JP5641281B2 - 重症患者の転帰予測のための炎症反応メディエーター関連遺伝的多型に関わる多変量解析 - Google Patents

Description

本発明は、病気のまたは重症の患者、例えばICUまたは病院の他の部分に収容された患者におけるより正確な転帰予測を提供するための予測因子（predictor）としての、炎症促進性メディエーターに関連する1つまたはそれ以上の遺伝的多型の使用に関する。

救急集中治療医学の分野では、敗血症、外傷性傷害、および火傷などの重篤状態の病理生理学について非常に多様な研究が行われている。とくに敗血症の病理生理学への自然免疫の関与は広範に研究されており、この研究成果により敗血症の病理生理学を明らかにする新しい発見がなされてきた（非特許文献1）。これら発見は自然免疫系による病原体の認識およびそれに続くサイトカインなどの炎症促進性メディエーターの産生が敗血症の病理生理学に重要な役割を果たすことを証明してきた（非特許文献2）。これら発見はまた、病原体の認識およびサイトカインの産生に個体差が存在し、それが遺伝的背景の差異に関連しているかもしれないことを証明してきた（非特許文献3）。事実、いくつかの遺伝子関連研究により、重症患者における臨床症状または特定種類の治療への反応に特定の遺伝的多型が関連することが報告されてきた（非特許文献4-6）ことから、遺伝的多型に基づき個別化医療（personalized medicine）またはテーラーメイド医療（tailor-made medicine）の可能性が示唆されている（非特許文献7）。他方、重症患者における特定の遺伝的多型と、転帰、疾患重症度、および／または機械換気の継続期間との関連性の研究が、遺伝的危険因子または転帰予測因子を同定するための試みの一部として実施されているが、最終的結論は得られていない（非特許文献8-10）。

本発明者らは、遺伝的多型と敗血症患者における疾患重症度および臨床転帰との関連を従前に報告している（非特許文献11、12）。炎症反応症候群の患者における遺伝的多型および臨床転帰と臓器不全評価（Sequential Organ Failure Assessment、SOFA）スコアが5
またはそれ以上であること（≧5）との間の相関関係を証明した（非特許文献12、13）。重症患者の転帰と関連する遺伝的多型を、従来の臨床パラメーター、例えば疾患重症度および全身症状などと組み合わせて、ICU患者の転帰のより優れた予測に使用することができる可能性は以前には調査されていない。

アパチ（APACHE、The Acute Physiology and Chronic Health Evaluation）IIスコア（非特許文献12、14）はICU患者の疾患の重症度測定に典型的に使用される指標である。この点数スコアは、生理学的変数、年齢および慢性病態点数（chronic health point）の合計として各ICU患者について算出され、疾患の重症度の評価だけでなく予後予測因子としても使用される。生理学的変数は疾患の重症度を直接的に反映し、そして年齢および慢性病態点数は疾患重症度に寄与する背景因子である。APACHE IIスコアに加え、性別、過去の治療歴、および感染などの要素がICU患者の予後に影響することが報告されてきた（非特許文献15-18）。

敗血症、膵炎、外傷性傷害、およびショックなどの多くの臨床症状において、炎症の悪化によるICU患者における臓器不全は、個々の患者の臨床経過および転帰を決定するのに決定的に重要な要素である（非特許文献19）。ICU患者の疾患の重症度は障害臓器の数に伴って増加し、そして様々な人工臓器による補助が障害臓器の数および種類に依存して利用される。重症患者における特定の遺伝的多型と臓器不全との間の関連性はしばしば報告されてきた（非特許文献20-22）。重症患者で認められた多様な種類の臓器不全のなかで、急性肺障害はこの臨床症状と炎症促進性サイトカインの遺伝的多型との間の関係を解明するために最も詳細に調査されている（非特許文献23-25）。

ICU患者の遺伝的多型はその生存だけでなく障害臓器の数およびICU滞在中の機械換気の必要性にも影響する可能性、並びに、ICU患者の臨床経過および転帰はそれらとの関連が長く知られている従来の人口学的および／または臨床的な要因（例えば、APACHE IIスコア、感染、年齢、性別、過去の治療歴）だけでなく、同じ転帰基準と関連する遺伝要因（例えば、炎症促進性メディエーター産生に関与する遺伝的多型）に依存する可能性は、従前には明らかにされていない。

下記引用文献および本明細書で言及する全ての刊行物は、本明細書に引用することにより全体として包含される。

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本発明の特徴は、重病患者の臨床転帰の決定または予測を、該患者からゲノムDNAを採集して該患者のゲノムDNA中の1つまたはそれ以上の遺伝的多型を検出することにより実施することである。当該遺伝的多型は炎症促進性メディエーターの産生に関わる多型であることができる。当該遺伝的多型はTNF-α遺伝子の第-308位がGまたはAである対立遺伝子を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1β遺伝子の第-31位がCまたはTである対立遺伝子を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1ra遺伝子のイントロン2内の可変数タンデム反復配列（a variable number of tandem repeats、VNTR）に関してRN1対立遺伝子を含むことができる。

