CN108949984B

CN108949984B - 基因desi2在三阴乳腺癌诊断、预后评估及治疗中的应用

Info

Publication number: CN108949984B
Application number: CN201810824478.4A
Authority: CN
Inventors: 宋立兵; 李隽�; 林楚勇; 叶丽平; 刘清华; 汪梦
Original assignee: Guangzhou Jieerke Biotechnology Co ltd; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Guangzhou Jieerke Biotechnology Co ltd; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN108949984A

Abstract

本发明公开了DESI2在三阴乳腺癌诊断、预后评估及治疗中的应用。本发明发现基因的表达水平与乳腺癌的预后密切相关，这提示了DESI2不仅具有成为乳腺癌辅助诊断标记物的潜能，还可以通过其表达水平变化来进行预后评估。此外，体内外实验还证明沉默DESI2基因的表达水平能显著抑制乳腺癌的侵袭、转移能力。提供了DESI2基因的一条靶向DESI2基因的反义寡核苷酸链可用于制备治疗乳腺癌疾病的药剂。说明本发明DESI2基因可为乳腺癌患者观察、监测以及用于预后评估等，具有客观性和准确性等优点，可用于临床指导，实现乳腺癌的个体化治疗。

Description

基因DESI2在三阴乳腺癌诊断、预后评估及治疗中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤药物领域，涉及基因DESI2在乳腺癌诊断、治疗及预后评估中的应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中致死率居首位，大量女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。由于乳腺癌的高度异质性，导致了乳腺癌患者在临床表现、治疗反应性和预后等方面存在显著差异。

近年来，乳腺癌分子亚型概念的提出，对于临床个体化治疗的指导和预后的判断可以起到重要作用。细胞内多种蛋白的周转率、活性、再生以及定位，都与肿瘤的发生与演进密切相关，其功能异常与包括肿瘤在内的多种疾病的发生密切相关。肿瘤是一类细胞周期性疾病，许多癌基因、抑癌基因直接参与细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控机制的主要成分。因此，明确乳腺癌患者分子亚型不仅为乳腺癌个体化治疗方案提供支持，也为研究乳腺癌分子机制提供了科学依据。

乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型，称为三阴性乳腺癌，是以雌激素受体（ER）阴性/黄体激素受体（PR）阴性/表皮生长因子受体（HER2）阴性为特征，三阴乳腺癌中有80-90%属于basal-like 型，其发病率约占乳腺癌中的17%~25%。由于其缺乏抗雌激素和抗HER2靶向治疗的靶标，以及有极高的概率会发生转移复发，它是预后最差的一种乳腺癌类型。因此对三阴乳腺癌需要尽早发现尽早治疗，越早发现治愈率将大大提高。然而，目前临床上并没有特异诊断、治疗、预后乳腺癌的分子标志物。

发明内容

本发明目的之一在于提供定量检测DESI 2基因的试剂在制备诊断、预后评估三阴乳腺癌的产品中的应用。

本发明另一目的在于提供抑制DESI 2表达的试剂在制备治疗或辅助治疗三阴乳腺癌的产品中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

定量检测DESI 2的试剂在制备乳腺癌检测、辅助检测、或/和乳腺癌预后评估的产品中的应用。

进一步的，所述定量检测DESI 2的试剂选自定量检测DESI 2的RNA转录水平的试剂、定量检测DESI 2的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。

进一步的，所述定量检测DESI 2的RNA转录水平的试剂选自定量检测DESI 2的引物。

进一步的，所述定量检测DESI 2的引物为：

DESI2-QF：CCTTCAGCAACGAAGTGGCACA（SEQ ID NO：1）；

DESI2-QR：GGATCTGAATGGAGTCCAGGAG（SEQ ID NO：2）。

进一步的，所述的乳腺癌为三阴乳腺癌。

抑制DESI 2表达的试剂在制备治疗或辅助治疗乳腺癌的产品中的应用。

进一步的，所述抑制DESI 2表达的试剂选自抑制DESI 2 RNA转录的试剂、或抑制DESI 2蛋白表达的试剂中的至少一种。

进一步的，所述抑制DESI 2表达的试剂选自沉默DESI 2表达的siRNA、沉默DESI 2表达的shRNA、沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链中的至少一种。

进一步的，所述沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链选自以下至少一种：

DESI2-AON#1序列: GCGAGGAATCTCTTTC（SEQ ID NO ：5）;

DESI2-AON#2序列：CGGAGGCCGCTCTCAC（SEQ ID NO ：6）;

