CN114774546B

CN114774546B - 一种与人骨肉瘤相关的分子标记物trim22及其应用

Info

Publication number: CN114774546B
Application number: CN202210454385.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡卫华; 杨思亭; 刘蔚; 葛旭辉; 唐鹏宇
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114774546A

Abstract

本发明公开了一种与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22，所述TRIM22的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。发明人通过实验研究发现：骨肉瘤组织中TRIM22蛋白的表达显著低于正常骨组织；过表达骨肉瘤细胞中TRIM22的表达可以降低骨肉瘤细胞体外增殖、克隆形成能力、侵袭转移能力，且可以降低骨肉瘤体内增殖及侵袭转移能力；TRIM22蛋白可以与NRF2蛋白相结合并提高其泛素化水平，NRF2在骨肉瘤中高度表达，并且与TRIM22表达量呈明显负相关。这些研究结果表明TRIM22可以作为骨肉瘤的分子标志物，应用于骨肉瘤的辅助诊断、疗效预测及预后判断。这对于骨肉瘤的早期诊断和预后评估具有重要的意义。

Description

一种与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22及其应用。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一种起源于间质细胞的恶性骨肿瘤，主要发生于儿童和青少年中，约占小儿患者所有恶性肿瘤的2.4％，病死率极高。骨肉瘤常发生于胫骨近端、肱骨近端和股骨远端的干骺端区域，具有高度侵袭性，中晚期常伴有肺部转移。尽管过去数十年中医疗技术包括手术方式、理念及放化疗技术得到迅速发展，由于肺转移及耐药等原因，骨肉瘤的五年生存率依然很低。实际上，由于目前仍然没有有效的治疗方法，伴有转移的骨肉瘤患者的总体生存率相当低，大约在10％-20％之间。因此，充分理解骨肉瘤发生发展的深层生物学机制，早期筛查诊断骨肉瘤具有重要意义。

泛素化修饰是最常见的蛋白质翻译后修饰之一，其通过调节蛋白质稳定性、信号传递、DNA修复等过程参与了一系列生物活动。大多数促癌或抑癌的蛋白都受到翻译后修饰，尤其是泛素化修饰的调控。TRIM(Tripartite motif-containing)蛋白家族是RING E3泛素连接酶家族的一个亚家族，目前共发现70多种TRIM蛋白。已有研究证明TRIM家族蛋白在多种生物学过程包括转录调控、细胞增殖、细胞转移、细胞凋亡、肿瘤形成等中发挥重要作用。然而，到目前为止，关于骨肉瘤中TRIM蛋白家族的相关研究甚少。TRIM22是TRIM蛋白家族的重要一员，其最初被鉴定为IFN诱导蛋白，同时也是TP53的转录靶点。某些参与重要生物学过程的蛋白包括IκBα、NS5A和NOD被证明是TRIM22的底物蛋白。之前的文献报道TRIM22可以通过降解IκBα激活胶质瘤细胞中的NF-κB信号通路。另一项研究表明，TRIM22可以通过其核定位的RING结构域抑制HBV相关基因表达水平。然而，关于TRIM22在骨肉瘤中的具体功能作用及其潜在生物学机制尚不清楚。

目前骨肉瘤的治疗手段只能稍微延长患者生存期，且诊断也要综合病史、影像学检查及穿刺活检病理学检查等，因此发展新的治疗手段和特异性高的分子诊断标记物成为防治骨肉瘤的迫切需求。因此本研究旨在通过肿瘤标志物试剂盒检测骨肉瘤患者分子病理变化，可以做到早期筛查及辅助诊断，从而提高骨肉瘤患者的总体生存率。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中骨肉瘤诊断技术的不足，提供一种能早期检测骨肉瘤的分子标记物，对骨肉瘤的早期诊断和预后评估具有重要的意义。

技术方案

一种与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22，所述TRIM22的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

SEQ ID No.1:

MDFSVKVDIEKEVTCPICLELLTEPLSLDCGHSFCQACITAKIKESVIISRGESSCPVCQTRFQPGNLRPNRHLANIVERVKEVKMSPQEGQKRDVCEHHGKKLQIFCKEDGKVICWVCELSQEHQGHQTFRINEVVKECQEKLQVALQRLIKEDQEAEKLEDDIRQERTAWKNYIQIERQKILKGFNEMRVILDNEEQRELQKLEEGEVNVLDNLAAATDQLVQQRQDASTLISDLQRRLRGSSVEMLQDVIDVMKRSESWTLKKPKSVSKKLKSVFRVPDLSGMLQVLKELTDVQYYWVDVMLNPGSATSNVAISVDQRQVKTVRTCTFKNSNPCDFSAFGVFGCQYFSSGKYYWEVDVSGKIAWILGVHSKISSLNKRKSSGFAFDPSVNYSKVYSRYRPQYGYWVIGLQNTCEYNAFEDSSSSDPKVLTLFMAVPPCRIGVFLDYEAGIVSFFNVTNHGALIYKFSGCRFSRPAYPYFNPWNCLVPMTVCPPSS。

