KR20160110104A - 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 바이오마커 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 바이오마커 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 신규 바이오마커 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 효과적인 진단을 가능하게 하고, 더 나아가 Mel-18 유전자의 발현 증가 또는 Mel-18 단백질의 투여에 의해서 종래 삼중-음성 유방암을 포함한 항호르몬제 내성 유방암에서 호르몬 요법의 치료효능을 획기적으로 개선시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

Description

항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 바이오마커 및 이를 포함하는 조성물 {Biomarker for diagnosis and treatment of antiestrogen-resistant or triple negative breast cancer and composition comprising the same}
본 발명은 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 신규 바이오마커 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
ESR1에 의해서 암호화되는 호르몬-의존적 핵 수용체인 에스트로겐 수용체(ER)-α는 유방암 예후와 유방암 서브타입의 분류에 사용되는 가장 흔한 임상 마커이다. 유방암의 대략 30%는 ER-α를 발현하지 않는데, 이는 항-에스트로겐 요법에 대해 내성인 공격적 표현형, 및 불량한 예후와 관련된다 (Ali S, and Coombes RC. Estrogen receptor alpha in human breast cancer: occurrence and significance. J Mammary Gland Biol Neoplasia.2000;5(3):271-81).
이들 ER-α-음성 세포에서, ER-α 및 프로게스테론 수용체 (PR, PGR에 의해서 암호화됨) 발현 그리고 표피 성장인자 수용체 2 (HER2) 과발현을 결여한 삼중-음성 유방암 (Triple-negative breast cancer, TNBC)은 종래의 호르몬 및 HER2-기반 치료로부터 치료 효과를 볼 수 없으며, TNBC의 분자 기전도 잘 이해되지 않고 있다. ESR1 발현은 히스티딘 변형 및 DNA 메틸화를 비롯한 몇몇 후성적 인자 (epigenetic factors)에 의해서 가역적으로 조절될 수 있기 때문에 (Giacinti L, Claudio PP, Lopez M, and Giordano A. Epigenetic information and estrogen receptor alpha expression in breast cancer. Oncologist. 2006;11(1):1-8; Keen JC, Yan L, Mack KM, Pettit C, Smith D, Sharma D, and Davidson NE. A novel histone deacetylase inhibitor, scriptaid, enhances expression of functional estrogen receptor alpha (ER) in ER negative human breast cancer cells in combination with 5-aza 2'-deoxycytidine. Breast Cancer Res Treat. 2003;81(3):177-86; Yang X, Phillips DL, Ferguson AT, Nelson WG, Herman JG, and Davidson NE. Synergistic activation of functional estrogen receptor (ER)-alpha by DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibition in human ER-alpha-negative breast cancer cells. Cancer Res. 2001;61(19):7025-9.), 탈메틸화 또는 탈아세틸화 제제를 사용한 ER-α 재발현이 엔도크라인 요법에 대한 ER-α-음성 유방암 및 TNBC의 민감성을 회복시키고자 수행된 바 있다 (Peddi PF, Ellis MJ, and Ma C. Molecular basis of triple negative breast cancer and implications for therapy. International journal of breast cancer. 2012;2012(217185)). 그러나, 현재까지도 유방암에서 ER-α 손실의 기전 및 ESR1 유전자 전사의 조절은 완전히 이해된 바가 없다.
MEL-18은 폴리콤 (polycomb) 억제 복합체 (PRC)-1의 일성분으로서, 이것은 줄기세포 조절과 정상 및 암 세포 발생의 결정적인 후성적 조절인자이다 (Sauvageau M, and Sauvageau G. Polycomb group proteins: multi-faceted regulators of somatic stem cells and cancer. Cell Stem Cell. 2010;7(3):299-313). 추가적인 임상 증거가 필요하지만, 축적된 연구는 MEL-18이 유방암을 비롯한 일부 사람의 종양에서 종양 억제인자로서 작용한다는 점을 시사하고 있다 (Guo WJ, Zeng MS, Yadav A, Song LB, Guo BH, Band V, and Dimri GP. Mel-18 acts as a tumor suppressor by repressing Bmi-1 expression and down-regulating Akt activity in breast cancer cells. Cancer research. 2007;67(11):5083-9; Wang W, Yuasa T, Tsuchiya N, Ma Z, Maita S, Narita S, Kumazawa T, Inoue T, Tsuruta H, Horikawa Y, et al. The novel tumor-suppressor Mel-18 in prostate cancer: its functional polymorphism, expression and clinical significance. International journal of cancer. 2009;125(12):2836-43; Riis ML, Luders T, Nesbakken AJ, Vollan HS, Kristensen V, and Bukholm IR. Expression of BMI-1 and Mel-18 in breast tissue--a diagnostic marker in patients with breast cancer. BMC cancer. 2010;10(686); Guo BH, Zhang X, Zhang HZ, Lin HL, Feng Y, Shao JY, Huang WL, Kung HF, and Zeng MS. Low expression of Mel-18 predicts poor prognosis in patients with breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2010;21(12):2361-9; Zhang XW, Sheng YP, Li Q, Qin W, Lu YW, Cheng YF, Liu BY, Zhang FC, Li J, Dimri GP, et al. BMI1 and Mel-18 oppositely regulate carcinogenesis and progression of gastric cancer. Molecular cancer. 2010;9(40).
