、インキュベーションを繰り返した。ChIP試料の上澄みを再度取り除き、新たなチューブに移した。約200μLのChIP試料が存在していた。10μLのプロテイナーゼK(20mg/mL)を各試料に添加し、55℃で45分間振とうさせながらインキュベートした。温度を67℃に高め、試料を少なくとも1.5時間振とうさせながらインキュベートした。DNAをZymo精製し(Zymo Research、#D4014)、10μLの水に溶出した。ポストChIP DNAを定量化して、ライブラリーを正しいサイズ分布で生成するために必要とされるTn5の量を推定した。これは、接触ライブラリーを適切に生成し、試料を過剰に音波処理せず、材料をストレプトアビジンビーズ上で頑強に捕捉したと推測した。1000万細胞でのSMC1 HiChIPは、15ng〜50ngのポストChIP DNAの予想収率を有していた。150ngより多くのポストChIP DNAを有するライブラリーの場合、材料を除外し、最大150ngをビオチン捕捉ステップに取り入れた。
vii.Illuminaシーケンシングのためのビオチンプルダウン及び調製
ビオチンプルダウンのための調製のために、5μLのストレプトアビジンC−1ビーズをTween洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを10μLの2Xビオチン結合緩衝液中に再懸濁し、試料に添加した。ビーズを室温で15分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石上で分離し、上澄みを破棄した。500μLのTween洗浄緩衝液を添加することによってビーズを2回洗浄し、55℃で2分間振とうさせながらインキュベートした。ビーズを100μLの1X(2Xから希釈した)TD緩衝液中で洗浄した。ビーズを25μLの2X TD緩衝液、各50ngのポストChIP DNAについて2.5μLのTn5、及び水中で50μLの量まで再懸濁した。
ビオチンプルダウンのための調製のために、5μLのストレプトアビジンC−1ビーズをTween洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを10μLの2Xビオチン結合緩衝液中に再懸濁し、試料に添加した。ビーズを室温で15分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石上で分離し、上澄みを破棄した。500μLのTween洗浄緩衝液を添加することによってビーズを2回洗浄し、55℃で2分間振とうさせながらインキュベートした。ビーズを100μLの1X(2Xから希釈した)TD緩衝液中で洗浄した。ビーズを25μLの2X TD緩衝液、各50ngのポストChIP DNAについて2.5μLのTn5、及び水中で50μLの量まで再懸濁した。
Tn5は、4μLの最大量を有していた。例えば、25ngのDNA転位の場合、1.25μLのTn5を添加し、一方で125ngのDNA転位の場合、4μLのTn5を使用した。正しい量のTn5を使用して、適切なサイズ分布をもたらした。過剰転位された試料は、より短い断片を有し、より低いアラインメント率を呈していた(接合部は断片端部に近かった)。過小転位された試料は、大き過ぎてIlluminaシーケンサー上で適切にクラスター化することができない断片を有する。ライブラリーを5サイクルで増幅させ、ライブラリーの転位のレベルに関係なく、深くシーケンシングされ、適切なサイズ分布を達成するために十分な複雑性を有していた。
ビーズを55℃で10分間、合間に振とうさせながらインキュベートした。試料を磁石上に置き、上澄みを取り除いた。50mM EDTAを試料に添加し、50℃で30分間インキュベートした。次いで、試料を迅速に磁石上に置き、上澄みを取り除いた。試料を50℃で3分間、50mM EDTAで2回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を55℃で2分間、Tween洗浄緩衝液中で2回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を10mM Tris−HCl(pH8.0)で洗浄した。
viii.PCR及びPCR後サイズ選択
ビーズを50μLのPCRマスターミックス中に懸濁した(デュアルIndexアダプター#15055289を有するIlluminaからのNextera XT DNAライブラリー調製キット#15028212)。PCRを以下のプログラムを使用して実施した。2つの方法のうちの1つを使用して、サイクル数を推定した。(1)最初の5サイクル(72℃で5分間、98℃で1分間、98℃で15秒間、63℃で30秒間、72℃で1分間)を、通常のPCR上で実施し、次いで産生物をビーズから取り除いた。次いで、0.25X SYBRグリーンを添加し、試料をqPCR上で実行した。試料を指数的増幅の開始時に取り出した。または(2)反応をPCR上で実行し、ポストChIP Qubitからの材料の量に基づいてサイクル数を推定した(50ng超は5サイクルで実行するが、およそ50ngは6サイクルで実行され、25ngは7サイクルで実行され、12.5ngは8サイクルで実行されるなど)。
