CN111154873A

CN111154873A - 一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN111154873A
Application number: CN202010014460.5A
Authority: CN
Inventors: 庄婷; 朱建; 刘云
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111154873B

Abstract

本发明属于肿瘤的免疫检测技术领域，尤其涉及一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用。本发明运用RT‑PCR、q‑PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，成功构建了靶向ZNF213基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰ZNF213基因后对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响，首次发现了ZNF213基因表达与三阴性乳腺癌细胞系迁移能力有关，三阴性乳腺癌细胞迁移能力在一定程度上可反映三阴性乳腺癌患者发生转移的可能性大小，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

Description

一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤的免疫检测技术领域，尤其涉及一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤之一，也是第六大中国女性癌症死亡原因，中国女性乳腺癌危险因素有一部分与西方国家一致，包括：年龄大于55岁、乳房密度高、月经初潮早、绝经晚、生育晚、肥胖、有家族史等。

三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型更差。多项研究表明，三阴性乳腺癌多发生于绝经前的年轻女性，尤其是非洲裔美国妇女，但是目前对其发病机制的研究尚不明确。

ZNF213是锌指结构蛋白(ZNF)家族中的一员，锌指蛋白(ZNF)是一类具有手指状结构域的转录因子，对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达。其中ZNF213是属于C2H2型。根据目前已有报道，主要功能可能还是跟2个角度有关-1.DNA调控2.泛素化修饰。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，所述分子标志物包括ZNF213基因和/或ZNF213基因的表达产物。

进一步地，所述ZNF213基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或与SEQID NO.1限定的DNA序列编码相同功能蛋白质的DNA序列。

进一步地，所述ZNF213基因的表达产物包括ZNF213 mRNA和/或ZNF213蛋白。

进一步地，所述ZNF213蛋白包括ZNF213蛋白和/或ZNF213蛋白的功能等同物。

进一步地，所述ZNF213蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；或将SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

如上述的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物在制备三阴性乳腺癌检测相关试剂盒或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括特异扩增ZNF213基因的引物，所述特异扩增ZNF213基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒还包括36B4上游引物5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’36B4下游引物5’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-3’。

进一步地，所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括ZNF213蛋白的免疫检测产品，所述ZNF213蛋白的免疫检测产品包括与ZNF213蛋白特异性结合的抗体。

进一步地，所述治疗三阴性乳腺癌的药物包括ZNF213基因和/或其表达产物的促进剂。

进一步地，本发明中所述的用于检测三阴性乳腺癌迁移能力的试剂盒的检测方法：提取样本的RNA，使用引物试剂、RT-PCR体系试剂及q-PCR体系试剂进行实时定量PCR反应，并以ZNF213基因样本为对照，对实时定量PCR结果进行分析即可。所述ZNF213蛋白的免疫检测产品包括与ZNF213蛋白特异性结合的抗体。可以通过ZNF213蛋白的特异性抗体检测出ZNF213蛋白的表达量，进而推测癌细胞的迁移能力。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

在kmplot数据库中，申请人发现在三阴性乳腺癌中病人的生存率和ZNF213的表达呈现正相关的关系，在ZNF213表达低的病人中，他们的生存期没有ZNF213表达高的病人生存期长，所以申请人猜测ZNF213在三阴性乳腺癌中扮演着“抑癌基因”的角色。然后本申请中通过迁移实验和侵袭实验发现，将ZNF213沉默后三阴性乳腺癌细胞系的迁移和侵袭能力明显增强，由于研究三阴性乳腺癌发生、发展以及转移过程的分子机制，可为三阴性乳腺癌患者的治疗提供新的思路。因此ZNF213可作为一种检测三阴性乳腺癌迁移和侵袭能力的一种分子标志物。

与现有技术相比，本发明运用RT-PCR、q-PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，成功构建了靶向ZNF213基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰ZNF213基因后对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响，本发明提供的试剂盒，可用于检测三阴性乳腺癌迁移能力，具有很好的实用性。

本发明首次发现了ZNF213基因表达与三阴性乳腺癌细胞系迁移能力有关，三阴性乳腺癌细胞迁移能力在一定程度上可反映三阴性乳腺癌患者发生转移的可能性大小，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

