TWI639433B - 黏膜治癒促進劑 - Google Patents

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Abstract

本發明者係經由使用大腸炎模式小鼠的實驗，發現抑制CHST15基因表現的siRNA，對於克隆氏症或潰瘍性大腸炎顯現治療效果。亦即，發現抑制CHST15基因表現的siRNA為黏膜治癒促進劑，特別是成為克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑，本發明因而完成。

Description

黏膜治癒促進劑
本發明係關於黏膜治癒促進劑。本發明特別係關於克隆氏症、潰瘍性大腸炎、貝塞特氏症等慢性炎症性疾病的治療劑。
[「瑞米凱德(REMICADE)以來」的克隆氏症治療的新展開：可調節全身症狀，因此，局部病變(腸管組織障礙)的調控=小腸/黏膜療癒成為下一課題]
克隆氏症(Crohn’s disease，CD)，係在消化管全域發生非連續性的炎症及潰瘍的非特異性炎症性疾患。在北美為40至60萬人，歐洲為60萬人，日本為約3萬人罹患CD之稀少疾病，患者數隨著生活習慣的變化而持續增加(非專利文獻1)。CD在消化管全面性的發生炎症或潰瘍，而可見下痢、腹痛、發熱、伴隨著下血之貧血、體重減少、體力降低或倦怠感等各種臨床症狀，QOL(生活品質，quality of life)顯著降低。再者，CD的炎症病變矽由黏膜內發症，由於波及黏膜下層、固有肌層，具有全層性的肉芽腫性炎症、浮腫、因纖維化而腸壁肥厚的特徵(非專利文獻2至4)。
對於CD的治療，以抗炎症以及免疫機制的為基礎的藥劑，亦即，5-ASA製劑、經口類固醇類、源自免疫抑制劑，近 年來亦使用TNF製劑的方式(非專利文獻5)。評估CD的臨床活動性的CDAI(Crohn’s Disease Activity Index)的減少可能為症狀的調控。然而，即使於經判定以CDAI使其緩解或輕症的患者，以內視鏡檢查多數為殘存有局部的活動性病變的症例，咸信成為重複炎症的再發病或因纖維化而狹窄的起點病灶(非專利文獻2、3、6、7)。確立CD為進行性的腸管組織障礙(Progressive digestive damage)的概念(非專利文獻4、6、7)，治療戰略亦自症狀調控，其重點移向經由i)長期的腸管保護之內視鏡病變的治癒以及ii)迴避因腸狹窄之外科手術(非專利文獻6至11)。特別地，已有報告內視鏡的腸管治癒(intestinal Healing：IH)或黏膜治癒(Mucosal Healing：MH)為涉及影響CD患者的預後的因子(非專利文獻6至11)，評估CD的內視鏡的活動性的SES-CD(Simple Endoscopic Score for CD)的改善，成為CD治療的心的效果判定基準。因現存藥物的CD患者的MH效果，5-ASA製劑及經口類固醇劑幾乎為無，免疫抑制劑為16.5%，抗TNF製劑亦報告為30.1%(非專利文獻7、11)。該等全身投予藥物無法充分調控而如何使內視鏡病變治癒(IH/MH)為重要的所附加的醫學知識為瑞米凱德有貢獻，亦可謂之對於CD冀求新藥為明確化的緊急課題。
[攻擊IH/MH的新穎治療戰略：由臨床病理學的觀點~更早期的把握慢性化的根據點、纖維化病灶，開始治療]
內視鏡病變殘存的病因雖然未充分解明，於潰瘍與纖維化同時存在的點，於CD有內視鏡病變治癒的困難。對組織損傷的修復過程中，咸信適切的MH替代，經由不適切的「纖維化 形成性」修復(Fibrotic healing)所誘導的情況，為伴隨潰瘍與纖維化的炎症病灶持續的情況之一重要因素(非專利文獻2、3、12)，推測單只對於該等局部病變之基於炎症、免疫機制的全身性現存藥物為無法獲得充分的效果者。考慮病理學上重複損傷、修復同時殘存(非專利文獻3)，CD中之口瘡性(aphthae)(伴隨浮腫狀小隆起及紅斑的糜爛)或潰瘍，該等亦作為浮腫性伴隨內腔的狹小化之病變，以內視鏡檢查予以診斷。進一步地，近年來，擴大內視鏡或共焦內視鏡等，以即時(real time)可更詳細觀察的技術亦為普及，已整理為可由早期治療的環境。
由炎症時自早期累積於病變部的纖維母細胞的過剩活性化傾向纖維性治癒(Fibrotic healing)的平衡予以證明的事實，「纖維母細胞活性化的抑制」於炎症性腸疾患中對於炎症性纖維化(Inflammation-driven intestinal fibrosis)作為新的治療標靶而受到注目(非專利文獻2及3)。根據炎症、免疫機制之獻存藥物單獨無法獲得充分效果的內視鏡病變，由於為潰瘍與纖維化同時存在的病變的事實，纖維化/纖維母細胞作為標的之治療，可謂於CD中作為新的治療戰略而興起。
[攻擊IH/MH的新穎治療戰略：由科學的觀點~CHST-CS路徑]
