CN104531710A - 三阴乳腺癌标志物col4a2及其应用 - Google Patents
三阴乳腺癌标志物col4a2及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种三阴乳腺癌标志物COL4A2及其应用。发明人通过对不同细胞系进行比较研究，在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发现一个特异表达的基因COL4A2，发明人进一步设计合成干扰COL4A2基因表达的序列并将其分别构建到质粒载体上，转染细胞MDA-MB-231，成功获得高效干扰COL4A2基因表达的序列。本发明提供的三阴乳腺癌标志物基因及高效干扰标志物基因的siRNA具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域，具体涉及一种三阴乳腺癌标志物COL4A2及其在三阴乳腺癌诊断中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性中最常见且致死率最高的恶性肿瘤。全球每年有将近130万女性患上乳腺癌，并且有超过40万女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。不同类型的乳腺癌可具有显著不同的生物学特性与临床表现。因此，对患者的乳腺癌进行分类已成为用于确定治疗方案的重要组成部分。目前临床上主要应用免疫组织化学方法，根据雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesteronereceptor，PR)和HER-2的检测结果，将乳腺癌分为4种分子亚型：luminal A型(ER阳性或PR阳性，HER-2阴性，Ki67低表达)、luminal B型(ER阳性或PR阳性，HER-2也阳性)、HER-2过表达型(ER、PR阴性，HER-2阳性，Ki67多为高表达)和basal-like型(ER、PR、HER-2均阴性)。
乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型，称为三阴性乳腺癌，以雌激素受体(ER)阴性/黄体激素受体(PR)阴性/表皮生长因子受体(HER2)阴性为特征，三阴乳腺癌中有80-90％属于basal-like型。其发病率约占乳腺癌中的17％～25％，由于缺乏抗雌激素和抗HER2靶向治疗的靶标，以及极高的概率发生转移复发，是预后最差的一种乳腺癌类型。所以对三阴性乳腺癌需要尽早发现尽早治疗，越早发现治愈率将大大提高。然而，目前对三阴乳腺癌标志物的研究很少，本发明的目的在于发现新的三阴乳腺癌标志物。
发明人通过对不同细胞系进行比较研究，在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发现一个特异表达的基因COL4A2，发明人进一步设计合成干扰COL4A2基因表达的序列并将其分别构建到质粒载体上，转染细胞MDA-MB-231，成功获得高效干扰COL4A2基因表达的序列。本发明提供的三阴乳腺癌标志物基因及高效干扰标志物基因的siRNA具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种三阴乳腺癌标志物COL4A2基因，所述标志物基因在三阴乳腺癌细胞系高表达。
发明从MDA-MB-231、MCF-7、BT-474、SK-BR-3这4个细胞系中检测COL4A2基因的表达情况，发现COL4A2基因的mRNA在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达，而其他三个乳腺癌细胞系相对表达较少。进一步的Western blot检测结果也显示COL4A2蛋白在MDA-MB-231细胞系中的表达明显高于其他3个细胞系。
本发明的目的是提供高效干扰三阴乳腺癌细胞中COL4A2表达的siRNA。所述siRNA序列见SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 6。优选siRNA序列为SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6。
本发明的目的还包括提供一种高效干扰三阴乳腺癌细胞中COL4A2表达的干扰质粒载体，所述质粒载体包括上述siRNA。优选将siRNA构建到质粒载体pGenesil-1上形成干扰质粒载体。更优选的，siRNA序列为SEQ ID NO 5或SEQID NO 6。
本发明的目的还在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的siRNA分子，或者包含上述干扰质粒载体。优选的，所述药物组合物包含序列为SEQ ID NO 5的siRNA分子或者包含序列为SEQ ID NO 6的干扰质粒载体。
发明人根据GenBank数据库中COL4A2(Gene ID：1284)基因序列设计了6条干扰序列及1条阴性对照序列，并将其分别以酶切连接的方式构建到质粒载体pGenesil-1上，将构建好的质粒载体分别转染细胞系MDA-MB-231，结果显示有3条质粒载体干扰效率都在60％以上，最高达69.61％，可以有效沉默COL4A2基因mRNA的表达。
本发明的目的是提供一种三阴乳腺癌检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物、内参引物、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO 14，下游引物序列为SEQ ID NO15。
进一步，本发明的目的在于提供上述检测试剂盒在制备三阴乳腺癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。