DESI2-AON#4序列：CTGAATGAAAAACTCC（SEQ ID NO ：8）;

DESI2-AON#5序列：GGAGCTGAAGTAGGCA（SEQ ID NO ：9）。

进一步的，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。

本发明的有益效果是：

本发明发现了DESI2基因表达与三阴乳腺癌密切相关，而且从生存分析中发现DESI2基因的表达水平与乳腺癌的预后密切相关，这提示了DESI2不仅具有成为乳腺癌辅助诊断标记物的潜能，还可以通过其表达水平变化来进行预后评估。此外，体内外实验还证明沉默DESI2基因的表达水平能显著抑制乳腺癌的侵袭、转移能力。提供了DESI2基因的一条靶向DESI2基因的反义寡核苷酸链可用于制备治疗乳腺癌疾病的药剂。说明本发明DESI2基因可为乳腺癌患者观察、监测以及用于预后评估等，具有客观性和准确性等优点。

附图说明

图1 为DESI2基因在乳腺癌中表达量差异的箱形图；图1的A和B对TCGA(TheCancer Genome Atlas)数据库中的数据分析得出，在600例非三阴乳腺癌组织（non-TNBC）以及115例三阴乳腺癌肿瘤组织（TNBC）中，三阴乳腺癌的DESI2的mRNA表达水平显著高于非三阴乳腺癌，且在分子亚型中basal-like(简称BL)亚型中尤为显著；图1的C对METABRIC数据库分析得出ER-HER2-（雌激素受体阴性、人表皮生长因子受体2阴性）的DESI2表达水平显著升高；图1的D对GOBO数据库中分析得出乳腺癌组织中basal亚型的DESI2的表达水平高于其它亚型；图1的E为 GOBO数据库中在乳腺癌的细胞系中相对于非basal亚型乳腺癌细胞系，DESI2基因在basal亚型乳腺癌细胞系中表达水平较高；(注：ER:雌激素受体；PR：孕激素受体；HER2：人表皮生长因子受体2；KI67：增殖细胞相关的核抗原；ER-HER2-KI67-：雌激素受体阴性、孕激素受体阴性、人表皮生长因子受体2阴性、增殖细胞相关的核抗原阴性；ER-HER2-KI67+：雌激素受体阴性、人表皮生长因子受体2阴性、增殖细胞相关的核抗原阳性；乳腺癌的4种分子亚型：LuA：luminal A型（LuA），luminal B型（LuB），HER-2过表达型（Her2），basal-like型（BL）； NL：normal-like)。

图2 为DESI2基因的mRNA相对表达的柱状图：图2的A为相对于非三阴乳腺癌（non-TNBC）细胞系，DESI2 mRNA表达水平在三阴乳腺癌（TNBC）细胞系较高；图2的B为相对于非三阴乳腺癌（non-TNBC）肿瘤组织，DESI2 mRNA表达水平在三阴乳腺癌（TNBC）肿瘤组织较高；

图3为DESI2基因的蛋白高表达水平与乳腺癌差的预后相关；图3的A为DESI2染色阳性率在三阴乳腺癌中相对较高；图3的B为DESI2染色强度大于6分以上为高表达，低于6分的为DESI2低表达；图3的C为相对于无转移的乳腺癌患者（Met-），在所有有转移的乳腺癌患者（Met+）中，三阴乳腺癌患者（TNBC patients）发生肿瘤转移比例较大，且其DESI2高表达患者发生肿瘤转移较大；图3的D为所有乳腺癌患者中，DESI2高表达（DESI2 High）患者较DESI2低表达（DESI2 Low）患者的无复发生存率（RFS，Relapse-free survival）明显较低；图3的E为三阴乳腺癌患者（TNBC patients）中，DESI2高表达患者较DESI2低表达患者的无复发生存率（RFS，Relapse-free survival）明显较低；图3的F为在所有乳腺癌患者中，DESI2高表达患者较DESI2低表达患者的无复发生存时间较短。

图4的A和B分别为DESI 2基因的mRNA相对表达量柱状图和免疫印迹图，验证筛选出一段最佳的DESI2反义寡核苷酸链序列（DESI2-AON#1）能有效下调DESI2的表达；

图5为DESI2上调和下调表达对乳腺癌侵袭和迁移的影响，其中A、B图为体外试验乳腺癌的划痕实验；C、D图为体外试验乳腺癌的transwell实验，结果显示高表达DESI2能促进乳腺癌细胞侵袭和迁移（A、C图），而下调DESI2（DESI2-AON#1）能抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移（B、D图）；

