CN111108199A - 用于动脉粥样硬化性心血管疾病的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于动脉粥样硬化性心血管疾病(ACVD)的生物标记物，其包含以下生物标记物1至3中的至少一种：生物标记物1，其包含至少一种SEQ ID NOs:1‑146的多核苷酸；和生物标记物2，其包含至少一种SEQ ID NOs:147‑594的多核苷酸；以及生物标记物3，其包含至少一种SEQ ID NOs:595‑1411的多核苷酸。该生物标志物可以有效地用于ACVD的诊断。

Description

用于动脉粥样硬化性心血管疾病的生物标志物
技术领域
本发明属于基因检测或基因诊断领域，并且涉及一种用于动脉粥样硬化性心血管疾病的生物标志物。
背景技术
动脉粥样硬化性心血管疾病(ACVD或ASCVD)通常是由斑块在动脉壁上的积聚(即，动脉粥样硬化)、尤其是在为心脏服务的大中型动脉中的积聚引起的。它是指以下情况：冠心病(CHD)、脑血管疾病、外周动脉疾病和主动脉粥样硬化疾病。这些病症具有相似的原因、机理和治疗。
检测ACVD的“金标准”是侵入性冠状动脉造影。然而，这是昂贵的，并且可能给患者带来风险。在血管造影之前，可以使用非侵入性诊断模式，例如心肌灌注成像(MPI)和CT血管造影，然而这些具有包括辐射照射、造影剂敏感性的并发症，并且只能适度增加阻塞性ACVD的识别率。
现有知识表明遗传、环境因素及其相互作用共同诱导了复杂的表型和许多疾病。近年来，全基因组关联研究(GWAS)已对ACVD进行了越来越多的研究，并通过46种常见变异揭示10.6％的遗传因素(Ehret,G.B.等人，Genetic variants in novel pathwaysinfluence blood pressure and cardiovascular disease risk,Nature 478,103-109,通过引用并入本文)。然而，我们对于基因对疾病的贡献的知识仍需进一步研究。
我们的“被遗忘的器官”——肠道菌群，在许多方面对我们的健康至关重要，例如从食物中获取能量、产生重要的代谢产物、促进免疫系统的发育和成熟以及保护宿主免受病原体感染等。最近的研究表明，某些代谢性疾病(例如糖尿病、肥胖症和冠状动脉疾病)的肠道中存在菌群失调、慢性炎症和代谢异常。最近的一项研究表明，肠道微生物可以将红肉成分(左旋肉碱、磷脂酰胆碱、胆固醇)代谢为TMA，然后在肝脏中将其进一步氧化为TMAO，从而引起血管中的氧化反应，导致炎症和脂质沉积，最终导致动脉粥样硬化和冠心病(Koeth,R.A.等人，Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine,a nutrient in redmeat,promotes atherosclerosis,Nature Medicine 19，576-585，通过引用并入本文)。酶，包括混杂肉碱TMA裂解酶YeaW/X、胆碱TMA裂解酶CutC及其激活蛋白CutD参与TMA的生产过程。这些研究表明，肠道微生物的失调可能通过诱导人类代谢异常而强烈影响ACVD的发病机理。然而，缺乏大规模的对于这一主要ACVD组的宏基因组学特征阻碍了对微生物组所起作用的进一步研究。
目前，仍需要开发用于诊断或评估ACVD的新生物标志物或新方法。
发明内容
通过深入研究和创造性工作，发明人对ACVD中的肠道微生物含量进行了深入分析，发现了47种肠道微生物和一些与ACVD密切相关的生物标记物。发明人惊奇地发现肠道微生物或生物标记物可有效地用于ACVD的诊断。因此，提供了以下发明：
在一方面，本发明涉及一种生物标记物，其包括以下生物标记物1至3中的至少一种：
生物标记物1，其包含SEQ ID NOs:1-146中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段；
生物标记物2，其包含SEQ ID NOs:147-594中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段；和
生物标记物3，其包含SEQ ID NOs:595-1411中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段。
在本发明的一个实施方案中，特异性片段的长度为至少30bp，或至少40bp，或至少50bp，或至少60bp，或至少70bp，或至少80bp，或至少90bp，或至少100bp，或至少150bp，或至少200bp，或至少250bp，或至少300bp，或至少350bp，或至少400bp，或至少450bp，或至少500bp，或至少600bp，或至少700bp，或至少800bp，或至少900bp，或至少1000bp，或至少1500bp，或至少2000bp。
在本发明的一个实施方案中，
生物标记物1由SEQ ID NOs:1-146的多核苷酸组成；
生物标记物2由SEQ ID NOs:147-594的多核苷酸组成；和/或
生物标记物3由SEQ ID NOs:595-1411的多核苷酸组成。
在本发明的一个实施方案中，生物标志物包括生物标志物1、生物标志物2和生物标志物3。
