RU2812903C2

RU2812903C2 - Композиции и способы лечения, предотвращения и обращения связанного с возрастом воспаления и расстройств

Info

Publication number: RU2812903C2
Application number: RU2021119040A
Authority: RU
Inventors: Джон М. СЕДИВИ; Марко ДЕ КЕККО
Original assignee: Браун Юниверсити
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2024-02-05

Abstract

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ лечения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ) пациенту, причем указанный ИОТ представляет собой ценсавудин или эльвуцитабин, а указанное связанное с возрастом воспаление связано с повышением экспрессии длинного диспергированного элемента-1 (L1), накоплением цитоплазматической кДНК длинного диспергированного элемента-1 (L1), активацией ответа интерферона типа I (IFN-I) или усилением провоспалительного состояния ассоциированного со старением клеток секреторного фенотипа (SASP). При этом указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, имеющего заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из: болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза (БАС), болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, потери зрения, потери слуха, дисфункции сердечно-сосудистой системы, лобно-височной деменции (ЛВД), рассеянного склероза (РС), синдрома Айкарди-Гутьерес, прогрессирующего надъядерного паралича (ПНП), остеоартрита, атеросклероза, остеопороза и фиброза легких. Изобретение обеспечивает лечение связанного с возрастом воспаления. 19 з.п. ф-лы, 20 ил., 11 табл., 6 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к области медицинской химии. В частности, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения, предотвращения и обращения связанного с возрастом воспаления путем введения ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ) нуждающемуся в этом пациенту. Связанное с возрастом воспаление может быть у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, потеря зрения, потеря слуха, дегенеративные заболевания периферической нервной системы, или дисфункция сердечно-сосудистой системы, лобно-височная деменция (ЛВД), рассеянный склероз (PC), синдром Айкарди-Гутьерес, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), остеоартрит, старение кожи, атеросклероз, вызванные химиотерапией нежелательные явления, связано с функцией гематопоэтических стволовых клеток, остеопорозом, связано с физическим функционированием и/или фиброзом легких, или у пациента, нуждающегося в заживлении ран или регенерации тканей.

ПОЛОЖЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ РАЗРАБОТОК, ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

[0002] Настоящее изобретение было разработано при поддержке следующим финансированием: стипендия постдокторанта Glenn/AFAR, пилотный грант NIH Р20 GM119943 COBRE; NIH F31 AG043189; NIH Т32 AG041688; NIH F31 AG050365; стипендии в области биотехнологии и спортивной медицины, Фармацевтическая школа, Болонский университет, Болонья, Италия; NIH R37 AG016667, R01 AG024353, Р01 AG051449, премия за прорывы в геронтологии Glenn-AFAR; NIH R01 AG050582, Р20 GM109035; NIH R37 AG016694, Р01 AG051449.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Количество людей, которые будут доживать до 60 или более лет, растет по всему миру. Ожидают, что между 2012 и 2050 годами процент количества людей в возрасте 60 лет и старше возрастет с 809 миллионов до 2 миллиардов (или с 11% до 22% популяции).

[0004] ¹ Среди основных причин смерти в пожилом возрасте есть несколько хронических состояний, включая болезни сердца, рак, диабет, болезнь Альцгеймера и инфекцию. Важно, что многие из данных связанных с возрастом заболеваний и само старение сильно связаны с хроническим воспалением на низком уровне.^2,3,4 Системное хроническое воспаление может ускорять старение.⁵ Действительно, многие маркеры воспаления являются важными прогностическими факторами смертности пожилых людей.⁶

[0005] Несмотря на эту общую связь между старением, воспалением и хроническими заболеваниями, был достигнут лишь ограниченный прогресс в понимании механизмов, которые контролируют связанное с возрастом воспаление, и причинно-следственные связи данных регуляторных факторов с хроническими дегенеративными заболеваниями не полностью понятны. Лучшее понимание роли данных регуляторных факторов в связанном с возрастом воспалении должно привести к новым стратегиям продления здоровья популяции пожилого возраста.

[0006] По этой причине, в данной области существует потребность в лучшем лечении и предотвращении связанного с возрастом воспаления и связанных с возрастом расстройств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение дает лучшее понимание механизмов, лежащих в основе связанного с возрастом воспаления, и роли последнего в старении, а также в соответствии с настоящим изобретением предложены композиции и способы предотвращения и уменьшения связанного с возрастом воспаления и расстройств.

[0008] Ретротранспозируемые элементы (RTE) оказывают вредное влияние на множестве уровней, и недостаточность систем надзора хозяина, следовательно, может приводить к негативным последствиям. Тем не менее, вклад активности RTE в старение и связанные с возрастом заболевания был неизвестен. В основе настоящего изобретения лежит несколько эмпирических наблюдений, включая наблюдение, что в процессе клеточного старения повышается уровень транскрипции элементов LINE-1 (L1), и они активируют ответ интерферона I типа (IFN-I). Ответ IFN-I представляет собой новый фенотип позднего клеточного старения и способствует поддержанию ассоциированного со старением секреторного фенотипа (SASP). Ответ IFN-I запускается цитоплазматической кДНК L1, и его антагонистами являются ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ), которые ингибируют обратную транскриптазу (ОТ) L1. Лечение пожилых мышей ИОТ ламивудином отрицательно регулировало активацию IFN-I и связанное с возрастом воспаление в некоторых тканях. Соответственно, активация RTE - это важный компонент стерильного воспаления, которое является отличительным признаком старения, и ОТ L1 является подходящей мишенью для лечения связанных с возрастом расстройств.

[0009] В соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения, предотвращения и/или обращения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента путем введения пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ).

[0010] При сравнительной оценке нескольких лекарственных средств ИОТ в анализе доза-ответ ингибирования активности L1, два лекарственных средства ИОТ - ценсавудин и эльвуцитабин, - проявили неожиданно превосходную способность ингибировать активность L1 мыши и человека. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения, предотвращения и/или обращения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента путем введения пациенту терапевтически эффективного количества ценсавудина и/или эльвуцитабина.

[0011] Связанное с возрастом воспаление связано с повышенной экспрессией L1, накоплением цитоплазматической кДНК L1, активацией ответа IFN-I и/или усилением провоспалительного состояния SASP. Лекарственное средство ИОТ вводят в количестве, достаточном для предотвращения или обращения по меньшей мере одного из перечисленных событий: повышения экспрессии L1, накопления цитоплазматической кДНК L1, активации ответа IFN-I и/или провоспалительного состояния SASP.

[0012] Связанное с возрастом воспаление, которое можно предотвратить, лечить или обратить с помощью способов согласно настоящему изобретению, присутствует у пациента, имеющего заболевание или расстройство, включая, но не ограничиваясь перечисленными: болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, потерю зрения, потерю слуха, дегенеративные заболевания периферической нервной системы, или дисфункцию сердечно-сосудистой системы, лобно-височную деменцию (ЛВД), рассеянный склероз (PC), синдром Айкарди-Гутьерес, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), остеоартрит, старение кожи, атеросклероз, вызванные химиотерапией нежелательные явления, нарушение функционирования гематопоэтических стволовых клеток, остеопороз, нарушение физического функционирования и/или фиброз легких, - или у пациента, нуждающегося в заживлении ран или регенерации тканей. В одном варианте реализации связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера. В альтернативном варианте реализации связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть БАС.

[0013] Также предложен способ отсрочивания (задержки проявления) или обращения прогрессирования патологии, лежащей в основе заболевания или расстройства, вызванного связанным с возрастом воспалением (первопричинной патологии), включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ИОТ. В некоторых вариантах реализации пациент страдает болезнью Альцгеймера или БАС и испытывает ослабление одного или более симптомов болезни Альцгеймера или БАС по сравнению с таковыми перед первым введением ИОТ пациенту. В некоторых вариантах реализации один или более симптомов болезни Альцгеймера включают потерю памяти, размещение предметов не на тех местах, забывание названий мест или объектов, повторение вопросов, меньшую приспосабливаемость к новым обстоятельствам, замешательство, дезориентацию, обсессивное поведение, компульсивное поведение, бред, афазию, нарушение сна, перепады настроения, депрессию, тревогу, фрустрацию, возбужденное состояние, трудности при выполнении пространственных задач, агнозию, трудности при передвижении, потерю веса, потерю речи, потерю кратковременной памяти или потерю долговременной памяти.

[0014] В некоторых вариантах реализации уменьшение одного или более симптомов болезни Альцгеймера оценивают в соответствии с руководством по диагностике и статистике психических расстройств (DSM-5).⁷ В некоторых вариантах реализации уменьшение симптомов определяют, используя когнитивную субшкалу шкалы оценки тяжести болезни Альцгеймера (ADAS-cog). В некоторых вариантах реализации уменьшение симптомов определяют, используя шкалу оценки изменений клиницистом на основании опроса (CIBIC-plus). В некоторых вариантах реализации уменьшение симптомов определяют, используя шкалу оценки повседневной деятельности (ADL). В некоторых вариантах реализации уменьшение симптомов длится 1-36 месяцев.

[0015] В некоторых вариантах реализации любое изменение в первопричиной патологии обнаруживают путем детектирования биомаркера до и после введения ИОТ. В некоторых вариантах реализации биомаркер представляет собой β-амилоид или белок Tau. В некоторых вариантах реализации биомаркер детектируют с помощью ПЭТ-визуализации. В некоторых вариантах реализации первопричинную патологию идентифицируют путем измерения β-амилоида или белка Tau в спинномозговой жидкости. В некоторых вариантах реализации первопричинную патологию идентифицируют путем измерения объема головного мозга до и после введения ИОТ. В некоторых вариантах реализации первопричинную патологию обращают или отсрочивают на 1-36 месяцев.

[0016] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИОТ представляет собой нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (НИОТ). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один НИОТ выбран из перечисленных далее: абакавир (ЗИАГЕН™), абакавир/ламивудин (Эпзиком), абакавир/ламивудин/зидовудин (ТРИЗИВИР™), адефовир, аловудин, амдоксовир, априцитабин, АТРИПЛА®, БАРАКЛЮД®, БИКТАРВИ®, ценсавудин, КОВИРАЦИЛ™, DAPD/DXG, D-D4FC, дексельвуцитабин, диданозин (ВИДЕКС™), диданозин с пролонгированным высвобождением (Видекс ЕС), dOTC, EFdA, эмтрицитабин (ЭМТРИВА™), эмтрицитабин/тенофовира алафенамид (ДЕСКОВИ®), эмтрицитабин/тенофовира дизопроксилфумарат (ТРУВАДА®), эльвуцитабин, фосалвудин, ламивудин/зидовудин (КОМБИВИР™), ЭВИПЛЕРА™, ГЕНВОЯ®, ХИВИД™, КИВЕКСА™, ламивудин (ЭПИВИР™), ЛОДЕНОЗИН™, ОДЕФСЕЙ®, ПРЕВЕОН®, рацивир, стампидин, ставудин (ЗЕРИТ™), СТРИБИЛД®, ТЕНОФОВИР™, тенофовира дизопроксилфумарат (ВИРЕАД™), ТРИУМЕК®, Тризивир, ВЕМЛИДИ® и/или зидовудин (РЕТРОВИР™). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один НИОТ представляет собой ценсавудин. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один НИОТ представляет собой эльвуцитабин.

[0017] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИОТ представляет собой ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ННИОТ). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ННИОТ выбран из перечисленных далее: делавирдин (DLV), эфавиренц (EFV), этравирин, невирапин (NVP) и/или рилпивирин.

[0018] В некоторых вариантах реализации пациент страдает болезнью Альцгеймера, и способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного второго терапевтического агента, полезного для лечения симптомов болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент выбран из перечисленных далее: донепезил, галантамин, мемантин и/или ривастигмин. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой антитело, которое связывается с β-амилоидом или белком Таu. В некоторых вариантах реализации указанное антитело связывается с β-амилоидом и представляет собой бапинейзумаб. В некоторых вариантах реализации указанное антитело связывается с белком Tau и представляет собой ABBV-8E12. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой вакцину против β-амилоида или белка Таu. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой агент, который снижает или изменяет содержание в головном мозге β-амилоида или Таu. В некоторых вариантах реализации второй терапевтический агент снижает или изменяет содержание в головном мозге β-амилоида и представляет собой ингибитор β-секретазы 1 (ВАСЕ). В некоторых вариантах реализации ингибитор ВАСЕ выбран из перечисленных далее: CTS-21166, ланабецестат (AZD3293), LY2886721 и верубецестат (MK-8931). В некоторых вариантах реализации второй агент снижает или изменяет содержание в головном мозге Tau и представляет собой никотинамид, или MPT0G211.

[0019] В некоторых вариантах реализации пациент страдает БАС, и способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного второго терапевтического агента, полезного для лечения симптомов БАС. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй агент, полезный для лечения БАС, представляет собой эдаравон и/или рилузол. В других вариантах реализации по меньшей мере один второй агент представляет собой ингибитор интегразы. В некоторых вариантах реализации ингибитор интегразы выбран из перечисленных далее: ауринтрикарбоновая кислота, производные ауринтрикарбоновой кислоты, BMS-538158, сложный эфир кофейной кислоты и фенэтилового спирта, производные сложного эфира кофейной кислоты и фенэтилового спирта, куркумин, производные куркумина, цикориевая кислота, производные цикориевой кислоты, 3,5-дикофеоилхиновая кислота, производные 3,5-дикофеоилхиновой кислоты, GSK364735C, L-870812 и L-25 870810, МK-0518, кверцетин, производные кверцетина, ралтегравир, S-1360, тирфостин, производные тирфостина и/или зинтевир (AR-177).

[0020] В некоторых вариантах реализации оценивают наличие у пациента одного или более симптомов или патологии заболевания в течение 1-36 месяцев после первого введения ИОТ пациенту.

[0021] В некоторых вариантах реализации ИОТ ингибирует активность обратной транскриптазы L1 в клетке пациента.

[0022] Также предложен способ предотвращения начала болезни Альцгеймера у пациента, у которого подозревают наличие легкого когнитивного нарушения или преклинической болезни Альцгеймера, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ИОТ нуждающемуся в этом пациенту.

[0023] Другие варианты реализации также описаны и перечислены в данной заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0024] С целью иллюстрирования некоторые варианты реализации настоящего изобретения показаны на фигурах, описанных ниже. Одни и те же символы на фигурах обозначают одни и те же элементы повсюду в настоящем описании. Тем не менее, должно быть понятно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными показанными конфигурациями, размерами и устройствами. Фигуры описаны далее.

[0025] На фиг. 1 показана активация L1, IFN-I и SASP в старых клетках. Экспрессию генов оценивали с помощью ОТ-кПЦР. Очищенную поли(А)-РНК использовали во всех исследованиях L1. Фиг. 1а. Динамика активации L1. Р-значения рассчитывали относительно РП - контрольных клеток раннего пассажа. Фиг. 1b. Схематическое представление стратегии ОТ-ПЦР L1. Синяя - смысловая; красная - антисмысловая (АС). Специфичность праймеров см. на фиг. 6f-h; разработку праймеров см. в разделе «Методы». Праймеры для ампликона F использовали в (а) и (е). Фиг. 1 с. Цепь-специфическую транскрипцию L1 оценивали, применяя ампликоны А-F. Также детектировали транскрипцию с антисмыслового промотора 5'-нетранслируемой области (НТО). Стар (П) - позднее старение клеток (16 недель). Фиг. 1d. Индукция уровней мРНК IFN-α и IFN-β1. Фиг. 1е. Временная индукция генов, связанных с повреждением ДНК (р21, также известный как CDKN1A), SASP (IL-1β CCL2, IL-6, ММР3) и ответом IFN-I (IRF7, IFN-α, IFN-β1, OAS1). Кластеризацию рядов рассчитывали как корреляцию Пирсона-1. РеС -репликативное старение; ВОС - вызванное онкогеном старение клеток (вызванное инфицированием Ha-RAS); ВСПС- вызванное стрессом преждевременное старение клеток (облучение гамма-лучами). Контроли: РП - ранний пассаж; ПВ - инфицирование пустым вектором; КОНТР. - без облучения, (а, с-е), n=3 независимых биологических образца, повторяли в двух независимых экспериментах, (а, с, d) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0026] На фиг. 2 показана регуляция активации L1 и индукции IFN-I. Фиг. 2а - экспрессия и иммунопреципитация хроматина (СhIР) RB1 и фиг. 2b - FOXA1. Экспрессию измеряли с помощью ОТ-кПЦР и иммуноблоттинга (левые панели). Связывание с элементами L1 оценивали с помощью ChIP-кПЦР (правые панели). Специфичность праймеров см. на фиг. 6b. RB1: 5-НТО, открытая рамка считывания (ОРС) 1 и ОРС2, праймеры для ампликонов А, Е и F, соответственно. FOXA1: праймеры для ампликонов А-Е. Количественную ПЦР нормировали на введенный хроматин. Стар (Р) - раннее старение клеток (8 недель). Результаты на гелях см. на фиг. 16. Фиг. 2 с-е. RB1, FOXA1 или TREX1 сверхэкспрессировали (СЭ) или подавляли с помощью кшРНК и определяли влияние на экспрессию L1, IFN-α и IFN-β1 с помощью ОТ-кПЦР очищенной поли(А)-РНК. Во всех случаях лентивирусные векторы использовали для доставки вмешательств непосредственно в старые клетки в 12 недель (точка D, фиг.6а), и клетки собирали для анализа четыре недели спустя (точка Е, 16 недель). Контролями служили неинфицированные старые клетки, собранные в то же время (точка Е, 16 недель). Для каждого гена использовали две различные кшРНК (а, b). Праймеры для ампликона F использовали для L1. Фиг. 2f. RB1 сверхэкспрессировали (СЭ), как описано выше, и его связывание с 5'-НТО оценивали с помощью ChIP-кПЦР (ампликон А). Фиг. 2g. Активация экспрессии L1, IFN-α и IFN-β1 после тройного (3Х) вмешательства с применением shRB1 (а), shTREXI (а) и FOXAI-СЭ в клетках раннего пассажа. Лентивирусные инфекции осуществляли последовательно с селекциями по чувствительности к лекарственному препарату на каждом этапе (shRB1, пуромицин ->shTREXI, гигромицин ->FOXAI-СЭ, бластицидин). Фиг. 2h. Экспрессию генов пути IFN-I определяли с помощью панелей RT2 Profiler PCR array (Qiagen). Нормированная средняя экспрессия показана для всех 84 генов панели. Красные символы: гены со значительно повышенной экспрессией. Пунктирные линии показывают границы ±2-кратного изменения, (a, b, h), n=3 независимых биологических образца, повторяли в 2 независимых экспериментах, (c-g), n=3 независимых эксперимента, (а-g) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0027] На фиг. 3 показано, что удаление L1 ослабляет активацию IFN-I и уменьшает ответ SASP. Фиг. 3а. Клетки исследовали с помощью иммунофлуоресцентной (ИФ) микроскопии, применяя антитела к одноцепочечной ДНК (оцДНК) или к белку ОРС1 L1. Видна яркая точка оцДНК в старых клетках, которая колокализована с заметной точкой ОРС1. Данный эксперимент независимо повторяли трижды со сходными результатами. Масштабная линейка =10 мкм. Фиг. 3b. Старые клетки обрабатывали кшРНК L1 (применяя лентивирусные векторы, как описано на фиг. 2 с, е, f) или 3ТС (7,5 мкМ) между 12 и 16 неделями старения. Влияние на ответ IFN-I определяли с помощью ОТ-кПЦР, ELISA или иммуноблоттинга. Результаты на гелях см. на фиг.16. Фиг. 3с. Клетки метили BrdU в течение 2 недель (с добавлением или без 7,5 мкМ 3ТС), меченую ДНК иммунопреципитировали и проводили количественный анализ содержания в ней последовательности L1 путем анализа методом мультиплексной количественной ПЦР TaqMan16 (фиг. 1b, ампликон F). РП (покоящ.) - покоящиеся клетки раннего пассажа. Фиг. 3d, левая панель, РеС-клетки: гены IFNAR1 и IFNAR2 подвергали мутагенезу, применяя систему CRISPR/Cas9, доставленную с помощью лентивирусных векторов непосредственно в старые клетки. Как и при вмешательствах с использованием кшРНК, клетки инфицировали в 12 недель и собирали в 16 недель старения (см. фиг. 1d-f, см. раздел «Методы»). Правая панель, клетки с ВСПС: вмешательство CRISPR/Cas9 осуществляли на клетках раннего пассажа и подтвержденный клон облучали, чтобы вызвать ВСПС. Фиг. 3е. ВОС и ВСПС вызывали, как на фиг. 1d, и клетки собирали через 20 дней (ВОС) или 30 дней (ВСПС). 3ТС (7,5 мкМ) присутствовал повсюду. Экспрессию генов IFN-I (IFN-α, IRF7, OAS1) измеряли с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 3f. Осуществляли серийный пассаж клеток до достижения репликативного старения (РеС) с присутствующим повсюду 3ТС (10 мкМ) и оценивали временную индукцию генов ответа SASP (IL-1β, CCL2, IL-6, ММР3). (b-d, f), n=3 независимых эксперимента, (e) n=3 независимых биологических образца, повторяли в 2 независимых экспериментах, (b-f) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01. (b, d-f) непарные двусторонние t-критерии, (с) однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки.

[0028] На фиг. 4 показано, что L1 активируются с возрастом в тканях мышей, и провоспалительный ответ IFN-I ослабляется благодаря лечению ИОТ. Фиг. 4а. Присутствие белка ОРС1 L1 в тканях исследовали с помощью ИФ микроскопии. Количественный анализ экспрессирующих ОРС1 клеток показан на правой панели; оценивали по три животных и по меньшей мере по 200 клеток на животное для каждого условия. Масштабная линейка =4 мкм. Фиг. 4b. Активацию L1 в старых клетках исследовали путем одновременного окрашивания на активность SA-β-Gal и белок ОРС1 с помощью ИФ (печень самцов, 5 и 26 месяцев). Масштабная линейка =4 мкм. Эксперимент независимо повторяли три раза с получением сходных результатов. Фиг. 4с. мышам вводили 3ТС (2 мг/мл) в питьевой воде в указанных возрастах в течение двух недель и умерщвляли их после лечения. Экспрессию р16, гена ответа IFN-I (IFN-α) и маркера провоспалительного состояния (II-6) оценивали с помощью ОТ-кПЦР. См. на фиг. 14 дополнительные ткани и гены. На диаграммах размаха показан диапазон данных (усы), 25-й и 75-й процентили (ящик), средние значения (пунктирная линия) и медианы (сплошная линия). Каждая точка представляет собой одно животное. 5 месяцев, n=8; 26 месяцев, n=12; 29 месяцев, n=6. Фиг. 4d. Мышей в возрасте шести месяцев облучали нелетальной дозой и экспрессию L1, р16 и типичных генов ответа IFN-I (lfn-α, Oas1) оценивали с помощью ОТ-кПЦР в указанные моменты времени после облучения. Графическое представление как в (с); без облучения, n=3 животных в возрасте 3 месяца, n=5 животных в возрасте 6 месяцев; облученные, n=4 животных в возрасте 3 месяца, n=5 животных в возрасте 6 месяцев. Фиг. 4е. Инфильтрацию макрофагами белой жировой ткани и почки оценивали по положительным по F4/80 клеткам (% от всех ядер), n=5 животных в группе (жировая ткань); n=8 (почка). Диаметр волокна скелетной мышцы измеряли (подробности см. в разделе «Методы») и наносили на график в виде совокупной диаграммы размаха, n=5 животных на группу, всего 500 волокон. Гломерулосклероз оценивали на окрашенных Шифф-йодной кислотой (ШИК) срезах (подробности см. в разделе «Методы») как сумму всех клубочков с баллом 3 или 4, деленную на общее количество, n=7 животных на группу, 40 клубочков на животное. Графическое представление аналогично (с). Обработка 3ТС длилась 2 недели для белой жировой ткани и 6 месяцев (20-26 месяцев) для других тканей. Пунктирный круг показывает границы одного клубочка. Масштабная линейка =50 мкм.

Фиг. 4f. Нарушение механизмов надзора за L1 приводит к хронической активации ответа IFN-I. СИД: стимулируемый интерфероном путь ДНК. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии (a, d, е) или однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки (с, е белая жировая ткань).

[0029] На фиг. 5 представлена схема последовательности молекулярного пути клеточного старения, приводящего к связанному с возрастом «стерильному» воспалению.

[0030] На фиг.6 показано установление культур старых клеток и анализ активации L1 и IFN-I. Фиг. 6а. Схема пассажей для получения длительно культивируемых репликативно старых клеток (подробности в разделе «Методы»). Точка А была принята за ноль времени в состоянии старения. Фиг. 6b-d. Подтверждение старого статуса культур. Показан типичный эксперимент; другие эксперименты контролировали таким же образом и получали результаты, которые соответствовали этим исходным данным. РП - контрольные клетки раннего пассажа; Стар (Р) - раннее старение клеток (8 недель); Стар (П) - позднее старение клеток (16 недель). Фиг. 6b, Клетки метили BrdU в течение 6 часов. Включение BrdU⁸ и ассоциированную со старением клеток активность β-галактозидазы (SA-β-Gal)⁹ определяли, как указано. Фокусы повреждения ДНК визуализировали, применяя антитела γ-Н2АХ и иммунофлуоресцентную микроскопию (ИФ).¹⁰ Фиг. 6с, Экспрессию белков р21 (CDKN1A) и р16 (CDKN2A) определяли с помощью иммуноблоттинга. GAPDH служила контролем загрузки. Результаты на гелях см. на фиг. 16. Фиг. 6d. Экспрессию генов, характерных для SASP, определяли с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 6е. Активацию L1 в процессе старения штаммов фибробластов IMR-90 и WI-38 оценивали с помощью ОТ-кПЦР, применяя очищенную поли(А)-РНК и праймеры для ампликона F (фиг. 1b). Фиг. 6f. ОТ-ПЦР длинных фрагментов проводили с праймерами А-прямой и С-обратный (ампликон G) и праймерами А-прямой и D-обратный (ампликон Н) (фиг. 1b, таблица 1) и кДНК клонировали и секвенировали. Несколько попыток использования того же протокола на пролиферирующих клетках из раннего пассажа не привели к получению каких-либо клонов L1. Последовательности картировали на демаскированном эталонном геноме, требуя 100%-ной идентичности. Таким образом смогли картировать 658 клонов, 51 дополнительный клон содержал по меньшей мере 1 несовпадение и, следовательно, вероятно представлял собой элементы, которые полиморфны в линии клеток, и 58 представляли собой артефакты клонирования. Среди 658 картируемых клонов было представлено 224 уникальных элемента (таблица 3). Интактные элементы представляют собой подгруппу полноразмерных элементов, аннотированных без инактивирующих ОРС мутаций. Размер элементов соответствует количеству раз, которое элемент был представлен среди 658 клонов. Фиг. 6g. Краткое описание результатов ПЦР длинных фрагментов, представленных на фиг. 6f и в таблице 3. Фиг. 6h. Выявленное в геноме число копий элементов, детектированных с помощью наших ампликонов (расположение ампликонов см. на фиг. 1b и стратегию разработки праймеров см. в разделе «Методы»).