附图说明

图1是检测干扰siRNA在蛋白水平上对ZNF213的沉默效果；

图2是检测干扰siRNA在mRNA水平上对ZNF213的沉默效果；

图3是利用划痕实验检测不同组三阴性乳腺癌细胞系迁移能力的影响结果图；

图4是利用Transwell小室模型实验检测不同组三阴性乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的影响结果图；

图5是在MDA-MB231细胞中使用慢病毒稳转技术过表达ZNF213后的相关实验数据。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中涉及的蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段；本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用。本发明中所涉及的ZNF213基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，ZNF213蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；三阴性乳腺癌细胞系为MDA-MB231细胞株，购于ATCC；ZNF213抗体购自sigma；细胞蛋白的提取按配制好的1xloading buffer进行，Westernblot方法检测蛋白表达；实时定量PCR方法参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，测浓度后，按TaKaRa公司PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行反转录，按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因表达(36B4为内参)；ZNF213-siRNA直接由sigma公司购买，具体序列如下：siZNF213#1:sense(5'-3')GGCAUUGGGAGACAUCCCA,antisense(5'-3')UGGGAUGUCUCCCAAUGCC；siZNF213#2：sense(5'-3')GCCUUUCAGUGGGCGUGGA,antisense(5'-3')UCCACGCCCACUGAAAGGC转染方法按Invitrogen公司Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂说明书进行，q-PCR及Western blot方法检测表达及干扰效果；细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Cosar公司，事先进行饥饿培养；细胞划痕实验所使用12孔板购自Cosar公司。

实施例1细胞培养、转染及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞株中ZNF213蛋白的干扰效果

细胞复苏：从-80℃冰箱取出MDA-MB231细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在最短时间内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至事先准备好的5mlEP管(已事先加入1ml DMEM+10％FBS)中，900rpm离心3min。弃去上清，用1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入培养瓶中，将重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养，次日更换一次培养基，继续培养，待细胞密度80％-90％左右时，开始传代。

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm,离心3min，弃去上清，用1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si ZNF213#1和si ZNF213#2作为实验组，si-control作为对照组。取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-ZNF213#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-ZNF213#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

Western Blot

(1)总蛋白的提取：将转染过24h的12孔板的细胞中旧培养基弃去，加入1xloadingbuffer100μL，有剪过的200ul枪头将1x loading buffer与细胞充分混匀，注意每个孔力度相同，将混合液移至标记好的1.5mL离心管中，100℃金属浴中煮10min，-80℃保存备用。(2)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量大小配制10％的聚丙烯酰胺凝胶。将用于配胶的1.5mm玻璃板洗干净并晾干后对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，按说明书准备配胶试剂，先加分离胶，先快后慢，避免产生气泡，加至距上端1.5cm处时加无水乙醇密封，静置20分钟后弃去无水乙醇，用离子水清洗3次后加浓缩胶至顶端，插入梳子，注意不能有气泡产生，静置10分钟左右，可进行上样。(3)上样电泳：将制备好的样本按照一定顺序，每孔加20μL，每一组实验样本周边以预染的蛋白质Marker隔开，起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶以后，电压改为120v，约1.5h，当小分子蛋白拉开距离以后，停止电泳。(4)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醛中激活1min左右，再把PVDF膜覆盖于电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，至于电转槽中，恒流300mA，90min。(5)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配的封闭液(含5％的脱脂牛奶的1×TBST)中，摇床上4℃过夜或室温2h。(6)封一抗：封闭结束后，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的一抗(抗ZNF213抗体稀释5000倍，抗GAPDH抗体稀释5000倍，各稀释2mL放离心管中)，在相应蛋白所在位置剪开，在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应一抗，摇床上4℃过夜或室温2h。(7)洗膜，孵二抗，洗二抗：取出PVDF膜，1×TBST摇床上洗3次，每次15min，将洗好的膜分别放在封抗体盒子中，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的二抗(二抗稀释5000倍，稀释2mL放离心管中)在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应二抗，摇床上室温1h，摇床上用1×TBST洗3次，每次10min。(8)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液A、B液等比例混合(使用前配制)，将洗好的膜用吸水纸吸干多余的1×TBST，将膜的正面向上放置在发光板上，均匀的滴加显影液，凝胶成像系统拍照、保存。