本发明的目的还在于提供三阴乳腺癌标志物COL4A2基因在制备检测三阴乳腺癌试剂或治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
进一步，本发明的目的还在于提供上述的siRNA分子或干扰质粒载体或药物组合物在制备治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
附图说明
图1 各组细胞COL4A2基因的mRNA的相对表达水平
图2 COL4A2干扰质粒干扰效率
图3 干扰载体对细胞COL4A2蛋白表达的影响
图4 干扰处理后COL4A2蛋白干扰效率
具体实施方式
实施例1 Real-time PCR检测各乳腺癌细胞中COL4A2基因mRNA表达
一、实验材料：
各个细胞及其培养基：
(1)MDA-MB-231：L15+10％FBS
(2)MCF-7：DMEM-H+10％FBS+0.01mg/ml胰岛素
(3)BT-474：RPMI1640++10％FBS+0.01mg/ml胰岛素
(4)SK-BR-3：RPMI1640++10％FBS
二、实验方法：
2.1细胞总RNA提取：
收集转染后培养细胞约1×106个，用PBS洗2次；将1ml预冷的TRNzol加到离心管中，混匀后，室温放置10min，4℃，10000rpm离心10min，取上清，移至新的离心管；加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃，10000rpm离心10min，取上层无色水相，移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置15min；4℃，10000rpm离心10min，去上清，加入1ml75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀；4℃，5000rpm离心3min，去上清，室温晾干，加入30μlRNase-free水溶解沉淀。
2.2提取RNA鉴定及检测：
提取的RNA 50倍稀释后检测OD260、OD280，根据1 OD260＝40μg/mL计算RNA的含量；根据OD260/OD280的值评价RNA纯度，比值在1.8-2.0范围说明RNA的纯度较好，同时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。提取的RNA-70℃保存。
2.3反转录：
以已经提取的细胞总RNA为模板，使用Takara反转录试剂盒进行cDNA的合成。根据RNA浓度，取0.5μgRNA进行反转录操作。其余产物-20℃保存。
2.4 Realtime PCR：
设计并制备COL4A2(扩增长度263bp)及beta-actin(扩增长度：318bp)扩增引物，按下述反应体系和反应条件进行PCR扩增反应；反应结束后，收集溶解曲线：从56℃开始，每升高0.5℃反应30s，直至95℃结束。
表1 Realtime PCR反应引物
| 序列编号 | 引物 | 引物序列 |
| SEQ ID NO 14 | COL4A2-F | GGGTGGCGGAGTTTGTG |
| SEQ ID NO 15 | COL4A2-R | ATGTGCGTGCGGATGAG |
| SEQ ID NO 16 | β-actin-F | ATCATGTTTGAGACCTTCAACA |
| SEQ ID NO 17 | β-actin-R | CATCTCTTGCTCGAAGTCCA |
表2 Real time PCR反应体系
| 体系组分 | 体积/μl |
| 10×PCR Buffer | 2.5 |
| Taq酶 | 1.0 |
| SYBRGeen I | 1.0 |
| dNTP | 1.0 |
| 引物F | 0.5 |
| 引物R | 0.5 |
| cDNA模板 | 1.0 |
| ddH2O | 补平至25 |
表3 Realtime PCR反应条件
三、结果分析
以β-actin为内参校正，所有数值与内参进行比较；分析结果如表4所示。可以看出COL4A2基因的mRNA在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231表达最高，其它三个乳腺癌细胞系相对表达都较少。
表4 各组细胞COL4A2的mRNA的相对表达水平
实施例2 Western blot检测各乳腺癌细胞中COL4A2蛋白表达
一、实验方法
1.1目的蛋白提取：
细胞培养结束后，倒掉培养板中细胞培养液，4℃预冷的0.9％NaCl洗涤2遍，吸干NaCl，将细胞培养板于冰上放置。每孔加入预加蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液100μl，冰上裂解细胞3min。细胞刮刀刮取裂解细胞，转移细胞裂解液至冰上预冷的1.5mlEP管中，4℃12000rpm离心20min。转移离心后，将上清液至一新的预冷的1.5mlEP管中，测定蛋白浓度。
1.2蛋白浓度测定：
根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。取10μl标准品用PBS稀释至100μl(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20μl。各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30分钟。冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
1.3蛋白样品制备：
根据实际测定的蛋白浓度，用RIPA裂解液将各组蛋白稀释至统一浓度。每管加入含10％β-巯基乙醇的5×loading buffer，混匀。100℃水浴锅煮沸15min变性，-20℃冰箱低温保存。
1.4浓缩胶制备：
清洗玻璃板，取1.0mm厚板安装至制胶架。按下表制备5％的浓缩胶，室温放置30min凝固。
