CN110592225A

CN110592225A - 一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用

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Publication number: CN110592225A
Application number: CN201911071081.3A
Authority: CN
Inventors: 庄婷; 朱建; 王仲浩
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN110592225B

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用。本发明运用RT‑PCR、q‑PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，成功构建了靶向RNF187基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰RNF187基因后对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响，首次发现了RNF187基因表达与三阴性乳腺癌细胞系迁移能力有关，三阴性乳腺癌细胞迁移能力在一定程度上可反映三阴性乳腺癌患者发生转移的可能性大小，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

Description

一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤之一，也是第六大中国女性癌症死亡原因，中国女性乳腺癌危险因素有一部分与西方国家一致，包括：年龄大于55岁、乳房密度高、月经初潮早、绝经晚、生育晚、肥胖、有家族史等。

三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型更差。多项研究表明，三阴性乳腺癌多发生于绝经前的年轻女性，尤其是非洲裔美国妇女，但是目前对其发病机制的研究尚不明确。

Ring figure domain 187(RNF187或RACO1)是一种环状结构域E3，最近被证实在HCC中过表达，并通过诱导细胞EMT促进HCC的进展。此外，还发现RNF187干扰通过下调生长相关AP-1靶基因的转录抑制细胞增殖，包括cyclin D1和RNF187表达升高可通过Wnt和Ras信号在结肠上皮肿瘤中增强肿瘤形成。重要的是，RNF187通过酵母2-杂交筛选将Ras信号连接到AP-1的激活，被鉴定为JunD的一个现在的共激活因子。鉴于已知的Wnt和Ras信号的致癌作用，RNF187可能在致癌过程中发挥重要的驱动作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用。本发明的目的是提供一种用于检测三阴性乳腺癌迁移和侵袭能力的试剂盒，满足检测三阴性乳腺癌的使用需求。

本发明是这样实现的，一种三阴性乳腺癌分子标志物，所述分子标志物包括RNF187基因和/或RNF187基因的表达产物。

进一步地，所述RNF187基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或与SEQIDNO.1限定的DNA序列编码相同功能蛋白质的DNA序列。

进一步地，所述RNF187基因的表达产物包括RNF187 mRNA和/或RNF187蛋白。

进一步地，所述RNF187蛋白包括RNF187蛋白和/或RNF187蛋白的功能等同物。

进一步地，所述RNF187蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；或将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

如上所述的三阴性乳腺癌分子标志物在制备三阴性乳腺癌检测相关试剂盒或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括特异扩增RNF187基因的引物，所述特异扩增RNF187基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒还包括36B4上游引物5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’36B4下游引物5’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-3’。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括RNF187蛋白的免疫检测产品，所述RNF187蛋白的免疫检测产品包括与RNF187蛋白特异性结合的抗体。

进一步地，所述治疗三阴性乳腺癌的药物包括RNF187基因和/或其表达产物的促进剂。

进一步地，本发明中所述的用于检测三阴性乳腺癌迁移能力的试剂盒的检测方法：提取样本的RNA，使用引物试剂、RT-PCR体系试剂及q-PCR体系试剂进行实时定量PCR反应，并以RNF187基因样本为对照，对实时定量PCR结果进行分析即可。所述RNF187蛋白的免疫检测产品包括与RNF187蛋白特异性结合的抗体。可以通过RNF187蛋白的特异性抗体检测出RNF187蛋白的表达量。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请中通过迁移和侵袭实验发现，将RNF187沉默后三阴性乳腺癌细胞系的迁移和侵袭能力明显增强。研究三阴性乳腺癌发生、发展以及转移过程的分子机制，可为三阴性乳腺癌患者的治疗提供新的思路。因此RNF187可作为一种检测三阴性乳腺癌迁移和侵袭能力的一种分子标志物。

与现有技术相比，本发明运用RT-PCR、q-PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，成功构建了靶向RNF187基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰RNF187基因后对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响，首次发现了RNF187基因表达与三阴性乳腺癌细胞系迁移能力有关，三阴性乳腺癌细胞迁移能力在一定程度上可反映三阴性乳腺癌患者发生转移的可能性大小，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