结果如图1所示，为Western Blot检测细胞株中干扰后的ZNF213蛋白表达水平较对照组明显减低。

实施例2通过实时定量PCR检测细胞株中ZNF213的mRNA干扰效果

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si ZNF213#1和si ZNF213#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-ZNF213#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-ZNF213#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

总RNA的提取：收集细胞后，参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，在该操作过程中需遵循无RNA酶操作，佩戴无菌手套和口罩。具体步骤如下：

1)需要用RL裂解液(已加入β-巯基乙醇)裂解细胞，并提前配置好70％乙醇，分开标记RL裂解液及70％乙醇以免混淆。

2)每个孔需要加入350μL配制好的RL细胞裂解液，用枪头的底部按照顺时针及逆时针方向轻轻划动，以充分裂解细胞，随即把裂解的溶液沿着侧壁缓慢滴到CS过滤柱上，并标记清楚，放入离心机中快速离心并收取滤液(2min，4℃，12000rpm)；

3)在滤液中缓慢加入70％乙醇，每孔约350μL，轻柔的混匀，混匀后的溶液转移到CR3吸附柱里，并放在对应的收集管中，再次离心(90s，4℃，12000rpm)并弃掉滤液，吸附柱重新放入收集管中；

4)沿着侧壁每个吸附柱中加入去蛋白液RW1 350μL，调整离心机转速12000rpm，温度为4℃，离心60s，弃掉滤液，吸附柱放到收集管中；

5)每个柱子中间悬空滴下DNaseⅠ工作液80μL，注意不要滴到侧壁，室温下静置15min；

6)每个柱子沿着侧壁缓慢加入去蛋白液RW1 350μL，4℃高速离心机，12000rpm离心60s，弃滤液，吸附柱重新放回收集管；

7)加入RW漂洗液500μL，静置置2min，离心并丢弃滤液(90s，4℃，12000rpm)，吸附柱放回到收集管中，重复该步骤1次，4℃高速离心机，12000rpm，离心2min，吸去滤液，打开吸附柱的盖子，静置大约4min，以便彻底清除吸附柱上的乙醇残留；

8)把晾干的吸附柱放到标好的RNase-Free 1.5ml EP管中，于每个柱子中心滴加30μL去离子水，室温放置2min后离心以便收取滤液(2min，4℃，12000rpm)，重复该步骤1次，以更多的获得RNA溶液。

紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/μL)和纯度，用DEPC水调零，OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明提取的RNA纯度好。

将提取好的RNA逆转录为cDNA，反应体系为:按TaKaRa公司PrimeScript RTMasterMix试剂盒进行反转录：5*PrimeScript RT Master MIX：2μL，所提总RNA：1μg；加ddH2O至总体积为10μL，置于PCR仪中进行逆转录，反应体系为37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存备用。

实时定量PCR方法按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因的表达(36B4为内参)的反应体系为：每孔10μl体系，设置3个复孔，配样体系共34μl，包括17μL SYBR，14μL去RNA酶水，1μLForward primer(5’-gcg acc ctg gag tac acatc-3’，SEQ ID NO.3)，1μL Reverse primer(5’-tca tgc tgg gca gat tcc tg-3’，SEQ IDNO.4)，1μL cDNA。反应程序为Holding Stage:50℃2min，95℃10min，Cycling Stage:95℃，15s，50℃，1min，Number of Cycles:40。计算CT值，结果以柱状图呈现。

结果如图2所示，为q-PCR检测细胞株中干扰后的ZNF213 mRNA表达水平较对照组明显减低。

实施例3利用划痕实验检测转染后三阴性乳腺癌细胞系迁移能力的影响

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm,离心3min，弃去上清，用1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃,5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si ZNF213#1和si ZNF213#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si ZNF213#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si ZNF213#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

划痕实验：12孔板转染后的细胞株待密度达100％时，用无血清DMEM培养基饥饿12h；小号枪头在12孔板各实验孔内划十字痕迹，创造人为伤口，以PBS洗去刮下细胞，洗3次，加1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)，显微镜下拍照,记录划痕宽度。继续培养24、48、72h，显微镜下拍照(每次拍照前换新鲜1ml DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)),记录划痕宽度，计算细胞迁移距离。