ビーズを50μLのPCRマスターミックス中に懸濁した(デュアルIndexアダプター#15055289を有するIlluminaからのNextera XT DNAライブラリー調製キット#15028212)。PCRを以下のプログラムを使用して実施した。2つの方法のうちの1つを使用して、サイクル数を推定した。(1)最初の5サイクル(72℃で5分間、98℃で1分間、98℃で15秒間、63℃で30秒間、72℃で1分間)を、通常のPCR上で実施し、次いで産生物をビーズから取り除いた。次いで、0.25X SYBRグリーンを添加し、試料をqPCR上で実行した。試料を指数的増幅の開始時に取り出した。または(2)反応をPCR上で実行し、ポストChIP Qubitからの材料の量に基づいてサイクル数を推定した(50ng超は5サイクルで実行するが、およそ50ngは6サイクルで実行され、25ngは7サイクルで実行され、12.5ngは8サイクルで実行されるなど)。
ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。ライブラリーをZymo Researchからのキットを使用して精製し、10μLの水に溶出した。AMPure XPビーズを用いて両側サイズ選択を実施した。PCR後、ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。次いで、25μLのAMPure XPビーズを添加し、上澄みを保持して700bp未満の断片を捕捉した。上澄みを新たなチューブに移し、15μLの新鮮なビーズを添加して、300bpより大きい断片を捕捉した。AMPure XPビーズから10μLの水中に最終溶出を実施した。Bioanalyzerを使用してライブラリーの質を検証した。
ix.緩衝液
Hi−C溶解緩衝液(10mL)は、100μLの1M Tris−HCl(pH8.0)、20μLの5M NaCl、200μLの10%NP−40、200μLの50Xプロテアーゼ阻害剤、及び9.68mLの水を含有した。核溶解緩衝液(10mL)は、500μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、200μLの0.5M EDTA、1mLの10%SDS、200μLの50Xプロテアーゼ阻害剤、及び8.3mLの水を含有した。ChIP希釈緩衝液(10mL)は、10μLの10%SDS、1.1mLの10%Triton X−100、24μLの500mM EDTA、167μLの1M Tris(pH7.5)、334μLの5M NaCl、及び8.365mLの水を含有した。低塩洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの10%SDS、1mLの10%Triton X−100、40μLの0.5M EDTA、200μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、300μLの5M NaCl、及び8.36mLの水を含有した。高塩洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの10%SDS、1mLの10%Triton X−100、40μLの0.5M EDTA、200μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、1mLの5M NaCl、及び7.66mLの水を含有した。LiCl洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの1M Tris(pH7.5)、500μLの5M LiCl、1mLの10%NP−40、1mLの10%Na−デオキシコール酸塩、20μLの0.5M EDTA、及び7.38mLの水を含有した。
Hi−C溶解緩衝液(10mL)は、100μLの1M Tris−HCl(pH8.0)、20μLの5M NaCl、200μLの10%NP−40、200μLの50Xプロテアーゼ阻害剤、及び9.68mLの水を含有した。核溶解緩衝液(10mL)は、500μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、200μLの0.5M EDTA、1mLの10%SDS、200μLの50Xプロテアーゼ阻害剤、及び8.3mLの水を含有した。ChIP希釈緩衝液(10mL)は、10μLの10%SDS、1.1mLの10%Triton X−100、24μLの500mM EDTA、167μLの1M Tris(pH7.5)、334μLの5M NaCl、及び8.365mLの水を含有した。低塩洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの10%SDS、1mLの10%Triton X−100、40μLの0.5M EDTA、200μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、300μLの5M NaCl、及び8.36mLの水を含有した。高塩洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの10%SDS、1mLの10%Triton X−100、40μLの0.5M EDTA、200μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、1mLの5M NaCl、及び7.66mLの水を含有した。LiCl洗浄緩衝液(10mL)は、100μLの1M Tris(pH7.5)、500μLの5M LiCl、1mLの10%NP−40、1mLの10%Na−デオキシコール酸塩、20μLの0.5M EDTA、及び7.38mLの水を含有した。