附图说明

图1是本发明实施例1中检测干扰siRNA在蛋白水平上对RNF187的沉默效果；

图2是本发明实施例2中检测干扰siRNA在mRNA水平上对RNF187的沉默效果；

图3是本发明实施例3中利用划痕实验检测不同组三阴性乳腺癌细胞系迁移能力的影响结果图；

图4是本发明实施例4中利用Transwell小室模型实验检测不同组三阴性乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的影响结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用。本发明中所涉及的RNF187基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列，RNF187蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；三阴性乳腺癌细胞系为MDA-MB231细胞株，购于ATCC；RNF187抗体购自sigma；细胞蛋白的提取按配制好的1xloading buffer进行，Western blot方法检测蛋白表达；实时定量PCR方法参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，测浓度后，按TaKaRa公司PrimeScriptRT Master Mix试剂盒进行反转录，按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因表达(36B4为内参)；RNF187-siRNA直接由sigma公司购买，具体序列如下：

siRNF187#1:

SASI-Hs02-00385907 GUGAUGGACCGUAGGAAGAdTdT

SASI-Hs02-00385907-AS UCUUCCUACGGUCCAUCACdTdT

siRNF187#2:

SASI-Hs02-000385909 CACUGAGCGGUUCAGGUCAdTdT

SASI-Hs02-005909-AS UGACCUGAACCGCUCAGUGdTdT

转染方法按Invitrogen公司Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂说明书进行，q-PCR及Western blot方法检测表达及干扰效果；细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Cosar公司，事先进行饥饿培养；细胞划痕实验所使用12孔板购自Cosar公司。

实施例1细胞培养、转染及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞株中RNF187蛋白的干扰效果

细胞复苏：从-80℃冰箱取出MDA-MB231细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在最短时间内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至事先准备好的5mLEP管(已事先加入1mL DMEM+10％FBS)中，900rpm离心3min。弃去上清，用1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入培养瓶中，将重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO₂培养箱中培养，次日更换一次培养基，继续培养，待细胞密度80％-90％左右时，开始传代。

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RNF187#1和si RNF187#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RNF187#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2ul Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RNF187#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

Western Blot

(1)总蛋白的提取：将转染过24h的12孔板的细胞中旧培养基弃去，加入1xloadingbuffer 100uL，有减过的200ul枪头将1x loading buffer与细胞充分混匀，注意每个孔力度相同，将混合液移至标记好的1.5mL离心管中，100℃金属浴中煮10min，-80℃保存备用。(2)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量大小配制10％的聚丙烯酰胺凝胶。将用于配胶的1.5mm玻璃板洗干净并晾干后对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，按说明书准备配胶试剂，先加分离胶，先快后慢，避免产生气泡，加至距上端1.5cm处时加无水乙醇密封，静置20分钟后弃去无水乙醇，用离子水清洗3次后加浓缩胶至顶端，插入梳子，注意不能有气泡产生，静置10分钟左右，可进行上样。(3)上样电泳：将制备好的样本按照一定顺序，每孔加20ul，每一组实验样本周边以预染的蛋白质Marker隔开，起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶以后，电压改为120v，约1.5h,当小分子蛋白拉开距离以后，停止电泳。(4)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醛中激活1min左右，再把PVDF膜覆盖于电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，至于电转槽中，恒流300mA，90min。(5)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配的封闭液(含5％的脱脂牛奶的1×TBST)中，摇床上4℃过夜或室温2h。(6)封一抗：封闭结束后，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的一抗(抗RNF187抗体稀释5000倍，抗GAPDH抗体稀释5000倍，各稀释2mL放离心管中)，在相应蛋白所在位置剪开，在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应一抗，摇床上4℃过夜或室温2h。(7)洗膜，孵二抗，洗二抗：取出PVDF膜，1×TBST摇床上洗3次，每次15min，将洗好的膜分别放在封抗体盒子中，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的二抗(二抗稀释5000倍，稀释2mL放离心管中)在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应二抗，摇床上室温1h，摇床上用1×TBST洗3次，每次10min。(8)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液A、B液等比例混合(使用前配制)，将洗好的膜用吸水纸吸干多余的1×TBST，将膜的正面向上放置在发光板上，均匀的滴加显影液，凝胶成像系统拍照、保存。