Предсказано: ПЦР in silico (подробности см. в разделе «Методы»). Наблюдается: количественную ПЦР проводили на 1 нг геномной ДНК и нормировали на известный однокопийный локус. Фиг. 6i. Активацию генов IFN-α и IFN-β1 в процессе старения клеток WI-38 и IMR-90 определяли с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 6j. Подтверждение стареющего статуса клеток при ВОС (20 дней, фиг. 6е) и ВСПС (30 дней, фиг.6е) по активности SA-β-Gal. ПВ - контрольный пустой вектор; КОНТР. - клетки без облучения. Фиг. 6k. Подтверждение экспрессии мРНК полноразмерного L1 во всех формах старения клеток с применением ОТ-кПЦР с праймерами для ампликонов А и F на очищенной поли(А)-РНК. Позднее начало активации показано путем сравнения дней 9 и 20 для ВОС и дней 12 и 30 для ВСПС.(b-e, i-k), n=3 независимых биологических образца, повторяли в 2 независимых экспериментах. Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0031] На фиг. 7 показано картирование сайтов инициации транскрипции в элементах L1, активированных во время старения клеток. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (5' RACE) проводили с праймерами С и D (фиг. 1а, таблица 1) на клетках в состоянии позднего старения (16 недель, точка D на фиг. 6а), продукты клонировали и отдельные клоны секвенировали по Сэнгеру (подробности см. в разделе «Методы»). Фиг. 7а. Получали множественное выравнивание последовательностей 50 картированных клонов с консенсусной последовательностью L1HS с помощью программного обеспечения MAFFT. Консенсусная последовательность L1HS показана сверху. Штриховка синим цветом выровненных клонов показывает степень их идентичности с консенсусной последовательностью. Вертикальная зеленая линия обозначает начало (положение 1) консенсусной последовательности L1HS. Вертикальные красные линии обозначают короткие гэпы (1-4 нуклеотида), открытые в консенсусной последовательности L1HS отдельными клонами. Консенсусная последовательность для 50 клонов показана снизу и была получена с помощью Jalview. Известно, что инициация транскрипции L1 неточная, причем большинство сайтов инициации встречается на расстоянии +/-50 п. о. от консенсусного сайта инициации, и одна подруппа находится настолько далеко как +180 п.о.¹¹ Фиг. 7b. Краткое описание результатов картирования и классификации клонов по семействам элементов L1. Относительные сайты инициации рассчитывали по отношению к консенсусному сайту инициации L1HS. Программное обеспечение RepEnrich¹² использовали, чтобы причислить клоны к семействам L1.

[0032] На фиг. 8 показана эволюция транскриптомных изменений во время прогрессирования старения клеток. Секвенирование РНК (RNA-seq) проводили на ранних пролиферирующих клетках LF1 (РП) и культурах 8-ми недель (Стар-Р) и 16-ти недель (Стар-П) старения клеток (точки С и D, соответственно, в Дополнительных данных на фиг.6а). Результаты анализировали, применяя трехфакторное сравнение: РП по сравнению со Стар-Р, РП по сравнению со Стар-П и Стар-Р по сравнению со Стар-П (подробности см. в разделе «Методы»). Фиг. 8а. Пропорциональные по площади обобщенные диаграммы Венна, изображающие пересечения трех сравнений для следующих наборов данных, i-ii -гены со значительно повышенной экспрессией и пониженной экспрессией (ряд 2х на панели b). iii-iv - важные пути KEGG, идентифицированные с помощью анализа представленности групп генов (GSEA). Заметна значительная эволюция транскриптома в поздний период старения клеток, примером которой являются большие изменения (особенно повышение экспрессии) в дифференциально экспрессирующихся генах, а также путях, v-vi -значительно изменяющиеся гены в группах генов IFN-I и SASP (см. в таблице 4 аннотирование групп генов). Заметно, что большая часть изменений в генах SASP происходит рано, тогда как большая составляющая изменений в IFN-I специфична для позднего старения клеток. Фиг. 8b. Краткое представление значительно изменяющихся генов с использованием фиксированного порога ожидаемой доли ложных отклонений (FDR) (<0,05) и порогов с вариабельной кратностью изменения (2х, 1,75х и 1,5х). Фиг. 8с. Анализ GSEA путей KEGG. Представление в виде тепловой карты показывает пути со значительно повышенной экспрессией красным цветом (также см. панель е) и пути с пониженной экспрессией синим цветом. Незначимые сравнения показаны черным цветом; вертикальные аннотации относятся к диаграммам Венна в (a, iii-iv). Примечательно, что у группы генов SASP экспрессия повышается рано, тогда как у группы генов IFN-I экспрессия повышается поздно. Фиг. 8d. Тепловые карты значительно изменяющихся генов в группах генов IFN-I и SASP. Вертикальные аннотации относятся к диаграммам Венна в (a, v-vi). Фиг. 8е. Перечень путей KEGG со значительно повышенной экспрессией, идентифицированный с помощью GSEA (см. в таблице 5 перечень всех путей). НПО-нормированные показатели обогащения. Группы генов IFN-I и SASP выделены желтым цветом. Заметно значительное повышение экспрессии IFN-I между ранним и поздним старением клеток. Красным шрифтом обозначены пути KEGG, указывающие на определение цитозольной ДНК и ответ интерферона I типа в позднем периоде. Фиг. 8f-g. Профили GSEA групп генов IFN-I и SASP для всех сравнений; FDR выделен желтым цветом. Примечательно, что экспрессия IFN-I значимо повышается для РП_Стар-П и Стар-Р_Стар-П, но не для РП_Стар-Р, и что повышение экспрессии SASP значимо для РП_Стар-Р и РП_Стар-П, но не для Стар-Р_Стар-П. n=3 независимых биологических образца. Анализировали значимость результатов дифференциальной экспрессии, применяя интерфейс GSEA GenePattern, и делали поправку результатов на множественные сравнения путем корректировки номинальных р-значений с применением метода Беньямини-Хохберга (подробности см. в разделе «Методы»).

[0033] На фиг. 9 показана характеристика эффекторов L1 и ответа IFN-I. Фиг. 9а. Экспрессию TREX1 определяли с помощью ОТ-кПЦР и иммуноблоттинга. Результаты на гелях см. на фиг. 16. Фиг. 9b. Экспрессию генов семейства RB сравнивали с помощью ОТ-кПЦР. Подтверждали, что у пар праймеров для всех генов была эквивалентная эффективность. Фиг. 9 с. Обогащение Н3K9mе3 и Н3K27mе3 элементов L1 исследовали с помощью ChIP-кПЦР (использовали праймеры ПЦР, показанные на фиг. 1b: 5'-НТО, ампликон А; ОРС1, ампликон Е; ОРС2, ампликон F). Фиг. 9d. Данные ChIP-seq из проекта ENCODE исследовали для выявления факторов транскрипции, которые связываются с консенсусной последовательностью L1. Кратность изменения log₂ обогащения по сравнению с контролями входной ДНК показана для указанных линий клеток. Было задокументировано связывание YY1 с промотором L1¹³, и его использовали в качестве положительного контроля. СЕВРВ использовали в качестве отрицательного контроля. Схематическое изображение, иллюстрирующее координаты L1 и важные особенности, приведено выше. Ампликоны А - Е такие же, как показано на фиг.1b. Фиг. 9е. Транскрипционную активность интактной 5'-НТО L1 или НТО, в которой отсутствует сайт связывания FOXA1 (НТО-А), определяли, используя смысловой и антисмысловой репортеры, которыми котрансфицировали клетки раннего пассажа LF1, либо с плазмидой экспрессии FOXA1, либо с пустым вектором (ПВ). Фиг. 9f. Осуществляли нокдаун FOXA1 в старых клетках с помощью shFOXAl (а) (см. также фиг. 2е и фиг. 10а), и связывание с 5'-НТО L1 (ампликоном В) определяли с помощью ChIP-кПЦР. Фиг. 9g. Осуществляли нокдаун RB1, TREX1 и эктопическую экспрессию FOXA1 в клетках раннего пассажа во всех одинарных (1Х), двойных (2Х) и тройных (3Х) комбинациях и оценивали с помощью ОТ-кПЦР, применяя очищенную поли(А)-РНК, активацию экспрессии L1, IFN-α и IFN-β1 (праймеры для ампликона F). Показано три контроля: клетки, инфицированные посторонней кшРНК (shGFP) или экспрессионной конструкцией (LacZ), или неинфицированные клетки раннего пассажа (РП). Фиг. 9h. Занятость 5'-НТО L1 RB1 и FOXA1 в клетках с 3Х определяли с помощью ChIP-кПЦР, которую проводили, как на фиг. 2а, b. Праймеры для ампликонов А и В использовали для RB1 и FOXA1, соответственно. Для сравнения также показаны отдельные вмешательства в клетки раннего пассажа с помощью shRB1 (а) или экспрессии кДНК FОХA1 (РП FOXA1-СЭ). Фиг. 9i. Подтверждение экспрессии мРНК полноразмерного L1 в клетках с 3Х с применением ОТ-кПЦР с праймерами для ампликонов А и F на очищенной поли(А)-РНК. КОНТР. - клетки, инфицированные посторонней кшРНК (shGFP). Фиг. 9j. Представление в виде тепловой карты, показывающее все биологические повторы для 67 генов, значительно изменяющих экспрессию в клетках Стар и/или 3Х (фиг. 2h, таблица 6). Кластеризацию столбцов рассчитывали как корреляцию Пирсона-1. Ряды были сгруппированы в функциональные подгруппы ответа IFN-1. Фиг. 9k. На диаграмме Венна показано перекрывание между 67 значительно изменяющимися генами, (a-f, h) n=3 независимых биологических образца, повторяли в двух независимых экспериментах, (g, i), n=3 независимых эксперимента, (а-i). Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0034] На фиг. 10 показана эффективность генетического и фармакологического вмешательств. Фиг. 10а. Нокдауны с помощью двух различных кшРНК (а, b) или эктопическую экспрессию кДНК (фиг. 10b) осуществляли в старых клетках, как описано на фиг. 2d, е, g (также см. раздел «Методы»). Эффективность данных манипуляций оценивали на соответствующих мишенях с помощью ОТ-кПЦР и иммуноблоттинга. Результаты на гелях см. на фиг. 16. Фиг. 10с. Экспрессия мРНК и белка RB1, TREX1 и FOXA1 после тройного (3Х) вмешательства (фиг. 2f). Фиг. 10d. Влияние обработки 3ТС на относительную распространенность последовательностей L1HS в старых клетках определяли с помощью мультиплексной количественной ПЦP TaqMan на общей ДНК (набор праймеров 6, таблица 1). Начало стар. - 0 недель старения (фиг. 1а; точка А на фиг. 6а). 3ТС вводили непрерывно с начала старения до момента сбора 16 недель спустя. Фиг. 10е. Применяли репортерную систему L1 с двойной люциферазой¹⁴, чтобы определить влияние введения дозы 3ТС на ретротранспозицию. Репортеры L1 вводили в клетки раннего пассажа, применяя лентивирусные векторы (подробности см. в разделе «Методы»), и клетки обрабатывали 3ТС в течение 4 дней перед сбором и анализом. JM111 - дефектный репортер, несущий мутации в ОРС1 (отсутствие 3ТС); L1RP - способный к ретротранспозиции репортер. Фиг. 10f. Влияние введения дозы 3ТС на ответ IFN-I. После эксперимента выше (d) проводили дальнейшую обработку с помощью ОТ-кПЦР, чтобы определить экспрессию IFN-α и IFN-β1. Фиг. 10g. Нокдауны L1 проводили с помощью двух различных кшРНК (а, b) в старых клетках (как на фиг. 2d, е, g) или клетках 3Х (как на фиг. 2g). Эффективность влияния на экспрессию L1 оценивали с помощью ОТ-кПЦР, применяя очищенную поли(А)-РНК и праймеры F. Фиг. 10h. В клетках в эксперименте в (д) исследовали уровни белка ОРС1 с помощью иммунофлуоресценции (ИФ). Анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения CellProfiler (подробности см. в разделе «Методы»). >200 клеток исследовали для каждого условия (УЕФ, условные единицы флуоресценции). Фиг. 10i. Обработку кшРНК L1 в эксперименте в (g) заменили на обработку 3ТС (10 мкМ) в течение такого же периода времени. Фиг. 10j. Исследовали влияние пяти различных ИОТ (или комбинаций) на ответ IFN-l. AZT (зидовудин, 15 мкМ), ABC (абакавир, 15 мкМ), FTC (эмтрицитабин, 10 мкМ), 3ТС (также называемый ламивудином или эпивиром, 10 мкМ), TZV (тризивир, комбинация 15 мкМ AZT, 15 мкМ ABC и 7,5 мкМ 3ТС). Клетки обрабатывали в течение 4 недель между 12 и 16 неделями старения клеток (фиг.1а; точки D и Е на фиг. 1а). Клетки 3Х (фиг. 2f) обрабатывали 3ТС в течение 48 часов после завершения последней селекции лекарственным средством. Экспрессию IFN-α определяли с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 10k. Клетки НеLa котрансфицировали нативным репортером L1 (pLD143)¹⁵ вместе с плазмидными векторами кшРНК (подробности см. в разделе «Методы»). Ретротранспозицию оценивали как GFP-положительные клетки, и нокдауны shL1 нормировали на отрицательный контроль shLuc. Абсолютная средняя частота ретротранспозиции (процент GFP-положительных клеток) составляла 4,1, что соответствовало опубликованным значениям для используемого репортера (pLD143)53. Фиг. 10l. Нокдауны cGAS и STING проводили в старых клетках или клетках 3Х, как и с другими кшРНК (фиг. 2d, е, g и a, g выше). Фиг. 10m. Снижение передачи сигнала интерферона после опосредованной CRISPR инактивации генов IFNAR1 и IFNAR2 проверяли по отсутствию транслокации IRF9 в ядро и фосфорилированию STAT2 в ответ на стимуляцию интерфероном. Клетки инфицировали лентивирусными векторами, экспрессирующими Cas9 и направляющие РНК (нРНК) для обоих IFNAR1 и IFNAR2 (AIFNAR, см. раздел «Методы»). После инфекции клетки повторно высевали на покровные стекла, обрабатывали интерфероном в течение 2 часов и исследовали с помощью ИФ микроскопии. Эксперимент повторяли трижды со сходными результатами, (a-i, I) n=3 независимых эксперимента, (k) n=3 независимых биологических образца, повторяли в 2 независимых экспериментах, (a-I) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0035] На фиг. 11 показана характеристика цитоплазматической ДНК в старых клетках. Фиг. 11а. Покоящиеся и старые клетки обрабатывали BrdU, как на фиг. 3а, и локализацию в клетке включения BrdU визуализировали с помощью ИФ микроскопии. Пролиферирующие клетки - РП (прол.) - показаны в качестве положительного контроля включения BrdU в ядро. Количественный анализ сигналов проводили, применяя программное обеспечение CellProfiler (правая панель, см. раздел «Методы»). Исследовали >200 клеток для каждого условия (УЕФ, условные единицы флуоресценции). Фиг. 11b. Стареющие (и контрольные РП) клетки (ни те, ни другие не мечены BrdU) фракционировали на ядерные и цитоплазматические фракции, и представленность последовательностей L1 в данных компартментах (а также целых клетках) оценивали с помощью количественной ПЦР, как на фиг. 3а (анализ методом мультиплексной количественной ПЦР TaqMan16, ампликон F, фиг. 1b). Стоит отметить, что единицы оси Y отличаются в 10 раз между левой и правой панелями. Фиг. 11 с. С помощью ИФ микроскопии исследовали присутствие в клетках белка ОРС1, гибридов РНК-ДНК и одноцепочечной ДНК (оцДНК). Антитела см. в разделе «Методы» и в таблице 2. Сигнал РНК-ДНК в старых клетках главным образом колокализовался с сигналом ОРС1 и утрачивался после обработки РНКазой А. Сигнал оцДНК также колокализовался с сигналом ОРС1 и выявлялся после обработки РНКазой. Эксперимент повторяли три раза с получением сходных результатов. Фиг. 11d. Осажденную содержащую BrdU ДНК (фиг. 3с, панель (а) выше, см. раздел «Методы») клонировали и секвенировали по Сэнгеру. Из всего 96 исследованных клонов 37 картировали на L1. Красные прямоугольники представляют относительные положения данных клонов на консенсусной последовательности L1. Фиг. 11е. Старые клетки, меченые BrdU (фиг. 3с, панель (а) выше), иммунопреципитировали антителами против BrdU, и представленность последовательностей L1 в осажденной ДНК оценивали с помощью количественной ПЦР с праймерами, охватывающими все элементы L1 (фиг. 1b, с). Фиг. 11f. Старые клетки обрабатывали кшРНК L1 (применяя лентивирусные векторы, как описано на фиг. 10g) между 12 и 16 неделями старения, и определяли экспрессию генов SASP. Фиг. 11g. Транскрипцию всех элементов L1 мыши оценивали цепь-специфическим способом, используя ту же стратегию, которую применяли по отношению к элементам L1 человека (фиг. 1b, с). Ампликоны (обозначенные W-Z, чтобы отличить их от специфических для человека праймеров) соответствуют 5'-НТО (W), ОРС1 (X), ОРС2 (Y) и 3'-НТО (Z). Последовательности праймеров также см. в разделе «Методы» и в таблице 1 (наборы праймеров 37, 48-50). Поли(А)-РНК получали из белой жировой ткани самцов. Оценивали всего 12 животных (3 группы по 4 животных в каждой) в трех независимых экспериментах. Фиг. 11h. Экспрессия трех на данный момент активных семейств элементов L1 мыши. Праймеры были разработаны таким образом, чтобы различить полиморфизмы 5'-НТО семейств MdA, MdN и Tf (см. раздел «Методы», наборы праймеров 51 - 53 в таблице 1). ОТ-кПЦР проводили, как в (f) выше (без специфичности к цепи), (а, b, е) n=3 независимых биологических образца, повторяли в двух независимых экспериментах, (f), n=3 независимых эксперимента, (a, e-h) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01. (а) однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки, (b, e-h) непарные двусторонние t-критерии.

[0036] На фиг. 12 показан эффект нарушения активации L1, цитоплазматического пути обнаружения ДНК или передачи сигналов интерферона на экспрессию IFN-I и ответы SASP. Фиг. 12а. Клетки 3Х обрабатывали кшРНК L1 или 3ТС в течение 48 часов, как описано на фиг. 10g, i. Влияние на ответ IFN-I определяли с помощью ОТ-кПЦР, ELISA или иммуноблоттинга. Результаты на гелях см. на фиг.16. Фиг. 12b. Осуществляли серийный пассаж клеток до достижения репликативного старения (РеС) с 3ТС (10 мкМ), присутствующим на всем протяжении, как на фиг. 3f, и экспрессию ингибиторов Cdk р21 и р16 оценивали с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 12с. Старые клетки обрабатывали кшРНК против cGAS или STING между 12 и 16 неделями старения (как описано на фиг. 10l), и определяли экспрессию генов ответа IFN-l (IFN-α, IRF7, OAS1). Фиг. 12d. Нокдауны cGAS и STING осуществляли с помощью кшРНК в клетках 3Х (как на панели (с) выше), и экспрессию генов IFN-I исследовали с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 12е. Осуществляли нокдаун cGAS и STING в старых клетках с помощью кшРНК (как на панели (с) выше) и экспрессию генов ответа SASP (IL-1β CCL2, IL-6, ММР3) анализировали с помощью ОТ-кПЦР. Фиг. 12f, g. Активность K-9 сравнивали с таковой для 3ТС в старых клетках и клетках 3Х. Культуры старых клеток обрабатывали между 12 и 16 неделями (как на фиг. 3b), а культуры 3Х - в течение 48 часов (как на панели (а) выше). Влияние на экспрессию генов IFN-I (IFN-α, IRF7, OAS1) и генов SASP (IL-1β IL-6, ММР3) оценивали с помощью ОТ-кПЦР. (а-g), n=3 независимых эксперимента, (а-g) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, непарные двусторонние t-критерии.

[0037] На фиг.13 показана оценка экспрессии р16, ОРС1 L1 и pSTAT1 в старых клетках и образцах кожи из пожилых людей. Фиг. 13а. Детектирование иммунофлуоресценции (ИФ) р16 и ОРС1 в раннем пассаже, 3Х и стареющих клетках. Фиг. 13b. Типичные изображения комбинированного окрашивания ОРС1 и р16 или ОРС1р и pSTAT1 в дерме человека. Эксперименты, представленные на панелях (а, b), независимо повторяли три раза с получением сходных результатов. Фиг. 13с. Клетки высевали на покровные стекла, окрашивали и осуществляли количественный анализ, как описано в разделе «Методы». Оценивали 200 клеток во множестве полей зрения для каждого условия. УЕФ, условные единицы флуоресценции. На вставках показан % клеток, обнаруженных в каждом квадранте. Фиг. 13d, е. Распространенность клеток с ОРС1 и р16 или pSTATI в коже человека. Получали криосрезы биоптатов кожи и окрашивали, как описано в разделе «Методы». 200 дермальных фибробластов во множестве полей зрения оценивали для каждого субъекта. Показаны совокупные результаты для четырех субъектов (800 клеток). Фиг. 13f. Результаты в (с) и (d) пересчитывали, чтобы показать относительную распространенность р16+ клеток среди всех клеток, и ОРС1+ клеток в пуле р16+клеток. Фиг. 13g. Результаты в (е) пересчитывали как в (f). Фиг. 13h. Характеристика людей, участвующих в анализе дермальных фибробластов. Данные образцы собирали в ходе продолжающегося исследования долгожительства Leiden Longevity Study.¹⁶ Образцы, используемые здесь, были выбраны произвольно из остатков материала. Анализ индуцированных дисфункцией теломер сайтов (TIF)¹⁷ основан на двухпараметрической (цветовой) визуализации теломер (с применением зонда FISH) и иммунофлуоресцентном детектировании сайтов повреждения ДНК (с применением антитела 53 ВР1). Вследствие ограниченного количества материала не представлялось возможным комбинировать детектирование р16 с экспериментами TIF в трехцветном эксперименте.

[0038] На фиг. 14 показано влияние лечения 3ТС или K-9 на экспрессию генов L1, р16, IFN-I и SASP в тканях мыши. Фиг. 14а-с. Мышам в указанных возрастах непрерывно вводили 3ТС в течение двух недель (см. также фиг. 4с, е, фиг. 15d-f и раздел «Методы»). Для всех условий экспрессию мРНК L1, р16, трех типичных генов ответа IFN-I (lfn-α, Itf7, Oas1) и трех типичных генов SASP (II-6, Мmр3, Раi1) оценивали с помощью ОТ-кПЦР. Ни в одном случае экспрессия через 5 месяцев +3ТС значительно не отличалась от контроля без лекарственного средства; следовательно, полученные результаты не показаны на фигуре (все собранные данные см. в таблице 7). На диаграммах размаха показан диапазон данных (усы), 25-й и 75-й процентили (ящик), средние значения (пунктирная линия) и медианы (сплошная линия). Каждая точка представляет собой одно животное. Фиг. 14а. Висцеральная белая жировая ткань, самцы мышей. 5 месяцев, n=8 животных; 26 месяцев, n=12 животных; 26 месяцев +3ТС, n=12 животных. Фиг. 14b. Висцеральная белая жировая ткань, самки мышей. 5 месяцев, n=8 животных; 26 месяцев, n=12 животных; 26 месяцев +3ТС, n=12 животных. Фиг. 14с. Печень, самцы мышей. 5 месяцев, n=8 животных; 26 месяцев, n=10 животных; 26 месяцев +3ТС, n=10 животных. Фиг. 14d. Мышам в возрасте 26 месяцев вводили K-9 или 3ТС в питьевой воде в течение двух недель и анализировали с помощью ОТ-кПЦР, как описано выше. НЛ - не лечили. Висцеральная белая жировая ткань, самцы мышей, n=7 животных в каждой группе. Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01, однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки.

[0039] На фиг. 15 показана комбинированная оценка старения клеток, маркеры IFN-I, SASP и L1 и влияние 3ТС на связанные с возрастом фенотипы в тканях мыши. Фиг. 15а, b. Проводили ИФ тотального препарата белой жировой самцов мышей в возрасте 5 месяцев и 26 месяцев (с 2 неделями обработки 3ТС и без обработки). В (а) утрата ламина В1 (маркера старения клеток) колокализовалась с IL-6 (маркер SASP). В (b) pStatl (маркер IFN-I) колокализовался с ОРС1 (маркер L1). Фиг. 15с. Количественный анализ экспериментов, показанных на (а) и (b). Для каждого условия оценивали четыре животных и по меньшей мере 200 клеток на животное. Фиг. 15d. Нейтральные липиды окрашивали BODIPY, чтобы визуализировать зрелые адипоциты в тотальных препаратах, и макрофаги детектировали с помощью ИФ, применяя антитело F4/80. Фиг. 15е. Влияние 2 недель лечения 3ТС на адипогенез оценивали путем измерения среднего размера адипоцитов (левая панель) и с помощью ОТ-кПЦР, чтобы определить экспрессию ключевых адипогенных генов (правые панели; Асаса - ацетил-КоА карбоксилаза 1; Cebpa - ССААТ/энхансер-связывающий белок альфа; Fasn - синтаза жирных кислот; Srebpl - белок 1, связывающий регуляторный элемент стерола). На диаграммах размаха показан диапазон данных (усы), 25-й и 75-й процентили (ящик), средние значения (пунктирная линия) и медианы (сплошная линия). Размер адипоцитов (окрашенную BODIPY площадь) рассчитывали, применяя CellProfiler; показаны совокупные результаты для 5 животных и всего 500 клеток. В результатах ОТ-кПЦР каждая точка представляет собой одно животное; n=6 животных. Фиг. 15f. Экспрессию гена Ucp1 (термогенин) в бурой жировой ткани определяли с помощью ОТ-кПЦР, и она представлена как в (е). n=5 животных. Фиг. 15g. Экспрессию мРНК L1 определяли с помощью ОТ-кПЦР, и она представлена как в (е). 5 месяцев, n=8 животных; 26 месяцев, n=12 животных; 29 месяцев, n=6 животных, (е-g) Результаты представляют собой среднее ±СО. *Р≤0,05, **Р≤0,01. (с, е левая панель, f, g) однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Тьюки, (е правые панели) непарные двусторонние t-критерии.

[0040] На фиг. 16 показаны сканированные изображения необработанных иммуноблотов. Фиг. 16А. Панель а, показан блот 1 - RB1: 1. РП; 2. Стар (П); 3. СЭ - Стар; 4. Стар (Р); панель b, показан блот 2 - TREX1: 1. РП; 2. Стар (Р); 3. Стар (П); и панель с, показан блот 3 - FOXA1: 1. РП; 2. Остановка; 3. Стар (Р); 4. Стар (П). Фиг. 16В: панель d, показан блот 4 - RB1: 1. РП; 2. 3Х; панель е, показан блот 5 - TREX1: 1. РП; 2. 3Х; и панель f, показан блот 6 - FOXA1: 1. РП; 2. 3Х. Фиг. 16С. Панель g. показан блот 7 - RB1: 1. Стар (П); 2. shRB1(b); 3. shRB1(a); 4. СЭ-RB1; панель h, показан блот 8 - TREX1: 1. Стар (П); 2. shTREXI (b); 3. shTREXI (а); 4. СЭ-TREX1; и панель i, показан блот 9 - FOXA1: 1. shFOXAl (а); 2. shFOXAl (b); 3. Стар (П); 4. OE-FOXA1. Фиг. 16D. Панель], показан блот 10 - STAT2: 1. 3Х; 2. shL; 3. НИОТ; 4. ΔIFNAR; 5. РП; панель к, показан блот 11 - IRF7: 1. РП; 2. shL1; 3. 3Х; 4. shLL1; 5. ΔIFNAR; панель I, показан блот 12 - STAT2:1. Стар (П); 2. AIFNAR; 3. shL1; 4. НИОТ; и панель m, показан блот 13 - IRF7: 5. Стар (П); 6. ΔIFNAR; 7. shL1; 8. НИОТ. На Фиг. 16Е показано: панель n, показан блот 14 - р16 (CDKN2A): 1. РП; 2. Стар (Р); 3. Стар (П); и панель о, показан блот 15 - р21 (CDKN1A): 1. РП; 2. Стар (Р); 3. Стар (П).

[0041] Ма фиг. 17 показано влияние адефовира и ламивудина на вызванные старением клеток повышение распространенности последовательности L1, экспрессию генов интерферона и экспрессию генов SASP. На фиг. 17а изображено влияние 5 мкМ адефовира и ламивудина на распространенность последовательности L1 (число копий) в трех различных линиях клеток фибробластов человека: LF1, IMR90, WI38, определенное с применением анализа методом количественной ПЦР. На фиг. 17b изображено влияние 5 мкМ адефовира и ламивудина на экспрессию генов интерферона для двух генов интерферона (IFN-α и IFN-β1) в двух линиях клеток (LF1 и IMR90). На фиг. 17с изображено влияние 5 мкМ адефовира и ламивудина на два гена SASP (IL-6 и ММР3) в линии клеток LF1. На фиг. 17d изображено влияние более высоких доз адефовира и ламивудина (10 мкМ и 50 мкМ) на экспрессию генов интерферона (IFN-α и IFN-β1) в линии клеток LF1.