结果如图3所示，ZNF213基因干扰后，MDA-MB231细胞系的划痕愈合的更快，表明其迁移能力和侵袭能力较对照组明显升高。

实施例4Transwel小室观察转染前后细胞迁移和侵袭能力的改变

取脂质体转染后的实验组细胞、阴性对照组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数后用无血清DMEM培养基重悬，调整细胞密度为5×105/mL。在上室加入200μL细胞悬液，细胞数为1×105个，下室为含20％胎牛血清的DMEM培养液500L，37℃、5％C2培养箱中孵育18h.孵育结束后，取出小室，用PBS洗两遍，棉签轻轻擦拭上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。将小室滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，每孔加入500μL结晶紫染液，染色20min，吸弃染色液，PBS洗三遍，将上室取出，用树脂胶封片，于倒置显微镜下拍照并计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野(共15个视野)，计算平均值。

Transwell侵袭实验与迁移实验不同的是：Transwell小室上室表面需要提前均匀铺上用无血清培养基：Matrigel胶＝8:1稀释过的Matrigel胶，于37℃细胞培养箱2-3小时使胶体凝固，模拟血管基底膜。

结果如图4所示，ZNF213基因干扰后，MDA-MB231细胞系的愈合速度加快，意味着侵袭能力和迁移能力较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。在MDA-MB231细胞中使用慢病毒稳转技术过表达ZNF213后，细胞的划痕愈合速度减慢，transwell实验显示细胞的迁移和侵袭能力也减弱，差异有统计学意义(P<0.01)，相关数据如图5所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7776

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(ZNF213)