图6为DESI2对小鼠体内肿瘤转移的作用检测图；其中A图为裸鼠体内肿瘤转移模型实验，DESI2-AON#1显著抑制乳腺癌细胞在肺器官的肿瘤细胞定殖及克隆形成能力；B图为活体荧光成像仪检测各组小鼠体内肿瘤形成情况显示，DESI2-AON#1有效抑制乳腺癌细胞在肺器官的肿瘤细胞定殖及克隆形成能力。

具体实施方式

优选的，所述定量检测DESI 2的试剂选自定量检测DESI 2的RNA转录水平的试剂、定量检测DESI 2的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。

优选的，所述定量检测DESI 2的RNA转录水平的试剂选自定量检测DESI 2的引物或探针。

优选的，所述定量检测DESI 2的引物为：

DESI2-QF：CCTTCAGCAACGAAGTGGCACA（SEQ ID NO：1）；

DESI2-QR：GGATCTGAATGGAGTCCAGGAG（SEQ ID NO：2）。

优选的，所述产品为试剂盒或芯片。

优选的，所述的乳腺癌为三阴乳腺癌。

优选的，所述抑制DESI 2表达的试剂选自抑制DESI 2 RNA转录的试剂、或抑制DESI 2蛋白表达的试剂中的至少一种。

优选的，所述抑制DESI 2表达的试剂选自沉默DESI 2表达的siRNA、沉默DESI 2表达的shRNA、沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链中的至少一种。

优选的，所述沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链选自以下至少一种：

DESI2-AON#1序列: GCGAGGAATCTCTTTC（SEQ ID NO ：5）;

DESI2-AON#2序列：CGGAGGCCGCTCTCAC（SEQ ID NO ：6）;

DESI2-AON#4序列：CTGAATGAAAAACTCC（SEQ ID NO ：8）;

DESI2-AON#5序列：GGAGCTGAAGTAGGCA（SEQ ID NO ：9）。

优选的，所述治疗或辅助治疗乳腺癌包括抑制乳腺癌侵袭、迁移或/和转移。

优选的，所述产品为药剂。

优选的，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。

一种乳腺癌检测、辅助检测、或/和乳腺癌预后评估的产品，所述产品中含有定量检测DESI 2的试剂。

优选的，所述定量检测DESI 2的引物为：

DESI2-QF：CCTTCAGCAACGAAGTGGCACA（SEQ ID NO：1）；

DESI2-QR：GGATCTGAATGGAGTCCAGGAG（SEQ ID NO：2）。

优选的，所述产品为试剂盒或芯片。

优选的，所述的乳腺癌为三阴乳腺癌。

一种治疗或辅助治疗乳腺癌的产品，所述产品中含有抑制DESI 2表达的试剂。

DESI2-AON#1序列: GCGAGGAATCTCTTTC（SEQ ID NO ：5）;

DESI2-AON#2序列：CGGAGGCCGCTCTCAC（SEQ ID NO ：6）;

DESI2-AON#4序列：CTGAATGAAAAACTCC（SEQ ID NO ：8）;

DESI2-AON#5序列：GGAGCTGAAGTAGGCA（SEQ ID NO ：9）。

优选的，所述产品为药剂。

优选的，所述乳腺癌为三阴乳腺癌。

一种抑制乳腺癌侵袭、迁移或/和转移的产品，所述产品中含有抑制DESI 2表达的试剂。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 DESI2在乳腺癌中表达上调

1.TCGA、METABRIC、GOBO数据库分析

方法:运用SPSS 统计学分析法，分别对TCGA、METABRIC、GOBO数据库中乳腺癌组织的mRNA水平进行整合分析。统计学分析用 SPSS20.0 统计软件进行处理。

结果：从整合的临床组织样品TCGA数据中，可以明确三阴乳腺癌肿瘤组织的DESI2基因RNA水平高于非三阴肿瘤组织（图1的A），且在分子亚型中basal-like亚型（BL）中尤为显著（图1的B），而其他乳腺癌肿瘤组织相对表达较低；从METABRIC数据库中整合的临床组织样品显示，ER-HER2-亚型乳腺癌的DESI2表达水平相对表达水平较高(图1的C)；从GOBO数据库中整合的乳腺癌临床组织样品和乳腺癌细胞系显示，basal亚型乳腺癌临床组织和basal亚型乳腺癌细胞系相对表达水平较高（图1的D和E）。