DNA溶出緩衝液(5mL)は、250μLの新鮮な1M NaHCO3、500μLの10%SDS、及び4.25mLの水を含有する。Tween洗浄緩衝液(50mL)は、250μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、50μLの0.5M EDTA、10mLの5M NaCl、250μLの10%Tween−20、及び39.45mLの水を含有した。2Xビオチン結合緩衝液(10mL)は、100μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、20μLの0.5M、4mLの5M NaCl、及び5.88mLの水を含有した。2X TD緩衝液(1mL)は、20μLの1M Tris−HCl(pH7.5)、10μLの1M MgCl2、200μLの100%ジメチルホルムアミド、及び770μLの水を含有した。
N.肝細胞への投与のための薬物希釈
肝細胞の化合物処理の前に、DMSO中0.1mMのストック薬物を0.9mLのDMSOと混合することによって、DMSO中の100mMストック薬物を10mMに希釈して、最終量を1.0mLにした。5μLの希釈薬物を各ウェルに添加し、薬物のウェルあたり0.5mLの培地を添加した。各薬物を三重に分析した。5μLの薬物を45μLの培地に添加し、50μLを細胞上の450μLの培地に添加することによって、1000xまでの希釈を実施した。
肝細胞の化合物処理の前に、DMSO中0.1mMのストック薬物を0.9mLのDMSOと混合することによって、DMSO中の100mMストック薬物を10mMに希釈して、最終量を1.0mLにした。5μLの希釈薬物を各ウェルに添加し、薬物のウェルあたり0.5mLの培地を添加した。各薬物を三重に分析した。5μLの薬物を45μLの培地に添加し、50μLを細胞上の450μLの培地に添加することによって、1000xまでの希釈を実施した。
生物活性化合物もまた、肝細胞に投与した。1mLのDMSO中の生物活性化合物の1000xストックを得るために、0.1mLの10,000Xストックを0.9mLのDMSOと複合した。
O.siRNAノックダウン
一次ヒト肝細胞を、24ウェルフォーマット(ウェルあたり1μL)でRNAiMAX試薬(ThermoFisherカタログ番号13778030)を使用し、6pmol siRNAを有するsiRNAで逆トランスフェクトした。翌朝、培地を取り除き、修飾された維持培地でさらに24時間置き換えた。処理全体は48時間続き、この時点で培地を取り除き、RNA抽出のためにRLT緩衝液(Qiagen RNeasy 96 QIAcubeHTキットカタログ番号74171)と置き換えた。細胞をqRT−PCR分析のために処理し、次いで標的mRNAのレベルを測定した。
一次ヒト肝細胞を、24ウェルフォーマット(ウェルあたり1μL)でRNAiMAX試薬(ThermoFisherカタログ番号13778030)を使用し、6pmol siRNAを有するsiRNAで逆トランスフェクトした。翌朝、培地を取り除き、修飾された維持培地でさらに24時間置き換えた。処理全体は48時間続き、この時点で培地を取り除き、RNA抽出のためにRLT緩衝液(Qiagen RNeasy 96 QIAcubeHTキットカタログ番号74171)と置き換えた。細胞をqRT−PCR分析のために処理し、次いで標的mRNAのレベルを測定した。
siRNAをDharmaconから取得し、全て関心対象の特定の遺伝子内で別個の部位を標的とするように設計された4つのsiRNA二重鎖のプールであった(「SMARTpool」)。
P.マウス研究
6マウス(C57BL/6J株)の群(雄3及び雌3)に、候補化合物を1日1回4連続日にわたって経口強制栄養を介して投与する。4日目の最後の投与から4時間後にマウスを屠殺した。肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、血漿を含む臓器を収集する。マウス肝臓組織を液体窒素中で粉砕し、小さいマイクロチューブに分注した。TRIzol(Invitrogenカタログ番号15596026)をチューブに添加して、組織試料からの細胞溶解を促進した。次いで、崩壊した組織を含有するTRIzol溶液を遠心分離し、上澄み相を収集する。Qiagen RNA抽出キット(Qiagenカタログ番号74182)を使用して、全RNAを上澄みから抽出し、qRT−PCRを使用して標的mRNAレベルを分析した。
6マウス(C57BL/6J株)の群(雄3及び雌3)に、候補化合物を1日1回4連続日にわたって経口強制栄養を介して投与する。4日目の最後の投与から4時間後にマウスを屠殺した。肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、血漿を含む臓器を収集する。マウス肝臓組織を液体窒素中で粉砕し、小さいマイクロチューブに分注した。TRIzol(Invitrogenカタログ番号15596026)をチューブに添加して、組織試料からの細胞溶解を促進した。次いで、崩壊した組織を含有するTRIzol溶液を遠心分離し、上澄み相を収集する。Qiagen RNA抽出キット(Qiagenカタログ番号74182)を使用して、全RNAを上澄みから抽出し、qRT−PCRを使用して標的mRNAレベルを分析した。
実施例2.刺激された肝細胞についてのRNA−seq研究
標的遺伝子発現を調整する小分子を特定するために、一次ヒト肝細胞を単一培養として調製し、少なくとも1つの小分子化合物を細胞に適用した。
標的遺伝子発現を調整する小分子を特定するために、一次ヒト肝細胞を単一培養として調製し、少なくとも1つの小分子化合物を細胞に適用した。
RNA−seqを実施して、肝細胞中の標的遺伝子の発現に対する化合物の効果を決定した。摂動されていた細胞系中の発現レベルを非摂動系中の発現レベルで除算することによって、倍率変化を計算した。0.05以下のp値を有する発現の変化を有意であるとみなした。