结果如图1所示，结果显示，Western Blot检测细胞株中干扰后的RNF187蛋白表达水平较对照组明显减低。

实施例2通过实时定量PCR检测细胞株中RNF187的mRNA干扰效果

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RNF187#1和si RNF187#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RNF187#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司),在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RNF187#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

总RNA的提取：收集细胞后，参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，在该操作过程中需遵循无RNA酶操作，佩戴无菌手套和口罩。具体步骤如下：

1)需要用RL裂解液(已加入β-巯基乙醇)裂解细胞，并提前配置好70％乙醇，分开标记RL裂解液及70％乙醇以免混淆。2)每个孔需要加入350μL配制好的RL细胞裂解液，用枪头的底部按照顺时针及逆时针方向轻轻划动，以充分裂解细胞，随即把裂解的溶液沿着侧壁缓慢滴到CS过滤柱上，并标记清楚，放入离心机中快速离心并收取滤液(2min，4℃，12000rpm)。3)在滤液中缓慢加入70％乙醇，每孔约350μL，轻柔的混匀，混匀后的溶液转移到CR3吸附柱里，并放在对应的收集管中，再次离心(90s，4℃，12000rpm)并弃掉滤液，吸附柱重新放入收集管中。4)沿着侧壁每个吸附柱中加入去蛋白液RW1 350μL，调整离心机转速12000rpm，温度为4℃，离心60s，弃掉滤液，吸附柱放到收集管中。5)每个柱子中间悬空滴下DNaseⅠ工作液80μL，注意不要滴到侧壁，室温下静置15min。6)每个柱子沿着侧壁缓慢加入去蛋白液RW1 350μL，4℃高速离心机，12000rpm离心60s，弃滤液，吸附柱重新放回收集管。7)加入RW漂洗液500μL，静置2min，离心并丢弃滤液(90s，4℃，12000rpm)，吸附柱放回到收集管中，重复该步骤1次，4℃高速离心机，12000rpm，离心2min，吸去滤液，打开吸附柱的盖子，静置大约4min，以便彻底清除吸附柱上的乙醇残留。8)把晾干的吸附柱放到标好的RNase-Free 1.5mLEP管中，于每个柱子中心滴加30μL去离子水，室温放置2min后离心以便收取滤液(2min，4℃，12000rpm)，重复该步骤1次，以更多的获得RNA溶液。

紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/u)和纯度，用DEPC水调零，OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明提取的RNA纯度好。

逆转录为CDA(reverse transcriptas，rt):反应体系为:按TaKaRa公司PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行反转录：5*PrimeScript RT Master MIX：2μL，所提总RNA：1μg；加ddH2O至总体积为10μL，置于PCR仪中进行逆转录，反应体系为37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存备用。

实时定量PCR方法按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因的表达(36B4为内参)的反应体系为：17μL SYBR，14μL去RNA酶水，1μL Forwardprimer(5’-AGGACTTGAATGACGCCCG-3’，SEQ ID NO.3)，1μL Reverse primer(5’-tccatcacgtgtcccttcca-3’，SEQ ID NO.4)，1μL cDNA。反应程序为Holding Stage：50℃2min，95℃10min，Cycling Stage：95℃，15s，50℃，1min，Number of Cycles:40。计算CT值，结果以柱状图呈现。

结果如图2所示，结果显示，q-PCR检测细胞株中干扰后的RNF187 mRNA表达水平较对照组明显减低。

实施例3利用划痕实验检测转染后三阴性乳腺癌细胞系迁移能力的影响

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RNF187#1和si RNF187#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RNF187#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RNF187#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

划痕实验：12孔板转染后的细胞株待密度达100％时，用无血清DMEM培养基饥饿12h；小号枪头在12孔板各实验孔内划十字痕迹，创造人为伤口，以PBS洗去刮下细胞，洗3次，加1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)，显微镜下拍照，记录划痕宽度。继续培养24、48、72h，显微镜下拍照(每次拍照前换新鲜1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)),记录划痕宽度，计算细胞迁移距离。

