TW201815816A - 新穎ｖｅｇｆ變體及其作爲生物癌症標幟物之用途 - Google Patents

Abstract

本發明之主要目的係在於揭露新穎之VEGF亞型及其用途，其中，該新穎VEGF亞型係能作為腦瘤診斷、分期及評估預後之生物標幟物，因此，藉由檢測樣本中VEGF亞型之表現或其表現量，能夠於體外快速且準確地檢測出腦癌發生、腦癌分期及其預後狀態。

Description

新穎VEGF變體及其作為生物癌症標幟物之用途

本發明係有關於一種生物標幟物及其用途，特別係指一種新穎VEGF變體及其作為生物癌症標幟物之用途。

按，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，下稱VEGF)係為一種特異性之肝素結合醣蛋白，基於選擇性剪切之故，使得VEGF具有許多亞型(isoform)，其中最常見於人類者為VEGF121、VEGF165及VEGF189。各個VEGF亞型具有不同之生化特性，例如對於硫酸乙醯肝素蛋白聚醣與VEGF受體之親和力不同，導致對於血管生成有不同影響。更進一步來說，不同VEGF亞型對於促進發炎及維持通透性係扮演不同角色。舉例來說，當VEGF亞型於肺部高度表現時，尤其是VEGF165及VEGF189，係能恢復免疫細胞具有提供基底肺泡免疫之額外功能。相反地，在某些病理狀態，如腫瘤，VEGF121及VEGF165之高度表現係會使新生血管增加，造成腫瘤生長加速。是以，不同VEGF亞型之表現係與癌症發生及癌症病人預後相關。

再者，先前研究中指出VEGF mRNA編碼區兩側為長度為1038核甘酸之富含GC之50非轉譯區(下稱50UTR)，其包含框架內(in-frame)替代之CUG起始密碼子及兩個內部核糖體進入位(internal ribosome entry sites)，而能夠改變轉錄之起始處。第一個CUG起始密碼子係位於傳統起始 密碼子AUG上游之第539個核甘酸。50UTR中含有一開放閱讀框架(open reading frame，下稱ORF)，起始於VEGF編碼區之一密碼子。該ORF之轉譯會使一被稱為L(large)-VEGF之長VEGF亞型表現。自於VEGF mRNA之長5’UTR中的起始密碼子(5’至3’端CUG)進行核糖體特異性掃描，發現許多不同之高分子量之VEGF亞型，即為L-VEGF。L-VEGF是被180個胺基酸所延伸，並且參與VEGF相關之血管新生過程。L-VEGF被分割為兩個片段，其一為23kDa NH₂特異性片段，另一為大小相近於傳統AUG起始之片段，因而L-VEGF被認為會表現不同以往的切割及蛋白質運輸之模式。

神經膠質瘤係為最常見之腦部腫瘤，大多數惡性之神經膠質瘤係生長於腦神經組織內，有些生長於腦部深處，因而無論於治療上皆有一定風險存在，並且，難以根治。而腦瘤早期幾乎沒有症狀，要等到腫瘤增大到一定程度後才會發生異常症狀。目前臨床上常用診斷方法不外乎X光、超音波、電腦斷層等影像檢查，其中有些情況更需要搭配手術切片檢查；被確診患者則須依據病情而選擇手術、放射線治療、化學療法或其組合進行治療；而接受治療後之患者，若欲追蹤其預後，則亦須藉由如上述影像檢查來進行。換言之，目前臨床上對於腦瘤之診斷、治療及預後評估之方法係仍需要投注大量研究心力以尋求快速、方便及準確之診斷及治療方法。

由上可知，雖然目前文獻中已經發現許多VEGF亞型及其與癌症間之關係，惟，倘若能夠開發出有別於習知技術之VEGF亞型，並且確切了解其與特定癌症間之關係，將能有利於生物醫藥及臨床診斷之用。

本發明之主要目的係在於揭露新穎之VEGF亞型，其包含有Large-VEGF 144(下稱L-VEGF 144)及Large-VEGF 138(下稱L-VEGF 138)，其中，L-VEGF 144之胺基酸序列係如SEQ ID No.2所示，L-VEGF 138之胺基酸序列係如SEQ ID No.4所示。更進一步來說，L-VEGF 144係由核苷酸編碼為SEQ ID No.1之序列轉譯而成者；L-VEGF 138係由核苷酸編碼為SEQ ID No.1之序列轉譯而成者。