与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22在制备骨肉瘤诊断或预后评估产品上应用。

检测上述分子标记物TRIM22的表达水平的试剂在制备骨肉瘤诊断或预后评估产品上的应用。

所述检测分子标记物TRIM22的表达水平的试剂包括用RT-PCR检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增引物。所述引物序列为：

TRIM22-F:5’-TCCGCATAAACGAGGTGGTC-3’

TRIM22-R:5’-GTCTCTCGATCTTCCAGGCG-3’。

一种用于早期诊断、预后评估骨肉瘤的试剂盒，包括通过RT-PCR检测分子标记物TRIM22表达水平的试剂，所述分子标记物的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，所述试剂包括特异性扩增分子标记物TRIM22的引物，所述引物序列为：

TRIM22-F:5’-TCCGCATAAACGAGGTGGTC-3’

TRIM22-R:5’-GTCTCTCGATCTTCCAGGCG-3’。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种与骨肉瘤诊断、预后评估相关的分子标志物TRIM22，该分子标记物在骨肉瘤患者组织中的表达量显著高于相应的正常骨组织，通过定量检测该分子标志物，可用于骨肉瘤的早期筛查及辅助诊断，从而提高骨肉瘤患者的总体生存率。

附图说明

图1为骨肉瘤患者组织及正常骨组织中TRIM22表达情况的免疫组织化学实验检测结果；

图2为骨肉瘤患者组织及正常骨组织中TRIM22蛋白表达量的Western Blot检测结果；

图3为骨肉瘤组织及正常骨组织中TRIM22mRNA表达量的qRT-PCR检测结果；

图4为骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中TRIM22的表达情况的Western blot检测结果；

图5为骨肉瘤细胞系143B中用慢病毒特异性过表达TRIM22后蛋白水平的表达量的Western blot检测结果；

图6为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的增殖能力的CCK-8检测结果；

图7为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的增殖能力的EDU检测结果；

图8为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的克隆形成数目统计结果；

图9为对照组143B细胞及过表达TRIM22的143B细胞皮下注射至裸鼠28天后形成的肿瘤及肿瘤体积与质量统计结果；

图10为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞侵袭转移数目统计结果；

图11为对照组143B细胞及过表达TRIM22的143B细胞尾静脉注射至裸鼠28天后肺部转移H&E染色及肺转移灶数目统计结果；

图12为骨肉瘤细胞系143B中TRIM22免疫沉淀复合物中NRF2特异性肽段的质谱鉴定图；

图13为骨肉瘤细胞系143B中USP13和METTL3蛋白的正反免疫共沉淀鉴定结果；

图14为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后内源性NRF2泛素化水平测试结果；

图15为骨肉瘤临床样本及对应的正常骨组织中NRF2蛋白表达量的Western blot检测结果；

图16为NRF2在骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中的表达情况的Western blot检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1骨肉瘤临床样本中TRIM22表达量分析