糖硫酸轉移酵素基因之Carbohydrate sulfotransferase 15(CHST 15)為硫酸軟骨素-A(chondroitin sulfate-A(CS-A))的GalNAc(4SO4)殘基的6位轉移為硫酸鹽，合成高度硫酸化之硫酸軟骨素-E(CS-E)為II行的膜貫通型高爾基體蛋白質(非專利 文獻13及14)。已有報告，CD患者的活動性大腸病變中高度地硫酸化之硫酸軟骨素(CS)的合成顯著地增加的事實(非專利文獻15)，經高度地硫酸化之CS-E係於CD患者的肥厚黏膜下層與增加的V型膠原蛋白結合的事實(非專利文獻16及17)，進一步地高度硫酸化之CS-E促進膠原蛋白纖維(Fibril)形成的事實(非專利文獻18)，咸認為CS-E與局部纖維化病變的維持有增強的相關。進一步地，已有報告高度地硫酸化之CS-E係與相關於纖維母細胞的黏著之分子CD44，相關於纖維母細胞的游移的趨化激素MCP-1、SDF-1，相關於纖維母細胞的增殖的PDGF、TGF-β結合的事實(非專利文獻19)，建議於黏膜下方部位經由該等分子的濃縮亦相關於纖維母細胞的定著與活性化的事實。
本發明者們發現，CHST15蛋白質於CD患者的纖維化部位過剩生產，以及於發生腸纖維化的大腸炎的動物模式中CHST15與腸纖維化相關連的事實(非專利文獻20及21)。藉由軟骨素分解酵素ABC或軟骨素脫硫酸酵素而去除過剩的硫酸化CS，以及經減輕纖維化的成果(專利文獻1，非專利文獻20及21)可知，本發明者們考慮調控成為原因之CHST15的產生係對於消化道中纖維化有期望的標靶而完成。單就以往的化學手法，選擇性地抑制高硫酸化CS或CHST15的方法不佳，本發明者們建議siRNA，將其經由局部注射路徑而選擇性地抑制的戰略。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本特許第4585611號
非專利文獻
非專利文獻1：Van Assche G, Geboes K, Rutgeerts P et al. Medical therapy for Crohn's disease strictures. Inflamm Bowel Dis 10: 55-60, 2004.
非專利文獻2：Rieder F. and Fiocchi C. Intestinal fibrosis in IBD-a dynamic, multifactorial process. Nature Rev Gastroenterol Hepatol 6: 228-35, 2009.
非專利文獻3：Rieder F and FIocchi C. First International summit on fibrosis in intestinal inflammation: mechanisms and biological therapies. Fibrogenesis & Tissue Repair 3: 22, 2010.
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非專利文獻6：Lacucci M and Ghosh S. Looking beyond symptom relief: evolution of mucosal healing in inflammatory bowel disease. Ther Adv Gastroenterol 4: 129-143, 2011.
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非專利文獻8：Pariente B, Cosnes J, Danese S et al. Development of the Crohn's disease digestive damage score, the Lemann score. Inflamm Bowel Dis 17: 1415-1422, 2011.
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非專利文獻12：Wynn TA. Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases. J Clin Invest 117: 524-529, 2007.
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非專利文獻20：Kiryu H, Terai G, Imamura O et al. A detailed investigation of accessibilities around target sites of siRNA and miRNAs. Bioinformatics 2011 Apr 29. [Epub ahead of print]
非專利文獻21：Suzuki K, Fujii M, Yoneyama H et al. The development of the therapeutic agent utilizing RNA interference in the colon of stenosis of Crohn's disease. J Jpn Soc Gastroenterol 107 (347): A29, 2010.