肝細胞のシグナル伝達中心を摂動するために使用される化合物は、表2に列挙される少なくとも1つの化合物を含む。表中で、化合物はそれらのID、標的、経路、及び薬学的作用とともに列挙される。摂動シグナルとして選択された大部分の化合物は、当該技術分野において少なくとも1つの正準細胞経路を調整することが知られている。いくつかの化合物を、有効性の欠失に起因して第III相臨床評価において失格した化合物から選択した。
実施例3.疾患、障害及び病態の治療の特定
RNA−seqデータの分析は、標的遺伝子の発現の有意な変化を引き起こした多数の化合物を明らかにした。有意性を、CPOXを除く全ての標的について、1以上のFPKM、0.5以上のlog2(倍率変化)、及び0.05以下のq値として定義した。少なくとも1つの選択した標的遺伝子を有意に調整した化合物についてのRNA−seq結果を表3〜表12に示す。
RNA−seqデータの分析は、標的遺伝子の発現の有意な変化を引き起こした多数の化合物を明らかにした。有意性を、CPOXを除く全ての標的について、1以上のFPKM、0.5以上のlog2(倍率変化)、及び0.05以下のq値として定義した。少なくとも1つの選択した標的遺伝子を有意に調整した化合物についてのRNA−seq結果を表3〜表12に示す。
表3は、フィブロネクチン腎症に関連するフィブロネクチンをエンコードするFN1の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表4は、遺伝性コプロポルフィリン症に関連するコプロポルフィリノーゲンオキシダーゼをエンコードするCPOXの発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。有意性を、0.5以上のFPKM、0.3以上のlog2(倍率変化)、及び0.05以下のq値として定義した。
表5は、SERPINC1欠損症に関連するアンチトロンビンをエンコードするSERPINC1の発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表6は、アラジール症候群に関連するjagged 1及びNotch 2をそれぞれエンコードするJAG1及び/またはNOTCH2の発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。太字の化合物は、JAG1及びNOTCH2の両方を有意に調整する化合物を表す。
上述のように、LDN193189、LDN−212854、サリドマイド、フェンホルミン、エンザスタウリン、GDF2(BMP9)、BMP2、アムバチニブ、BMP4、及びBAY 87−2243、及びINNO−206(アルドキソルビシン)は、JAG1のみを有意に調整することが観察され、ジボテンタン及び740 Y−Pは、NOTCH2のみを有意に調整することが観察された。メレスチニブ及びトルセトラピブは、JAG1及びNOTCH2の両方を有意に調整することが観察された。
表7は、糖原病1bに関連するグルコース−6−リン酸トランスロカーゼ(G6PT)をエンコードするSLC37A4の発現を著しく増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表8は、急性間欠性ポルフィリン症に関連するヒドロキシメチルビランシンターゼをエンコードするHMBSの発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表9は、LECT2アミロイドーシスに関連する白血球細胞由来ケモタキシン2をエンコードするLECT2の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表10は、APOL1関連糸球体疾患に関連するアポリポタンパク質L1をエンコードするAPOL1の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表11は、ジルベール症候群及びクリグラーナジャーII型に関連するUDPグリクロノシルトランスフェラーゼファミリー1メンバーA1をエンコードするUGT1A1の発現を著しく増加させることが観察された化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表12は、脂質異常症に関連する、低密度リポタンパク質受容体をエンコードするLDLRの発現を有意に増加させること、ならびに/またはアンジオポエチン様3及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型をエンコードするANGPTL3及び/もしくはPCSK9の発現を減少させることが化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
表13は、脂質異常症に関連するアンジオポエチン様3をエンコードするANGPTL3の発現を有意に減少させることが観察された追加の化合物についてのlog2倍率変化を提供する。
本明細書における結果は、有意な治療効果を有することが表3〜表13に示される化合物を使用して、標的遺伝子に関連する疾患の表現型を救出することができるという証拠を提供する。標的遺伝子と同じ経路内の、または同じシグナル伝達中心によって制御される追加の遺伝子は、表3〜表13の化合物によって調整されてもよい。
実施例4:肝細胞中のSERPINC1の上方制御
