JP2016520572A - ビタミンd受容体/smadゲノム回路は線維化反応を制御する - Google Patents
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Abstract
本開示は、ナノ粒子およびビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物(例えば、VDRアゴニスト)を含む組成物、ならびに上皮細胞または星細胞などの細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の保持または貯蔵を増加させるためにそのような化合物を使用する方法を提供する。このような方法は線維症を処置または予防するために使用できる。ナノ粒子であって、その表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−6−リン酸修飾アルブミン、脂肪酸エステル、レチニルエステルまたは直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーのうちの1つまたは複数を含むナノ粒子、および該ナノ粒子にあるまたは該ナノ粒子に結合するビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物を含む、組成物。
Description
関連出願の引用
本願は、2013年4月24日に出願した米国仮出願第61/815,575号に対する優先権を主張する。米国仮出願第61/815,575号は、本明細書に参考として援用される。
本願は、2013年4月24日に出願した米国仮出願第61/815,575号に対する優先権を主張する。米国仮出願第61/815,575号は、本明細書に参考として援用される。
分野
本開示は、ナノ粒子およびビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物(例えば、VDRアゴニスト)を含む組成物、ならびに例えば線維症を処置または予防するために例えば細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵を保持するまたは増加させるためにこのような化合物を使用する方法を提供する。
本開示は、ナノ粒子およびビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物(例えば、VDRアゴニスト)を含む組成物、ならびに例えば線維症を処置または予防するために例えば細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵を保持するまたは増加させるためにこのような化合物を使用する方法を提供する。
政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたDK057978、HL105278、DK090962、HL088093、ES010337およびCA014195下で政府支援によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたDK057978、HL105278、DK090962、HL088093、ES010337およびCA014195下で政府支援によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
背景
細胞外マトリックス(ECM)の過剰な蓄積ならびにその結果として起こる柔軟性および肝機能の損失によって定義される肝線維症は、急性または慢性のいずれかの肝臓傷害によって引き起こされる創傷治癒反応の結果である(BatallerおよびBrenner、2005年;Hernandez-GeaおよびFriedman、2011年;LeeおよびFriedman、2011年)。先進国において線維症をもたらす肝臓傷害の主原因には、慢性肝炎ウイルス(HBV/HCV)感染、アルコール乱用および次第に増えてきている非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が含まれる(Friedman、1999年、2003年;FriedmanおよびBansal、2006年;Siegmundら、2005年)。持続性の傷害と共に、線維状コラーゲンの進行性の沈着が存在し、最終的に、肝硬変の組織学的特徴である、コラーゲンバンドによって囲まれる実質小結節をもたらす(BatallerおよびBrenner、2005年;Friedman、2003年)。
細胞外マトリックス(ECM)の過剰な蓄積ならびにその結果として起こる柔軟性および肝機能の損失によって定義される肝線維症は、急性または慢性のいずれかの肝臓傷害によって引き起こされる創傷治癒反応の結果である(BatallerおよびBrenner、2005年;Hernandez-GeaおよびFriedman、2011年;LeeおよびFriedman、2011年)。先進国において線維症をもたらす肝臓傷害の主原因には、慢性肝炎ウイルス(HBV/HCV)感染、アルコール乱用および次第に増えてきている非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が含まれる(Friedman、1999年、2003年;FriedmanおよびBansal、2006年;Siegmundら、2005年)。持続性の傷害と共に、線維状コラーゲンの進行性の沈着が存在し、最終的に、肝硬変の組織学的特徴である、コラーゲンバンドによって囲まれる実質小結節をもたらす(BatallerおよびBrenner、2005年;Friedman、2003年)。
慢性肝臓疾患および肝硬変は主要な世界の健康上の懸念を代表する(BatallerおよびBrenner、2005年)。豪州およびUKにおいて、慢性肝臓疾患は、心臓疾患、がん、脳卒中および胸部疾患に続いて5番目に多い死因である(Williams、2006年)。USにおいて、それらは8番目に多い死亡原因としてランク付けされている(Kimら、2002年)。現在、慢性肝臓疾患に対する抗線維化治療でFDAに承認されているものはなく(Cohen-NaftalyおよびFriedman、2011年)、肝臓疾患の基礎をなす原因が改善できない場合、治療選択肢は、門脈圧亢進症、肝細胞癌および肝不全などの、結果として生じる合併症に対処することに限られる。したがって、肝臓における肝臓線維形成反応を調節する分子機構のより深い理解が、成功する抗線維化治療のための新規標的を同定するために必要とされる。
肝臓線維症における中心的なプレーヤーは肝星細胞(HSC)などの非実質細胞(NPC)であり(BatallerおよびBrenner、2005年;Bouwensら、1992年)、これはECMの主要な生産者である(Friedman、2008年;Friedmanら、1985年;Reynaertら、2002年)。健康な肝臓において、HSCは、類洞内皮と肝細胞との間のディッセ腔に位置するレチノイド(ビタミンA)貯蔵細胞である(Friedman、2008年)。傷害後、パラクリン刺激により、HSCは(活性化と呼ばれるプロセスにおいて)劇的な表現型変化を受け、それによりそれらは、ケモカイン、サイトカインおよび病理学的細胞外マトリックス構成成分の分泌を伴う、増殖、収縮性およびレチノイド貯蔵の損失を示す(Friedman、2008年;Geerts、2001年)。このプロセスを調節する正確な機構はまだ解明されていないが、形質転換成長因子β1(TGFβ1)シグナル伝達が、ECM合成の原因となる最も効力のある線維化促進(pro-fibrotic)経路のうちの1つとして認識されている(Breitkopfら、2006年;InagakiおよびOkazaki、2007年)。
TGFβは、細胞分裂、分化、移動、接着、組織化および死に対して大きな効果を有する多機能サイトカインである。TGFβの3つの主要なアイソフォーム(TGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3)が存在し、TGFβ1は肝臓線維症に関与する主なアイソフォームである(InagakiおよびOkazaki、2007年)。肝臓傷害後、パラクリンおよびオートクリン源の両方に由来するTGFβ1はHSCの細胞表面上のI型およびII型セリン/トレオニン受容体キナーゼと結合する(InagakiおよびOkazaki、2007年)。その後、その下流エフェクターであるSMAD2およびSMAD3がリン酸化され、サイトゾル内に放出され、それらがSMAD4と複合体を形成する。このSMAD複合体は次いで、核内に移行し、ゲノム上のSMAD結合エレメント(SBE)を認識し、標的遺伝子を直接調節する(FengおよびDerynck、2005年;Massagueら、2005年)。したがって、HSCにおけるTGFβ−SMAD転写ネットワークを解明し、それが細胞外および細胞内因子によりどのように制御され得るかを理解することは、効果的な抗線維化戦略の開発にとって重要である。
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概要
肝臓機能におけるビタミンDについての生理的役割は、肝臓における低レベルのVDR発現に起因して長い間、退けられていたが(Bookoutら、2006年;Hanら、2010年)、本明細書においてVDRは肝臓線維症のモジュレーターであることが示される。例えば、肝傷害の標準的なマウスモデルにおいて、合成VDRアゴニストカルシポトリオールの投与はコラーゲン沈着および線維化遺伝子発現の両方を減少させる。また、Vdrノックアウトマウスが、自然発生する肝臓線維症を発症することも示され、正常な肝臓恒常性におけるこの受容体の役割を証明している。機構研究により、VDRシグナル伝達の活性化が、肝星細胞(HSC)における線維化促進遺伝子に対する広範囲のTGFβ/SMAD依存性転写反応に拮抗することが明らかにされた。VDRおよびSMAD3のゲノム−ワイド結合部位のマッピングにより、線維化促進遺伝子のcis−調節エレメント上のこれらの転写因子の重複するDNA占有率が明らかになった。加えて、TGFβ−SMADシグナル伝達は、これらのゲノム遺伝子座とのリガンドVDRの接近性を向上させ、これは同様にSMAD3の動員に拮抗した。この動的VDR/SMADゲノムフィードバック回路は肝線維形成を調節するための以前に認識されていない機構を表す。
肝臓機能におけるビタミンDについての生理的役割は、肝臓における低レベルのVDR発現に起因して長い間、退けられていたが(Bookoutら、2006年;Hanら、2010年)、本明細書においてVDRは肝臓線維症のモジュレーターであることが示される。例えば、肝傷害の標準的なマウスモデルにおいて、合成VDRアゴニストカルシポトリオールの投与はコラーゲン沈着および線維化遺伝子発現の両方を減少させる。また、Vdrノックアウトマウスが、自然発生する肝臓線維症を発症することも示され、正常な肝臓恒常性におけるこの受容体の役割を証明している。機構研究により、VDRシグナル伝達の活性化が、肝星細胞(HSC)における線維化促進遺伝子に対する広範囲のTGFβ/SMAD依存性転写反応に拮抗することが明らかにされた。VDRおよびSMAD3のゲノム−ワイド結合部位のマッピングにより、線維化促進遺伝子のcis−調節エレメント上のこれらの転写因子の重複するDNA占有率が明らかになった。加えて、TGFβ−SMADシグナル伝達は、これらのゲノム遺伝子座とのリガンドVDRの接近性を向上させ、これは同様にSMAD3の動員に拮抗した。この動的VDR/SMADゲノムフィードバック回路は肝線維形成を調節するための以前に認識されていない機構を表す。
これらの観察に基づいて、ナノ粒子ならびに細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵のうちの1つまたは複数を増加させる化合物などの、ビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物を含む組成物が本明細書に提供される。ナノ粒子はビタミンDアゴニストを肝臓、膵臓または腎臓に送達するために使用され得る。一例において、ナノ粒子には、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−6−リン酸修飾アルブミン(例えば、ナノ粒子を肝星細胞に対して標的化するために、例えば、Liら、J. Pharm. Pharmacol. 2009年、61巻(9号):1155〜61頁を参照のこと)、脂肪酸エステルまたはレチニルエステルのうちの1つまたは複数が含まれる。このような作用物質は、(例えば、これらの作用物質の1つまたは複数で被覆された)ナノ粒子の表面に存在してもよい。いくつかの例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子である。ナノ粒子中またはナノ粒子上に存在してもよいVDRアゴニストの例には、限定されないが、ビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD受容体リガンド、ビタミンD受容体アゴニスト前駆体およびそれらの組合せが含まれる。開示される組成物は、化学療法剤(例えば、ゲムシタビン)、生物製剤(例えば、モノクローナル抗体)またはそれらの組合せなどの他の治療剤を含んでもよい。
上皮細胞または星細胞などの細胞においてビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するために治療有効量の開示される組成物を使用する方法もまた、提供される。このような方法はin vitroまたはin vivoで実施されてもよい。例えば、治療有効量の組成物は投与を必要とする被験体に投与されてもよく、それにより被験体における上皮細胞および/または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持することができる。いくつかの例において、被験体は、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症/肝硬変、胆管線維症/胆汁性肝硬変、肝臓がん、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫(angiosarcoma)、血管肉腫(hemangiosarcoma)、膵臓線維症、膵管腺癌(PDA)または腎臓の線維症のうちの1つまたは複数などの肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患を有する。
星細胞(肝臓星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎臓星細胞など)によるVDRの発現を増加させる方法もまた、提供される。このような方法は、星細胞(stellate)を、VDRアゴニストとVDRとの結合を少なくとも10倍向上させるのに十分な量のVDRアゴニストと接触させるステップを含んでもよい。
本開示はまた、肝臓、膵臓または腎臓線維症などの線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、星細胞(肝臓星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎臓星細胞など)を、1種または複数の試験作用物質および必要に応じてTGF−β1と接触させるステップを含んでもよい。その後、星細胞によるVDRアゴニストの産生、星細胞によるCYP24A1の産生もしくは発現、星細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾(リン酸化)もしくは発現、VDRアゴニストのVDRへの結合またはそれらの組合せが検出される。1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるVDRアゴニストの産生を少なくとも5倍増加させる、1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるCYP24A1の産生を少なくとも5倍増加させる、1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて星細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾(リン酸化)もしくは発現を少なくとも1.5倍減少させる、またはそれらの組合せとなる試験作用物質が選択される。選択される試験作用物質は線維症を処置できる作用物質である。いくつかの例において、方法はまた、1種または複数の試験作用物質がin vitroまたはin vivoで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップを含む。
本開示の上述および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する、以下の詳細な記載からより明らかになる。
配列表
核酸配列は37C.F.R.1.822に定義されているヌクレオチド塩基についての標準的な省略文字を使用して示される。各々の核酸配列の一本鎖のみが示されるが、示された鎖に対する任意の参照により相補鎖が含まれることは理解される。
核酸配列は37C.F.R.1.822に定義されているヌクレオチド塩基についての標準的な省略文字を使用して示される。各々の核酸配列の一本鎖のみが示されるが、示された鎖に対する任意の参照により相補鎖が含まれることは理解される。
配列番号1〜34は様々な遺伝子の発現を測定するために使用されるプライマー配列である。
詳細な説明
用語および方法の以下の説明は、本開示をより良く記載し、当業者に本開示の実施の指針を示すために提供される。単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その」は、文脈が他のことを明確に示さない限り、1つまたは1つ超を指す。例えば、「細胞を含む」という用語は、単一または複数の細胞を含み、「少なくとも1つの細胞を含む」という語句と等価とみなされる。「または」という用語は、文脈が他のことを明確に示さない限り、述べられている代替のエレメントの単一のエレメントまたは2つまたはそれ超のエレメントの組合せを指す。本明細書に使用される場合、「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。したがって、「AまたはBを含む」は、追加のエレメントを排除せずに「A、BまたはAおよびBを含む」ことを意味する。本明細書に参照される全てのGenBank(登録商標)受託番号は2014年4月24日に利用可能となった配列に関して参照により組み込まれる。本明細書に引用される特許および特許出願ならびにGenBank(登録商標)受託番号を含む、全ての参考文献は参照により組み込まれる。
用語および方法の以下の説明は、本開示をより良く記載し、当業者に本開示の実施の指針を示すために提供される。単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その」は、文脈が他のことを明確に示さない限り、1つまたは1つ超を指す。例えば、「細胞を含む」という用語は、単一または複数の細胞を含み、「少なくとも1つの細胞を含む」という語句と等価とみなされる。「または」という用語は、文脈が他のことを明確に示さない限り、述べられている代替のエレメントの単一のエレメントまたは2つまたはそれ超のエレメントの組合せを指す。本明細書に使用される場合、「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。したがって、「AまたはBを含む」は、追加のエレメントを排除せずに「A、BまたはAおよびBを含む」ことを意味する。本明細書に参照される全てのGenBank(登録商標)受託番号は2014年4月24日に利用可能となった配列に関して参照により組み込まれる。本明細書に引用される特許および特許出願ならびにGenBank(登録商標)受託番号を含む、全ての参考文献は参照により組み込まれる。
他のことを説明されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料が本開示の実施または試験に使用されてもよいが、好適な方法および材料が以下に記載される。材料、方法および例は例示のみであり、限定することを意図していない。
本開示の実施または試験に好適な方法および材料は以下に記載される。しかしながら、提供される材料、方法および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。したがって、他のことを記載している場合を除いて、本開示の方法および技術は、記載されているものと類似もしくは等価の方法および材料に従って、ならびに/または当技術分野において周知であり、本明細書全体を通して引用され、論じられている様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されている従来の方法に従って実施されてもよい。
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される:
投与:本明細書に提供される組成物は、経口、経鼻、吸入、直腸、膣、経皮および非経口投与などの、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、それを必要とする被験体に送達されてもよい。一般に、非経口製剤は、摂取を除く任意の可能な様式を介して投与されるものである。この用語はまた、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、関節内、腫瘍内または皮下に投与されるかどうかに関わらず注射、ならびに例えば、鼻腔内、吸入、皮内および局所適用を含む、様々な表面適用を指す。
接触:ある作用物質を別の作用物質に近接させることにより、それらの作用物質が相互作用することを可能にすること。例えば、ナノ粒子およびVDRアゴニストを含有する組成物が細胞(例えば組織培養物中)に適用されてもよいか、または被験体に投与されてもよく、それによりナノ粒子/VDRアゴニストがin vitroまたはin vivoで細胞と相互作用することを可能にする。
線維症:器官または組織の正常な構成要素としての線維化組織の形成とは対照的に、修復または反応プロセスとしての器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成または発生を指す。線維症という用語は、少なくとも肝臓/肝線維症、腎臓/腎線維症および膵臓線維症を含む。特定の例において、本明細書において処置される被験体は肝臓線維症などの線維症を有する。