本發明係以提供黏膜治癒促進劑，特別是克隆氏症、潰瘍性大腸炎的新穎治療劑的提供為課題。
RNA干擾(RNAi)係自病毒感染用於保護細胞而進化之生體防禦機制之一。該機制辨識病毒RNA的獨特構造，其次，誘導RNAi的活性化，可分解全部的病毒RNA。其結果，RNAi發揮使受到感染的細胞病毒感染回復的功能。本發明合成具有獨特構造之siRNA。
本發明之siRNA(抗CHST15 siRNA)係抑制相關於CHST15產生之人類CHST15基因表現的方式所特異地設計27mer(鹼基)的siRNA。27mer的siRNA雙股係以nM或pM的程級非常強地抑制基因表現。本發明的CHST15 siRNA的反-CHST15 siRNA為CHST15 mRNA，亦即，包含與人類CHST15的序列領域互補的序列之合成siRNA，其反股鏈係作為對於RNAi功能的導引序列，藉由特異地辨識人類CHST15而使其分解，阻斷相關於糖硫酸轉移酵素(CHST15蛋白質)產生的基因表現。其結果，不發生CS的硫酸基的轉移，纖維母細胞亦不活性化而推定纖維化受到抑制。
本發明者們，藉由使用大腸癌模式小鼠的實驗，發現抑制CHST15基因表現的siRNA，對於克隆氏症或潰瘍性大腸炎顯示治療效果。亦即發現，抑制CHST15基因表現的siRNA成為克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑，本發明遂而完成。
本發明，更具體地為提供以下的[1]至[6]者。
[1]一種siRNA，其為抑制CHST15基因表現的siRNA，其包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列之RNA以及包括與該RNA互補的序列之RNA所雜交的構造。
[2]末端具有1個或複數個核酸突出(overhang)的構造之[1]揭示的siRNA。
[3]一種DNA載體，其可表現[1]或[2]揭示的siRNA。
[4]一種黏膜治癒促進劑，其包含[1]或[2]揭示的siRNA、或[3]揭示的DNA作為有效成份。
[5]一種克隆氏症或潰瘍性大腸炎治療劑，其包含[1]或[2]揭示的siRNA、或[3]揭示的DNA作為有效成份。
[6]一種用於創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒的醫藥組成物，其包含[1]或[2]揭示的siRNA、或[3]揭示的DNA作為有效成份。
進一步地，本發明關於以下者。
[a]一種黏膜治癒的促進方法，或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療方法，包含向對象投藥包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列以及包括與該RNA互補的序列所雜交的構造的siRNA的步驟。(此處，對象而言，為哺乳動物(人類，或非人類哺乳動物等)，較佳為克隆氏症或潰瘍性大腸炎的患者。)
[b]一種siRNA的用途，係於黏膜治癒促進劑，或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑的製造中，包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列以及包括與該RNA互補的序列所雜交的構造的siRNA。
[c]一種siRNA，其係黏膜治癒促進用，或克隆氏症或潰 瘍性大腸炎的治療用者(用於治療中所使用者)，包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列以及包括與該RNA互補的序列所雜交的構造的siRNA。
[d]一種用於製造黏膜治癒促進劑、或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑的方法，其抑制CHST15基因表現，該黏膜治癒促進劑或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑抑制CHST15基因表現，且含有siRNA，該siRNA包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列以及包括與該RNA互補的序列所雜交的構造。
[圖1]圖1為本發明實驗設計的模式圖。
[圖2]圖2為顯示本發明的抗CHST15 siRNA對於大腸CHST15基因表現的影響圖。各點表示n=2至6的平均值及SD值。N表示正常小鼠，C表示陰性對照群。
[圖3]圖3為顯示本發明之抗CHST15 siRNA對大腸羥脯胺酸量的影響(Day 19)圖。N表示正常小鼠，C表示陰性對照群。
[圖4]圖4為顯示本發明之抗CHST15 siRNA對Segmental SES-CD分數的影響圖。於Day 19抗CHST15 siRNA投藥群與陰性對照群的差為p<0.01(***)(邦弗隆尼多重比較測試(Bonferroni multiple comparison test))。
用於實施發明之形態
以下，詳細地說明本發明。
經由本發明者，發現藉由抑制CHST15(糖硫酸轉移酵素 15)基因的表現，可發揮克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療效果，或創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒的效果。更詳細言之，本發明者係藉由RNAi效果抑制CHST15基因的表現，發現具有克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療效果，或創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒的效果之RNA分子(siRNA)。