结果如图3所示，结果RNF187基因干扰后，MDA-MB231细胞系的迁移能力显著上升，较对照组明显增高。

实施例4 Transwel小室观察转染前后细胞迁移和侵袭能力的改变

取脂质体转染后的实验组细胞、阴性对照组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数后用无血清DMEM培养基重悬，调整细胞密度为5×105/mL。在上室加入200μL细胞悬液，细胞数为1×105个，下室为含20％胎牛血清的DMEM培养液500L，37℃、5％CO₂培养箱中孵育18h。孵育结束后，取出小室，用PBS洗两遍，棉签轻轻擦拭上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。将小室滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，每孔加入500μL结晶紫染液，染色20min，吸弃染色液，PBS洗三遍，将上室取出，用树脂胶封片，于倒置显微镜下拍照并计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野(共15个视野)，计算平均值。

Transwell侵袭实验与迁移实验不同的是：Transwell小室上室表面需要提前均匀铺上用无血清培养基：Matrigel胶＝8:1稀释过的Matrigel胶，于37℃细胞培养箱2-3小时使胶体凝固，模拟血管基底膜。

结果如图4所示，RNF187基因干扰后，MDA-MB231细胞系的侵袭能力显著上升，较对照组明显增强，差异有统计学意义(P<0.01)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种三阴性乳腺癌分子标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8807

<212> DNA

<213> RNF187(RNF187)