本发明所采用的骨肉瘤及正常骨组织临床样本均来自于南京医科大学第一附属医院。本项目已征求病人同意并经南京医科大学第一临床医学院伦理委员会批准。

(1)组织标本来源

南京医科大学第一附属医院收集到共100对骨肉瘤及正常骨组织临床样本。手术中组织离体后立即放入液氮中冷冻，后转移储存于-80℃冰箱中。

(2)组织切片及免疫组化

a)组织固定于4％多聚甲醛24小时；

b)将固定好的组织制备石蜡包埋的组织蜡块，用切片机将组织蜡块切成厚度为6μm厚的蜡块，将切好的组织片放在37℃烘箱过夜；

c)将切好的石蜡切片依次进行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，流水冲洗3-5min；

d)将切片浸没于柠檬酸盐抗原修复液中，沸水水浴15分钟进行抗原修复后，取出自然冷却；

e)将切片放入浸满PBS的洗片盒中，放置摇床上洗3次，每次5分钟；

f)滴加封闭血清至切片上，常温封闭1小时；

g)轻轻甩去封闭血清，将0.5％BSA稀释的TRIM22抗体(Proteintech，1：200稀释)滴加在切片上，4℃孵育过夜；

h)次日取出切片，PBS洗切片3次，每次5分钟；

i)将0.5％BSA稀释的HRP标记的二抗(碧云天，稀释比例1：1000)滴加在切片上，常温孵育1小时后，PBS洗切片3次，每次5分钟；

j)DAB显影液滴加在切片上，室温反应，镜下观察，根据显色情况，在水中终止反应，记录显色时长，流水冲洗5分钟；

k)苏木素染核30-60秒，流水冲洗5分钟，镜下观察染核情况；

l)依次将切片放入70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精I、100％酒精II各两分钟，二甲苯I、二甲苯II各2分钟；

m)中性树脂封片，通风橱晾干，正置显微镜下拍照记录。

骨肉瘤患者组织及正常骨组织中TRIM22表达情况的免疫组织化学实验检测结果如图1所示，可以看出，骨肉瘤组织中TRIM22蛋白的表达显著低于正常骨组织。对骨肉瘤临床样本TRIM22蛋白的表达情况进行统计，发现骨肉瘤组织中TRIM22强阳性14例，阳性25例，弱阳性45例，阴性16例。

(3)Western Blot

a)总蛋白提取：随机选取12对骨肉瘤及正常骨组织，按照1mL裂解液、10μL磷酸酶抑制剂、10μL PMSF及1μl蛋白酶抑制剂配置蛋白裂解液。将组织放入匀浆机中4℃充分匀浆后冰上裂解20分钟，将裂解液收集于EP管中，4℃，12000rpm，5分钟离心，将上清转入新的EP管中；吸取部分蛋白裂解液行BCA蛋白浓度测定；余下体积按比例加入适量5×LoadingBuffer后于100℃煮沸；待室温冷却后根据实验安排放入-20℃保存或行Western Blot实验。

b)电泳与转膜：按照实验需求配制不同浓度的分离胶及浓缩胶；加入样品，80V跑浓缩胶；待蛋白样品至分离胶时调节电压至120V；待蛋白至底时停止电泳。裁剪适当大小的PVDF膜，顺序叠放滤纸、凝胶及PVDF膜制备转膜三明治，赶尽其中的气泡；夹紧转膜夹放入转膜槽之中；将转膜槽放入冰盒中，加入预冷的转膜液，300mA恒定电流转膜，转膜时间视情况而定。转膜后取出PVDF膜，放入5％BSA封闭液中封闭2小时。

c)抗体孵育及检测：封闭结束后孵育TRIM22一抗(Proteintech，1：2000稀释)，4℃过夜；次日TBST洗膜三遍，孵育相应二抗(Jackson，1：10000稀释)，常温2小时；洗膜、配置曝光液，将曝光液涂抹均匀至PVDF膜，放入凝胶成像系统，拍照分析。

骨肉瘤患者组织及正常骨组织中TRIM22蛋白表达量的Western Blot检测结果见图2，由图2可以看出，骨肉瘤组织中TRIM22蛋白的表达显著低于正常骨组织。

(4)qRT-PCR

a)总RNA提取：随机选取40对骨肉瘤及正常骨组织，移入匀浆管，每50mg组织加入1mL RNA裂解液，匀浆机4℃充分匀浆后冰上裂解15分钟后移入EP管；按每使用1mL RNA裂解液加入0.2mL氯仿加入氯仿，剧烈震荡15秒，同体积的异丙醇混匀，75％乙醇清洗沉淀后，于4℃，12000rpm离心5分钟后去除上清；待室温晾干后加入50μL的DEPC水，吹打混匀，Nanodrop2000测定RNA浓度；根据实验需要存放于-80℃或行逆转录实验。

b)RNA逆转录：采用的逆转录试剂盒购买于日本Takara公司，逆转录体系见表1：

表1

按表1的体系进行逆转录反应，设定程序为50℃，15分钟，85℃，5秒；将逆转录完成的cDNA用DEPC水1：20稀释后根据实验需要存放于-20℃或行qRT-PCR实验。

c)qRT-PCR

PCR扩增体系见表2：

表2

两步法扩增条件为：95℃，5分钟；循环反应95℃，10秒，60℃，30秒，40个循环；后溶解曲线阶段。

d)目的基因的表达量以GAPDH校正后按照2^-ΔΔCT方法计算。基因引物序列分别为：

TRIM22-F:5’-TCCGCATAAACGAGGTGGTC-3’