化合物を、SERPINC1/AT III欠損症の潜在的な治療を特定するための、SERPINC1 mRNAの上方制御について、肝細胞中で試験した。表14〜表16は、選択した化合物で処置された一次ヒト肝細胞及びマウス肝細胞の定量的PCR結果、ならびに選択した化合物で処置されたMGH54細胞のRNA seq結果を示す。図6は、非標的対照siRNA(NTC)と比較して、mTOR及びNFKBに対して標的とされるsiRNAによる72時間の処置後のSERPINC1 mRNAの上方制御を示す。図7は、DMSO対照と比較して、化合物308(OSI−027)及び化合物309(PF04691502)による処置に応答した、SERPINC1の用量依存的上方制御を示す。
化合物を、SERPINC1/AT III欠損症の潜在的な治療を特定するための、SERPINC1 mRNAの上方制御について、肝細胞中で試験した。表14〜表16は、選択した化合物で処置された一次ヒト肝細胞及びマウス肝細胞の定量的PCR結果、ならびに選択した化合物で処置されたMGH54細胞のRNA seq結果を示す。図6は、非標的対照siRNA(NTC)と比較して、mTOR及びNFKBに対して標的とされるsiRNAによる72時間の処置後のSERPINC1 mRNAの上方制御を示す。図7は、DMSO対照と比較して、化合物308(OSI−027)及び化合物309(PF04691502)による処置に応答した、SERPINC1の用量依存的上方制御を示す。
実施例5:選択した化合物によるMECP2の上方制御。
17−AAGを、MECP2 mRNAの上方制御について肝細胞中で試験した。17−AAGによる処置は、DMSO対照と比較して、qPCRによって検出されるように、マウス肝細胞(図8)及びマウス肝臓(図9)中のMECP2 mRNAの増加をもたらした。2つのドナーからの一次ヒト肝細胞は、17−AAGで処置した場合、MECP2 mRNAの用量依存的増加を示した(図10A及び10B)。追加の化合物を、ヒト肝細胞中のMECP2 mRNAの誘導について試験した(表17〜表19)。
17−AAGを、MECP2 mRNAの上方制御について肝細胞中で試験した。17−AAGによる処置は、DMSO対照と比較して、qPCRによって検出されるように、マウス肝細胞(図8)及びマウス肝臓(図9)中のMECP2 mRNAの増加をもたらした。2つのドナーからの一次ヒト肝細胞は、17−AAGで処置した場合、MECP2 mRNAの用量依存的増加を示した(図10A及び10B)。追加の化合物を、ヒト肝細胞中のMECP2 mRNAの誘導について試験した(表17〜表19)。
実施例6:選択した化合物によるAPOL発現の下方制御。
3.3μMのモメロテニブ(図11)またはモメロテニブ代謝産物M21(図12)による処置時の、一次ヒト肝細胞中のAPOL mRNAの下方制御を観察した。10μM用量でAPOL mRNAの下方制御を示した上記のRNAseqによって追加の化合物を特定した(表20)。
3.3μMのモメロテニブ(図11)またはモメロテニブ代謝産物M21(図12)による処置時の、一次ヒト肝細胞中のAPOL mRNAの下方制御を観察した。10μM用量でAPOL mRNAの下方制御を示した上記のRNAseqによって追加の化合物を特定した(表20)。
等価物及び範囲
当業者であれば、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本開示による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本開示の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
当業者であれば、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本開示による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本開示の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
特許請求の範囲において、「a」、「an」及び「the」などの冠詞は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、1つ以上を意味し得る。群の1つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、群のメンバーのうちの1つ、2つ以上、または全てが所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、群のうちの正確に1つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーのうちの2つ以上、または全体が所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。
「含む(comprising)」という用語は、制約がないことが意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするが、その必要がないことにも留意する。「含む(comprising)」という用語が本明細書で使用される場合、したがって「からなる(consisting of)」という用語もまた包含され、開示される。
範囲が与えられている場合、エンドポイントは含まれる。さらに、特に記載されない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかである場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に示さない限り、その範囲の下限の単位の10分の1まで、本開示の異なる実施形態の指定された範囲内の任意の特定の値または下位範囲をとることができることを理解する。