<400> 1

gaggacttcc ggcgccggga gctcgcggcg gaagtgggat ctcctgggcc gtagtgggcg 60

ttgtgtgttt cgggggcggg ggcgggggcg ggggccgggg cggggacggg gcctctggcc 120

gcctggctcc aacatcaagc accgggctcc gagtggccgg gatcagcgcc ccgaggcaga 180

ggccggaggg cgcgcgcact gctaggaagt gctggtcccc cgcgccgctc tgccagcttg 240

gtcccccggc agacgcccct gtacgatcgc cgctcgcccc gcgggcgagg ctgcggtgga 300

cagcgcgggg ctccggctgg ctcgccttcc cgcctgccgt gtcctgctga gcgaccctgg 360

tgagtcctgg ccctcttcga ggaaagtctt cttcgaagtc accagaggat gagaatggtg 420

cgcgcacctt tcaggggtct tgtgaggagc agaataaata aagtgcttag gatggactaa 480

agaattggaa acaacccgaa tgcatcactc gagtattgat taagaaacta gagcatatcc 540

ataccgcgga agctcatagt gccgctaatg tctgtgcagt aaggtctcat ttatgtagaa 600

acacatcaag caccttttct ccccgctatg gatgactttt ttagtaaaag cacaggaaaa 660

ggtctgggac gtcatttgtc agactgttaa gtcggggggt acaatggtat tgaggaaggg 720

agagttttac agatttctat attgtttgaa tcttcccttt tttattaaga tggtttgtat 780

ttttttcatt ttctttttac ttttcttttc tttctttttt tttttttttt gagatggtct 840

cactctgttg cccaggctgg agtacagtgg tgcgatcata gctcattgca acctcaaact 900

cctggactca agcaatcttt cctcctcagc ctccccagta gctgggacta caggagcccc 960

acctggcttt ttttgttttt tggtacagat ggcgtctcac attgtcttcc caaaggggtc 1020

ttgaacccct ggcctcaagc aatcatcctg tgtctgtctc ccaaaatgct gggattacag 1080

gcataagcca ccaagcccgg ccagtttgta tttttattgt tgaaacaaaa aatcgattac 1140

tgaaaattgc ataatacact tttcagtaga gagtaacaat gtaaggtata aatgtgtcat 1200

acatttatat gtacctgtgg ataaatggct ttggatggtg tctgtaagcc cttctgtgac 1260

acctcagggc cagatgtgtt ttggaattca gaggttttca aatttgagaa agataatata 1320

gtgcacagac gatatatcaa gcacatctcc agagggatct ggggcaacac taaataatga 1380

aacatatcag ttaaaatttt ttaattaggc cgggcgcagt ggctcacgcc tgtaatccca 1440

gcactttagg aggccgaggc gggtggatca caaggtcagg agtttgagac catcctggcc 1500

aacatggtga aacctcgtct ctactaaaaa tacaaaaaat tagctggacg tggtagctgg 1560

tgcctgtagt cccagctact tgggaggctg aagcaggaga atcgcttgaa cctggcaggc 1620

agaggttgca gtgaactgag attgcgccac tgcactccag cctgggcgac agagtgagac 1680

tctctctcag taaaaaaaaa aaaaaaagat atttaattga tgtataatgt gcaatacaga 1740

aaaacacacg agtgggtata gctcaatgaa attttataaa ctgaagatat atgttattaa 1800

tatttccacc ataattttga acatttacat ttagtggaat aaattgagat tataaatatg 1860

cttatatcag gtcaggtggt gctgccaaat gaatgacatt gggttttgct gtcaaagagt 1920

tatgaaacac ccgggttttg gatttctggc tttgggatga gagcttgtgg gcctgtgtta 1980

ataggagaga cagtcacatg agcaaggcat tacagtaaag cctagaaaag gcttcagggc 2040

catgaaagga tggggactgg atggctcttc agcctggggt ttgctcgtgt attccacatc 2100

cttcctcctc agtcctgcca ttttgctctt tccccaggag tacacatcca gatgccagcc 2160

cagctaccac aggggatccc tctgggagac tgaaagtaca ggttctgggg cccaggttga 2220

agccgaccaa ccctgagcct caggccaggg gaatggcagc ccccttggag gcccaggacc 2280

aggcccctgg ggagggagaa gggcttctga ttgtgaaagt ggaagattcc tcctgggaac 2340

aggaatctgc ccagcatgag gatggcaggg attccgaagc ctgccgccag cgcttccggc 2400

aattctgcta cggggatgtg catgggcctc atgaggcctt cagccagctc tgggagctct 2460

gctgccgctg gctgcggccc gagctgcgta ccaaggagca gatcctggag ctgctggtgc 2520

tggagcagtt cctgacagtg ctgccagggg agatccaggg ctgggtgcgt gagcagcacc 2580

cgggaagcgg tgaggaggct gtcgccttgg tggaggacct acagaagcag ccagtgaaag 2640