肝線維症は、異常な細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の蓄積および結果として起こる肝機能の損失であり、慢性肝臓傷害により引き起こされる炎症により駆動される創傷治癒プロセスを伴う(BatallerおよびBrenner 2005年 J Clin Invest.、115巻(2号):209〜18頁)。線維症をもたらす肝臓傷害の一般的な原因には、慢性C型肝炎ウイルス(HCV)感染症、アルコール乱用、慢性B型肝炎感染症(HBV)および座りがちな生活様式が増加している状況において肥満および関連するインスリン抵抗性を上昇させる肝代謝結果を表す、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が含まれる(BatallerおよびBrenner 2005年 J Clin Invest.、115巻(2号):209〜18頁;Friedman 1999年 Am J Med.、107巻(6B号):27S〜30S頁;Siegmundら、2005年 Dig Dis.、23巻(3〜4号):264〜74頁;Friedman & Bansal Hepatology.、43巻(2号 補遺1):S82〜8頁)。肝傷害によって生じる炎症プロセスは、細胞修復、再生、増加した細胞外マトリックス代謝回転、および最終的に一部の患者において重篤な線維症を含む、様々な細胞反応を引き起こす。肝臓の進行性線維症は最終的に、肝硬変、肝臓機能の損失(非代償性肝硬変)、門脈圧亢進症および肝細胞癌を生じ得る(Bataller & Brenner 2005年 J Clin Invest. 115巻(2号):209〜18頁;Friedman 2003年 J. Hepatol. 38巻(補遺1):S38〜S53頁)。
理論によって束縛されないが、肝線維形成は、壊死細胞またはアポトーシス細胞を置きかえるために実質細胞が増殖する、継続した肝臓傷害後に起こる創傷治癒プロセスの結果であると考えられる。このプロセスは炎症反応およびECMの制限された沈着と関連する。肝傷害が持続する場合、最終的に肝細胞は、線維状コラーゲンを含む、豊富なECM構成成分で置きかえられる。肝臓の小葉構築物内のこの線維性物質の分布は肝臓傷害の起源に依存する。慢性ウイルス性肝炎および慢性胆汁鬱滞性障害において線維化組織は最初に門脈路周囲に位置するのに対して、アルコール性肝臓疾患およびNASHにおいて線維化組織は中心周辺および類洞周囲領域に見出される(Friedman 2003年 J. Hepatol.、38巻(補遺1):S38〜S53頁;Popper & Uenfriend 1970年. Am. J. Med.、49巻:707〜721頁)。線維化肝臓疾患が進行するにつれて、病状が、単離されたコラーゲンバンドから架橋線維症(bridging fibrosis)、および最終的にI型コラーゲンバンド内に封入される肝細胞の再生結節を伴う確立された肝硬変へ進む(Popper & Uenfriend 1970年. Am. J. Med.、49巻:707〜721頁)。
腎線維症は、透析または腎臓移植の必要性をもたらす一次後天性病変として顕著な罹患率および死亡率の原因となる。腎線維症は、腎臓の機能単位である、ネフロンの濾過または再吸収構成成分のいずれかにおいて起こり得る。実験モデルは、腎瘢痕化、特に糸球体濾過の自己調節に関与する生理の障害の一因となる多くの因子が同定された。このことは次に、蓄積された細胞外マトリックス(ECM)での正常な構造物の置きかえをもたらす。個々の細胞の生理の様々な変化は、瘢痕化を支持するためにECM合成と分解との間の平衡の変化を刺激する多数のペプチド線維(fibrogen)および非ペプチド線維の産生をもたらす。末期の腎疾患(ESRD)のほとんど全ての形態は重篤な腎線維症によって特徴付けられる。
膵臓の線維症は慢性膵炎の様々な病因のうちの特有の特徴であり、壊死/アポトーシス、炎症および管閉塞のようなプロセスによって引き起こされる。膵臓における線維形成を誘導する初期事象は、間質間葉細胞、導管細胞および/または腺房細胞に関与し得る傷害である。膵臓のこれらの組織区画のいずれか1つに対する障害は、常在する線維芽細胞/膵臓星細胞の筋線維芽細胞へのサイトカイン誘発性形質転換ならびにその後の細胞外マトリックスの産生および沈着と関連する。膵臓および関与する組織区画における傷害部位に応じて、主に小葉間(辺縁)線維症(inter(peri)lobular fibrosis)(慢性アルコール性膵炎のような)、管周囲線維症(遺伝性膵炎のような)、管周囲および小葉間線維症(自己免疫性膵炎のような)またはびまん性小葉間および小葉内線維症(閉塞性慢性膵炎のような)が発症する。
肝星細胞(HSC):肝臓の類洞周囲腔(類洞と肝細胞との間の小領域)に見出される周皮細胞を含む。肝星細胞は肝臓線維症に関与する主要な細胞型であり、これは肝臓障害に反応する瘢痕組織の形成である。星細胞は塩化金で選択的に染色され得るが、通常の組織学的調製物におけるそれらの静止(非活性化)状態におけるそれらの際立った特徴は、紫外(UV)光に曝露された場合、自己蛍光を発する、それらの細胞質内の複数のビタミンAリッチ脂質滴の存在である。
正常な肝臓において星細胞は静止状態で存在する。静止星細胞は肝臓細胞の総数の5〜8%を表す。各細胞は、細胞体から延び、類洞に巻き付く数個の長い突起部を有する。細胞体内の脂質滴はビタミンAを貯蔵する。理論によって束縛されないが、静止肝星細胞は、生理的(正常)ECM産生および代謝回転において役割を果たし、さらに、肝臓に常在する抗原提示細胞として作用し、脂質抗原をNKT細胞に提示し、NKT細胞の増殖を刺激すると考えられる。
肝臓が障害を受ける場合、星細胞は活性化した状態に変化し得る。活性化した星細胞は、増殖、収縮性および走化性によって特徴付けられる。貯蔵されるビタミンAの量は肝臓傷害において徐々に減少する。活性化した星細胞はまた、分泌過剰および病的ECM構成成分の原因となり、さらに、マトリックス分解酵素の産生を減少させ、これにより線維症をもたらす。
高カルシウム血症:血液中の上昇向上したカルシウムレベルは、例えば、上昇したレベルの1α,25(OH)2−VitD3(正常範囲:約8.5〜10.5mg/dLまたは2.2〜2.6mmol/L)によって引き起こされ得る。これは、過剰な骨格カルシウム放出、増加した腸管でのカルシウム吸収または低下した腎臓でのカルシウム排泄に起因し得る。
高カルシウム血症自体は、疲労、うつ、錯乱、食欲不振、吐き気、嘔吐、便秘、膵炎または排尿増加をもたらし得る。心拍リズムの異常も生じる可能性があり、短いQT間隔および拡大したT波のEKG所見は高カルシウム血症を示唆している。
症状は高カルシウムレベル(12.0mg/dLまたは3mmol/l)においてより一般的である。重度の高カルシウム血症(15〜16mg/dL超または3.75〜4mmol/l超)は医学的緊急事態とみなされ:これらのレベルにおいて、昏睡および心停止が生じる可能性がある。
単離された:「単離された」生物学的構成成分(核酸分子、ペプチドまたは細胞など)は、混合試料(細胞抽出物など)中の他の生物学的構成成分から精製されている。例えば、「単離された」ペプチドまたは核酸分子は、ペプチドまたは核酸分子が存在している細胞(組換えペプチドまたは核酸分子についての発現宿主細胞など)の他の構成成分から分離されているペプチドまたは核酸分子である。
薬学的に許容される担体:本開示に有用な薬学的に許容される担体は従来の通りである。E. W. MartinによるRemington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第15版(1975年)は、本明細書に開示される組成物の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。例えば、本明細書に提供される組成物は1種または複数の薬学的に許容される担体の存在下で投与されてもよい。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理的に許容される流体を含む注射可能な流体、例えば、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む。固体組成物(例えば、粉剤、丸薬、錠剤またはカプセル形態)に関して、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含んでもよい。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有してもよい。他の医薬組成物の実施形態は、当業者に公知であるような従来の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび対イオンを用いて調製されてもよい。いくつかの実施形態において組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、粉剤、溶液剤または懸濁剤などの固体、半固体および液体剤形において単位用量の形態である。
SMAD3(デカペンタプレジックホモログ3に対する起源):OMIM603109。SMAD3核酸分子およびタンパク質を含む。SMAD3タンパク質は大いに細胞に関与し、TGFβシグナルをモジュレートする。SMAD3配列は、例えば、GenBank(登録商標)配列データベースから公的に利用可能である(例えば、受託番号NP_001138574.1およびAAB81755.1は例示的なSMAD3タンパク質配列を提供するのに対して、受託番号AH011390.1、NM_001145102.1およびAF016189.1は例示的なSMAD3核酸配列を提供する)。当業者は、SMAD3生物活性を保持するSMAD3バリアント(これらの公的に利用可能な配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するか、またはSMAD3の成熟形態とこのような量を有するこれらのバリアント配列など)を含む、さらなるSMAD3核酸配列およびタンパク質配列を同定できる。
被験体:ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む分類である、生存している多細胞脊椎動物。本明細書に開示される方法および組成物は、医学的および獣医学的状況において同等の用途を有する。したがって、「被験体」という一般用語は、限定されないが、ヒトまたは他の霊長類(サルを含む)、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなどの獣医学的被験体を含む、全ての動物を含むことが理解される。一例において、被験体は、肝臓、膵臓または腎臓の線維症を発症する危険性を有するか、または危険性がある被験体である。
治療有効量:単独または他の薬剤と組み合わせた治療剤(VDRアゴニストを含む本明細書に提供される組成物など)の量は、疾患の進行を予防し、疾患の退縮を引き起こすのに十分であるか、または肝臓、膵臓もしくは腎臓の線維症と関連する症状、例えば、発熱、呼吸器症状、線維化内容物(fibrotic content)、疼痛もしくは腫れなどの疾患によって引き起こされる症状を緩和できる。一例において、治療有効量は、線維症の症状を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも70%または少なくとも90%減少させるのに十分なVDRアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量である。一例において、治療有効量は、上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の量を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも70%または少なくとも90%増加させるのに十分なVDRアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量である。一例において、治療有効量は、上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の量を保持するのに十分なVDRアゴニストおよびナノ粒子を含む本明細書に提供される組成物の量であり、このような量は,10%以下、5%以下または1%以下など、20%超まで低下させない。
形質転換成長因子ベータ1(TGF−β1):OMIM 190180。TGF−β1核酸分子およびタンパク質を含む。TGFβ−1タンパク質は細胞の成長および分裂(増殖)、細胞が特定の機能(分化)、細胞運動(運動性)および細胞の自滅(アポトーシス)を実施するために成熟するプロセスを制御するのに役立つ。TGF−β1配列は、例えば、GenBank(登録商標)配列データベースから公的に利用可能である(例えば、受託番号NP_000651.3およびNP_035707.1は例示的なTGF−β1タンパク質配列を提供するのに対して、受託番号NM_000660およびNM_011577は例示的なTGF−β1核酸配列を提供する)。当業者は、TGF−β1生物活性を保持するTGF−β1バリアント(これらの公的に利用可能な配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するか、またはTGF−β1の成熟形態とこのような量の同一性を有するこれらのバリアント配列など)を含む、さらなるTGF−β1核酸配列およびタンパク質配列を同定できる。
疾患を処置する:「処置」とは、疾患または病態(例えば線維症)の兆候または症状が発症し始めた後、それを改善する治療的介入を指す。「予防」とは、例えば、肝臓、膵臓または腎臓の線維症を発症する危険性があったまたは危険性があるヒトなどの、疾患にかかりやすいことが知られているヒトにおいて疾患の完全な発症を阻止することを指す。
ビタミンD:脂溶性セコステロイドプロホルモンおよびホルモンの群、それらの2つの主要な形態はビタミンD2(エルゴカルシフェロール)およびビタミンD3(コレカルシフェロール)であり、それらは、ビタミンDの生理的に活性な形態である、カルシトリオールとしても公知である、1α,25ジヒドロキシビタミンD3(1α,25−(OH)2−D3)に変換される。
ビタミンDアゴニストまたは類似体:VDRリガンド(例えば、カルシトリオール)、VDRアゴニスト前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD前駆体などの、VDRに結合し、活性化する、合成または天然の任意の化合物。
天然および合成のビタミンDアゴニストおよび類似体の特定の非限定的な例には、1α,25(OH)2D3、カルシポトリオール、LG190090、LG9190119、LG190155、LG190176およびLG190178(例えば、Boehmら、(1999年) Chemistry & Biology、6巻:265〜275頁を参照のこと);LY2108491およびLY2109866(Maら、(2006年) J Clin. Invest.、116巻:892〜904頁);2β−(3−ヒドロキシプロポキシ)1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(ED−71)(Tsurukamiら、(1994年) Calcif. Tiss. Int. 54巻:142〜149頁);EB1089(Pepperら、(2003年) Blood、101巻:2454〜2460頁);OCT(22−オキサ−カルシトロール)(Makibayashiら、(2001年) Am. J. Path.、158巻:1733〜1741頁);(1αOH−2,19−nor−25ヒドロキシビタミンD3)および(1,3−デオキシ−2−CHCH2OH−19−nor−25−ヒドロキシビタミンD3)(Posnerら、(2005年) Bioorganic & Medicinal Chemistry、13巻:2959〜2966頁)およびReyら、(1999年) J. Organic Chem.、64巻:3196〜3206頁に開示されているビタミンD類似体のいずれか;ならびにリトコール酸(lithochoic acid)(LCA)およびウルソデオキシコール酸(ursodoxycholic acid)(UDCA)などの胆汁酸誘導体(例えば、Nehringら、(2007年) PNAS、104巻:10006〜10009頁;Makishimaら、(2002年) Science、296巻:1313〜1316頁;Copaciら、(2005年) Rom. J. Gastroenterol.、14巻:259〜266頁を参照のこと)が含まれる。これらの参考文献の各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ビタミンD前駆体:酵素によってビタミンD受容体のアゴニストに変換できる任意の化合物。ある特定の非限定的な例において、その酵素はCYP27B1である。ビタミンD前駆体の特定の非限定的な例には、ビタミンD3(コレカルシフェロール)、25−ヒドロキシ−ビタミンD3(25−OH−D3)(カルシジオール)、ならびにビタミンD2(エルゴカルシフェロール)およびその前駆体が含まれる。
ビタミンD受容体(VDR):核ホルモン受容体(NHR)スーパーファミリーのメンバーであって、それは、カルシウム恒常性および骨格健康の重要な調節因子である(Bouillonら、2008年;Goltzmanら、2004年)。VDRは共通の核受容体構造を有し、例えば、N末端活性化ドメイン、2つの亜鉛フィンガードメインを有するDNA結合領域(DBD)、ヒンジ領域およびリガンド結合ドメイン(LBD)から構成される。VDR活性化遺伝子転写は、インポーチン−αによる初期の核移行、RXRとのヘテロ二量化および標的遺伝子に存在する反応エレメントとの結合を必要とする。VDRは腸および腎臓内のカルシウムおよびリン酸恒常性の維持と関連する遺伝子を調節する。VDR/RXRヘテロ二量体によって開始されるシグナルは、共活性化または共抑制タンパク質の会合によってモジュレートされ、また、核区画内の他のシグナル伝達パートナーにも依存する。VDR/RXRヘテロ二量体は、RXRリガンドの存在または非存在がVDR反応に影響を及ぼすことが知られていないという点で、非許容性である。
NHRスーパーファミリー内のVDRの最も近い構造的および機能的類縁体には、ファルネソイドX受容体(FXR)、構成的アンドロスタン受容体(CAR)およびプレグナンX受容体(PXR)が含まれ、これらの全ては肝臓内の胆汁酸恒常性および生体異物解毒の調節因子である(Bookoutら、2006年;Bouillonら、2008年)。
VDRの内因性活性化因子には、ビタミンDの生物学的に活性な形態(1α,25(OH)2D3(カルシトリオール))ならびにリトコール酸(LCA)およびその誘導体(LCA−アセテート、LCA−ホルメート、3−ケトLCA)などの胆汁酸が含まれる(Makishimaら、2002年;Nagpalら、2005年)。
概説
肝臓線維症は肝星細胞(HSC)のTGFβ1活性化に関与する可逆的創傷治癒反応である。本明細書において、ビタミンD受容体(VDR)リガンドはHSC活性化を阻害し、肝臓線維症を阻害する(abrogate)のに対して、Vdrノックアウトマウスは肝線維症を自然発症することが示される。機構的に、TGFβ1線維化促進傷害によって引き起こされる、HSCにおけるゲノムワイドVDR結合部位(VDRシストローム)の明白な再分配が示される。このTGFβ1誘導性VDRシストロームは、多くのセットの線維化促進遺伝子上で同定された多数のcis調節エレメントにおいて共占有を有するSMAD3結合部位と広範に重なる。VDRリガンドの付加は共調節遺伝子にてSMAD3占有率を減少させ、肝線維形成を調節する交差するVDR/SMADゲノム回路を明らかにする。これらの結果は、肝臓における創傷治癒反応をモジュレートするための内分泌チェックポイントとしてのVDRについての役割を提供し、肝臓線維症ならびに腎臓および膵臓などの他の器官の線維症のための治療としてのVDRリガンドを示す。
肝臓線維症は肝星細胞(HSC)のTGFβ1活性化に関与する可逆的創傷治癒反応である。本明細書において、ビタミンD受容体(VDR)リガンドはHSC活性化を阻害し、肝臓線維症を阻害する(abrogate)のに対して、Vdrノックアウトマウスは肝線維症を自然発症することが示される。機構的に、TGFβ1線維化促進傷害によって引き起こされる、HSCにおけるゲノムワイドVDR結合部位(VDRシストローム)の明白な再分配が示される。このTGFβ1誘導性VDRシストロームは、多くのセットの線維化促進遺伝子上で同定された多数のcis調節エレメントにおいて共占有を有するSMAD3結合部位と広範に重なる。VDRリガンドの付加は共調節遺伝子にてSMAD3占有率を減少させ、肝線維形成を調節する交差するVDR/SMADゲノム回路を明らかにする。これらの結果は、肝臓における創傷治癒反応をモジュレートするための内分泌チェックポイントとしてのVDRについての役割を提供し、肝臓線維症ならびに腎臓および膵臓などの他の器官の線維症のための治療としてのVDRリガンドを示す。
1990年代の初期において正常肝臓および線維化肝臓においてECMを沈着させるための一次エフェクター細胞としてのHSCの確立は肝線維症の病因を理解する際の画期的な発見であった(Friedman、1993年)。それ以来、HSCにおける広範囲の細胞シグナル伝達分子、ホルモン、細胞膜受容体および転写因子が調べられ、肝線維形成を促進することが見出された(Hernandez-GeaおよびFriedman、2011年)。しかしながら、この病理プロセスを能動的に予防する因子およびシグナル伝達カスケードは十分に理解されていない。
本明細書において、VDRの薬理学的活性化が実験動物モデルにおいて肝臓線維症の進行を弱めるのに対して、VDR発現の遺伝子阻害は肝臓線維症の自然発症をもたらし、それにより肝臓において創傷治癒反応を負にモジュレートする内分泌チェックポイントにおいて、VDRに関与することが示される。機構的に、HSCにおける線維形成反応の強度を抑制でき、肝臓内の線維形成を支配することができるVDRおよびSMAD転写因子の反対作用から構成される、以前に認識されておらず、時間的に制御されるゲノム回路が提供される。特に、肝臓傷害に反応して、TGFβ1によるHSC活性化は、核へのSMAD移行およびクロマチンリモデリングによって線維化促進遺伝子発現を誘導する。隣接するビタミンD反応エレメント(VDRE)への到達性を増加させることによって、SMAD活性化は、以前には隠れていたゲノム部位へのVDR動員を促進する。その後、リガンドが結合したVDRはクロマチン上のSMAD存在性に拮抗し、ヒストンH3のアセチル化を損ない、線維化促進遺伝子発現を最終的に抑制する(図14D)。特に、ほぼ10,500のTGFβ1誘導性SMAD結合部位およびTGFβ1誘導性VDR結合部位の位置の近接からクロマチン構造全体を同定し、統合されたVDR/SMADゲノム回路が、肝線維化反応の主要な調節因子として機能することを示す。