病気の患者または重病の患者、例えば集中治療室（ICU）に収容された患者に関する臨床転帰（またはその転帰の見込み）を決定または予測する方法を提供する。当該方法は、患者のゲノムDNA中の1つまたはそれ以上の遺伝的多型を検出するために患者からゲノムDNAを採集することを含むことができる。当該遺伝的多型は炎症促進性メディエーターの産生に関わる多型であることができる。当該遺伝的多型はTNF-α遺伝子の第-308位がGまたはAである対立遺伝子を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1β遺伝子の第-31位がCまたはTである対立遺伝子を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1ra遺伝子のイントロン2内の可変数タンデム反復配列（a variable number of tandem repeats、VNTR）に関してRN1対立遺伝子を含むことができる。患者のために臨床転帰を決定することは、臨床要因の決定を含むことができる。当該臨床要因はAPACHE IIスコア、感染、年齢、性別、および／または過去の治療歴であることができる。患者のゲノムDNA中の遺伝的多型を検出することは、自動配列検出システムを用いることにより達成され得る。患者のゲノムDNA中の遺伝的多型を検出することは、電気泳動により達成することができる。当該遺伝的多型を検出することは、多型を含む遺伝子を自動PCRサーマルシークエンサーにより増幅することを含むことができる。当該患者は集中的治療を必要とする臨床症状を有することができる。当該臨床症状は、敗血症、外傷性傷害、重症急性膵炎、劇症肝炎、または手術後の回復期のものであることができる。

病気の患者または重病の患者、例えば集中治療室（ICU）に収容された患者に関する臨床転帰（またはその転帰の見込み）を決定または予測する方法は、患者からDNAを採集すること、該患者のゲノムDNA中の遺伝的多型を検出すること、該遺伝的多型が検出された場合および臨床要因が測定された場合に該患者に関する臨床転帰が死亡、臓器不全、および／または肺障害であると決定することを含むことができる。当該臨床要因はAPACHE IIスコア、感染、年齢、性別、および／または過去の治療歴であることができる。当該臨床転帰は、ICUでの死亡、臓器不全、および／または肺障害であることができる。当該遺伝的多型はTNF-α遺伝子の第-308位がGまたはAである対立遺伝子を含むことができ、該臨床要因はAPACHE IIスコアであることができ、そして該臨床転帰はICUでの死亡であることができる。当該遺伝的多型はIL-1β遺伝子の第-31位がCまたはTである対立遺伝子を含むことができ、該臨床要因はAPACHE IIスコアであることができ、そして該臨床転帰はICUでの死亡であることができる。当該遺伝的多型はTNF-α遺伝子の第-308位がGまたはAである対立遺伝子、IL-1β遺伝子の第-31位がCまたはTである対立遺伝子を含むことができ、該臨床要因はAPACHE IIスコアであることができ、そして該臨床転帰はICUでの死亡であることができる。当該遺伝的多型はIL-1ra遺伝子のイントロン2内のVNTRに関してRN1対立遺伝子を含むことができ、該臨床転帰は肺障害であることができ、そして該臨床要因はAPACHEIIスコア、過去の治療歴、および／または感染であることができる。過去の治療歴は心臓疾患であることができる。

本教示を添付の図面を参照して説明する。当該図面は例示することを意図しており本教示を限定するものではない。

全患者群における死亡率（例えばICUでの死亡）の予測のためのROC曲線を示す図である。当該予測のために、臨床パラメーターおよび遺伝的パラメーターの4つの異なった組み合わせを用いた。曲線1：感染 + APACHE II スコア（ROC-AUC = 0.77）；曲線2：感染 + APACHE II スコア + TNF-α-308（ROC-AUC = 0.78）；曲線3：感染 + APACHE II スコア+ IL-1β-31（ROC-AUC = 0.80）；および曲線4：感染 + APACHE II スコア+ TNF-α-308 + IL-1β-31（ROC-AUC = 0.81）。

敗血症部分群におけるICUでの死亡の予測のためのROC曲線を示す図である。当該予測のために、臨床パラメーターおよび遺伝的パラメーターの4つの異なった組み合わせを用いた。曲線1：APACHE II スコア単独（ROC-AUC= 0.68）；曲線2：APACHE II スコア + TNF-α-308（ROC-AUC= 0.72）；曲線3：APACHE II スコア + IL-1β-31（ROC-AUC= 0.77）；および曲線4：APACHE II スコア + TNF-α-308 + IL-1β-31（ROC-AUC = 0.80）。

本発明および方法は、医療事業を支援するために、病気または重病の患者の転帰を予測することに使用できる。一例として、本発明は集中治療部や外傷治療部などの病院組織で、重病患者の臨床経過または転帰を決定するために使用することができる。本発明が使用できる場所は、限定はなく、介護施設、病院、野戦病院、および同種のものを含むことができる。本発明は患者の状態の重篤度評価を容易にすることができる。患者の状態の重篤度についてより良い理解を提供することにより、本発明は治療の決定や生命終焉の決定などの医療的決定において、例えば介護者、医療提供者、または患者の縁者を補助することができる。

本発明はICUに関して説明するが、これは例示に過ぎず、本発明はどんな場所に居る患者にも適用される。炎症促進性メディエーターに関連した遺伝的多型は、病気または重病の患者の転帰に有意に関連することがある。ゆえに、遺伝的多型は病気または重病の患者の転帰の予測因子として使用することができる。当該遺伝的多型はそれ単独で、あるいは、他の遺伝的多型および／または患者の転帰の予測に従来使用されていた臨床要因と組み合わせて使用することができる。例えば、本願発明者らは、患者が例えばICUに収容された後に、該ICU患者の死亡危険率またはICU死亡率を1つまたはそれ以上の遺伝要因および／または1つまたはそれ以上の遺伝要因と臨床要因との組み合わせに基づいて決定できることを見出した。遺伝的多型などの1つまたはそれ以上の遺伝要因は該ICU患者の臨床経過および転帰の正確な予測を可能にする。当該遺伝的多型はサイトカインなどの炎症促進性メディエーターの産生に関与し得る。その上またはあるいは、当該遺伝的多型は従来の臨床要因により予測された患者の転帰を評価するまたはさらに確認するために使用することができる。