TRIM22-R:5’-GTCTCTCGATCTTCCAGGCG-3’

GAPDH forward:5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’

GAPDH reverse:5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’

骨肉瘤组织及正常骨组织中TRIM22mRNA表达量的qRT-PCR检测结果见图3，由图3可以看出，骨肉瘤组织中TRIM22 mRNA的表达显著低于正常骨组织(P<0.001)。

实施例2骨肉瘤细胞系中TRIM22表达量分析

(1)细胞来源及培养

骨肉瘤细胞系包括HOS、Saos-2、U-2OS、143B及MG63，正常成骨细胞系hFOB 1.19细胞系均购买于中国科学院细胞库(上海)。骨肉瘤细胞系及成骨细胞系培养在含有10％胎牛血清(Gibco)，1％三抗(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中。

(2)Western Blot

a)总蛋白提取：弃去细胞原有培养基，PBS洗三遍，加入适量裂解液。按照1ml裂解液、10μL磷酸酶抑制剂、10μL PMSF及1μL蛋白酶抑制剂配置蛋白裂解液。将细胞及蛋白裂解液放置于冰上裂解10分钟，用细胞刮刀将裂解物全部刮下后收集于EP管中；4℃，12000rpm，5分钟离心，将上清转入新的EP管中；吸取部分蛋白裂解液行BCA蛋白浓度测定；余下体积按4:1比例加入5×Loading Buffer后于100℃煮沸；待室温冷却后根据实验安排放入-20℃保存或行Western Blot实验。

c)抗体孵育及检测：封闭结束后孵育TRIM22一抗(1：2000稀释)，4℃过夜；次日TBST洗膜三遍，孵育相应二抗(Jackson，1：10000稀释)，常温2小时；洗膜、配置曝光液，将曝光液涂抹均匀至PVDF膜，放入凝胶成像系统，拍照分析。

骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中TRIM22的表达情况的Western blot检测结果见图4，如图4所示，骨肉瘤细胞系(HOS、Saos-2、U-2OS、143B及MG63)中TRIM22的蛋白表达水平明显低于正常成骨细胞系hFOB 1.19。

实施例3TRIM22对骨肉瘤细胞增殖及克隆形成能力的作用

由于TRIM22在骨肉瘤细胞系143B细胞中表达量最低，为了进一步明确TRIM22在骨肉瘤中的作用，我们在143B细胞中用慢病毒对TRIM22基因进行过表达，检测过表达效率及TRIM22对骨肉瘤细胞体内外增殖及克隆形成能力的影响。

(1)骨肉瘤细胞中过表达TRIM22

针对TRIM22的全长序列设计并合成其特异性过表达序列Lv-TRIM22(即TRIM22的编码序列，如SEQ ID No.2所示)，感染143B细胞，使TRIM22基因在细胞中过表达；

SEQ ID No.2：

病毒包装及细胞感染方法如下：

a)HEK 293T细胞(中国科学院细胞库(上海))以10万/mL密度铺板；

b)制备慢病毒包装转染体系质粒磷酸钙混合转染液，室温放置半小时；将上述质粒磷酸钙混合转染液加入HEK 293T细胞中；

c)6-8小时后，弃去上清，加入10mL新鲜RPMI1640培养液(Gibco，11875)，继续培养；

d)24小时后，荧光显微镜下观察HEK 293T细胞转染效率；

e)48小时后，收集细胞上清，4℃，1500rpm离心5分钟，弃沉淀，0.45μm滤器过滤后-80℃冻存，即可获得重组慢病毒液；

f)将143B细胞以50万/孔密度铺于在6孔板中，12小时待细胞贴壁后加入1mL重组慢病毒液及8μL polybrene(终浓度1μg/μL)，继续培养箱中培养；

g)4小时后半量换液，24小时后全量换液；

h)72小时后提取蛋白，Western blot检测过表达效率。

如上述方法所述，提取空载对照组(即空载质粒组)及TRIM22过表达组细胞蛋白，Western blot检测TRIM22蛋白表达量以验证过表达效率。

图5为骨肉瘤细胞系143B中用慢病毒特异性过表达TRIM22后蛋白水平的表达量的Western blot检测结果，可以看出，转染慢病毒后，TRIM22在骨肉瘤细胞中显著过表达。