[0042] На фиг. 18 показано ингибирование активности L1 мыши восьмью соединениями ИОТ: ламивудин (3ТС); ставудин; эмтрицитабин; априцитабин; тенофовира дизопроксил; ценсавудин; эльвуцитабин и тенофовир. Получали дозозависимый ответ на активность ретротранспозиции активного LINE-1 мыши, применяя клетки HeLa, в первом эксперименте (фиг. 18А) и во втором независимом эксперименте (фиг. 18В).

[0043] На фиг. 19 показано ингибирование активности L1 человека тремя соединениям ИОТ: ламивудин (3ТС); ценсавудин и эльвуцитабин. Получали дозозависимый ответ на активность ретротранспозиции активного LINE-1 человека, применяя клетки HeLa, в первом эксперименте с применением ламивудина (3ТС); ценсавудина и эльвуцитабина (фиг. 19А); и во втором эксперименте с применением ламивудина (3ТС) и эльвуцитабина (фиг. 19В).

[0044] На фиг. 20 показана жизнеспособность клеток HeLa после обработки 10 различными соединениями ИОТ: ламивудин (3ТС); ставудин; эмтрицитабин; априцитабин; тенофовира дизопроксил; ценсавудин; эльвуцитабин; тенофовир и стауроспорин.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0045] Должно быть понятно, что некоторые аспекты, способы, варианты реализации, вариации и особенности настоящего изобретения описаны ниже с различными уровнями детализации, чтобы обеспечить значительное понимание настоящего изобретения.

[0046] Следующее описание конкретного(-ых) аспекта(-ов) по своему характеру лишь иллюстративно и ни в коей мере не предназначено для ограничения объема настоящего изобретения, его применений или использования, которые могут, конечно, изменяться. Настоящее изобретение описано в соответствии с неограничивающими определениями и терминологией, включенными в данную заявку. Данные определения и терминология не предназначены для ограничения объема или осуществления настоящего изобретения, и присутствуют исключительно с целью иллюстрирования и описания. Хотя композиции или процессы описаны как использующие конкретные материалы или порядок отдельных этапов, должно быть понятно, что эти материалы или этапы могут быть взаимозаменяемыми, так что описание настоящего изобретения может включать множество частей или этапов, упорядоченных множеством способов, что без труда поймет специалист в данной области.

Определения

[0047] Определения некоторых терминов, используемых в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, представлены ниже. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, которые обычно понимает средний специалист в области, к которой относится настоящее изобретение.

[0048] В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если только в содержании явно не требуется иное. Например, термин «клетка» включает комбинацию двух или более клеток, и тому подобное.

[0049] Термин «приблизительно» или «около» при упоминании значения или параметра, как правило, используется, чтобы включить количества, отклоняющиеся в пределах 5%, 10%, 15% или 20% в любом направлении (большем или меньшем) от указанного количества, если только не указано или не очевидно из контекста иное (за исключением случаев, когда такое количество будет меньше 0% или будет превышать 100% от возможного значения). В данной заявке упоминание «приблизительно» или «около» значения или параметра включает (и описывает) варианты реализации, которые направлены на это значение или параметр. Например, описание, ссылающееся на «приблизительно X», включает описание «X».

[0050] В данной заявке термин «или» означает «и/или». В данной заявке предполагается, что термин «и/или», используемый в такой формулировке как «А и/или В», включает оба А и В; А или В; А (отдельно) и В (отдельно). Аналогичным образом, предполагается, что в объем термина «и/или», используемого в такой формулировке как «А, В и/или С», входит каждый из следующих вариантов реализации: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).

[0051] Должно быть очевидно, что во всех случаях, когда варианты реализации описаны в данной заявке с термином «включающий», также предложены в противном случае аналогичные варианты реализации, описанные с использованием терминов «состоящий из» и/или «состоящий по существу из». Также понятно, что во всех случаях, когда варианты реализации описаны в данной заявке с термином «состоящий по существу из», также предложены в противном случае аналогичные варианты реализации, описанные с использованием термина «состоящий из».

[0052] Должно быть понятно, что некоторые особенности настоящего изобретения, которые для ясности описаны в данной заявке в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть предложены в комбинации в одном варианте реализации. И наоборот, различные особенности настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, также могут быть предложены отдельно или в любой подкомбинации. Кроме того, упоминание значений, выраженных диапазонами, включает все без исключения значения внутри данного диапазона.

[0053] Термин «субъект» относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь перечисленными: собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, цыпленка, грызуна или примата. Субъекты могут представлять собой домашних питомцев (например, собак, кошек), сельскохозяйственных животных (например, коров, лошадей, свиней, кур и т.д.), лабораторных животных (например, мышей, крыс, кроликов и т.д.), но не ограничены ими. Субъекты включают людей. Субъект, который представляет собой человека, может представлять собой субъекта детского, взрослого или старческого возраста. Субъект, который представляет собой человека, может быть любого пола.

[0054] Термины «эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» включают количество, достаточное для предотвращения или снижения выраженности проявления заболевания или медицинского состояния, такого как связанное с возрастом расстройство. Должно быть очевидно, что в данной области известно множество способов определения эффективного количества для данного применения. Например, можно использовать фармакологические способы определения дозировки в терапевтическом контексте. В контексте терапевтического или профилактического применения количество композиции, которое вводят субъекту, будет зависеть от типа и тяжести заболевания и от особенностей субъекта, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и переносимость лекарственных средств. Оно также будет зависеть от степени, тяжести и типа заболевания. Квалифицированный специалист сможет определить подходящие дозировки в зависимости отданных и других факторов. Указанные композиции также можно вводить в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими соединениями.

[0055] В данной заявке термины «процесс лечения», или «лечение», или «лечить», или «облегчение», или «облегчать» относятся как к (1) терапевтическим мерам, которые исцеляют, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного заболевания или инфекции, так и к (2) профилактическим или предупредительным мерам, которые предотвращают или замедляют развитие заболевания или инфекции.

[0056] В данной заявке термин «длительное» введение означает, что терапевтический агент или лекарственное средство вводят в течение периода по меньшей мере 12 недель. Это включает случай, когда терапевтический агент или лекарственное средство вводят так, что оно эффективно свыше, или в течение, периода, составляющего по меньшей мере 12 недель, и не обязательно подразумевает, что само введение происходит в течение 12 недель, например, если применяют композиции с замедленным высвобождением или длительно действующий терапевтический агент или лекарственное средство. Таким образом, субъекта лечат в течение периода, составляющего по меньшей мере 12 недель. Во множестве случаев длительное введение происходит в течение по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 месяцев или более, или в течение по меньшей мере 1,2,3, 5, 7 или 10 лет, или дольше.

[0057] В данной заявке термин «возрастное воспаление» (или «связанное с возрастом воспаление») означает воспаление, обычно хроническое, в частности, хроническое системное воспаление, которое возникает при увеличении возраста. Такое воспаление можно наблюдать после возраста 30, 35 или 40 лет, но обычно наблюдают у субъектов в возрасте 45, 50, 55 или 60 или более лет. Во многих случаях это может быть воспаление на низком уровне.

[0058] В данной заявке термин «хроническое воспаление» означает воспаление (например, воспалительное состояние), которое наблюдается постоянно или длительно в организме субъекта. В общем, это означает воспалительный ответ или состояние продолжительностью 20, 25 или 30 дней или дольше или 1 месяц или дольше, в частности, по меньшей мере 2 или 3 месяца или дольше. Хроническое воспаление приводит к прогрессирующему сдвигу в типе клеток, присутствующих в очаге воспаления. Хроническое воспаление может являться предпосылкой к развитию множества заболеваний или расстройств, включая, в частности, дегенеративные заболевания или заболевания или состояния, связанные с утратой юношеского функционирования или со старением.

[0059] В данной заявке термин «системное воспаление» означает воспаление, которое не ограничено конкретной тканью, или очагом, или локализацией в организме. Указанное воспаление может быть распространенным (генерализованным) по всему организму. В системное воспаление обычно вовлечены эндотелий и другие системы органов.

[0060] В данной заявке термин «воспаление на низком уровне» (указанный термин используют в данной заявке как синонимичный термину «воспаление низкой степени») характеризуется двух-трехкратным повышением системных концентраций цитокинов, таких как TNFα, IL-6 и CRP, например, которые измеряют в плазме или сыворотке. Повышение может быть по отношению или по сравнению с нормальными концентрациями или эталонными концентрациями, например, концентрациями, которые определили в конкретной эталонной группе или популяции субъектов, например, молодых субъектов (например, молодых взрослых) или здоровых субъектов, например, субъектов, которые не страдают каким-либо заболеванием или состоянием, включая какое-либо воспалительное заболевание, или у которых нет воспаления. Повышение также может быть по сравнению с уровнем концентрации у субъекта перед развитием воспаления. Воспаление на низком уровне можно наблюдать при отсутствии явных признаков или симптомов заболевания.

Таким образом, воспаление на низком уровне может представлять собой субклиническое воспаление. В качестве альтернативы, у субъекта с воспалением на низком уровне может не быть клинически диагностированного состояния или заболевания, но могут проявляться некоторые признаки или симптомы воспалительного ответа или воспалительного состояния. Другими словами, могут присутствовать признаки или симптомы влияния воспаления на организм, но они могут еще не прогрессировать до явного или различимого заболевания.

[0061] В данной заявке термин «раковое воспаление» означает воспаление, которое происходит в контексте рака и может, в качестве альтернативы, быть названо «связанным с раком воспалением». Установили, что воспаление является отличительным признаком рака и может быть необходимо для онкогенеза и поддержания ракового состояния. Симптомы рака связаны с воспалением. Таким образом, у субъекта с раком может присутствовать или проявляться воспаление, которое может представлять собой воспаление на низком уровне или периферическое воспаление, которое обсуждалось выше, и, в частности, хроническое или системное воспаление, которое обсуждалось выше.

[0062] Если нет других определений, все термины (включая технические и научные термины), используемые в данной заявке, имеют те же значения, которые обычно понимает средний специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, должно быть понятно, что термины, такие как термины, определения которых приведены в широко используемых словарях, следует истолковывать как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте соответствующей области техники и настоящего описания, и не следует истолковывать в идеализированном или слишком формальном смысле, если только они явно не определены таким образом в данной заявке.

Фармацевтические композиции

[0063] Композиции и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения нуждающегося в этом индивида. В некоторых вариантах реализации индивид представляет собой млекопитающее, такое как человек или отличное от человека млекопитающее. При введении животному, такому как человек, композицию или соединение предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, соединение согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области и включают, например, водные растворы, такие как вода или физиологический буферный солевой раствор, или другие растворители или среды, такие как гликоли, глицерин, масла, такие как оливковое масло, или органические эфиры для инъекций. В предпочтительных вариантах реализации, в которых такие фармацевтические композиции предназначены для введения человеку, в частности, для инвазивных путей введения (т.е., таких путей, как инъекция или имплантация, при которых избегают транспорта или диффузии через эпителиальный барьер), водный раствор является апирогенным или по существу апирогенным. Вспомогательные вещества можно выбрать, например, таким образом, чтобы они осуществляли отсроченное высвобождение агента или селективное нацеливание на одну или более клеток, тканей или органов. Фармацевтическая композиция может находиться в форме единичных доз, такой как таблетка, капсула (включая капсулу с покрытыми частицами и желатиновую капсулу), гранула, лиофилизат для восстановления влагосодержания, порошок, раствор, сироп, суппозиторий, форма для инъекции или тому подобные формы. Композиция также может присутствовать в системе трансдермальной доставки, например, в кожном пластыре. Композиция также может присутствовать в растворе, подходящем для топического введения, таком как лосьон, крем или мазь.

[0064] Фармацевтически приемлемый носитель может содержать физиологически приемлемые агенты, которые действуют, например, чтобы стабилизировать, повысить растворимость или повысить всасывание соединения, такого как соединение согласно настоящему изобретению. Такие физиологически приемлемые агенты включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные белки или другие стабилизаторы или вспомогательные вещества. Выбор фармацевтически приемлемого носителя, включая физиологически приемлемый агент, зависит, например, от пути введения композиции. Препарат или фармацевтическая композиция может представлять собой самоэмульгирующуюся систему доставки лекарственного средства или самомикроэмульгирующуюся систему доставки лекарственного средства. Фармацевтическая композиция (препарат) также может представлять собой липосому или другую полимерную матрицу, в которую может быть заключено, например, соединение согласно настоящему изобретению. Липосомы, например, которые содержат фосфолипиды или другие липиды, представляют собой нетоксичные, физиологически приемлемые и метаболизируемые носители, которые относительно просто получать и вводить.

[0065] Формулировка «фармацевтически приемлемый» используется в данной заявке по отношению к тем соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в рамках тщательной медицинской оценки подходят для применения в контакте с тканями людей и животных, не вызывая избыточную токсичность, раздражение, аллергический ответ или другую проблему или осложнение, соответствующие приемлемому отношению польза/риск.

[0066] Формулировка «фармацевтически приемлемый носитель» в данной заявке означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или среду, такую как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами состава и не вреден пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкованный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и суппозиторные воски; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) эфиры, такие какэтилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия (15) альгиновая кислота; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатно-буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах.

[0067] Фармацевтическую композицию (препарат) можно вводить субъекту любым из множества путей введения, включая, например, пероральное введение (например, жидкие лекарственные формы, такие как в виде водных или безводных растворов или суспензий, таблетки, капсулы (включая капсулы с покрытыми частицами и желатиновые капсулы), болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык); всасывание через слизистую оболочку полости рта (например, сублингвально); подкожное введение; трансдермальное введение (например, в виде пластыря, прикрепленного к коже); и топическое введение (например, в виде крема, мази или спрея, нанесенного на кожу). Соединение можно также включить в состав для ингаляции. В некоторых вариантах реализации соединение можно просто растворить или суспендировать в стерильной воде. Подробности относительно подходящих путей введения и композиций, подходящих для них, можно найти, например, в патентах США №6110973; 5763493; 5731000; 5541231; 5427798; 5358970 и 4172896, а также в патентах, цитированных в них.

[0068] Составы могут быть удобным образом представлены в единичной лекарственной форме, и их можно получить с помощью любых способов, хорошо известных в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом-носителем для получения лекарственной формы, содержащей одну дозу, будет изменяться в зависимости от хозяина, которого лечат, конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом-носителем для получения лекарственной формы, содержащей одну дозу, как правило, будет представлять собой такое количество соединения, которое оказывает терапевтическое действие. Как правило, из ста процентов это количество будет находится в диапазоне от приблизительно 1 процента до приблизительно девяноста девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 5 процентов до приблизительно 70 процентов, наиболее предпочтительно от приблизительно 10 процентов до приблизительно 30 процентов.

[0069] Способы получения данных составов или композиций включают этап приведения в контакт активного соединения, такого как соединение согласно настоящему изобретению, с носителем и необязательно с одним или более дополнительными ингредиентами. Обычно, составы получают путем равномерного и тщательного приведения в контакт соединения согласно настоящему изобретению с жидкими носителями, или тонкоизмельченными твердыми носителями, или обоими типами носителей, а затем, при необходимости, формования полученного продукта.

[0070] Составы согласно настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут находиться в форме капсул (включая капсулы с покрытыми частицами и желатиновые капсулы), крахмальных облаток, пилюль, таблеток, леденцов (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и камеди акации или трагаканта), лиофилизата, порошков, гранул или в виде раствора или суспензии в водной или безводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии типа масло в воде или типа вода в масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин, или сахароза и камедь акации) и/или в виде жидкостей для полоскания рта и в тому подобных формах, каждая из которых содержит заранее определенное количество соединения согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Композиции или соединения можно также вводить в виде болюса, электуария или пасты.

[0071] Для получения твердых лекарственных форм для перорального введения (капсул (включая капсулы с покрытыми частицами и желатиновые капсулы), таблеток, пилюль, драже, порошков, гранул и тому подобных форм), активный ингредиент смешивают с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или любыми из следующих агентов: (1) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит, и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или камедь акации; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) замедляющие растворение агенты, такие как парафин; (6) ускорители всасывания, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) лубриканты, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; (10) комплексообразующие агенты, такой как, модифицированные и немодифицированные циклодекстрины; и (11) красящие агенты. В случае капсул (включая капсулы с покрытыми частицами и желатиновые капсулы), таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные вещества. Твердые композиции сходного типа можно также применять в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, используя такие вспомогательные вещества как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и тому подобные агенты.

[0072] Таблетку можно получить путем прессования или формования, необязательно с одним или более дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получить с применением связующего вещества (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), скользящего вещества, инертного разбавителя, консерванта, дезинтегрирующего агента (например, крахмалгликолята натрия или перекрестно-связанной карбоксиметилцеллюлозы натрия), поверхностно-активного или диспергирующего агента. Формованные таблетки можно получить путем формования в подходящем устройстве смеси порошкованного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем.

[0073] На таблетки и другие твердые лекарственные формы фармацевтических композиций, такие как драже, капсулы (включая капсулы с покрытыми частицами и желатиновые капсулы), пилюли и гранулы, необязательно можно нанести риски или получить их с покрытием и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области составления фармацевтических композиций. Их также можно включить в состав лекарственных форм для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения из них активного ингредиента, применяя, например, гидроксипропилметилцеллюлозу в различных соотношениях, чтобы добиться желательного профиля высвобождения, другие полимерные матрицы, липосомы и/или микросферы. Их можно стерилизовать, например, путем фильтрации через задерживающий бактерии фильтр или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворить в стерильной воде или некоторых других стерильных средах для инъекций непосредственно перед применением. Данные композиции могут также необязательно содержать замутняющие агенты и могут иметь такой состав, что они высвобождают активный(-е) ингредиент(ы) только, или преимущественно, в некоторой части желудочно-кишечного тракта, необязательно отсроченным способом. Примеры инкапсулирующих композиций, которые можно применять, включают полимерные вещества и воски. Активный ингредиент также может быть в микроинкапсулированной форме, при необходимости, с одним или более из описанных выше вспомогательных веществ.

[0074] Жидкие лекарственные формы, пригодные для перорального введения, включают фармацевтически приемлемые эмульсии, лиофилизаты для восстановления влагосодержания, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Дополнительно к активному ингредиенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, широко применяемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, циклодекстрины и их производные, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, из зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, и их смеси.

[0075] Помимо инертных разбавителей пероральные композиции также могут содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие, ароматизирующие, красящие, отдушивающие и консервирующие агенты.

[0076] Суспензии, дополнительно к активным соединениям, могут содержать суспендирующие агенты, такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, и их смеси.

[0077] Лекарственные формы для топического или трансдермального введения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и лекарственные формы для ингаляции. Активное соединение можно смешать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться.

[0078] Мази, пасты, кремы и гели могут содержать, дополнительно к активному соединению, вспомогательные вещества, такие какживотные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка, или их смеси.

[0079] Порошки и спреи могут содержать, дополнительно к активному соединению, вспомогательные вещества, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок, или смеси данных веществ. Спреи могут дополнительно содержать обычные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.

[0080] Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество, обеспечивая контролируемую доставку соединения согласно настоящему изобретению в организм. Такие лекарственные формы можно получить путем растворения или диспергирования активного соединения в подходящей среде. Способствующие всасыванию вещества также можно применять для повышения проникновения соединения через кожу. Скорость такого проникновения можно контролировать либо с помощью контролирующей скорость проникновения мембраны, либо путем диспергирования соединения в полимерной матрице или геле.

[0081] Формулировки «парентеральное введение» и «вводили парентерально» в данной заявке означают способы введения, отличные от энтерального и топического введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутриглазную (такую как интравитреальная), внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, внутрипозвоночную и внутристернальную инъекцию и инфузию. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, содержат одно или более активных соединений в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или безводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, влагосодержание которых можно восстановить стерильными инъецируемыми растворами или дисперсиями непосредственно перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства, растворенные вещества, которые делают состав изотоничным крови предполагаемого реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты.

[0082] Примеры подходящих водных и безводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтилен гликоль и тому подобные), и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Примеры подходящих водных и безводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобные), и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения обволакивающих материалов, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий, и путем применения поверхностно-активных веществ.

[0083] Данные композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов можно гарантировать путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и тому подобных агентов. Также может потребоваться добавить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и тому подобные агенты. Кроме того, пролонгированного всасывания лекарственной формы для инъекции можно добиться путем добавления агентов, которые отсрочивают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

[0084] В некоторых случаях для того, чтобы продлить действие лекарственного средства, желательно замедлить всасывание лекарственного средства из подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно добиться путем применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. Скорость всасывания лекарственного средства затем зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В качестве альтернативы, замедленного всасывания парентерально введенной лекарственной формы добиваются путем растворения или суспендирован и я лекарственного средства в масляной среде.

[0085] Депо-формы для инъекций получают путем формирования микроинкапсулированных матриц обсуждаемых соединений в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера и природы конкретного используемого полимера, скорость высвобождения лекарственного средства можно контролировать. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и пол и (ангидриды). Депо-составы для инъекций также получают путем заключения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.

[0086] Для применения в способах согласно настоящему изобретению активные соединения можно давать в чистом виде или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,1 до 99,5% (более предпочтительно от 0,5 до 90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0087] Способы введения также могут быть предложены с помощью перезаправляемых или биоразлагаемых устройств. Различные полимерные устройства для медленного высвобождения были разработаны и исследованы in vivo в последние годы для контролируемой доставки лекарственных средств, включая белковые биофармацевтические средства. Различные биосовместимые полимеры (включая гидрогели), включая как биоразлагаемые, так и неразлагаемые полимеры, можно применять для получения имплантата для замедленного высвобождения соединения в конкретном целевом участке.

[0088] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях можно изменять, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно приводит к достижению желательного терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсического действия на пациента.

[0089] Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных факторов, включая активность конкретного соединения или комбинации используемых соединений, или его сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного(-ых) используемого(-ых) соединения(-й), продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретным(и) используемым(и) соединением(-ями), возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, которого лечат, и тому подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

[0090] Врач или ветеринар со средним уровнем компетенции в данной области может легко определить и назначить необходимое терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз фармацевтической композиции или соединения на уровнях, более низких чем необходимые для оказания желательного терапевтического действия, и постепенно повышать дозировку до достижения желательного эффекта. Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевают концентрацию соединения, которой достаточно, чтобы вызвать желательное терапевтическое действие. Как правило, понятно, что эффективное количество соединения будет изменяться в зависимости от массы тела, пола, возраста и анамнеза субъекта. Другие факторы, которые влияют на эффективное количество, могут включать, но не ограничены перечисленными: тяжесть состояния пациента, расстройство, которое лечат, стабильность соединения и, при необходимости, другой тип терапевтического агента, который вводят вместе с соединением согласно настоящему изобретению. Более большую суммарную дозу можно доставить путем множества введений агента. Способы определения эффективности и дозировки известны специалистам в данной области.¹⁸

[0091] Обычно, подходящая суточная доза активного соединения, используемая в композициях и способах согласно настоящему изобретению, будет представлять собой такое количество соединения, которое представляет собой наименьшую дозу, эффективную для оказания терапевтического действия. Такая эффективная доза, как правило, будет зависеть от факторов, описанных выше.

[0092] При необходимости, эффективную суточную дозу активного соединения можно вводить в виде одной, двух, трех, четырех, пяти, шести или более частичных доз, которые вводят отдельно с подходящими интервалами в течение дня, необязательно в виде лекарственных форм, содержащих одну дозу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения активное соединение можно вводить по два или три раза ежедневно. В других вариантах реализации активное соединение будут вводить раз в день.

[0093] Пациент, получающий данное лечение, представляет собой любое нуждающееся в этом животное, включая приматов, в частности, людей; и других млекопитающих, таких как представители семейства лошадиных, бычьих, свиных, овечьих, кошачьих и псовых; домашних птиц; и домашних питомцев в целом.

[0094] В некоторых вариантах реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять отдельно или вводить совместно с другим типом терапевтического агента.

[0095] Согласно настоящему изобретению предложено применение фармацевтически приемлемых солей соединений согласно настоящему изобретению в композициях и способах согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации предложенные соли согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены солями алкил-, диалкил-, триалкил- или тетраалкиламмония. В некоторых вариантах реализации предложенные соли согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены солями L-аргинина, бенентамина, бензатина, бетаина, гидроксида кальция, холина, деанола, диэтаноламина, диэтиламина, 2-(диэтиламино)этанола, этаноламина, этилендиамина, N-метилглюкамина, гидрабамина, 1Н-имидазола, лития, L-лизина, магния, 4-(2-гидроксиэтил)морфолина, пиперазина, калия, 1-(2-гидроксиэтил)пирролидина, натрия, триэтаноламина, трометамина и цинка. В некоторых вариантах реализации предложенные соли согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены солями Na, Са, K, Mg, Zn или других металлов. В некоторых вариантах реализации предложенные соли согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены солями 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты, 2,2-дихлоруксусной кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, 2-оксоглутаровой кислоты, 4-ацетамидобензойной кислоты, 4-аминосалициловой кислоты, уксусной кислоты, адипиновой кислоты, I-аскорбиновой кислоты, I-аспарагиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, (+)-камфорной кислоты, (+)-камфор-10-сульфоновой кислоты, каприновой кислоты (декановой кислоты), капроновой кислоты (гексановой кислоты), каприловой кислоты (октановой кислоты), карбоновой кислоты, коричной кислоты, лимонной кислоты, цикламовой кислоты, додецилсерной кислоты, этан-1,2-дисульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, муравьиной кислоты, фумаровой кислоты, галактаровой кислоты, гентизиновой кислоты, d-глюкогептоновой кислоты, d-глюконовой кислоты, d-глюкуроновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутаровой кислоты, глицерофосфорной кислоты, гликолевой кислоты, гиппуровой кислоты, бромистоводородной кислоты, соляной кислоты, изомасляной кислоты, молочной кислоты, лактобионовой кислоты, лауриновой кислоты, малеиновой кислоты, l-яблочной кислоты, малоновой кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, нафталин-1,5-дисульфоновой кислоты, нафталин-2-сульфоновой кислоты, никотиновой кислота, азотной кислоты, олеиновой кислоты, щавелевой кислоты, palmitic кислоты, памоевой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, l-пироглутаминовой кислоты, салициловой кислоты, себациновой кислоты, стеариновой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, l-винной кислоты, тиоциановой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и ундециленовой кислоты.

[0096] Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут также существовать в виде различных сольватов, например, с водой, метанолом, этанолом, диметилформамидом и тому подобными растворителями. Смеси таких сольватов также можно получить. Источником такого сольвата может быть растворитель кристаллизации: может быть свойством, присущим растворителю, используемому при получении или кристаллизации, или может быть внешним по отношению к растворителю.

[0097] Смачивающие агенты, эмульгаторы и скользящие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красящие агенты, разделительные агенты, покрывающие агенты, подслащивающие, ароматизирующие и отдушивающие агенты, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композициях.

[0098] Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные антиоксиданты; (2) растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллаты, альфа-токоферол и тому подобные антиоксиданты; и (3) хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобные агенты.

РОЛЬ СТАРЕНИЯ КЛЕТОК В СТАРЕНИИ И СВЯЗАННЫХ С ВОЗРАСТОМ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

[0099] На фиг. 5 представлена схема последовательности, описывающей молекулярный путь старения клеток, приводящий к связанному с возрастом стерильному воспалению, что описано более подробно ниже.

Повышение экспрессии ретротранспозируемых элементов (RTE)

[0100] Известно, что транскрипция RTE активируется в старых клетках¹⁹ и в некоторых тканях мыши.²⁰ Ранее было показано, что три регуляторных фактора участвуют в регуляции L1: FOXA1, RB, TREX1. Было описано, что в старых клетках повышается экспрессия FOXA1,²¹ и он связывается с промотором L1.²² Было описано, что RB репрессирует элементы L1.²³ Было описано, что полная утрата TREX1 (генеративная делеция) приводит к аутоиммунному заболеванию (синдром Айкарди-Гутьерес, AGS), которое связано с активацией L1,²⁴

[0101] Хотя было описано, что данные три регуляторных фактора играют роль в регуляции L1, результаты, представленные в настоящем описании, впервые демонстрируют, что неправильной регуляции комбинации данных трех факторов достаточно, чтобы обеспечить возможность активации эндогенных элементов L1 в нормальных клетках. См. пример 2. Более того, в соответствии с настоящим изобретением предложено первое описание позднего клеточного старения как отдельной временной, и до настоящего времени неизвестной, стадии старения клеток, для которой характерно повышение экспрессии элементов L1 и запуск ответа IFN-I. См. пример 1.