患者のゲノムDNAを採集し、そして該患者の臨床転帰を遺伝的多型の存在に基づいて決定することができる。

1つまたはそれ以上の炎症促進性メディエーターに関連する遺伝的多型は、一塩基多型（SNPs）、例えば腫瘍壊死因子-α（TNF-α）-308G/A、TNF-α-238G/A、LTα-T/C、インターロイキン-1β（IL-1β）-511A/G、IL-1β-31C/T、IL-6-174G/C、IL-6-634G/C、IL-10-1082A/G、IL-10-819C/T、IL-10-592C/A、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）-173G/C、CD14-159G/A、プロテインC（PROC）-1654C/T、PROC-1641G/A、および／またはPROC-1476A/Tを包含することができる。当該遺伝的多型は第-308位においてGまたはA対立遺伝子の存在を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1β遺伝子の第-31位においてCまたはT対立遺伝子の存在を含むことができる。当該遺伝的多型はIL-1ra遺伝子のイントロン2内の可変数タンデム反復配列（a variable number of tandemrepeats、VNTR）に関してRN1対立遺伝子の存在を含むことができる。患者の臨床転帰は患者の死亡可能性若しくはICU死亡率、患者の臓器不全の可能性、および／または患者の肺不全の可能性を包含することができる。患者は集中治療を必要とする臨床状態であることができる。当該臨床状態は敗血症、外傷性傷害、重症急性膵炎、劇症肝炎、および／または術後回復であることができる。

他の遺伝的多型はまた、患者の転帰を決定する1つまたはそれ以上の臨床要因と、別個に、あるいは、組み合わせて使用することができる。

患者の臨床転帰は1つまたはそれ以上の遺伝要因および／または1つまたはそれ以上の遺伝要因と臨床要因との組み合わせに基づいて決定することができる。当該1つまたはそれ以上の遺伝要因は、炎症促進性メディエーターの産生に関連する1つまたはそれ以上の遺伝的多型であることができる。当該遺伝的多型は、例えば、第-308位におけるGまたはA対立遺伝子の存在、IL-1β遺伝子の第-31位におけるCまたはT対立遺伝子の存在、および／またはIL-1ra遺伝子のイントロン2内の可変数タンデム反復配列（a variable number of tandemrepeats、VNTR）に関するRN1対立遺伝子の存在であることができる。当該臨床要因は高いAPACHE IIスコア、感染、年齢、性別、および／または過去の疾患であることができる。過去の疾患または過去の治療歴には様々な疾患、例えば心臓疾患、呼吸器疾患、肝臓疾患、糖尿病、悪性腫瘍、腎臓疾患、および／または脳疾患を包含することができる。

例えば、ICU死亡率の臨床転帰は、検出された遺伝的多型がTNF-α遺伝子の第-308位におけるGまたはAの存在および／またはIL-1β遺伝子の第-31位におけるCまたはT対立遺伝子の存在を含む場合に決定することができる。死亡の臨床転帰はICUスコアの範囲約50-71、例えば55-71、65-71、または70-71（ICU患者を指すAPACHE IIスコア）と関連する。ICU死亡率の臨床転帰は、APACHE IIスコアがおよそ65-71の範囲内にある場合、および、検出された遺伝的多型がTNF-α遺伝子の第-308位におけるGまたはAの存在および／またはIL-1β遺伝子の第-31位におけるCまたはT対立遺伝子の存在を含む場合に決定することができる。

肺不全の臨床転帰は検出された遺伝的多型がIL-1ra遺伝子のイントロン2内のVNTRに関するRN1対立遺伝子の存在を含む場合に決定することができる。肺不全の臨床転帰は、検出された遺伝的多型がIL-1ra遺伝子のイントロン2内のVNTRに関するRN1対立遺伝子の存在を含む場合、および、次に示す臨床要因、APACHE II範囲50-71、心臓疾患、および／または感染の少なくとも1つが存在する場合に決定することができる。

患者の臨床転帰は1つまたはそれ以上の遺伝要因および／または1つまたはそれ以上の遺伝要因と臨床要因との組み合わせに基づいて決定することができる。本願発明者らは、患者の転帰の予測に従来使用されていた臨床要因を遺伝要因と組み合わせて使用すると、臨床要因のみを使用するよりもより正確に患者の臨床転帰を決定できることを見出している。言い換えれば、患者が臨床転帰に関連する1つまたはそれ以上の特定の遺伝的多型を有し、そして臨床転帰と結びつく従来の臨床要因の範囲に入る場合、特定の臨床転帰の発生の可能性が、臨床要因またはパラメーターのみを考慮する場合より有意に大きくなる。ここで、用語「有意に（significantly）」は予測された転帰が本発明を使用しないときよりも少なくとも50％、例えば50％−100％、60％−90％、または70％−80％、より正確であることを意味する。例えば、2つの臨床要因（APACHE IIスコアおよび感染）および1つの遺伝要因（TNF-α-308）によってより正確な死亡率予測が実施可能であったこと、および、2つの臨床要因（APACHE IIスコアおよび感染）および2つの遺伝要因（TNF-α-308およびIL-1β-31）によってより正確な死亡率予測が実施可能であったことを見出した。