加えて、先行技術内に入る本開示の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか1つ以上から明示的に除外され得ることを理解する。そのような実施形態は、当業者に既知であるとみなされるため、それらは、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも除外され得る。本開示の組成物のいずれの特定の実施形態(例えば、任意の抗生物質、治療成分または活性成分;任意の産生方法;任意の使用方法など)も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の1つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であり、添付の特許請求の範囲の権限内で、そのより広い態様において本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく変更が行われてもよいことを理解されたい。
本開示は、いくつかの記載される実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特定性で説明されてきたが、任意のそのような特定事項または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図しないが、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供するもの、したがって、本発明の意図される範囲を有効に包含するものとして解釈される。
Claims (34)
- フィブロネクチン腎症を有する対象を治療する方法であって、FN1遺伝子の発現を低減することができる表3からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のFN1遺伝子の発現を低減する方法であって、前記FN1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表3からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、BGJ398、AZD2858、及びベシル酸アムロジピンからなる群から選択される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 遺伝性コプロポルフィリン症を有する対象を治療する方法であって、CPOX遺伝子の発現を増加させることができる表4からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のCPOX遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記CPOX遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表4からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、17−AAG、塩化コバルト、SKL2001、FICZ、及びプレドニゾンからなる群から選択される、請求項4または請求項5に記載の方法。
- SERPINC1欠損症を有する対象を治療する方法であって、SERPINC1遺伝子の発現を増加させることができる表5からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のSERPINC1遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記SERPINC1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表5、表14、表15、または表16からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、OSI−027、PF04691502、CP−673451、エキノマイシン、及びパクリチニブ(SB1518)からなる群から選択される、請求項7または請求項8に記載の方法。
- アラジール症候群を有する対象を治療する方法であって、JAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の発現を増加させることができる表6からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のJAG1遺伝子及び/またはNOTCH2遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記JAG1遺伝子及び/または前記NOTCH2遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表6からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、メレスチニブ及びトルセトラピブからなる群から選択される、請求項10または請求項11に記載の方法。