Накопление цитоплазматической кДНК L1

[0102] Существование цитоплазматической кДНК L1 было известно. Было показано, что одним ее источником являются митохондрии.²⁵ Сообщалось, что хромосомная ДНК «вытекает» из ядер в цитоплазму в старых клетках.²⁶ Ее впоследствии назвали «цитоплазматическими фрагментами хроматина» (ЦФХ, CCF)²⁷ и позже описали ее наличие в старых клетках.²⁸ Тем не менее, ни в одном из данных сообщений не упоминали RTE и L1 как компоненты ЦФХ.

[0103] Результаты в настоящем описании показывают не только то, что последовательности ДНК L1 обнаружены в цитоплазме старых клеток, но также что их количество больше, чем в ядерных последовательностях ДНК. См. пример 3. По этой причине, ранее описанное простое вытеснение части хромосомной ДНК из ядра в цитоплазму не может объяснить большее количество последовательностей L1, наблюдаемое здесь.

[0104] Хотя ранее сообщали, что количество ДНК L1 было повышено в клетках, лишенных TREX1 (AGS),²⁹ и что кДНК L1, накапливающаяся в клетках с нокаутом TREX1, была цитоплазматической локализации,³⁰ AGS является редким аутоиммунным заболеванием, которое не связано с возрастом. Напротив, результаты, представленные в настоящем описании, позволяют прийти к выводу, что присутствие цитоплазматической ДНК L1 свойственно старым клеткам - одному из основных факторов, стимулирующих старение организма и связанные со старением заболевания.

Индукция IFN-I и взаимовлияние на иммунную систему, усиление SASP

[0105] Ранее сообщали, что цитоплазматическая ДНК (и, в частности, ЦФХ) узнается сенсорным сигнальным путем cGAS/STING, который, следовательно, вызывает воспалительное состояние.³¹ В контексте старения клеток данное провоспалительное состояние известно как ассоциированный со старением клеток секреторный фенотип (SASP). В данных сообщениях показали, что SASP по меньшей мере отчасти зависит от ЦФХ, поскольку нокдаун компонентов сигнального пути cGAS/STING уменьшал SASP. Также сообщали, что ответ IFN-I является частью данного провоспалительного каскада.³²Выше отмечено, что ни в одном изданных предыдущих сообщений не связывали элементы L1 с активацией SASP посредством ЦФХ.

[0106] Результаты, представленные в настоящем описании, доказывают, что ДНК L1 не только составляет значительную часть ЦФХ, которым обогащена цитоплазматическая ДНК по сравнению с ядерными последовательностями, но она также функционально значима для активации SASP. В частности, результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что уменьшение количества цитоплазматической ДНК L1, либо с помощью кшРНК к L1, либо путем блокирования обратной транскрипции L1 с помощью лекарственных средств - ИОТ, уменьшало как ответ IFN-I, так и SASP в старых клетках. Важно отметить, что результаты, представленные в настоящем описании, представляют собой первое доказательство, подтверждающее, что лечение с помощью ИОТ может эффективно обратить как IFN-I, и так и провоспалительный SASP после того, как они полностью установились в старых клетках. См. примеры 3 и 4.

[0107] Все предшествующие исследования, имеющие отношение к терапии, были ограничены препятствованием сигнальному пути обнаружения ДНК cGAS/STING, например, показывающие, что кшРНК против компонентов пути cGAS/STING отрицательно регулировала ответ IFN-I и SASP.^33,34 Хотя можно предположить, что применение низкомолекулярных ингибиторов сигнального пути cGAS/STING будет понижающим образом регулировать SASP, такое лечение приведет к повышенной восприимчивости к вирусным, бактериальным инфекциям и инфекциям другими патогенами.

[0108] Подход в соответствии с настоящим изобретением нацеливания лекарственных средств ИОТ на синтез ДНК L1 обращен к корню проблемы, так как он нацелен на являющийся первоначальной причиной агент (саму ДНК L1), а не на последующие события процессинга, такие как сигнальный путь обнаружения ДНК cGAS/STING, или даже еще более далекие компоненты сигнальных путей интерферона или иммунитета. Авторы настоящего изобретения понимают, что все данные последующие компоненты обладают незаменимыми клеточными функциями, и, следовательно, нацеливание на них нарушит, в некотором аспекте, нормальные физиологические процессы. С другой стороны, ДНК L1 представляет собой уникальный «чужеродный» компонент, фармакологическому нацеливанию на который могут препятствовать только «побочные» эффекты.

[0109] В последние годы стало ясно, что старение клеток является одним из основных факторов, способствующих старению организма и связанным со старением заболеваниям.³⁵ Следовательно, присутствует значительный интерес в «сенотерапевтических средствах», блокирующих вредное влияние старых клеток.³⁶Основные усилия были направлены на «сенолитические» лекарственные средства, которые селективно уничтожают (и, следовательно, удаляют) старые клетки из тканей. «Сеноморфики» были классифицированы как малые молекулы, которые подавляют стареющие фенотипы без уничтожения клеток. Мы предпочитаем называть такие лекарственные средства «сеностатическими» лекарственными средствами, чтобы особо подчеркнуть, что их основное действие состоит в остановке или блокировании вредного влияния старых клеток, в частности, SASP.

[0110] Результаты в настоящем описании демонстрируют, что в клетках человека и в моделях на мышах ИОТ представляют собой сеностатические лекарственные средства, которые обращают SASP старых клеток и, следовательно, ослабляют связанное с возрастом провоспалительное состояние. Результаты в настоящем описании также описывают, какие конкретно ИОТ, и в каких дозах, особенно эффективны для обращения SASP. Широкая эффективность ИОТ в качестве сеностатических лекарственных средств, которые могут лечить множество связанных с возрастом состояний, ранее не была описана в данной области.

Стимуляция связанного с возрастом «стерильного» воспаления

[0111] Стерильное воспаление, также известное как воспалительное старение (inflammaging), является отличительным признаком старения и фактором, способствующим множеству связанных с возрастом заболеваний.^37,38 Результаты в настоящем описании свидетельствуют о том, что активация элементов L1 (и необязательно других RTE) вызывает воспалительное старение, и что ОТ L1 является подходящей мишенью для лечения связанного с возрастом воспаления и возрастных расстройств.

[0112] В настоящем описании предложены конкретные примеры пожилых мышей, у которых связанные с возрастом патологии можно обратить или по меньшей мере уменьшить путем введения ИОТ. Например, показано, что НИОТ ламивудин (также известный как 3ТС или эпивир) обращает или понижающим образом регулирует:

Панель маркеров IFN-I и SASP, измеренных с помощью ОТ-кПЦР во множестве тканей;

Инфильтрацию макрофагов в белую жировую ткань и ткань почки, измеренную с помощью ИФ микроскопии;

Атрофию мышц, измеренную по диаметру мышечного волокна;

Гломерулосклероз почки, измеренный с помощью патологической оценки окрашенных ШИК срезов;

Атрофию адипоцитов, измеренную при помощи микроскопа по размеру клеток и путем анализа с помощью ОТ-кПЦР ключевых адипогенных генов; и

Термогенез, измеренный путем анализа с помощью ОТ-кПЦР экспрессии Ucp1.

[0113] Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложено

применение ИОТ в качестве «сеностатических» лекарственных средств, которые способны останавливать или блокировать вредное влияние старых клеток, в частности, SASP, и предотвращать или обращать связанные с возрастом воспаление и расстройства.

Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ)

[0114] НИОТ представляют собой активные ингибиторы обратной транскриптазы, обнаруженные в ретровирусах, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Различные нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы могут активироваться различным образом, но у них одинаковый механизм действия. НИОТ, как правило, активируются фосфорилированием клеточными ферментами с образованием трифосфатной формы. Она затем конкурирует с клеточными трифосфатами, которые являются субстратами для провирусной ДНК, продуцируемой вирусной обратной транскриптазой. НИОТ были первым типом лекарственных средств, доступных для лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции) и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

[0115] В таблице 8 представлен перечень обычных одобренных лекарственных средств НИОТ или комбинированных лекарственных средств НИОТ, применяемых для лечения ВИЧ-инфекции и СПИДа. Выше описано, в соответствии со способами настоящего изобретения, что НИОТ можно применять в качестве «сеностатических» лекарственных средств, которые способны останавливать или блокировать вредное влияние старых клеток, в частности, SASP, и предотвращать или обращать связанные с возрастом воспаление и расстройства.

[0116] Лекарственные средства на основе НИОТ, которые можно применять в способах настоящего изобретения, включают, но не ограничены перечисленными: Амдоксовир, Априцитабин (АТС), АТРИПЛА® (эфавиренц/эмтрицитабин/тенофовира дизопроксил), БАРАКЛЮД® (энтекавир; ETV), БИКТАРВИ® (биктегравир/эмтрицитабин/тенофовира алафенамид), Ценсавудин (INN; BMS-986001; ОВР-601; фестинавир), КОМБИВИР™ (зидовудин/ламивудин), КОВИРАЦИЛ™ (эмтрицитабин; FTC), DAPD/DXG (активный метаболит DAPD - 2,6-диаминопуриндиоксолан), ДЕСКОВИ® (эмтрицитабин/тенофовира алафенамид), D-D4FC (Дексельвуцитабин; Реверсет; INCB-8721; DPC 817), dOTC (2'-дезокси-3'-окса-4'-тиоцитидин; ВСН-10652), Эльвуцитабин, ЭМТРИВА™ (эмтрицитабин), ЭПИВИР™ (ламивудин; 3ТС), EFdA (4'-этинил-2-фтор-2'-дезоксиаденозин; МK-8591), ЭВИПЛЕРА™ (рилпивирин/эмтрицитабин/тенофовира дизопроксил), ГЕНВОЯ® (элвитегравир/кобицистат/эмтрицитабин/тенофовира алафенамид), ХИВИД™ (залцитабин; ddC), КИВЕКСА™ (абакавир/ламивудин), ЛОДЕНОЗИН™ (F-ddA), ОДЕФСЕЙ® (рилпивирин/тенофовира алафенамид/эмтрицитабин), ПРЕВЕОН® (адефовира дипивоксил), Рацивир (RCV; (+/-)-эмтрицитабин), РЕТРОВИР™ (зидовудин; ZDV; азидотимидин; AZT), Стампидин, СТРИБИЛД® (Элвитегравир /кобицистат/эмтрицитабин/тенофовира дизопроксил), ТЕНОФОВИР™ (TDF, bis-POC РМРА), ТРИУМЕК® (долутегравир/абакавир/ламивудин), ТРИЗИВИР™ (абакавир/ламивудин/зидовудин), ТРУВАДА® (эмтрицитабин/тенофовира дизопроксил), ВЕМЛИДИ® (тенофовира алафенамид; TAF), ВИДЕКС™ (диданозин, dd1), ВИРЕАД™ (тенофовира дизопроксил), ЗИАГЕН^М (абакавир; 159U89), и ЗЕРИТ™ (ставудин; d4T).

[0117] В дозах, применяемых для терапии ВИЧ/СПИД, данные лекарственные средства могут вызывать широкий диапазон побочных действий. Обычные побочные действия НИОТ включают, среди прочего, токсичность для митохондрий (связанную с ингибированием митохондриальной полимеразы), нейропатию, панкреатит, стеатоз печени и молочнокислый ацидоз, миелосуппрессию, симптоматическую миопатию и кардиомиопатию.³⁹ Хотя НИОТ можно применять в дозировках, одобренных для лечения ВИЧ/СПИД, для предотвращения или лечения связанных с возрастом воспаления и расстройств можно применять более низкие дозировки, чтобы избежать побочных действий, связанных с более высокими дозами. В одном варианте реализации дозировка, применяемая для предотвращения или лечения связанных с возрастом воспаления и расстройств, составляет половину (50%) дозировки, одобренной для лечения ВИЧ/СПИД (см. таблицу 9). В альтернативном варианте реализации применяемая дозировка составляет 75% от дозировки, одобренной для лечения ВИЧ/СПИД. В еще одном альтернативном варианте реализации применяемая дозировка составляет 25% от дозировки, одобренной для лечения ВИЧ/СПИД. В других альтернативных вариантах реализации применяемая дозировка составляет 90%, 80%, 70%, 60%, 40%, 30%, 20%, или 10% от дозировки, одобренной для лечения ВИЧ/СПИД. В других альтернативных вариантах реализации применяемая дозировка составляет от 0,1 до 99,5%, от 10 до 90%, от 20 до 80%, от 25 до 75%, от 30 до 70%, от 40 до 60% или от 45 до 55% от дозировки, одобренной для лечения ВИЧ/СПИД.

[0118] В некоторых вариантах реализации субъекту проводят длительное введение одного или более лекарственных средств ИОТ согласно определению в данной заявке. В одном варианте реализации субъекта лечат в течение периода, составляющего по меньшей мере 12 недель. Во многих случаях длительное введение осуществляют в течение по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 месяцев или более, или в течение по меньшей мере 1,2,3, 5, 7 или 10 лет или более.

Связанные с возрастом расстройства

[0119] В связи с тем, что старение клеток является одним из основных факторов, способствующих старению организма и связанным со старением заболеваниям,⁴⁰ способы в соответствии с настоящим изобретением можно применять для предотвращения или лечения расстройств или заболеваний, которые связаны со старением клеток, в частности, в которых присутствие старых клеток вероятно оказывает вредное действие, путем введения одного или более сеностатических лекарственных средств ИОТ.

[0120] Расстройства или заболевания, которые связаны со старением клеток, включают, но не ограничены перечисленными: болезнь Альцгеймера⁴¹ боковой амиотрофический склероз (БАС), атеросклероз ⁴² болезнь Гентингтона, потерю зрения, потерю слуха, дегенеративные заболевания периферической нервной системы, дисфункцию сердечно-сосудистой системы,⁴³ атеросклероз, лобно-височную деменцию (ЛВД), рассеянный склероз (PC), синдром Айкарди-Гутьерес, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), вызванные химиотерапией нежелательные явления (например, подавление функции костного мозга, кардиотоксичность, рецидив рака, тромбы, утомляемость),⁴⁴ нарушение функционирования гематопоэтических стволовых клеток,⁴⁵остеоартрит⁴⁶ остеопороз,⁴⁷ болезнь Паркинсона,⁴⁸ нарушение физического функционирования ⁴⁹ фиброз легких,⁵⁰ старение кожи, заживление ран и/или регенерацию тканей.⁵¹

Способы лечения, предотвращения и обращения связанного с возрастом воспаления с помощью ИОТ

[0121] Предложен способ лечения, предотвращения и обращения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента путем введения ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ) нуждающемуся в этом пациенту. Связанное с возрастом воспаление может быть у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, потеря зрения, потеря слуха, дегенеративные заболевания периферической нервной системы и дисфункция сердечно-сосудистой системы.

[0122] В одном варианте реализации предложен способ отсрочивания или обращения прогрессирования патологии, лежащей в основе связанного с возрастом воспалительного расстройства, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ). В некоторых вариантах реализации пациент испытывает ослабление одного или более симптомов болезни Альцгеймера по сравнению с таковыми перед первым введением ИОТ пациенту.

[0123] В другом варианте реализации предложен способ предотвращения начала связанного с возрастом воспалительного расстройства у пациента, у которого подозревают наличие легкого когнитивного нарушения, включающий введение по меньшей мере одного ИОТ нуждающемуся в этом пациенту.

[0124] В некоторых вариантах реализации НИОТ представляет собой абакавир, ламивудин, зидовудин, эмтрицитабин, тенофовира дизопроксилфумарат, тенофовира алафенамид, диданозин, ставудин, априцитабин, аловудин, дексельвуцитабин, амдоксовир, фосалвудин или эльвуцитабин. В других вариантах реализации ИОТ представляет собой абакавир (Зиаген), абакавир/ламивудин (Эпзиком), абакавир/ламивудин/зидовудин (Тризивир), ламивудин/зидовудин (Комбивир), ламивудин (Эпивир), зидовудин (Ретровир), эмтрицитабин/тенофовира дизопроксилфумарат (Трувада), эмтрицитабин (Эмтрива), тенофовира дизопроксилфумарат (Виреад), эмтрицитабин/тенофовира алафенамид (Дескови), диданозин (Видекс), диданозин с пролонгированным высвобождением (Видекс ЕС) или ставудин (Зерит). В другом варианте реализации НИОТ представляет собой ценсавудин.

[0125] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИОТ представляет собой ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (ННИОТ). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один НИОТ представляет собой Эфавиренц (EFV), Невирапин (NVP), Делавирдин (DLV), Этравирин или Рилпивирин.

[0126] В дополнительном варианте реализации ИОТ ингибирует активность обратной транскриптазы L1 в клетке, например, в клетке головного мозга, пациента.

[0127] В случаях, когда ИОТ является одобренным FDA лекарственным средством, ИОТ можно вводить в терапевтически эффективных количествах, которые одобрены для терапевтического применения. В других вариантах реализации эффективные количества можно определить с помощью не более чем проведения обычного эксперимента. Например, эффективные количества могут находиться в диапазоне от приблизительно 1 нг/кг до приблизительно 200 мг/кг, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг. Дозировка композиции может представлять собой любую дозировку, включая, но не ограничиваясь приблизительно 1 мкг/кг.Дозировка композиции может представлять собой любую дозировку, включая, но не ограничиваясь перечисленными: приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 10 мкг/кг, приблизительно 25 мкг/кг, приблизительно 50 мкг/кг, приблизительно 75 мкг/кг, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 125 мкг/кг, приблизительно 150 мкг/кг, приблизительно 175 мкг/кг, приблизительно 200 мкг/кг, приблизительно 225 мкг/кг, приблизительно 250 мкг/кг, приблизительно 275 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 325 мкг/кг, приблизительно 350 мкг/кг, приблизительно 375 мкг/кг, приблизительно 400 мкг/кг, приблизительно 425 мкг/кг, приблизительно 450 мкг/кг, приблизительно 475 мкг/кг, приблизительно 500 мкг/кг, приблизительно 525 мкг/кг, приблизительно 550 мкг/кг, приблизительно 575 мкг/кг, приблизительно 600 мкг/кг, приблизительно 625 мкг/кг, приблизительно 650 мкг/кг, приблизительно 675 мкг/кг, приблизительно 700 мкг/кг, приблизительно 725 мкг/кг, приблизительно 750 мкг/кг, приблизительно 775 мкг/кг, приблизительно 800 мкг/кг, приблизительно 825 мкг/кг, приблизительно 850 мкг/кг, приблизительно 875 мкг/кг, приблизительно 900 мкг/кг, приблизительно 925 мкг/кг, приблизительно 950 мкг/кг, приблизительно 975 мкг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно 90 мг/кг, приблизительно 100 мг/кг, приблизительно 125 мг/кг, приблизительно 150 мг/кг, приблизительно 175 мг/кг, приблизительно 200 мг/кг или более. В других вариантах реализации дозировка составляет 1 мг - 500 мг. В некоторых вариантах реализации дозировка составляет 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мг. Данные дозы могут быть единичными или разделенными и могут вводиться один или более раз в день. Приведенные выше дозировки являются примерами среднего случая, но могут быть индивидуальные случаи, в которых стоит вводить более высокие или более низкие дозировки, и они входят в объем настоящего изобретения. На практике врач определяет терапевтически эффективные количества и фактическую схему введения доз, которая наиболее подходит для отдельного субъекта, которые могут изменяться в зависимости от возраста, массы тела и ответа конкретного субъекта.

[0128] ИОТ можно вводить один, два или три раза в сутки в течение от 1 дня до конца жизни, или в течение от 1 дня до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более лет, или до тех пор, пока ИОТ не вызовет неприемлемые побочные действия или более не будет приносить пользу.

[0129] У пациента отслеживают изменения в симптомах связанного с возрастом воспалительного заболевания. В одном варианте реализации наблюдается уменьшение симптомов. В другом варианте реализации симптомы остаются приблизительно такими же, и нет признаков прогрессирования. По отношению к болезни Альцгеймера, такие симптомы включают потерю памяти, размещение предметов не на тех местах, забывание названий мест или объектов, повторение вопросов, меньшую приспосабливаемость к новым обстоятельствам, замешательство, дезориентацию, обсессивное поведение, компульсивное поведение, бред, афазию, нарушение сна, перепады настроения, депрессию, тревогу, фрустрацию, возбужденное состояние, трудности при выполнении пространственных задач, агнозию, трудности при передвижении, потерю веса, потерю речи, потерю кратковременной памяти или потерю долговременной памяти. Способы для контролирования и измерения любых изменений данных симптомов можно осуществить с помощью стандартных способов или путем проведения обычного эксперимента.

[0130] В одном варианте реализации симптомы легкого когнитивного нарушения и любое изменение в симптомах болезни Альцгеймера определяют, используя критерии, предложенные в DSM-5. В другом варианте реализации симптомы легкого когнитивного нарушения и любое изменение в симптомах болезни Альцгеймера определяют, используя шкалу оценки изменений клиницистом на основании опроса (CIBIC-plus). В другом варианте реализации симптомы легкого когнитивного нарушения и любое изменение в симптомах определяют, используя шкалу оценки изменений клиницистом на основании опроса (CIBIC-plus).

[0131] Любое изменение в симптомах можно отслеживать в течение 1-36 месяцев или более, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 месяцев.

[0132] В другом варианте реализации у пациента отслеживают изменение в лежащей в основе болезни Альцгеймера патологии. В одном варианте реализации наблюдается ослабление первопричинной патологии. В другом варианте реализации первопричинная патология остается приблизительно на том же уровне и не наблюдаются признаки прогрессирования.

[0133] В некоторых вариантах реализации любое изменение в лежащей в основе болезни патологии обнаруживают путем детектирования биомаркера до и после введения ИОТ. В одном варианте реализации биомаркер представляет собой (3-амилоид или белок Tau. В другом варианте реализации биомаркер детектируют с помощью ПЭТ-визуализации. В другом варианте реализации первопричинную патологию идентифицируют путем измерения объема головного мозга до и после введения ИОТ.

[0134] В некоторых вариантах реализации первопричинная патология обращается или задерживается ее проявление на 1-36 месяцев, например, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35 или 36 месяцев после первого введения ИОТ.

[0135] В некоторых вариантах реализации пациенту также вводят по меньшей мере один второй терапевтический агент, полезный для лечения симптомов связанного с возрастом воспалительного расстройства. В одном варианте реализации пациенту вводят по меньшей мере один второй терапевтический агент, полезный для лечения болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой донепезил, галантамин, ривастигмин или мемантин. В другом варианте реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой антитело, которое связывается с β-амилоидом или белком Tau. В другом варианте реализации указанное антитело связывается с β-амилоидом и представляет собой бапинейзумаб. В другом варианте реализации указанное антитело связывается с белком Tau и представляет собой ABBV-8E12. В другом варианте реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой вакцину против β-амилоида или белка Таu. В другом варианте реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой агент, который снижает или изменяет содержание в головном мозге 0-амилоида или Tau. В другом варианте реализации второй терапевтический агент снижает или изменяет содержание в головном мозге βамилоида и представляет собой ингибитор β-секретазы 1 (ВАСЕ). В другом варианте реализации ингибитор ВАСЕ представляет собой CTS-21166, верубецестат (МK-8931), ланабецестат (AZD3293) или LY2886721. В другом варианте реализации второй агент снижает или изменяет содержание в головном мозге β-амилоида или изменяет содержание в головном мозге Tau и представляет собой никотинамид, или MPT0G211.

[0136] Указанный по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно вводить отдельно или совместно в составе единой фармацевтической композиции.

[0137] Если связанное с возрастом воспалительное расстройство представляет собой БАС, то пациенту можно вводить по меньшей мере один второй агент, полезный для лечения симптомов БАС. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй агент представляет собой ингибитор интегразы. В некоторых вариантах реализации ингибитор интегразы представляет собой ралтегравир, куркумин, производные куркумина, цикориевую кислоту, производные цикориевой кислоты, 3,5-дикофеоилхиновую кислоту, производные 3,5-дикофеоилхиновой кислоты, ауринтрикарбоновую кислоту, производные ауринтрикарбоновой кислоты, сложный эфир кофейной кислоты и фенэтилового спирта, производные сложного эфира кофейной кислоты и фенэтилового спирта, тирфостин, производные тирфостина, кверцетин, производные кверцетина, S-1360, зинтевир (AR-177), L-870812, и L-25 870810, МK-0518, BMS-538158 или GSK364735C.⁵²

[0138] У пациента можно отслеживать улучшение симптомов БАС. Такие симптомы включают один или более из следующих симптомов: затруднения при ходьбе или осуществлении нормальных ежедневных активностей, спотыкание и падения, слабость ног, ступней или лодыжек, слабость рук или неуклюжесть, невнятную речь или затруднение при глотании, мышечные судороги, судорожные движения рук, плеч или языка, неадекватный приступ плача, когнитивные изменения и изменения поведения.

[0139] Любое изменение в симптомах можно отслеживать в течение 1-36 месяцев или более, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 месяцев. В некоторых вариантах реализации лежащая в основе патология обращается или задерживатеся ее проявление на 1 - 36 месяцев, например, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 месяцев после первого введения ИОТ.

СОЛИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И НАБОРЫ

[0140] Способы в соответствии с настоящим изобретением можно осуществить путем введения по меньшей мере одного ИОТ в виде чистого соединения или в виде фармацевтической композиции. Введение фармацевтической композиции или чистого соединения ИОТ можно осуществить до или после установления клинического диагноза расстройства, связанного со связанным с возрастом воспалением. Обычно фармацевтические композиции стерильны и не содержат токсичных, канцерогенных или мутагенных соединений, которые будут вызывать нежелательную реакцию при введении.

[0141] Дополнительно предложены наборы, содержащие по меньшей мере один ИОТ и необязательно по меньшей мере один второй терапевтический агент, полезный для лечения или предотвращения расстройства, связанного со связанным с возрастом воспалением, упакованные отдельно или совместно, и вкладыш с инструкциями по применению данных активных агентов. В одном варианте реализации по меньшей мере один ИОТ упакован отдельно вместе с инструкциями по введению вместе с по меньшей мере одним вторым терапевтическим агентом. Указанные по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно вводить одновременно или последовательно, чтобы добиться желательного эффекта. Кроме того, ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно вводить в одной композиции или в двух отдельных композициях.

[0142] Примеры по меньшей мере одного второго терапевтического агента, полезного для лечения болезни Альцгеймера, который может находиться в наборе, включают донепезил, галантамин, ривастигмин и мемантин. Другие необязательные терапевтические агенты, которые могут находиться в наборе, включают антитело, которое связывается с β-амилоидом или белком Tau. В одном варианте реализации указанное антитело связывается с β-амилоидом и представляет собой бапинейзумаб. В другом варианте реализации антитело связывается с Tau и представляет собой ABBV-8E12.

[0143] В другом варианте реализации набор может содержать по меньшей мере один второй терапевтический агент, который представляет собой вакцину против β-амилоида или белка Tau.

[0144] В другом варианте реализации набор может содержать по меньшей мере один второй терапевтический агент, который снижает или изменяет содержание в головном мозге β-амилоида или белка Tau. В некоторых вариантах реализации второй терапевтический агент, который изменяет или снижает содержание в головном мозге β-амилоида, представляет собой ингибитор β-секретазы 1 (ВАСЕ). В некотором варианте реализации ингибитор ВАСЕ представляет собой CTS-21166, верубецестат (МK-8931), ланабецестат (AZD3293) или LY2886721, каждый из которых участвовал в клинических испытаниях для лечения болезни Альцгеймера.

[0145] В другом варианте реализации набор может содержать второй агент, который снижает или изменяет содержание в головном мозге Tau и представляет собой никотинамид, или MPT0G211.

[0146] В некоторых вариантах реализации пациент страдает БАС и набор дополнительно содержит по меньшей мере один второй агент, полезный для лечения БАС. В других вариантах реализации ИОТ упакован отдельно вместе с инструкциями по введению по меньшей мере одного второго терапевтического агента для лечения БАС. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй терапевтический агент для лечения БАС представляет собой эдаравон или рилузол.