患者、例えばICUに収容された患者のための臨床転帰の決定方法は、該患者からゲノムDNAを採集すること、および該ゲノムDNA中の炎症促進性メディエーターに関連する1つまたはそれ以上の関連遺伝的多型の存在を検出することを含むことができる。患者からのゲノムDNAの採集は、当該分野で知られたいかなる方法によっても実施できる。ゲノムDNAは患者からのいかなる生物学的試料からも採集することができる。生物学的試料は血液、血清、尿、前立腺液、精漿、精液、組織抽出試料、または生検試料であることができる。生物学的試料は、例えば、患者から血液を採取すること、および、EDTA抗凝固全血からゲノムDNAを抽出することを含むことができる。ゲノムDNAからの関連遺伝子の増幅は、自動化ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）サーマルシークエンサーを使用して、または当該分野で知られた他のいかなる適当な方法を使用しても実施することができる。炎症促進性サイトカインに関連した遺伝的多型の検出は、当該分野で知られたいかなる検出システムを使用しても実施することができる。ABI PRISM 7000 シークエンス ディテクション システム（AppliedBiosystems, Foster City, CA）などの自動化配列検出システム（an automated sequence detectionsystem）は、例えば、各SNPを検出するためにPCRの前後に使用することができる。IL-1ra 遺伝子のイントロン2内の可変数反復単位を含むDNA断片はバイオラドアイサイクラー（a Bio-Rad iCycler、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）中でPCRにより増幅することができ、そして得られたPCR産物はアジレント テクノロジーズ バイオアナライザー 2100（Agilent Technologies Bioanalyzer 2100、AgilentTechnologies, Santa Clara, CA）中で電気泳動により分析することができる。

2つの遺伝的多型、TNF-α-308GAおよびIL-1β-31CT/TTは、重症患者、特に敗血症の患者におけるICU死亡率と有意な相関性を有する傾向がある。これら2つの多型遺伝座における遺伝子型を従来の臨床的予測因子と組み合わせて、または組み合わせずに使用することにより、ICU患者における転帰のより正確な予測を可能にすることができる。臨床的予測因子は、高いAPACHEIIスコア、性別、過去の治療歴、および／または感染であることができる。当該遺伝的多型、TNF-α-308GAおよびIL-1β-31CT/TTのAPACHE IIスコアと組み合わせた使用は、重症患者におけるICU死亡率と有意な相関性を有する傾向がある。

本願の教示は次の実施例および得られたデータを参照することによりさらにいっそう充分に理解することができる。

材料および方法
研究の被験者：本研究の被験者は、千葉大学付属病院のICUに2001年10月から2007年11月までの間に収容された敗血症、外傷性傷害、重症急性膵炎、劇症肝炎、および術後回復（患者群）などの、集中治療を必要とする臨床状態にある224例の患者、および294例の健常ボランティア（対照群）である。

敗血症の診断は、米国胸部医学会議／集中治療医学会・合意会議（The American College of Chest Physicians/Society of the CriticalCare Medicine Consensus Conference）による合意文書中に記載された基準により行った（非特許文献26）。本研究は千葉大学大学院医学研究員倫理審査委員会による承諾を得た。インフォームド・コンセントは各研究への参加者またはその家族より入手した。

データ収集：年齢、性別、および過去の治療歴（心臓疾患、呼吸器疾患、肝臓疾患、腎臓疾患、悪性腫瘍、糖尿病、自己免疫疾患、および脳疾患）はICU収容時に各患者について記録し、ICU収容24時間以内にAPACHE IIスコアを算出した。

過去の治療歴として記録された臨床状態：「過去の治療歴」として記録される臨床状態には次の状態が包含されていた。
1）心臓疾患：薬物治療中の高血圧症、狭心症、虚血性心疾患、またはニューヨーク心臓協会クラスIII／IV。
2）呼吸器疾患：厳しい運動制限、すなわち、階段登攀や家事遂行の不能に至る慢性拘束性、閉塞性、または欠陥性疾患；あるいは、報告された慢性低酸素血症、炭素過剰血症、2次性多血症、肺高血圧症（＞40mmHg）、または人工呼吸器依存者。
3）肝臓疾患：チャイルド分類B/C、生検診断された肝硬変、門脈圧亢進症、または肝不全／肝性昏睡の履歴。
4）糖尿病：医療機関で診断され、投薬治療されている糖尿病。
5）悪性腫瘍：白血病およびリンパ腫以外の全ての種類の悪性腫瘍。
6）腎臓疾患：K/DOQI（Kidney Disease Outcome QualityInitiative、非特許文献27）のステージIIIまたはそれ以上に分類された慢性腎臓疾患。
7）脳疾患：脳梗塞、頭蓋内出血。
免疫抑制剤または高濃度ステロイドで治療された自己免疫疾患は「過去の治療履歴」から除外した。化学療法または放射線療法で治療された悪性腫瘍疾患も除外した。

転帰の定義：ICU収容期間中の死亡率および臓器不全および肺障害は、本研究で予測されるべき転帰基準とみなした。ICU収容期間に算出されたSOFAスコアは臓器不全の重症度の指標として使用した。SOFAスコアはICU収容時、および毎日の午前6：00−6：30の間に算出した。ICU収容期間のSOFAスコアの最大値はSOFA maxと表示し、10以上のSOFAmaxは重症臓器不全の存在を示すと判断した。機械換気の使用は、肺障害の指標とみなした。機械換気期間は7日間を超えた場合、重症の肺障害の存在を示すと判断した。

試料採集およびDNA抽出：被検患者から血液試料をICU収容時およびその後1日1回動脈カテーテルを介して採集した。毎日の血液試料は全て午前6：00−6：30の間に採集した。健常ボランティアから静脈血試料を前肘部静脈を介して採集した。血液試料は抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を加えた血液採取管に採集した。ゲノムDNAはEDTA−抗凝固全血からQIAGEN QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN, Valencia, CA）を使用して製造者の使用説明書に従い抽出した。