在本发明的一个实施方案中，生物标志物包含与生物标志物1、生物标志物2或/和生物标志物3的多核苷酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，生物标志物用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。
本发明的另一方面涉及生物标志物组合物，其包含至少一种本发明的生物标志物，任选地，还包含药学上可接受的赋形剂，例如溶剂或缓冲剂。
在本发明的一个实施方案中，生物标志物组合物用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。
在本发明的一个实施方案中，ACVD患者或患有ACVD的受试者是民族汉族。
本发明的另一方面涉及本发明的生物标志物在制备药物或试剂盒中的用途，在本发明的一个实施方案中，所述药物或试剂盒用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。
本发明的其他另外方面涉及用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应的方法，包括以下步骤：
(1)确定受试者样品中的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)如唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a的相对丰度；
优选地，进一步包括以下步骤：
(2)基于样品中唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的相对丰度和训练数据集获得受试者患有ACVD的概率(以下也称为“ACVD的概率”)。
在本发明的一个实施方案中，ACVD为冠心病(CHD)、脑血管疾病、外周动脉疾病或主动脉粥样硬化疾病。
在本发明的一个实施方案中，样品是粪便样品。
在本发明的一个实施方案中，训练数据集是根据多个患有ACVD的受试者和多个正常受试者的唾液乳杆菌的相对丰度构建的。
在本发明的一个实施方案中，通过使用多元统计模型(例如，使用训练数据集构建的随机森林模型)来获得ACVD的概率。
受试者患有ACVD的概率还可以用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。例如，如果ACVD的概率大于阈值，则表明要测试的受试者患有ACVD或相关疾病或处于发展ACVD或相关疾病的风险中；优选地，阈值是0.5。
在一些实施方案中，唾液乳杆菌的相对丰度由唾液乳杆菌的生物标志物例如唾液乳杆菌的特异性DNA片段的相对丰度表示，优选地，唾液乳杆菌的相对丰度由根据本发明的生物标志物的相对丰度表示。
在一些实施方案中，根据本发明中任一项的生物标志物的相对丰度是基于其多核苷酸序列确定的；优选地，通过以下方法获得每个样品中每种生物标志物的相对丰度：1)将其组成基因的相对丰度求和，和2)计算平均值。
在一些实施方案中，训练数据集是矩阵，其中每一行代表根据本发明的任一项的生物标志物，每一列代表样品，每个单元格代表样品中生物标志物的相对丰度图谱，并且样品疾病状态是矢量，其中1为ACVD，0为对照。
本发明的其他另外方面涉及用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应的系统，包括：
处理器；和
存储介质，包含由处理器执行的程序指令，该程序指令使处理器执行以下步骤，包括：
(1)确定受试者样品中的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)如唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a的相对丰度；
优选地，进一步包括以下步骤：
(2)基于样品中唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的相对丰度和训练数据集获得受试者患有ACVD的概率。
在本发明的一个实施方案中，ACVD为冠心病(CHD)、脑血管疾病、外周动脉疾病或主动脉粥样硬化疾病。
在本发明的一个实施方案中，样品是粪便样品。
在本发明的一个实施方案中，训练数据集是根据多个患有ACVD的受试者和多个正常受试者的唾液乳杆菌的相对丰度构建的。
在本发明的一个实施方案中，通过使用多元统计模型(例如，使用训练数据集构建的随机森林模型)来获得ACVD的概率。
受试者患有ACVD的概率还可以用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应的系统中。例如，如果ACVD的概率大于阈值，则表明要测试的受试者患有ACVD或相关疾病或处于发展ACVD或相关疾病的风险中；优选地，阈值是0.5。
在一些实施方案中，唾液乳杆菌的相对丰度由唾液乳杆菌的生物标志物例如唾液乳杆菌的特异性DNA片段的相对丰度表示，优选地，唾液乳杆菌的相对丰度由根据本发明的生物标志物的相对丰度表示。
在一些实施方案中，根据本发明中任一项的生物标志物的相对丰度是基于其多核苷酸序列确定的；优选地，通过以下方法获得每个样品中每种生物标志物的相对丰度：1)将其组成基因的相对丰度求和，和2)计算平均值。