[0147] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один второй агент представляет собой ингибитор интегразы. В некоторых вариантах реализации ингибитор интегразы представляет собой ралтегравир, куркумин, производные куркумина, цикориевую кислоту, производные цикориевой кислоты, 3,5-дикофеоилхиновую кислоту, производные 3,5-дикофеоилхиновой кислоты, ауринтрикарбоновую кислоту, производные ауринтрикарбоновой кислоты, сложный эфир кофейной кислоты и фенэтилового спирта, производные сложного эфира кофейной кислоты и фенэтилового спирта, тирфостин, производные тирфостина, кверцетин, производные кверцетина, S-1360, зинтевир (AR-177), L-870812, и L-25 870810, МK-0518, BMS-538158 или GSK364735C.⁵³

[0148] Второй терапевтический агент вводят в количестве, достаточном для оказания им желательного терапевтического действия. Диапазон эффективных дозировок для каждого необязательного терапевтического агента известен в данной области, и необязательный терапевтический агент вводят нуждающемуся в этом индивиду в пределах таких установленных диапазонов.

[0149] В объем настоящего изобретения входит получение и применение солей ИОТ. В данной заявке «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям или цвиттер-ионным формам ИОТ. Соли ИОТ можно получить на последних этапах выделения и очистки соединений или отдельно путем приведения во взаимодействие соединения с подходящей кислотой. Фармацевтически приемлемые соли ИОТ могут представлять собой соли присоединения кислоты, образованные с фармацевтически приемлемыми кислотами. Примеры кислот, которые можно применять для получения фармацевтически приемлемых солей, включают неорганические кислоты, такие как азотная, борная, соляная, бромистоводородная, серная и фосфорная кислоты, и органические кислоты, такие как щавелевая, малеиновая, янтарная и лимонная кислоты. Лишь некоторые из примеров солей ИОТ включают, но не ограничены перечисленными солями: гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, бисульфат, 2-гидроксиэтансульфонат, фосфат, вторичный кислый фосфат, ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, глицеринфосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, формат, сукцинат, фумарат, малеат, аскорбат, изетионат, салицилат, метансульфонат, мезитиленсульфонат, нафтиленсульфонат, никотинат, 2-нафталинсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, трихлорацетат, трифторацетат, фосфат, глутамат, бикарбонат, паратолуолсульфонат, ундеканоат, лактат, цитрат, тартрат, глюконат, метансульфонат, этандисульфонат, бензолсульфонат и пара-толуолсульфонат. Кроме того, доступные аминогруппы, присутствующие в ИОТ, могут быть кватернизированы метил-, этил-, пропил-и бутилхлоридами, бромидами и йодидами; диметил-, диэтил-, дибутил- и диамилсульфатами; децил, лаурил, миристил и стерилхлоридами, бромидами и йодидами; и бензил- и фенэтилбромидами. В свете описанного выше, предполагается, что любое упоминание ИОТ, встречающееся в данной заявке, включает ИОТ, а также его фармацевтически приемлемые соли, гидраты или сольваты.

[0150] В объем настоящего изобретения входит получение и применение сольватов ИОТ. Сольваты обычно значительно не изменяют физиологическую активность или токсичность соединений и, соответственно, могут действовать как фармакологические эквиваленты. Термин «сольват» в данной заявке представляет собой комбинацию, физическое взаимодействие и/или сольватацию соединения согласно настоящему изобретению молекулой растворителя, такой как, например, дисольват, моносольват или гемисольват, где отношение молекулы растворителя к соединению согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 2:1, приблизительно 1:1 или приблизительно 1:2, соответственно. Такое физическое взаимодействие включает различные степени ионных и ковалентных связей, включая водородную связь. В некоторых случаях сольват можно выделить, например, когда одна или более молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Таким образом, в объем термина «сольват» входят как сольваты в жидкой фазе, так и поддающиеся выделению сольваты. ИОТ может присутствовать в виде сольватированных форм с фармацевтически приемлемым растворителем, таким как вода, метанол и этанол, и предполагается, что в объем настоящего изобретения входят как сольватированная, так и несольватированная формы ИОТ. Один тип сольвата представляет собой гидрат. «Гидрат» относится к конкретной подгруппе сольватов, в которой молекула растворителя представляет собой воду. Сольваты обычно могут функционировать как фармакологические эквиваленты. Получение сольватов известно в данной области. См., например, Caira и др. (2004),⁵⁴ в которой описано получение сольватов флуконазола с этилацетатом и водой. Аналогичное получение сольватов, гемисольватов, гидратов и тому подобных описаны у Van Tonder и др. (2004)⁵⁵ и Bingham и др. (2001).⁵⁶ Обычный неограничивающий процесс получения сольвата будет включать растворение по меньшей мере одного ИОТ или по меньшей мере одного второго терапевтического агента в желательном растворителе (органическом, воде или их смеси) при температурах выше 20°С до приблизительно 25°С, затем охлаждение раствора при скорости, достаточной для образования кристаллов, и выделение кристаллов с помощью известных способов, например, фильтрации. Аналитические методики, такие как инфракрасная спектроскопия, можно применять для подтверждения присутствия сольвата в кристалле сольвата.

[0151] По меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент обычно вводят в смеси с фармацевтическим носителем с получением фармацевтической композиции, выбранной с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением составляют обычным способом, применяя один или более физиологически приемлемых носителей, содержащих вспомогательные вещества и/или добавки, которые облегчают обработку по меньшей мере одного ИОТ и по меньшей мере одного второго терапевтического агента.

[0152] Данные фармацевтические композиции можно производить, например, с помощью обычных процессов смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, эмульгирования, инкапсулирования, заключения в оболочку или лиофилизирования. Подходящий состав зависит от выбранного пути введения. Когда терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ИОТ и/или по меньшей мере одного второго терапевтического агента вводят перорально, композиция обычно находится в форме таблетки, капсулы, порошка, раствора или эликсира. При введении в форме таблетки композиция может дополнительно содержать твердый носитель, такой как желатин или адъювант. Таблетка, капсула и порошок содержат от приблизительно 0,01% до приблизительно 95% и предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 50% по меньшей мере одного ИОТ и по меньшей мере одного второго терапевтического агента. При введении в жидкой форме можно добавить жидкий носитель, такой как вода, нефтепродукт или масла животного или растительного происхождения. Жидкая форма композиции может дополнительно содержать физиологический солевой раствор, растворы декстрозы или других сахаридов, или гликоли. При введении в жидкой форме композиция содержит от приблизительно 0,1% до приблизительно 90%, и предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 50%, по массе, по меньшей мере одного ИОТ и по меньшей мере одного второго терапевтического агента.

[0153] Когда терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ИОТ и по меньшей мере одного второго терапевтического агента вводят путем внутривенной, кожной или подкожной инъекции, указанная композиция находится в форме апирогенного приемлемого для парентерального введения водного раствора. Получение таких приемлемых для парентерального введения растворов с соответствующим учетом рН, изотоничности, стабильности и тому подобного, находится в рамках компетенции в данной области. Предпочтительная композиция для внутривенной, кожной или подкожной инъекции обычно содержит изотоническую среду.

[0154] По меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно легко объединить с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Стандартные фармацевтические носители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences.⁵⁷ Такие носители позволяют включать активные агенты в форму таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и тому подобные формы для перорального приема внутрь субъектом, которого лечат. Фармацевтические композиции для перорального применения можно получить путем добавления по меньшей мере одного ИОТ и/или по меньшей мере одного второго терапевтического агента к твердому вспомогательному веществу, необязательно перемалывание полученной в результате этого смеси и обработку смеси гранул, после добавления подходящих добавок, при необходимости, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящие вспомогательные вещества включают, например, наполнители и препараты целлюлозы. При необходимости можно добавить дезинтегрирующие агенты.

[0155] По меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно включить в состав для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композициям можно придавать такие формы как суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средах, и они могут содержать такие агенты для получения лекарственной формы, как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

[0156] Фармацевтические композиции для парентерального введения содержат водные растворы активного агента в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии по меньшей мере одного ИОТ и по меньшей мере одного второго терапевтического агента можно получить в виде подходящих маслянистых суспензий для инъекции. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла или синтетические эфиры жирных кислот.Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии. Необязательно суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений и позволяют получение высоко концентрированных растворов. В качестве альтернативы, композиция в соответствии с настоящим изобретением может находиться в форме порошка для разбавления в подходящей среде, например, стерильной апирогенной воде, перед применением.

[0157] По меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент также можно включить в состав ректальных композиций, таких как суппозитории или микроклизмы с удержанием, например, содержащие обычные основы для суппозиториев. Дополнительно к составам, описанным ранее, по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент также можно включить в состав в виде депо-препарата. Такие составы продолжительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или путем внутримышечной инъекции. Таким образом, например, по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно включить в состав с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменными смолами.

[0158] В частности, по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент можно вводить перорально, буккально или сублингвально в форме таблеток, содержащих вспомогательные вещества, такие как крахмал или лактоза, или в капсулах или капсулах яйцевидной формы, либо отдельно, либо в смеси со вспомогательными веществами, или в форме эликсиров или суспензий, содержащих ароматизирующие или красящие агенты. Такие жидкие препараты можно получить с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как суспендирующие агенты. По меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент также можно вводить путем парентеральной инъекции, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутрикоронарно. Для парентерального введения по меньшей мере один ИОТ и по меньшей мере один второй терапевтический агент обычно применяют в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, соли или моносахариды, такие как маннит или глюкоза, чтобы сделать раствор изотоничным крови.

[0159] Некоторые варианты реализации технологии, описанной в данной заявке, можно определить согласно любому из следующих пронумерованных абзацев:

1. Способ лечения, предотвращения и/или обращения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ) нуждающемуся в этом пациенту, отличающийся тем, что ИОТ включает ценсавудин или эльвуцитабин.

2. Способ согласно абзацу 1, отличающийся тем, что связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, потеря зрения, потеря слуха, дегенеративные заболевания периферической нервной системы, или дисфункция сердечнососудистой системы, лобно-височная деменция (ЛВД), рассеянный склероз (PC), синдром Айкарди-Гутьерес, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), остеоартрит, старение кожи, атеросклероз, вызванные химиотерапией нежелательные явления, нарушение функционирования гематопоэтических стволовых клеток, остеопороз, нарушение физического функционирования и/или фиброз легких, - или у пациента, нуждающегося в заживлении ран или регенерации тканей.

3. Способ согласно абзацу 1, отличающийся тем, что связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера.

4. Способ согласно абзацу 1, отличающийся тем, что связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть БАС.

5. Способ задержки проявления или обращения прогрессирования патологии, лежащей в основе расстройства, вызванного связанным с возрастом воспалением, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ), причем указанный ИОТ включает ценсавудин или эльвуцитабин.

6. Способ согласно абзацу 5, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера или БАС и испытывает ослабление одного или более симптомов болезни Альцгеймера или БАС по сравнению с таковыми перед первым введением пациенту.

7. Способ согласно абзацу 6, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и один или более симптомов включают потерю памяти, размещение предметов не на тех местах, забывание названий мест или объектов, повторение вопросов, меньшую приспосабливаемость к новым обстоятельствам, замешательство, дезориентацию, обсессивное поведение, компульсивное поведение, бред, афазию, нарушение сна, перепады настроения, депрессию, тревогу, фрустрацию, возбужденное состояние, трудности при выполнении пространственных задач, агнозию, трудности при передвижении, потерю веса, потерю речи, потерю кратковременной памяти или потерю долговременной памяти.

8. Способ согласно абзацу 6, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и уменьшение одного или более симптомов оценивают в соответствии с DSM-5.

9. Способ согласно абзацу 6, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют, используя когнитивную субшкалу шкалы оценки тяжести болезни Альцгеймера (ADAS-cog).

10. Способ согласно абзацу 6, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют, используя шкалу оценки изменений клиницистом на основании опроса (CIBIC-plus).

11. Способ согласно абзацу 6, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют, используя шкалу оценки повседневной деятельности (ADL).

12. Способ согласно любому одному из абзацев 6-11, отличающийся тем, что уменьшение симптомов происходит в течение 1-36 месяцев.

13. Способ согласно любому одному из абзацев 6-11, отличающийся тем, что любое изменение в первопричинной патологии обнаруживают путем детектирования биомаркера до и после введения ИОТ.

14. Способ согласно абзацу 13, отличающийся тем, что биомаркер представляет собой β-амилоид или белок Tau.

15. Способ согласно абзацам 13 или 14, отличающийся тем, что биомаркер детектируют с помощью ПЭТ-визуализации.

16. Способ согласно абзацам 13 или 14, отличающийся тем, что биомаркер детектируют путем измерения в спинномозговой жидкости.

17. Способ согласно любому одному из абзацев 6-11, отличающийся тем, что первопричинную патологию идентифицируют путем измерения объема головного мозга до и после введения ИОТ.

18. Способ согласно любому одному из абзацев 6-17, отличающийся тем, что первопричинную патологию обращают или отсрочивают на 1-36 месяцев.

19. Способ предотвращения начала болезни Альцгеймера у пациента, у которого подозревают наличие легкого когнитивного нарушения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ), причем указанный ИОТ включает ценсавудин или эльвуцитабин.

20. Способ согласно любому одному из абзацев 1-19, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера или легким когнитивным нарушением, и дополнительно включающий введение по меньшей мере одного второго терапевтического агента, полезного для лечения симптомов болезни Альцгеймера.

21. Способ согласно абзацу 20, отличающийся тем, что по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой донепезил, галантамин, ривастигмин или мемантин.

22. Способ согласно абзацу 20, отличающийся тем, что по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой антитело, которое связывается с р-амилоидом или белком Tau.

23. Способ согласно абзацу 22, отличающийся тем, что антитело связывается с β-амилоидом и представляет собой бапинейзумаб.

24. Способ согласно абзацу 22, отличающийся тем, что антитело связывается с белком Tau и представляет собой ABBV-8E12.

25. Способ согласно абзацу 20, отличающийся тем, что по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой вакцину против р-амилоида или белка Tau.

26. Способ согласно абзацу 20, отличающийся тем, что по меньшей мере один второй терапевтический агент представляет собой агент, который снижает или изменяет содержание в головном мозге р-амилоида или Tau.

27. Способ согласно абзацу 26, отличающийся тем, что второй терапевтический агент снижает или изменяет содержание в головном мозге β-амилоида и представляет собой ингибитор р-секретазы 1 (ВАСЕ).

28. Способ согласно абзацу 27, отличающийся тем, что ингибитор ВАСЕ представляет собой CTS-21166, верубецестат (МK-8931), ланабецестат (AZD3293) или LY2886721.

29. Способ согласно абзацу 26, отличающийся тем, что второй агент снижает или изменяет содержание в головном мозге Tau и представляет собой никотинамид, или MPT0G211.

30. Способ согласно любому одному из абзацев 1, 2 или 4, отличающийся тем, что пациент страдает БАС, и дополнительно включающий введение по меньшей мере одного второго агента, полезного для лечения БАС.

31. Способ согласно абзацу 30, отличающийся тем, что лекарственное средство, полезное для лечения БАС, представляет собой эдаравон или рилузол.

32. Способ согласно абзацу 30, отличающийся тем, что по меньшей мере один второй агент представляет собой ингибитор интегразы.

33. Способ согласно абзацу 32, отличающийся тем, что ингибитор интегразы представляет собой ралтегравир, куркумин, производные куркумина, цикориевую кислоту, производные цикориевой кислоты, 3,5-дикофеоилхиновую кислоту, производные 3,5-дикофеоилхиновой кислоты, ауринтрикарбоновую кислоту, производные ауринтрикарбоновой кислоты, сложный эфир кофейной кислоты и фенэтилового спирта, производные сложного эфира кофейной кислоты и фенэтилового спирта, тирфостин, производные тирфостина, кверцетин, производные кверцетина, S-1360, зинтевир (AR-177), L-870812, и L-25 870810, МK-0518, BMS-538158 или GSK364735C.

34. Способ согласно любому одному из абзацев 1-33, отличающийся тем, что оценивают наличие у пациента одного или более симптомов или патологии заболевания через 1-36 месяцев после первого введения ИОТ пациенту.

35. Способ согласно любому одному из абзацев 1-34, отличающийся тем, что ИОТ ингибирует активность обратной транскриптазы L1 в клетке пациента.

36. Способ согласно любому одному из абзацев 1-35, отличающийся тем, что ИОТ представляет собой эльвуцитабин.

37. Способ согласно любому одному из абзацев 1-35, отличающийся тем, что ИОТ представляет собой ценсавудин.

38. Способ согласно любому одному из абзацев 1-35, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного второго терапевтического агента пациенту.

39. Способ согласно абзацу 38, отличающийся тем, что пациент страдает болезнью Альцгеймера, и по меньшей мере один второй терапевтический агент полезен для лечения симптомов болезни Альцгеймера.

40. Способ согласно абзацу 38, отличающийся тем, что пациент страдает боковым амиотрофическим склерозом (БАС), и по меньшей мере один второй терапевтический агент полезен для лечения БАС.

ПРИМЕРЫ

[0160] Настоящее изобретение теперь описано в общих чертах, его будет легче понять, ссылаясь на следующие примеры, которые включены в данную заявку исключительно с целью иллюстрирования некоторых аспектов и вариантов реализации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

МЕТОДЫ

Культивирование клеток

[0161] В данном исследовании использовали несколько различных штаммов нормальных фибробластов человека. Клетки LF1 получали из эмбриональной ткани легкого, как было описано.⁵⁸ Данные клетки непрерывно использовались в нашей лаборатории с момента их выделения в 1996 г. Для данного исследования извлекли и использовали исходные образцы, замороженные в 1996 г. и непрерывно хранящиеся в нашей лаборатории. Клетки IMR-90 и WI-38 получили из АТСС. Ни одна из данных линий клеток не перечислена в базе данных Международного комитета по аутентификации клеточных линий (ICLAC). Данные линии нормальных фибробластов культивировали, используя физиологические условия содержания кислорода (92,5% N₂, 5% СО₂, 2,5% О₂), в питательной смеси Хэма F-10 (Thermo Scientific) с 15% фетальной бычьей сывороткой (ФБС, Hyclone). Среду дополнительно дополняли L-глутамином (2 мМ), пенициллином и стрептомицином.⁵⁹ Культуры клеток периодически исследовали на наличие заражения микоплазмой с помощью набора для детектирования микоплазмы MycoAlert® (Lonza).

[0162] Для получения репликативно старых (РеС) клеток, культуры LF1 серийно размножали до прекращения пролиферации. При каждом пассаже после достижения 80% конфлюэнтности клетки трипсинизировали и разбавляли 1:4. Следовательно, каждый пассаж эквивалентен приблизительно двум удвоениям популяции. В культурах ранних пассажей время между пассажами было постоянным и составляло приблизительно 3 дня. По мере приближения культурами к старению время между пассажами постепенно увеличивалось. Интервал в 2-3 недели свидетельствовал о том, что культура находилась на предпоследнем пассаже. В этот момент после достижения 80% конфлюэнтности клетки пересевали при разведении 1:2 и данный момент времени обозначали как последний пассаж (точка А на фиг. 2а). Некоторый рост клеток обычно еще происходит в следующие 2 - 3 недели, но культуры не достигают 80%. В данной схеме эксперимента большинство клеток в культуре входят в состояние старения в течение 3-4-недельного окна, середина которого находится грубо около момента последнего пассажа (серый столбик на фиг. 2а). В точке В (4 недели) культуры трипсинизировали и пересевали, как описано,⁶⁰ чтобы удалить небольшую фракцию сохранившихся клеток с контактным ингибированием. Культуры снова пересевали в точке С (8 недель).

[0163] Вызванного онкогеном старения клеток (ВОС) добивались путем инфицирования пролиферирующих клеток LF1 плазмидой pLenti CMV RasV12 Neo (Addgene, плазмида №22259). Образование лентивирусных частиц и процедура инфицирования описаны ниже. По окончании инфицирования клетки пересевали при 15-20% конфлюэнтности и проводили селекцию с помощью G418 при концентрации 250 мкг/мл, которую постоянно поддерживали до завершения эксперимента. Среду меняли каждые 3 дня до сбора культур в указанные моменты времени. Вызванного стрессом преждевременного старения клеток (ВСПС) добивались путем облучения рентгеновскими лучами в дозе 20 Гр при скорости 87 сГр/мин в одной фракции, применяя источник гамма-излучения цезий-137 (Nordion Gammacell 40). Клетки были конфлюэнтны на 15-20% на момент облучения. Среду заменяли незамедлительно после облучения и с интервалами в 3 дня после этого. Клетки 293Т (Clontech) использовали для упаковки лентивирусных векторов и культивировали их при 37°С в DMEM с 10% ФБС в условиях нормального содержания кислорода (воздух, дополненный 5% СO₂).

Ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ)

[0164] Все ИОТ (ламивудин, 3ТС; зидовудин, AZT; абакавир, ABC; эмтрицитабин, FTC), используемые в данном исследовании, были фармацевтической чистоты (USP) и были получены от Aurobindo Pharma, Хайдарабад, Индия. Для получения тризивира (TZV) его компоненты (ABC, AZT и 3ТС) объединяли в подходящих количествах. Условия содержания мышей

[0165] Мышей C57BL/6J обоих полов получали из колоний пожилых грызунов из Национального института по проблемам старения (NIA)⁶¹ в возрасте 5 и 18 месяцев. Животных в возрасте 5 месяцев умерщвляли после кратковременного (в течение 1 недели) периода акклиматизации, различные ткани собирали, быстро замораживали в LN2 и хранили при -80°С.Животных в возрасте 18 месяцев поселяли до достижения ими желательного возраста. Мышей поселяли в специальный свободный от патогенов сертифицированный Международной ассоциацией по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC) виварий барьерного типа. Клетки, подстилку (подстилка из древесины лиственных пород Sani-chip) и корм (Purina Lab Chow 5010) стерилизовали путем автоклавирования. Корм и воду (также стерилизовали) предоставляли без ограничений. Использовали цикл света/темноты по 12 часов (в 7 утра свет включали, в 7 вечера выключали). Поддерживали температуру 70°F и влажность 50%. Всех животных осматривали ежедневно и взвешивали раз в неделю. В пробном эксперименте три группы по 10 животных в каждой лечили 3ТС, растворенным в питьевой воде (1,5 мг/мл, 2,0 мг/мл, 2,5 мг/мл) непрерывно начиная с 18 месяцев и до умерщвления в 24 месяца. Четвертой (контрольной) группе давали ту же воду без лекарственного средства. Не наблюдали значительного различия в поведении, массе тела или выживаемости между 4 группами в течение всего эксперимента. Один раз во время эксперимента (в возрасте 20 месяцев) у животных однократно брали приблизительно 70 мкл крови из хвостовой вены. Собранную плазму пересылали в Центр клинической фармакологии и аналитической химии CFAR университета Северной Каролины для анализа 3ТС. Для группы 2 мг/мл концентрация 3ТС в плазме в среднем составляла 7,2 мкМ. Данную дозу лекарственного средства выбрали для дальнейших экспериментов, чтобы имитировать терапевтическую дозу против ВИЧ у человека (300 мг в сутки, 5-8 мкМ в плазме).⁶² Для экспериментов, представленных в данном сообщении, животные состаривались внутри лаборатории до достижения ими возраста 26 месяцев. Затем их произвольно распределял на две группы технический специалист, который не был заслеплен в отношении внешнего вида или других особенностях животных. Одну группу лечили в течение 2 недель 2 мг/мл 3ТС в питьевой воде, а другой (контрольной) группе давали ту же воду без лекарственного средства, которую вводили тем же способом. По окончании периода лечения всех животных умерщвляли и собирали из них ткани, как описано выше. Всех животных из обеих групп включили во все последующие эксперименты. Эксперимент проводили в отдельных случаях на самцах и самках животных. Проводили нелетальное облучение всего организма (6 Гр), как описано,⁶³ и образцы тканей держали на сухом льду. ПЦР.

[0166] Для всех экспериментов использовали устройство ABI ViiA 7 (Applied Biosystems). Количественную ПЦР ДНК проводили, применяя систему TaqMan (Applied Biosystems), как описано у Coufal и др. (2009).⁶⁴ 100 пг очищенной геномной ДНК использовали с указанными праймерами (см. таблицу 1). Количественную ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) РНК проводили, применяя систему SYBR Green (Applied Biosystems). Полиаденилированную РНК использовали во всех экспериментах, в которых оценивали транскрипцию элементов L1, и общую РНК использовали для всех других генов. Общую РНК получали, применяя реагент Тризол (Invitrogen). Поли(А)-РНК выделяли из общей РНК, применяя модуль для выделения поли(А)-мРНК с помощью магнитных гранул NEBNext (New England Biolabs). Проводили обратную транскрипцию 1 мкг общей РНК или 10 нг поли(А)-РНКс получением кДНК в 50 мкл реакционной смеси, применяя набор TaqMan (Applied Biosystems). Для того чтобы оценить цепь-специфическую транскрипцию, случайные праймеры в реакции ОТ заменяли на цепь-специфический праймер к целевой РНК. 1 мкл каждой реакционной смеси ОТ использовали в последующих реакциях количественной ПЦР. GAPDH использовали в качестве контроля для нормировки в экспериментах с клетками человека. Среднее арифметическое значение для Gapdh и двух дополнительных контролей (Hsp90 и GusB) использовали для нормировки экспериментов ОТ-кПЦР с тканями мышей, за исключением печени, которую нормировали на Hsp90 и GusB. Для измерения транскрипции L1 образцы поли(А)-РНК тщательно расщепляли свободной от РНКаз ДНКазой (Qiagen) перед синтезом кДНКб. Эффективность расщепления ДНКазой оценивали с применением контролей без использования фермента ОТ.

Разработка праймеров для ПЦР

[0167] Наборы праймеров с 1 по 5 (таблица 1, ампликоны А - Е на фиг. 1b) к L1 человека были разработаны таким образом, чтобы преимущественно амплифицировать элементы подсемейств специфического для человека L1HS и эволюционно недавнего специфического для приматов L1РА(2-6), как описано далее. Во-первых, получали консенсусные последовательности элементов L1HS и L1РА2 - L1РА6 из Repbase (Исследовательский институт генетической информации (Genetic Information Research Institute⁶⁵)). Во-вторых, получали консенсусную последовательность данных шести последовательностей с помощью инструмента для множественного выравнивания последовательностей Clustal Omega.⁶⁶⁶⁷ Затем осуществляли разработку праймеров на общем консенсусе с помощью Primer3 и BLAST, применяя инструмент Primer-BLAST NCBI.^68,69 Пары праймеров к L1 оценивали против их мишеней, применяя инструмент ln-Silico PCR,⁷⁰ на последней сборке генома (hg38) с минимальным идеальным совпадением на 3'-конце каждого праймера, равным 15. Праймеры кОРС2 (набор праймеров 6, ампликон F на фиг.1b) были разработаны Coufal и др. (2009), чтобы они преимущественно нецеливались на L1HS. Праймеры для оценки транскрипции активных элементов L1 мыши (набор праймеров 37, таблица 1) разрабатывали на объединенной консенсусной последовательности семейств L1MdA и L1Tf, полученной из Repbase, и проверяли, как описано выше. Пары праймеров к L1, перекрывающие всю длину данных элементов (наборы праймеров 48-50), были разработаны с применением той же стратегии. Пары праймеров, специфичные к трем активным семействам элементов L1 мыши (наборы праймеров 51-53), были разработаны с использованием полиморфизмов в области 5'-НТО. Анализ с помощью ОТ-кПЦР транскрипции L1 проводили на очищенной поли(А)-РНК, применяя способ SYBR Green. Для всех других (не L1) генов, всякий раз, когда это было возможно, праймеры были отделены по меньшей мере одним интроном в последовательности геномной ДНК (как указано в таблице 1). Праймеры к семействам IFN-альфа человека были разработаны против консенсусной последовательности для всех последовательностей генов IFN-альфа человека (IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21), сгенерированной с помощью инструмента для множественного выравнивания последовательностей Clustal Omega. Все праймеры против мышиных мишеней были разработаны, как описано выше, и представлены в таблице 1. Последовательности праймеров, соответствующие консенсусу для всех генов семейства IFN-альфа мыши, а также гену IFNB1, были получены из публикации Gautier и др.⁷¹ Для измерения относительного числа копий L1 в геноме (клетки человека) использовали мультиплексный способ TaqMan, разработанный Coufal и др. (2009)⁷². Данные праймеры перечислены как набор №6 и набор №7 (с соответствующими зондами VIC и 6FAM) в таблице 1. Иммунопреципитация хроматина

[0168] Все эксперименты СhIР проводили, применяя набор для СhIР с центрифужной колонкой Chromatrap (Porvair). Вкратце, 2×10⁶ клеток перекрестно связывали в культуральных чашках с помощью 1% формальдегида (10 мин, комнатная температура), реакцию гасили глицином, промывали дважды ледяным ФБР (содержащим ингибитор протеаз) и, наконец, соскребали в микроцентрифужную пробирку. Осадки клеток ресуспендировали в 0,4 мл гипотонического буфера и инкубировали в течение 10 мин на льду. Ядра осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,3 мл лизирующего буфера и разрушали ультразвуком, применяя устройство Bioruptor UCD-200 (Diagenode) с установленным импульсом «высокий» (30 сек, а затем 30 сек покой) в течение суммарного времени 10 мин. Экстракты центрифугировали в микроцентрифуге (максимальная скорость, 5 мин, 4°С), чтобы удалить обломки клеток, супернатанты переносили в новые пробирки и хранили при -80°С. Количество экстракта, содержащее 2 мкг ДНК, смешивали с 4 мкг антитела и загружали на твердофазную матрицу с белком A Chromatrap.Иммунокомплексам позволяли сформироваться в течение ночи при 4°С при легком взбалтывании, после чего образцы промывали и элюировали, следуя протоколу производителя. IgG кролика и 1% входной ДНК использовали в качестве контролей. 1 мкл иммунопреципитированной ДНК использовали в каждой реакции количественной ПЦР.