遺伝的多型解析：サイトカイン産生に関連する16の異なる遺伝的多型を本研究で検討した。それらは、15の異なる遺伝子座での一塩基多型（SNPs）、これらは全て関連遺伝子のプロモーター領域に位置するものであり、そしてIL-1ra遺伝子のイントロン2内の可変タンデム反復配列（VNTR）である。SNP遺伝子座は次のものについて検討した：腫瘍壊死因子-α（TNF-α）-308G/A、TNF-α-238G/A、LTα-T/C、インターロイキン-1β（IL-1β）-511A/G、IL-1β-31C/T、IL-6-174G/C、IL-6-634G/C、IL-10-1082A/G、IL-10-819C/T、IL-10-592C/A、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）-173G/C、CD14-159G/A、プロテインC（PROC）-1654C/T、PROC-1641G/A、および／またはPROC-1476A/T。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイは、特異的蛍光標識プローブを用い、15のSNP遺伝子座の遺伝子タイピングのために実施した。PCRプライマーおよび蛍光発生プローブは各SNPについて設計し、PrimerExpress^商標 version 1.5 software（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて解析した。各ウエルの蛍光はPCRの前後にABI PRISM 7000 Sequence DetectionSystem（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して測定した。SNP遺伝子タイピングの詳細な方法は従前に公表されている（非特許文献12）。

IL-1ra遺伝子のイントロン2内の多型領域は可変数の86bpタンデム反復単位を含む。この領域を含むDNA断片をBio-Rad iCycler（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）中でPCRにより増幅し、そして得られたPCR産物をAgilent Technologies Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, SantaClara, CA）中で電気泳動により分析した。86bpタンデム反復単位を4つ、2つ、5つ、3つ、および6つ持つ対立遺伝子（それぞれRN1、RN2、RN3、RN4、およびRN5と表示する。）は、それぞれ410bp、240 bp、500 bp、325 bp、および595 bpの大きさの増幅産物を採用実験条件下でもたらす。VNTR遺伝子タイピングの詳細な方法は従前に公表されている（非特許文献28）。

血中IL-6レベル：ICU患者の血中IL-6レベルをICU収容時およびICU収容期間中1日1回分析した。分析は、迅速な化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）により、フジレビオ・ヒトIL-6 CLEIAカートリッジ（Fujirebio, Tokyo,Japan）を備えた自動化CLEIAシステム フジレビオ ルミパルス エフ^登録商標（Fujirebio Lumipulse f^登録商標、Fujirebio,Tokyo, Japan）を使用して行った（非特許文献12、29）。「試料採集およびDNA抽出」の項に記載したように採取した血液試料から血漿を直ちに分離し、分析まで凍結保存（-70℃）した（非特許文献12）。ICU収容期間中の最大血中IL-6レベルをIL-6 Maxと表示する。

統計解析：遺伝子型頻度がハーディー・ワインベルグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）と一致するかを、対照被験体と患者について、χ²適合度検定（χ² goodness of fit test）を使用して検定した。各多型遺伝子座での遺伝子型頻度と対立遺伝子頻度に関する患者群および対照群の間の相違はχ²検定により検討した。全患者群（n = 224）において、ICU死亡率に対するAPACHE IIスコア、年齢、性別、過去の治療歴、感染、および遺伝的多型の影響、SOFA Max（＞10）、機械換気、並びに機械換気期間（＞7日間）を、逐次多変量ロジスティック回帰分析（a stepwisemultivariable logistic regression analysis applying）により0.05のp値をもって後進選択（backward selection）を適用し検討した。感染と他の予測因子との間の交互作用は各応答変数について検討した。同様の分析を敗血症部分群（n = 123）について実施した。各モデルの予測能力を、リーブ ワン アウト交差検定（leave-one-outcross-validation）によって導かれた受信者動作特性曲線（a receiver-operating characteristics (ROC) curve）および曲線下面積（corresponding area under the curve (AUC)）により検討した。全てのp値は両側検定とした。p値が0.05より小さい場合、統計的に有意であるとみなした。
全ての統計解析はウインドウズ用SAS ver9.1.3（SAS Institute, Inc., Cary, NC）およびウインドウズ用Rver. 2.6.1（R Development Core Team）を使用して実施した（非特許文献30）。

結果
炎症促進性メディエーターに関連した16の異なる遺伝的多型および従来の人口学的および／または臨床的なパラメーター（APACHEIIスコア、年齢、性別、過去の治療歴、および感染）のICU死亡率に対する影響の検討を、ICU収容期間中の疾患重症度（SOFA）、機械換気、および機械換気期間の検討に加えて、全患者群（n = 224）において多変量ロジスティック回帰解析により実施した。それにより、ICU患者の転帰に有意に相関する要因が明らかになった。敗血症部分群（n = 123）において同様の方法で部分群分析を実施した。TNF-α-308GA（オッズ比、8.01；95%CI、1.30-49.92；p = 0.025）、IL-1β-31CT（オッズ比、3.25；95%CI、1.21-8.72；p = 0.020）、およびAPACHE IIスコア（オッズ比、1.08；95%CI、1.02-1.13；p = 0.004）は、全患者群においてICU死亡率と有意に相関した。以下に詳述するように、敗血症部分群においてICU死亡率と有意に相関した要因は、TNF-α-308GA（オッズ比、12.92；95%CI、1.25-144.79；p = 0.038）、IL-1β-31CT/TT（オッズ比、9.04；95%CI、1.12-72.75；p = 0.039）、およびAPACHE IIスコア（オッズ比、1.06； 95%CI、1.01-1.12；p = 0.030）であった。敗血症部分群に関するこの所見はこのように、全患者群に関するものと同様であった。ROC解析により、臨床パラメーターのみの組み合わせ（APACHE IIスコアおよび感染）と比較して（ROC-AUC = 0.77）、2つの臨床パラメーターおよび2つの遺伝パラメーター（TNF-α-308およびIL-1β-31）の使用により、全患者群におけるICU死亡率のより正確な予測が可能になることが証明された（ROC-AUC = 0.81）。同様に、2つの遺伝パラメーターおよびAPACHE IIスコア（ROC-AUC = 0.80）を使用することにより、APACHE IIスコアのみ（ROC-AUC = 0.68）を使用したときと比較して、敗血症部分群におけるICU死亡率をより正確に予測できた。