<400> 1

gttggcgtct tcgtcctgtt gctggtctcc gtccggtcgc cggccgtcta ggtctccggc 60

cctccccagc cgctcctgcg cccttgccgg ccccgccgcc cgcagccctg gcgctccctg 120

cgggccccgc cgaggccgcc tgcgccctgt gccagcgcgc gccccgggaa ccggtgcgcg 180

ccgactgcgg ccaccgcttc tgtcgggcgt gcgtggtgcg cttctgggcc gaggaggacg 240

ggcccttccc gtgccccgag tgcgccgacg actgctggca gcgcgccgtg gagcccggca 300

ggcccccgct cagccgccgc cttctggcgc tcgaggaggc ggccgcggcg cccgcgcgcg 360

acggcccggc cagcgaggcc gcgctgcagc tgctgtgccg cgccgacgcc ggcccgctct 420

gcgccgcctg ccgtatggct gcgggccccg agccgcccga gtgggaaccg cgctggagga 480

aggcgctgcg cggcaaggtg cgcgccgcgg ggtcccgtgc cccaccccgg acggtgccct 540

gcgcctctcc gcccccgccc cggtccccct gagccctggg cccttcccgt ctccactgtt 600

cctgtccccg gattgtcccc gtccccggat tgtccccctc ccctcaccgc cacgggtccc 660

ctctccagcg tgtgctgggc ccctccctcc tgcggcttgc ctccccatat ttcctgcgtc 720

tcttcggagt ctggtcccct tccccgtctt ggtgtcccct gctgggcggt gccttatctc 780

cccaccccct accttctacg aagtccttcc cccaccagcg cccatctttg tggtcccatc 840

actagctgtg ccctgtctcg ccctcataga ccccctctag ttcctacaga ttgactcctc 900

cactcactct tcccttgggg gagacatcac gcctcttgcc cctctgtatt ccactgtgtc 960

cacaggcctg gcccaccttc tcgtctgctc cccgggccac ccagccctcg cctgcacccc 1020

ctgtcccctc tcccatcttt cagaaacccg ctctgagagt ctggcagcag cgggtccggg 1080

agtctggagc cttgcccatg gcgggttggt tgtgggacac agaataggag acaacagcca 1140

gcctggggtc ctgctcttca atacagggga ggggaagcca gccagactgt gtccctgggt 1200

gctcctcctg cattgggggt cctgccaccg ggcagagcga cccccatccg gctcaggcag 1260

ggcagggtgt agggcaggct gtgcagacct ttggtacagg ccgaactcac actgaacagg 1320

gccacttaca gacacagaac tcctaaaccc acctagacag tccccttagc cccagcaccc 1380

agatccttct gaataggtgt gaagcccaag aaaccttttg actgcctgtg cgttcctgcc 1440

ctagacaacc gggcttcgag gttatctctg ggatggtcag actgtgtgca gtcagctggg 1500

gtgatgtccc tcagtactgg gctgggttgg gggacccaga gcttctgccc acccctggtg 1560

accttctttt ctttacagga gaacaagggg tctgtggaaa tcatgagaaa ggacttgaat 1620

gacgcccggg acctgcatgg ccaggcagag tcagcagctg cagtgtggaa ggcaagtggg 1680

gggacctggg gcagcctgga atgaggggac tgtgggctca gggctctaga caaagggacc 1740

accaggccaa gtgggccagg cctctgaact gctcagctgg ttggttggag gaggggcctc 1800

tggacttaag tgagcttcag ggtatttttt ttaggatgtg tttgtatttc tcaaatagaa 1860

tctagccaaa gccagtggaa gcctcttttt ctcctcacat tttacctgta ggtgatggca 1920

gcatcagact tctttttttt ttcccaagag acagagtctc acttcattac ccaggctgaa 1980

gtgcaatggc atgattgtag ctcactgcag ctcgaactgg cctcaggcga tcctcccacc 2040

tcagcctctg ggactatagg cacgtgctac cacacctggt taattttaaa atgcttttct 2100

agaggtgggg gtcttgctgt gttgcccagg ctggtctcaa actcctgacc ttaagcggtt 2160

ctcccgcctt ggcctcccaa agtgctattt tttttttctt ttttagaaca catctgtaat 2220

tttctgtggt cctcttgttc tgatctgaga gttgctcatt attttttaga ggctagaagt 2280

ccaagatgaa ggaactggca gattccctgt ctggtgaggg cgtttcctgg ttcatagatg 2340

gtgtcttctc actgtgtcct cacatggtgg aagaagtgag ggtgtctctg gggcctttgt 2400

gtaaggacac tgattccgtt cttgagagtt ccaccctcac aacctcatca cctcccaagg 2460

gtcctgcctc ctaacgccat cacctgaggg atgaggattt cagcatgggg atttggggag 2520

gacacagaca ttcagaccag agcagcgtta ctttccttgg gtgccttcca cagtattata 2580

tcccaagggg acatcccata gattctttta ggttactcac cagtaaagct ctttagtcgt 2640

ttaaactcta tttggtgact ttttcctcgt gtagtaaaaa cctgtgtgcc attttctctg 2700