又，本發明之CHST15，關於別的稱呼，亦稱為GalNAc4S-6ST(N-乙醯半乳糖胺4-硫酸6-O磺基轉移酶(N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-0 sulfotransferase))。
本發明者首先，提供藉由RNAi效果抑制CHST15基因表現的siRNA(亦包含shRNA)。該RNA具有克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療效果，或具有創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒的效果。
本發明之CHST15基因雖無特別限制，通常係源自動物，更佳係源自哺乳動物，最佳係源自人類。
本發明之藉由RNAi(RNA interferance；RNA干擾)效果可抑制CHST15基因表現的RNA(本說明書中有單獨稱為「本發明之siRNA」的情況)，更具體而言，可列舉包含序列編號：1至4之任一者揭示的鹼基序列之RNA。再者，本發明之siRNA之更佳態樣中，可列舉包括序列編號：1或2揭示的鹼基序列之RNA作為一股的雙股RNA(siRNA)。
本發明係提供藉由RNAi效果可抑制CHST15基因表現的RNA(siRNA)，係包含：將包括序列編號：1揭示的鹼基序列之RNA，以及包括與該RNa互補的序列之RNA所雜交的構造之雙股RNA。
例如，以包含序列編號：1揭示的鹼基序列(5'-GGAGCAGAGCAAGAUGAAUACAAUC-3')為特徵之本發明的siRNA，可例示如以下方式構造的RNA。
(上述「I」表示氫鍵。)
又，上述RNA分子之任一端為經封閉構造的分子，例如，具有髮夾(hairpin)構造(莖環構造)之siRNA(shRNA)亦包含於本發明。亦即，分子內可形成雙股RNA構造的分子亦包含於本發明。
例如，5’-GGAGCAGAGCAAGAUGAAUACAAUC(序列編號：1)(xxxx)n GAUUGUAUUCAUCUUGCUCUGCUCC(序列編號：2)-3’方式之分子亦包含於本發明。(上記「(xxxx)n」表示包含任意鹼基及序列數目之多核苷酸。)
進一步地，5’-GGAGCAGAGCAAGAUGAAUACAAUCAG(序列編號：3)(xxxx)n GAUUGUAUUCAUCUUGCUCUGCUCCAU(序列編號：4)-3’方式之分子亦包含於本發明。
本發明之siRNA也可不必然全部的核苷酸皆為核糖核苷酸(RNA)。亦即，本發明中，構成siRNA的1個或複數個核糖核苷酸，只要作為分子本身為具有CHST15基因表現的功能者即可，亦可為對應之去氧核糖核苷酸。該「對應」意指雖然糖部分的構造不同，但為相同鹼基種類(腺嘌呤、鳥嘌呤、 胞嘧啶、胸嘧啶(尿嘧啶))。例如，對應於具有腺嘌呤之核糖核苷酸之去氧核苷酸，稱為具有腺嘌呤之去氧核苷酸。再者，前述「複數」雖無特別限制，較佳為指稱2至5左右的少數。
一般言之RNAi，係經由將包含：包括與目標基因的mRNA序列為相同序列之正股(sense)RNA以及包括與其互補的序列之反股(antisense)RNA之雙股RNA導入至細胞內，誘導目標基因mRNA的破壞，目標基因表現受到阻礙的現象。通常，具有RNAi效果的雙股RNA，為包含下述者之雙股RNA：包括於目標基因的mRNA中與連續RNA區域相同的序列之正股RNA，以及包括與該正異RNA互補的序列之反股RNA。
本發明之較佳態樣中，係藉由RNAi效果可抑制CHST15基因表現的RNA，為包括：包含序列編號：1所揭示鹼基序列之RNA，以及包含與該RNA互補之序列之RNA雜交的構造之雙股RNA。亦即，本發明係提供抑制CHST15基因表現的siRNA，所提供之siRNA包含：包括序列編號：1揭示的鹼基序列之RNA，以及包括與該RNA互補的序列之RNA所雜交的構造。更具體而言，可列舉序列編號：1揭示的RNA，以及序列編號：2揭示的RNA所雜交的構造之核酸分子。
本發明之siRNA的較佳態樣中，係藉由RNAi效果可抑制CHST15基因表現的RNA(siRNA)，可適宜地顯示包括：包含序列編號：1所揭示鹼基序列之RNA，以及包含與該RNA互補之序列之RNA雜交的構造之雙股RNA。惟，於該雙股RNA的末端，例如，1個或複數的RNA或DNA係經加成或缺失構造的雙股RNA(RNA與DNA之雜交分子)也包含於本發 明中。
本發明之siRNA亦可為末端具有數個鹼基突出的分子。形成該突出的鹼基長度以及序列並無特別限制。再者，該突出亦可為DNA及RNA之任一者。較佳可例示2鹼基的突出。作為一例，可列舉於3’末端具有AG、AU的突出的雙股RNA。本發明之雙股RNA亦包含形成突出的鹼基為DNA的分子。
作為本發明之siRNA的較佳態樣，例如，可列舉3’末端的突出部分的鹼基為AG、AU之下述siRNA分子(相當於實施例之「抗CHST15 siRNA」)。
亦即，作為本發明之siRNA的較佳態樣，可列舉序列編號：3所揭示之RNA與序列編號：4所揭示之RNA經雜交之構造的siRNA分子。