TGFβシグナル伝達を阻害するクロマチン基盤の同定は調節標的としてSMAD依存性転写に直接焦点を合わせる。このことは、TGFβ−SMADシグナル伝達が、後生動物生態のほぼ全ての態様において本質的な役割を果たし、その調節不全は、自己免疫から線維症およびがんに及ぶ多様なヒト疾患をもたらし得る(Hernandez-GeaおよびFriedman、2011年;LiおよびFlavell、2008年;Massague、2008年)。VDRとSMADとの間のゲノム拮抗作用のこの所見は、クロマチンインターフェースにてTGFβ−SMADシグナル伝達を弱める第1のDNA結合転写因子としてVDRを確立するだけでなく、「転写クロストーク」のより一般的な概念について特異性(シストロン層(cistromic layer))も加える。
TGFβ−SMAD活性化により、SMAD標的を抑制するためにリガンド結合VDRの後の動員が可能となるという観察は、2つの内因性シグナル伝達経路が互いの活性を交差調節できる手段を明らかにする。したがって、このゲノム中継(genomic relay)は、後でVDRによって阻害されるSMADによる正の活性化を可能にし、それにより相互排他的様式で転写因子間の以前に報告されたゲノムクロストークから高度に同定可能である自己調整ゲノム回路を構成する(Barishら、2010年;Huaら、2009年)。この回路は、正常および線維化の両方の肝臓においてECM合成を組織化する能力をHSCに与えることができる。
TGFβ−SMAD経路に加えて、線維症は、殆ど常に、臨床的に持続する炎症が先行する(Hernandez-GeaおよびFriedman、2011年;LeeおよびFriedman、2011年)。それ故、VDRシグナル伝達に対する広範な抗炎症の役割は肝臓におけるその抗線維化特性のに寄与し得る。これに関して、VDRは炎症反応の中心となるいくつかの細胞型においてその発現について実証されており(Barishら、2005年;Griffinら、2001年;von Essenら、2010年)、VDR自体のビタミンD欠損および多型の両方ならびにビタミンD代謝に関与する遺伝子は炎症性疾患の危険性および重症度の両方に関連している(Agmon-Levinら、2012年;Janssensら、2011年;Mungerら、2006年;Ramagopalanら、2011年)。しかしながら、肝線維形成の文脈においてVDRシグナル伝達の抗炎症作用の役割はほとんど解明されていない。一方で、Vdr−/−マウスにおいて肝臓線維症の自然発症と関連した調節不全炎症反応は、VDRシグナル伝達が抗炎症機構により肝線維形成を制御できることを示す(図3H、右)。他方で、この考えは、Vdr+/−マウスにおいていかなる炎症反応も見出されない中程度の類洞周囲肝臓線維症表現型によって鈍らされる(図3H、中央)。さらに、炎症と線維症との間の引き起こされ得る関係は完全には確立されないままであり、肝線維形成の間の炎症の主要な線維形成促進の役割はTGFβ−SMAD活性化に対してHSCを感受性にするようである(Sekiら、2007年;SekiおよびSchnabl、2012年)。したがって、VDRシグナル伝達の抗炎症特性はその抗線維化機能において主要な役割を果たすことができない。
本明細書における結果は肝臓病態生理においてVDRシグナル伝達の認識されていない機能を明確にする。その非常に低い発現に起因して、VDRは、脂質およびグルコース代謝、薬物の処分、コレステロール流出および胆汁酸恒常性を含む肝機能のほぼ全ての態様に影響を与えるFXR、PXRおよびCARを含む、その高度に発現された同種クレードメンバーよりはるかに注目を集めていない(Bookoutら、2006年;Chawlaら、2001年)。しかしながら、低いビタミンDレベルが、慢性肝臓疾患を有する患者における肝線維症の増加に関連し(Abramovitchら、2011年;LimおよびChalasani、2012年;Pettaら、2010年;Terrierら、2011年)、ビタミンDがラットにおける肝臓線維症を阻害できる(Abramovitchら、2011年)ことを示している最近の研究は、肝VDRについての潜在的な生理的役割を示している。しかしながら、VDRが肝線維形成を直接的または間接的に調節するかどうかおよびどのように調節するかは解決されていないままである。VDRがHSC静止を促進し、TGFβシグナル伝達を制御するという本明細書における観察は、ビタミンDがその抗線維化効果を発揮できる新たな機構を同定する。これらの結果は、VDRにおける多型が、肝臓線維症の進行の増加および肝硬変の進展と関連していることを示唆している研究と一致する(Baurら、2011年;Tanakaら、2009年)。
先進国世界における死の最大で45%までは線維化疾患に起因し得るが、少しの抗線維化薬物のみしか臨床用途のために現在承認されていない(Wynn、2008年)。TGFβを中和するように設計された治療は広範な抗線維化活性を示すが(Rosenbloomら、2010年)、利点は非疾患組織においてTGFβを不必要に遮断することによって損なわれる。VDR/SMADゲノム回路の同定は、全身のシグナル伝達を乱す代わりにTGFβ阻害をVDR陽性細胞に制限することによって安全な抗線維化戦略を提供する。
まとめると、本明細書における結果は、肝線維形成を支配するVDR転写因子およびSMAD転写因子を含む交差しているゲノム回路を提供する。この所見は、2つの異なるシグナル依存性転写因子がどのように互いに相互作用して細胞同一性および機能を確立するのかに対する理解を広げる。遺伝子モデルおよび誘導モデルの使用により、TGFβ1シグナル伝達に反応する全体のプログラムがどのように確立され、調節されるかが新たに明らかにされる。さらに、これらの研究は肝臓線維症を処置するための薬物標的としてのVDRを確立し、VDR依存性遺伝子発現調節の新たなパラダイムを提供する。VDRおよびTGFβの遍在的発現パターンを考慮すると、VDR/SMADゲノム回路は広範囲のヒト疾患の病因に影響を与えることができる多くの他の細胞型に適用可能である。
これらの所見に基づいて、ナノ粒子およびビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物(本明細書においてVDRアゴニストと称される)を含む組成物が本明細書に提供される。例えば、このような組成物は2つまたはそれ超の異なる種類のナノ粒子および/または2つまたはそれ超の異なるVDRアゴニストを含んでもよい。一例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子および/もしくはポリマーナノ粒子であるか、または脂質ナノ粒子および/もしくはポリマーナノ粒子を含む。開示される組成物は、化学療法剤(例えば、ゲムシタビン)、生物製剤(例えば、モノクローナル抗体)またはそれらの組合せなどの他の治療剤をさらに含んでもよい。いくつかの例において、組成物は薬学的に許容される担体を含む。
一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、星細胞(肝星細胞、腎星細胞、膵臓星細胞、心臓星細胞または肺星細胞など)などの目的の細胞を標的化するための作用物質を含む。一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−6−リン酸修飾アルブミン(例えば、ナノ粒子を肝星細胞に標的化するために本明細書に参照により組み込まれる、例えば、Liら、J. Pharm. Pharmacol. 2009年、61巻(9号):1155〜61頁を参照のこと)、脂肪酸エステルまたはレチニルエステル(例えば、レチニルパルミテート)のうちの1つまたは複数を含む。一例において、アルブミンは血清アルブミン(ヒト[OMIM 103600、例えば、GenBank(登録商標)受託番号NP_000468.1]またはウシ[例えば、GenBank(登録商標)受託番号NP_851335]など)である。別の例において、アルブミンはニワトリ卵白由来である。アルブミンは、例えばSigma−Aldrichから市販されている(例えば、カタログ番号A2153、05470、A9731およびA5503)。いくつかの例において、アルブミンはマンノース6−リン酸を含むように修飾される。ナノ粒子と共に使用され得るレチノール結合タンパク質(RBP)には、例えばGenBank(登録商標)配列データベースから公的に利用可能なもの(例えば、受託番号AAA59188.1、AAB06955.1、CAA24959.1およびAAA42018.1ならびにこれらの公的に利用可能な配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するか、またはRBPの成熟形態とこのような量の同一性を有するこれらのバリアント配列などの、RBP生物活性を保持するRBPバリアント)が含まれる。当技術分野において公知の任意の方法がこのような分子をナノ粒子に結合するために使用されてもよい。
いくつかの例において、ナノ粒子は、直径が少なくとも1nm、例えば少なくとも10nm、少なくとも100nmまたは少なくとも500nm、例えば1〜1000nm、10〜1000nm、50〜500nmまたは100〜500nmである。
例えば、いくつかの例において、VDRの生物活性を増加させる化合物(またはそれを含有する組成物)は、化合物の非存在下での生物活性と比較して、VDRの生物活性を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%または少なくとも500%増加させることができる。いくつかの例において、増加させるVDRの生物活性は、細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵のうちの1つまたは複数である(例えばこのような作用物質の放出を減少させることによる)。したがって、例えば、VDR(またはそれを含有する組成物)の生物活性を増加させる化合物は、化合物の非存在下での貯蔵と比較して、細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%または少なくとも500%増加させる。いくつかの例において、VDRの生物活性を増加させる化合物(またはそれを含有する組成物)は、化合物の非存在下での放出と比較して、細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の放出を少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%減少させる。いくつかの例において、VDRの生物活性を増加させる化合物(またはそれを含有する組成物)は、星細胞、上皮細胞または両方におけるVDRの生物活性を増加させる。このような細胞の例には、膵臓星細胞、腎臓星細胞、肝星細胞、心臓星細胞および肺星細胞が含まれる。
VDRアゴニストの例には、限定されないが、ビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD受容体リガンド、ビタミンD受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せが含まれる。VDRアゴニストの具体例には、限定されないが、カルシポトリオール、25−ヒドロキシ−D3(25−OH−D3)(カルシジオール)、ビタミンD3(コレカルシフェロール)、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)、1,α25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール)またはそれらの組合せが含まれる。
開示される組成物を使用する方法もまた、提供される。一例において、上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するための方法が提供される。このような方法は、本明細書に提供される治療有効量の組成物を上皮細胞および/または星細胞と接触させ、それにより上皮細胞および/または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するステップを含んでもよい。このような方法はin vitroまたはin vivoで実施されてもよい。例えば、上皮細胞または星細胞は被験体中にあってもよく、接触させるステップが、治療有効量の組成物を被験体へ投与し、それにより上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するステップを含んでもよい。いくつかの例において、このような方法は、被験体における肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患などの疾患を処置する。開示される方法を使用して処置できる肝臓疾患の例には、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症/肝硬変、胆管線維症/胆汁性肝硬変、肝臓がん、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシスおよびウィルソン病のうちの1つまたは複数が含まれる。いくつかの例において、肝臓がんは肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫である。開示される方法で処置できる膵臓疾患の例には、限定されないが、膵臓線維症および膵管腺癌(PDA)が含まれる。いくつかの例において、腎臓疾患は腎臓の線維症である。
本開示はまた、SMAD3とVDR共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメントの結合を減少させる方法を提供する。このような方法は、本明細書に提供される治療有効量の組成物(ナノ粒子およびVDRアゴニスト(against)を含むものなど)を上皮細胞および/または星細胞と接触させ、それにより上皮細胞および/または星細胞上の共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメント上のSMAD3の結合を減少させるステップを含んでもよい。いくつかの例において、組成物は、組成物の非存在下での生物活性と比較して、共調節線維化促進遺伝子のゲノムエンハンサーエレメント上のSMAD3の結合を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%減少させる。
本開示はまた、星細胞(膵臓星細胞、腎臓星細胞、肝星細胞、心臓星細胞または肺星細胞など)におけるVDRの発現を増加させる方法を提供する。このような方法は、星細胞を、VDRアゴニストのVDRへの結合を少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍増強するのに十分な量の、ナノ粒子の部分であるVDRアゴニストと接触させるステップを含んでもよい。
肝臓、膵臓または腎臓の線維症などの線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法もまた、提供される。特定の例において、方法は、肝星細胞、腎星細胞、肺星細胞、心臓星細胞、腎臓星細胞または膵臓星細胞を、1種または複数の試験作用物質および必要に応じてTGF−β1と接触させるステップを含む。続いて、細胞により産生されたVDRアゴニスト、細胞によるCYP24A1の産生または発現、星細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾または発現およびVDRリガンドのVDRへの結合のうちの1つまたは複数が検出される。1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるVDRアゴニストの産生を少なくとも5倍(例えば少なくとも6倍、少なくとも8倍または少なくとも10倍)増加させる、1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるCYP24A1の産生または発現を少なくとも1.5倍(例えば少なくとも6倍、少なくとも8倍または少なくとも10倍)増加させる、1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて、細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾もしくは発現を少なくとも5倍(例えば少なくとも6倍、少なくとも8倍または少なくとも10倍)減少させる、またはそれらの組み合わせである試験作用物質であって、選択される試験作用物質は線維症を処置できる作用物質である。いくつかの例において、選択される試験作用物質はVDRのVDRアゴニストへの結合を少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍増強する。スクリーニング方法は、1種または複数の選択された試験作用物質がin vitroまたはin vivoで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含んでもよい。いくつかの例において、方法はまた、in vitro、in vivoまたは両方において高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップを含む。
いくつかの例において、スクリーニング方法はin vivoで試験するステップをさらに含む。例えば、方法は、選択された試験作用物質のうちの1種または複数を、線維症を有する哺乳動物(肝臓線維症、膵臓線維症または腎臓線維症の動物モデルなど)へ投与するステップ、および1種または複数の試験作用物質が線維症を処置または予防する(例えば、選択された試験作用物質の投与の非存在下でのこのような量と比べて、線維症を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%低下させる、星細胞および/または上皮細胞におけるビタミンA、ビタミンD、脂質貯蔵を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍または少なくとも10倍増加させる、またはそれらの組み合わせである)かどうかを決定するステップを含んでもよい。いくつかの例において、方法はまた、線維症を処置した試験作用物質を選択するステップを含む。
ナノ粒子およびVDRアゴニストを含有する組成物
本開示は、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物、すなわち、ビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD受容体リガンド、ビタミンD受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せなどのVDRアゴニストを含む組成物を提供する。このような組成物は、1種または複数の薬学的に許容される担体、他の治療剤またはそれらの組合せなどのさらなる作用物質を含んでもよい。一例において、組成物は、化学療法剤(ゲムシタビンなど)、生物製剤(治療抗体など)またはそれらの組合せをさらに含む。使用できるVDRアゴニストの具体例には、限定されないが、カルシポトリオール、25−ヒドロキシ−D3(25−OH−D3)(カルシジオール)、ビタミンD3(コレカルシフェロール)、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール)およびそれらの組合せが含まれる。VDRアゴニストはナノ粒子中に存在してもよいか、またはナノ粒子表面に結合してもよい。
本開示は、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物、すなわち、ビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD受容体リガンド、ビタミンD受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せなどのVDRアゴニストを含む組成物を提供する。このような組成物は、1種または複数の薬学的に許容される担体、他の治療剤またはそれらの組合せなどのさらなる作用物質を含んでもよい。一例において、組成物は、化学療法剤(ゲムシタビンなど)、生物製剤(治療抗体など)またはそれらの組合せをさらに含む。使用できるVDRアゴニストの具体例には、限定されないが、カルシポトリオール、25−ヒドロキシ−D3(25−OH−D3)(カルシジオール)、ビタミンD3(コレカルシフェロール)、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール)およびそれらの組合せが含まれる。VDRアゴニストはナノ粒子中に存在してもよいか、またはナノ粒子表面に結合してもよい。
開示される組成物に使用され得るナノ粒子の例には、限定されないが、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20130287688号、同第20130287857号、同第20100233251号、同第20100092425号、同第20120027808号、同第20080226739号および同第20050215507号ならびに米国特許第7427394号、同第8343497号、同第8562998号、同第7550441号、同第7727969号、同第8343498号および同第8277812号に提供されるものが含まれる。いくつかの例において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子である。一例において、ナノ粒子は、それらの表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−6−リン酸修飾アルブミン(例えば、Liら、J. Pharm. Pharmacol. 2009年、61巻(9号):1155〜61頁を参照のこと)、脂肪酸エステルまたはレチニルエステル(例えば、レチニルパルミテート)のうちの1つまたは複数を含む。ナノ粒子はまた、所定の標的に対するリガンド(例えば、星細胞(肺、肝臓、腎臓、心臓または膵臓に存在するものなど)に対するリガンド、VDRアゴニストまたはそれらの組合せ)、樹状突起およびリガンドを樹状突起に連結するポリエチレングリコール(PEG)鎖を含む、生物活性材料を封入するための直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーを含んでもよい。いくつかの例において、ナノ粒子は、直径が約0.1nmおよび5000nm、例えば、1〜100nm、0.1〜1nm、5〜20nm、5〜15nm、10〜5,000nm、20〜1,000nm、10〜500nm、10〜200nm、10〜150nm、10〜100nm、10〜25nm、20〜40nmまたは10、15、20、25、35、45、50、75、100、150もしくは200nmの間である。
開示される組成物によって増加され得るVDRの生物活性は、細胞からのビタミンAの放出の減少、細胞からのビタミンDの放出の減少、細胞からの脂質の放出の減少またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの例において、細胞は星細胞(膵臓星細胞、腎臓星細胞または肝星細胞など)、上皮細胞または両方である。例えば、傷害またはストレスに反応して、ビタミンAおよびDならびに脂質は活性化した細胞(活性化した上皮細胞または星細胞など)から放出され得、これにより線維症などの他の傷害が生じ得る。したがって、線維症などのこれらの他の傷害を減少させるために、VDRの機能が増加されて細胞を静止状態に反転させ得る。
ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物(例えば、VDRアゴニスト)を含む組成物は、VDR活性を少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%またはさらにいくつかの例において少なくとも500%増加させることができる。したがって、一例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)からのビタミンAの放出を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させることができる。一例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)からのビタミンDの放出を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させることができる。一例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)からの脂質の放出を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させることができる。
いくつかの例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)によるビタミンAの保持または貯蔵を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%増加させることができる。一例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)によるビタミンDの保持または貯蔵を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%増加させることができる。一例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物は、組成物の非存在と比較して、細胞(星細胞または上皮細胞など)による脂質の保持または貯蔵を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%を増加させることができる。
細胞内のビタミンA、ビタミンDおよび脂質を測定する方法は公知であり、本明細書に提供され、このようなアッセイは、化合物がVDR活性を増加させ、それにより本明細書に提供される組成物に使用できるかどうかを決定するために使用され得る。細胞内のビタミンAを測定するための例示的な方法は、Vogelら(J. Lipid Res. 41巻(6号):882〜93頁、2000年)に提供され、細胞内のビタミンDを測定するための方法は、Blumら(Endocrine. 33巻(1号):90〜4頁、2008年)に提供される。一例において、星細胞などの細胞を静止状態に反転する化合物または組成物の能力は、化合物/組成物の存在下および非存在下で(例えば化合物/組成物と接触させる前後に)、中性脂質に結合するBODIPY(登録商標)蛍光色素を用いて細胞を染色することによって決定され得る。静止細胞は、活性化した細胞状態において損失し、静止を誘導するVDRの生物活性を増加させる化合物などの薬物での活性化した細胞の処理により蓄積する、細胞質内脂質滴によって特徴付けられる。したがって、活性化した細胞の処理、その後のBODIPY(登録商標)染色および蛍光測定が、細胞(星細胞など)を静止状態に駆動するVDRの生物活性を増加させる化合物を同定するために使用され得る。
例示的なVDRアゴニスト
開示される組成物は、例えば、肝臓、膵臓および/または腎臓における傷害、炎症および線維形成のプロセスを予防または弱めるためにVDRに結合でき、VDRを活性化できる1つまたは複数のVDRアゴニスト(VDRリガンドなど)を含む。VDRアゴニストには、限定されないが、1α,25(OH)2−D3ならびにその前駆体および類似体、VDRリガンドおよびVDRアゴニスト前駆体が含まれる。本開示は特定のビタミンDアゴニストに限定されない。様々な生物学的に活性なビタミンDアゴニストが意図される。例示的な作用物質は当技術分野において公知である。
開示される組成物は、例えば、肝臓、膵臓および/または腎臓における傷害、炎症および線維形成のプロセスを予防または弱めるためにVDRに結合でき、VDRを活性化できる1つまたは複数のVDRアゴニスト(VDRリガンドなど)を含む。VDRアゴニストには、限定されないが、1α,25(OH)2−D3ならびにその前駆体および類似体、VDRリガンドおよびVDRアゴニスト前駆体が含まれる。本開示は特定のビタミンDアゴニストに限定されない。様々な生物学的に活性なビタミンDアゴニストが意図される。例示的な作用物質は当技術分野において公知である。
いくつかの例において、1α,25(OH)2D3またはビタミンD前駆体もしくは類似体がVDRアゴニストとして使用される。有益な治療効果を達成するためにビタミンDの最も生物学的に活性な形態を使用することは必要ではない。ビタミンD受容体の天然に存在するリガンドはカルシトリオールである。一実施形態において、カルシトリオールの前駆体(カルシジオールなど)が被験体に投与され、次いで標的細胞集団内でカルシトリオールに変換される。
加えて、HSCは、側鎖ヒドロキシル化によってカルシトリオールの生物学的効果を終結させるシトクロムP450酵素であるCYP24A1を発現する。したがって、一実施形態において、CYP24A1による非活性化に抵抗性であるVDRリガンドまたは他のVDRアゴニストまたはアゴニスト前駆体が、標的細胞集団において、より効果的かつより長く継続するVDR活性化を達成するために使用される。具体例において、VDRリガンドはCYP27B1によって活性化され得るが、CYP24A1による非活性化に抵抗性であるものである。これにより、肝臓(例えば、HSC)、膵臓および腎臓内の標的細胞集団におけるVDR活性化が可能となるが、カルシウム恒常性に対する望ましくない全身作用を最小化する。
一例において、VDRアゴニストまたはその前駆体は広範な肝代謝に起因して高い初回通過肝クリアランスの特性を示す。この特性を有する分子は、経口投与される場合、門脈を介して肝臓に吸収され、輸送される。肝臓内で、分子は、肝星細胞、クッパー細胞および類洞内皮細胞などの細胞集団においてVDRを活性化するが、低い全身バイオアベイラビリティに起因してカルシウム恒常性に対して最小の全身作用を示す。
使用され得るVDRアゴニストには、VDRを活性化させるこれらの分子が含まれる。作用物質がVDRアゴニストであるかどうかを決定する方法は慣用されている。例えば、CYP24A1発現の誘導は作用物質と接触したVDRを発現する細胞内で測定でき、CYP24A1発現の増加(例えば、発現の10〜20倍の増加)は、作用物質がVDRアゴニストであることを示す。他の方法には、トランスフェクトされたレポーター遺伝子構築およびFRETアッセイが含まれる。いくつかの例において、アゴニストの精製したLBDへの結合は共活性化因子ペプチド(例えば、LXXLL)について誘導された動員を測定することによって検出される。例えば、VDRアゴニストは、アゴニストの非存在と比較して、VDR発現細胞においてCYP24A1発現を少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも200%またはさらに少なくとも1000%超、増加させることができる。
VDRアゴニストには、ビタミンD化合物、その前駆体および類似体が含まれる。ビタミンD化合物には、限定されないが、以下の特徴:D−環に結合した任意の側鎖と一緒にビタミンDの5,7ジエン二重結合系によって相互接続したビタミンDのC−環、D−環および3β−ヒドロキシシクロヘキサンA−環のうちの少なくとも1つを有する化合物(例えば、「ビタミンD核」およびD−環に結合した側鎖と一緒にビタミンDに特有である5,7ジエン二重結合系によって相互接続した置換または非置換A−、C−およびD−環を有する化合物)が含まれる。
ビタミンD類似体には、セコステロイドカルシトリオールの様々な活性を模倣できるこれらの非セコステロイド化合物が含まれる。このような化合物の例には、限定されないが、LG190090、LG190119、LG190155、LG190176およびLG1900178が含まれる(Boehmら、Chemistry & Biology 6巻:265〜275頁、1999年を参照のこと)。
ビタミンD化合物には、in vivoで生物学的に活性であるか、または化合物がin vivoで活性になるように哺乳動物被験体中で作用する、これらのビタミンD化合物およびビタミンD類似体が含まれる。このような化合物の例には、限定されないが、ビタミンD、カルシトリオールおよびその類似体[例えば、1α−ヒドロキシビタミンD3(1α−OH−D3)、1,25−ジヒドロキシビタミンD2(1,25−(OH2)D2)、1α−ヒドロキシビタミンD2(1α−OH−D2)、1α,25−(OH)2−16−エン−D3、1α,25−(OH)2−24−オキソ−16−エン−D3、1α,24R(OH)2−D3、1α,25(OH)2−22−オキサ−D3、20−エピ−22−オキサ−24a,24b,−ジホモ−1α,25(OH)2−D3、20−エピ−22−オキサ−24a,26a,27a,−トリホモ−1α25(OH)2−D3、20−エピ−22−オキサ−24ホモ−1α,25(OH)2−D3、1,25−(OH)2−16,23E−ジエン−26−トリフルオロ−19−ノル−D3および非セコステロイド性ビタミンD模倣物が含まれる。
一例において、VDRアゴニストは、以下のビタミンD、1,α25ジヒドロキシビタミンD3、カルシポトリオール、1α−ヒドロキシビタミンD3、1,25−ジヒドロキシビタミンD2、1α−ヒドロキシビタミンD2、1α,25−(OH)2−16−エン−D3、1α,25−(OH)2−24−オキソ−16−エン−D3、1α,24R(OH)2−D3、1α,25(OH)2−22−オキサ−D3、20−エピ−22−オキサ−24a,24b,−ジホモ−1α,25(OH)2−D3、20−エピ−22−オキサ−24a,26a,27a,−トリホモ−1α25(OH)2−D3、20−エピ−22−オキサ−24ホモ−1α,25(OH)2−D3および1,25−(OH)2−16,23E−ジエン−26−トリフルオロ−19−ノル−D3のうちの1つまたは複数である。
一実施形態において、生物学的に活性なビタミンD化合物は、1,α25−ジヒドロキシビタミンD3、19−ノル−1,25−ジヒドロキシビタミンD2、19−ノル−1,25−ジヒドロキシ−21−エピ−ビタミンD3、1,25−ジヒドロキシ−24−ホモ−22−デヒドロ−22E−ビタミンD3および19−ノル−1,25−ジヒドロキシ−24−ホモ−22−デヒドロ−22E−ビタミンD3および非セコステロイド性ビタミンD模倣物から選択される。さらなる例において、生物学的に活性なVDRアゴニストは、以下の式:
(式中、X1およびX2は各々、水素およびアシルからなる群から選択され、Y1およびY2はHであってもよく、または一方はO−アリールもしくはO−アルキルであってもよく、他方は水素であり、βもしくはα配置を有していてもよく、Z1およびZ2は両方、Hであり、またはZ1およびZ2は一緒にCH2になり、Rはアルキル、ヒドロキシアルキルもしくはフルオロアルキル基であり、またはRは以下の側鎖:
(式中、(a)はSもしくはR配置を有していてもよく、R1は水素、ヒドロキシもしくはO−アシルを表し、R2およびR3は各々、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、または一緒になる場合、基−−(CH2)m−−(式中、mは2〜5の値を有する整数である)を表し、R4は水素、ヒドロキシ、フッ素、O−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択され、R5は水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択されるか、またはR4およびR5は一緒になって、二重結合した酸素を表し、R6およびR7は一緒になって、炭素−炭素二重結合を形成し、R8はHまたはCH3であってもよく、nは1〜5の値を有する整数であり、側鎖における20、22もしくは23位の任意の1つにおける炭素はO、SもしくはN原子によって置換されていてもよい)を表していてもよい)
によって表される類似体から選択される。
一実施形態において、生物学的に活性なビタミンD化合物は、1,α25−ジヒドロキシビタミンD3、19−ノル−1,25−ジヒドロキシビタミンD2、19−ノル−1,25−ジヒドロキシ−21−エピ−ビタミンD3、1,25−ジヒドロキシ−24−ホモ−22−デヒドロ−22E−ビタミンD3および19−ノル−1,25−ジヒドロキシ−24−ホモ−22−デヒドロ−22E−ビタミンD3および非セコステロイド性ビタミンD模倣物から選択される。さらなる例において、生物学的に活性なVDRアゴニストは、以下の式:
によって表される類似体から選択される。
一例において、本明細書に提供される方法に使用されるVDRアゴニストは、被験体に投与された場合に高カルシウム血症の症状を引き起こさない。別の例において、VDRアゴニストは、被験体に投与された場合、カルシトリオールに匹敵するほどの多くのカルシウム血性反応を生じない(すなわち程度が低い)。一例において、VDRアゴニストはカルシトリオールと比較して低いカルシウム血性反応特性を有する。別の実施形態において、これらの化合物は、1α,25−(OH)2−24−エピ−D2、1α,25−(OH)2−24a−ホモ−D3、1α,25−(OH)224a−ジホモ−D3、1α,25−(OH)2−19−ノル−D3および20−エピ−24−ホモ−1α,25−(OH)2−D3から選択される。
使用できる他の例示的なVDRアゴニストは表1に提供される。
他の作用物質
開示される組成物は、他の治療剤、例えば、化学療法剤、生物製剤(例えば、モノクローナル抗体、阻害RNA分子)などを含んでもよい。具体例が以下に開示される。
いくつかの例において、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤などを含む。具体例が以下に開示される。
ナノ粒子およびVDRアゴニストを含有する組成物の使用方法。
本開示は、上皮細胞または星細胞などの細胞においてビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加または保持するために、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む開示される組成物を使用する方法もまた提供する。したがって、活性な星細胞または上皮細胞をその静止状態に戻す、または星細胞または上皮細胞を静止状態に維持するために使用可能な方法を提供する。
本開示は、上皮細胞または星細胞などの細胞においてビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加または保持するために、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む開示される組成物を使用する方法もまた提供する。したがって、活性な星細胞または上皮細胞をその静止状態に戻す、または星細胞または上皮細胞を静止状態に維持するために使用可能な方法を提供する。
いくつかの例において、該方法は、治療有効量の1または複数の開示される組成物と、細胞(例えば、VDR陽性細胞)、例えば上皮細胞または星細胞、例えば活性化上皮細胞または星細胞とを接触させるステップを含む。このような方法を使用して、細胞中のビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加または保持することができ、したがって、該方法を使用して、活性な星細胞もしくは上皮細胞をその静止状態に戻す、または星細胞もしくは上皮細胞を静止状態に維持することができる。いくつかの例において、細胞は被験体中にあり、接触させるステップは、治療有効量の組成物を被験体に投与して、それによって、対象の細胞(例えば、上皮細胞および/または星細胞、例えば膵臓星細胞、肝臓星細胞、心臓星細胞、肺星細胞および/または腎臓星細胞)においてビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加または保持するステップを含む。
いくつかの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞(例えば、星細胞または上皮細胞)によるビタミンAの保持または貯蔵を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%増加させる。1つの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞(例えば、星細胞または上皮細胞)によるビタミンDの保持または貯蔵を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%増加させる。1つの例において、該方法は、未処理と比較して、細胞(例えば、星細胞または上皮細胞)による脂質の保持または貯蔵を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%増加させる。
いくつかの例において、処置される被験体は、肝臓疾患、例えば、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症/肝硬変、胆管線維症/胆汁性肝硬変、肝臓がん(例えば、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫)、肝炎、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、ヘマクロマトーシスまたはウィルソン病の1つまたは複数を有する。いくつかの例において、処置される被験体は、膵臓疾患、例えば、膵臓線維症、膵管腺癌(PDA)または両方を有する。いくつかの例において、処置される被験体は、腎臓疾患、例えば、腎臓の線維症または腎細胞癌を有する。したがって、開示される組成物を使用して、これらの疾患の1つまたは複数を処置または予防可能である。
1つの例において、被験体は、肝臓、膵臓または腎臓の線維症の症状を示す。例えば、被験体は、B型肝炎またはC型肝炎に感染している恐れがある。いくつかの例において、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む治療組成物の投与は、線維症の症状を減少させる。いくつかの例において、被験体は、線維症発症のリスクにあり(例えば、B型肝炎に感染している、またはアルコール性肝臓疾患である、もしくは他の肝臓疾患を有する)、治療組成物は予防的に投与される。
いくつかの例において、開示される方法は、開示される組成物による処置をしなかった場合と比較して、線維症の1つまたは複数を(例えば、線維化肝臓、腎臓または膵臓の線維化内容物を減少させることによって)低減させる、腫瘍の成長、サイズもしくは体積および転移性病巣を減少させるために使用することができる。したがって、いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、線維症を(例えば、線維化肝臓、腎臓または膵臓の線維化内容物を減少させることによって)、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、腫瘍(例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍)の成長速度を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、腫瘍(例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍)のサイズもしくは体積を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させる。いくつかの例において、該方法は、未処置と比較して、転移(例えば、肝臓、腎臓または膵臓の腫瘍の転移)の数、サイズまたは体積を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させる。
いくつかの例において、開示される方法は予防的である。例えば、該方法は、線維症発症のリスクのある被験体に、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む治療組成物を投与するステップを含むことができる。このような予防的投与は、肝臓、腎臓または膵臓の線維症の症状の発症を遅延させることができる。例えば、ナノ粒子およびVDRの生物活性を増加させる化合物を含む組成物の予防的投与は、線維症の症状または特徴の1つまたは複数の発症を予防するために使用することができる。例えば、臓器が線維症に侵された場合、臓器の機能性細胞集団は瘢痕組織(コラーゲンおよび他の異常なマトリックス成分)により置き換えられるので、臓器の機能性細胞集団が減少する。加えて、線維症は、機能を衰えさせ得る構造組織崩壊を引き起こし、病理、例えば門脈圧亢進症をもたらし、肝臓の場合、肝細胞癌のリスクが増加する。重度の門脈圧亢進症は通常、食道の出血/胃静脈瘤および/または腹水(ascities)として現れる。腎臓および膵臓において、進行した線維症の特徴は、腎不全ならびに内分泌性および/または外分泌性膵臓不全である。
モニタリング療法
ある特定の実施形態において、本明細書に提供された組成物のこれらの作用は、限定するものではないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、ビリルビン、アルファ−2マクログロブリン、ハプトグロビン、メタロプロテイナーゼ−1の組織阻害因子、ヒアルロン酸、タイプIIIコラーゲンのアミノ末端プロペプチドならびに他のコラーゲン前駆体および代謝産物、血小板数、アポリポタンパク質A1、C−反応タンパク質ならびにフェリチンを含む、肝臓の炎症、傷害および線維形成の血液、血清および血漿マーカーによりモニターされる。いくつかの例において、これらの試験は単独で使用され、一方、他の例において、これらの試験は組み合わせて使用される。肝線維症はまた、一過性エラストグラフィー(Fibroscan(商標))の技術によりモニターすることができる。さらなる実施形態は、肝臓生検により得られた肝臓組織の直接検査による、処置の影響のモニタリングを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供された組成物のこれらの作用は、限定するものではないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、ビリルビン、アルファ−2マクログロブリン、ハプトグロビン、メタロプロテイナーゼ−1の組織阻害因子、ヒアルロン酸、タイプIIIコラーゲンのアミノ末端プロペプチドならびに他のコラーゲン前駆体および代謝産物、血小板数、アポリポタンパク質A1、C−反応タンパク質ならびにフェリチンを含む、肝臓の炎症、傷害および線維形成の血液、血清および血漿マーカーによりモニターされる。いくつかの例において、これらの試験は単独で使用され、一方、他の例において、これらの試験は組み合わせて使用される。肝線維症はまた、一過性エラストグラフィー(Fibroscan(商標))の技術によりモニターすることができる。さらなる実施形態は、肝臓生検により得られた肝臓組織の直接検査による、処置の影響のモニタリングを含む。