- 糖原病1bを有する対象を治療する方法であって、SLC37A4遺伝子の発現を増加させることができる表7からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のSLC37A4遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記SLC37A4遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表7からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、エキノマイシン、プレドニゾン、CP−673451、及び塩化コバルトからなる群から選択される、請求項13または請求項14に記載の方法。
- 急性間欠性ポルフィリン症を有する対象を治療する方法であって、HMBS遺伝子の発現を増加させることができる表8からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のHMBS遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記HMBS遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表8からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、ソトラスタウリンである、請求項16または請求項17に記載の方法。
- LECT2アミロイドーシスを有する対象を治療する方法であって、LECT2遺伝子の発現を低減することができる表9からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のLECT2遺伝子の発現を低減する方法であって、前記LECT2遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表9からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、カルシトロール、17−AAG、及びリタオナビル(Ritaonavir)からなる群から選択される、請求項19または請求項20に記載の方法。
- APOL1関連糸球体疾患を有する対象を治療する方法であって、APOL1遺伝子の発現を低減することができる表10または表16からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のAPOL1遺伝子の発現を低減する方法であって、前記APOL1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表10または表16からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、ニトロフラントイン、クリゾチニブ、モメロテニブ(Momelotenib)、及びモメロテニブ代謝産物M21からなる群から選択される、請求項22または請求項23に記載の方法。
- ジルベール症候群またはクリグラーナジャーII型を有する対象を治療する方法であって、UGT1A1遺伝子の発現を増加させることができる表11からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のUGT1A1遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記UGT1A1遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表11からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、FICZ、カルトゲニン、meBIO、CP−673451、BAM7、及びEW−7197からなる群から選択される、請求項25または請求項26に記載の方法。
- 脂質異常症を有する対象を治療する方法であって、LDLR遺伝子の発現を増加させることならびに/あるいはANGPTL3遺伝子及び/またはPCSK9遺伝子の発現を低減することができる表12からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 細胞中のANGPTL3、LDLR、及びPCSK9遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を調整する方法であって、前記ANGPTL3、LDLR、またはPCSK9遺伝子の調節配列領域(RSR)またはその一部分に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表12または表13からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、WYE−125132、ピフィスリン−u、LY294002、SGI−1776、プレラデナント、及びCO−1686からなる群から選択される、請求項28または請求項29に記載の方法。
- レット症候群を有する対象を治療する方法であって、MECP2遺伝子の発現を増加させることができる表17、表18または表19からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- レット症候群を有する対象を治療する方法であって、MECP2遺伝子の発現を増加させることができる表17、表18または表19からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 前記化合物が、17−AAGである、請求項31または32に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
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