(2)体外细胞增殖及克隆形成

a)CCK-8实验

按照2000个/孔细胞量将对照组及TRIM22过表达组细胞分别接种于96孔板中，放入细胞培养箱12小时以上至细胞贴壁。根据说明书的要求，将CCK-8试剂(同仁化学)加入孔板中，孵育24、48、72、96及120小时。使用酶标仪在450nm处测量吸光度，通过与0小时吸光度比较，增长倍数表示细胞增殖能力。

图6为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的增殖能力的CCK-8检测结果，可以看出，过表达TRIM22后骨肉瘤细胞增殖能力明显下降(P<0.001)。

b)EDU实验

按照10万个/孔细胞量将对照组及TRIM22过表达组的细胞分别接种于24孔板中，放入细胞培养箱12小时以上至细胞贴壁。根据说明书的要求，使用EDU细胞增殖试剂盒(碧云天)进行分析测定，倒置荧光显微镜下拍照分析。红色荧光为EDU阳性，蓝色荧光为细胞核。红色荧光细胞数目/蓝色荧光细胞数目为EDU阳性率。

图7为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的增殖能力的EDU检测结果；由图7可以看出，过表达TRIM22后骨肉瘤细胞EDU阳性率显著下降，代表细胞增殖能力明显下降(P<0.01)。

c)克隆形成实验

将细胞种植于六孔板中，密度500/孔，培养2周，随后固定细胞并用结晶紫染色，相机拍照，统计克隆形成数目并分析。

图8为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞的克隆形成数目统计结果，可以看出，过表达TRIM22后骨肉瘤细胞克隆形成数目明显减少，代表增殖能力明显下降(P<0.01)。

(3)过表达TRIM22抑制骨肉瘤体内肿瘤生长

将对照组及TRIM22过表达组细胞以200万数量接种于4周龄雌性裸鼠(南京医科大学实验动物中心)皮下，每隔4天测量肿瘤的直径，计算肿瘤组织体积，第28天结束实验取出肿瘤组织称重并拍照。

图9为对照组143B细胞及过表达TRIM22的143B细胞皮下注射至裸鼠28天后形成的肿瘤及肿瘤体积与质量统计结果，可以看出，过表达TRIM22的骨肉瘤细胞比对照组骨肉瘤细胞体内肿瘤生长速度慢，肿瘤体积小(P<0.001)，肿瘤质量小(P<0.001)，提示过表达TRIM22抑制骨肉瘤体内生长。

实施例4TRIM22对骨肉瘤细胞侵袭转移能力的作用

(1)Transwell实验

使用24孔Transwell小室(Ibidi)进行骨肉瘤细胞侵袭转移相关实验分析。将约2万悬浮于不含有胎牛血清培养基中的骨肉瘤细胞系143B细胞种植于上室，而在下室放入含有10％胎牛血清完全培养基。24小时后，用棉签擦拭未侵袭的上层细胞。侵袭转移的下层细胞进行固定并结晶紫染色，显微镜拍照，统计下层细胞数目并分析。

图10为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后骨肉瘤细胞侵袭转移数目统计结果，可以看出，过表达TRIM22后骨肉瘤细胞侵袭转移数目明显减少(P<0.01)，代表侵袭转移能力明显下降。

(2)过表达TRIM22抑制骨肉瘤体内肺转移

将对照组(空载质粒组)及TRIM22过表达组细胞以200万数量悬浮于100μL DMEM培养基中通过尾静脉注射至4周龄雌性裸鼠(南京医科大学实验动物中心)以评估骨肉瘤细胞体内肺转移能力。第28天结束实验取出肺组织，切片，H&E染色，显微镜下拍照并记录肿瘤转移灶数目，统计分析。

图11为对照组143B细胞及过表达TRIM22的143B细胞尾静脉注射至裸鼠28天后肺部转移H&E染色及肺转移灶数目统计结果，如图11所示，过表达TRIM22的骨肉瘤细胞比对照组骨肉瘤细胞体内肺转移灶数目减少(P<0.01)，提示过表达TRIM22抑制骨肉瘤体内肺转移。

实施例5TRIM22蛋白结合NRF2蛋白

(1)TRIM22与NRF2结合

a)免疫沉淀质谱联用(IP/MS)

取500μg 143B细胞蛋白样品，加入1μg与后续IP同种属IgG和20μl充分重悬的Protein A/G-agarose beads(Santa Cruz)，4℃缓慢摇动1小时，后2500rpm离心5分钟，收集上清用于后续的免疫沉淀。加入5μg用于IP的TRIM22抗体(Proteintech，1：50稀释)，4℃缓慢摇动过夜。次日加入20μl充分重悬的Protein A/G-agarose beads，4℃缓慢摇动2小时。后2500rpm离心5分钟，小心吸除上清，留下沉淀，裂解液洗涤沉淀5次。完成最后一次洗涤后根据余下体积按4:1比例加入5×Loading Buffer后100℃煮沸；待室温冷却后根据实验安排放入-20℃保存或行Western Blot实验。跑胶，将所得胶条行考马斯亮蓝染色(碧云天)后，由南京医科大学分析测试中心行质谱检测并分析。