本發明之另一目的係在於提供L-VEGF 144及L-VEGF 138之用途，其係能於來自於如膠狀神經瘤之腦癌患者所提供之細胞或組織內表現，因此能夠作為腦癌之生物標幟物，用以診斷腦癌發生、於體外評估腦癌分期或預測腦癌預後。

本發明之次一目的係在於提供用以檢測L-VEGF 144及/或L-VEGF 138表現之專一性引子，其中，用以檢測L-VEGF 144之專一性引子對係編碼為SEQ ID No.7及SEQ ID No.8之序列，或是編碼為SEQ ID No.9及SEQ ID No.8之序列；用以檢測L-VEGF 138之專一性引子對係由編碼為SEQ ID No.9及SEQ ID No.10之序列所組成者。

藉由本發明所設計之專一性引子對，應用於本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知之蛋白質檢測技術，可用以達到快速且專一檢測之功效。

本發明之次一目的係在於揭露L-VEGF 144及L-VEGF 138之用途，其係具有主動進入細胞核仁之能力，並且，能夠於細胞核仁聚集，因而能夠作為將細胞核外物質送入細胞核內之載體。

於本發明之一實施例中係揭露檢測腦瘤之方法，其包含下列 步驟：

步驟a：取一待測樣品。

步驟b：檢測該待測樣品中是否表現L-VEGF 144及/或L-VEGF 138，當該待測樣品中表現L-VEGF 144及/或L-VEGF 138時，表示該待測樣品提供者係為罹患腦瘤之高風險族群。

較佳地，步驟b係以專一性引子對搭配PCR技術分析該待測樣品中L-VEGF 144或L-VEGF 138之表現。

本發明之另一實施例係揭露進行腦癌分期之方法，其包含下列步驟：步驟a：取一待測樣品；步驟b：檢測該待測樣品中是否表現L-VEGF 144，當該待測樣品中表現L-VEGF 144時，表示該待測樣品提供者係為罹患腦瘤第四期。

較佳地，步驟b係以專一性引子對搭配PCR技術分析該待測樣品中L-VEGF 144或L-VEGF 138之表現。

本發明之一實施例中係揭露評估腦癌預後之方法，其包含下列步驟：步驟a：取一待測樣品；步驟b：檢測該待測樣品中是否表現L-VEGF 144，當該待測樣品中表現L-VEGF 144時，表示該待測樣品提供者之預後不佳。

較佳地，步驟b係以專一性引子對搭配PCR技術分析該待測樣品中L-VEGF 144或L-VEGF 138之表現。

本發明之又一實施例係提供一種醫藥組合物，其係包含有至 少一蛋白質及一有效成份，其中，該蛋白質之胺基酸序列編碼係為SEQ ID No.2或SEQ ID No.4，並且，該有效成份係選自由化合物、蛋白質及核酸分子所組成之群而構築於該蛋白質上。由於該蛋白質係具有進入細胞核仁之能力，因此，可使該醫藥組合物進入細胞核內，使該有效成份於細胞核內發揮作用。

本發明之一實施例係提供一種檢測套組，其係包含一引子對，其係為編碼為SEQ ID No.7及SEQ ID No.8之序列、SEQ ID No.9及SEQ ID No.8之序列或SEQ ID No.9及SEQ ID No.10之序列。而該套組係可直接以PCR技術進行檢測，亦可搭配一基材，製備成一生物晶片。

第一圖A係為人類VEGF基因組之示意圖。

第一圖B係為習知VEGF變體示意圖。

第一圖C係為本發明所揭新穎VEGF變體示意圖。

第二圖係為各VEGF變體進行RT-PCR之結果。

第三圖係為本發明所揭新穎VEGF變體之胺基酸序列。

第四圖係為細胞試驗之結果，其中，綠色係為綠色螢光蛋白之 表現；紅色係為肌動蛋白之染色結果；藍色係為細胞核之染色結果。

第五圖係顯示帶有綠色螢光蛋白之L-VGEF144進入細胞核之染色結果。

請參第一圖A及B，人類VEGF基因體DNA(NCBI Reference Sequence：NG_008732.1)中最常見之變體係由8個外顯子之剪切變化而形成，包含有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189及VEGF206。