いくつかの実施形態において、開示される方法の膵臓の疾患に対する効果は、血液、血清、血漿のアミラーゼまたはリパーゼならびに膵臓の外分泌および内分泌機能の試験によりモニターされる。他の実施形態において、膵炎は、限定するものではないが、放射線学、核医学、超音波および磁気共鳴を含む画像化技術によりモニターされる。
いくつかの実施形態において、開示される方法の腎臓の疾患に対する効果は、血液、血清もしくは血漿の尿素もしくはクレアチニンの測定または腎機能の他の試験を単独で、または組み合わせてモニターされる。いくつかの実施形態において、腎臓疾患は、限定するものではないが、放射線学、核医学、超音波および磁気共鳴を含む画像化技術によりモニターされる。別の実施形態において、腎臓に対する処置の影響は、腎臓生検により得られた組織の直接検査によりモニターされる。
他の治療剤との併用
開示される組成物を、他の治療剤、例えば化学療法剤(chemotherapy)および生物療法剤(biotherapy)と組み合わせて処置に使用することができる。1つの例において、他の治療剤としては、限定するものではないが、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−ガンマ(PPAR−γ、NR1C3)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−アルファ(PPAR−α、NR1C1)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−デルタ(PPAR−δ、NR1C2)、ファルネソイドX受容体(FXR、NR1H4)、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンII受容体アンタゴニスト、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、クルクミンに対するリガンドを含む、1つまたは複数の核内受容体リガンド、限定するものではないが、ビタミンE、レチノイド、例えばビタミンAを含む抗酸化剤および、病理ECMを分解するためにプロテアーゼを肝臓に送達する療法剤が挙げられる。いくつかの例において、他の治療剤は、本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の一部である。
開示される組成物を、他の治療剤、例えば化学療法剤(chemotherapy)および生物療法剤(biotherapy)と組み合わせて処置に使用することができる。1つの例において、他の治療剤としては、限定するものではないが、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−ガンマ(PPAR−γ、NR1C3)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−アルファ(PPAR−α、NR1C1)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−デルタ(PPAR−δ、NR1C2)、ファルネソイドX受容体(FXR、NR1H4)、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンII受容体アンタゴニスト、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、クルクミンに対するリガンドを含む、1つまたは複数の核内受容体リガンド、限定するものではないが、ビタミンE、レチノイド、例えばビタミンAを含む抗酸化剤および、病理ECMを分解するためにプロテアーゼを肝臓に送達する療法剤が挙げられる。いくつかの例において、他の治療剤は、本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の一部である。
「共投与」、「組み合わせて投与される」およびこれらの文法的等価用語は、2またはそれ超の治療剤の単一被験体への投与を包含することを意味し、薬剤が、同一もしくは異なる投与経路により、または同一もしくは異なる時間に投与される処置レジメンを含むことが意図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の1つまたは複数の組成物は、他の薬剤と共投与される。これらの用語は、2またはそれ超の薬剤を、両方の薬剤および/またはこれらの代謝産物が、被験体中に同時に存在するように被験体に投与されることを包含する。それらは、別個の組成物の同時投与、別個の組成物で異なる時間における投与および/または両方の薬剤が存在する1つの組成物で投与することを含む。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および他の薬剤(複数可)は、単一組成物で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および他の薬剤(複数可)は、組成物中に混合される。
例示的化学療法剤および生物学的治療剤
開示される方法は、開示される組成物を他の治療剤、例えば化学療法剤および生物療法剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、このような化学療法剤および/または生物療法剤は、本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の一部である。化学療法剤および生物療法剤としては、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤ならびに他の薬剤、例えば抗体を挙げることができる。このような薬剤の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。下記の分類の1つまたは複数に分類できるとは限らない他の治療剤、例えば、抗腫瘍剤もまた、記載の組成物と組み合わせた投与に適切である。このような薬剤の選択および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。
開示される方法は、開示される組成物を他の治療剤、例えば化学療法剤および生物療法剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、このような化学療法剤および/または生物療法剤は、本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の一部である。化学療法剤および生物療法剤としては、抗新生物化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼ阻害剤ならびに他の薬剤、例えば抗体を挙げることができる。このような薬剤の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。下記の分類の1つまたは複数に分類できるとは限らない他の治療剤、例えば、抗腫瘍剤もまた、記載の組成物と組み合わせた投与に適切である。このような薬剤の選択および治療投薬量は、当業者に公知であり、熟練した医師により決定され得る。
1つの例において、化学療法剤または生物療法剤は、細胞、例えば、肝臓細胞、膵臓細胞または腎臓細胞の死滅化を増加させる(またはこれらの生存能力を減少させる)。このような細胞死は、細胞の100%の減少をもたらす必要はなく、例えば、生存細胞(例えば、がん細胞)の数を、(例えば、化学療法剤または生物療法剤による処置をしない場合と比較して)少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させる化学療法剤が、本明細書に提供される方法に使用可能である。例えば、化学療法剤または生物療法剤は、細胞(例えば、がん細胞)の成長を、(例えば、該化学療法剤または生物療法剤を使用しない場合と比較して)少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%または少なくとも95%減少させることができる。
使用可能な(およびいくつかの例において、ナノ粒子およびVDRアゴニストを含む組成物の一部である)化学療法剤の特定の例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン)、白金含有化合物(例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびBBR3464)、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン;葉酸(例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド)、プリン(例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン)、ピリミジン(例えば、カペシタビン)、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン;植物アルカロイド、例えばポドフィルム(例えば、エトポシドおよびテニポシド);微小管結合剤(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン(ナベルビン)ビンクリスチン、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン15、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、リゾキシンならびにこれらの誘導体および類似体)、DNAインターカレーターまたは架橋剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミドならびにこれらの誘導体および類似体)、DNA合成阻害剤(例えば、メトトレキサート、5−フルオロ−5’−デオキシウリジン、5−フルオロウラシルおよびこれらの類似体);アントラサイクリンファミリーメンバー(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン);代謝拮抗物質、例えば、細胞毒性/抗腫瘍性抗生物質、ブレオマイシン、リファンビシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン;トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン;光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、メチルアミノレブリネート、ポリフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン、酵素、酵素阻害剤(例えば、カンプトテシン、エトポシド、フォルメスタン、トリコスタチンならびにこれらの誘導体および類似体)、キナーゼ阻害剤(例えば、イマチニブ、ゲフィチニブおよびエルロチニブ(erolitinib))、遺伝子調節剤(例えば、ラロキシフェン、5−アザシチジン、5−アザ−2’−デオキシシチジン、タモキシフェン、4−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストンならびにこれらの誘導体および類似体);ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ(vemurafinib)、バンデタニブおよびトレチノインが挙げられる。
1つの例において、生物療法剤(bio−therapy)(いくつかの例において、ナノ粒子およびVDRアゴニストを含む組成物の一部である)は、抗体、例えばヒト化抗体を含む、またはこれからなる。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体であってよい。上記のように、特定の標的に対して特異的である抗体の作製方法は日常的な方法である。いくつかの例において、治療抗体は毒素とコンジュゲートされる。例示的生物療法剤としては、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラツズマブが挙げられる。
生物療法剤(いくつかの例において、ナノ粒子およびVDRアゴニストを含む組成物の一部である)の他の例としては、抑制性核酸分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA(miRNA)、shRNAまたはリボザイムが挙げられる。標的核酸を特異的に標的化し、標的核酸の発現を調節する任意のタイプのアンチセンス化合物の使用が企図される。アンチセンス化合物は、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズし、標的核酸分子の発現をモジュレートする化合物である。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝型またはヘアピン化合物として導入することができ、構造エレメント、例えば、内部または末端のバルジまたはループを含有し得る。二本鎖アンチセンス化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する2つの鎖であるか、またはハイブリダイゼーションおよび完全または部分的な二本鎖化合物の形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖であってよい。いくつかの例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的mRNAにハイブリダイズする場合、二本鎖がRNaseHにより認識され、mRNAの切断をもたらすような一本鎖アンチセンス化合物である。他の例において、miRNAは、RNAi経路を介して遺伝子発現を調節するmRNA分子と少なくとも部分的に相補性である、約21〜23ヌクレオチドの一本鎖RNA分子である。さらなる例において、shRNAは、siRNAへ切断される強固なヘアピンを形成するRNAオリゴヌクレオチドである。siRNA分子は、概して約20〜25ヌクレオチド長であり、2つのヌクレオチドオーバーハングを3’末端に有してよく、または平滑末端であってもよい。概して、siRNAの1つの鎖は、標的核酸に少なくとも部分的に相補性である。遺伝子を特異的に標的化するアンチセンス化合物は、標的ヌクレオチド配列、例えばmRNA配列に相補的な化合物をデザインすることによって調製することができる。アンチセンス化合物は、標的を特異的にハイブリダイズして、その発現を調節する標的核酸分子に100%相補性である必要はない。例えば、アンチセンス化合物または該化合物のアンチセンス鎖は、二本鎖化合物の場合、標的核酸配列と、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%相補性であってよい。特異性のためのアンチセンス化合物のスクリーニング方法は周知である(例えば、米国特許出願公開第2003−0228689号を参照されたい)。加えて、抑制性核酸分子をデザイン、調製および使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。
治療剤の投与
いくつかの例において、開示される方法は、治療有効量の開示される組成物の1つまたは複数を単独または別の治療剤、例えば、化学療法剤または生物療法剤と組み合わせて被験体に提供するステップを含む。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。いくつかの例において、開示される方法は、外科手術および/または照射線療法を、本明細書に記載の処置と組み合わせて、(例えば、順次、実質的に同時にまたは同時に)被験体に提供するステップをさらに含む。投与は、単回用量または複数回用量により達成することができる。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重および全体的状態、使用する特定の治療剤およびその投与様式に依存して、被験体ごとに変動する。
いくつかの例において、開示される方法は、治療有効量の開示される組成物の1つまたは複数を単独または別の治療剤、例えば、化学療法剤または生物療法剤と組み合わせて被験体に提供するステップを含む。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。いくつかの例において、開示される方法は、外科手術および/または照射線療法を、本明細書に記載の処置と組み合わせて、(例えば、順次、実質的に同時にまたは同時に)被験体に提供するステップをさらに含む。投与は、単回用量または複数回用量により達成することができる。このような薬剤および処置の方法および治療投薬量は当業者に公知であり、例えば、熟練の医師により決定され得る。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重および全体的状態、使用する特定の治療剤およびその投与様式に依存して、被験体ごとに変動する。
本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物を含む治療剤は、当分野において公知の任意の適切な手段を使用して、処置を必要とする被験体に投与することができる。投与の方法としては、限定するものではないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、非経口、腫瘍内、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻腔内、吸入、経口または遺伝子銃による投与が挙げられる。鼻腔内投与は、鼻孔の1つまたは両方を介した、組成物の鼻および鼻道内への送達を指し、治療剤の噴霧機構、液滴機構またはエアロゾル化による送達を含むことができる。
吸入による治療剤の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達を介した鼻または口によるものであってよい。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域に直接的であってよい。非経口投与は、概して注射により達成される。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体としての溶液もしくは懸濁液(solution of suspension)に適切な固体形態またはエマルジョンのいずれかとして既存の形態で調製することができる。注射溶液および注射懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。投与は全身であっても、または局所であってもよい。
本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物を含む治療剤は、任意の適切な様式で、例えば薬学的に許容される担体と一緒に投与することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物および組成物の投与に使用される特定の方法により一部決定される。したがって、広範囲の本開示の医薬組成物の適切な製剤が存在する。本開示において有用な薬学的に許容される担体(ビヒクル)は、既存である。E. W. Martinによる、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第15版(1975年)は、1つまたは複数の治療剤の薬学的送達に適切な組成物および製剤を記載している。
非経口投与のための調製物としては、滅菌の水性溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液(例えば、リンゲルデキストロースに基づく)などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在してよい。
本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の局所投与を含む、局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、液滴、坐薬、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。既存の薬学的担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。
本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物の経口投与を含む、経口投与のための治療剤としては、粉末もしくは顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェまたは錠剤が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。
本明細書に提供されるナノ粒子/VDRアゴニスト組成物を含む治療剤は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸ならびに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸との反応により、または無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムならびに有機塩基、例えば、モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンとの反応により形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる。