表5 WB检测浓缩胶制备体系
| 成分 | 体积(ml) |
| ddH2O | 2.700 |
| 30％Acr-Bis(29∶1) | 0.670 |
| 1 M Tris，pH8.8 | 0.500 |
| 10％SDS | 0.040 |
| 10％过硫酸铵 | 0.040 |
| TEMED | 0.004 |
1.5分离胶制备：
按下表制备12％的分离胶，室温放置30min凝固。
表6 WB检测分离胶制备体系
| 成分 | 体积(ml) |
| ddH2O | 2.000 |
| 30％Acr-Bis(29∶1) | 4.000 |
| 1.5M Tris，pH6.8 | 3.800 |
| 10％SDS | 0.100 |
| 10％过硫酸铵 | 0.100 |
| TEMED | 0.004 |
1.6 SDS-PAGE电泳：
加入1×Tris-甘氨酸电泳液，电泳液至少要漫过内侧小玻璃板，取下梳子，安装好电泳槽，倒入缓冲液，微量加样器加样，25μl/孔。每孔加样前需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，避免交叉污染。恒压60V进行浓缩胶分离，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳。
1.7转膜：
配制含20％甲醇的1×转印缓冲液，4℃预冷。转印用滤纸和硝酸纤维素膜在预冷的1×转印缓冲液中预先浸泡5min。卸胶，按由黑到白，由胶到膜的顺序将电泳后的凝胶转入转印芯。装置后的转印系统冰上恒压60V转印3h。
1.8抗体孵育：
5％脱脂奶粉室温封闭1h。加入一抗(COL4A2抗体1∶500稀释，Her2抗体按1∶1000稀释)，4℃孵育过夜。一抗孵育结束，1×TBST洗涤5次，每次8min。加入二抗(HRP-GAR、HRP-GAM，1∶2500稀释)，室温孵育1h；二抗孵育结束，1×TBST洗涤8次，每次6min。
1.9显色：
将ECL发光液A液和B液按1∶1比例混合，均匀地滴于膜正面；KODAK凝胶成像分析系统曝光。
二、实验结果：
各细胞系COL4A2蛋白表达情况，结果如表7所示，结果表明，COL4A2在MDA-MB-231中表达最高，其它3个细胞中表达较少。
表7 COL4A2蛋白在各细胞系中的表达情况
实施例3干扰质粒的构建
3.1 COL4A2基因干扰序列设计及合成
根据GenBank中COL4A2(Gene ID：1284)基因序列，设计6条干扰序列及1条阴性对照序列，干扰序列及命名如表8所示：
表8 干扰序列的设计
| 序列编号 | 序列命名 | 序列 |
| SEQ ID NO 1 | Si-1 | GGGTGTGAAGAAGTTTGAT |
| SEQ ID NO 2 | Si-2 | GCCTTATGCACTGCCTAAA |
| SEQ ID NO 3 | Si-3 | GGGGTGAACCTGGAGAGCC |
| SEQ ID NO 4 | Si-4 | GCCAAGACCAAGGAGAATG |
| SEQ ID NO 5 | Si-5 | GGAATGCAGATGTACAGAA |
| SEQ ID NO 6 | Si-6 | GGCAACAGAGGACTTGGTT |
| SEQ ID NO 7 | Neg | GCAGATAGGTAGGCGTTAT |
3.2 COL4A2干扰序列引物设计
引物带有5’端带有HindIII酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，具体见序列表SEQ ID NO 8-13。
3.3引物退火
(1)、引物合成之后，加水溶解至10μM；根据以下体系和条件进行引物退火；
表9 引物退火反应体系
| 体系组分 | 体积/μl |
| 10xPCR buffer | 5 |
| 上游引物F | 10 |
| 下游引物R | 10 |
| ddH2O | Add to 50 |
表10 引物退火反应条件
| 反应温度/℃ | 反应时间/min |
| 94 | 5 |
| 72 | 5 |
| 64 | 2 |
| 58 | 2 |
| 54 | 2 |
(2)、反应结束，缓慢冷却至室温；加入150μl无水乙醇，-20℃沉淀20min；
(3)、12,000rpm离心5min；去上清，室温静置10min，使乙醇彻底挥发完全。
(4)、加入30μl灭菌双蒸水，混匀，取3μl电泳检测。
3.4 COL4A2干扰质粒构建
酶切反应：按如下体系使用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pGenesil-1；酶切体系置37℃水浴反应4h。
表11 pGenesil-1双酶切体系
| 体系组分 | 体积/μl |
| 10xbuffer 2 | 5 |
| HindIII | 1 |
| BamHI | 1 |
| 100×BSA | 0.5 |
| pGenesil-1载体 | 3μg |
| ddH2O | 补平至50 |
3.5酶切载体回收
酶切反应结束，反应体系行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切取目的片断；加入回收试剂溶液A 300μl/0.1g，60℃水浴至胶完全溶化；加入50μl回收试剂溶液B，混匀；将溶液置于离心柱中，静置5min，12000rpm，1min，弃液体；加入500μl80％乙醇，12000rpm，离心1min，弃液体，重复一次；12000rpm，离心5min，甩干余液，弃液体，晾干5-10min；将离心柱置于新的离心管中，加入30μl灭菌双蒸水，静置10min；12000rpm，离心3min，管底即为所纯化目的产物，2μl电泳检测。
3.6连接反应
根据表6连接反应体系，16℃水浴连接6h，将干扰序列连接到pGenesil-1载体。