本發明之siRNA，對於此項技術領域者，藉由本發明說明書所揭示之鹼基序列為基礎，可適宜製作。具體而言，以序列編號：1至4之任一者所揭示之鹼基續列為基礎，可製作本發明之雙股RNA。只要判明其中一股(例如，序列編號：1揭示的鹼基序列)，此項技術領域者可容易地知道另一股(互補股)的鹼基序列。本發明之siRNA，於此項技術領者可使用市售之核酸合成機而適宜製作。再者，關於所期望之RNA的合成，可利用一般之合成委託服務。
本發明之siRNA(例如，序列編號：1至4之任一 者揭示的鹼基序列之一股作為雙股RNA分子)，由於具有黏膜治癒促進効果，特別是克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療效果，本發明提供含有本發明之siRNA作為有效成份之黏膜治癒促進劑，或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的治療劑。進一步地，本發明之siRNA由於具有創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒的效果，本發明提供含有本發明之siRNA作為有效成份之黏膜治癒促進劑、創傷治癒劑、黏膜治癒劑或潰瘍治癒劑。再者，本發明提供含有本發明之siRNA作為有效成份之用於創傷治癒、黏膜治癒或潰瘍治癒之醫藥組成物。
本發明中成為治療對象的疾患，例如，可列舉炎症、創傷中之黏膜治癒、創傷治癒、潰瘍治癒。
本發明之慢性炎症疾患治療劑，例如，有用於作為皮膚為首之外皮及上皮組織之彈性纖維症、硬皮症、慢性腹膜炎、後腹膜腔纖維化症等，結締組織等支持組織、肌肉之多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性多發動脈炎、軟組織纖維症、風濕性關節炎、手掌纖維腫、腱炎、腱鞘炎、阿奇里斯腱炎、足菌腫等，骨髓、心臓等血液組織、脈管系之骨髓纖維症、脾機能亢進症、脈管炎、徐脈性不整脈、動脈硬化、閉塞性血栓性血管炎、結節性纖維症、狭心症、擴張型鬱血性心肌症、心衰竭、拘束型心肌症、瀰漫性非閉塞性心肌症、閉塞性心肌症、肺性心、僧帽瓣狹窄、大動脈瓣狹窄、慢性心膜炎、心內膜纖維症、心內膜心肌纖維症等，肝臓等消化器系統為慢性胰臟炎、克隆氏症、潰瘍性大腸炎、酒精性肝炎、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、威爾森症、肝硬化、病毒性肝炎、高雪氏症(Gaucher's Disease)、糖原病、α-抗胰蛋白酶缺乏症(α-Antitrypsin deficiency)、遺傳性血色素沉澱症(Haemochromatosis)、酪胺酸血症、果糖血症、半乳糖血症、柴爾維格氏症(Zellweger syndrome)、先天性肝纖維症、門脈壓亢進症、肝肉芽腫症、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、原發性硬化性膽管炎、脂肪肝、非酒精性肝炎、肝纖維症、先天性肝纖維症、酒精性肝硬化、病毒性肝硬化、寄生蟲性肝硬化、中毒性肝硬化、營養障礙性肝硬化、鬱血性肝硬化、肝硬化症、夏科氏(Charcot’s)肝硬化、托德氏(Todd’s)肝硬化、續發性膽汁性肝硬化、單葉性肝硬化、自慢性非化膿性破壞性膽炎移行之肝硬化、閉塞性肝硬化、膽細管性肝硬劃、膽汁性肝硬化、萎縮性肝硬化、壞死後性肝硬化、肝炎後肝硬化、結節性肝硬化、混合型肝硬化、小結節性肝硬化、代償性肝硬化、非代償性肝硬化、大結節性肝硬化、中隔性肝硬化、突發性肝硬化、門脈周圍性肝硬化、門脈性肝硬化、原發性膽汁性肝硬化等，肺等呼吸系統之球黴菌症(coccidioidomycosis)、芽生菌症(blastomycosis)、過敏性支氣管肺麴菌症、古巴士德氏症(Goodpasture's syndrome)、成人呼吸窘迫症候群之肺纖維症、慢性閉塞性肺疾患、無氣肺、肺炎、矽肺症、石綿肺症、過敏性肺炎、異位性肺纖維症、淋巴球性間質性肺炎、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)肉芽腫症、嚢胞性纖維症、膿胞性纖維症、肺纖維症、異位性肺纖維症、纖維化性肺胞隔炎、間質性纖維症、瀰漫性肺纖維症、慢性間質性肺炎、支氣管擴張症、細支氣管炎纖維症、支氣管周圍纖維症、胸膜纖維症等，腎臓等泌尿器、生殖器系統之男性 性腺機能低下症、肌僵直性營養不良(Myotonic Dystrophy)、派尼爾氏症(Peyronie's Disease)等所致之纖維症、慢性尿細管間質性腎炎、體染色體隱性多囊性腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease)、骨髓腫腎、水腎症、急速進行性絲球體腎炎、腎毒性疾患、黃色肉芽腫性腎盂腎炎、鎌狀紅血球腎症、腎性尿崩症、體染色體顯性多發性嚢胞腎病、慢性絲球體腎炎、IgA腎症、腎硬化症、巢狀絲球體硬化症、膜性腎炎、膜増殖性絲球體腎炎、慢性腎盂腎炎、腎類澱粉變性症、多發性嚢胞腎病、後腹膜纖維症、狼瘡性腎炎等膠原病伴隨之腎病變、糖尿病性腎症、慢性前列腺炎、住血吸蟲症所致之膀胱炎、乳腺纖維症、乳腺纖維腺腫等，脊椎等神經系統之先天性斜頸、僵直性脊椎炎、神經纖維腫或脊髓損傷後的神經功能缺損等脊髓疾患，帕金森氏症或阿茲海默症等腦神經疾患，眼球之後部水晶體纖維化症、増殖性網膜症等，再者，於全身產生病變之肉瘤病、全身性紅斑性狼瘡所致之纖維症或全身性硬皮症、多發性肌炎、皮膚肌炎等，手術後的併發症，以及糖尿病、癌等各種慢性炎症性疾患的治療劑。
再者，Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol 2008；214：199-210之表1所揭示的疾患亦可成為本發明治療劑的治療對象。