分析：SPSS统计分析结果表明，TCGGA、METABRIC、GOBO数据资料中的三阴乳腺癌患者肿瘤组织和三阴乳腺癌细胞系中的DESI2的表达明显高于其他的非三阴乳腺癌组织和其他细胞系（P<0.05）,在乳腺癌中检测到DESI2高表达更能确诊为乳腺癌。TCGGA、METABRIC、GOBO数据库资料分析提示DESI2可作为辅助诊断的指标。

2.qRT-PCR检测乳腺癌组织中DESI2基因的mRNA水平

本发明使用qRT-PCR对乳腺癌组织中的DESI2进行验证。

方法：

（1）乳腺癌组织来源：从中山大学肿瘤防治中心收集11例乳腺癌患者肿瘤组织，其中包括4例非三阴乳腺癌组织（non-TNBC）和7例三阴乳腺癌组织（TNBC）。

（2）细胞系和细胞培养：14株乳腺癌细胞系：T47D、MDAMB-415、MCF-7、MDAMB-453、ZR-75-1、SK-BR-3、MCF10A、HCC1806、HCC1937、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、SUM159PT、BT-20。将细胞培养于含有10%FBS的DMEM(Dulbecco's Minimum Essential Medium，Invitrogen，Carlsbad，USA)培养基中，放置37℃的5% CO2培养箱。

（3）实时荧光定量PCR：收集上述组织和14种细胞，分别利用Trizol提取RNA，使用MMLV反转录酶(Promega )进行反转录合成cDNA，使用2× SYBR mix (Roche)对各组细胞中的 DESI2的表达水平进行qRT-PCR检测。

以GAPDH做内参。所用qRT-PCR引物为：

DESI2-QF：CCTTCAGCAACGAAGTGGCACA（SEQ ID NO：1）；

DESI2-QR：GGATCTGAATGGAGTCCAGGAG（SEQ ID NO：2）；

GAPDH-QF：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC（SEQ ID NO：3）；

GAPDH-QR：TGGTGAAGACGCCAGTGGA（SEQ ID NO：4）；

将每个样本获得的DESI2基因的Ct值减去其内参基因GAPDH的Ct值得到△ Ct，结果用2^-△△Ct表示。

结果：

定量PCR结果显示，三阴乳腺癌（TNBC）肿瘤组织的DESI2的mRNA表达水平明显高于非三阴乳腺癌（non-TNBC）肿瘤组织（图2的A）；相对于非三阴乳腺癌细胞（T47D、MDAMB-415、MCF-7、MDAMB-453、ZR-75-1、SK-BR-3），DESI2基因在三阴乳腺癌细胞系（MCF10A、HCC1937、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、SUM159PT、BT-20）显著高表达（图2的B）。

上述结果说明，在三阴乳腺癌病人（TNBC patients）的肿瘤组织和三阴乳腺癌细胞系中DESI2高表达；因此，用本发明的诊断试剂盒检测到临床样本中DESI2高表达，更能确诊为该组织样本为三阴乳腺癌(TNBC)。临床样本的分析提示DESI2可作为辅助诊断的指标。

3.免疫组化检测DESI2基因蛋白在乳腺癌组织切片中的表达水平

方法：

对选取的338例乳腺癌组织切片，使用DESI2抗体进行免疫组化染色。免疫组化方法为：

（1）60℃烤片1 h 30 min；

（2）脱蜡及复水：二甲苯两缸，每次15min；100%乙醇两次，95%乙醇一次，75%乙醇一次，蒸馏水洗两次，每次各3min；

（3）切片于湿盒内，加3%双氧水，室温25min，蒸馏水洗两次，每次各3min；

（4）柠檬酸盐修复液，高压修复，冒气后3min；

（5）切片在修复液中自然冷却至室温；

（6）1×PBST，3min×3次；

（7）甩干，加A液（非特异性染色阻断剂）于室温，湿盒内15min；

（8）弃封闭液，加一抗；

（9） 1×PBST，3min×3次，甩干；

（10）加B液（生物素羊抗兔/鼠IgG）15min，1×PBST，3min×3次，甩干；

（11）加C液（链霉卵白素）15min，1×PBST，3min×3次；

（12）DAB显色，自来水终止染色；

（13）自来水流水漂洗；

（14）苏木素复染3min，自来水刷洗至无紫色；

（15）95%盐酸酒精分化10~15s，自来水漂洗返蓝45min；

（16）60%乙醇，80%乙醇，100%乙醇脱水2min；

（17）放入二甲苯2min，透明化后，未干时滴加100uL树酯，封片。

结果：

肿瘤细胞比例（以DAB显色为例）的标准:高倍镜（20×）下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定，染色强度评分标准: 不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分；阳性细胞所占比例评分标准: 无阳性细胞者0分，阳性细胞数<10%者1分; 10%～35%者2分，36%～75%者3分，≥75%者4分。两种评分相乘得到分值 SI（Staining Index）：0～1分为Negative; 2～4分为 Weak；6～8分为 Moderate；9～12分为 strong。