Осаждение BrdU

[0169] Для получения покоящихся клеток пролиферирующие клетки растили до 50% конфлюэнтности, вместо добавления сыворотки в среду использовали 0,1% ФБС и инкубацию продолжали до момента сбора. Покоящияся и старые клетки непрерывно метили в течение двух недель бромдезоксиуридином (BrdU labeling reagent, Thermo Fisher), следуя протоколу производителя для мечения культивируемых клеток. Клетки собирали и подсчитывали: обрабатывали по 5×10⁵ клеток на условие. Геномную ДНК очищали путем экстракции фенолом-хлороформом, обрабатывали РНКазой А, а затем расщепляли, применяя устройство Bioruptor UCD-200 (установленный импульс «низкий», 30 сек включен и 30 сек выключен, всего 10 мин). Пробирки с ДНК инкубировали в термоблоке (100°С) в течение ровно одной минуты, а затем быстро замораживали в жидком азоте. Пробиркам позволяли разморозиться при комнатной температуре и добавляли по 1 мкг очищенного антитела против BrdU (BD Pharmingen, №в каталоге 555627) на пробирку вместе с магнитными гранулами с белком A/G и буфер для разведения для СhIР. Иммунные взвеси инкубировали в течение ночи при 4°С при постоянном вращении. Иммунологически захваченную меченую BrdU ДНК очищали с помощью набора для иммунопреципитации хроматина Magna СhIР™ A/G (Millipore Sigma). Несвязанную ДНК сохраняли в качестве исходной. 1 мкл иммунопреципитированной ДНК использовали в каждой реакции количественной ПЦР. В качестве альтернативы, для обогащения одноцепочечными мечеными BrdU ДНК, опосредованную нагреванием денатурацию опускали и образцы обрабатывали для осаждения BrdU, как описано выше. Затем получали вторую цепь ДНК путем добавления смеси случайных праймеров (Thermo Fisher), буфера для реакции синтеза второй цепи, дНТФ и ДНК-полимеразы I (Pol I, New England Biolabs). Реакционную смесь инкубировали в течение 4 часов при 16°С, а затем очищали путем экстракции фенолом-хлороформом. После синтеза второй цепи дцДНК концы ДНК достраивали с помощью набора End-It DNA End-Repair (Epicenter, №в каталоге ER0720). Фрагменты с тупыми концами клонировали, применяя набор для ПЦР-клонирования Zero Blunt ТОРО (Thermo Fisher), а затем использовали для трансформации химически компетентных Е. coli One Shot ТОР10 (Thermo Fisher, №в каталоге С404010). Отдельные колонии собирали и подвергали секвенированию по Сэнгеру, применяя праймер к промотору Т7, в Beckman Coulter Genomics. Секвенирование РНК (RNA-seq)

[0170] Общую РНК из раннего пассажа, ранних стареющих и глубоко старых клеток (фиг. 6а) экстрагировали, как описано выше. Общую РНК обрабатывали с помощью набора lllumina TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero и проводили секвенирование спаренных концов 2×125 п.о. на HiSeq2500 lllumina, применяя реагенты версии 4, в Beckman Coulter Genomics Inc. Для каждого образца получали свыше 70 миллионов прочтений. Эксперимент по секвенированию РНК проводили в трех биологических повторах.

[0171] Необработанные считывания секвенирования РНК выравнивали со сборкой генома человека GrCh38, применяя HiSat2.⁷³ Количество прочтений, картированных на геном, определяли, применяя feature Counts.⁷⁴ Количество прочтений затем нормировали, применяя способ усеченного среднего М-значений (ТММ), в EdgeR.⁷⁵ EdgeR дополнительно использовали для получения дифференциальной экспрессии по набору нормированных результатов. Результаты дифференциальной экспрессии затем ранжировали по кратности изменения log₂ и вводили в интерфейс GenePattern для GSEA Preranked, используя 1000 пермутаций, чтобы определить обогащение путями KEGG, SASP и ответа интерферона.⁷⁶⁷⁷Результаты затем корректировали на множественные сравнения путем корректировки номинального β-значения с применением способа Беньямини-Хохберга.⁷⁸ Результаты отображали, применяя программное обеспечение GENE-E.⁷⁹Анализ in silico факторов транскрипции, связывающихся с L1

[0172] Спектры факторов транскрипции создавали, используя данные ChlP-seq из проекта ENCODE (номера доступа GEO GSE2961 и GSE32465). Прочтения ChlP-seq факторов транскрипции и контроля входной ДНК выравнивали с консенсусной последовательностью L1 HS, применяя bowtiel.⁸⁰ Рассчитывали кратность изменения 1од2 обогащения на пару оснований консенсусной последовательности L1HS, используя покрытие прочтений ChlP-seq факторов транскрипции на миллион картированных прочтений (RPM) по сравнению со значениями RPM для контроля входной ДНК и сглаживали путем локально взвешенного сглаживания диаграммы рассеяния (LOESS) с параметром α=0,1. Общее количество картированных прочтений, использованных в нормировке RPM, определяли по отдельному выравниванию bowtiel с геномом человека (hg19).

Конструирование репортеров FOXA1

[0173] Репортерные плазмиды промотора L1 - L1WT и L1 del (390-526) - получали от Сергея Дмитриева, Институт биоорганической химии, Москва.⁸¹⁸² Обе содержали люциферазу в качестве репортера, клонированную в смысловой ориентации. Для того чтобы определить антисмысловую транскрипцию стой же плазмиды, вставляли усиленный вариант желтого флуоресцентного белка (EYFP) в обратной ориентации против хода транскрипции от 5'-НТО L1, как описано далее. Последовательность EYFP вырезали из pEYFP-N1 (Clontech, №в каталоге 6006-1) с помощью рестриктаз Agel и Notl и создавали тупые концы. Плазмиды L1WT и L1 del расщепляли рестриктазой Xbal, создавали тупые концы и обрабатывали FastAP (Fermentas). Успешную вставку антисмысловой EYFP проверяли с применением праймеров ПЦР AAAGTTTCTTATGGCCGGGC (в EYFP) и GCTGAACTTGTGGCCGTTTA (в промоторе L1) и секвенирования по Сэнгеру. Плазмиду pcDNA3.1/LacZ использовали в качестве контроля котрансфекции. Эксперименты с люциферазой и β-галактозидазой проводили, как описано.⁸³ EYFP-N1 использовали в качестве положительного контроля для детектирования сигнала EYFP. Котрансфекции проводили на клетках раннего пассажа LF1, применяя липофектамин с реагентом Plus (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Лентивирусные векторы

[0174] Конструкции получали из общедоступных депозитариев, как указано ниже. Получали вирионы и инфицировали клетки-мишени, как описано.⁸⁴ Последовательности кшРНК получали из The RNAi Consortium (TRC),⁸⁵ клонировали в векторы pLKO.1 третьего поколения и исследовали их эффективность. Четыре селектируемых маркера использовали для обеспечения возможности селекции множеством лекарственных средств: pLKO.1 puro (2 мкг/мл) и pLKO.1 hygro (200 мкг/мл) (Addgene, плазмида №8453, 24150), pLKO.1 blast (5 мкг/мл) (Addgene, плазмида №26655), pLKO.1 neo (250 мкг/мл) (Addgene, плазмида 13425). pLKO-RB1-shRNA63 и pLKO-RB1-shRNA19 (Addgene, плазмиды # 25641 и 25640).⁸⁶ Для FOXA1 использовали кшРНК TRCN0000014881 (а) и TRCN0000014882 (b). Для TREX1 использовали кшРНК TRCN0000007902 (а) и TRCN0000011206 (b). Для нокдауна L1 были разработаны и исследованы девять кшРНК, из которых для двух (shl_1_11 к ОРС1, AAGACACATGCACACGТATGТ и shl_1_44 к ОРС2 AAGACACATGCACACGTATGT) выявили значительный нокдаун (фиг. 10g), и они были выбраны для дальнейшей работы. Остальные семь кшРНК не вызывали или вызывали минимальный нокдаун. Для cGAS использовали кшРНК TRCN0000128706 (а) и TRCN0000128310 (b). Для STING использовали кшРНК TRCN0000161345 (а) и TRCN0000135555 (b).

[0175] Во всех экспериментах по эктопической экспрессии использовали конструкции, полученные в ORFeome Collaboration⁸⁷ в лентивирусном векторе pl_X304 (устойчивом к бластицидину, Addgene, плазмида 25890), и их получали из депозитария плазмид DNASU.⁸⁸ RB1 (ccsbBroad304_06846, HsCD00434323), TREX1 (ccsbBroad304_02667, HsCD00445909), FOXA1 (ccsbBroad304_06385, HsCD00441689).

[0176] Все вмешательства в старые клетки начинали путем инфицирования клеток в 12 недель старения (точка D на фиг. 6а). После селекции подходящими лекарственными средствами клетки инкубировали до 16 недель старения (точка Е на фиг. 6а), а затем собирали для дальнейшего анализа.

[0177] Вмешательство 3Х проводили путем инфицирования клеток раннего пассажа LF1 последовательно векторами pLKO.1 puro shRB, pLKO.1 hygro shTREXI и pLX304 blast FOXA1 (фиг. 10c). После каждой инфекции нарастающий устойчивый к лекарственному средству пул клеток незамедлительно инфицировали следующим вектором. После третьей инфекции клетки собирали для дальнейшего анализа через 48 часов после завершения селекции лекарственным средством. Инфицирования также осуществляли в различных комбинациях, и в каждом случае они приводили к активации экспрессии L1, началу старения клеток и индукции ответа IFN-I. Указанную выше последовательность выбирали, так как она приводила к наиболее эффективной селекции клеток для дальнейшего анализа. Для того чтобы обеспечить возможность дополнительного (четвертого) вмешательства в клетки 3Х (shL1, shSTING или shCGAS), шпильки, нацеленные на RB1, переклонировали в pLKO.1 пео, таким образом, высвобождая pLKO.1 puro для четвертого интересующего гена. Это позволяло эффективно осуществить процесс селекции лекарственным средством и собрать образец через 48 часов после последней селекции. Репортеры ретротранспозиции

[0178] Двухвекторную репортерную систему с двойной люциферазой, описанную Xie и др. (2011),⁸⁹ приспосабливали для лентивирусной доставки. Репортеры L1RP-Fluc переклонировали из плазмид pWA355 и pWA366 в лентивирусный каркас pLX304. pWA355 содержала функциональный активный элемент L1rp, тогда как pWA366 содержала мутированный элемент L1 RP(JM111), несущий две миссенс-мутации в ОРС1, который неспособен к ретротранспозиции. Клетки раннего пассажа LF1 инфицировали Rluc, экспрессирующей лентивирус и ген устойчивости к пуромицину. Объединенные устойчивые к лекарственному средству клетки затем инфицировали высоким титром частиц с конструкциями pLX304-WA355 или pLX304-WA366. Незамедлительно после инфицирования клетки обрабатывали в течение четырех дней 3ТС (при указанных концентрациях). Клетки затем собирали и анализировали в них активности люцифераз Rluc и Flue. Клетки HeLa котрансфицировали репортером ретротранспозиции нативного L1 pLD143⁹⁰ с векторами pLKO (shLuc, shL1_11 и shL1_44), применяя FuGene HD (Promega). Культивирование клеток, трансфекцию и анализ ретротранспозиции проводили, как описано выше. Активность ретротранспозиции нормировали на активность L1rp, котрансфицированного с shLuc. Проводили по три независимых эксперимента для каждой конструкции.

Идентификация экспрессированных элементов L1 с помощью ОТ-ПЦР длинных фрагментов и 5'RACE

[0179] Общую РНК собирали из клеток, применяя реагент Тризол (Invitrogen). Полученную РНК дополнительно очищали, применяя набор Purelink RNA Mini (Invitrogen), с расщеплением ДНКазой I. Из элюированной общей РНК выделяли поли(А)-РНК, применяя модуль для выделения поли(А)-мРНК с помощью магнитных гранул NEBNext (New England Biolabs). Прямой праймер (MDL15UTRPRAF, набор праймеров 1, таблица 1) применяли с любым из двух обратных праймеров (MDL15UTRPRCR, набор праймеров 3, размер ампликона 537 п. о., или MDL15UTRPRDR, набор праймеров 4, размер ампликона 654 и.о.). Применяли высокоточную термостабильную обратную транскриптазу (набор PyroScript RT-PCR Master Mix, Lucigen) с 10 нг поли(А)-мРНК на реакцию и амплифицировали в течение 10 циклов. В качестве отрицательных контролей использовали реакционную смесь без матрицы и обработанные РНКазой А образцы. Полученные ампликоны клонировали в вектор ТОРО-ТА (Invitrogen) и полученные в результате этого плазмиды использовали для трансформации химически компетентных Е. coli One Shot ТОР10. Отдельные колонии собирали и проводили секвенирование по Сэнгеру, применяя праймер для секвенирования к промотору Т7, в Beckman Coulter Genomics. 96 реакций секвенирования (1 планшет) проводили для каждой пары праймеров в четырех экспериментах, суммарно 768 секвенированных клонов. Из результатов секвенирования удаляли праймеры ОТ-ПЦР, и выравнивали их с геномом человека (GRCh38) с помощью BLAST с ценой совпадения/несовпадения +1, -4, позволяя видоспецифические повторы для Homo sapiens. Оценивали только идеальные совпадения и аннотировали их геномные координаты. 658 клонов можно было картировать на эталонном геноме, 51 содержали по меньшей мере 1 несовпадение и, следовательно, вероятно представляли собой элементы, которые были полиморфны в линии клеток, и 58 были артефактами клонирования. Если клон был представлен во множестве случаев идеальной идентичности, то использовали фракционное количество путем деления подсчитанного количества на количество элементов с такой же последовательностью. Каждый картированный клон дополнительно анализировали, применяя LIXplorer,⁹¹ чтобы выявить особенности классификации элемента L1 и интактный он или нет.

[0180] В качестве альтернативы, поли (А)-РНК, выделенную как описано выше, подвергали быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Каждая реакционная смесь содержала 10 нг поли(А)-РНК, и ее обрабатывали, применяя набор 5'RACE System (Thermo Fisher, №в каталоге 18374-041). Два антисмысловых ген-специфичных праймера (GSP), используемых для 5'RACE, перечислены далее: в качестве GSP1 - MDL15UTRPRDR (набор праймеров 4, таблица 1), и в качестве гнездового GSP2 - MDL15UTRPRCR (набор праймеров 3, таблица 1). Продукты амплификации клонировали и секвенировали, как описано выше, применяя праймер для секвенирования к промотору Т7, в Beckman Coulter Genomics. Всего секвенировали 94 клона: 26 содержали, главным образом, участок nonn(G), образованный на этапе создания хвоста в протоколе RACE, и 18 невозможно было картировать на геном человека. Остальные 50 картированных клонов содержали последовательности L1, и их выравнивали с консенсусной последовательностью L1HS, используя установку >95% идентичности в положениях 1-450.⁹² Картированные клоны также приписывали отдельным семействам L1, применяя программное обеспечение RepEnrich.⁹³ Попарные выравнивания с консенсусом проводили с помощью LALIGN.⁹⁴Множественные выравнивания последовательностей рассчитывали, применяя MAFFT (множественное выравнивание с применением быстрого преобразования Фурье) с алгоритмом L-INS-i (точный для выравнивания <200 последовательностей).⁹⁵Визуализацию выравнивания, расцвечивание % идентичности и консенсус получали с помощью Jalview.⁹⁶

Создание и анализ нокаутов CRISPR-Cas9

[0181] Исследовали три различные последовательности нРНК для каждой цепи рецептора IFNAR (IFNAR1 и IFNAR2), перечисленные в ресурсе GeCKO версии 2.0 (Feng Zhang Lab, MIT⁹⁷)⁹⁸, и выбрали следующие: IFNAR1 (HGLibA_29983) AACAGGAGCGATGAGTCTGTA; IFNAR2 (HGLibA_29985) GTGTATATCAGCCTCGTGTT. Cas9 и нРНК доставляли, используя один лентивирусный вектор (LentiCRISPR_v2, Feng Zhang Lab, MIT; Addgene, плазмида №52961), несущий ген устойчивости к пуромицину. Эффективность мутагенеза CRISPR-Cas9, на основании которой выбрали указанные выше две нРНК, оценивали с помощью обработки инфицированных и прошедших селекцию лекарственным средством клеток интерфероном (универсальный интерферон I типа, PBL Анализ Science, № в каталоге 11200-1) и отслеживания транслокации в ядро фосфо-SТАТ2 и IRF9 с помощью иммунофлуоресценции. Отсутствие транслокации означало отсутствие ответа IFN-I и, следовательно, утрату функции IFNAR. Экспериментальные процедуры проводили, следуя протоколам, предоставленным Zhang lab.^99,100 В эксперименте, показанном на фиг. 3h (РеС) и фиг. 10k, использовали обе нРНК IFNAR1 и IFNAR2 для обработки одних и тех же клеток, чтобы дополнительно повысить эффективность нарушения ответа INF-I. Для клеток раннего пассажа и старых клеток осуществляли коинфицирование векторами IFNAR1 и IFNAR2, а затем селекцию пуромицином. Для старых клеток, высоким титром лентивирусных частиц обрабатывали старые клетки в 12 недель старения клеток (точка D, фиг.6а), и клетки анализировали через 4 недели (точка Е, фиг.6а). Для эксперимента, показанного на фиг.3h (ВСПС), редактированные клетки раннего пассажа клонировали путем клонирования потомства одной клетки. 24 отдельные клетки выделяли, применяя технологию CellRaft (Cell Microsystems), и размножали. Геномный скрининг сайтов разрезания CRISPR проводили с помощью CRISPR Sequencing Service (CCIB DNA Core, Больница общего профиля Массачусетса).¹⁰¹ Успешный нокаут IFNAR1 и IFNAR2 подтвердили в четырех из 24 размноженных клональных линий клеток. Иммуно блоттинг

[0182] Клетки собирали в буфер для образца Лэммли (60 мМ Трис, рН 6,8, 2% ДСН, 10% глицерин, 100 мМ ДТТ) и кипятили в течение 5 мин при 100°С. Экстракты цельных клеток (60 мкг белка) разделяли с помощью ЭФ в ПААГ/ДСН и переносили на мембраны Immobilon-FL (Millipore). Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации в 4% бычьем сывороточном альбумине (БСА; Thermo Fisher) и 0,1% твин-20 на ФБР в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичные антитела разбавляли в блокирующем растворе и инкубировали в течение ночи при 4°С.П еречень всех первичных антител представлен в таблице 2. Вторичные антитела разбавляли в блокирующем растворе и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Сигналы детектировали, применяя систему визуализации в инфракрасном диапазоне LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences). Для количественного анализа сигналов все образцы, которые необходимо было сравнить, разделяли на одном геле. Стандарты загрузки визуализировали на том же блоте, что и тестируемые образцы, применяя 2-цветную систему LI-COR. Полосы визуализировали и осуществляли количественный анализ, применяя программное обеспечение LI-COR. Количественный анализ всех полос, которые необходимо было сравнить, проводили на одном изображении, и сигналы полос находились в пределах линейного диапазона детектирования устройством.

Иммунофлуоресцентная микроскопия, проведенная на клетках в культуре

[0183] Клетки растили на покровных стеклах и образцы обрабатывали, как описано ранее.¹⁰² Первичные антитела приведены в таблице 2. Окрашивание оцДНК проводили, как описано у Thomas и др.¹⁰³ Вкратце, клетки, высеянные на покровные стекла, фиксировали на льду с помощью 4% параформальдегида (ПФА) в течение 20 мин, а затем инкубировали в 100% метаноле при -20 С в течение ночи. Клетки затем обрабатывали 200 мг/мл РНКазы А при 37°С в течение 4 часов. Клетки блокировали 3% БСА и инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами, разбавленными в 3% БСА. Изображения получали, применяя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 710 Zeiss или инвертированный флуоресцентный микроскоп Ti-S Nikon. Все настройки микроскопа были установлены для сбора изображений ниже насыщения, и их сохраняли постоянными для всех полученных изображений в одном эксперименте, как описано ранее.¹⁰⁴ Анализ изображений проводили, как описано ниже для тканей. Панели для ПЦР

[0184] Общую РНК собирали из клеток, как указано выше (количественная ПЦР) и анализировали, применяя панель для проведения ПЦР RT² Profiler™ Human Type I Interferon Response от Qiagen (№в каталоге PAHS-016ZE-4). Реакции обратной транскрипции проводили с помощью набора Qiagen RT² First Strand (№в каталоге 330404), используя 1 мкг общей РНК в качестве исходного материала. В 102 мкл смеси с завершенной реакцией добавляли 650 мкл общей смеси Qiagen RT² SYBR Green ROX qPCR Mastermix (№ в каталоге 330521) и 548 мкл свободной от РНКаз воды, чистой для молекулярного анализа, и анализировали в 384-луночном блоке на устройстве ViiA 7 Applied Biosystems. При всех процедурах следовали протоколам производителя. Все условия анализировали в трех повторах. Результаты анализировали, используя GeneGlobe Data Analysis Center от Qiagen.¹⁰⁵ Вкратце, значения C_t нормировали по панели генов домашнего хозяйства (HKG). Значения ΔC_t рассчитывали между значением для интересующего гена (GOI) и средним значением для HKG. Кратность изменения затем рассчитывали, применяя формулу 2 ^-ΔΔСТ. Нижний предел детектирования устанавливали на C_t, равный 35. Для любого GOI, чтобы считать значение значимым, устанавливали следующие фильтры: (i) изменение в экспрессии >в 2 раза; и (ii) р-значение >0,05. Кроме того, гены со средним C_t>32 как в контрольном, так и в тестируемых образцах, также удаляли. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)

[0185] Проводили количественный анализ уровней интерферона (3 с помощью набора для анализа ELISA сыворотки VeriKine-HS Human Interferon Beta Serum (PBL Assay Science, №в каталоге 41415). Культуральные среды кондиционировали в течение 48 часов перед сбором. Для удаления частиц и обломков аликвоты по 1 мл центрифугировали 5 мин при 5000 х д. Все инкубации проводили в закрытой камере при комнатной температуре (22-25°С), стараясь избежать колебаний температуры. 50 мкл буфера для образца, а затем 50 мкл раствора разбавленного антитела добавляли в каждую лунку. Наконец, добавляли по 50 мкл на лунку тестируемых образцов, стандартов или пустых контролей. Планшеты запечатывали и встряхивали при 450 об/мин в течение 2 часов. По окончании периода инкубации содержимое планшета удаляли и лунки промывали три раза 300 мкл разбавленного раствора для промывки. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора HRP и инкубировали в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Лунки опорожняли и промывали четыре раза раствором для промывки. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора субстрата ТМВ. Планшеты инкубировали в темноте в течение 30 мин. Наконец, в каждую лунку добавляли по 100 мкл останавливающего реакцию раствора и в течение 5 мин регистрировали поглощение на 450 нм. Значения, зарегистрированные для пустых контролей, вычитали из значений для стандартов, а также для образцов, чтобы убрать фон. Единицы оптической плотности (ОП) наносили на график, используя 4-параметрическую аппроксимацию стандартной кривой, и использовали для расчета титров интерферона в образцах.

Образцы тканей человека

[0186] Образцы кожи человека собирали в ходе исследования Leiden Longevity Study,¹⁰⁶¹⁰⁷ и они были предоставлены Медицинским центром Лейденского университета, Нидерланды. Получали информированное согласие, и все протоколы были одобрены этическим комитетом Медицинского центра Лейденского университета. Образцы собирали в виде биоптатов толщиной 4 мм, полученных путем щипковой биопсии на всю толщину, заливали средой для получения срезов при оптимальной температуре (ОСТ), быстро замораживали и хранили при -80°С. Исследователи были заслеплены в отношении всего, кроме возраста и пола субъектов. Из залитых ОСТ образцов получали криосрезы толщиной 8 мкм, применяя криомикротом Leica CM3050S. Стекла фиксировали 4% ПФА и 0,5% тритоном Х-100 на ФБР (предварительно нагретым до 37°С) в течение 20 мин при комнатной температуре. Не проводили дополнительную пермеабилизацию. Инкубации с антителом предшествовал этап блокирования 4% бычьим сывороточным альбумином (БСА; фракция V, Thermo Fisher), 2% сывороткой осла, 2% сывороткой кролика и 0,1% тритоном Х-100 на ФБР в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела разбавляли в описанном выше блокирующем растворе (1:200) и инкубировали в течение ночи при 4°С на качалке во влажной камере. Вторичные антитела (меченые AlexaFluor 546 и AlexaFluor 647, Life Technologies) также разбавляли в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. По три 15 мин этапа промывки в ФБР, содержащем 0,2% тритон Х-100, следовало после каждой инкубации с антителом. Осуществляли контрастное окрашивание ядер с помощью 2 мкг/мл DAPI на ФБР, содержащем 0,2% тритон Х-100, в течение 15 мин. Окрашенные стекла заключали в ProLong Antifade Mountant без DAPI (Life Technologies) и визуализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710. Для каждого поля получали серию срезов по оси z, охватывающих всю толщину ткани. Все установочные параметры микроскопа и время экспозиции устанавливали таким образом, чтобы получить изображения ниже насыщения, и держали постоянными для всех изображений, полученных в рамках одного эксперимента. Анализ изображений проводили, применяя либо программное обеспечение CellProfiler,¹⁰⁸ либо открытое программное обеспечение ImageJ от NIH.¹⁰⁹ Ядра определяли, используя канал DAPI. Контуры клеток определяли путем радиального расширения маски для ядер, используя функцию Propagate, до тех пор, пока не был достигнут порог интенсивности в каналах AlexaFluor 546 и AlexaFluor 647. Интенсивность флуоресценции внутри данных областей затем регистрировали в обоих каналах. Для каждого образца регистрировали всего 200 ядер во множестве полей зрения. Срезы тканей мыши обрабатывали и анализировали таким же образом, как описано выше. Образцы тканей мыши

[0187] Общую РНК экстрагировали из 50 мг висцеральной жировой ткани, ткани тонкого кишечника, ткани скелетных мышц, бурой жировой ткани или ткани печени путем измельчения, а затем гомогенизации в тризоле (Invitrogen) с применением гомогенизатора Power Gen 125 (Fischer Scientific). После разделения фаз РНК в водном слое очищали, применяя набор для выделения РНК Purelink RNA Mini (Invitrogen) с расщеплением ДНКазой I. Чтобы оценить экспрессию генов с помощью ОТ-кПЦР, осуществляли обратную транскрипцию 1 мкг общей РНК, как описано выше. В каждом отдельном эксперименте все образцы обрабатывали параллельно и без заслепления.