如图12所示，对NRF2蛋白的氨基酸序列进行研究比对结合质谱结果，NRF2可能与TRIM22相结合。

b)蛋白免疫共沉淀(Co-IP)

Co-IP实验进一步验证TRIM22是否与NRF2相结合。IP步骤如上所述，先用TRIM22抗体(Proteintech，1：50稀释)作IP，NRF2抗体(Proteintech，1：200稀释)行IB分析；后用NRF2抗体(Proteintech，1：50稀释)作IP，TRIM22抗体(Proteintech，1：200稀释)行IB分析。

如图13所示，Co-IP结果提示TRIM22蛋白与NRF2蛋白相结合。

实施例6TRIM22蛋白去泛素化NRF2蛋白

由于TRIM22是一种E3泛素连接酶，因此接下来评估对照组及TRIM22过表达组骨肉瘤细胞中NRF2的泛素化水平。NRF2抗体(Proteintech，1：50稀释)作IP，Ub抗体(CST，1：200稀释)行IB分析。

图14为过表达骨肉瘤细胞系143B中TRIM22后内源性NRF2泛素化水平测试结果，可以看出，相比于对照组，TRIM22过表达组骨肉瘤细胞内源性泛素化水平明显上升，提示TRIM22调控NRF2蛋白泛素化水平，过表达TRIM22后NRF2蛋白泛素化水平升高。

实施例7骨肉瘤临床样本中NRF2表达量分析

对12对骨肉瘤临床样本及对应的正常组织中NRF2蛋白表达量进行Western blot实验检测，Western Blot步骤同实施例1中的第(3)部分，测试结果见图15。

由图15可以看出，骨肉瘤组织中NRF2蛋白的表达显著高于正常骨组织。

对100例骨肉瘤临床样本NRF2蛋白的表达情况进行统计，结果见表3：

表3

TRIM22和NRF2表达相关性分析(斯皮尔曼法)

可以发现，骨肉瘤组织中NRF2强阳性43例，阳性26例，弱阳性22例，阴性9例，结果提示骨肉瘤中TRIM22蛋白与NRF2蛋白表达量呈明显负相关(R＝-0.434，P<0.001)。

实施例8骨肉瘤细胞系中NRF2表达量分析

Western Blot检测NRF2在骨肉瘤细胞系(HOS、Saos-2、U-2OS、143B及MG63)及正常成骨细胞系(hFOB 1.19)中的表达情况，Western Blot步骤同实施例2，检测结果见图16。

图16为NRF2在骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中的表达情况的Western blot检测结果，可以看出，骨肉瘤细胞系(HOS、Saos-2、U-2OS、143B及MG63)中NRF2的蛋白表达水平明显高于正常成骨细胞系hFOB 1.19。

综上，可以发现，骨肉瘤组织中TRIM22蛋白的表达显著低于正常骨组织；过表达骨肉瘤细胞中TRIM22的表达可以降低骨肉瘤细胞体外增殖、克隆形成能力、侵袭转移能力，且可以降低骨肉瘤体内增殖及侵袭转移能力；TRIM22蛋白可以与NRF2蛋白相结合并提高其泛素化水平，NRF2在骨肉瘤中高度表达，并且与TRIM22表达量呈明显负相关。这些结果提示了TRIM22可以作为骨肉瘤的分子标志物，应用于骨肉瘤的辅助诊断、疗效预测及预后判断。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到此技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

<120> 一种与人骨肉瘤相关的分子标记物TRIM22及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Phe Ser Val Lys Val Asp Ile Glu Lys Glu Val Thr Cys Pro