cctggcgaca ggtgaggggc ccttccacat ccaggggcac ctggatggta tctgagctcg 2700

agagaagtgg gtaacctgca gagataagtc tcccagaggc tcacagggta ggggagacac 2760

agagccccca ggagcaggca cacaagcaca gtgtgccatg ggtgcctttc tgaaagatgc 2820

gatccaaagt aaatgtgatt tattttttgt ggctttggaa ggcagcaata gggctgaagt 2880

gcgaatgttc cagacaggag gttttagctc catgcagggt ctgctgatgt ttatttgcat 2940

tttgctctag gcctggctct ggggacacaa gggtgtgcat agagccagct ccagagtggg 3000

gcgagaaggt ggagctgtcc ggggcctctg ctaccttgtg ggatgttggg tccttcacat 3060

tggatgcatc tggggaggtt ctaatgagtg gctgggggat ggggttctgc ctttggcagg 3120

agggtcccca gctaccccct tgctaagtgg ctgtgattct ggcctttcag ggctggttct 3180

tgcctcgtga atgatcgggg agcatccttg ggcacacagc attacctggt atcacattct 3240

cctccggact tttcctgggg caccatattg gtctccttcc cacaccccag catcctgagg 3300

gtcatgtcct gtgtctcctt cccagggagt aaactctgtc tcccccggtc tggtctcggg 3360

ctgatgagca tgttgtggtt cctgcacagg atgtgccctc ggaggaggcg gaacccgagg 3420

ctgcaggccg gggatcccag gccacggggc ctcccccgac ggtgggggca cggaggcggc 3480

cgtctgttcc ccaggagcag cacagccata gcggtgagta agcctccgtt cttgtggaca 3540

gtcgagtggc tgggcaggga cctagctttg tcaccggcgt tgccctaagg gtcacaggca 3600

ggacagctcc ctctgtgaag tccagggcgt gtgtgcatgc gcacaggctg gggaggccat 3660

aggcgtcggt gtcaagcctg ggctggcctt tctaaggctc cattcttctc cttcagccca 3720

gcctcctgct cttcttaaag agggtcgtcc cggagagacg acggacacct gctttgtctc 3780

tggggtccat gtgagtcacc agtccctttg tcttctttaa ggcacttggc cctgttgagt 3840

ttgtaaaatg ggacttgctg tcccatcagg cctctttcat ctgacccatc ctgtccccgc 3900

cagtgctgct gggaggcctg agccgggtct tctcacccca ttccagggac ctgtggcatt 3960

gggagacatc ccattctatt tctcccggga agaatggggc accctggacc ctgctcagcg 4020

ggatctcttc tgggacataa agcgggagaa ctcccggaac accaccctgg gtaagcaccc 4080

agggcctttg ggtccaggct ggccgccccc gattctgctg gaacttcagt cttgtttccc 4140

accccatcct tagctggttc caaagcaggc tctccctagg tcttgccagg agcctgagta 4200

actcctttct tggctgatga tcagtttttg tgcgtttcca catgcagcat gggacggcgc 4260

cggcgctgcc cagccctgca gttgctctaa gggcaacttc tcctttgagt ctcacaacct 4320

agtgcatgga agtattgtcc ccattttacg cataagggac ctgagactca ggtcagtgga 4380

tgctgaaggg acacagctgg gacttggatc aggcacagtt gtgaggccac cttgggctgc 4440

taggagcagg ggtgctgacg gggaacccca gctgctcacc agcctgggcc cctgctcgtc 4500

agaactgcac ttaccaggtt cctctccatg ccaggcccct tctcagcacc atcagggatc 4560

atcttgttca gtcacactcc caggaggatg ggctgcgacc tctgtccaga tctgtgttga 4620

gtttggagaa ctagagcctg cgtggtgaag ggagccacac tagctagacc agtttggctc 4680

ctcagtttcc gactgtgacg gttgggaaaa attttctttc tttttttttt ttttgagatg 4740

gagtcttgct ctgtcgccag gccggaatgc agtggtgtga tctcagctca ctgaaacttc 4800

cacctcccgg gttcaagcaa ttctcctgcc tcagcctgag tagctgggat tacaggcatg 4860

agccaccatg cccggctaat ttttttgtat ttttaataga gacgagtttt caccatgttg 4920

gtcaggctgg tctcgaactc ctgacttcat gatccgcctg cctcagcctc ccaaagtgct 4980

gggattacag gcgtgagcca ccgcgcccgg cccttgaaaa gtttcagaat tactataaat 5040

ctgttctgct gtggagcttg atatctgggg ttcagagtgg gacattggat cccagtgtgg 5100

cctgcagggc acagatggct tagggggctg gcccatgcag gcgggatcag aggcttattc 5160

agactgctgc tctgccgaat tttttcatca tccctgattt atttgggttt ttgtttgttt 5220

ttgagacaaa gtctcgctct tggagtgcaa tggcatgatc ccggcttact gcaacctccg 5280

cttcatgggt tcaagtgatt cttctacctc agcctcctga gtagctggga ttacagatgt 5340