cgtttcataa attcctatct ccttctttta acctgaaaga cagagtgctt ttcacaggtg 2760

cagcagctct tgggtaactg gctgcatctc gaggctgagg cccacgtttt taccccagct 2820

tgaggctgag gtgggctctg tgctcctggt gctgccaagc ccttgcctgc tatccacagg 2880

cctgaggtgc aggcctccct cagacagtga cgggttacac atggggtccc tgatgccact 2940

cagacccctg gcactccaca ctgcccttgg ggctgctctg aacttctcct tgccttgtga 3000

gtggtcaaca ctgcccagtg caagtgaggc tggaaggctt tggggacctc caagttttca 3060

gtaaccctgt gttaccccaa gggaattgtt ttgcccacag attttagcag gttggagctt 3120

tcaatctgtc ctgttttggg ggtttgtggc ttagatgctg ggatgagaga agccacctaa 3180

atccaaagga aggagtttgc agcgtgttgc atcagccagc cagcagacac ccagctgtca 3240

tttgcattct cagcaacaaa agccttggcc cctcatgact atgggtgtca cctgccctgt 3300

gtggcccagg gccaggtgga agccatccat gactgagtaa aatcagagta gcatcctgct 3360

ctgctctcct gtttgcaagg ttaggagttg gctgaaaacc agctgaagag tggcaagtgt 3420

gaatgctgtt tgttgaaggc tgatgggatg gttttcagcc attggagttc tggtgtgggc 3480

acagcaggga cagttgctgg caagatgggt gtgtgtcctg ccctgacagt cacgtgcctg 3540

acaggctcta gacctagcag ggccactcaa ggatttactg tccccttggc catgggagat 3600

gggagaggga cagtcttcct gtgcagctga gcactgcagt gtaggggaga aagaactcta 3660

tttctcccct tttagggccc caggctgggc gggagaatta aactgacata agctaaacta 3720

acagggtcag gtgcagtggt tcatgcctgt aatcccagca acttgggagg ctgaggtgta 3780

ggaggattgc ttgaggctag gagttcgaga ccagcctggg taacatagtg agaccaccat 3840

ctgtacaaaa attaataaat tagccaggta tggtgttgca tctgtggtcc cagctacttg 3900

ggaggctgag gtgggaggat cacttaagcc caagaggttg aggctgcagt gaactgtgat 3960

ggcaccactg cactccaaca tgggtgacag agtgaggccc tatctcaaaa aaaaaaaaaa 4020

aaaaaaaata aagggagatg ggttaatggg agaaaaaaca taggattttt tttttttgag 4080

atggagtctt gctctgttgc ccaggctgga gtgcagtggt gcgatcttgc ctcactgcat 4140

cctccacctc cttggttcaa gtggttctcc tgcctcagcc tcccgagtaa ctgcgactac 4200

aggtgtgcac caccacgcct ggctaatctt gtatttttag tggagatggg gtttcaccat 4260

gttggccagg ctggtcttga actcctgacc tcaagtgatc caaccacctc ggcctcccaa 4320

agtgctggga ttacaggtgt gagccaccgt gtccagccag gcatattaat ttaacacaag 4380

ttttatacag cacaggctcc cttataatga aatgaagact caaagtggca aaattaaatc 4440

acttatatac tgacttggac aaagactagc cacttgtaaa aaagcaacta catgatgtgg 4500

ggatgcttga aagagttgtt ttcacaaggt ctgtaccaaa ttctgtcggc cttgacttcc 4560

tgtcgtcctt gatgataaaa tcattttatt tgatatgggg agggcgtctt tcacttggga 4620

atttcatttg cttttaagaa gcagaatgga ggtcagggtg atcttgcact gttttttgat 4680

tttttttaaa aaaggccttg ctctgttggc ccaggctgga gtgcagtggt atggtcatag 4740

ctcactgcag cctcaaactc ctgggctcaa gcgatcgtct tacctcagcc tcccgagttg 4800

ctgggaccat aggtgtgcac cactatgcct ggctaatgtt tttgattttt agtagagaca 4860

ggttttcact gttgcccagg ctagtctcga actcctgggc tcaagcaatc ctcccacctc 4920

agcctcccaa agtactgtga ttacaggcat gaggcaccgt gccaggcctc ttctgttatt 4980

gttttttttt ttgttttttg tttttttttg gctcaccgca acctctgcct cccaggttca 5040

agcgattctc ctgcttcagc ctcccaagta gctgggacta caggcgtgcg ccaccacgcc 5100

cagctaattt ttatatttgt agtagagatg gggtttcagc aggttggcca ggatggtctt 5160

aatctccgga cctcatgttc tgtctgcctc agcctcccaa agtgctggga ttataggcgt 5220

gagcccccgt gcctggcttt tttttttttt tttttttttt ttgagatgga gtctcgctct 5280

gtcgcccagg ctggagtgca gtagcatgaa ctcgggctca ctgcaacctc cgcctcctgg 5340

attcaagtga ttcacctgcc tcagcctccc gattagctgg gattacaggc gtgccaccac 5400

gcctggctca tttttgtatt tttagtagag acggggtttc accatgttgg tcaggctggt 5460