본 발명자들도 또한 MEL-18 손실이 유방암에서 줄기세포 활성, 세포 성장, 혈관형성, 및 상피-배엽 변이(EMT)를 촉진한다는 것을 밝힌 바 있는데 (12-15), 이는 MEL-18 손실과 공격적 표현형의 관련성을 시사한다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13; Park JH, Lee JY, Shin DH, Jang KS, Kim HJ, and Kong G. Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1alpha mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway. Oncogene. 2011;30(45):4578-89; Lee JY, Jang KS, Shin DH, Oh MY, Kim HJ, Kim Y, and Kong G. Mel-18 negatively regulates INK4a/ARF-independent cell cycle progression via Akt inactivation in breast cancer. Cancer Res. 2008;68(11):4201-9; Lee JY, Park MK, Park JH, Lee HJ, Shin DH, Kang Y, Lee CH, and Kong G. Loss of the polycomb protein Mel-18 enhances the epithelial-mesenchymal transition by ZEB1 and ZEB2 expression through the downregulation of miR-205 in breast cancer. Oncogene. 2014;33(10):1325-35).
MEL-18은 표적 단백질의 다수의 번역-후 변형과 후성적 유전자 조절에 연루된다. 유비퀴틴 E3 리가아제 RING1B를 함유하는 PRC-1은 히스톤 H2A 유비퀴틴화-매개 유전자 침묵화 및 유비퀴틴-프로테오솜-매개 단백질 분해를 모두 조절한다. 본 발명자들 역시 MEL-18이 BMI-1 전사를 억제함으로써 RING1B 활성을 음성적으로 조절한다는 것을 증명한 바 있다 (Qian T, Lee JY, Park JH, Kim HJ, and Kong G. Id1 enhances RING1b E3 ubiquitin ligase activity through the Mel-18/Bmi-1 polycomb group complex. Oncogene. 2010;29(43):5818-27). 또한, MEL-18은 SUMO화의 저해인자로서 작용하는 것으로도 알려져 있지만 (Zhang J, Goodson ML, Hong Y, and Sarge KD. MEL-18 interacts with HSF2 and the SUMO E2 UBC9 to inhibit HSF2 sumoylation. The Journal of biological chemistry. 2008;283(12):7464-9; Zhang J, and Sarge KD. Mel-18 interacts with RanGAP1 and inhibits its sumoylation. Biochemical and biophysical research communications. 2008;375(2):252-5), SUMO화에서 MEL-18의 중요성은 현재까지도 불분명한 상태로 남아있다.
따라서, 종래 어떠한 문헌에서도, Mel-18과 삼중-음성 유방암을 포함하는 항호르몬제 내성 유방암 사이의 관계에 대해서 보고한 바가 없으며, 더 나아가 Mel-18을 사용하여 종래 유방암의 치료 효능을 향상시키고자 한 바는 더더욱 보고된 바가 없다.
따라서, 본 발명에서는 Mel-18 유전자 및 단백질을 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 효과적인 진단을 위한 바이오마커로 제공하고자 하였으며, 더 나아가 그 발현을 증가시킴으로써 종래 유방암의 치료에 활용되는 호르몬 요법의 치료효능을 획기적으로 증가시키고자 하였다.
본 발명의 상기 과제를 해결하기 위해서,
Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 Mel-18 유전자의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열일 수 있다.
1 atgcatcgga ctacacggat caaaatcaca gagctgaacc cccacctcat gtgtgccctc
61 tgcggggggt acttcatcga cgccaccact atcgtggagt gcctgcattc cttctgcaaa
121 acctgcatcg tgcgctacct ggagaccaac aaatactgcc ccatgtgtga cgtgcaggtc
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241 aaattggtcc ctgggctttt taaagatgag atgaaacggc ggcgggattt ctatgcagcg
301 taccccctga cggaggtccc caacggctcc aatgaggacc gcggcgaggt cttggagcag
361 gagaaggggg ctctgagtga tgatgagatt gtcagcctct ccatcgaatt ctacgaaggt
421 gccagggacc gggacgagaa gaagggcccc ctggagaatg gggatgggga caaagagaaa
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781 gacaaggctc ccagccctgc caccctgcca gccacctcct cctccctgcc cagcccagcc
841 accccatccc atggctctcc cagttcccat gggcctccag ccacccaccc tacctccccc
901 actccccctt cgacagccag tggggccacc acagctgcca acgggggtag cttgaactgc
961 ctgcagacac catcctccac cagcaggggg cgcaagatga ctgtcaacgg cgctcccgtg
1021 ccccccttaa cttga
바람직하게는 상기 Mel-18 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열일 수 있다.