検討した224例のICU患者には、123例の敗血症患者、47例の待機手術を受けている患者（心臓手術、25例；腹部手術、9例；神経系／脊椎手術、6例；その他、4例）、15例の重症急性膵炎、9例の外傷性傷害患者、6例の心肺停止患者、5例の自己免疫疾患患者、4例の呼吸器疾患、4例の出血性ショック患者、4例の急性腎不全患者、3例の急性薬物中毒患者、2例の急性心筋梗塞患者、1例の火傷患者、および1例の急性腹症患者が含まれる。表1に全患者群および敗血症部分群の背景特性を要約する。

ICU患者群における遺伝的多型の詳細な分析の前に、遺伝子型頻度がハーディー・ワインベルグ平衡と一致することを、本検討で対照群において検討した15のSNP遺伝子座全てについて確認した。さらに、解析した16の遺伝的多型のいずれについても、患者群と対照群の間で遺伝子型頻度に有意な差異は何も認められなかった。

表2に患者群におけるSNP遺伝子タイピングの結果を要約する。解析した15のSNP遺伝子座のうちIL-6-174は単型であることが分かった（表2）。IL-1ra遺伝子のイントロン2内のVNTRに関し3つの異なった遺伝子型、すなわち197例の患者でRN1/1、21例の患者でRN1/2、および6例の患者でRN1/3が同定された。これらの所見に基づき、試験した16の遺伝的多型からIL-6-174を除外し、15の異なった遺伝的多型をICU患者の臨床経過および転帰との相関性に関して検討した。

多変量解析により3つの要因が全患者群におけるICU死亡率と有意に相関することが判明した。それらは、TNF-α-308GA（オッズ比、8.01；95% CI、1.30-49.92；p = 0.025）、IL-1β-31CT（オッズ比、3.25；95% CI、1.21-8.72；p = 0.020）、およびAPACHE IIスコア（オッズ比、1.08；95% CI、1.02-1.13； p = 0.004）である。感染はICU死亡率に相関すると分かったが、その相関は統計的に有意ではなかった（オッズ比、3.22；95% CI、0.98-10.54；p = 0.053）。敗血症部分群におけるICU死亡率と有意に相関した要因はTNF-α-308GA（オッズ比、12.92；95% CI、1.25-144.79；p = 0.038）、IL-1β-31CT/TT（オッズ比、9.04; 95% CI、1.12-72.75；p = 0.039）、およびAPACHE IIスコア（オッズ比、1.06；95% CI、1.01-1.12；p =0.030）であった。このことは、敗血症部分群における所見が全患者群におけるものと同様であることを示す（表3）。

APACHEIIスコア（オッズ比、1.19；95% CI、1.12-1.25；p < 0.001）および感染（オッズ比、4.98；95% CI、2.47-10.05；p < 0.001）は全患者群におけるICU収容期間中のSOFA max値が10以上であること（＞10）と有意に相関した。敗血症部分群では、APACHE IIスコア（オッズ比、1.16；95% CI、1.09-1.25；p < 0.001）および女性性（female gender）（オッズ比、0.36；95% CI、0.14-0.91；p = 0.03）がこの転帰基準と有意に相関した。

4つのパラメーターが全患者群における機械換気の効率と有意に相関した。それらはIL-1ra VNTR RN1/1（オッズ比、2.69；95% CI、1.01-7.18；p = 0.048）、心臓疾患の履歴（オッズ比、3.28；95%CI、1.14-7.64；p = 0.006）、APACHE IIスコア（オッズ比、1.15；95% CI、1.10-1.22；p < 0.001）、および感染（オッズ比、2.16；95% CI、1.09-4.38；p = 0.028）である。敗血症部分群では、APACHE IIスコア（オッズ比、1.06；95% CI、1.01-1.12；p = 0.030）のみがこの転帰基準と有意に相関した（表4）。

APACHEIIスコア（オッズ比、1.11；95% CI、1.06-1.16；p < 0.001）および感染（オッズ比、9.28；95% CI、4.24-20.25；p < 0.001）は全患者群における7日間を越える機械換気期間と有意に相関した。敗血症部分群では、APACHE IIスコア（オッズ比、1.08；95% CI、1.03-1.14；p = 0.002）のみがこの転帰基準と有意に相関した（表5）。

多変量解析により同定された4つのICU死亡率予測因子の様々に組み合わせたモデルの予測能力をROC分析により評価した。臨床パラメーターのみの組み合わせ（APACHE IIスコアおよび感染）と比較して（ROC-AUC = 0.77）、2つの臨床パラメーターに加えて1つの遺伝パラメーターを組み合わせると全患者群におけるICU死亡率をより正確に予測できた（TNF-α-308、ROC-AUC = 0.78；IL-1β-31、ROC-AUC = 0.80）。2つの臨床パラメーターおよび2つの遺伝パラメーターを組み合わせて使用すると、さらにいっそう正確な予測が可能になった（ROC-AUC = 0.81）（図1）。これら結果は同様に敗血症部分群においても得られた。APACHE IIスコアのみと比較して（ROC-AUC = 0.68）、APACHE IIスコアに加えて1つの遺伝パラメーターを組み合わせると（TNF-α-308、ROC-AUC =0.72；IL-1β-31、ROC-AUC = 0.77）ICU死亡率をより正確に予測できた。2つの臨床パラメーターおよび2つの遺伝パラメーターを組み合わせて使用すると、さらにいっそう正確な予測が可能になった（ROC-AUC = 0.80）（図2）。