gcgccaccat gccctgctga tttttgcatt ttttaataga gacggggttt caccatgttg 5400

gccaggctgg tctcgaactc ctaacctcag gtgatcagct cgcctcagcc tcccaaaatg 5460

ttgggattac aggcttgagt cactgcgcct ggccaatcat ccctgtttta tagatgagga 5520

acctgagaat tcagctgtgt gaacccaggg ctttctgaac ctggaggcca gggagctttc 5580

cccagccttg tttcttcctc acctcagctc tggccccaga accgcgtggg actgaagagg 5640

tcgcctcctt ccccttgcag gttttgggct caaaggccaa agtgagaagt ccctgctgca 5700

ggagatggtg ccggtggtgc caggccagac aggcagcgac gtgactgtgt cctggagccc 5760

cgaggaggct gaggcctggg agagcgagaa ccggccgagg gcggccctgg gcccagtggt 5820

gggcgcgcga cgggggcggc cacccactcg ccggcgccag ttccgggacc tggcagccga 5880

gaagccgcac agctgcgggc agtgtggaaa gcgcttccgc tggggctcgg acctggcgcg 5940

gcaccagcgc acgcacacgg gcgagaagcc acacaagtgc cctgagtgcg acaagagctt 6000

ccgcagctcc tcggacctgg tgcgccacca aggcgtgcac acgggcgaga agcccttctc 6060

ctgttccgag tgcggcaaga gcttcagccg cagcgcctac ctggccgacc accagcgcat 6120

acacacgggc gagaagcctt tcggctgcag cgactgcggc aagagcttct cgctgcgctc 6180

ctacctgctg gaccatcggc gtgtgcacac cggtgagcgg cccttcggct gcggagagtg 6240

cgacaagagc ttcaagcagc gcgcgcacct catcgcgcat cagagcctgc acgccaagat 6300

ggcccagccc gtggggtgag cagctggctt ggccggaaac ccgggggagg cccagccacg 6360

gcacatcctg ctttgttcac cactgggact ctccttccat ctgtggccac ctcccgggct 6420

gtccgaggga ccccagggta cctcacactc ggagctcgcc tgccctgctt ggctctgagg 6480

acctgcccag cgctcaaagg gaacggaagc cttcccctcc cgcccccgat cttgtcctct 6540

ttcccccttc tgcgcctagc gttcctcttc ccctctagtt tcctggagcc ccaacacatt 6600

cctggcaggg acagcagggt ggcaaggact caggtctagg tcccttccca gaagcccccg 6660

agcctcattt gactgtgtgg ctctttggcc cccaccctgt ggggtgggtc catgggtcag 6720

gcctctgccc taccaacctg tgcctttcag tgggcgtgga ggactggcct tggcccccca 6780

gggggctgct ggactttggg agagacagcc cacacctgtg ggaccgcggg tcttagtcac 6840

ggcggcaggg gctttctggc cccctcccac tcccgtttcc aggccatgac cactctgccc 6900

tgtcctggcc atacggactc ggcctgcctt tgccctcggc ctacttgccc tagcatgagg 6960

ctctgagagc cacctgccca ccaatctggt gaggataatg gtggctccag cgacaggagg 7020

ccaaccctgg agaccaagaa cagggcgcct ggctgccatc ttttcctcca gaggtggggc 7080

tgcaccagac tcagcactag cactccatca gcactagcac ctcactccat cagcactagc 7140

acctcactcc atcggccccg gcaccctgct ccatcggcac tggcgccctg ctccatcggc 7200

actaatgctc cactcggcgc cccactccat cggccccgct ccatcggcac taatgcccca 7260

ctcggcgccc cactccatca gcactaatgc tccactccat tggcactaac gccccaactc 7320

cagcggcact aatgacccgc tcctttgaca ttggtgcccc actccatcag cactaacgcc 7380

ctgctccatc ggcactggtg tcccactcca ttgtcactaa cgtccggctc catcggcact 7440

accaccccgc tccatcatca ctatgtccag ctccgtcggc actaccaccc tgctccatca 7500

tcactacgtc cagctccaac ggcactggtg ccccattcca tcggcactaa cgccccgctc 7560

caccggcacc agtgcctcgc tccattggca ccaacgccca gctccaccgg tactggctcc 7620

ctgctccatc ggcactaacg ccctgcttca ttggcacttt gctgctgcct cctgagcact 7680

gccttccatg aacagggaca gaccagaggc cctgcaagga ctccccctca gacctccaaa 7740

gggcaacaga agagtattaa taaacgtgaa aactta 7776

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(ZNF213)

<400> 2

Met Ala Ala Pro Leu Glu Ala Gln Asp Gln Ala Pro Gly Glu Gly Glu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Ile Val Lys Val Glu Asp Ser Ser Trp Glu Gln Glu Ser