1 mhrttrikit elnphlmcal cggyfidatt iveclhsfck tcivryletn kycpmcdvqv
61 hktrpllsir sdktlqdivy klvpglfkde mkrrrdfyaa ypltevpngs nedrgevleq
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301 tppstasgat taanggslnc lqtpsstsrg rkmtvngapv pplt
바람직하게는, 상기 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 Mel-18 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체는 Mel-18 단백질에 특이적인 단클론 (monoclonal) 항체 또는 다클론 (polyclonal) 항체일 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는 RORC 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 키트를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해서, 환자의 시료로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시료일 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은, 환자의 시료로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 정상 대조군 시료 내 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 Mel-18 유전자의 mRNA의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 Mel-18 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 Mel-18의 mRNA 발현을 증가시키기 위한 성분, 또는 Mel-18 단백질을 유효 성분으로 포함하는 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 유방암 치료용 항-호르몬 치료제를 포함할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 상기 항-호르몬 치료제는 타목시펜 (tamoxifen), raloxifene (Evista), toremifene (Fareston) 등일 수 있다.
또한, 항-호르몬 치료제와 BKM120 등과 같은 PI3K 억제제를 함께 투여시에 Mel-18 소실 항호르몬제 내성 유방암 치료에 효과적인 바, 상기 약학적 조성물은 유방암 치료용 항-호르몬 치료제와 함께 PI3K 억제제를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 환자에서는 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도가 감소한다는 사실에 기초하여, 대상 환자로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정함으로써, 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 환자를 더욱 정확하고 효과적으로 진단 또는 예후하고자 하였다. 더 나아가, 이러한 유방암 환자에서 Mel-18의 mRNA 발현을 인위적으로 증가시키거나, 또는 Mel-18 단백질을 투여함으로써, 해당 환자의 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암을 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 하였다.
종래에, 폴리콤 (polycomb) 단백질인 MEL-18이 유방암의 호르몬 조절에 어떠한 기능적 영향을 미치는지에 대한 연구는 수행된 바가 없다. 본 발명에서는 MEL-18 손실이 호르몬 수용체의 발현을 조절함으로써 유방암의 호르몬-독립적 표현형에 기여한다는 사실을 밝혀내었으며, 더불어 삼중-음성 유방암 집단에서 MEL-18이 유의하게 하향 조절된다는 사실을 밝혀내었다.
하기 실시예에서도 볼 수 있는 바와 같이, MEL-18 발현은 에스트로겐 수용체(ER)-α(ESR1에 의해서 암호화됨)를 비롯한 루미날 마커의 발현과 양성적으로 관련되었으며, MEL-18의 손실은 ER-α-양성 유방암에서 항-호르몬 요법의 효과를 저해하는 것으로 나타났다. 또한, 루미날 유방암에서 MEL-18 손실은 ER-α와 프로게스테론 수용체(PR)의 발현 및 활성의 하향조절을 가져왔지만, TNBC에서는 MEL-18 과발현이 ER-α 발현을 회복시켰다. 한편, 생체내 이종이식 실험 결과, MEL-18 손실이 루미날 유방암에서 에스트로겐-독립적 성장과 타목시펜 내성을 유도한다는 점, 및 MEL-18 과발현이 TNBC에서 타목시펜 민감성을 부여한다는 점을 밝혔다. 그 기전에 있어서, MEL-18은 ESR1 트랜스활성화인자인 p53 및 SP1의 SUMO화를 억제함으로써 ESR1 발현을 촉진하는 것으로 판단되며, SENP1의 BMI-1/RING1B-매개 유비퀴틴-프로테아솜 분해를 저해함으로써 탈SUMO화 과정을 촉진하는 것으로 판단된다. 종합하면, 이러한 데이터들은 호르몬 수용체의 SUMO-의존적 조절제인 MEL-18이 항-호르몬 요법 반응을 결정하는데 중요한 역할을 하고 있다는 점을 시사한다.