いくつかの例において、VDR活性を増加させる薬剤およびナノ粒子を含む組成物の用量は、約1mg〜約1000mg、約10mg〜約500mgまたは約50mg〜約100mgである。いくつかの例において、該組成物の用量は、約1mg、約10mg、約50mg、約100mg、約250mg、約500、約700mg、約1000mg、約2000mg、約3000mg、約4000mg、約5000mg、約6000mg、約7000mg、約9000mgまたは約10,000mgである。いくつかの実施形態において、該組成物の用量は、約1μg/kg〜約1000mg/kg、約1μg/kg〜1000μg/kg、約1μg/kg〜100μg/kg〜約5mg/kg〜約500mg/kg、約10mg/kg〜約100mg/kg、約50mg/kg〜100mg/kgまたは約25〜約50mg/kgである。いくつかの例において、該組成物の用量は、約1μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約12.5mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約60mg/kg、約70mg/kg、約80mg/kgまたは約100mg/kgである。これらの投薬量は単なる例であり、適切な用量は、日常的な実験だけを使用して、当業者により決定可能であることは十分に理解される。1つの例において、用量は約20μg/kgPOである。
1つの例において、治療有効用量のビタミンD2およびD3は、約50IUから約50,000IUの範囲である。いくつかの実施形態において、ビタミンD2および/またはD3は、例えば、約75IU、約100IU、約250IU、約500IU、約750IU、約1,000IU、約1,500IU、約2,000IU、約2,500IU、約5,000IU、約7,500IU、約10,000IU、約15,000IU、約20,000IU、約25,000IU、約40,000IUもしくは約50,000IUまたはそれ超未満の経口用量で投与される。他の実施形態において、カルシトリオールは、0.001から10マイクログラムの用量で投与される。例えば、カルシトリオール(calcitrol)は、いくつかの実施形態において、約0.01μg、約0.05μg、約0.1μg、約0.25μg、約0.5μg、約1μg、約5μgまたは約10μgの用量で投与される。いくつかの実施形態において、VDRアゴニストのより大きい用量が、目的の臓器、例えば、肝臓、腎臓または膵臓を標的化する送達経路を介して投与される。
ある特定の実施形態において、ナノ粒子と、VDR活性を増加させる薬剤とを含有する組成物は、例えば単回用量または分割用量で経口投与される。経口投与のために、組成物は、例えば、処置される被験体に対する投薬量の症候的調整のために、1.0から1000mgの活性成分、例えば、少なくとも75IU、少なくとも100IU、少なくとも250IU、少なくとも500IU、少なくとも750IU、少なくとも800IU、少なくとも1,000IU、少なくとも1,500IU、少なくとも2,000IU、少なくとも2,500IU、少なくとも5,000IU、少なくとも7,500IU、少なくとも10,000IU、少なくとも15,000IU、少なくとも20,000IU、少なくとも25,000IU、少なくとも40,000IUまたは少なくとも50,000IU/日、例えば、50IUから2000IU/日、100IUから1000IU/日、例えば、800IU/日、またはそれ超の活性成分を含有する錠剤の形態で提供される。有効な非経口用量は、化合物に依存して、より低い、例えば約0.001μgから約10μgの範囲を予想することができる。
別の実施形態において、ナノ粒子組成物中のVDR活性を増加させる薬剤が、1α−ヒドロキシ化合物ではない場合、1.0から100μgの間/日/160ポンドの患者の1日用量が投与され、例えば、5.0から50μgの間/日/160ポンドの患者が投与される。異なる実施形態において、生物学的活性ビタミンD化合物が1α−ヒドロキシ化合物である場合、0.1から20μgの間/日/160ポンドの患者の1日用量が投与されるが、好ましい用量は、0.5から10μの間/日/160ポンドの患者である。特定の例において、用量は3〜10μgの間/日である。
1つの例において、ナノ粒子組成物中のVDRアゴニストは、コレカルシフェロールまたはカルシジオールである。いくつかの例において、頻度は少ないが、普通より高い用量、例えば、50,000から500,000ユニットが毎週投与される。
スクリーニング方法
VDRが線維症を処置または予防する作用物質を同定するための標的であるという観察に基づいて、線維症、例えば、肝臓、膵臓および/または腎臓の線維症を処置または予防することのできる1つまたは複数の作用物質を同定するスクリーニング方法を、本明細書において提供する。いくつかの例において、該方法は、細胞(例えば、肝星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎星細胞)と、1つまたは複数の試験作用物質とを接触させるステップを含む。1つの例において、細胞は、肝星細胞、例えば、初代細胞または肝星細胞由来の不死化細胞系または星細胞のいくつかの表型的または機能的特徴を保持する他の細胞系である。いくつかの例において、複数の細胞を、一度に1つの試験作用物質と接触させる。いくつかの例において、複数の細胞を、2種またはそれ超の異なる試験作用物質、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10種の異なる試験作用物質と、同時に接触させる。添加する試験作用物質の量は、当業者により決定可能である。いくつかの例において、in vitroで細胞に添加される試験作用物質(複数可)(例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される)の量は、少なくとも1nM、少なくとも10nM、少なくとも100nM、少なくとも1mM、少なくとも10mM、少なくとも100mM、または1000mM、例えば、1nM〜1M、1nM〜100nMまたは1nM〜10nMである。いくつかの例において、細胞は、少なくとも1国際単位(IU)、例えば、少なくとも5IU、少なくとも10IU、少なくとも10IU、少なくとも100IU、少なくとも1000IU、少なくとも5000IU、少なくとも10,000IU、少なくとも50,000IU、少なくとも100,000IUまたは少なくとも500,000IU、例えば、5IUから約50,000IU、5〜10,000IU、10〜1000IU、または50,000〜500,000IUの1種または複数の試験作用物質と一緒に培養される。いくつかの例において、in vitroで細胞に添加される試験作用物質(複数可)(例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される)の量は、半対数(half−log)漸増濃度においてスクリーニングされた1nMから10μMである。特定の実施形態において、試験作用物質はVDRアゴニストを含む。
VDRが線維症を処置または予防する作用物質を同定するための標的であるという観察に基づいて、線維症、例えば、肝臓、膵臓および/または腎臓の線維症を処置または予防することのできる1つまたは複数の作用物質を同定するスクリーニング方法を、本明細書において提供する。いくつかの例において、該方法は、細胞(例えば、肝星細胞、膵臓星細胞、肺星細胞、心臓星細胞または腎星細胞)と、1つまたは複数の試験作用物質とを接触させるステップを含む。1つの例において、細胞は、肝星細胞、例えば、初代細胞または肝星細胞由来の不死化細胞系または星細胞のいくつかの表型的または機能的特徴を保持する他の細胞系である。いくつかの例において、複数の細胞を、一度に1つの試験作用物質と接触させる。いくつかの例において、複数の細胞を、2種またはそれ超の異なる試験作用物質、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10種の異なる試験作用物質と、同時に接触させる。添加する試験作用物質の量は、当業者により決定可能である。いくつかの例において、in vitroで細胞に添加される試験作用物質(複数可)(例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される)の量は、少なくとも1nM、少なくとも10nM、少なくとも100nM、少なくとも1mM、少なくとも10mM、少なくとも100mM、または1000mM、例えば、1nM〜1M、1nM〜100nMまたは1nM〜10nMである。いくつかの例において、細胞は、少なくとも1国際単位(IU)、例えば、少なくとも5IU、少なくとも10IU、少なくとも10IU、少なくとも100IU、少なくとも1000IU、少なくとも5000IU、少なくとも10,000IU、少なくとも50,000IU、少なくとも100,000IUまたは少なくとも500,000IU、例えば、5IUから約50,000IU、5〜10,000IU、10〜1000IU、または50,000〜500,000IUの1種または複数の試験作用物質と一緒に培養される。いくつかの例において、in vitroで細胞に添加される試験作用物質(複数可)(例えば、試験作用物質は、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートまたは他の基材において、成長培地中の培養物において成長する細胞に添加される)の量は、半対数(half−log)漸増濃度においてスクリーニングされた1nMから10μMである。特定の実施形態において、試験作用物質はVDRアゴニストを含む。
いくつかの例において、細胞を、細胞によるVDR発現を、TGF−β1の非存在下での発現と比較して増加させるために十分な量のTGF−β1とさらに接触させる。いくつかの例において、細胞によるVDRの発現は、TGF−β1を添加しない発現量と比較して、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも20倍、例えば、2倍〜50倍、2倍〜20倍、2倍〜10倍、2倍〜5倍、3倍、4倍、5倍または6倍増加させる。VDR発現を測定する方法は、当分野において公知であり、限定するものではないが、PCR、RT−qPCR、FISH、ウエスタンブロッティング、およびタンパク質の蛍光顕微鏡検査などを挙げることができる。いくつかの例において、該方法は、TGF−β1の添加後のVDRの発現を測定するステップをさらに含む。添加するTGF−β1の量は、当業者により決定可能である。いくつかの例において、in vitroで細胞に添加するTGF−β1の量は、少なくとも0.1ng/ml、少なくとも1ng/ml、少なくとも5ng/mL、少なくとも10ng/ml、少なくとも100ng/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも100mg/mlまたは1000mg/ml、例えば、0.1ng/ml〜1g/ml、1ng/ml〜100ng/ml、1ng/ml〜5ng/mLまたは1ng/ml〜10ng/ml、例えば、1ng/mlである。
いくつかの例において、1種または複数の試験作用物質が、TGF−β1と同じ時に、例えば、同時に(simultaneously)、または同時に(contemporaneously)細胞に添加される。いくつかの例において、試験作用物質は、TGF−β1の前、例えば、TGF−β1の少なくとも1時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間または少なくとも24時間前の期間に添加される。いくつかの例において、TGF−β1は、試験作用物質の前、例えば、試験作用物質(複数可)の少なくとも1時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間または少なくとも24時間前の期間(例えば、4〜6時間前)に添加される。いくつかの例において、試験作用物質およびTGF−β1は細胞と一緒に、少なくとも30分、例えば、少なくとも60分、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間または少なくとも48時間、例えば、6〜24時間、6〜12時間または8〜24時間、例えば、24時間インキュベートされる。
1種または複数の試験作用物質およびTGF−β1と一緒のインキュベーション後、該方法は、(1)細胞によるVDRアゴニストもしくはカルシトリオールの産生を検出するステップ、(2)細胞によるCYP24A1の産生を検出するステップ、(3)細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾もしくは発現を検出するステップ、または(4)VDRのVDRアゴニストへの結合を検出するステップ、の1つまたは複数を含むことができる。このような測定方法は当分野において周知であり、本開示は、特定の検出方法に限定されるものではない。例えば、細胞によるVDRアゴニストの産生は、質量分析、イムノアッセイまたは他のアッセイ系(特定の化学構造物または化学構造物のファミリーを検出可能なin vivoの細胞ベースおよびin vitroのVDR/コアクチベーター会合アッセイを含む)により測定することができる。細胞によるCYP24A1および/またはSMAD3の産生または発現は、核酸またはタンパク質発現の測定に使用される任意の方法、例えば、CYP24A1特異的抗体またはSMAD3特異的抗体を使用する方法(例えば、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学など)およびCYP24A1特異的またはSMAD3特異的なプローブまたはプライマーを使用する方法(例えば、PCR増幅、in situハイブリダイゼーションなど)により測定することができる。VDRのVDRアゴニストへの結合を測定する方法は、限定するものではないが、リガンド誘導性受容体−コアクチベーター結合の測定(例えば、AlphaQuest(登録商標)系、Perkin Elmer製を使用する)、リガンド誘導性受容体−コアクチベーター結合のFRET測定、競合リガンド結合アッセイ(例えば、放射標識されたVDRリガンドを使用する)、リガンド結合ドメインの差次的熱安定性などを含む。
試験作用物質は、(1)1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて細胞によるVDRアゴニストまたはカルシトリオールの産生を少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍もしくは少なくとも10倍増加させる、(2)1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて肝細胞によるCYP24A1の産生または発現を、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍もしくは少なくとも10倍増加させる、(3)1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて肝細胞によるSMAD3の産生または発現を、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍もしくは少なくとも10倍減少させる、または(4)1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べてVDRのVDRアゴニストへの結合を、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍もしくは少なくとも10倍増加させる、のうちの1つまたは複数を行うものを選択することができ、ここで、該選択される作用物質が線維症を処置もしくは予防できる作用物質である。
いくつかの実施形態において、スクリーニング方法は、細胞により産生されたVDRアゴニストが、Cyp24A1により分解され得るかどうかを決定するステップを含み、他の実施形態において、該方法は、Cyp24A1によるVDRアゴニストの分解をもたらさなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、作用物質がin vitroで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含み、ある特定の例において、該方法は、in vitroで高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む。さらに他の実施形態において、該方法は、作用物質がin vivoで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含み、ある特定の例において、該方法は、in vivoで高カルシウム血性効果を有さなかった(例えば、血中カルシウムレベル≧3mmol/lを引き起こさなかった)試験作用物質を選択するステップもまた含む。
さらなる実施形態は、選択した試験作用物質のうちの1種または複数を、線維症を有する哺乳動物に投与するステップ、および該1種または複数の試験作用物質が線維症を処置または予防するかどうかを決定するステップを含み、いくつかの例において、線維症を処置または予防した試験作用物質を選択するステップを含む。線維症の動物モデル、例えば、下記の実施例に記載の肝臓の傷害および線維症のCCl4モデルは周知である。
in vivoまたはin vitroで星細胞によるVDRの発現を増加させる方法もまた、本明細書において提供される。このような方法は、星細胞と、VDRアゴニストのVDRへの結合を少なくとも10倍増強するのに十分な量のVDRアゴニストおよび必要に応じて、十分な量のTGF−β1とを接触させるステップを含むことができる。
(実施例1)
実験手順
本実施例は、下記の実施例に記載の結果のための材料および方法を提供する。
実験手順
本実施例は、下記の実施例に記載の結果のための材料および方法を提供する。
初代HSCの単離および培養
HSCを、10週齢の雄C57BL/6JマウスおよびWistarラットから、すでに報告されているin situプロナーゼ、コラゲナーゼ潅流および単一ステップのHistogenz勾配(Hendriksら、1985年;Knookら、1982年)により単離した。単離されたHSCを、20%FBS(Hyclone)を含有するDMEM(Mediatech)中で6ウェルプレートにおいて40時間培養し、その後エンドポイントアッセイを実施した。
HSCを、10週齢の雄C57BL/6JマウスおよびWistarラットから、すでに報告されているin situプロナーゼ、コラゲナーゼ潅流および単一ステップのHistogenz勾配(Hendriksら、1985年;Knookら、1982年)により単離した。単離されたHSCを、20%FBS(Hyclone)を含有するDMEM(Mediatech)中で6ウェルプレートにおいて40時間培養し、その後エンドポイントアッセイを実施した。
免疫沈降およびウエスタンブロット
全細胞溶解物を、RIPAバッファーによる溶解を介して得、核抽出物の単離を、すでに報告されているように実施した(Dingら、2008年)。全SMAD3および核SMAD3を、それぞれ、LX−2全細胞および核抽出物から抗SMAD2/3抗体(Santa Cruz、sc−133098)を使用して免疫沈降させ、その後、SDS−PAGEおよび抗SMAD3(Cell Signaling、9523)および抗pSMAD3(Cell Signaling、9520)特異的抗体によるウエスタンブロット検出を行った。
全細胞溶解物を、RIPAバッファーによる溶解を介して得、核抽出物の単離を、すでに報告されているように実施した(Dingら、2008年)。全SMAD3および核SMAD3を、それぞれ、LX−2全細胞および核抽出物から抗SMAD2/3抗体(Santa Cruz、sc−133098)を使用して免疫沈降させ、その後、SDS−PAGEおよび抗SMAD3(Cell Signaling、9523)および抗pSMAD3(Cell Signaling、9520)特異的抗体によるウエスタンブロット検出を行った。
細胞培養、ルシフェラーゼアッセイおよびRT−qPCR
Professor Scott Friedman、Mount Sinai School of Medicine、New York、NYのご厚意により寄贈されたLX−2細胞を、先に記載(Xuら、2005年)のように培養した。TGFβ1(R&D Systems)、1,25(OH)2D3およびカルシポトリオール(Tocris)を、他のことが示された場合を除いて、それぞれ、1ng/ml、100nMおよび100nMの濃度で使用した。ルシフェラーゼアッセイのために、DNAトランスフェクションを、Fugene6(Roche)を使用して製造業者の指示に従って実施した。DNAトランスフェクションの24時間後、細胞を、ビヒクル、カルシポトリオールもしくはTGFβ1または両方でさらに24時間処置し、その後、ルシフェラーゼ/β−ガラクトシダーゼアッセイ(Promega)を行った。RT−qPCRを行い、TRIzol抽出の後で全RNAを精製して、DNaseI(Invitrogen)で処理した。cDNA合成を、iScript RT Supermix(Biorad)により実施した。定量的PCRを、SYBR Green試薬(Biorad)を使用して技術的に三連で実施した。相対標準曲線法を定量(Biorad)のために使用した。発現レベルをGapdh(マウス)またはU36B4(ヒト)の量のいずれかに対して正規化することによって計算した。プライマーの配列を表2に列挙する。
Professor Scott Friedman、Mount Sinai School of Medicine、New York、NYのご厚意により寄贈されたLX−2細胞を、先に記載(Xuら、2005年)のように培養した。TGFβ1(R&D Systems)、1,25(OH)2D3およびカルシポトリオール(Tocris)を、他のことが示された場合を除いて、それぞれ、1ng/ml、100nMおよび100nMの濃度で使用した。ルシフェラーゼアッセイのために、DNAトランスフェクションを、Fugene6(Roche)を使用して製造業者の指示に従って実施した。DNAトランスフェクションの24時間後、細胞を、ビヒクル、カルシポトリオールもしくはTGFβ1または両方でさらに24時間処置し、その後、ルシフェラーゼ/β−ガラクトシダーゼアッセイ(Promega)を行った。RT−qPCRを行い、TRIzol抽出の後で全RNAを精製して、DNaseI(Invitrogen)で処理した。cDNA合成を、iScript RT Supermix(Biorad)により実施した。定量的PCRを、SYBR Green試薬(Biorad)を使用して技術的に三連で実施した。相対標準曲線法を定量(Biorad)のために使用した。発現レベルをGapdh(マウス)またはU36B4(ヒト)の量のいずれかに対して正規化することによって計算した。プライマーの配列を表2に列挙する。
siRNAのトランスフェクション
トランスフェクションを、20nMの濃度の表示のsiRNAで(SMAD2/3の場合、10nMの各siRNAをトランスフェクション用に組み合わせた)、RNAiMaxトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクトされた細胞を、撹乱せずに少なくとも48時間培養し、その後末端アッセイを行った。