1 5 10 15

Ile Cys Leu Glu Leu Leu Thr Glu Pro Leu Ser Leu Asp Cys Gly His

20 25 30

Ser Phe Cys Gln Ala Cys Ile Thr Ala Lys Ile Lys Glu Ser Val Ile

35 40 45

Ile Ser Arg Gly Glu Ser Ser Cys Pro Val Cys Gln Thr Arg Phe Gln

50 55 60

Pro Gly Asn Leu Arg Pro Asn Arg His Leu Ala Asn Ile Val Glu Arg

65 70 75 80

Val Lys Glu Val Lys Met Ser Pro Gln Glu Gly Gln Lys Arg Asp Val

85 90 95

Cys Glu His His Gly Lys Lys Leu Gln Ile Phe Cys Lys Glu Asp Gly

100 105 110

Lys Val Ile Cys Trp Val Cys Glu Leu Ser Gln Glu His Gln Gly His

115 120 125

Gln Thr Phe Arg Ile Asn Glu Val Val Lys Glu Cys Gln Glu Lys Leu

130 135 140

Gln Val Ala Leu Gln Arg Leu Ile Lys Glu Asp Gln Glu Ala Glu Lys

145 150 155 160

Leu Glu Asp Asp Ile Arg Gln Glu Arg Thr Ala Trp Lys Asn Tyr Ile

165 170 175

Gln Ile Glu Arg Gln Lys Ile Leu Lys Gly Phe Asn Glu Met Arg Val

180 185 190

Ile Leu Asp Asn Glu Glu Gln Arg Glu Leu Gln Lys Leu Glu Glu Gly

195 200 205

Glu Val Asn Val Leu Asp Asn Leu Ala Ala Ala Thr Asp Gln Leu Val

210 215 220

Gln Gln Arg Gln Asp Ala Ser Thr Leu Ile Ser Asp Leu Gln Arg Arg

225 230 235 240

Leu Arg Gly Ser Ser Val Glu Met Leu Gln Asp Val Ile Asp Val Met

245 250 255

Lys Arg Ser Glu Ser Trp Thr Leu Lys Lys Pro Lys Ser Val Ser Lys

260 265 270

Lys Leu Lys Ser Val Phe Arg Val Pro Asp Leu Ser Gly Met Leu Gln

275 280 285

Val Leu Lys Glu Leu Thr Asp Val Gln Tyr Tyr Trp Val Asp Val Met

290 295 300

Leu Asn Pro Gly Ser Ala Thr Ser Asn Val Ala Ile Ser Val Asp Gln

305 310 315 320

Arg Gln Val Lys Thr Val Arg Thr Cys Thr Phe Lys Asn Ser Asn Pro

325 330 335

Cys Asp Phe Ser Ala Phe Gly Val Phe Gly Cys Gln Tyr Phe Ser Ser

340 345 350

Gly Lys Tyr Tyr Trp Glu Val Asp Val Ser Gly Lys Ile Ala Trp Ile

355 360 365

Leu Gly Val His Ser Lys Ile Ser Ser Leu Asn Lys Arg Lys Ser Ser

370 375 380

Gly Phe Ala Phe Asp Pro Ser Val Asn Tyr Ser Lys Val Tyr Ser Arg

385 390 395 400

Tyr Arg Pro Gln Tyr Gly Tyr Trp Val Ile Gly Leu Gln Asn Thr Cys

405 410 415

Glu Tyr Asn Ala Phe Glu Asp Ser Ser Ser Ser Asp Pro Lys Val Leu

420 425 430

Thr Leu Phe Met Ala Val Pro Pro Cys Arg Ile Gly Val Phe Leu Asp

435 440 445

Tyr Glu Ala Gly Ile Val Ser Phe Phe Asn Val Thr Asn His Gly Ala

450 455 460

Leu Ile Tyr Lys Phe Ser Gly Cys Arg Phe Ser Arg Pro Ala Tyr Pro

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Pro Trp Asn Cys Leu Val Pro Met Thr Val Cys Pro Pro

485 490 495

Ser Ser

<210> 2

<211> 2888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttgtggag accagccctc tggcttggtg agtgaatctg gtttacaccg gctcctgccc 60