20 25 30

Ala Gln His Glu Asp Gly Arg Asp Ser Glu Ala Cys Arg Gln Arg Phe

35 40 45

Arg Gln Phe Cys Tyr Gly Asp Val His Gly Pro His Glu Ala Phe Ser

50 55 60

Gln Leu Trp Glu Leu Cys Cys Arg Trp Leu Arg Pro Glu Leu Arg Thr

65 70 75 80

Lys Glu Gln Ile Leu Glu Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Leu Thr Val

85 90 95

Leu Pro Gly Glu Ile Gln Gly Trp Val Arg Glu Gln His Pro Gly Ser

100 105 110

Gly Glu Glu Ala Val Ala Leu Val Glu Asp Leu Gln Lys Gln Pro Val

115 120 125

Lys Ala Trp Arg Gln Asp Val Pro Ser Glu Glu Ala Glu Pro Glu Ala

130 135 140

Ala Gly Arg Gly Ser Gln Ala Thr Gly Pro Pro Pro Thr Val Gly Ala

145 150 155 160

Arg Arg Arg Pro Ser Val Pro Gln Glu Gln His Ser His Ser Ala Gln

165 170 175

Pro Pro Ala Leu Leu Lys Glu Gly Arg Pro Gly Glu Thr Thr Asp Thr

180 185 190

Cys Phe Val Ser Gly Val His Gly Pro Val Ala Leu Gly Asp Ile Pro

195 200 205

Phe Tyr Phe Ser Arg Glu Glu Trp Gly Thr Leu Asp Pro Ala Gln Arg

210 215 220

Asp Leu Phe Trp Asp Ile Lys Arg Glu Asn Ser Arg Asn Thr Thr Leu

225 230 235 240

Gly Phe Gly Leu Lys Gly Gln Ser Glu Lys Ser Leu Leu Gln Glu Met

245 250 255

Val Pro Val Val Pro Gly Gln Thr Gly Ser Asp Val Thr Val Ser Trp

260 265 270

Ser Pro Glu Glu Ala Glu Ala Trp Glu Ser Glu Asn Arg Pro Arg Ala

275 280 285

Ala Leu Gly Pro Val Val Gly Ala Arg Arg Gly Arg Pro Pro Thr Arg

290 295 300

Arg Arg Gln Phe Arg Asp Leu Ala Ala Glu Lys Pro His Ser Cys Gly

305 310 315 320

Gln Cys Gly Lys Arg Phe Arg Trp Gly Ser Asp Leu Ala Arg His Gln

325 330 335

Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro His Lys Cys Pro Glu Cys Asp Lys

340 345 350

Ser Phe Arg Ser Ser Ser Asp Leu Val Arg His Gln Gly Val His Thr

355 360 365

Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Tyr Leu Ala Asp His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro

385 390 395 400

Phe Gly Cys Ser Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ser Tyr Leu

405 410 415

Leu Asp His Arg Arg Val His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gly Cys Gly

420 425 430

Glu Cys Asp Lys Ser Phe Lys Gln Arg Ala His Leu Ile Ala His Gln

435 440 445

Ser Leu His Ala Lys Met Ala Gln Pro Val Gly

450 455

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ZNF213-F)

<400> 3

gcgaccctgg agtacacatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ZNF213-R)

<400> 4

tcatgctggg cagattcctg 20

Claims

1.一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，其特征在于：所述分子标志物包括ZNF213基因和/或ZNF213基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，其特征在于：所述ZNF213基因的编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，其特征在于：所述ZNF213基因的表达产物包括ZNF213 mRNA和/或ZNF213蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，其特征在于：所述ZNF213蛋白包括ZNF213蛋白和/或ZNF213蛋白的功能等同物。

5.根据权利要求4所述的一种三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物，其特征在于：所述ZNF213蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；或将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5任一所述的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物在制备三阴性乳腺癌检测相关试剂盒或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物的应用，其特征在于：所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括特异扩增ZNF213基因的引物，所述特异扩增ZNF213基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物的应用，其特征在于：所述三阴性乳腺癌检测相关试剂盒包括ZNF213蛋白的免疫检测产品，所述ZNF213蛋白的免疫检测产品包括与ZNF213蛋白特异性结合的抗体。

9.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力检测分子标志物的应用，其特征在于：所述治疗三阴性乳腺癌的药物包括ZNF213基因和/或其表达产物的促进剂。