根据以上评分得出，DESI2染色在乳腺癌患者呈阳性，高表达DESI2基因（DESI2-H）的乳腺癌患者在三阴乳腺癌中尤为显著（图3的A和B）。

4. DESI2高表达水平与差的预后相关

方法：

所有统计学分析用 SPSS20.0 统计软件进行处理。采用 Kaplan-Meier 方法绘制生存分析曲线，并采用 log-rank 检验方法检测其统计学意义。检验系数P<0.05认为在统计学上有显著性差异。运用 SPSS 统计软件分析 DESI2的表达与肿瘤转移和乳腺癌患者无复发生存率（Relapse-free Survival，RFS）的关系。

结果：

如图 3的C 所示，相对于无转移的乳腺癌患者(Met-)，在所有有转移的乳腺癌患者（Met+）中，三阴乳腺癌患者（TNBC patients）发生肿瘤转移比例较大，且其DESI2高表达患者发生肿瘤转移较大；如图 3的D和E所示，临床选取的338例标本中DESI2高表达（DESI2High）的乳腺癌病人比DESI2低表达（DESI2 Low）的乳腺癌病人的无复发生存率（RFS，Relapse-free survival）明显较低，且在三阴乳腺癌患者（TNBC patients）中DESI2高表达的乳腺癌病人比DESI2低表达的乳腺癌病人的无复发生存率（RFS）较低；根据图3的F显示，高表达的DESI2基因的乳腺癌患者中，其无复发生存时间亦较短。

分析：SPSS统计分析结果显示DESI2高表达与乳腺癌病人无复发生存率负相关（P<0.05），且在有肿瘤转移中DESI2高表达比例较大，DESI2高表达明确指示较差的生存预后。因此，DESI2可作为患者生存预后的潜在指标。

实施例 2：通过靶向DESI2基因的反义寡核苷酸链技术下调DESI2基因的表达

方法：三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较高的DESI2表达水平，因此将其应用于RNA干扰实验。使用靶向DESI2基因的反义寡核苷酸链转染MDA-MB-231细胞，转染试剂使用Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen),按照试剂说明书进行转染。转染后48小时，抽提细胞的RNA和裂解细胞获得蛋白质，运用qRT-PCR方法和免疫印迹法检测基因沉默效果。

结果：5个针对DESI2基因干扰分子被应用于沉默DESI2的表达，从图4的A和B中可知，DESI2-AON#1被证实能够有效地稳定沉默DESI2基因的表达。而本发明所用到5个DESI2-AON2序列分别为：

DESI2-AON#1序列: GCGAGGAATCTCTTTC（SEQ ID NO ：5）

DESI2-AON#2序列：CGGAGGCCGCTCTCAC（SEQ ID NO ：6）

DESI2-AON#3序列：TCCGGATGAGGCACCT（SEQ ID NO ：7）

DESI2-AON#4序列：CTGAATGAAAAACTCC（SEQ ID NO ：8）

DESI2-AON#5序列：GGAGCTGAAGTAGGCA（SEQ ID NO ：9）。

实施例 3：构建稳定高表达 DESI2的细胞系和转染DESI2-AON#1的细胞系。

1.构建稳定的DESI2高表达的细胞株

（1）构建DESI2的表达质粒

使用本发明前部分的引物，扩增DESI2前体的cDNA全长序列，将纯化的DESI2全长序列连接到pLVX-IRES-Hygro-DESI2表达载体（购自Clontech公司），获得含有DESI2序列的过表达质粒pLVX-IRES-Hygro-DESI2，转导到三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549，工作浓度为5nM。使用Western Blot和qRT-PCR方法对表达的蛋白进行验证。

（2）转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549

分别利用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen)和优化的质粒(Invitrogen，K4975-00)将获得的pLVX-IRES-Hygro-DESI2，以及对照的pLVX-IRES-Hygro空载体转入293FT细胞，并于6小时后加入DMEM培养基辅以10％的胎牛血清，总体积共18毫升，并在36小时及60小时后收集慢病毒上清，转导进入三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549细胞。