tgccttcact cttctcccct gattcaagac tcctctgctt tggactgaag cactgcagga 120

gtttgtgacc aagaacttca agagtcaaga cagaaggaag ccaagggagc agtgcaatgg 180

atttctcagt aaaggtagac atagagaagg aggtgacctg ccccatctgc ctggagctcc 240

tgacagaacc tctgagccta gattgtggcc acagcttctg ccaagcctgc atcactgcaa 300

agatcaagga gtcagtgatc atctcaagag gggaaagcag ctgtcctgtg tgtcagacca 360

gattccagcc tgggaacctc cgacctaatc ggcatctggc caacatagtt gagagagtca 420

aagaggtcaa gatgagccca caggaggggc agaagagaga tgtctgtgag caccatggaa 480

aaaaactcca gatcttctgt aaggaggatg gaaaagtcat ttgctgggtt tgtgaactgt 540

ctcaggaaca ccaaggtcac caaacattcc gcataaacga ggtggtcaag gaatgtcagg 600

aaaagctgca ggtagccctg cagaggctga taaaggagga tcaagaggct gagaagctgg 660

aagatgacat cagacaagag agaaccgcct ggaagaatta tatccagatc gagagacaga 720

agattctgaa agggttcaat gaaatgagag tcatcttgga caatgaggag cagagagagc 780

tgcaaaagct ggaggaaggt gaggtgaatg tgctggataa cctggcagca gctacagacc 840

agctggtcca gcagaggcag gatgccagca cgctcatctc agatctccag cggaggttga 900

ggggatcgtc agtagagatg ctgcaggatg tgattgacgt catgaaaagg agtgaaagct 960

ggacattgaa gaagccaaaa tctgtttcca agaaactaaa gagtgtattc cgagtaccag 1020

atctgagtgg gatgctgcaa gttcttaaag agctgacaga tgtccagtac tactgggtgg 1080

acgtgatgct gaatccaggc agtgccactt cgaatgttgc tatttctgtg gatcagagac 1140

aagtgaaaac tgtacgcacc tgcacattta agaattcaaa tccatgtgat ttttctgctt 1200

ttggtgtctt cggctgccaa tatttctctt cggggaaata ttactgggaa gtagatgtgt 1260

ctggaaagat tgcctggatc ctgggcgtac acagtaaaat aagtagtctg aataaaagga 1320

agagctctgg gtttgctttt gatccaagtg taaattattc aaaagtttac tccagatata 1380

gacctcaata tggctactgg gttataggat tacagaatac atgtgaatat aatgcttttg 1440

aggactcctc ctcttctgat cccaaggttt tgactctctt tatggctgtg cctccctgtc 1500

gtattggggt tttcctagac tatgaggcag gcattgtctc atttttcaat gtcacaaacc 1560

acggagcact catctacaag ttctctggat gtcgcttttc tcgacctgct tatccgtatt 1620

tcaatccttg gaactgccta gtccccatga ctgtgtgccc accgagctcc tgagtgttct 1680

cattccttta cccacttctg catagtagcc cttgtgctga gactcagatt ctgcacctga 1740

gttcatctct actgagacca tctcttcctt tctttcccct tcttttactt agaatgtctt 1800

tgtattcatt tgctagggct tccatagcaa agcatcatag attgctgatt taaactgtaa 1860

ttgtattgcc gtactgtggg ctggaaatcc caaatctaga ttccagcaga gttggttctt 1920

tctgaggtct gcaaggaagg gctctgttcc atgcctctct ccttggcttg tagaaggcat 1980

cttgtcccta tgactcttca cattgtcttt atgtacatct ctgtgcccaa gttttccctt 2040

tttattaaga caccagtcat actggctcag ggcccaccgc taatgcctta atgaaatcat 2100

tttaacatta tattctctac aaagacctta tttccaaata agataatatt tggaggtatt 2160

gggaataaaa actccaacat ataaatttga ggaaggcacg atttcactca taacaatctt 2220

accctttctt gcaagagatg cttgtacatt attttcctaa taccttggtt tcactagtag 2280

taaacattat tatttttttt atatttgcaa aggaaacata tctaatcctt cctatagaaa 2340

gaacagtatt gctgtaattc cttttctttt cttcctcatt tcctctgccc cttaaaagat 2400

tgaagaaaga gaaacttgtc aactcatatc cacgttatct agcaaagtac ataagaatct 2460

atcactaagt aatgtatcct tcagaatgtg ttggtttacc agtgacaccc catattcatc 2520

acaaaattaa agcaagaagt ccatagtaat ttatttgcta atagtggatt tttaatgctc 2580

agagtttctg aggtcaaatt ttatcttttc acttacaagc tctatgatct taaataattt 2640

acttaatgta ttttggtgta ttttcctcaa attaatattg gtgttcaaga ctatatctaa 2700

ttcctctgat cactttgaga aacaaacttt tattaaatgt aaggcacttt tctatgaatt 2760

ttaaatataa aaataaatat tgttctgatt attactgaaa agatgtcagc catttcaatg 2820

tcttgggaaa caattttttg tttttgttct gttttctttt tgcttcaata aaacaatagc 2880

tggctcta 2888

Claims

1.过表达TRIM22的制剂在制备抑制骨肉瘤肺转移产品上应用，所述TRIM22的序列如SEQ ID No.2所示。