トランスフェクションを、20nMの濃度の表示のsiRNAで(SMAD2/3の場合、10nMの各siRNAをトランスフェクション用に組み合わせた)、RNAiMaxトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクトされた細胞を、撹乱せずに少なくとも48時間培養し、その後末端アッセイを行った。
肝臓の傷害および線維症のCCl4モデル
8週齢の雄C57BL/6Jマウスに、0.5ml/kg体重のCCl4(Sigmaのコーン油中1:50v/v)またはビヒクル(コーン油中DMSO)を、週に3回を4週間IP注射した。カルシポトリオール(20μg/kg体重)を、経口強制栄養により、CCl4の初回投与の20日後に開始して週に5回投与した。動物を、最終CCl4注射の72時間後に終結させ、全肝臓および血清を、組織学的、細胞学的、生化学的および分子的分析用に回収した。
8週齢の雄C57BL/6Jマウスに、0.5ml/kg体重のCCl4(Sigmaのコーン油中1:50v/v)またはビヒクル(コーン油中DMSO)を、週に3回を4週間IP注射した。カルシポトリオール(20μg/kg体重)を、経口強制栄養により、CCl4の初回投与の20日後に開始して週に5回投与した。動物を、最終CCl4注射の72時間後に終結させ、全肝臓および血清を、組織学的、細胞学的、生化学的および分子的分析用に回収した。
Vdrノックアウトマウス
Vdrの標的除去についてヘテロ接合性のC57BL/6Jマウス(Liら、1997年)をThe Jackson Laboratory(Stock Number006133)から入手した。野生型対照、Vdr+/−およびVdr−/−マウスを、21%カルシウムおよび0.67%のリンおよび20%のラクトースを含有し、4.4ユニットのビタミンD/グラム食餌を補充したVdr−/−救済食餌(Amlingら、1999年)で6カ月飼育し、その後犠牲にした。肝臓を、上記の分析用に回収した。
Vdrの標的除去についてヘテロ接合性のC57BL/6Jマウス(Liら、1997年)をThe Jackson Laboratory(Stock Number006133)から入手した。野生型対照、Vdr+/−およびVdr−/−マウスを、21%カルシウムおよび0.67%のリンおよび20%のラクトースを含有し、4.4ユニットのビタミンD/グラム食餌を補充したVdr−/−救済食餌(Amlingら、1999年)で6カ月飼育し、その後犠牲にした。肝臓を、上記の分析用に回収した。
線維化スコアおよび肝コラーゲンおよびヒドロキシプロリン含有量の定量
ホルマリン固定肝臓の5μm切片を、標準的H&Eおよびシリウスレッド法に従って染色し、実験条件を知らされていない病理学者が精査した。線維症を、Ishak変形組織学的活動指数(HAI)スコアリング系を使用してスコア付けした。線維症を、またImage Jソフトウェアを使用して、10の非隣接シリウスレッド染色切片に対して定量した。すべての画像は、×4/0.13、×10/0.30、×20/0.50および×40/0.75のUplanFL N plan対物レンズを搭載したOlympus顕微鏡に装着された高解像度Leica DFC420デジタルカメラを使用して得、Leica Application Suiteで処理した。肝ヒドロキシプロリン含有量を、Biovision(K555−100)による市販の比色アッセイを使用して測定した。
ホルマリン固定肝臓の5μm切片を、標準的H&Eおよびシリウスレッド法に従って染色し、実験条件を知らされていない病理学者が精査した。線維症を、Ishak変形組織学的活動指数(HAI)スコアリング系を使用してスコア付けした。線維症を、またImage Jソフトウェアを使用して、10の非隣接シリウスレッド染色切片に対して定量した。すべての画像は、×4/0.13、×10/0.30、×20/0.50および×40/0.75のUplanFL N plan対物レンズを搭載したOlympus顕微鏡に装着された高解像度Leica DFC420デジタルカメラを使用して得、Leica Application Suiteで処理した。肝ヒドロキシプロリン含有量を、Biovision(K555−100)による市販の比色アッセイを使用して測定した。
ChIPおよびChIP−Re−ChIP
LX−2細胞を、カルシポトリオール(100nM)で16時間前処理し、その後、カルシポトリオール(100nM)もしくはTGFβ1(1ng/ml)または両方とさらに4時間インキュベーションした。次いで細胞をChIPアッセイ用に収集した。ChIPのための実験手順は、すでに記載されていた(Barishら、2010年)。簡潔に言うと、固定後、LX−2細胞から核を単離し、溶解して、Diagenode Bioruptorでせん断して、200〜1000塩基対のサイズのDNA断片を得、その後以下に列挙した抗体:正常ウサギIgG(Santa Cruz、sc−2027)、VDR(Santa Cruz、sc−1008)、SMAD3(Abcam、ab28379)およびヒストンH3(Abcam、ab1791)を使用して免疫沈降させた。ChIP−Re−ChIPに関しては、第1のChIPの後で、免疫沈降させたDNA−タンパク質複合体を、10mM DTTを使用してビーズから溶出させ、100倍に希釈し、その後、第2の抗体、re−ChIPにより再免疫沈降させた。
LX−2細胞を、カルシポトリオール(100nM)で16時間前処理し、その後、カルシポトリオール(100nM)もしくはTGFβ1(1ng/ml)または両方とさらに4時間インキュベーションした。次いで細胞をChIPアッセイ用に収集した。ChIPのための実験手順は、すでに記載されていた(Barishら、2010年)。簡潔に言うと、固定後、LX−2細胞から核を単離し、溶解して、Diagenode Bioruptorでせん断して、200〜1000塩基対のサイズのDNA断片を得、その後以下に列挙した抗体:正常ウサギIgG(Santa Cruz、sc−2027)、VDR(Santa Cruz、sc−1008)、SMAD3(Abcam、ab28379)およびヒストンH3(Abcam、ab1791)を使用して免疫沈降させた。ChIP−Re−ChIPに関しては、第1のChIPの後で、免疫沈降させたDNA−タンパク質複合体を、10mM DTTを使用してビーズから溶出させ、100倍に希釈し、その後、第2の抗体、re−ChIPにより再免疫沈降させた。
ChIP−seqデータ分析
この手順は既に記載されていた(Barishら、2010年)。簡潔に言うと、短鎖DNAリードを、Illumina Pipeline Suite v1.7を使用してヒトhg18参照ゲノム(NCBI Build 36.1)に対してアライメントした。リードは、リード中の2つまでの不一致を許容するBowtie alignerを使用してアライメントした。ゲノムに対してユニークにマッピングされたタグだけを、さらなる分析用と見なした。その後のピークコーリングおよびモチーフ分析を、ChIP−Seq分析に適切なソフトウェアであるHOMERを使用して実施した。下記のHOMERの方法は実装されており、http://biowhat.ucsd.edu/homer/(Heinzら、2010年)において自由に利用可能である。それぞれのユニークな位置に由来する1つのタグを検討して、ChIPSeqプロトコールの間の断片のクローン性増幅からもたらされたピークを除外した。200bpのスライディングウインドウ内のタグのクラスタに対して検索し、互いに少なくとも1kb離れた隣接クラスタを要求することによって、ピークを同定した。有効なピークを決定するタグの数に対する閾値は、ランダム化されたタグ位置を使用してピーク発見手順を反復することにより経験的に決定されるとおりに、<0.0001の偽発見率について、選択した。ゲノムの重複または非局在化結合を有する領域を同定することを回避するために、ピークは、インプットまたはIgG対照試料より(合計数に対して正規化された)少なくとも4倍超のタグおよび局所バックグラウンド領域(10kb)と比べて4倍超のタグを有する必要がある。最も近いRefSeq転写開始部位を同定することによって、ピークを遺伝子産物に対してアノテーションする。ChIP−Seq結果の可視化は、UCSCゲノムブラウザ上にカスタムトラックをアップロードすることによって達成された。ヒト表現型分析は、GREAT(Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)、http://great.stanford.edu/を使用して実施した。
この手順は既に記載されていた(Barishら、2010年)。簡潔に言うと、短鎖DNAリードを、Illumina Pipeline Suite v1.7を使用してヒトhg18参照ゲノム(NCBI Build 36.1)に対してアライメントした。リードは、リード中の2つまでの不一致を許容するBowtie alignerを使用してアライメントした。ゲノムに対してユニークにマッピングされたタグだけを、さらなる分析用と見なした。その後のピークコーリングおよびモチーフ分析を、ChIP−Seq分析に適切なソフトウェアであるHOMERを使用して実施した。下記のHOMERの方法は実装されており、http://biowhat.ucsd.edu/homer/(Heinzら、2010年)において自由に利用可能である。それぞれのユニークな位置に由来する1つのタグを検討して、ChIPSeqプロトコールの間の断片のクローン性増幅からもたらされたピークを除外した。200bpのスライディングウインドウ内のタグのクラスタに対して検索し、互いに少なくとも1kb離れた隣接クラスタを要求することによって、ピークを同定した。有効なピークを決定するタグの数に対する閾値は、ランダム化されたタグ位置を使用してピーク発見手順を反復することにより経験的に決定されるとおりに、<0.0001の偽発見率について、選択した。ゲノムの重複または非局在化結合を有する領域を同定することを回避するために、ピークは、インプットまたはIgG対照試料より(合計数に対して正規化された)少なくとも4倍超のタグおよび局所バックグラウンド領域(10kb)と比べて4倍超のタグを有する必要がある。最も近いRefSeq転写開始部位を同定することによって、ピークを遺伝子産物に対してアノテーションする。ChIP−Seq結果の可視化は、UCSCゲノムブラウザ上にカスタムトラックをアップロードすることによって達成された。ヒト表現型分析は、GREAT(Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)、http://great.stanford.edu/を使用して実施した。
マイクロアレイデータ分析
初代のラットまたはマウスHSC由来の全RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen)を使用して標準的プロトコールに従って単離した。RNAの完全性および品質を、Agilent Bioanalyzerを使用して評価し、Illuminaのラットまたはマウスの遺伝子発現アッセイとのハイブリダイゼーション用に、標準的Illuminaプロトコールに従って調製した。特徴抽出を、Illumina GenomeStudioソフトウェアを使用して実施した。生物学的重複(biological duplicates)からの差次的に発現した遺伝子の正規化および同定を、VAMPIRE、http://sasquatch.ucsd.edu/vampire/を使用して実施した。
初代のラットまたはマウスHSC由来の全RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen)を使用して標準的プロトコールに従って単離した。RNAの完全性および品質を、Agilent Bioanalyzerを使用して評価し、Illuminaのラットまたはマウスの遺伝子発現アッセイとのハイブリダイゼーション用に、標準的Illuminaプロトコールに従って調製した。特徴抽出を、Illumina GenomeStudioソフトウェアを使用して実施した。生物学的重複(biological duplicates)からの差次的に発現した遺伝子の正規化および同定を、VAMPIRE、http://sasquatch.ucsd.edu/vampire/を使用して実施した。
受託番号
全データセット(ChIP−seqおよびマイクロアレイ)のGEO受託番号はGSE38103である。
全データセット(ChIP−seqおよびマイクロアレイ)のGEO受託番号はGSE38103である。
(実施例2)
VDRは肝臓線維症を予防する
以前の結果(Abramovitchら、2011年;Gascon-Barreら、2003年)と一致して、VdrはHSCにおいて発現されるが、全肝臓または精製肝細胞のどちらにおいても検出不可であることが観察された(図1A〜C)。さらに、十分に確立されたTGFβ1応答性ヒトHSC細胞系(Xuら、2005年)である初代HSCおよびLX−2細胞の両方において、1,25(OH)2D3またはその低カルシウム血性類似体のカルシポトリオール(Cal)(Nagpalら、2005年)(図2A)、のいずれかによるCYP24A1発現のリガンド誘導により決定した場合、HSC発現VDRは、完全に機能性である(図1Dおよび1E)。
VDRは肝臓線維症を予防する
以前の結果(Abramovitchら、2011年;Gascon-Barreら、2003年)と一致して、VdrはHSCにおいて発現されるが、全肝臓または精製肝細胞のどちらにおいても検出不可であることが観察された(図1A〜C)。さらに、十分に確立されたTGFβ1応答性ヒトHSC細胞系(Xuら、2005年)である初代HSCおよびLX−2細胞の両方において、1,25(OH)2D3またはその低カルシウム血性類似体のカルシポトリオール(Cal)(Nagpalら、2005年)(図2A)、のいずれかによるCYP24A1発現のリガンド誘導により決定した場合、HSC発現VDRは、完全に機能性である(図1Dおよび1E)。
VDRシグナル伝達が線維化遺伝子発現を抑制し、in vivoの肝線維形成を妨害することができるかどうかに対処するために、肝臓線維症を、野生型C57BL/6Jマウスにおいて、広く使用される肝毒性物質の四塩化炭素(CCl4)を0.5ml/kgの用量で腹腔内(IP)注射を週に3回行うことによって誘導した。4週までに、CCl4処置マウスは、相当のコラーゲン沈着を伴う広範囲に及ぶ肝臓架橋線維症を示したが、一方、CCl4/カルシポトリオール共処置マウスは、シリウスレッド染色の定量、肝ヒドロキシプロリン含有量および組織学的線維化スコア付により実証されるとおり、線維症の有意な減少を有した(図3A〜3D)。血清カルシウム濃度は、カルシポトリオール処置により有意に変化しなかった(図2B)。鍵となる線維化マーカー遺伝子、例えば、Col1a1、Tgfb1およびTimp1は、カルシポトリオールによる50〜70%の間の下方制御を明らかにした(図3E〜3G)。興味深いことに、マウスをカルシポトリオールで5週間前処置し、その後CCl4/カルシポトリオールの共処置を行った場合、肝臓における線維形成反応は、ほぼ完全に阻害され(図2C〜F)、VDRアゴニストが線維症を弱める能力を保有するだけでなく、肝臓線維症をin vivoで積極的に予防する潜在力を保有することが示唆された。
このことから、本発明者らは、VDRの欠乏が、肝臓線維形成に影響を与え得るかどうかを検査するに至った。実際、6カ月齢のVdr−/−マウスは、コラーゲン沈着の増加により実証される特発性肝臓傷害/線維症表現型を示し、4匹のうちの2匹のマウスが、肝細胞壊死および門脈路周囲の壊死性炎症の病巣(図3H、右/下、矢印)を伴う明白な硬変(図3H、右/上)を発症した。肝臓切片のシリウスレッド染色を使用して観察された肝臓線維症の程度にいくらかの変動性が存在するので、肝ヒドロキシプロリン含有量を、最も軽度の線維症(非硬変マウス)を示す2匹のVdr−/−マウスにおいて測定し、野生型またはVdr+/−マウスのいずれかに観察された含有量より有意に多いことをさらに見出した(図3I)。さらに、Vdr+/−マウスは、炎症性応答の非存在下で類洞周囲の線維症の複数の病巣を示し(図3H、中央/上、矢印)、同一のカルシウムおよびリン酸塩補充食餌で飼育された対照の野生型マウスにおいて、病理は観察されなかった(図3H、左)。組織学的所見を、肝ヒドロキシプロリン含有量の定量および鍵となる線維化マーカー遺伝子Col1a1の検査より確認した(図3I〜3J)。
これらのデータは、両方のVdr対立遺伝子が正常な肝臓構造の維持に必要であり、完全に阻害された場合、線維形成の調節不全に加えて、局所炎症応答の制御の喪失をもたらすことを示している。
(実施例3)
VDRシグナル伝達は、TGFβ誘導性線維化促進遺伝子を抑制する
発現プロファイルを使用して、TGFβ1およびTGFβ1+1,25(OH)2D3−処置初代ラットのHSCにおけるVDRシグナル伝達の影響の可能性を調査した。特に、1,25(OH)2D3処置は、HSCの培養誘導性活性化を減弱させ、したがって、処置細胞のトランスクリプトームは新鮮に単離された静止細胞と非常に似ており(図4A)、1,25(OH)2D3とTGFβ1との共処置は、TGFβ1誘導遺伝子の大きなセットの著しい抑制をもたらした(完全なリストに関しては、Dingら、Cell、153:610〜13頁、2013年の表S1を参照されたく、当該文献は本明細書に参照により組み込まれ、より短いリストを下記の表3に提供する)。
VDRシグナル伝達は、TGFβ誘導性線維化促進遺伝子を抑制する
発現プロファイルを使用して、TGFβ1およびTGFβ1+1,25(OH)2D3−処置初代ラットのHSCにおけるVDRシグナル伝達の影響の可能性を調査した。特に、1,25(OH)2D3処置は、HSCの培養誘導性活性化を減弱させ、したがって、処置細胞のトランスクリプトームは新鮮に単離された静止細胞と非常に似ており(図4A)、1,25(OH)2D3とTGFβ1との共処置は、TGFβ1誘導遺伝子の大きなセットの著しい抑制をもたらした(完全なリストに関しては、Dingら、Cell、153:610〜13頁、2013年の表S1を参照されたく、当該文献は本明細書に参照により組み込まれ、より短いリストを下記の表3に提供する)。
これらのうち、39の遺伝子は、コラーゲン(BatallerおよびBrenner、2005年;Tsukadaら、2006年)、Tgfスーパーファミリのメンバー(InagakiおよびOkazaki、2007年)、マトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのメンバー(Mmps)(Arthur、2000年;Han、2006年)、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(Timps)(Arthur、2000年;Yoshijiら、2002年)、インテグリン(PatsenkerおよびStickel、2011年)およびリシルオキシダーゼファミリーのメンバー(Barry-Hamiltonら、2011年;KaganおよびLi、2003年;Vadaszら、2005年)を含む肝臓線維形成の中心であった(図4B)。
次に、初代マウスHSCおよびLX−2細胞の両方において、カルシポトリオールが線維化遺伝子発現を強力に抑制したことが確認され、VDRアゴニストの抗TGFβ特性は、哺乳動物種にわたって保存されている可能性があることを示唆していた(データ非掲載)。最後に、LX−2細胞においてRNAiを使用して、VDRの喪失が、TGFβ1誘導遺伝子発現のカルシポトリオール媒介性抑制を無効にすることが観察され(図4C)、併せて、VDRが、抗TGFβ/線維化ネットワークをin vitroで調節することが明らかにされた。
(実施例4)
HSCにおけるVDRシストロームおよびSMAD3シストロームの定義
この実施例は、VDRが、抗線維化遺伝子ネットワークの直接または間接的な調節因子であるかどうかを決定するために使用される方法を記載する。SMAD2およびSMAD3は、HSCにおいてTGFβ1誘導線維化促進遺伝子発現を必要とし(図5A)、VDRの活性化は、TGFβ1誘導性リン酸化およびその後のSMAD3の核移行に有意な影響を与えず(図5B)、VDRに対する直接調節の役割が提唱された。この可能性を調査するために、ゲノム全域にわたるVDRおよびSMAD3の結合部位を、カルシポトリオールおよびTGFβ1の両方と一緒に培養されたLX−2細胞において、クロマチン免疫沈降をハイスループットディープシーケンシング(ChIP−Seq)と併せて使用して分析した。得られたシストロームにより、24,984のVDRおよび23,581のSMAD3高信頼度結合部位を同定した(FDR<0.0001)(図6Aおよび6E)。他の転写因子に対する包括的な結合パターンの報告(Barishら、2010年;Biddieら、2011年;Heinzら、2010年;Trompoukiら、2011年)と一致して、VDRおよびSMAD3の結合部位の大部分は局在化し、遺伝子間領域およびイントロン領域から離れており、わずか16−21%が遺伝子プロモーターに見出されている(図6Aおよび6E)。
HSCにおけるVDRシストロームおよびSMAD3シストロームの定義
この実施例は、VDRが、抗線維化遺伝子ネットワークの直接または間接的な調節因子であるかどうかを決定するために使用される方法を記載する。SMAD2およびSMAD3は、HSCにおいてTGFβ1誘導線維化促進遺伝子発現を必要とし(図5A)、VDRの活性化は、TGFβ1誘導性リン酸化およびその後のSMAD3の核移行に有意な影響を与えず(図5B)、VDRに対する直接調節の役割が提唱された。この可能性を調査するために、ゲノム全域にわたるVDRおよびSMAD3の結合部位を、カルシポトリオールおよびTGFβ1の両方と一緒に培養されたLX−2細胞において、クロマチン免疫沈降をハイスループットディープシーケンシング(ChIP−Seq)と併せて使用して分析した。得られたシストロームにより、24,984のVDRおよび23,581のSMAD3高信頼度結合部位を同定した(FDR<0.0001)(図6Aおよび6E)。他の転写因子に対する包括的な結合パターンの報告(Barishら、2010年;Biddieら、2011年;Heinzら、2010年;Trompoukiら、2011年)と一致して、VDRおよびSMAD3の結合部位の大部分は局在化し、遺伝子間領域およびイントロン領域から離れており、わずか16−21%が遺伝子プロモーターに見出されている(図6Aおよび6E)。