在一些实施方案中，训练数据集是矩阵，其中每一行代表根据本发明的任一项的生物标志物，每一列代表样品，每个单元格代表样品中生物标志物的相对丰度图谱，并且样品疾病状态是矢量，其中1为ACVD，0为对照。
本发明的另一方面涉及唾液乳杆菌或用于检测唾液乳杆菌的试剂组合物或试剂盒在制备药物或试剂盒中的用途，所述制备成的药物或试剂盒用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应；优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
本发明的其他另外方面涉及唾液乳杆菌，其用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应，优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
本发明的另一方面涉及一种用于检测唾液乳杆菌的试剂组合物或试剂盒，其包含可以与唾液乳杆菌中的至少一些多核苷酸杂交的一种或多种引物或一种或多种探针；优选地，试剂组合物或试剂盒包含可与本发明的至少一种生物标志物杂交的一种或多种引物或一种或多种探针；更优选地，试剂组合物或试剂盒用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应，优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
本文所用的术语“特异性片段”是指与靶多核苷酸(例如，唾液乳杆菌中的多核苷酸)杂交的多核苷酸。关于多核苷酸之间的杂交，可以在本领域的许多文献中找到参考，包括例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Edition 2,Sambrook,etc.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring,1989。杂交可以使用各种程度的严格条件，例如，中等严格条件、中等高度严格条件或高度严格条件。条件越严格，形成双螺旋所需的互补度越高。严格度可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等来控制。对于双链DNA，杂交在比DNA杂合子的解链温度[Tm]低20-25℃的温度下在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性的DNA中进行过夜。洗涤通常进行如下：在Tm-20℃下在0.2XSSPE、0.1％SDS中，一次，15分钟(在中等严格条件下洗涤)。
根据本发明，术语“MLG”被定义为宏基因组中的一组遗传物质，其可能在物理上作为一个单元而不是独立地分布(参见，Qin,J.等人，A metagenome-wide associationstudy of gut microbiota in type 2diabetes，Nature 490,55-60(2012)，通过引用全部内容并入本文)。它可以避免完全确定宏基因组中特定微生物种类的需要，这很重要，考虑到存在大量未知生物，并且细菌之间频繁发生横向基因转移(LGT)。在本发明中，MLG是指具有一致的丰度水平和分类学分配的一组基因。
根据本发明，术语“相对丰度”具有本领域已知的共同含义，并且可以通过本领域已知的方法来计算。例如，基因(即生物标记物)或MLG的相对丰度可以通过Qin,J.等人，Ametagenome-wide association study of gut microbiota in type 2diabetes，Nature490，55-60(2012)中公开的方法确定或计算，其通过引用并入本文。
术语“基因丰度”或“相对基因丰度”或“一个基因/多个基因的相对丰度”具有本领域已知的共同含义，并且可以通过本领域已知的方法来计算。例如，基因(即生物标记物)或MLG的相对丰度可以通过Qin,J.等人，A metagenome-wide association study of gutmicrobiota in type2diabetes，Nature 490，55-60(2012)中公开的方法确定或计算，其通过引用并入本文。
具体地，相对基因丰度或一个或多个基因的相对丰度计算如下：
使用“同一性>90％”的标准通过SOAP2，将每个样品的高质量读数与基因集进行比对。在基于序列的图谱分析中，只能接受两种类型的比对：i).完整的配对末端读段，其可以映射到具有正确插入大小的基因上；和ii).仅当读取的另一端映射到基因区域之外时，才可以将配对末端的一个末端映射到基因末端。在这两种情况下，映射的读段都算作一个副本。
然后，对于任何样品S，发明人计算丰度如下：
步骤1：计算每个基因的拷贝数：
Figure BDA0002411175700000091
步骤2：基因i的相对丰度的计算
Figure BDA0002411175700000092
ai：样品S中基因i的相对丰度。
Li：基因i的长度。
xi：可以在样品S中(映射读取的数量)检测到该基因i的时间。
bi：样品S测序数据中的基因i的拷贝数。