본 발명에 있어서, "진단"이라는 용어는, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 진단은 환자에서 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 여부를 확인하는 것이다. 구체적으로, 환자의 시료에서 Mel-18의 mRNA 또는 그 단백질의 발현이 정상 대조군에 비해서 억제되는지 여부를 확인하여 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암을 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "Mel-18 유전자의 mRNA의 발현 정도 측정"이라는 용어는, 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암을 진단하기 위해서 생물학적 시료로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, Mel-18 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는, 환자의 시료 내에서 Mel-18 유전자의 mRNA를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, Mel-18 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 (primer), 프로브 (probe), 안테센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 Mel-18 유전자의 mRNA 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링 (annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 Mel-18 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적 (substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
일예로, 본원의 Mel-18 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 는 타겟으로 하는 Mel-18 유전자의 mRNA 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 Mel-18 유전자의 mRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 Mel-18 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 일예로, 본원의 Mel-18 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는 프라이머 (primer) 쌍 또는 프로브 (probe)이며, Mel-18 유전자의 염기서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3'-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 (DNA polymerase) 또는 역전사 효소 (reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 Mel-18 염기서열의 센스 (sense) 및 안티센스 (antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 삼중-음성 유방암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 프라이머는 Mel-18 유전자의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
다른 일예로, 본원의 Mel-18 유전자의 mRNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 (labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 Mel-18 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 삼중-음성 유방암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 Mel-18 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 Mel-18 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, Mel-18 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝 (cloning)하여 상기 Mel-18 유전자에 의해 코딩되는 Mel-18 단백질을 얻고, 얻어진 Mel-18 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 Mel-18 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 삼중-음성 유방암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 (light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄 (heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명에 있어서, Mel-18 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단 마커인 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 Mel-18 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 본 발명의 키트에는 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 Mel-18 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 선택적으로 Mel-18 단백질을 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, Mel-18 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너 (container), 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩 (chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 Mel-18 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알카라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 삼중-음성 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 삼중-음성 유방암 진단 마커 Mel-18을 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, Mel-18 유전자의 발현 정도를 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 환자의 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "환자의 시료"란 삼중-음성 유방암의 마커 유전자인 Mel-18의 발현 정도가 차이 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 검출 방법들을 통하여, 삼중-음성 유방암 의심환자에서의 Mel-18의 발현 정도를 정상 대조군에서의 Mel-18 발현 정도와 비교함으로써 해당 환자의 실제 삼중-음성 유방암 여부를 진단할 수 있다. 즉, 삼중-음성 유방암으로 추정되는 환자의 Mel-18 발현 정도를 측정하고, 정상 대조군의 Mel-18 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, Mel-18의 발현 정도가 정상 대조군의 것보다 삼중-음성 유방암으로 추정되는 환자에서 더 적게 발현되면 대상 환자를 삼중-음성 유방암으로 진단할 수 있는 것이다.
Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사 효소 중합효소반응, 실시간 역전사 효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도와 삼중-음성 유방암 의심환자에서의 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교할 수 있고, Mel-18 유전자의 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 삼중-음성 유방암 의심 환자의 실제 삼중-음성 유방암 여부를 진단할 수 있다.
Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도 측정은 바람직하게는, 삼중-음성 유방암 마커인 Mel-18 유전자의 mRNA에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사 효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사 효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 비침습적으로 삼중-음성 유방암 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 삼중-음성 유방암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, Mel-18 단백질의 유의한 발현량의 감소여부를 판단하여, 삼중-음성 유방암 의심 환자의 실제 삼중-음성 유방암 여부를 진단할 수 있다.
본원에서 "항원-항체 복합체"란 삼중-음성 유방암 마커인 Mel-18 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 (redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
일 구체예로, 단백질 발현 정도 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 삼중-음성 유방암 마커인 Mel-18 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 삼중-음성 유방암 발병 여부를 확인할 수 있다.
바람직하게는, Mel-18 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 Mel-18 단백질의 양을 확인하여, 삼중-음성 유방암 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 Mel-18 유전자의 발현량과 삼중-음성 유방암 의심 환자에서의 Mel-18 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 삼중-음성 유방암 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준은 Mel-18 단백질의 절대적 (예: ㎍/㎖) 또는 상대적 (예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, Mel-18 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 삼중-음성 유방암 발병 여부를 확인할 수 있다.