表12 连接反应体系
| 体系组分 | 体积/μl |
| 酶切载体 | 3 |
| 退火片段 | 2 |
| T4 DNA ligase | 1 |
| 10x buffer | 1 |
| ddH2O | 补平至10 |
3.7转化反应
取连接产物加入到100μl DH5α感受态细胞中，冰浴静置30min；42℃，90s，即刻冰浴2min；加入800μl LB培养基，150rpm，37℃培养1h；离心4000rpm，3min，吸弃800μl上清；重悬细胞，涂于Kan+LB培养板上，37℃培养过夜。
3.8菌落PCR检测
挑取单菌落，进行PCR鉴定；扩增引物为pGenesil-1载体引物U6和pCMV-R，反应结束，取5μl进行电泳检测。
3.9干扰质粒测序检测
阳性质粒送测序公司进行测序，引物为pGenesil-1载体引物U6；测序结果用BioEdit比对，测序结果显示，确定为目的序列片段，载体构建成功。
实施例4 干扰质粒载体的转染
将阴性对照(Neg)与6条干扰基因(Si-1～Si-6)的载体质粒分别转染到MDA-MB-231细胞中。具体操作如下：转染前一天，以合适的细胞密度接种到6cm培养皿中。转染时，细胞要达到90％的融合度；转染前每个孔弃调旧的培养基，加入5ml不含双抗5％FBS的培养基；500μl opti-MEM加8μg/种质粒，500μlopti-MEM加20μl lip2000(invitrogen)，室温下静止5min；将质粒和lip2000轻轻混匀，室温下置20min；将质粒和lip2000的混合液轻轻滴加到每个孔中，摇动培养板混匀；在37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养6小时；6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2培养箱中培养48～72h，荧光显微镜下观察转染水平。
实施例5 干扰质粒干扰效率检测
为鉴定并筛选高效COL4A2干扰质粒，分别通过Real-time PCR和Westernblot方法对转染细胞COL4A2 mRNA和蛋白表达水平进行检测。
5.1 Real-time PCR检测干扰效率
具体实验步骤参照实施例1，分析结果如表13所示，以β-actin为内参校正，所有数值与内参进行比较；从表中可以看出，干扰3(Si-3)和干扰5(Si-5)和6(Si-6)能有效沉默COL4A2基因mRNA的表达(图1)，干扰效率(图2)分别达到60.86％(P＝0.0005 vsNC)、69.61％(P＝0.0006 vs NC)和65.67(P＝0.0003vs NC)。
表13 各组细胞COL4A2基因的mRNA的相对表达水平
5.2 Western Blot检测干扰效率
曝光结果如图3所示，结果表明，除干扰载体si-1外，其它构建的干扰载体均能显著降低转染后MDA-MB-231细胞COL4A2的蛋白表达水平(见表14)，尤其Si-5与Si-6干扰效果较好，效率最高(见图4)。
表14 各组细胞COL4A2的蛋白的相对表达水平
本发明筛选了不同的乳腺癌细胞系，在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发现一个特异表达的基因COL4A2，进而设计合成7条干扰COL4A2基因表达的序列并将其分别构建到质粒载体pGenesil-1上，转染细胞MDA-MB-231，成功筛选到2条高效COL4A2干扰序列Si-5、Si-6。
Claims (10)
1.COL4A2基因或COL4A2蛋白在制备三阴乳腺癌标志物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，COL4A2基因的mRNA或COL4A2蛋白在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达。
3.一种干扰三阴乳腺癌细胞中COL4A2基因表达的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子选自序列表SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 6序列中的任意一种或几种。
4.根据权利要求3所述的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子为SEQ IDNO 5或SEQ ID NO 6。
5.一种干扰三阴乳腺癌细胞中COL4A2基因表达的干扰质粒载体，其特征在于，所述干扰质粒载体包括权利要求3或4中的siRNA。
6.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物，包含权利要求3-4所述的siRNA分子，或者包含权利要求5所述干扰质粒载体。
7.一种三阴乳腺癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游检测引物和下游检测引物，上游检测引物序列为SEQ ID NO 14，下游检测引物序列为SEQ ID NO 15。
8.权利要求7所述的三阴乳腺癌检测试剂盒在制备检测三阴乳腺癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。
9.三阴乳腺癌标志物COL4A2基因在制备检测三阴乳腺癌试剂或治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
10.权利要求3-4中任一项所述的siRNA分子或权利要求5所述干扰质粒载体或权利要求6所述的药物组合物在制备治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
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