具体地，MLG的相对丰度计算如下：
通过将其组成基因的相对丰度相加，然后计算平均值，即可获得MLG的相对丰度。具体地，通过使用来自该MLG的基因的相对丰度的值来估计MLG的相对丰度。对于该MLG，丢弃相对丰度最高的5％中的基因和相对丰度最低的5％中的基因，然后将其余的基因拟合为泊松分布。泊松分布的估计平均值被解释为该MLG的相对丰度。
术语“基因谱”在本文中用于指由基因及其在样品中的相对丰度的相关度量建立的谱。
术语“基因丰度图谱”在本文中用于指代基因图谱的构建。
术语“宏基因组关联分析(MWAS)”在本文中是指基于从患者和对照的粪便样品中提取的DNA的深层次下一代鸟枪法测序的两阶段病例对照宏基因组关联分析(MGWAS)。
在本发明中，使用随机森林模型和ROC曲线的方法在本领域中是众所周知的(参见Liaw,Andy&Wiener,Matthew.Classification and Regression by randomForest,R News(2002),Vol.2/3p18；Jianguo Xia,David I.Broadhurst,Michael Wilson,DavidS.Wishart.Translational biomarker discovery in clinical metabolomics:anintroductory tutorial,Metabolomics(2013)9:280–299.)，本领域技术人员可以根据具体情况设置和调整参数。
在本发明中，训练集和测试集具有本领域众所周知的含义。在本发明的实施方案中，训练集是指冠心病受试者和具有给定数目的正常受试者的样品中生物标志物的内容的数据集。测试集是用于测试训练集性能的一组数据。
在本发明中，术语“多个受试者”可以指大于10、大于20、大于30、大于40、大于50、大于60、大于70、大于80、大于90、大于100、大于150或大于200的受试者，或甚至更多。
发明的有益效果
据认为，由于以下原因，一种与ACVD相关的肠道微生物，即唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a对于增加早期阶段的ACVD检测是有价值的。首先，与TMA-裂解酶标记物(胆碱TMA-裂解酶CutC及其活化蛋白CutD；混杂肉碱TMA-裂解酶YeaW/X)相比，本发明的标记物更具特异性和敏感性。第二，对粪便的分析保证准确性、安全性、可负担性和患者依从性。并且粪便样品是可运输的。因此，本发明涉及一种舒适且无创的体外方法，因此人们将更容易地参与给定的筛查程序。第三，本发明的标记物还可以用作在ACVD患者中进行治疗监测的工具，以检测对治疗的反应。
附图说明
图1：显示了来自训练集的粪便样品的3个MLG(5倍RFCV执行5次)的交叉验证随机森林模型的受试者工作特征曲线(ROC)。表3示出了选择的3个MLG。括号中示出了AUC的95％置信区间(CI)。表5示出了其相应的ACVD概率。
图2：显示了来自测试集的粪便样品的3个MLG(5倍RFCV执行5次)的交叉验证随机森林模型的受试者工作特征曲线(ROC)。表3示出了选择的3个MLG。括号中示出了AUC的95％置信区间(CI)。表5示出了其相应的ACVD概率。
具体实施方式
提出以下实施例，以向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不是旨在限制发明人如何认为其发明的范围。实施例中未指出的技术或条件可以根据文献或产品说明书进行。未指明制造商的试剂或仪器是可以从市场上购买的常规产品。
实施例1：获取粪便样品的测序数据
1.样品采集
在广东省总医院医学研究中心收集了405名中国人(包括218名患有ACVD的个体和187名对照受试者)的样品。患有ACVD的个体表现出稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛或急性心肌梗死(AMI)的临床表现(表1)。通过冠状动脉血管造影术证实了ACVD诊断，并且包括了单个或多个血管中狭窄≥50％的个体。所有患者均为中国汉族，没有已知的血缘关系，年龄在40至80岁之间。排除标准包括持续感染性疾病、癌症、肾功能衰竭或肝功能衰竭、周围神经病变、中风以及在样品采集后一个月内使用抗生素。在医学检查时，所有健康对照个体均未出现临床上明显的ACVD症状。通过调查表收集人口统计数据和心血管危险因素。排除患有周围动脉疾病、已知冠状动脉疾病或心肌梗塞、心肌病、肾功能衰竭、周围神经病变、全身性疾病和中风的个体。入院后第一天早晨收集每个受试者的新鲜粪便，并在30分钟内在干冰上冷冻，并保存在-80℃的冰柜中，然后进行进一步分析。
该研究得到广东省总医院医学伦理审查委员会和深圳华大生命科学(BGI)研究院机构审查委员会的批准。从所有参与者获得了知情同意。
表1 ACVD病例和对照的基线特征。
年龄和BMI均通过Wilcoxon秩和检验进行检验，而性别则通过Fisher检验进行检验。
Figure BDA0002411175700000121
注意：第三列和第五列是不知道年龄、性别或BMI信息的人数。
2.从粪便样品中提取DNA