進一步地，本發明之siRNA(雙股RNA)或可表現序列編號：1至4之任一者所揭示RNA之DNA，皆包含於本發明。亦即，本發明提供可表現本發明之即siRNA(雙股RNA)之DNA(載體)。本發明之可表現上述本發明之上記雙股RNA 之DNA(載體)，例如，具有將編碼該雙股RNA中之一股的DNA，以及編碼該雙股RNA中之另一股的DNA，以可各自表現的方式功能性連結至啟動子的構造的DNA。本發明之上述DNA，此項技術領域者，可經由一般的基因遺傳工程技術而製作。更具體而言，可經由將編碼本發明之RNA(例如，序列編號：1至4之任一者所揭示RNA)之DNA適宜插入至習知的各種表現載體而製作。
本發明之CHST15(GalNAc4S-6ST)的序列，可根據讀取編號NM_015892而取得。作為一例，本發明之CHST15基因的鹼基序列之序列編號：5，經由該基因所編碼胺基酸序列而揭示為序列編號：6。
即使為包含上述以外的胺基酸序列的蛋白質，例如與序列編號：6揭示的序列具有高的同源性(通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，最佳為95%以上)，且保持上述蛋白質所具有的功能的蛋白質，包含於本發明之CHST15蛋白質。作為上述蛋白質，例如，包含於序列編號：6揭示的胺基酸序列中，1個以上的胺基酸經加成、欠缺、置換、插入的胺基酸序列的蛋白質，通常改變的胺基酸數目為30個胺基酸以內，較佳為10個胺基酸以內，更佳為5個胺基酸以內，最佳為3個胺基酸以內。
本發明之上述基因，例如，包含對應於包含序列編號：5揭示的鹼基序列的DNA之其他生物之內因性基因(人類之上述基因的類似物等)。
再者，對應於包含序列編號：5揭示的鹼基序列的 DNA之其他生物的內因性DNA，一般而言，各自與序列編號：5揭示的DNA具有高的同源性(相同性)。高的同源性，意指較佳為70%以上，再佳為80%以上，更佳為90%以上(例如，95%以上，進一步地96%、97%、98%或99%以上)的相同性。該相同性可經由mBLAST演算法(Altschul et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7)決定。再者該DNA由活體內單離的情況，咸信為各自與序列編號：5揭示的DNA在嚴苛的條件下雜交。作為此處之「嚴苛的條件」，例如可列舉「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」，作為更嚴苛的條件可列舉「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」及「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」的條件。
再者，本發明之藥劑可表現為「醫藥品」、「醫藥組成物」、「治療用醫藥」等。
又，本發明之「治療」，包含可預先抑制疾患產生的預防效果的情況。再者，不必限定為具有完全治療的情況，亦可為具有部分效果的情況。
本發明之藥劑，可與生理學上容許的擔體、賦形劑或稀釋劑等混合，作為醫藥組成物，經口或非經口的投予。作為經口劑，可作成顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、溶劑、乳劑或懸浮劑等劑型。作為非經口劑，可選擇注射劑、點滴劑、外用藥劑、吸入劑(氣霧器)或栓劑等劑型。注射劑可顯示為皮下注射劑、肌肉注射劑、腹腔內注射劑、頭蓋內注射劑或鼻腔 內投予注射劑等。外用藥劑，可顯示為經鼻投予劑或軟膏劑等。作成包含主成分之本發明藥劑方式之上述劑型之製劑技術為習知的。
例如，經口投予用的錠劑，係於本發明之藥劑可添加混合賦形劑、崩解劑、黏合劑、以及潤滑劑，經由壓縮整形而製造。賦形劑而言，一般使用乳糖、澱粉或甘露醇等。作為崩解劑，一般使用碳酸鈣或羧甲基纖維素鈣等。黏合劑而延，使用阿拉伯膠、羧甲基纖維素或聚乙烯基吡咯啶酮。作為潤滑劑，習知為滑石或硬脂酸鎂。
包含本發明之藥劑的錠劑，可為了遮蔽或作成腸溶性製劑，施用習知的包覆。包覆既可使用乙基纖維素或聚氧乙二醇等。
再者，注射劑可將主成分之本發明的藥劑，與適當的分散劑同時溶解、溶解於分散介質或藉由使其分散而可製得。藉由分散介質的選擇，可作成與水性溶劑及油性溶劑之任一者的劑型。水性溶劑時，以蒸餾水；生理食鹽水或林格氏液等作為分散介質。油性溶劑時，利用各種職務由或丙二醇等作為分散介質。此時，根據需要亦可添加對羥基苯甲酸酯(paraben)等保存劑。再者，注射劑中，可添加氯化鈉或葡萄糖等習知的等張化劑。進一步地，可添加苄索氯銨或鹽酸普卡因等無痛化劑。
再者，本發明之藥劑可經由固形、液狀或半固形狀的組成物而作為外用劑。關於固形或液狀的組成物，如同前述者可做成同樣的組成物而作為外用劑。半固形狀的組成物，可根據需要添加增黏劑於適當的溶劑中調製。溶劑可使用水、 乙醇或聚乙二醇等。增黏劑，一般係使用澎潤土、聚乙烯醇、丙烯酸、甲基丙烯酸或聚乙烯基吡咯啶酮等。該組成物中，可添加苄索氯銨等保存劑。再者，可藉由組合作為擔體之可可油脂等油性基材，或纖維素衍生物之水性凝膠基材，作成栓劑。
本發明之藥使用劑作為基因治療劑時，除了經由注射本發明的藥劑之直接投予的方法之外，可列舉投予經組入核酸的載體(vector)的方法。作為上述載體，可列舉腺病毒載體、腺相關病毒載體、疱疹病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體等，藉由使用該等病毒載體可有效率的投予。