[0188] Визуализацию тотального препарата белой жировой ткани осуществляли, следуя способу, описанному у и др. (2014).¹¹⁰ Вкратце, белую жировую ткань (висцеральные отложения) разделяли на кусочки 0,5-1 см³ и инкубировали в 10 мл свежего фиксирующего буфера (1% ПФА на ФБР, рН 7,4) в течение 30 мин при комнатной температуре при легком покачивании. После трех этапов промывки с помощью ФБР, тканевые блоки разрезали на шесть равных кусочков. Все последующие инкубации проводили в цилиндрических микроцентрифужных пробирках емкостью 2 мл. Перед инкубацией с первичным антителом проводили этап блокирования с помощью 5% БСА, 0,1% сапонина на ФБР в течение 30 мин при комнатной температуре. Первичные антитела разбавляли в описанном выше блокирующем растворе (1:200) и инкубировали в течение ночи при 4°°С при легком покачивании. Вторичные антитела (окрашенные AlexaFluor 546, AlexaFluor 594 и AlexaFluor 647, Life Technologies) также разбавляли в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. По три 10 мин этапа промывки в ФБР следовало после каждой инкубации с антителом. Антитело-независимое окрашивание ядер и липидов проводили после иммунологического окрашивания: DAPI и BODIPY (Thermo Fisher) разбавляли в ФБР с 5% БСА и инкубировали с образцами тканей в течение 20 мин с последующими тремя этапами промывки, как описано выше. Окрашенные образцы аккуратно помещали на оптимизированные для конфокальной визуализации предметные стекла с лунками из боросиликатного стекла №1,5. Маленькая капля ФБР предотвращала высыхание. Полученные изображения анализировали, как описано выше.

[0189] Одновременное окрашивание активности SA-β-Gal и белка ОРС1 в срезах печени осуществляли путем окрашивания сначала SA-β-Gal, как описано.¹¹¹ Затем образцы подвергали тепловому демаскированию эпитопов путем обработки паром в течение 20 мин в буфере для демаскирования антигена (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,05% твин 20, рН 9,0). Образцы затем обрабатывали для иммунофлуоресцентного окрашивания, как описано выше («Образцы тканей человека»).

[0190] Получали криосрезы ткани почки, сохраненной в ОСТ, обрабатывали в течение 10 мин 0,5% (масса/объем) перйодной кислотой, затем окрашивали реагентом Шифф-йодной кислотой (Fisher Scientific, №в каталоге SS32-500) в течение 10 мин. Окрашенные срезы ткани заключали в Shandon Aqua Mount (Fisher Scientific, №в каталоге 14-390-5), а затем визуализировали путем освещения методом светлого поля. Гломерулосклероз оценивали, как описано.¹¹² Вкратце, 40 клубочков на животное оценивали заслепленным образом и распределяли баллы от 1 до 4: балл 1 -<25% склероза; 2 - 25 - 50% склероза; 3 - 50 - 75% склероза; 4 ->75% склероза. Свойством, применяемым для оценки склероза, была интенсивность и глубина проникновения окрашивания в ШИК-положительные повреждения внутри клубочков. На фиг. 4е приведен пример склерозированного клубочка, который выглядит более сморщенным и окрашивается ШИК более интенсивно.

[0191] Четырехглавые мышцы заливали ОСТ, делали срезы толщиной 12 мкм и заключали в гистологическую среду на положительно заряженных стеклах. Срезы окрашивали Н&Е (гематоксилин, 3 мин, а затем эозин, 30 сек). Залитые стекла визуализировали с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200М, оборудованного камерой для цветной съемки Zeiss MRC5. Для измерения диаметра мышечного волокна измеряли наименьшее расстояние поперек ~100 мышечных волокон на животное, применяя программное обеспечение ImageJ, как описано.¹¹³ Критерий Колмогорова-Смирнова использовали для оценки статистической значимости различий между полученными распределениями. Статистическая обработка

[0192] Excel использовали для проведения общего статистического анализа (средние значения, CO., t-критерии и т.д.) Программное обеспечение R для статистических вычислений (64-битная версия 3.3.2) использовали для однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием множественных сравнений Тьюки. Для согласованности сравнений значимость на всех фигурах обозначена, как описано далее: *Р<0,05, **Р<0,01. Размеры выборок выбирали на основании предшествующего опыта и ранее опубликованных экспериментов, в которых наблюдали различия. Не использовали статистический тест, чтобы заранее определить размер выборки. Ни один образец не был исключен. Все попытки репликации были успешными. Не было находок, которые бы не повторялись или были бы не воспроизводимы. Природа и количества анализируемых образцов (обозначенные n) в каждом эксперименте перечислены на подписях к фигурам.

Количество независимых экспериментов также перечислено на подписях к фигурам. При количественном анализе результатов измерения иммунофлуоресценции исследователи были заслеплены. Поля зрения или срезы тканей для количественного анализа выбирали произвольно и оценивали, применяя способы, указанные для отдельных экспериментов. При оценке гломерулосклероза и диаметра мышечных волокон исследователи были также заслеплены. Для экспериментов по секвенированию РНК и экспериментов с панелями ПЦР статистическая обработка описана внизу указанных разделов (выше).

Пример 1 Активация L1 и интерферона при старении клеток

[0193] Активность RTE может вызывать аберрантную транскрипцию, альтернативный сплайсинг, инсерционный мутагенез, повреждение ДНК и нестабильность генома.¹¹⁴ Происходящие из RTE последовательности составляют две трети генома человека,¹¹⁵ хотя значительное большинство были активны миллионы лет назад и более не интактны. Единственным RTE человека, способным к автономной ретротранспозиции, является длинный диспергированный элемент-1 (LINE-1, или L1). Тем не менее, генеративная активность L1 является основным источником структурного полиморфизма у человека.¹¹⁶ Все больше фактов указывает на активацию RTE в некоторых типах рака, в головном мозге взрослого и в процессе старения.^117,118 ^119,120 Механизмы клеточной защиты включают гетерохроматинизацию данных элементов, пути малых РНК, которые нацелены на указанные транскрипты, и механизмы противовирусного врожденного иммунитета.¹²¹Соматическая активация RTE с возрастом консервативна у дрожжей и Drosophila, и снижение активности RTE оказывает полезное действие.¹²²

[0194] На фиг. 1а и фиг. 6а-е показано, что транскрипция L1 активировалась экспоненциально в процессе репликативного старения (РеС) фибробластов человека, возрастая в 4-5 раз к 16 неделям после прекращения пролиферации, что называли поздним старением клеток. Множество праймеров для ОТ-кПЦР были разработаны, чтобы детектировать эволюционно недавние элементы L1 (L1HS - L1PA5; фиг. 1b, фиг. 6h). Уровни поли(А)+РНК L1 возрастали в 4-5 раз в клетках на стадии позднего старения (РеС) в смысловом, но не в антисмысловом направлении на протяжении всего элемента (фиг. 1с). Ампликоны, полученные в результате ОТ-ПЦР длинных фрагментов (фиг. 1b), секвенировали по Сэнгеру, выявив 224 элемента, диспергированных по всему геному; одна треть (75, 33,5%) представляла собой L1HS, из которых 19 (25,3%, 8,5% от общего количества) были интактными (т.е., аннотированными как не содержащие инактивирующих ОРС мутаций; фиг. 6f, g). Также проводили 5'RACE с теми же праймерами и обнаружили, что большая часть транскриптов L1 с повышенной экспрессией в старых клетках инициировалась внутри или рядом с 5-НТО (фиг. 7).

[0195] Элементы L1 могут стимулировать ответ IFN-I.¹²³ На фиг. 1d и фиг. 6i показано, что интерфероны IFN-α и IFN-β1 индуцировались до высоких уровней в клетках на стадии позднего старения. Старение клеток проходит через раннюю фазу ответа на повреждение ДНК, за которой следует ответ SASP.¹²⁴ В полученных результатах в данной заявке задокументирована третья и еще более поздняя фаза, характеризуемая повышением экспрессии L1 и ответа IFN-I (фиг. 1е), которая ранее не была описана, вероятно, потому что в большинстве исследований сосредотачивались на более ранних моментах времени. Анализ полного транскриптома RNA-seq подтвердил, что SASP и ответы IFN-I разделены во времени (фиг. 8). Позднюю фазу активации L1 и индукции IFN-I также наблюдали при вызванном онкогеном старении клеток (ВОС) и вызванном стрессом преждевременном старении клеток (ВСПС) (фиг. 1е, фиг. 1j, k).

Пример 2 Механизмы активации L1

[0196] Для того чтобы исследовать, как механизм надзора не справляется в процессе старения клеток, исследовали три фактора: TREX1, RB1 и FOXA1. TREX1 представляет собой 3'-экзонуклеазу, которая разрушает чужеродные вторгающиеся ДНК, и его утрата была ассоциирована с накоплением цитоплазматической кДНК L1,¹²⁵ На фиг. 9а показано, что экспрессия TREX1 значительно снижалась в старых клетках. Было показано, что RB1 связывается с повторяющимися элементами, включая L1, и вызывает их гетерохроматинизацию.¹²⁶ На фиг. 2а показано, что экспрессия RB1 сильно снижалась в старых клетках (РеС); тогда как экспрессия других представителей семейства RB (RBL1, RBL2) не изменялась (фиг. 9b). Обогащение RB1 5'-НТО элементов L1 было видно в пролиферирующих клетках, снижалось при раннем старении клеток и становилось недетектируемым в более позднее время (фиг. 2а). Это совпадало с уменьшением количества меток H3K9me3 и Н3K27me3 в данных областях (фиг. 9с).

[0197] Для того чтобы определить новые факторы, которые взаимодействуют с 5'-НТО L1, мы исследовали базу данных ENCODE ChlP-seq и обнаружили, что ведущий фактор транскрипции FOXA1 связывается с данной областью в нескольких линиях клеток (фиг. 9d). Экспрессия FOXA1 повышена в старых клетках.¹²⁷ На фиг. 2b показано, что FOXA1 связан с центральной областью 5'-НТО L1. Используя репортеры транскрипции, мы обнаружили, что делеция сайта связывания FOXA1 снижала как смысловую, так и антисмысловую транскрипцию с 5-НТО L1¹²⁸ (фиг. 9е). Следовательно, наблюдаемая неправильная регуляция данных трех факторов в старых клетках может вызывать активацию L1 посредством трех дополнительных механизмов: утрата RB1 в результате снижения репрессии гетерохроматина, повышение уровней FOXA1 в результате активации промотора L1 и утрата TREX1 в результате нарушения удаления кДНК L1.

[0198] Следовательно, влияние воздействия на экспрессию RB1, FOXA1 или TREX1 в полностью старых клетках исследовали, применяя лентивирусные векторы (фиг. 10а, b). Эктопическая экспрессия RB1 подавляла повышенную экспрессию L1, IFN-α и IFN-β1 в старых клетках, тогда как его нокдаун дополнительно увеличивал их экспрессию (фиг. 2d). Сверхэкспрессия RB1 также восстанавливала его присутствие в 5'-НТО L1 (фиг. 2с). И наоборот, нокдаун FOXA1 уменьшал его связывание с 5'-НТО L1 (фиг. 9f) и снижал экспрессию L1, IFN-α и IFN-β1, тогда как сверхэкспрессия FOXA1 повышала уровни L1, IFN-α и IFN-β1 (фиг.2е). Соответствующие результаты также получили путем воздействия на TREX1 (фиг. 2g). Следовательно, каждый изданных факторов оказывал значимый эффект на регуляцию L1 и ответа IFN-I в старых клетках.

[0199] Одиночные или двойные вмешательства, нацеленные на данные факторы, вызывали лишь небольшие изменения экспрессии L1 и IFN-I в растущих клетках раннего пассажа. Хотя некоторые из данных эффектов были статистически значимыми, их затмевало тройное вмешательство (3Х) путем комбинирования нокдаунов RB1 и TREX1 со сверхэкспрессией FOXA1, что приводило к масштабной индукции L1 и экспрессии IFN-I (фиг. 2f, фиг. 9g-i и фиг. 10с). Следовательно, в нормальных здоровых клетках во всех трех эффекторах должны быть отклонения, чтобы эффективно высвободить L1.

Пример 3 Последствия активации L1

[0200] Для того чтобы более подробно оценить активацию IFN-I посредством L1, мы исследовали экспрессию 84 генов в данном пути, используя панели ПЦР. Мы наблюдали обширный ответ, причем экспрессия большинства генов была повышена (фиг. 2h, фиг. 9j, k): у 68% (57/84) экспрессия была значительно повышена в старых клетках и у 52% (44/84) экспрессия была повышена в клетках 3Х. Полученные результаты подтверждают и дополнительно уточняют транскриптомный анализ RNA-seq (фиг. 8).

[0201] Обнаружили, что некоторые НИОТ, разработанные против ВИЧ, также ингибируют активность ОТ L1.¹²⁹ Мы также разработали кшРНК против L1, две из которых снижали уровни транскрипции на 40-50% и 70-90% в глубоко старых клетках и клетках 3Х, соответственно (фиг. 10g). Уровни белка ОРС1 были соответственно снижены в глубоко старых клетках (фиг. 5h). Наконец, указанные кшРНК также уменьшали ретротранспозицию рекомбинантных конструкций репортера L1 (фиг. 10k).

[0202] В клетках, лишенных TREX1, выявляют цитоплазматическую ДНК L1, накопление которой можно ингибировать с помощью НИОТ.¹³⁰ Хотя отсутствие включения BrdU является каноническим свойством старых клеток (фиг. 6b), длительное мечение выявило ДНК, которая была преимущественно цитоплазматической и высоко обогащенной последовательностями L1 (фиг. 11а, b). Синтез цитоплазматической ДНК L1 можно было почти полностью блокировать с помощью НИОТ ламивудина (3ТС) или кшРНК к L1 (фиг. 3а, с). С помощью антитела против гибридов ДНК:РНК обнаружили цитоплазматический сигнал в старых клетках, который в значительной мере колокализовался с белком ОРС1 и превращался в сигнал оцДНК после расщепления РНКазой (фиг. 11с). Анализ меченых BrdU последовательностей L1 в старых клетках показал, что они локализованы по всему элементу L1 (фиг. 11d, е). Относительное увеличение количества последовательностей L1 HS в общей клеточной ДНК также можно обнаружить с помощью анализа методом количественной ПЦР 6,1 6.^131,132 3ТС в диапазоне 7,5-10 мкМ полностью блокировал такое увеличение в старых клетках и также гасил активность репортера ретротранспозиции L1 (фиг. 10d, е).

[0203] Нокдаун L1 с помощью кшРНК или обработка клеток с помощью 3ТС значительно снижали уровни интерферона, а также более обширно уменьшали ответ IFN-I как в клетках на стадии позднего старения, так и в клетках 3Х (фиг. 3b, фиг. 12а). 3ТС в диапазоне 7,5-10 мкМ оптимально ингибировал ответ IFN-I и был наиболее эффективным из 4 исследованных НИОТ (фиг. 10f, j). Относительные эффективности НИОТ согласуются с их способностью ингибировать L1 человека RT15. 3ТС также противодействовал ответу IFN-I при других формах старения клеток - ВОС и ВСПС (фиг. 3е).

[0204] Клетки пересевали при постоянном присутствии 3ТС с пролиферативной фазы до глубокой старости клеток. 3ТС значительно не влиял на время вхождения в состояние старения клеток, индукцию р21 или р16, или ранний ответ SASP, такой как повышение экспрессии IL-β (фиг. 3f, фиг. 12b). Тем не менее, масштаб позднего ответа SASP (такого как индукция CCL2, IL-6 и ММР3) значительно уменьшался. Обработка кшРНК L1 также снижала уровни экспрессии IL-6 и ММР3 в клетках на стадии позднего старения (фиг. 11f). Следовательно, хотя активация L1 и последующий ответ IFN-I наступали относительно поздно, они вносят важный вклад в зрелый SASP и провоспалительный фенотип старых клеток.

[0205] 3ТС не влиял на уровни транскрипта L1 (фиг. 10i), позволяя предположить, что ответ INF-I запускается кДНК L1. Как предсказывает данная модель, нокдаун компонентов пути определения цитозольной ДНК, cGAS или STING,¹³³ ингибировал ответ IFN-I как в клетках на стадии позднего старения, так и в клетках 3Х (фиг. 10l и фиг. 12с, d), а также отрицательно регулировал ответ SASP в клетках на стадии позднего старения (фиг. 12е).

[0206] НИОТ, модифицированные алкилом в положении 5'-рибозы, не могут быть фосфорилированы и, следовательно, не ингибируют ферменты ОТ. Тем не менее, они обладают природной противовоспалительной активностью, ингибируя опосредованные Р2Х7 события, которые активируют путь инфламмасомы NLRP3.¹³⁴ Три-метокси-3ТС (K-9) при концентрации 10 мкМ или 100 мкМ не ингибировал ответ IFN-I ни в клетках на стадии позднего старения, ни в клетках 3Х (фиг. 12f). Следовательно, для действия 3ТС на путь IFN-I требуется ингибирование ОТ. При высоких концентрациях (100 мкМ) K-9 проявлял некоторую ингибиторную активность в отношении маркеров воспаления (фиг. 12g).

[0207] Для проверки роли передачи сигналов интерферона в SASP, рецепторы IFN-α/β (IFNAR1 и 2) были инактивированы с помощью CRISPR/Cas9. Эффективная остановка передачи сигналов IFN-I достигалась как в клетках раннего пассажа, так и в клетках в состоянии глубокого старения (фиг. 10m). Как при репликативной, так и при ВСПС формах старения клеток, утрата передачи сигналов интерферона антагонизировала поздние (CCL2, IL-6, ММР3), но не ранние (IL-1β) маркеры SASP (фиг. 3d). Этот результат дополнительно демонстрирует, что передача сигналов IFN-I способствует установлению полного и зрелого ответа SASP в старых клетках.

Пример 4 Активация L1 в тканях человека и мыши

[0208] Активацию экспрессии L1 при раке у человека детектировали с помощью антитела ОРС1,¹³⁵ Тот же реагент показал распространенную экспрессию ОРС1 как в старых клетках, так и в клетках 3Х (фиг. 8а, с, f). В биоптатах кожи нормальных пожилых людей мы обнаружили, что 10,7% дермальных фибробластов были положительны по маркеру старения клеток р16, что находится в рамках диапазона, задокументированного при старении приматов¹³⁶ (фиг. 13b, d, f, h). Некоторые из положительных по р16 дермальных фибробластов были также положительны по ОРС1 (10,3%). Стоит отметить, что мы никогда не наблюдали ОРС1 в отсутствие экспрессии р16. Мы также обнаружили, на уровне отдельных клеток, присутствие фосфорилированного STAT1, согласующееся с наличием передачи сигналов интерферона в микроокружении ткани¹³⁷ (фиг. 13b, е, g). Следовательно, во фракции старых клеток у нормальных людей наблюдается активация L1, что согласуется с накоплением данных событий во время прогрессирования старения клеток.

[0209] Затем мы исследовали мышей и обнаружили, что экспрессия мРНК L1 постепенно повышалась с возрастом в некоторых тканях (фиг. 15g). Обнаруженные последовательности РНК L1 преимущественно представляли собой смысловую цепь, представленную повсюду в элементе, и обнаруживались все три активных семейства L1 (фиг. 11g, h). На уровне белка, встречаемость положительных по ОРС1 L1 клеток повышалась в тканях с возрастом (фиг. 4а). Области окрашивания ОРС1 колокализовались с активностью ассоциированной со старением клеток р-галактозидазы (SA-β-Gal) (фиг.4b). Экспрессия нескольких генов ответа IFN-I (lfn-α, Irf7, Oas1), а также провоспалительных маркеров и маркеров SASP (11-6, Мmр3, Pail, также известный как Serpine1) повышалась в тканях старых мышей (фиг. 4с, фиг. 14). Повышение экспрессии L1 и генов ответа IFN-I (lfn-α, Oas1) также наблюдали в модели вызванного экспериментально старения клеток (молодые животные, подвергнутые облучению сублетальными дозами; фиг. 4d).

[0210] Старых животных (26 месяцев) лечили в течение двух недель 3ТС (вводили в воде в терапевтических для человека дозах). Мы обнаружили обширную и значительную понижающую регуляцию ответа IFN-I и облегчение провоспалительного состояния SASP (фиг. 4с; весь набор данных см. на фиг. 14 и в таблице 7). Экспрессия мРНК L1 и р16 незначительно снижалась, в большинстве случаев не достигая статистической значимости. K-9 не влиял ни на ответ IFN-I, ни на ответ SASP. Иммунофлуоресцентный анализ срезов ткани подтвердил, что в старых клетках наблюдался SASP, и в экспрессирующих ОРС1 клетках наблюдалась активированная передача сигналов IFN-I (фиг. 15а-с). Лечение 3ТС значительно снижало как IFN-I, так и SASP, но не экспрессию L1 или присутствие старых клеток. Следовательно, НИОТ можно категоризировать как «сеностатические» агенты, чтобы отличить их от «сенолитической» терапии, которая удаляет старые клетки из тканей.^138,139

[0211] Пониженный адипогенез¹⁴⁰ и термогенез¹⁴¹ свойственны природному старению, и оба были повышены в старых животных через 2 недели лечения 3ТС (фиг. 15d-f). На фиг.4е показано, что более длительное лечение (в возрасте от 20 до 26 месяцев) эффективно боролось с несколькими известными фенотипами старения: (i) инфильтрацией макрофагами тканей - отличительным признаком хронического воспаления,^142,143 (ii) гломерулосклерозом почки¹⁴⁴ и (iii) атрофией скелетных мышц.¹⁴⁵Наибольший ответ наблюдали для инфильтрации макрофагами белой жировой ткани, которая возвращалась к юношеским (5 месяцев) уровням всего лишь после 2 недель лечения 3ТС.

[0212] Активация эндогенных элементов L1 и наступление устойчивой активации ответа IFN-I является новым фенотипом старых клеток, включая встречающиеся в природе старые клетки в тканях. Данный фенотип постепенно развивается в процессе ответа старением клеток и, похоже, является важным, но до сих пор недооцененным компонентом SASP. Мы показали, что экспрессия трех регуляторных факторов RB1, FOXA1 и TREX1 изменяется во время старения клеток, и что данные изменения как достаточны, так и необходимы, чтобы позволить активацию транскрипции элементов L1 (фиг. 4g). Следовательно, множество механизмов надзора должно быть нарушено, чтобы высвободить L1, что подчеркивает важность сохранения данных элементов в репрессированном виде в соматических клетках.

[0213] Активация передачи сигналов врожденного иммунитета в ответ на активацию L1 во время старения клеток и старения организма происходит посредством стимулирующего интерферон пути ДНК (СИД). Цитоплазматическая ДНК может происходить из нескольких источников, таких как мтДНК, высвобожденная из находящихся в стрессовых условиях митохондрий,¹⁴⁶ или цитоплазматические фрагменты хроматина (ЦФХ), высвобожденные из поврежденных ядер.^147,148 Результаты настоящего изобретения позволяют предположить, что кДНК L1 является важным индуктором IFN-I в старых клетках. Примечательно, что лечение НИОТ эффективно противодействовало не только ответу IFN-I, но также, более обширно, уменьшало связанное с возрастом хроническое воспаление во множестве тканей.

[0214] Стерильное воспаление, также известное как воспалительное старение, является отличительным признаком старения организма и фактором, способствующим множеству связанных с возрастом заболеваний.^149,150 Результаты настоящего изобретения свидетельствуют о том, что активация элементов L1 (и необязательно других RTE) вызывает воспалительное старение, и что ОТ L1 является подходящей мишенью для лечения связанного с возрастом воспаления и расстройств.

Пример 5 Влияние адефовира и ламивудина на вызванное старением клеток повышение распространенности последовательностей l1, экспрессии генов интерферона и экспрессии генов sasp

[0215] Влияние адефовира и ламивудина на вызванное старением клеток повышение распространенности последовательностей L1, экспрессию генов интерферона и экспрессию генов SASP оценивали в линиях фибробластов человека.

[0216] Распространенность последовательности L1 (число копий) оценивали в трех различных линиях фибробластов человека: LF1, IMR90, WI38, - применяя анализ методом количественной ПЦР. Результаты анализа нормировали на распространенность 5S рДНК. Контроль (КТРЛ) представлял собой необработанные пролиферирующие клетки раннего пассажа. Лекарственные средства вводили непрерывно в среде, начиная с нескольких пассажей до старения клеток, при старении клеток, а затем до позднего старения клеток. «Старые» образцы собирали через четыре месяца после начала старения клеток. Оба лекарственных средства добавляли в среду при концентрации 5 мкМ. Красный столбик в условиях «старые»: культуры без лекарственных средств через 4 месяца в состоянии старения клеток. На фиг. 17а показано, что число копий L1 повышалось при старении клеток во всех трех линиях клеток, и оба лекарственных средства значительно предотвращали данное повышение, причем адефовир был несколько более эффективным, чем ламивудин.

[0217] Влияние 5 мкМ адефовира и ламивудина на экспрессию генов интерферона оценивали в двух линиях клеток (LF1 и IMR90) и на двух генах интерферона (IFN-α и IFN-β1), как описано на фиг. 17а, за исключением того, что экспрессию указанных генов измеряли с помощью ОТ-кПЦР. На фиг. 17b показано, что высокая экспрессия генов интерферона в старых клетках значительно снижалась во всех случаях под воздействием обоих лекарственных средств, и снова адефовир был несколько более эффективным, чем ламивудин. Красные столбики представляют собой культуры без лекарственных средств через 4 месяца старения клеток.

[0218] Влияние 5 мкМ адефовира и ламивудина на экспрессию генов SASP оценивали в одной линии клеток (LF1), используя два гена SASP (IL-6 и ММР3). КТРЛ представлял собой экспрессию в нормальных, до старения, необработанных клетках. На фиг. 17 с показано, что наблюдали повышение экспрессии со старением клеток (красные столбики), и в обоих случаях экспрессия генов SASP значительно снижалась после обработки лекарственными средствами, причем адефовир был несколько более эффективным, чем ламивудин.

[0219] Наконец, влияние высоких концентраций ламивудина и эмтрицитабина (10 мкМ и 50 мкМ) на экспрессию генов интерферона (IFN-α и IFN-β1) оценивали в линии клеток LF1. Это осуществляли путем пассирования клеток LF1 до состояния старения, поддержания их в состоянии старения клеток в течение трех месяцев, добавления лекарственных средств, выдерживания клеток в присутствии лекарственных средств в течение 1 месяца, затем сбора через 4 месяца. Экспрессию генов интерферона оценивали с помощью ОТ-кПЦР. КТРЛ представлял собой клетки, обработанные, как описано выше, но без лекарственных средств. На фиг. 17d показано, что при концентрации 10 мкМ ламивудин снижал индукцию IFN-I и был несколько более эффективным, чем эмтрицитабин. При концентрации 50 мкМ ламивудин в действительности вызывал повышение экспрессии интерферонов, даже превосходя уровни, наблюдаемые в необработанной клетке. Полагают, что такое повышение было вызвано токсичностью лекарственного средства на данных высоких уровнях. Напротив, эмтрицитабин при концентрации 50 мкМ снижал экспрессию интерферонов, даже до более низкого уровня, чем снижение, наблюдаемое при 10 мкМ.

[0220] Соответственно, при высоких дозах токсичность ИОТ может ухудшать их способность останавливать или блокировать вредное влияние старых клеток и их способность предотвращать или обращать связанное с возрастом воспаление и расстройства.

Пример 6 Сравнительная оценка нескольких ИОТ в анализе доза-ответ

ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ L1 В КЛЕТКАХ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА

[0221] Оценивали способность восьми соединений ИОТ ингибировать активность LINE-1 (L1) в анализе ретротранспозиции L1 мыши: ламивудина (3ТС); ставудина; эмтрицитабина; априцитабина; тенофовира дизопроксила; ценсавудина; эльвуцитабина и тенофовира. Три соединения ИОТ оценивали в анализе ретротранспозиции L1 человека: ламивудин (3ТС); ценсавудин и эльвуцитабин.