한편, 본 발명은 Mel-18의 mRNA 발현을 증가시키기 위한 성분, 또는 Mel-18 단백질을 유효 성분으로 포함하는 삼중-음성 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
관련하여, 본 발명에서는 삼중-음성 유방암 환자에 있어서 Mel-18의 발현을 인위적으로 증가시켰을 때, 항암 효과가 관찰된다는 점을 밝혀내었으며, 따라서 이러한 사실을 기반으로 한 삼중-음성 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에서, "유효 성분으로 포함"이라는 용어는, 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 또는 충분한 양으로 해당 성분이 포함되는 것을 의미한다. 실제 적용에 있어서 유효 성분으로 포함되는 양의 결정은 대상 질병을 치료하기 위한 양으로서, 다른 독성을 야기하지 않는 사항을 고려해서 결정될 수 있으며, 예를 들어 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 조성물의 형태, 피험체의 크기, 또는 질병 또는 병태의 심각도 등과 같은 다양한 인자에 따라서 변화될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 지닌 기술자라면 과도한 실험을 동반하지 않고 개별적 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
상기 조성물의 형태는 투여하고자 하는 모드에 따라서 다양하게 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 정제, 환약, 분말, 캡슐, 겔, 연고, 유체 또는 현탁액 등의 고상, 반고상 또는 액상의 투약 형태일 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 정확한 투약량의 단독 투여에 적절한 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 또한 상기 조성물은 동물 또는 인간 투여를 위한 약학 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 수성-기제 운반제로 정의되는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 원하는 제형에 의존하여 포함할 수 있다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 식염수, 링거액, 포도당 용액, 및 행크스(Hank's) 용액이 있다. 약학적 조성물은 또한 다른 약물 제제, 약학 제제, 담체, 보조제, 비독성, 비치료상, 비면역성 안정화제 등을 포함할 수 있다. 이러한 희석제 또는 담체의 유효량은 성분의 용해성, 생물학적 활성 등으로 환산하여 약학적으로 허용 가능한 제형을 획득하는데 유효한 양이다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 기존의 유방암 치료용 항-호르몬 치료제의 약효를 더욱 증대시키는데 사용 가능한바, 이에 제한되는 것은 아니지만, 타목시펜 (tamoxifen), raloxifene (Evista), toremifene (Fareston) 등과 같은 항-호르몬 치료제의 치료 효능을 더욱 증대시키는데 사용가능하다.
또한, 항-호르몬 치료제와 BKM120 등과 같은 PI3K 억제제를 함께 투여시에 Mel-18 소실 항호르몬제 내성 유방암 치료에 효과적인 바, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유방암 치료용 항-호르몬 치료제와 함께 PI3K 억제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 삼중-음성 유방암의 효과적인 진단을 위한 바이오마커를 제공할 수 있으며, 더 나아가 그 발현을 증가시킴으로써 종래 삼중-음성 유방암을 포함한 항호르몬제 내성 유방암에서 호르몬 요법의 치료효능을 획기적으로 개선시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 MEL-18의 손실이 불량한 예후 및 TNBC와 관련됨을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 1A는 상이한 유방암 서브타입에서 MEL-18 음성 및 양성 퍼센트를 파이 챠트로 도시한 것이다. **P< 0.01 (피셔 이그젝트 테스트);
도 1B는 223개의 유방 종양 샘플에서 MEL-18 발현과 ER-α 및 PR 발현 사이의 상관성을 나타낸 대표적인 IHC 이미지와 막대 그래프이다. 축척 막대: 100μm. *P< 0.05, **P< 0.01 (피셔 이그젝트 테스트);
도 1C는 제시된 유방암 집단의 공개된 마이크로어레이 데이터세트에서 상이한 유방암 서브타입에서 MEL-18 mRNA 수준의 히트맵(위) 및 박스 플롯(아래)을 도시한 것이다. 박스의 아래와 위는 제1 사분위 및 제3 사분위에 상응하고, 상자 안의 밴드는 50번째 백분위(중간)를 표시하고, 휘스커는 하부 및 상부 사분위의 사분범위(IQR)의 1.5배 내에서 최저 및 최고 값을 표시하고, 아웃라이어는 휘스커를 넘는 모든 값이다. P 값은 페이와이즈 비교 방식으로 ANOVA를 통해 계산되었다. ***P< 0.001 루미날 유방암과 비교(Lum);
도 1D는 GEO 데이터세트에서 MEL-18 발현과 ESR1 및 PGR 발현의 상관성을 나타낸 스캐터 플롯이다 (Li et al., GSE19615. ref. 22). r 값은 스피어만 랭크 상관 계수 분석을 통해 계산되었다;
도 1E는 223건의 사람 유방암(좌)과 53건의 TNBC 사례(우) 중에서 MEL-18 발현에 따른 OS 및 DFS를 도시한 것이다. 본 데이터는 로그-랭크 테스트 및 Cox 회귀 모델과 함께 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 분석되었다. *P< 0.05, **P< 0.01.31.