請再參閱第一圖B，相較於過去文獻中所揭露之VEGF變體，本發明係揭露新穎之VEGF變體，分別名為L-VEGF 144及L-VEGF 138，其中：

L-VEGF 144之胺基酸序列係為SEQ ID No.1所示，其命名係代表理論上於切除信號肽後能編碼為一段長為143個胺基酸及中止密碼子所組成之人類VEGF分子(如SEQ ID No.2所示)。L-VEGF 144之mRNA係由一部分之外顯子1(編碼為34個胺基酸)、外顯子6a(編碼為24個胺基酸)、外顯子7及8(編碼為50個胺基酸)所組成，並且，缺少N端片段(外顯子1-5)。再者，由於L-VEGF 144之起始密碼子係位於非AUG(CUG)轉譯起始位點，因而能產生一額外之亞型，並且，其特徵在於有一大小為108bp之插入，精準地位於外顯子5及6間，其中，該108bp之插入係保留第5內含子末段核苷酸，因而不會於後續之閱讀框中產生框移突變(frameshift mutation)，並維持正確之外顯子6a、外顯子7及外顯子8。該108bp之插入係能夠編碼為36個殘基之插入(36-residue insert)，且僅被發現於於U87 MG細胞株(下稱U87細胞株)及多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme，下稱GBM)活組織檢體中。

L-VEGF 138係為L-VEGF 144之移框突變，其核苷酸序列係如SEQ ID No.3所示。相較於L-VEGF 144，L-VEGF 138係缺少18個鹼基，亦即缺少6個胺基酸，換言之，L-VEGF 138係能轉譯為含有137個胺基酸及 一個中止密碼子之蛋白質，其序列如SEQ ID No.4所示。

所謂U87細胞株係為本發明所屬技術領域之通常知識者所用於研究人類神經膠質瘤之細胞株，並且，該細胞株具有自我更生之能力。

所謂輸核蛋白係指蛋白質或胜肽不需仰賴其他分子即可進行有主動進入細胞核或核仁。

所謂醫藥組合物

由上可知，本發明所揭L-VEGF 144確實為一新穎VEGF變體。

以下，將茲舉若干實例搭配圖式更進一步說明如后，其中，本發明所揭實例之流程係經由臺中榮民總醫院倫理委員會同意，並且腫瘤分級係依據美國聯合委員會之癌症標準，而提供樣本之患者皆未接受術前放射治療或化學治療。

於本發明實例中所使用之U87細胞株係購買臺灣生資中心(Bioresource Collection and Research Center)，其培養於DMEM培養基(GIBCO,Rockville,MD,USA)中，該培基中包含有10%胎牛血清、1%盤尼西林-鏈黴素，培養於37℃、濕度95%及5%二氧化碳之環境下。

實例一：RT-PCR分析

RT-PCR之流程係參照先前文獻(Chiao et al.)。簡言之，以Trizol試劑(Invitrogen,CA,USA)取2mg之總RNA萃取物，進行反轉錄，藉由MMLV轉錄酶(Promega Corporation)進行PCR。獲得之VEGF cDNA係被用於作為版模，以進行35次之PCR擴增反應，其中，總RNA係萃取自U87細胞株或是GBM活檢體組織，該組織係來自於第二期、第三期及第四期之 患者；PCR反應條件為1分鐘、94℃，30秒、60℃及1分鐘、72℃。而PCR中所使用之引子對係如下表一所示，其中，P1-F及P1-R係為先前文獻所揭露之引子對，其餘引子係為本發明所設計之引子，而P1-F及P1-R係組成P1引子對；V1-F及V1-R係組成P2引子對；V2-F及V1-R係組成P3引子對；V2-F及V2-R係組成P4引子對。

實例二：獲得新穎VEGF變體

參照實例一之步驟，取第二期至第四期之GBM患者檢體及U87細胞進行RT-PCR，結果如第二圖所示。

由引子對P1進行RT-PCR係得到VEGF121、VEGF165、VEGF189及VEGF206之產物，大小依序分別為434個鹼基對、566個鹼基對、638個鹼基對及689個鹼基對，雖然其中以VEGF206於第四期GBM患者檢體中表現量最高，惟，以P1引子對進行RT-PCR之結果顯示出與許多無預期之DNA片段具有非專一性結合，且該等無預期之DNA片段多無法由DNA定序所辨識，換言之，由樣品中檢測習知VEGF亞型之表現係無法判斷腦癌之有無或是評估腦癌之分期或預後。