Анализ ретротранспозиции LINE-1 мыши

[0222] Кодирующая двойную люциферазу плазмида pYX016, содержащая элемент L1 мыши, была описана у Xie и др., 2011.¹⁵¹ Ламивудин (3ТС), ставудин (d4T), эмтрицитабин, априцитабин, тенофовира дизопроксил и тенофовир приобретали в АK Science. Эльвуцитабин получали с помощью синтеза на заказ. Ценсавудин синтезировали в Oncolys BioPharma. Клетки рака шейки матки HeLa культивировали при 37°С в термостате с влажностью 5% СО₂ в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л глюкозы), L-глутамином, пируватом натрия и бикарбонатом натрия (Sigma), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (Thermo Fisher).

[0223] Анализы проводили, как описано у Xie и др., 2011,¹⁵¹ с несколькими модификациями. Репортерный анализ проводили в 96-луночных белых планшетах с оптическим дном. 6000 клеток HeLa высевали в каждую лунку за 24 часа до трансфекции и обработки соединениями. Все соединения ресуспендировали в ДМСО. Концентрации исходного раствора изменялись от 50 мМ до 1,25 мМ в зависимости от растворимости соединения. Получали серийные разведения (1:3) в ДМСО. Десять различных концентраций каждого соединения исследовали в трех повторах. Среду, содержащую различные концентрации соединений, получали путем добавления 2 мкл разведения соединения в 1 мл культуральной среды. Конечная концентрация ДМСО в среде составляла 0,2%. Реагент для трансфекции FuGENE® HD (Promega) использовали для трансфекции плазмидой pYX016 клеток. Смесь для трансфекции получали в OpiMEM (Thermo Fisher), используя соотношение реагента и ДНК 3,5:1, следуя инструкциям производителя. Культуральную среду удаляли из клеток и отбрасывали. Смесь для трансфекции (5 мкл) смешивали со средой, содержащей соединение (100 мкл/лунку), и эту смесь добавляли к клеткам каждой лунки. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С/5% СО₂.

[0224] Проводили количественный анализ активности люциферазного репортера с помощью системы для репортерного анализа Dual-Luciferase® (Promega), следуя инструкциям производителя для многолуночных планшетов со следующей модификацией: клетки лизировали непосредственно в многолуночном планшете с помощью 30 мкл пассивного лизирующего буфера (PLB) в течение 20 мин при комнатной температуре при плавном встряхивании, чтобы гарантировать полный лизис клеток (вместо 20 мкл PLB в течение 15 мин). Измеряли сигналы люцифераз Firefly и Renilla, применяя многомодовый спектрофотометр для прочтения микропланшетов SpectraMax i3x. Для измерения сигналов Firefly и Renilla использовали время накопления сигнала 100 мс и 10 мс, соответственно. Относительную активность L1 рассчитывали как Firefly/Renilla *10000. Результаты ингибирования доза-ответ аппроксимировали четырехпараметрическим логистическим уравнением, используя нелинейную регрессию (применяя Graphpad Prism 8), чтобы определить значения IC₅₀ для каждого ингибитора. Эксперимент проводили дважды, независимо.

Результаты

[0225] Кривые ингибирования доза-ответ для восьми соединений ИОТ в двух независимых экспериментах представлены на фиг. 18А и фиг. 18В, соответственно. Значения IC₅₀ кратко представлены в таблице 10. Неожиданно, для двух соединений ИОТ - ценсавудина и эльвуцитабина - выявили гораздо более низкие значения IC₅₀(приблизительно 100 нМ), чем для других соединений ИОТ, таким образом, они проявили неожиданную ингибиторную активность в отношении L1 мыши.

Анализ ретротранспозиции LINE-1 человека

[0226] Учитывая их неожиданную способность ингибировать активность L1 мыши, исследовали способность ценсавудина и эльвуцитабина ингибировать активность L1 человека. Ламивудин также исследовали для сравнения.

[0227] Исследования L1 человека проводили очень сходным образом с таковыми для мыши. pYX017, кодирующий последовательность LINE-1 человека,¹⁵¹ использовали вместо pYX016. Так как человеческая конструкция давала меньший сигнал, соединения инкубировали с клетками в течение 72 часов вместо 48 часов и клетки высевали при плотности 2000/лунку вместо 6000/лунку. Кроме того, соотношение реагента для трансфекции и ДНК составляло 2:1 вместо 3,5:1.

Результаты

[0228] Кривые ингибирования доза-ответ для трех соединений ИОТ представлены на фиг. 19А-В и значения IC₅₀ кратко представлены в таблице 11. Снова, ценсавудин и эльвуцитабин проявили неожиданную ингибиторную активность в отношении L1 человека (IC₅₀ приблизительно 100 нМ) по сравнению с ламивудином (IC₅₀ более 800 нМ).

Анализ жизнеспособности клеток

[0229] Выше описано, что токсичность ИОТ может нарушить их способность останавливать или блокировать вредное влияние старых клеток и их способность предотвращать или обращать связанное с возрастом воспаление и расстройства. Потенциальную токсичность ламивудина (3ТС); ставудина; эмтрицитабина; априцитабина; тенофовира дизопроксила; ценсавудина; эльвуцитабина и тенофовира оценивали в анализе жизнеспособности клеток в дозах, используемых для получения кривых доза-ответ ингибирования L1.

[0230] Клетки HeLa обрабатывали различными концентрациями восьми соединений ИОТ в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega®) и представляли в виде процента жизнеспособных клеток по сравнению с необработанными клетками. Стауроспорин, который, как известно, вызывает гибель клеток, использовали в качестве контроля.

Результаты

[0231] На фиг. 20 показано, что восемь соединений ИОТ не приводили к каким-либо значимым уровням гибели клеток в противоположность контролю - стауроспорину.

[0232] В заключение, оба ценсавудин и эльвуцитабин проявили неожиданную способность ингибировать активность L1 мыши и человека (IC₅₀ приблизительно 100 нМ), не вызывая токсичность в анализе жизнеспособности клеток при дозах до 2 мкМ.

[0233] Таблицы, описанные в настоящем описании, представлены ниже.

96

Ссылочные материалы:

1 Engel, P. (2014). These Staggering Maps Show How Much The World's Population Is Aging. Business Insider, May 16, 2014.

2 Chung H Y, et al., (2009). Molecular inflammation: underpinnings of aging and age-related diseases. Ageing Res. Rev. 8(1): 18-30

3

4 Pawelec G, et al., (2014). Inflammation, ageing and chronic disease. Current Opinion in Immunology. 29: 23-28.

5 Jurk, D. e tal., (2014). Chronic inflammation induces telomere dysfunction and accelerates ageing in mice. Nature Communications, Vol 5, Article: 4172.

6 Singh, T. & Newman, A.B. (2011). Inflammatory markers in population studies of aging. Ageing Res Rev. 10(3): 319-329.

7 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition, pp.602-614, American Psychiatric Association Publishing, Washington, DC (2013).

8 Schorl, C. & Sedivy, J.M. (2007). Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods 41,143-50.

9 Itahana, K., Campisi, J. & Dimri, G.P. (2007). Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31.

10 Herbig, U. et al. (2004). Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(CIP1), but not p16(INK4a). Mol. Cell 14, 501-513.

11 Rangwala, S.H., et al. (2009). Many LINE1 elements contribute to the transcriptome of human somatic cells. Genome Biol 10, R100.

12 Criscione, S.W., et al. (2014). Transcriptional landscape of repetitive elements in normal and cancer human cells. BMC Genomics 15, 583.

13 Athanikar, J.N., et al. (2004). A YY1-binding site is required for accurate human LINE-1 transcription initiation. Nucleic Acids Res. 32, 3846-55.

14 Xie, Y., et al. (2011). Characterization of L1 retrotransposition with high-throughput dual-luciferase assays. Nucleic Acids Res 39, e16.

15 An, W., et al. (2011). Characterization of a synthetic human LINE-1 retrotransposon ORFeus-Hs. Mob DNA 2, 2.

16 Schoenmaker, M., et al. (2006). Evidence of genetic enrichment for exceptional survival using a family approach: the Leiden Longevity Study. Eur. J. Hum. Genet. 14, 79-84.

17 Herbig, U., et al. (2004). Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(CIP1), but not p16(INK4a). Mol. Cell 14, 501-13.

18 See, e.g., I sselbacher et al. (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882.

19 De Cecco, M., et al. (2013). Genomes of replicatively senescent cells undergo global epigenetic changes leading to gene silencing and activation of transposable elements. Aging Cell 12, 247-256.

20 De Cecco, M., et al. (2013). Transposable elements become active and mobile in the genomes of aging mammalian somatic tissues. Aging (Albany NY).

21 Li, Q., et al. (2013) FOXA1 mediates p16(INK4a) activation during cellular senescence. EMBO J 32, 858-873.

22 Sun, X., et al. (2018). Transcription factor profiling reveals molecular choreography and key regulators of human retrotransposon expression. Proc Natl Acad Sci U S A 115, E5526-E5535.

23 Montoya-Durango, D.E., et al. (2009). Epigenetic control of mammalian LINE-1 retrotransposon by retinoblastoma proteins. Mutat Res 665, 20-28.

24 Stetson, D.B., et al. (2008). Trex1 prevents cell-intrinsic initiation of autoimmunity. Cell 134, 587-598.

25 West, A.P., et al. (2015). Mitochondrial DNA stress primes the antiviral innate immune response. Nature 520, 553-557.

26 Ivanov, A., et al. (2013). Lysosome-mediated processing of chromatin in senescence. J Cell Biol 202, 129-143.

27 Dou, Z., et al. (2017). Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer. Nature 550, 402-406.

28 Takahashi, A., et al. (2018). Downregulation of cytoplasmic DNases is implicated in cytoplasmic DNA accumulation and SASP in senescent cells. Nat Commun 9, 1249.

29 Stetson, D.B., et al. (2008). Trexl prevents cell-intrinsic initiation of autoimmunity. Cell 134, 587-598.

30 Thomas, C.A., et al. (2017). Modeling of TREX1-dependent autoimmune disease using human stem cells highlights L1 accumulation as a source of neuroinflammation. Cell Stem Cell 21, 319-331 e318.

31 Dou, Z., et al. (2017). Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer. Nature 550, 402-406.

32 Takahashi, A., et al. (2018). Downregulation of cytoplasmic DNases is implicated in cytoplasmic DNA accumulation and SASP in senescent cells. Nat Commun 9, 1249.

33 Dou, Z., et al. (2017). Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer. Nature 550, 402-406.

34 Takahashi, A., et al. (2018). Downregulation of cytoplasmic DNases is implicated in cytoplasmic DNA accumulation and SASP in senescent cells. Nat Commun 9, 1249.

35 Lopez-Otin, C, et al. (2013).The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217.

36 https://en.wikipedia.org/wiki/Senotherapy

37 Franceschi, C. & Campisi, J. (2014). Chronic inflammation (inflammaging) and its potential contribution to age-associated diseases. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 69 Suppl. 1, S4-9.

38 Lopez-Otin, C. et al. (2013). The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-217.

39 Safrin, S., (2012). Antiviral Agents (Chapter 49). In: Basic and Clinical Pharmacology. 12e. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ (Editors). McGraw-Hill / Lange. (Access-Medicine).

40 Lopez-Otin, C, et al. (2013). The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217.

41 Bussian, T.J., et al. (2018). Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature 562, 578-582.

42 Childs, B.G., et al. (2016). Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science 354, 472-477.

43 Baker, D.J., et al. (2016). Naturally occurring p16(lnk4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature 530, 184-189.

44 Demaria, M., et al. (2017). Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov 7,165-176.

45 Chang, J., et al. (2016). Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nat Med 22, 78-83.

46 Schafer, M.J., et al. (2017). Cellular senescence mediates fibrotic pulmonary disease. Nat Commun 8, 14532.

47 Farr, J.N., et al. (2017). Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nat Med 23, 1072-1079.

48 Chinta, S.J., et al. (2018). Cellular Senescence Is Induced by the Environmental Neurotoxin Paraquat and Contributes to Neuropathology Linked to Parkinson's Disease. Cell Rep 22, 930-940.

49 Xu, M., et al. (2018). Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med 24, 1246-1256.

50 Schafer, M.J., et al. (2017). Cellular senescence mediates fibrotic pulmonary disease. Nat Commun 8, 14532.

51 Demaria, M., et al. (2014). An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell 31, 722-733.

52 See, U.S. Published Patent Application 2018/0050000.

53 See, U.S. Published Patent Application 2018/0050000.

54 Caira M., et al, (2004). Preparation and crystal characterization of a polymorph, a monohydrate, and an ethyl acetate solvate of the antifungal fluconazole. J. Pharmaceut. Sci., 93(3):601-611.

55 Van Tonder E.C., et al. (2004). Preparation and Physicochemical Characterization of 5 Niclosamide Solvates and 1 Hemisolvate. AAPS Pharm. Sci. Tech., 5(1): Article 12.

56 Bingham A.L., et al. (2001). Over one hundred solvates of sulfathiazole: solvates and adducts of sulfathiazole. Chem. Commun. 7: 603-604.

57 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995.

58 Brown, J.P., et al., (1997). Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts. Science 277, 831-834.

59 Herbig, U. et al., (2004). Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(CIP1), but not p16(INK4a). Mol. Cell 14, 501-513.

60 Fumagalli, M., et al, (2014). Stable cellular senescence is associated with persistent DDR activation. PLoS One 9, e110969.

61 www.nia.nih.gov/research/dab/aged-rodent-colonies-handbook

62 Else, L.J. et al. (2012). Pharmacokinetics of lamivudine and lamivudine-triphosphate after administration of 300 milligrams and 150 milligrams once daily to healthy volunteers: results of the ENCORE 2 study. Antimicrob. Agents Chemother. 56,1427-1433.

63 Le, O.N. et al. (2010). Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell 9, 398-409.

64 Coufal, N.G. et al. (2009). L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature 460, 1127-1131.

65 http://www.girinst.org/repbase/update/browse.php

66 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

67 Li, W. et al. (2015). The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework. Nucleic Acids Res. 43, W580-584.

68 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/primer-blast/

69 Ye, J. et al. (2012). Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, 134.

70 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr

71 Gautier, G. et al. (2005). A type I interferon autocrine-paracrine loop is involved in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic cells. J. Exp.Med. 201, 1435-1446.

72 Coufal, N.G. et al. (2009). L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature 460, 1127-1131.

73 Kim, D., et al. (2015). HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods 12, 357-360.

74 Liao, Y., et al. (2014). featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics 30, 923-930.

75 Robinson, M.D., et al. (2010). edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140.

76 Reich, M. et al. (2006). GenePattern 2.0. Nat Genet 38, 500-501.

77 Subramanian, A. et al. (2005). Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550.

78 Benjamini, Y. & Hochberg, Y. (1995). Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J Roy Stat Soc В 57, 289-300.

79 http://www. broad institute. org/cance r/software/G E N E-E

80 Langmead, B. (2010). Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics Chapter 11, Unit 11.7.

81 Alexandrova, E.A. et al. (2012). Sense transcripts originated from an internal part of the human retrotransposon LINE-1 5' UTR. Gene 511, 46-53.

82 Olovnikov, I.A. et al. (2007). A key role of the internal region of the 5'-untranslated region in the human L1 retrotransposon transcription activity. Mol. Biol. (Mosk) 41, 508-514.

83 Alexandrova, E.A. et al. (2012). Sense transcripts originated from an internal part of the human retrotransposon LINE-1 5' UTR. Gene 511, 46-53.

84 https://www.addgene.org/tooIs/protocoIs/plко/

85 http://www.broad.mit.edu/genome_bio/trc/rnai.html

86 Michaud, K. et al. (2010). Pharmacologic inhibition of cyclin-dependent kinases 4 and 6 arrests the growth of glioblastoma multiforme intracranial xenografts. Cancer Res. 70, 3228-3238.

87 http://www.orfeomecollaboration.org/

88 https://dnasu.org/DNASU/Home.do

89 Xie, Y. et al. (2011). Characterization of L1 retrotransposition with high-throughput dual-luciferase assays. Nucleic Acids Res 39, e16.

90 An, W., et al. (2011). Characterization of a synthetic human LINE-1 retrotransposon ORFeus-Hs. Mob DNA 2, 2.

91 Penzkofer, Т., et al. (2005). LIBase: from functional annotation to prediction of active LINE-1 elements. Nucleic Acids Res 33, D498-500.

92 http://www.girinst.org/repbase/update/browse.php

93 Criscione, S.W., et al. (2014). Transcriptional landscape of repetitive elements in normal and cancer human cells. BMC Genomics 15, 583.

94 Childs, B.G., et al. (2015). Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nat. Med. 21, 1424-1435.

95 Katoh, K. & Standley, D.M. (2013). MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol 30, 772-780.

96 Waterhouse, A.M. et al. (2009). Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics 25, 1189-1191.

97 http://genome-engineering.org/gecko/?page_id=15

98 Sanjana, N.E., et al. (2014). Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods 11, 783-784.

99 http://genome-engineering.org/gecko/wp-content/uploads/2013/12/lentiCRISPRv2-and-lentiGuide-oligo-cloning-protocol.pdf

100 Shalem, O. et al. (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 343, 84-87.

101 https://dnacore.mgh.harvard.edu/

102 Kreiling, J.A. et al. (2011). Age-associated increase in heterochromatic marks in murine and primate tissues. Aging Cell 10, 292-304.

103 Thomas, C.A. et al. (2017). Modeling of TREX1-dependent autoimmune disease using human stem cells highlights L1 accumulation as a source of neuroinflammation. Cell Stem Cell 21, 319-331 e8.

104 Kreiling, J.A. et al. (2011). Age-associated increase in hetero chromatic marks in murine and primate tissues. Aging Cell 10, 292-304.

105 http://www.qiagen.com/us/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page/

106 Schoenmaker, M. et al. (2006). Evidence of genetic enrichment for exceptional survival using a family approach: the Leiden Longevity Study. Eur. J. Hum. Genet. 14, 79-84.

107 Waaijer, M.E. et al. (2012). The number of p16INK4a positive cells in human skin reflects biological age. Aging Cell 11, 722-725.

108 Kamentsky, L., et al. (2011). Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics 27,1179-1180.

109 http://rsbweb.nih.gov/ij/

110 Martinez-Santibanez, G., et al. (2014). Imaging white adipose tissue with confocal microscopy. Methods Enzymol 537, 17-30.

111 Itahana, К., Campisi, J. & Dimri, G.P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).

112 Baker, D.J., et al. (2016). Naturally occurring p16(lnk4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature 530, 184-189.

113 Baker, D.J., et al. (2011). Clearance of p16lnk4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature 479, 232-236.

114 Huang, C.R., et al. (2012). Active transposition in genomes. Annu. Rev. Genet. 46, 651-675.

115 de Koning, A.P., et al. (2011). Repetitive elements may comprise over two-thirds of the human genome. PLoS Genet. 7, e1002384.

116 Hancks, D.C. & Kazazian Jr, H.H. (2012). Active human retrotransposons: variation and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 22, 191-203.

117 Rodic, N., et al. (2014). Long interspersed element-1 protein expression is a hallmark of many human cancers. Am. J. Pathol. 184, 1280-1286.

118 Erwin, J.A., et al. (2014). Mobile DNA elements in the generation of diversity and complexity in the brain. Nat. Rev. Neurosci. 15, 497-506.

119 De Cecco, M., et al. (2013). Genomes of replicatively senescent cells undergo global epigenetic changes leading to gene silencing and activation of transposable elements. Aging Cell 12, 247-256.

120 Van Meter, M., et al. (2014). SIRT6 represses LINE1 retrotransposons by ribosylating KAP1 but this repression fails with stress and age. Nat Commun 5, 5011.

121 Kreiling, J.A., et al. Contribution of retrotransposable elements to aging, in Human Retrotransposons in Health and Disease (ed. Cristofari, G.) 297-321 (Springer International, 2017).

122 ld

123 Volkman, H.E. & Stetson, D.B. (2014). The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat. Immunol. 15, 415-422.

124 Salama, R., et al. (2014). Cellular senescence and its effector programs. Genes Dev 28, 99-114.

125 Thomas, C.A., et al. (2017). Modeling of TREX1-dependent autoimmune disease using human stem cells highlights L1 accumulation as a source of neuroinflammation. Cell Stem Cell 21, 319-331 e8.

126 Ishak, C.A. et al. (2016). An RB-EZH2 complex mediates silencing of repetitive DNA sequences. Mol Cell 64, 1074-1087.

127 Li, Q., et al. (2013). FOXA1 mediates p16(INK4a) activation during cellular senescence. EMBO J. 32, 858-873.

128 Denli, A.M., et al. (2015). Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell 163, 583-593.

129 Dai, L., et al. (2011). Effect of reverse transcriptase inhibitors on LINE-1 and Ty1 reverse transcriptase activities and on LINE-1 retrotransposition. BMC Biochem. 12, 18.

130 Thomas, C.A., et al. (2017). Modeling of TREX1-dependent autoimmune disease using human stem cells highlights L1 accumulation as a source of neuroinflammation. Cell Stem Cell 21, 319-331 e8.

131 De Cecco, M., et al. (2013). Genomes of replicatively senescent cells undergo global epigenetic changes leading to gene silencing and activation of transposable elements. Aging Cell 12, 247-256.

132 Coufal, N.G., et al. (2009). L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature 460, 1127-1131.

133 Dhanwani, R., et al. (2017). Cytosolic sensing of immuno-stimulatory DNA, the enemy within. Curr Opin Immunol 50, 82-87.

134 Fowler, B.J., et al. (2014). Nucleoside reverse transcriptase inhibitors possess intrinsic antiinflammatory activity. Science 346, 1000-1003.

135 Rodic, N., et al. (2014). Long interspersed element-1 protein expression is a hallmark of many human cancers. Am. J. Pathol. 184, 1280-1286.

136 Herbig, U., et al. (2006). Cellular senescence in aging primates. Science 311, 1257.

137 Coppe, J.P., et al. (2010). The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu. Rev. Pathol. 5, 99-118.

138 Chang, J., et al. (2016). Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nat Med 22, 78-83.

139 Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell 14,644-58(2015).

140 Tchkonia, Т., et al. (2010).Fat tissue, aging, and cellular senescence. Aging Cell 9, 667-684.

141 Mattson, M.P. (2010). Perspective: Does brown fat protect against diseases of aging? Ageing Res Rev 9, 69-76.

142 Tchkonia, Т., et al. (2010). Fat tissue, aging, and cellular senescence. Aging Cell 9, 667-684.

143 Frasca, D. & Blomberg, B.B. (2016). Inflammaging decreases adaptive and innate immune responses in mice and humans. Biogerontology 17, 7-19.

144 Baker, D.J., et al. (2016). Naturally occurring p16(lnk4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature 530, 184-189.

145 Baker, D.J., et al. (2011). Clearance of p16lnk4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature 479, 232-236.

146 West, A.P. & Shadel, G.S. (2017). Mitochondrial DNA in innate immune responses and inflammatory pathology. Nat Rev Immunol 17, 363-375.

147 Dou, Z., et al. (2017). Cytoplasmic chromatin triggers inflammation in senescence and cancer. Nature 550, 402-406.

148 Takahashi, A., et al. (2018). Downregulation of cytoplasmic DNases is implicated in cytoplasmic DNA accumulation and SASP in senescent cells. Nat Commun 9, 1249.

149 Franceschi, C, & Campisi, J. (2014). Chronic inflammation (inflammaging) and its potential contribution to age-associated diseases. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 69 Suppl 1, S4-9.

150 Lopez-Otin, C.,ef al. (2013). The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217.

151 Xie Y., Rosser J.M., Thompson T.L., Boeke J.D. (2011). An W. Characterization of L1 retrotransposition with high-throughput dual-luciferase assays. Nucleic Acids Res. 39: e16.

[0234] Все патенты, заявки на патент и публикации, цитированные в данной заявке, полностью включены в данную заявку посредством ссылки.

[0235] Должно быть понятно, что раздел «Подробное описание», а не разделы «Краткое описание» и «Реферат», предназначен для объяснения формулы изобретения. В разделах «Краткое описание» и «Реферат» может быть описан один или более, но не все типичные варианты реализации настоящего изобретения, предполагаемые автором(-ами) настоящего изобретения, и, следовательно, они не предназначены для ограничения каким-либо образом настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

[0236] Предшествующее описание конкретных вариантов реализации настолько полно раскрывает основную природу настоящего изобретения, что другие смогут, используя знания в рамках квалификации в данной области, легко модифицировать и/или приспособить для различных применений такие конкретные варианты реализации без проведения лишних экспериментов, не отклоняясь от основной идеи настоящего изобретения. Следовательно, предполагают, что такие приспособленные и модифицированные варианты находятся в рамках значения и диапазона эквивалентов описанных вариантов реализации, на основании идеи и руководства, представленных в данной заявке. Должно быть очевидно, что фразеология или терминология в данной заявке предназначена для описания, но не для ограничения, так что терминология или фразеология в настоящем описании должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете идеи и руководств.

[0237] Ширина и объем настоящего изобретения не должны быть ограничены каким-либо из описанных выше типичных вариантов реализации, но должны определяться только в соответствии со следующими пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.

Claims

1. Способ лечения связанного с возрастом воспаления у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора обратной транскриптазы (ИОТ) указанному пациенту,

причем указанный ИОТ представляет собой ценсавудин или эльвуцитабин,

причем указанное связанное с возрастом воспаление связано с повышением экспрессии длинного диспергированного элемента-1 (L1), накоплением цитоплазматической кДНК длинного диспергированного элемента-1 (L1), активацией ответа интерферона типа I (IFN-I) или усилением провоспалительного состояния ассоциированного со старением клеток секреторного фенотипа (SASP), и

при этом указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, имеющего заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из: болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза (БАС), болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, потери зрения, потери слуха, дисфункции сердечно-сосудистой системы, лобно-височной деменции (ЛВД), рассеянного склероза (РС), синдрома Айкарди-Гутьерес, прогрессирующего надъядерного паралича (ПНП), остеоартрита, атеросклероза, остеопороза и фиброза легких.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную композицию вводят в количестве, достаточном для предотвращения или обращения повышения экспрессии L1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную композицию вводят в количестве, достаточном для предотвращения или обращения накопления цитоплазматической кДНК L1.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную композицию вводят в количестве, достаточном для предотвращения или обращения активации ответа IFN-I.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную композицию вводят в количестве, достаточном для предотвращения или обращения провоспалительного состояния SASP.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть болезнь Альцгеймера.

7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть БАС.

8. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть лобно-височная деменция (ЛВД).

9. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП).

10. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное связанное с возрастом воспаление присутствует у пациента, у которого есть синдром Айкарди-Гутьерес.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера или БАС и испытывает ослабление одного или более симптомов болезни Альцгеймера или БАС по сравнению с таковыми до введения указанного ИОТ указанному пациенту.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и один или более симптомов включают потерю памяти, размещение предметов не на тех местах, забывание названий мест или объектов, повторение вопросов, меньшую приспосабливаемость к новым обстоятельствам, замешательство, дезориентацию, обсессивное поведение, компульсивное поведение, бред, афазию, нарушение сна, перепады настроения, депрессию, тревогу, фрустрацию, возбужденное состояние, трудности при выполнении пространственных задач, агнозию, трудности при передвижении, потерю веса, потерю речи, потерю кратковременной памяти или потерю долговременной памяти.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и уменьшение одного или более симптомов оценивают в соответствии с DSM-5.

14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют, используя когнитивную субшкалу шкалы оценки тяжести болезни Альцгеймера (ADAS-cog).

15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют, используя шкалу оценки изменений клиницистом на основании опроса (CIBIC-plus).

16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и уменьшение симптомов определяют с применением шкалы оценки повседневной деятельности (ADL).

17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что указанный ИОТ представляет собой ценсавудин.

18. Способ по любому из пп. 1-17, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного второго терапевтического агента указанному пациенту.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный пациент имеет болезнь Альцгеймера, и указанный по меньшей мере один второй терапевтический агент полезен для лечения симптомов болезни Альцгеймера.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный пациент имеет БАС, и указанный по меньшей мере один второй терапевтический агент полезен для лечения БАС.