本実施例に述べた結果と一致して、TNF-α-308、IL-1β-31、およびAPACHE IIスコアはICU死亡率と全患者群および敗血症部分群の両方において独立して相関した。APACHE IIスコアに対するオッズ比は全患者群（1.08）および敗血症部分群（1.06）の間で大きく変わらなかったが、敗血症部分群におけるTNF-α-308 GAに対するオッズ比（12.92）は全患者群のもの（8.01）より高かった。さらに、敗血症部分群におけるIL-1β-31CT/TTに対するオッズ比（9.04）は全患者群のIL-1β-31CTに対するオッズ比（3.25）より高かった。これら結果は、遺伝的多型のICU死亡率への影響は全患者群より敗血症部分群においてより大きいことを示唆する。

重症患者の病理学におけるサイトカインの中枢的役割は、今や良く認識されている。高サイトカイン血症は現在、重症の病気の重症度の指標とみなされており、そして高サイトカイン血症の進行はそれ自体が、臨床状態の悪化に役割を果たすことが知られている（非特許文献15、31）。本研究では、ICU収容中の、炎症促進性サイトカイン指標、IL-6 Maxが敗血症部分群で有意に高く（表2、p < 0.001）、このことは敗血症部分群における高サイトカイン血症が全患者群のものよりいっそう重いことを示唆する。この結論に一致して、敗血症部分群におけるAPACHE IIスコアおよびSOFA Maxは全患者群のものより高い傾向であった。このことは、臨床状態が敗血症部分群において全患者群よりもいっそう重いことを示す。従前の結果では何らかの遺伝的多型がIL-6の過剰産生に関連し、そして重症患者の臨床転帰に密接に相関することが示唆された（非特許文献12、13）。これにより、本研究で検討された炎症促進性サイトカインに関連する2つの他の遺伝的多型、TNF-α-308およびIL-1β-31が、より重い高サイトカイン血症およびより重い臨床状態を示した敗血症群における転帰予測により大きく影響することを説明できる。

TNF-αは敗血症患者における遺伝的多型の研究で最も広く検討されてきたサイトカインである。TNF-α-308G/AはTNF-α遺伝子のプロモーター量領域内のSNPであり、TNF-αの典型的な機能的遺伝的多型である。このSNP遺伝子座でのA対立遺伝子が、ヒトB細胞におけるTNF-α遺伝子の転写増加（非特許文献32）、および、細菌性リポポリサッカライド（LPS）で刺激を受けたヒトにおける循環中の単核白血球および顆粒球によるTNF-αの高産生（非特許文献33）に関連すること報告されているが、一方、LPS注射を受けて実験的エンドトキシン血症を誘発した87例の健常男性ボランティアではこのSNPとTNF-α産生との間で有意な相関性は何も観察されなかった（非特許文献34）。TNF-α-308G/Aの敗血症、重症敗血症、および敗血症ショックとの相関性はこのように未だ明らかではない。スタバーら（Stuber et al.）は、術後回復期に重症敗血症を発症した80例の患者において、このSNPと重症敗血症の発生率との間に有意な相関性は何も検出されなかったと報告している（非特許文献35）。それに反し、ディアンリアングら（Dianliang et al）は、重症急性膵炎の208例の患者におけるこのSNPと敗血症ショックの発生率との間の相関性を示している（非特許文献36）。メンゲスら（Menges et al.）は、重症外傷性傷害の159例の患者において、このSNPが敗血症の発症率と死亡率に関連したことを報告した（非特許文献37）。

また、IL-1β-31 and IL-1β-511の遺伝子タイプ（CC、CT、およびTT）の頻度分布は、患者群（表2）および対照群（データ非記載）において一致率がそれぞれ98.2％および97.7％であることにより示されるように、ほぼ同じだった。エル−オマールら（El-Omaret al.）により報告された同様の結果は、既定民族の集団内でこれら2つの多型遺伝子座での遺伝子タイプの継承パターンが類似していることを示唆する（非特許文献38）。にも拘らず、本実施例では、IL-1β-31のみが全患者群および敗血症部分群の両方におけるICU死亡率と有意に相関したことは、これら2つの多型の重症患者の臨床転帰への影響に少し相違がある可能性があることを示唆する。本実施例の結果と一致しない知見がIL-1β-31およびIL-1β-511の敗血症との相関に関して得られている。すなわち、バーバーら（Barber etal.）は、IL-1β-31での多型と重症火傷の228例の患者における重症敗血症の発症および死亡率の危険とに有意な相関が何もないと報告しており（非特許文献39）、そして、マーら（Ma et al.）はIL-1β-511が敗血症と診断された60例のICU患者における高い敗血症重症度の危険因子である可能性を示唆した（非特許文献28）。注意すべきことは、上記2つの研究はいずれも、IL-1β遺伝子のプロモーター領域内のこれら2つの遺伝的多型の検討を本実施例で行ったように同時に、検討しなかったことである。