由藉由本發明所設計之專一性引子對P2進行RT-PCR，顯示於第四期GBM患者檢體及U87細胞株中有一大小約為520bp之單一DNA片 段被表現(如圖中lane 1及6所示)。以DNA自動定序儀定序該DNA片段可知其核苷酸序列為SEQ ID No.1，經比對後可知該DNA片段係有異於習知所揭VEGF變體，應為新穎之VEGF變體。該DNA片段能夠被轉譯為144個胺基酸(SEQ ID No.2)，因此，將該DNA片段命名為L-VEGF144。

又以本發明所設計之P3引子對進行RT-PCR，能夠於樣本中檢測出L-VEGF 144專一且特異性之表現，顯示P3引子對係能夠作為檢測L-VEGF 144之表現之專一性引子對。

再以經設計之專一性P4引子對進行RT-PCR，發現於各期GBM患者檢體及U87細胞株中皆有表現一大小為174個鹼基對之另一新穎VEGF變體，經定序分析後將之命名為L-VEGF 138。

實例三：定序分析

藉由DNA自動定序儀依據本發明所周知之標準程序分析實例二中所得PCR產物，結果如第三圖所示，可知：

L-VEGF144包含有一部分之外顯子1(111個核苷酸)，一長度為118bp之第五內含子片段，插於該外顯子1與外顯子6a間，一外顯子7及一外顯子8，而該插入序列(外顯子1至第5內含子)之末端鹼基非為AG。

L-VEGF 138之核苷酸序列係為SEQ ID No.3，能轉譯為含有138個胺基酸之蛋白質(SEQ ID No.4)。相較於L-VEGF144，L-VEGF 138係缺少外顯子6a上之18個鹼基，因而所轉譯出之蛋白質係缺少6個胺基酸。

實例四：L-VEGF144可作為檢測神經膠質瘤之生物標幟物

為能更準確、專一且重複地於檢體中檢測出L-VEGF144，採用V1-R及V2-F作為P3引子對，其中V2-F正向引子係外顯子1最後兩個鹼 基及第5內含子互補，使得P3引子對對於L-VEGF144具有敏感性及專一性。如第二圖所示，以該P3引子對進行RT-PCR所得之產物大小約為385bp，並且，該PCR產物係分別出現於U87細胞及第四期之GBM組織中。

由此結果顯示，本發明所揭L-VEGF144係能特異性地於神經膠質瘤中表現，而能作為判斷神經膠質瘤之生物標幟物，並且，基於L-VEGF144係能獨特地表現於第四期GBM患者所提供之樣本中，可合理推論L-VEGF144除能作為判斷神經膠質瘤有無之生物標幟物外，其更能作為臨床上評估預後或作為癌症分期之生物標幟物。

實例五：L-VEGF144/138具有進入細胞核之能力

將全長L-VEGF144及L-VEGF138之N端分別構築綠色螢光蛋白後，再分別克隆至質體pEGFP-C1(Clontech)之Bgl II/Xba I位點，而形成pEGFP-L-VEGF144、pEGFP-L-VEGF138。而pEGFP-C1質體係帶有綠色螢光蛋白之序列。

將1μg之pEGFP-L-VEGF144、pEGFP-L-VEGF138及pEGFPC1分別以jetPEI(Polyplus-transfection,101-10)轉染至U87細胞，並且分別培養16小時。檢測各細胞之結果係如第四圖及第五圖所示，其中，圖中綠色係為綠色螢光蛋白，紅色為核纖維素(核仁標記)，藍色為核仁。

由第四圖之結果可知pEGFP-C1質體係分散於細胞中，而pEGFP-L-VEGF144、pEGFP-L-VEGF138係能定位於核仁中並表現綠色螢光，顯示L-VEGF144及L-VEGF138具有輸入細胞核之能力。

請再參閱第五圖，藉由綠色螢光蛋白及核纖維素之雙重染色，可清楚得知L-VEGF144確實能夠定位於核仁，並且於核仁處聚集。

藉由上述實例之結果可清楚證實本發明所揭L-VEGF144及L-VEGF138係為新穎之VEGF之變體，並且，L-VEGF144及L-VEGF138係具有主動進入細胞核之能力，其中，L-VEGF144更能於細胞核仁處聚集，而能作為未來臨床上藥物開發之載體。此外，L-VEGF144及L-VEGF138係皆能於神經膠質瘤之細胞中表現，因而能作為判斷或評估神經膠質瘤發生之生物標幟物，並且，L-VEGF144係能夠特異地表現於第四期神經膠質瘤之細胞中，是以，藉由設計L-VEGF144及L-VEGF138之專一性引子對係能有效且準確地偵測樣品提供者是否罹患神經膠質瘤，亦能進一步作為臨床上分期或是預測預後之生物標幟物。

【參考文獻】

Chiao MT, Yang YC, Cheng WY, Shen CC, Ko JL. CD133+ glioblastoma stem-like cells induce vascular mimicry in vivo. Curr Neurovasc Res. 2011;8(3):210-9.