cttgaactcc tgacctcatg atccgcccgc cttggcctcc tggagtgctg ggattacaag 5520

cgtgagccac tgtgcctggc ctaatagtcg atgtgcctga gcagcatgtt ttggagtggc 5580

atgttcttaa ctccttcaag agcaaacagg ttccccttcc cctggggagg gtgggtgagg 5640

acacaggtct tttcctgcca cccgtttgca gggacacgtg atggaccgta ggaagaaggc 5700

actgaccgac tacaagaagc tgcgggcctt ctttgtggag gaggaggagc atttcctgca 5760

ggaggctgag aaggaggagg ggctccctga ggacgagctg gctgacccca ctgagcggtt 5820

caggtcactg ctgcaggcgg tctcggagct ggagaagaag catcgcaacc tgggcctcag 5880

catgctgctg caggtgcggg agccccgctg ggtctgccca ccatcgggcc agggtggacg 5940

caggcagcag cgagccattg ggggaccatt gcccgaagtc aaggcttaaa agcccagcct 6000

gactcccact gccgtggcct tgcagggctg aatttcggga atgggtgggt ggtcagggaa 6060

ggtgatggga aggggtttta agttgaggag ggtctgaggt gtccctgacc ttcacaaagg 6120

agggcacttg gcatcccgag tgcccgagca tggaaggctc ctgcctcgcc ctggggtcct 6180

gaaggcagaa gcagccaaga aacccaacct cagggctttt cttctgcctc tgcccagggc 6240

ctggcctgaa ccccagaccc tgcagcaacc cagatggccc tgaacggttc agttgcccgt 6300

gccagccata ggtgacaagg ctttggccct ggggagacgg aagtctgggc caggccctgg 6360

gtttgttgtg ctcaggacag tacctcatgc gctgtctcat gtgcgctctc tctttcgctc 6420

tctccttttg cctctgtctc tgactctgtg tgtctctttc tctttttgtc tctctgtctt 6480

tccctctccc ctcccatgca gtgatggcgc caacccgtgg cagtcccaga gctggaggca 6540

ggaggatgga tcctcatctc catgggaagt gtcagcgtgt ggctgccagg gaagcgtggc 6600

aggcgcctgg ccttgggtcc atctacatag ttgcgtgttt caacaatgtc catttatcct 6660

tcaccccgag gcgtgttttg ggggctgcaa acacctcccg gtagaggctg gacctgagga 6720

cccttcccac ctgtgcccgt cccttcctga agtcctagcc acagcccatc ctccatgagt 6780

cccggcagct ctgggtcatg cccttccctg gtcacccatc tgcccctcac ctcgtcatcc 6840

agggacccag accctgcacc ttccatgtgg gcccacagat ccttggcagg tacctgaggt 6900

gcaccattga gtgtcggatt tggggttagc atccagaaag aagaatgcgc atgacgctct 6960

gtgaaggctg gaactcaggt cttcagggag agaaaggaag actggattgc accttgatgc 7020

ctcctgagga ggcggccccc ctcttgaggt gggcgtgggc ccggcccagc cttatccaag 7080

tcgctctgtc cacctccccc ttcctggccc ccaccccact cctgtgcctc ccaggagccc 7140

tccctgtgct ccacctgcct ccgcagaagg aagcctcttt ctctgtttcc ctgggtgagg 7200

gggctggcag gtggctaacc ccatttagca tctccaggcc ctgccatcgt gtctcatctt 7260

gctgttatct ctagctcttt ccctcctccc atttccttta gtagttgaat tttgcaaagc 7320

ttgtagcagt agctcagttg cctgcagcat ccttgtgtgt agataaatta gtcgacagaa 7380

actcagcact ggggacagga ttgcaaagtc ggggacatag atgcagacag ttgttgagat 7440

ttggggatag ccgggcttgt gagcggtgcc catttccaga tgaagccttt cagcccttct 7500

gagtccccgg cccttggtgc gatgtctgtg agtttgacct gcccagcgtg tgggctggct 7560

caatgctgaa taaagtgggt ttgtgtcagc tcgtttgctt cgtctccgtg tgtccacctg 7620

gcctcttccc cctgccctgg ccaccctcca gtgtcaaagg aaacttcctc gtgacacgtg 7680

ctaaagcatg gtgaggagga ctttgattgg gaccattgag atgggtgtgg gaccctttcc 7740

ttggggcctg gggggagatg gggctccacc ccgacgtagc agggcagggg ttggaggagc 7800

gaggagcagt atagggtcca tgggtgggaa tgactgtgag gagacatcag ggctgagggg 7860

gctctggcta aacccacctc acagagtcct tgctgcaggc aggcagggcg atcagacatt 7920

ggctgcaaac ggtcagagag gaacccagtc aggtaccatt gagggtggtc agatattatg 7980

gttaaccaaa ttagggttct tgctaaaact ggatttcata agaaagggca aagagggccc 8040

taggagaaga ttccagagcc tggccagagt ttggccaagt agagaatctt tgtcagcacg 8100

ccaacaacat cccgaccctg agacctccag tttgtctttc tcactgtctc cgcctgctgc 8160