将粪便样品在冰上解冻，并根据制造商的说明使用Qiagen QIAamp DNA粪便迷你试剂盒(Qiagen)进行DNA提取。提取物用不含DNase的RNase处理，以消除RNA污染。
使用NanoDrop分光光度计、Qubit荧光计(带有Quant-iTTMdsDNABR测定试剂盒)和凝胶电泳测定DNA量。
3.粪便样品的DNA文库构建和测序
按照制造商的说明书(Illumina)进行DNA文库的构建。我们使用与先前描述的相同的工作流程(Qin,J.等人，2012)进行簇生成、模板杂交、等温扩增、线性化、封闭和变性以及测序引物的杂交。我们构建了一个双末端(PE)文库，每个样品的插入片段大小为350bp，然后进行高通量测序，获得约3千万个长度为2x100bp的PE读数。通过从Illumina原始读数中过滤具有不确定的“N”碱基，接头污染和人DNA污染的低质量读数，并同时修剪低质量读数的末端碱基，来获得高质量的读数。过滤低质量和人读数(映射到hg19参考)后，仍有90％以上(每个样品5520万个读数)的读数保留。
实施例2：宏基因组数据处理和分析
1.基因丰度图谱的构建
通过SOAP2，使用同一性≥90％的标准，将以上获得的高质量读数与9,879,896个基因(9.9M基因集，以下称为参考集)进行比对。如先前所述(Li,J.等人，An integratedcatalog of reference genes in the human gut microbiome,Nat.Biotechnol.32,834–841(2014)，通过引用并入本文)，进行基于序列的基因丰度分析。使用405个样品中的这9,879,896个基因及其相关的相对丰度测量值来建立关联分析的基因谱，并且计算相对基因丰度的方法与已发表的T2D论文(Qin等人，2012,同上)中所述一致。
2.宏基因组关联分析(MWAS)
如先前所述(Qin,J.等人，A metagenome-wide association study of gutmicrobiota in type 2diabetes，Nature 490,55-60(2012)，在ACVD群组上进行MWAS，如下所示。
在参考集中，高质量读数被映射到9,879,896个基因上(Li,J.等人，2014年，同上)。去除了少于10个样品中检测到的基因，因此获得了3,694,132个基因及其基因丰度图。然后根据这些基因在所有样品中的丰度变化，将这些基因聚类为MLG(Qin,J.等人，2012)。如前所述(Qin，J.等人，2012)，通过将其组成基因的相对丰度相加然后计算平均值来获得每个样品中每个MLG的相对丰度。从而获得了2982个包含超过100个基因的MLGs。
根据非参数方法，Wilcoxon秩和检验，对包含超过100个基因的2982个MLG进行患有ACVD的个体的富集或耗竭测试(218个ACVD病例，187个对照；表1)，并进行对照用于多次测试(q值<0.05)。如前所述(Qin，J.等人，2012)，根据其组成基因的分类法对MLG进行分类学分配，这些组成基因与NCBI参考基因组(一个MLG中超过50％的基因)比对。对于每个带有暂定物种注释的MLG，均显示了前3个参考基因组的覆盖基因百分比和平均同一性(表2)。
3.使用RFCV的ACVD特异性MLG的选择
使用样品的MLG相对丰度的分布图，在随机森林模型(R 3.3.0,randomForest4.6-12软件包)上进行5倍交叉验证。对5倍交叉验证的5个试验的交叉验证误差曲线(每个5个测试集的平均值)进行平均，并将平均曲线中的最小误差加上该点的标准偏差用作阈值(Zhang,X.等人，The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoidarthritis and partly normalized after treatment。Nat.Med.21,895–905(2015)；Feng,Q.等人Gut microbiome development along the colorectal adenoma–carcinomasequence.Nat.Commun.6,6528(2015),通过引用并入本文)。列出了误差小于阈值的所有MLG标记物集(≤25个)，并且选择了具有最小数量的MLG的集合(47个MLGs，表2)作为最佳集合。据报道，某些唾液乳杆菌菌株为益生菌，但在ACVD患者中富集特定的唾液乳杆菌。
考虑到唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a-mlg16687、唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a-mlg189055、唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a-mlg254590与相同的微生物唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a关联，发明人利用了3种粪便微生物组合物相对于ACVD的诊断价值(参见表3)。
Figure BDA0002411175700000151
Figure BDA0002411175700000161