도 2는 MEL-1이 ESR1 및 PR 발현을 양성적으로 조절함을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 2A는 두 그룹 사이의 루미날 및 기저 마커의 차등 발현을 나타내는 대조군(shCon) 또는 MEL-18 shRNA(shMEL)를 발현하는 MCF-7 세포의 마이크로어레이 분석으로부터 생성된 히트맵(위)이다. 이 벤다이어그램은 MEL-18 표적 유전자와 PAM3005 유전자 리스트 사이의 공통 유전자의 수를 나타낸다(아래);
도 2B는 마이크로어레이 분석으로부터 얻어진 MEL-18 표적 유전자를 GO 부화 분석을 통해 유전자 기능에 따라 분류한 것이다;
도 2C는 MEL-18-침묵화된(shMEL) 또는 MEL-18-과발현(MEL-18) 유방암 세포 및 대조군 세포(shCon 및 Con)가 48h 동안 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양되었고, 세포 용해물이 제시된 항체를 사용하여 면역 블롯팅한 것이다. TNBC 세포에서 ER-α 단백질 발현을 검출하기 위해 100μg를 초과하는 세포 용해물이 면역 블롯팅에 사용되었다. 상대적 면역 블롯 밴드 밀도가 각 블롯의 아래에 제시된다. n.d.는 검출되지 않은 것이다. 블롯 내의 검은색 라인은 밴드가 상이한 분자량의 PR 동형의 발현 때문에 동일한 겔에서 같은 레인으로부터 스플라이스된 것을 나타낸다(아래: PR-A, 81kDa; 위: PR-B, 116kDa). 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. (D 및 E) 제시된 안정한 셀라인에서 ER-α(ESR1)의 mRNA 수준이 qRT PCR을 통해서 검증되었다. 데이터는 3회 중복 측정의 평균±SD를 나타낸다. *P< 0.05 2-테일드 스튜던트 t-테스트에 기초하여 대조군(shCon 또는 Con)과 비교.
도 3은 MEL-18 고갈이 ER-α-의존적 전사 활성을 없애고 에스트로겐-독립적 종양 성장을 유도함을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 3A-3C는 ERE 루시페라제 분석 (A) 및 24h 동안 E2(MCF-7 세포 중 10nM 또는 MDA-MB-468 세포 중 20nM)의 존재 및 부재하에 대조군 및 MEL-18-침묵화된 또는 MEL-18-과발현 셀라인에서 TFF1(pS2라고도 한다) 및 PR(PGR) 발현 수준의 qRT-PCR 분석 (B 및 C)을 도시한 것이다. 오차 막대는 3회 중복 실험의 평균±SD를 나타낸다. *P< 0.05 - 대조군과 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 3D는 E2-독립적 유방 종양 성장에 대한 MELl-18 녹다운의 효과를 도시한 그래프이다. 대조군 또는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포가 E2 치료의 부재하에 NOD/SCID 마우스(n= 8)의 유방 지방층에 이식되었다. 마우스 이종 이식편 종양 성장을 평가하기 위해서 종양 크기가 모니터되었다. *P< 0.05(그룹 x 일) 제0일부터 제시된 일자까지 RM ANOVA에 기초. P< 0.001(일; RM ANOVA);
도 3E는 3마리의 독립적인 이종 이식된 마우스의 제시된 샘플에서 MEL-18, ER-α 및 PR에 대한 IHC를 도시한 그래프이다. 축척 막대: 100μm. D 및 E에서 데이터는 평균±SEM으로 표시된다 (각각 n= 8 및 n= 3, 독립적 실험). *P< 0.05 shCon와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트).
도 4는 MEL-18의 손실이 항-에스트로겐 요법에 대한 내성을 유도함을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 4A는 5일 동안 제시된 용량(μM)의 타목시펜(Tam) 또는 에탄올(부형제) 처리 후 세포 생육성을 MTT 분석을 통해 분석한 그래프이다. 데이터는 평균±SD로 제시된다(n= 3);
도 4B는 E2 펠릿의 이식 후 또는 이식하지 않은 후 대조군 또는 MEL-18-침묵화된 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스에 4주 동안 타목시펜이 투여된 그래프이다 (그룹당 n= 8; 평균±SEM). 다중 비교에 대한 P 값 (4개 그룹: shCon/E2, shMEL/E2, shCon/E2+Tam, 및 shMEL/E2+Tam)이 Welch ANOVA 후 Dunnett's T3 테스트를 통해 계산되었다. **P= 0.004 shCon/E2+Tam에 대해; †P= 0.019 shCon/E2에 대해; P= n.s(유의성 없음) shMEL/E2에 대해; ‡P<0.001(shCon/E2+Tam 대 shMEL/E2+Tam) 및 P= 0.043(shCon/E2 대 shMEL/E2) - RM ANOVA에 기초;
도 4C는 제시된 마우스 그룹의 이종 이식된 종양에서 ER-α 및 PR에 대한 IHC (3마리 마우스의 평균±SEM)이다. *P< 0.05 shCon과 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트). 축척 막대: 100μm;
도 4D는 타목시펜(5mg/펠릿) 또는 위약으로 처리된 대조군 또는 MEL-18-과발현 MDA-MB-468 세포가 이식된 NOD/SCID 마우스에 대한 종양 성장 곡선이다 (그룹당 n= 8; 평균±SEM). P< 0.001(일), P= 0.026(그룹 x 일) - RM ANOVA에 기초. **P= 0.006 Con/Tam에 대해; †P= 0.026 MEL-18/위약에 대해(포스트훅 LSD 테스트);
도 4E는 Kaplan-Meier 방법을 사용한 103건의 타목시펜-처리된 ER-α 양성 사람 유방 종양에서 MEL-18 발현에 따른 OS 및 DFS의 분석 결과이다.