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (17)

1. 一種新穎VEGF亞型，其胺基酸序列係選自由編碼為SEQ ID No.2及SEQ ID No.4所組成之群。
2. 依據申請專利範圍第1項所述新穎VEGF亞型，其中，VEGF亞型之胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2時，其係由編碼為SEQ ID No.1之核苷酸序列轉譯而成者。
3. 依據申請專利範圍第1項所述新穎VEGF亞型，其中，VEGF亞型之胺基酸序列編碼為SEQ ID No.4時，其係由編碼為SEQ ID No.3之核苷酸序列轉譯而成者。
4. 一種腦癌之生物標幟物，其胺基酸序列係選自由編碼為SEQ ID No.2及SEQ ID No.4所組成之群。
5. 一種腦癌之生物標幟物，其核苷酸序列係選自由編碼為SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所組成之群。
6. 一種輸核蛋白，其胺基酸序列係選自由編碼為SEQ ID No.2及SEQ ID No.4所組成之群。
7. 一種檢測腦瘤之方法，其包含下列步驟：步驟a：取一待測樣品；步驟b：檢測該待測樣品中是否表現下列至少一蛋白質，其胺基酸序列編碼係選自由SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所組成之群，當該待測樣品中表現該蛋白質時，表示該待測樣品提供者係為罹患腦瘤之高風險族群。
8. 依據申請專利範圍第7項所述檢測腦瘤之方法，其中，步驟b係以 PCR技術分析蛋白質表現。
9. 依據申請專利範圍第8項所述檢測腦瘤之方法，其中，當該蛋白質之胺基酸序列為SEQ ID No.2時，並且，所使用之正向引子之序列選自由SEQ ID No.7及SEQ ID No.9所組成之群，而反向引子之序列為SEQ ID No.8。
10. 依據申請專利範圍第8項所述檢測腦瘤之方法，其中，當該蛋白質之胺基酸序列為SEQ ID No.4時，所使用之引子對之序列係為SEQ ID No.9及SEQ ID No.10。
11. 一種進行腦癌分期之方法，其包含下列步驟：步驟a：取一待測樣品；步驟b：檢測該待測樣品中是否表現胺基酸序列編碼係選自由SEQ ID No.2之蛋白質，當該待測樣品中表現該蛋白質時，表示該待測樣品提供者係為罹患腦瘤晚期。
12. 依據申請專利範圍第11項所述方法，其中，步驟b係以PCR技術分析蛋白質表現，並且，所使用之正向引子之序列選自由SEQ ID No.7及SEQ ID No.9所組成之群，而反向引子之序列為SEQ ID No.8。
13. 一種評估腦癌預後之方法，其包含下列步驟：步驟a：取一待測樣品；步驟b：檢測該待測樣品中是否表現胺基酸序列編碼係選自由SEQ ID No.2之蛋白質，當該待測樣品中表現該蛋白質時，表示該待測樣品提供者之預後不佳。
14. 依據申請專利範圍第13項所述方法，其中，步驟b係以PCR技術分 析蛋白質表現，並且，所使用之正向引子之序列選自由SEQ ID No.7及SEQ ID No.9所組成之群，而反向引子之序列為SEQ ID No.8。
15. 一種醫藥組合物，其係包含有至少一蛋白質及一有效成份，其中，該蛋白質之胺基酸序列編碼係選自由SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所組成之群，並且，該有效成份係選自由化合物、蛋白質及核酸分子所組成之群而構築於該蛋白質上。
16. 一種檢測L-VEFG 144之套組，其係包含有一引子對，其中，正向引子之序列選自由SEQ ID No.7及SEQ ID No.9所組成之群，而反向引子之序列為SEQ ID No.8。
17. 一種檢測L-VEFG 138之套組，其係包含有由編碼為SEQ ID No.9及SEQ ID No.10之序列所組成之一引子對。