作為本發明之較佳態樣，可列舉局部投予。具體而言，可列舉於大腸、直腸等的黏膜下，使用內視鏡注入的方法(內視鏡局部投予)。
再者，亦可將本發明之藥劑導入微脂體等磷脂質小胞體，投予該小胞體。將保持有siRNA或shRNA的小胞體利用脂轉染法(lipofection)導入至既定的細胞。由此，所得細胞例如靜脈內、動脈內等全身投予。
本發明之藥劑，於安全的投予量範圍內，對於包含人類的哺乳動物，投予必要量(有效量)。本發明的藥劑投予量，考慮劑型種類、投予方法、患者的年齡或體重、患者的症狀等，最終可由醫師或獸醫師的判斷而適宜決定。再者，為了將siRNA或shRNA導入至目的之組織或器官，亦可使用市售之基因導入套組(例如Adeno Express：Clontech公司)。
再者，本發明係關於克隆氏症、潰瘍性大腸炎的治療方法，包含對個體(例如，患者等)或細胞組織投予本發明 之RNA或DNA，或本發明之藥劑之步驟。
本發明的方法中之個體，較佳為人類，但無特別限制，亦可為非人類動物。
對個體的投予，一般而言，例如，可經由使用內視鏡之局部投予(例如，對大腸或直腸黏膜下的投予)、動脈內注射、靜脈內注射、皮下注射等此項技術領域者所習知的方法進行。投予量，係根據對象者(患者等)的體重或年齡、投予方法等而變動，此項技術領域者可適宜選擇適當的投予量。
進一步地，本發明係關於本發明的RNA或DNA，或本發明的藥劑，使用於克隆氏症、潰瘍性大腸炎的治療劑的製造。
又，本說明書中所引用之全部的先前技術文獻，以參考方式併入本文。
【實施例】
以下，利用實施例進一步具體說明本發明。惟，本發明的技術範圍不限定為該等實施例者。
又，本實施例中所使用之「抗CHST15 siRNA」係序列編號：3及4所揭示之RNA所雜交之構造的siRNA。
[目的]
研究對於以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發之慢性大腸炎模式小鼠之抗CHST15 siRNA的治療效果。本模式係顯示黏膜層至黏膜下層的炎症性纖維化病變的模式，由於與在克隆氏症患者中所確認的伴隨黏膜下層的肥厚之炎症性纖維化病變一致的事實，可進行對於相同病變的治療效果評估。
[方法]
自2.5% DSS的攝取開始第6日(Day 5)變更為通常飲水，第7日(Day 6)以小鼠大腸單位體積25nM、250nM、2500nM之抗CHST15 siRNA，投予至大腸黏膜下(圖1)。於第12日(Day 11)與第20日(Day 19)進行解剖，進行CHST15基因表現及大腸羥脯胺酸(hydroxyproline)量的測定。詳細的條件示於以下的表1至6。
試驗設計如圖1所示。具體而言，首先於C57BL/6J小鼠自Day 0至Day 5為止投予2.5%DSS溶液(低用量的抗CHST siRNA、中用量的抗CHST siRNA、高用量的抗CHST siRNA、對照及陰性對照各群)，或精製水(無處置)。
Day 0至Day 6間，每日觀察體重分數、下痢糞便分數、血便分數。體重分數、下痢糞便分數及血便分數，依據表1、8、9分別算出，其合計值作為疾病活性分數(Disease Activity Score(DAI))。一般狀態係於Day 0日至Day 19間，每日觀察。
投予日(Day 6)及犧牲日(Day 11及Day 19)，使用內視鏡拍攝全部動物的照片。為了確認抗CHST15 siRNA對於大腸炎的效果，由各個體的肛門部位拍攝0.5cm、1.0cm、1.5cm的照片3張。關於Day 6及Day 19的全部照片，根據Segmental SES-CD分數法給予分數。SES-CD分數係開發作為感度高的內視鏡指數，使用於臨床診斷。Segmental SES-CD分數的基準係 如表10所示。
此次試驗中，由肛門0.5至1.5cm的直腸部位，經由Segmental SES-CD分數的評估，總點數為12點。
[Day 11及Day 19的最終觀察]
1.採血方法
施行以下表11的條件進行採血。
2.基因表現解析的方法
(1)RNA抽取
基因表現解析用的直腸樣品浸漬於RNAlater(Lot No.108K0483，SIGMA Alderich)，保存於4℃。該樣品使用RNAiso Plus(Takara)均質化，經酚/氯仿處理後，所採取的分解物注入RNA fast pure kit(Lot No.1001，Takara)匣，於室溫經由8000 x g、1分鐘的離心，使核酸吸附至匣。於匣注入10% EtOH WB溶液750μL，於室溫經由8000 x g、1分鐘的離心洗淨匣。注 入EB溶液30μL，於室溫培育4分鐘後，於室溫經由8000 x g、1分鐘的離心，由匣溶出總RNA。藉由測定所得總RNA的吸光值算出總RNA濃度(1OD=40μg/mL total RNA)。
(2)反轉錄反應及即時RT-PCR
總RNA溶液稀釋為1000ng/μL作為定量用樣品，使用隨機的6個鹼基引子以示於下表的反應條件進行反轉錄反應。對於所得cDNA為模板的標的基因(小鼠CHST15)使用即時PCR用引子，進行相對定量的即時RT-PCR。使用檢量線用的陰性對照群的cDNA，製作由10ng/μL至4倍的稀釋系列。再者，使用對於小鼠β肌動蛋白的引子，相同樣品同樣地進行測定。小鼠CHST15基因的表現，以β肌動蛋白的表現量校正，以無處置群作為1的相對表現量顯示。即時RT-PCR反應，係根據SYBR Premix ExTaq II(Perfect Real Time)的方案，使用即時RT-PCR装置Thermal Cycler Dice Real Time System以表12及13所示反應條件進行。