用Hygro(0.5μg/mL；Sigma-aldrich)筛选10天左右，得到稳定的DESI2高表达的细胞株MDA-MB-231 DESI2和BT549 DESI2，对照细胞株为MDA-MB-231 Vector和 BT549Vector。

（3）培养稳定的高表达DESI2的细胞株

使用辅以10%的胎牛血清的DMEM培养基（Gibco BRL）培养三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549，并在37℃的含5%浓度二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行培养。

（4）验证稳定的高表达DESI2的细胞株

使用Western Blot和qRT-PCR方法对表达的蛋白进行验证。

2.构建DESI2-AON#1低表达的细胞株

（1）构建DESI2-AON#1的表达质粒，分别用阴性对照AON-Vector及可以下调DESI2的DESI2-AON#1处理三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549，工作浓度为5nM。

结果：分别获得对照组细胞MDA-MB-231 AON-Vector，BT549 AON-Vector和沉默DESI2的细胞MDA-MB-231 DESI2-AON#1、BT549 DESI2-AON#1。

实施例4：DESI2促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移和转移

1.体外实验：划痕实验

方法:先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，道与道之间大约隔0.5～1cm，并横穿过孔，每孔至少穿过3条线。在孔中加入约5×10⁵个细胞，过夜。第二天用枪头比着直尺，枪头要垂直不能倾斜，尽量垂直于背后的横线划痕。细胞用PBS洗3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃ 5%CO₂培养箱培养。0小时和24小时分别取样并拍照。

结果：如图5的A图所示，和空载体对照细胞相比，DESI2的高表达对于乳腺癌细胞的迁移有显著的促进作用；图5的B图显示，DESI2的下调表达对于乳腺癌细胞的迁移有显著的抑制作用。

2.体外实验：transwell实验

方法：消化细胞，用基础培养基稀释细胞浓度至2×10⁵个/mL，于24孔板中加入500uL 辅以20%的胎牛血清的DMEM培养基，transwell小室中加入200uL细胞悬液。放入37℃5%CO₂培养箱培养。24h后，用PBS洗小室；固定，经10%甲醛固定5分钟，再用1%的结晶紫染色30s，用自来水清洗，用棉签轻轻擦拭小室里的细胞，晾干，拍照。

结果：如图5的C图所示，和空载体对照细胞相比，DESI2的高表达对于乳腺癌细胞的侵袭有显著的促进作用；图5的D图显示，DESI2的下调表达对于乳腺癌细胞的侵袭有显著的抑制作用。

3.体内实验：小鼠体内肿瘤转移模型

方法：通过尾静脉向小鼠体内注射2×10⁵个MDA-MB-231或BT549细胞。3 天后将小鼠分成两组（n = 10），分别向小鼠腹腔注射DESI2-AON#1或sramble阴性对照。3天/次，每次注射100μL，浓度为2mg/ml。监测注射后35天内肺内转移肿瘤结节的形成情况。

结果：图6的A和B结果显示，注射DESI2-AON#1 沉默 DESI2的裸鼠在肺器官中形成的肿瘤的能力明显低于对照组，甚至检测不到肿瘤细胞。采用HE 染色方法发现，注射DESI2-AON#1小鼠在肺器官形成的肿瘤克隆数、肿瘤大小和结节数明显低于对照组，部分小鼠没有发现肿瘤结节（图6 A）。图6的B的活体荧光成像仪检测的结果显示，尾静脉注射DESI2-AON#1沉默 DESI2的小鼠在肺器官中形成的肿瘤的能力明显低于对照组，甚至检测不到肿瘤细胞。

分析：用DESI2-AON#1处理后降低乳腺癌细胞在肺器官肿瘤形成能力。结果还表明DESI2-AON#1具有抑制乳腺癌细胞转移的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

广州杰尔克生物技术有限公司

<120> 基因DESI2在三阴乳腺癌诊断、预后评估及治疗中的应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttcagcaa cgaagtggca ca 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatctgaat ggagtccagg ag 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggtgaagac gccagtgga 19

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgaggaatc tctttc 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggaggccgc tctcac 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccggatgag gcacct 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgaatgaaa aactcc 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggagctgaag taggca 16

Claims

1.抑制DESI 2表达的试剂在制备治疗或辅助治疗三阴乳腺癌的产品中的应用，所述抑制DESI 2表达的试剂为沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链，所述沉默DESI 2表达的反义寡核苷酸链为：DESI2-AON#1序列: GCGAGGAATCTCTTTC。