도 5는 MEL-18이 ESR1 전사 인자 p53 및 SP1의 SUMO화를 저해함으로써 ESR1 전사를 조절함을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 5A는 20mM NEM으로 처리된 세포 용해물에 면역 블롯팅을 행한 사진이다. SUMO화된 단백질의 양이 SUMO화된 단백질/총 단백질의 비를 측정함으로써 정량되었다;
도 5B는 MEL-18 shRNA를 발현하는 MCF-7 세포에 대한 마이크로어레이 결과와 RITA로 처리된 MCF-7 세포에 대한 결과 간의 관계를 나타내는 벤다이어그램이다 (GSE13291, ref. 36);
도 5C는 MEL-18 siRNA(siMEL)를 발현하는 MCF-7 세포가 p53 또는 SP1의 WT 또는 SUMO화-결핍 돌연변이체 구성물과 ESR1 프로-루시페라제로 공-트랜스펙션되었고, 루시페라제 리포터 분석된 결과이다. 데이터는 평균±SD로 제시된다(n= 3). * 및 †, P< 0.05 각각 siCon/Con 및 siMEL/Con와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 5D는 제시된 세포에서 ESR1 프로모터에 모집된 ESR1 전사 인자의 양을 나타내는 ChIP-qPCR 분석 결과이다. 데이터는 평균±SD로 제시된다(n= 3). *P< 0.05 shCon와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 5E는 MEL-18-침묵화된 세포에서 ER-α의 발현에 대한 징콜산의 효과를 나타낸 데이터이다. 세포는 24h 동안 100mM 징콜산으로 처리되어 면역 블롯팅되었다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 제시된다. 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 면역 블롯 밴드 밀도를 측정함으로써 정량되었다(평균±SD). *P< 0.05 shCon와 비교; †P< 0.05 shMEL와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트). 나타낸 모든 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 6은 MEL-18이 SENP1의 유비퀴틴-프로테아솜 분해를 저해함으로써 ESR1 전사 인자의 탈SUMO화를 증진시킴을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 6A는 면역 블롯팅 및 qRT-PCR을 통한 SENP1 발현의 분석 결과이다;
도 6B 및 C는 제시된 기간 동안 100μg/ml CHX로 (B) 또는 2h 동안 DMSO 또는 10μM MG132로 (C) 처리된 대조군 및 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포의 세포용해물의 면역 블롯팅 결과이다. SENP1 단백질 안정성의 정량이 그래프로 도시된다. A 및 B에서 데이터는 3회 중복 측정의 평균±SD로 제시된다. *P< 0.05 shCon와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 6D는 293T 세포에서 생체내 SENP1 유비퀴틴화 분석 결과이다;
도 6E는 6h 동안 40μM MG132로 처리되거나 처리되지 않은 대조군 및 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 내인성 SENP1 단백질 유비퀴틴화 수준의 결과이다;
도 6F-H는 제시된 세포주의 면역 블롯팅 결과이다. WT RING1B 또는 촉매 비활성 RING1B 돌연변이체(Mut) (F) 또는 SENP1 (H)를 안정하게 발현하는 세포가 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포로부터 생성되었다. BMI-1 녹다운의 경우, 비-표적화된 또는 BMI-1 siRNA가 48h 동안 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에 트랜스펙션되었다. 제미닌 단백질인 공지된 RING1B E3 리가아제 기질이 RING1B 활성의 측정에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 7은 MEL-18에 의한 호르몬-의존적 유방암의 조절을 위해 제안된 모델을 모식적으로 도시한 것으로서,
도 7A는 MEL-18에 의한 SUMO-의존적 ESR1 전사의 조절에 대한 도식적 모델을 도시한 것이다. MEL-18의 손실은 SUMO E2 효소 Ubc9와 그것의 기질 간 직접 결합을 통해서 SUMO 활성화를 증진시킨다. 더욱이, MEL-18 고갈은 SENP1의 BMI-1-1/RING1B E3 유비퀴틴 리가아제 복합체-매개 유비퀴틴(Ub)-프로테아솜 분해를 증진시킴으로써 SENP1의 탈SUMO화 활성을 저해한다. 이들 두 경로를 통해서 MEL-18은 p53의 SUMO화를 저해한다. 또는, MEL-18은 SENP1-매개 탈SUMO화 경로를 통해서 SP1 SUMO화를 조정한다. MEL-18 침묵화를 통해서 p53 및 SP1 SUMO화를 증가시키는 것은 ESR1 프로모터로의 이들의 모집을 저해하고, ER-α 발현을 하향 조절한다;
도 7B는 사람 유방암에서 폴리콤 (polycomb) 단백질 MEL-18에 의한 호르몬 의존성과 독립성 사이의 균형 조절을 위해 제안된 모델이다. 루미날 유방암에서 MEL-18은, 각각 ESR1 전사 인자의 SUMO화를 저해하고, ER-α-의존적 전사 활성을 증진시킴으로써, 호르몬 수용체 ER-α 및 PR의 발현 유지에는 기여하지만 HER2에 대해서는 그렇지 않게 된다. 그러나, MEL-18 발현이 유방암 진행 과정에서 손실되었을 때 종양은 호르몬 의존성 항-호르몬 요법에 대한 내성을 발생시키며, TNBC를 포함하는 호르몬 수용체-음성 유방암의 표현형은 ESR1 및 PR 발현의 손실과 HER2 증폭의 결여를 특징으로 한다. 따라서, MEL-18은 호르몬 수용체 발현의 조절인자로서 작용하고, 사람 유방암에서 호르몬 의존성 및 독립성의 중요한 결정요인이다.