表3唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a物种的3个MLG的SEQ IDSEQ ID
Figure BDA0002411175700000171
实施例3：3种MLG分别作为ACVD诊断的标志物的用途
在本文，将3个MLG(表3)分别用作标记物以测试识别ACVD患者的可靠性。
将实施例1中获得的405个样品的高质量读数随机分为训练集(405个样品中的70％)和测试集(405个样品中的30％)，通过交叉验证计算训练集中每个生物标记物的预测误差率和AUC，并根据训练集构建的模块计算测试集中每种生物标志物的预测误差和AUC(表4和表5)。
具体地，随机森林模型分类使用R版本3.3.0的“随机森林4.6-12软件包”进行。输入包括训练数据集(即，训练样品中选定MLG的相对丰度谱图)、样品疾病状态(训练样品的样品疾病状态是矢量，ACVD为1，对照为0)和测试集(仅测试集中所选MLG的相对丰度图谱)。然后，发明人使用了R软件中随机森林软件包中的随机森林函数来建立分类，并使用预测函数来预测测试集。输出为预测结果(患病概率；阈值为0.5，如果患病概率≥0.5，则受试者处于ACVD的风险中)。
表4 405个样品中的3种MLG的相对丰度谱(第一行：MLG ID；第一列：样品ID，N代表对照，ZSL代表ACVD)
Figure BDA0002411175700000181
Figure BDA0002411175700000191
Figure BDA0002411175700000201
Figure BDA0002411175700000211
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Figure BDA0002411175700000301
表5通过对405个样品中的每个样品设置的3个MLG物种计算的ACVD概率(富集：1：ACVD；0：对照，如果概率≥0.5，则受试者处于ACVD的危险中；全部：3个MLG集)
Figure BDA0002411175700000302
Figure BDA0002411175700000311
Figure BDA0002411175700000321
Figure BDA0002411175700000331
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Figure BDA0002411175700000381
Figure BDA0002411175700000391
Figure BDA0002411175700000401
Figure BDA0002411175700000411
Figure BDA0002411175700000421
实施例4：3种MLG的组合作为ACVD诊断的标志物的用途
此外，发明人还通过组合训练集和测试集上的3个MLG来计算预测误差率和AUC(表6)，发现训练集的AUC为0.695，测试集的AUC为0.712(图1和图2)。同时，我们注意到基于MLG的分类器的AUC高于仅使用TMA裂解酶获得的0.63的AUC(CutC/D和YeaW/X，在所有405个样品中使用相同的R版本和软件包(R 3.3.0，pROC软件包)绘制基于TMA裂解酶的ROC和ACVD概率。图1和图2表明，它为我们提供了一种通过使用上述3个MLG标记物集来预测ACVD或相关疾病风险的有效方法。其中：
发明人从Uniprot数据库中检索了TMA裂解酶的酶序列(主要(引文)登录号：X8HTY7、X6QEX0、A0A0E2Q854、W3YJY9、U2TK70、A0A0M3KL45、A0A0M3KL44、A0A0M4MQL2、A0A0M4N7P9用于胆碱TMA裂解酶CutC；D0C9N6和D0C9N8用于肉碱TMA裂解酶CntA/B)和来自NCBI数据库(登录号：ACL49259.1(GI:219868924)，登录号：ABB40076.1(GI:78220727)和登录号：ACL49260.1(GI:219868925，登录号：ABB40075.2(GI:342906634)用于CutC/D；登录号：ACB03000.1(GI:169889293)和登录号：ACB03001.1(GI:169889294)用于混杂肉碱TMA裂解酶YeaW/X(其体外底物包括γ-丁酰甜菜碱、L-肉碱、胆碱和甜菜碱))。在肠道微生物组中未发现CntA/B，这与其在不动杆菌中的最初报道一致(Zhu，Y.等人Carnitine metabolismto trimethylamine by an unusual Rieske-type oxygenase from human microbiota,Proc.Natl.Acad.Sci.111,4268-4273(2014)，通过引用并入本文)。
参考肠道微生物组基因集中的基因(Li,J.等人，2014同上)被鉴定为这些酶(根据BlastP的最佳匹配，同一性>35％，得分>60，E<1e-3)，然后可以在所有405个样品中相应地确定它们的相对丰度。
Figure BDA0002411175700000441