3. 羥脯胺酸測定的方法
計量羥脯胺酸測定用的直腸樣品後，添加2N的NaOH，使用Block incubator(ASTEC)於65℃進行10分鐘加熱處理。由此所得腸溶解物，取10μL使用BCA assay kit(Lot No.LD144450、Thermoscientific)測定蛋白質量，其餘部份以121℃、20分鐘高溫高壓滅菌處理，進行熱鹼分解。於熱鹼分解的樣品添加6N HCl，以121℃、20分鐘高溫高壓滅菌處理進行水解後，添加活性碳-4N NaOH溶液、乙酸-檸檬酸緩衝液中和。離心所得樣品，回收上清部份。所得上清部份添加混合氯胺T(CHLORAMINE-T)試劑，於室溫反應25分鐘，其次添加混合艾利希試劑(Ehrlich's reagent)，於65℃加熱20分鐘後，冰冷5分鐘。於4℃離心後，所得上清部份150μL分注於96孔盤，使用Power wave XS(Biotek)測定560nm的吸光度。樣品中的羥脯胺酸量，藉由使用羥脯胺酸的標準溶液所製作之檢測線，使用4-參數法算出。所得羥脯胺酸量以蛋白質濃度校正。
[統計解析]
試験結果以平均值±SD表示。全部的檢定係使用Bonferroni multiple comparison test(PRISM software)。P<0.05時為統計學上顯著。
[成績]
1.一般症狀
無處置群以外的群組，Day 1至Day 2以後觀察到豎毛。全部個體的試驗期間中，未觀察到病理狀態以外的一般症狀的異常。
2.基因表現解析(圖2)
與無處置群(N)比較，對照群及陰性對照群(C)中，Day 11及Day 19均確認CHST15基因的表現上升。抗CHST15 siRNA投予群中，與陰性對照群的表現量比較，確認CHST15基因表現的下降。Day 19中，亦確認濃度依賴性的傾向。
無處置群(N)中CHST15基因表現量作為基線(0%)、陰性對照群(C)的平均值設定為100%時，抗CHST15 siRNA的平均擊倒(knockout)效率(%)如表14所示。
3.羥脯胺酸測定(圖3)
與無處置群(N)比較，對照群及陰性對照群(C)中，Day 11及Day 19均確認大腸羥脯胺酸量的增加傾向。Day 19中，抗CHST15 siRNA投予群(250nM及2500nM)確認大腸羥脯胺酸量的下降。亦確認濃度依賴性的傾向。
陰性対照群(C)中大腸羥脯胺酸量的平均值設定100%時之因抗CHST15 siRNA所致之平均下降率(%)如表15所示。
4.Segmental SES-CD分數(圖4)
陰性對照群中，與Day 6相比，Day 19確認Segmental SES-CD分數的減少傾向。Day 19中，全部濃度的抗CHST15 siRNA投藥群較陰性對照群確認Segmental SES-CD分數的顯著降低。濃度依賴性不明確。
[結論]
以2.5% DSS誘發之慢性大腸炎模式小鼠中，於大腸黏膜下投予抗CHST15 siRNA的25、250、2500nM投予用量時，雖然未明確地顯示濃度依賴性，但確認CHST15的基因表現量下降。抗CHST15 siRNA的250、2500nM之Day 19中，確認大腸羥脯胺酸含量的下降，經由目標基因之CHST15基因表現抑制，而顯示抗纖維化效果。
【產業上可利用性】
本發明之抗CHST15 siRNA，於大腸顯示CHST15的基因表現抑制及羥脯胺酸量的下降效果。再者，臨床上最重要的觀察項目之Segmental SES-CD分數顯示顯著的抑制效果。由此結果可知，本發明之抗CHST15 siRNA於慢性大腸炎模式小鼠中，對於以炎症與纖維化為基礎之內視鏡病變的改善顯示明確的有效性。
<110> STELIC INSTITUTE & CO.
<120> 黏膜治癒促進劑
<130> S10-A1201P-TW
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的siRNA序列
<400> 1
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的siRNA序列
<400> 2
<210> 3
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的siRNA序列
<400> 3
<210> 4
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的siRNA序列
<400> 4
<210> 5
<211> 4713
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (514)..(2199)
<400> 5
<210> 6
<211> 561
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6

Claims (1)

  1. 一種(i)包含包括序列編號：1揭示的鹼基序列的RNA及包括與該RNA互補的序列之RNA所雜交的構造之抑制CHST15基因表現之siRNA、(ii)3’末端具有2個核酸突出(overhang)的構造之(i)之siRNA、或(iii)可表現(i)或(ii)之siRNA之DNA表現載體作為有效成分之用途，其係用於製備內視鏡的黏膜治癒或內視鏡的潰瘍性治癒之醫藥組成物，其中該有效成分係投予至黏膜下。
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