APACHEIIスコアおよび感染は全患者群におけるICU収容中のSOFA Max（＞10）と相関する因子であったが、APACHE IIスコアおよび女性性は敗血症部分群におけるこの転帰基準と相関した。遺伝子多型と臨床状態の悪化の指標であるICU収容中のSOFA Maxとの有意な相関性は、全患者群または敗血症部分群のいずれでも何も認められなかった。敗血症部分群（全て50歳以上の年齢）での結果とは対照的に、性別が重症患者の転帰に影響することを裏付ける最近の知見では女性性の利点が示唆されている（非特許文献40-42）。フリンクら（Frink et al.）は、多様な外傷性傷害の患者の中で女性（50歳以上ではない）は同年齢の男性より、高サイトカイン血症および多臓器不全に対する感受性が低いことを証明した（非特許文献40）。アドリエら（Adrie et al.）は、重症敗血症の患者の中で、病院全体の死亡率が女性（50歳以上）において同年齢の男性より有意に低く、より若年の群では男性および女性の間に有意な相違が何もなかったことを報告した（非特許文献41）。チョウドリーら（Choudhry et al.）は、男性ホルモンおよび女性ホルモンの外傷後免疫反応への効果の相違を精査し、そして損傷に続く免疫機能の維持において、アンドロゲンの抑制効果を逆転することを介したエストロゲンの役割を強調した（非特許文献42）。これら知見は、本発明者らの知見と共に、外傷性障害からの生存および良好な回復に関して女性性の優位性をほぼ決定的に証明する。

急性肺障害／急性呼吸窮迫症候群および呼吸器関連肺傷害（ventilator-associated lung injury）に関連する遺伝子を同定するための広範囲にわたる検討が報告され、多くのSNPが疾患修飾性遺伝子座の候補として挙げられた（非特許文献43）。本願実施例の結果は、IL-1ra VNTR RN1/1が全患者群における機械換気に有意に相関する唯一の遺伝子マーカーであり、また、検討した遺伝子多型はどれも敗血症部分群におけるこの転帰基準と有意に相関しなかったことを示す。さらに、全患者群または敗血症部分群のいずれにおいても機械換気期間と有意に相関する遺伝子多型はなかった。IL-1ra VNTRのRN2対立遺伝子は敗血症患者で死亡率と有意に相関したが、RN1対立遺伝子は相関しなかった（非特許文献28）。さらに、IL-1ra VNTR自体、Lam and dos Santos（非特許文献43）では疾患修飾遺伝子候補のリストに含まれていない。

ICU死亡率の4つの有望な予測因子、すなわち2つの臨床パラメーターおよび2つ遺伝パラメーターを多変量解析により同定し、全患者群および敗血症部分群における死亡率を予測するために様々な組み合わせで使用した。ROC分析により、臨床パラメーターのみの組み合わせ（APACHE IIスコアおよび感染）と比較して、2つの臨床パラメーターに1つまたは2つの遺伝パラメーター（TNF-α-308GAおよび／またはIL-1β-31CT）を加えると全患者群におけるICU死亡率をより正確に予測できた。これと一致して、APACHE IIスコアに1つまたは2つの遺伝パラメーターを加えるとAPACHE IIスコア単独よりも、敗血症部分群におけるICU死亡率をより正確に予測できた。しかしながら、予測能力の付随する向上は、ROC-AUCの変化により示されたように、敗血症部分群でより大きかった（全患者群で0.77から0.81、敗血症部分群で0.68から0.80）。このことは、遺伝子パラメーター（関連多型遺伝子座の遺伝子型）（TNF-α-308GA and IL-1β-31CT/TT）を従来のAPACHE IIスコアなどの臨床予測因子組み合わせて使用することにより、敗血症を発症したICU患者の転帰のより正確な予測が可能になることを示唆する。

総括すると、重症患者の遺伝的多型とICU死亡率、疾患重症度、機械換気の実施、および機械換気期間との関連を多変量解析により検討した。結果は、2つの遺伝的多型、TNF-α-308G/AおよびL-1β-31C/Tが、重症患者、特に敗血症の患者のICU死亡率と有意に相関することを証明した。本結果はさらにこれら2つの多型遺伝子座における遺伝子型を従来の臨床予測因子であるAPACHE IIスコアと組み合わせて使用することにより患者の転帰のより正確な予測が可能になることを示唆する。

出願者は全ての引用文献の内容全体を本開示に特に包含する。さらに、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限の値および好ましい下限の値のリストとして量、濃度、または他の値若しくはパラメーターが示されている場合、その範囲が別々に開示されるかに関わらず、それは任意の上限または好ましい値と任意の下限または好ましい値の任意の対から成る全ての範囲を具体的に開示していると理解するべきである。本明細書において数値の範囲が列挙されている場合、特に断らない限り、その範囲は、その終了点と範囲内の全ての整数と分数とを含むことを意図している。範囲が定義されている場合、本発明の範囲を列挙された特定の値に限定すべきではない。

本発明の他の実施形態は、本文に開示された本発明の明細書および実施を考慮することにより、当業者に明らかであろう。本明細書および実施例は、単なる例示とみなされると解釈される。

Claims (5)

1. 集中治療を必要とする臨床状態にある患者の生物学的試料からゲノムDNAを採集し、該患者ゲノムDNAにおいてTNF-α遺伝子の第-308位およびIL-1β遺伝子の第-31位での遺伝的多型の検出を配列決定システムを使用して行い、かつ
   該患者のAPACHE IIスコアの測定を行い、
   TNF-α遺伝子の第-308位でのGまたはA対立遺伝子およびIL-1β遺伝子の第-31位でのCまたはT対立遺伝子の存在が検出され、かつ
   APACHE IIスコアが55〜71の範囲であるとき、
   該患者の臨床転帰が死亡であると予測することを含む、集中治療を必要とする臨床状態にある患者の臨床転帰予測を補助する方法。
2. 前記集中治療を必要とする臨床状態にある患者が、集中治療を必要とする敗血症の患者である請求項1に記載の方法。
3. 前記遺伝的多型の検出が自動ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）サーマルシークエンサーを使用して該多型を含む遺伝子を増幅することを含む請求項1または請求項2に記載の方法。
4. 前記配列決定システムが電気泳動を含む請求項1または請求項2に記載の方法。
5. 前記配列決定システムが自動配列決定システムを含む請求項1または請求項2に記載の方法。

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