因此，发明人已经通过基于ACVD相关基因标记物的随机森林模型鉴定了1种与ACVD相关的肠道微生物。并且发明人已经构建了基于与ACVD相关的肠道微生物来评估ACVD疾病的风险的方法。
尽管已经详细描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有细节，可以对这些细节进行各种修改和替换，它们仍然在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同形式给出。

Claims (29)

1.一种生物标记物，其包括以下生物标记物1至3中的至少一种：
生物标记物1，其包含SEQ ID NOs:1-146中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段；
生物标记物2，其包含SEQ ID NOs:147-594中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段；和
生物标记物3，其包含SEQ ID NOs:595-1411中的至少一种多核苷酸，或其一个或多个特异性片段。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其中所述特异性片段为至少30bp，或至少40bp，或至少50bp，或至少60bp，或至少70bp，或至少80bp，或至少90bp，或至少100bp，或至少150bp，或至少200bp，或至少250bp，或至少300bp，或至少350bp，或至少400bp，或至少450bp，或至少500bp，或至少600bp，或至少700bp，或至少800bp，或至少900bp，或至少1000bp，或至少1500bp，或至少2000bp。
3.根据权利要求1所述的生物标志物，其中：
生物标记物1由SEQ ID NOs:1-146的多核苷酸组成；
生物标记物2由SEQ ID NOs:147-594的多核苷酸组成；和/或
生物标记物3由SEQ ID NOs:595-1411的多核苷酸组成。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的生物标志物，其包括生物标志物1、生物标志物2和生物标志物3。
5.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物，其包含与生物标志物1、生物标志物2或/和生物标志物3的多核苷酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸。
6.一种生物标志物组合物，其包含至少一种权利要求1-5中所述的生物标志物，任选地，还包含药学上可接受的赋形剂，例如溶剂或缓冲剂。
7.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物或权利要求6所述的生物标志物组合物，其用于获得所述受试者患有ACVD的概率，或用于诊断所述受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于所述ACVD患者的预后评估，或用于所述ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。
8.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标记物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于获得所述受试者患有ACVD的概率，或用于诊断所述受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于所述ACVD患者的预后评估，或用于所述ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应。
9.一种方法，其用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应，包括以下步骤：
(1)确定受试者样品中的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)如唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a的相对丰度；
优选地，进一步包括以下步骤：
(2)基于样品中唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的相对丰度和训练数据集获得受试者患有ACVD的概率。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述ACVD为冠心病(CHD)、脑血管疾病、外周动脉疾病或主动脉粥样硬化疾病。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(2)中，所述训练数据集是根据多个患有ACVD的受试者和多个正常受试者的唾液乳杆菌的相对丰度构建的。
13.根据权利要求9所述的方法，通过使用多元统计模型，例如，使用训练数据集构建的随机森林模型来获得受试者患有ACVD的概率。