VDRおよびSMAD3の結合部位のリストから、すでに特徴付けられた機能性ビタミンD応答エレメント(VDRE)の数を、公知のビタミンD−誘導遺伝子、例えば、CYP24A1(図6B)、SPP1、BGLAP(図7A〜7B)およびID1(図6F)、SMAD7ならびにTGFβI(図7Cおよび7D)を含む、TGFβシグナル伝達標的遺伝子のためのSMAD結合エレメント(SBE)に関して確認した。遺伝子のアノテーション分析により最も近い転写開始部位への近接に基づいてピークを割り当て、個別のVDRシストロームおよびSMAD3シストローム中にそれぞれ11,031および9,210の推定標的遺伝子を得た。これらのアノテーションを付与された遺伝子の遺伝子オントロジー(GO)分析により、推定のVDR標的遺伝子およびSMAD3標的遺伝子に関する最も一般的な分類された機能は、代謝(47%)および細胞シグナル伝達(34%)であったことが明らかにされた(図6Cおよび6G)。
最後に、VDRおよびSMAD3に関する最も有意に富化された結合モチーフを調べた。これらの配列シグネチャーの中で、3bpスペーサーを有する直接六量体リピート(DR3)のコンセンサス配列がVDR部位における最も富化されたモチーフであり、VDR結合ピークの74%を説明しており(図6D、上)、一方、コンセンサスSBE配列、GTCTモチーフはSMAD3結合ピークの83%を占める(図6H、上)。興味深いことに、この分析は、GTCTおよびDR3タイプのモチーフが、それぞれ、VDR結合部位およびSMAD3結合部位においてヌクレオソームの距離内で共富化されることを明らかにし、VDRおよびSMAD3が、交差するシストロームを介して連絡していることを示唆していた(図6Dおよび6H、下)。
(実施例5)
VDR/SMAD3ゲノムクロストークを介したTGFβシグナル伝達のアンタゴニズム
この可能性に対処するために、バイオインフォマティクス分析を使用してVDRおよびSMAD3両方により結合された部位の数を計算することによって、シストロームの交差の程度を定量した。合計10,436のゲノム部位が、共占有され(図8A)、この共占有パターンは、SMAD3結合ピークの周囲のVDR部位を定量するヒートマップにより可視化されるとおり、ゲノム全域にわたった(図8B)。このゲノム交差が、VDR/SMAD3のクロストークを媒介する場合、VDRおよびSMAD3は、これらの共占有部位と同時に相互作用可能である。逐次ChIP(ChIP−re−ChIP)実験により、VDRおよびSMAD3が、少なくとも一時的に、同じゲノム部位を共占有できることが確認された(図8C)。
VDR/SMAD3ゲノムクロストークを介したTGFβシグナル伝達のアンタゴニズム
この可能性に対処するために、バイオインフォマティクス分析を使用してVDRおよびSMAD3両方により結合された部位の数を計算することによって、シストロームの交差の程度を定量した。合計10,436のゲノム部位が、共占有され(図8A)、この共占有パターンは、SMAD3結合ピークの周囲のVDR部位を定量するヒートマップにより可視化されるとおり、ゲノム全域にわたった(図8B)。このゲノム交差が、VDR/SMAD3のクロストークを媒介する場合、VDRおよびSMAD3は、これらの共占有部位と同時に相互作用可能である。逐次ChIP(ChIP−re−ChIP)実験により、VDRおよびSMAD3が、少なくとも一時的に、同じゲノム部位を共占有できることが確認された(図8C)。
次に、抗TGFβシグナル伝達がVDR/SMADのゲノム交差により媒介される場合、その場合は、HSC中の線維化促進遺伝子は、一緒に結合された調節エレメントにおいて大きな比率を占めるはずである。実際に、ヒト表現型を指定するGO分析により、VDRおよびSMAD3により共占有された病巣に関する「異常な瘢痕形成」応答の有意な富化(67%)が示され(図8D)、早期に同定された39の線維化促進遺伝子による潜在的VDR/SMAD3共占有の検査に至った(図4B)。このサブセット内で、34が、VDR/SMAD3共占有部位を含有することが見出された(図8E)。さらに、これらの遺伝子の多くが、複数のVDR/SMAD3共占有部位を含有することが見出された(図8Fおよび表3)。
COL1A1遺伝子上のVDR/SMAD3共結合部位を担持するルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、これらのゲノムエレメントが、カルシポトリオールおよびTGFβ1の対立する作用を、少なくとも部分的に再現できることが観察され、これらのシスエレメントが、線維化促進遺伝子発現のエンハンサーとして機能することを示した(図9A)。
(実施例6)
VDR/SMADのゲノムアンタゴニズム
共占有ゲノム領域におけるVDRとSMAD3との間の空間的関係のインフォマティクス分析により、これらのそれぞれの応答エレメントが、1つのヌクレオソームウインドウ(≦200塩基対)内に共局在していることを確認し(図9B)、近位のDNA結合によるゲノムアンタゴニズム(Barishら、2010年;Hua ら、2009年)の可能性をさらに支持している。
VDR/SMADのゲノムアンタゴニズム
共占有ゲノム領域におけるVDRとSMAD3との間の空間的関係のインフォマティクス分析により、これらのそれぞれの応答エレメントが、1つのヌクレオソームウインドウ(≦200塩基対)内に共局在していることを確認し(図9B)、近位のDNA結合によるゲノムアンタゴニズム(Barishら、2010年;Hua ら、2009年)の可能性をさらに支持している。
VDR/SMADゲノムアンタゴニズムの存在は、VDRおよびSMAD3の共占有部位の中心に対するこれらの平均ChIP−Seqシグナル強度をプロットすることによって可視化可能である。これにより、カルシポトリオールの存在下で、SMAD3のTGFβ誘導性動員が、全体的に約1.5倍損なわれたが、一方、VDRのこれらの部位への結合が、全体的にほぼ10倍増強されたことが実証された(図10A〜10B)。加えて、提唱されたゲノムアンタゴニズムを、VDR/SMAD共占有調節エレメント、例えばCOL1A1を含有する線維化促進遺伝子と共にその影響を検査することによって例示した。シーケンシングトラックの可視化により、カルシポトリオールが、COL1A1遺伝子上の3つの主要なVDR/SMAD3共結合部位全てにおいてVDRの占有を促進したことが明らかにされた(図10C、中央の2つのトラック)。対照的に、TGFβ誘導性SMAD3結合は、概して、カルシポトリオール処理の際に遺伝子と共に減少した(図10C、上の2つのトラックならびにChIP−qPCRにより独立して検証された、図10Dおよび10F)。VDRの動員と併せたSMAD3の同様の喪失は、他の線維化促進遺伝子、例えば、COL1A2、TGFB1、TGFB2、TIMP1、TIMP2およびLOXL2の調節領域においても観察された(図11A〜F)。さらに、VDRおよびSMAD2/3のRNAi媒介性枯渇は、それぞれ、SMAD3動員および共占有調節エレメントへのTGFβ1誘導性VDR結合のカルシポトリオール依存性喪失を阻害し、VDRおよびSMADが、このゲノムアンタゴニズムを媒介するために必要であることを実証した(図10Eおよび10G)。
ヒストン修飾補助因子、例えば、CBPおよびp300の動員ならびにヒストンH3の過剰アセチル化は、TGFβシグナル伝達の活性化のランドマークイベントとして確立されているので(Massagueら、2005年)、VDR/SMADゲノムアンタゴニズムが、このエピジェネティックな経路に干渉することによって、TGFβシグナル伝達を抑えることができるかどうかを決定した。ヒストンH3のアセチル化ならびにCBPおよびp300のVDR/SMAD共占有部位への動員の状態を、カルシポトリオールもしくはTGFβ1のいずれか、または両方により処理した細胞において検査した。ChIP−qPCRにより、TGFβ1が、COL1A1のVDR/SMAD共占有調節領域におけるp300およびCBPの動員ならびにヒストンH3の過剰アセチル化を誘導することが実証された。この効果は、カルシポトリオールおよびTGFβ1により共処理した細胞において喪失され(図12A)、VDR/SMADのゲノムアンタゴニズムが、コアクチベーターの動員およびヒストンの過剰アセチル化を損なうことによって、TGFβの活性化を制限することを示した。
リガンド依存性コリプレッサーの動員または「トランス抑制」は、炎症遺伝子発現を負に調節する、核受容体、例えば、PPARγおよびLXRの主要な機構として提唱されている(GlassおよびSaijo、2010年)。トランス抑制がアンタゴニズムに寄与するかどうかを試験するために、カルシポトリオールおよびTGFβ1に応答した、NCoR、SMRT、HDAC3、CoREST、LSD1およびG9aを含むコリプレッサーの、線維化促進遺伝子、例えば、COL1A1およびCOL1A2のVDR/SMAD3共占有調節領域への潜在的な誘導性動員を検査した。しかし、これらのコリプレッサーのこれらの部位への結合の変化は検出されず(図12B)、これらの部位から転写活性化複合体の喪失が、コリプレッサーの動員の増加によるものではないことを示した。
(実施例7)
TGFβは、シグナル依存性VDRシストロームをアンマスクする
VDR/SMAD3ゲノムアンタゴニズムは確立されたが、TGFβ/SMADシグナル伝達が、COL1A1のシス調節領域への、リガンド結合したVDRの動員を増強するようであることが観察された(図10Fおよび10G)。この効果が、線維化促進遺伝子の他のVDR結合部位において観察されるかどうかを決定するために、VDRシストローム±カルシポトリオールを、TGFβ1の存在下、または非存在下において分析した。TGFβ1が、すべての線維化促進遺伝子において、リガンド結合したVDRのシス調節領域への結合を促進するが、リガンド非結合VDRの結合は促進しないことが観察された(図11Bおよび11A〜F、下の4つのトラック)。
TGFβは、シグナル依存性VDRシストロームをアンマスクする
VDR/SMAD3ゲノムアンタゴニズムは確立されたが、TGFβ/SMADシグナル伝達が、COL1A1のシス調節領域への、リガンド結合したVDRの動員を増強するようであることが観察された(図10Fおよび10G)。この効果が、線維化促進遺伝子の他のVDR結合部位において観察されるかどうかを決定するために、VDRシストローム±カルシポトリオールを、TGFβ1の存在下、または非存在下において分析した。TGFβ1が、すべての線維化促進遺伝子において、リガンド結合したVDRのシス調節領域への結合を促進するが、リガンド非結合VDRの結合は促進しないことが観察された(図11Bおよび11A〜F、下の4つのトラック)。
次に、カルシポトリオール誘導性VDRの全体的結合パターンを、TGFβ1の存在下、または非存在下において比較した。6,281の結合部位は、TGFβ1の非存在下で新規なVDRシストロームを含むが、24,984部位からなる新しいシストロームは、TGFβ1の存在下で誘導された(図6A)。興味深いことに、わずか3,537部位は両方のシストロームにより共有され、TGFβ誘導性リガンド結合VDRの結合部位の85%(21,447部位)はユニークであり(図13A)、TGFβが、リガンド結合したVDRのゲノム全域にわたる結合位置の劇的なシフトをもたらすことを示した。
2つのVDRシストロームの比較研究により、TGFβ1+カルシポトリオール部位(カルシポトリオール単独部位ではない)は、SMAD3結合部位において高度に富化されていたことが明らかにされた(図13B)。さらに、これらのゲノム部位へのVDRの結合は、TGFβシグナル伝達により増強され(図13C)、この効果は、VDR発現の変化による可能性はなかった(図13D)。
VDRゲノム遺伝子座のさまざまなサブセットのDNA配列を検査し、70%より多くが、新規のVDR調節部位を含有することが観察され(図13E)、SMAD依存性テザリングと対照的に、VDRがDNAに直接作用することを示した。興味深いことに、TGFβは、VDR−SMAD3共結合部位においてヌクレオソームの有意な枯渇を誘導し(図13F)、局所クロマチンリモデリングの増強および得られた接近可能性により、TGFβ−SMADシグナル伝達が、VDRのその隣接部位への結合を促進できることを示した。
(実施例8)
VDRとSMADとの間のゲノム回路
上で論じられた所見は、VDRとTGFβ−SMADシグナル伝達との間の動的関係を示唆しており、おそらく、SMADのクロマチンへの結合のTGFβ誘導は、SMAD抑制の一時的遅延を可能にすることができるリガンド結合されたVDRに今や接近可能になる、新しいゲノムランドスケープを作り出す。この時空関係を調査するために、SMAD3およびVDRの、線維化遺伝子(例えば、COL1A1)の共占有シス調節エレメントへの動員の動態を、カルシポトリオールもしくはTGFβ1のいずれかまたは両方の存在下で決定した。特に、ChIP−qPCRを用いて、VDRおよびSMAD3の、複数の時点(0、1、2、4、6、16時間)におけるCOL1A1のシス調節領域への結合をモニターした。
VDRとSMADとの間のゲノム回路
上で論じられた所見は、VDRとTGFβ−SMADシグナル伝達との間の動的関係を示唆しており、おそらく、SMADのクロマチンへの結合のTGFβ誘導は、SMAD抑制の一時的遅延を可能にすることができるリガンド結合されたVDRに今や接近可能になる、新しいゲノムランドスケープを作り出す。この時空関係を調査するために、SMAD3およびVDRの、線維化遺伝子(例えば、COL1A1)の共占有シス調節エレメントへの動員の動態を、カルシポトリオールもしくはTGFβ1のいずれかまたは両方の存在下で決定した。特に、ChIP−qPCRを用いて、VDRおよびSMAD3の、複数の時点(0、1、2、4、6、16時間)におけるCOL1A1のシス調節領域への結合をモニターした。
特に、リガンド結合されたVDRおよびSMAD3の両方のこの部位への結合は、処理の4時間後にTGFβ1により最大に促進され、その後、16時間後基底レベルまで徐々に減少し(図14A〜14B)、VDRのクロマチンへの動員を容易にするTGFβ1の役割を確認した。興味深いことに、TGFβ1刺激の際のSMAD3の結合曲線は、カルシポトリオールの存在により劇的に変化し、TGFβ1処置のちょうど1時間後にSMAD3の最大の結合を観察した。4時間後、SMAD3の動員は、70%まで有意に減少した(図14B)。さらに、カルシポトリオールおよびTGFβ1両方の存在下のVDRおよびSMAD3の結合の、これらの基底レベルに対する正規化は、VDRおよびSMAD3の占有は逆相関し(図14C)、TGFβ誘導性クロマチン接近可能性が、VDRによるSMAD活性化の逆転を容易にするゲノム構造を生み出すことを示した。まとめると、このVDR/SMADゲノム回路は、HSCにおけるTGFβシグナル伝達に拮抗することによりVDRが線維症をブロックする、クロマチンベースの機構を提供する。
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本開示の原理が適用できる多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は、本発明の単なる例であると認識するべきであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。むしろ、本開示の範囲は下記の特許請求の範囲により規定される。従って、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内にあるすべてを本発明者らの発明として特許請求する。
Claims (27)
- ナノ粒子であって、その表面上に、アルブミン、レチノール結合タンパク質、マンノース−6−リン酸修飾アルブミン、脂肪酸エステル、レチニルエステルまたは直鎖樹枝状ハイブリッドポリマーのうちの1つまたは複数を含むナノ粒子、および
該ナノ粒子にあるまたは該ナノ粒子に結合するビタミンD受容体(VDR)の生物活性を増加させる化合物
を含む、組成物。 - 前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子またはポリマーナノ粒子を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記VDRの生物活性が、細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵のうちの1つまたは複数を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記化合物が、前記VDRの生物活性を、該化合物の非存在下での該生物活性と比較して、少なくとも25%増加させる、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 前記化合物が、細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵を、該化合物の非存在下での該貯蔵と比較して、少なくとも25%増加させる、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
- 前記化合物が、星細胞、上皮細胞または両方における前記VDRの生物活性を増加させる、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
- 前記化合物が、膵臓星細胞、心臓星細胞、肺星細胞、腎臓星細胞または肝星細胞における前記VDRの生物活性を増加させる、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 前記化合物が、星細胞によるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質の貯蔵を、該化合物の非存在下での該貯蔵と比較して、少なくとも25%増加させる、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
- 化学療法剤、生物製剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項1から8のいずれかに記載の組成物。
- 前記化学療法剤がゲムシタビンを含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記VDRアゴニストが、ビタミンD、ビタミンD前駆体、ビタミンD類似体、ビタミンD受容体リガンド、ビタミンD受容体アゴニスト前駆体またはそれらの組合せである、請求項1から10のいずれかに記載の組成物。
- 前記VDRアゴニストが、カルシポトリオール、25−ヒドロキシ−D3(25−OH−D3)(カルシジオール)、ビタミンD3(コレカルシフェロール)、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオール)またはそれらの組合せである、請求項1から11のいずれかに記載の組成物。
- 上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するための方法であって、
請求項1から12のいずれかに記載の治療有効量の組成物を該上皮細胞または星細胞と接触させ、それにより該上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するステップ
を含む、方法。 - 前記上皮細胞または星細胞が被験体に存在し、接触させるステップが、治療有効量の前記組成物を該被験体へ投与し、それにより該上皮細胞または星細胞におけるビタミンA、ビタミンDおよび/または脂質を増加させるまたは保持するステップを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記被験体が、肝臓疾患、腎臓疾患または膵臓疾患を有する、請求項13に記載の方法。
- 前記肝臓疾患が、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝臓疾患、肝臓線維症/肝硬変、胆管線維症/胆汁性肝硬変、肝臓がん、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、黄疸、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシスまたはウィルソン病のうちの1つまたは複数である、請求項15に記載の方法。
- 前記肝臓がんが、肝細胞癌、胆管癌、脈管肉腫または血管肉腫である、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓疾患が、膵臓線維症または膵管腺癌(PDA)である、請求項15に記載の方法。
- 前記腎臓疾患が腎臓の線維症である、請求項15に記載の方法。
- 線維症を処置できる作用物質をスクリーニングする方法であって、
星細胞を1種または複数の試験作用物質と接触させるステップ、
該星細胞を、TGF−β1の非存在下での発現と比べて該星細胞におけるビタミンD受容体(VDR)発現を少なくとも2倍増加させるのに十分な量の該TGF−β1と接触させるステップ、
該星細胞によるVDRアゴニストの産生、該星細胞によるCYP24A1の産生、該星細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾もしくは発現、またはそれらの組合せを検出するステップ、および
1種または複数の該試験作用物質の非存在下と比べて該星細胞による該VDRアゴニストの産生を少なくとも5倍増加させる、1種または複数の該試験作用物質の非存在下と比べて該星細胞によるCYP24A1の産生を少なくとも5倍増加させる、前記1種または複数の試験作用物質の非存在下と比べて前記星細胞によるSMAD3の産生、翻訳後修飾もしくは発現を少なくとも5倍減少させる、またはそれらの組合せである試験作用物質を選択するステップであって、選択した該試験作用物質が線維症を処置できる作用物質である、ステップ
を含む、方法。 - 選択した前記試験作用物質が、VDRの前記VDRアゴニストへの結合を少なくとも10倍増強する、請求項20に記載の方法。
- 1種または複数の選択した前記試験作用物質がin vitroで高カルシウム血性効果を有するかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項20または21に記載の方法。
- in vitroで高カルシウム血性効果を有さなかった試験作用物質を選択するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 選択した前記試験作用物質のうちの1種または複数を、線維症を有する哺乳動物に投与するステップ、および
1種または複数の該試験作用物質が該線維症を処置するかどうかを決定するステップ
をさらに含む、請求項20から23のいずれかに記載の方法。 - 前記線維症を処置した試験作用物質を選択するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 前記線維症が肝臓線維症である、請求項20から25のいずれかに記載の方法。
- 星細胞によるVDRの発現を増加させる方法であって、
該星細胞を、VDRアゴニストの該VDRへの結合を少なくとも10倍増強するのに十分な量のVDRアゴニストおよび十分な量のTGF−β1と接触させるステップ
を含む、方法。
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