agtctgctgt catccctgag catccctgcc cctgccctgc acacctgtga tgcttgcccg 8220

gacaggtcct gatggcagag tctcccacaa catcagtgtc tccacatcac caggtccgac 8280

agtggcttca ccatcctcac ctaacctagc tgaccagcaa catcccaccc tgtcaatcac 8340

aacctctttc tatttaagaa aattatatat ttatggggca cagtgtgatg ttttgatatc 8400

tatgtacatt gtggagtgac agattaatgt atccatctca tgtttttttt ggtggtgaga 8460

atatttgaaa tctacactca gcaatttcaa atacagtcat ccctctgtgc ctaaggggga 8520

ttggttccag gaccccctca tggataccaa aatctgcaga tactcaagta ccctgcagtc 8580

agccctccct ctgcacatat gtgggacagt cagatacaga gggccaactg cgtacagtac 8640

acggttatca gctgaagtca ccatgctgtg caatagacct tgagtttatt cttgtatagc 8700

agggactctg taccctctga ctagaatttc cccaaatcct cttgtctcag cccctgctaa 8760

ccaccgttct actctctaat tctataaatc aacattttga ttccaca 8807

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> RNF187(RNF187)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Ala Gly Pro Ala Glu Ala Ala Cys Ala Leu Cys Gln

1 5 10 15

Arg Ala Pro Arg Glu Pro Val Arg Ala Asp Cys Gly His Arg Phe Cys

20 25 30

Arg Ala Cys Val Val Arg Phe Trp Ala Glu Glu Asp Gly Pro Phe Pro

35 40 45

Cys Pro Glu Cys Ala Asp Asp Cys Trp Gln Arg Ala Val Glu Pro Gly

50 55 60

Arg Pro Pro Leu Ser Arg Arg Leu Leu Ala Leu Glu Glu Ala Ala Ala

65 70 75 80

Ala Pro Ala Arg Asp Gly Pro Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Cys Arg Ala Asp Ala Gly Pro Leu Cys Ala Ala Cys Arg Met Ala Ala

100 105 110

Gly Pro Glu Pro Pro Glu Trp Glu Pro Arg Trp Arg Lys Ala Leu Arg

115 120 125

Gly Lys Glu Asn Lys Gly Ser Val Glu Ile Met Arg Lys Asp Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Arg Asp Leu His Gly Gln Ala Glu Ser Ala Ala Ala Val Trp

145 150 155 160

Lys Gly His Val Met Asp Arg Arg Lys Lys Ala Leu Thr Asp Tyr Lys

165 170 175

Lys Leu Arg Ala Phe Phe Val Glu Glu Glu Glu His Phe Leu Gln Glu

180 185 190

Ala Glu Lys Glu Glu Gly Leu Pro Glu Asp Glu Leu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Glu Arg Phe Arg Ser Leu Leu Gln Ala Val Ser Glu Leu Glu Lys Lys

210 215 220

His Arg Asn Leu Gly Leu Ser Met Leu Leu Gln

225 230 235

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(RNF187-F)

<400> 3

aggacttgaa tgacgcccg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RNF187-R)

<400> 4

tccatcacgt gtcccttcca 20

Claims

1.一种三阴性乳腺癌分子标志物，其特征在于：所述分子标志物包括RNF187基因和/或RNF187基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌分子标志物，其特征在于：所述RNF187基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌分子标志物，其特征在于：所述RNF187基因的表达产物包括RNF187 mRNA和/或RNF187蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种三阴性乳腺癌分子标志物，其特征在于：所述RNF187蛋白包括RNF187蛋白和/或RNF187蛋白的功能等同物。

5.根据权利要求4所述的一种三阴性乳腺癌分子标志物，其特征在于：所述RNF187蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；或将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5任一所述的三阴性乳腺癌分子标志物在制备三阴性乳腺癌检测相关试剂盒或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌分子标志物的应用，其特征在于：所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括特异扩增RNF187基因的引物，所述特异扩增RNF187基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌分子标志物的应用，其特征在于：所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括RNF187蛋白的免疫检测产品，所述RNF187蛋白的免疫检测产品包括与RNF187蛋白特异性结合的抗体。

9.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌分子标志物的应用，其特征在于：所述治疗三阴性乳腺癌的药物包括RNF187基因和/或其表达产物的促进剂。