14.根据权利要求9所述的方法，其中如果受试者患有ACVD的概率大于阈值，则表明要测试的受试者患有ACVD或相关疾病或处于发展ACVD或相关疾病的风险中；优选地，阈值是0.5。
15.根据权利要求9-14中任一权利要求所述的方法，其中，所述唾液乳杆菌的相对丰度由唾液乳杆菌的生物标志物例如唾液乳杆菌的特异性DNA片段的相对丰度表示，优选地，所述唾液乳杆菌的相对丰度由根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物的相对丰度表示。
16.根据权利要求15的方法，其中根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物的相对丰度基于其多核苷酸序列来确定；优选地，通过将其组成基因的相对丰度求和，然后计算平均值，来获得每个样品中每种生物标记的相对丰度。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述训练数据集是矩阵，其中，每一行表示根据权利要求1-5中任一权利要求所述的每个生物标记，每一列表示样品，每个单元格代表所述样品中生物标记物的相对丰度图谱，并且所述样品疾病状态是矢量，其中1为ACVD，0为对照。
18.一种用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应的系统，包括：
处理器；和
存储介质，包含由处理器执行的程序指令，该程序指令使处理器执行以下步骤，包括：
(1)确定受试者样品中的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)如唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a的相对丰度；
优选地，进一步包括以下步骤：
(2)基于样品中唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的相对丰度和训练数据集获得受试者患有ACVD的概率。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述ACVD为冠心病(CHD)、脑血管疾病、外周动脉疾病或主动脉粥样硬化疾病。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
21.根据权利要求18所述的系统，其中所述训练数据集是根据多个患有ACVD的受试者和多个正常受试者的唾液乳杆菌的相对丰度构建的。
22.根据权利要求18所述的系统，其中通过使用多元统计模型，例如，使用训练数据集构建的随机森林模型来获得受试者患有ACVD的概率。
23.根据权利要求18所述的系统，其中如果受试者患有ACVD的概率大于阈值，则表明要测试的受试者患有ACVD或相关疾病或处于发展ACVD或相关疾病的风险中；优选地，阈值是0.5。
24.根据权利要求18-23中任一权利要求所述的系统，其中，所述唾液乳杆菌的相对丰度由唾液乳杆菌的生物标志物例如唾液乳杆菌的特异性DNA片段的相对丰度表示，优选地，所述唾液乳杆菌的相对丰度由根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物的相对丰度表示。
25.根据权利要求24的系统，其中根据权利要求1-5中任一权利要求所述的生物标志物的相对丰度基于其多核苷酸序列来确定；优选地，通过将其组成基因的相对丰度求和，然后计算平均值，来获得每个样品中每种生物标记的相对丰度。
26.根据权利要求24或25所述的系统，其中，所述训练数据集是矩阵，其中，每一行表示根据权利要求1-5中任一权利要求所述的每个生物标记，每一列表示样品，每个单元格代表所述样品中生物标记物的相对丰度图谱，并且所述样品疾病状态是矢量，其中1为ACVD，0为对照。
27.唾液乳杆菌或用于检测唾液乳杆菌的试剂组合物或试剂盒在制备药物或试剂盒中的用途，所述制备成的药物或试剂盒用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应；优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
28.唾液乳杆菌，其用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应，优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
29.一种用于检测唾液乳杆菌的试剂组合物或试剂盒，其包含可以与唾液乳杆菌中的至少一些多核苷酸杂交的一种或多种引物或一种或多种探针；优选地，试剂组合物或试剂盒包含可与权利要求1-5中所述的至少一种生物标志物杂交的一种或多种引物或一种或多种探针；更优选地，试剂组合物或试剂盒用于获得受试者患有ACVD的概率，或用于诊断受试者是否患有与ACVD有关的异常状况或处于发展与ACVD有关的异常状况的风险中，或用于ACVD患者的预后评估，或用于ACVD患者的治疗监测以检测对治疗的反应，优选地，唾液乳杆菌是唾液乳杆菌ACS-116-V-Col5a。
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