도 8은 사람 유방암 코호트에서 MEL -18 발현의 임상 타당성 결과를 나타낸 그래프로서, 도 8A-C는 MEL -18 mRNA 발현 수준에 따른 유방암 환자의 제시된 서브타입에서 OS 및 DFS가 Kaplan-Meir 플롯터를 사용하여 분석된 결과를 나타낸 것이다 (http://kmplot.com/analysis).
도 9는 호르몬 수용체 전사 및 활성에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 9A는 제시된 단백질의 발현을 결정하기 위한 유방암 세포주 세포 용해물의 면역 블롯팅 결과이다. β-액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다;
도 9B는 대조군(shCon) 또는 MEL-18 shRNA(shMEL)를 발현하는 MCF-7 세포에서 PR(PGR)의 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해서 입증한 결과이다;
도 9C는 사람 ESR1 유전자의 프로모터 영역과 종래문헌에 기재된 루시페라제 리포터 벡터에 클론된 ESR1의 프로모터 단편을 도식적으로 도시한 것이다. 청색 및 적색 라인은 ESR1 전사(위)의 전사 인자 및 유전외적 조절인자에서 이전에 설명된 결합 영역을 나타낸다. ESR1의 근위 프로모터에서 p53 및 SP1의 결합 영역이 제시된다(아래);
도 9D는 대조군(siCon) 또는 MEL-18 siRNA(siMEL)로 일시적으로 트랜스펙션된 MCF-7 세포 또는 빈 벡터(Con) 또는 MEL-18 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 MDA-MB-468 세포에서 ESR1 프로모터 활성의 루시페라제 리포터를 분석한 결과이다;
도 9E는 PR 전사에 대한 MEL-18의 효과를 도시한 것이다. MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 PR 프로모터 활성을 측정하기 위해서 루시페라제 리포터 분석이 사용되었다;
도 9F는 24h 동안 합성 프로게스틴(Pg) 10nM R5020의 존재 또는 부재하에 대조군 및 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포의 PRE 루시페라제 분석 결과이다. B 및 D-F에서 오차 막대는 3회 중복 실험의 평균±SD를 나타낸다. * P< 0.05 - 2-테일드 스튜던트 t-테스트에 기초하여 대조군(shCon, siCon, 또는 Con)과 비교.
도 10은 호르몬 수용체 활성에 대한 MEL-18의 효과를 나타낸 일련의 데이터들로서,
도 10A는 ERE 루시페라제 활성을 24h 동안 10nM E2의 존재 및 부재하에 제시된 세포주에서 측정한 결과이다. 오차 막대는 3회 중복 실험의 평균±SD를 나타낸다. *P< 0.05 - 2-테일드 스튜던트 t-테스트에 기초하여 대조군(shCon 또는 Con)과 비교;
도 10B는 24h 동안 10nM E2(MCF-7 세포 중 10nM 또는 MDA-MB-468 세포 중 20nM)의 존재 및 부재하에 대조군, MEL-18-침묵화된(좌), 또는 MEL-18-과발현(우) 세포에서 TFF1(pS2라고도 한다) 및 PR 발현에 대한 면역 블롯팅 결과이다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 제시된다. 나타낸 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다.
도 11은 MEL-18 발현에 대한 호르몬 활성의 효과를 나타낸 일련의 데이터들로서,
도 11A-D는 세포를 제시된 기간 동안 10nM E2 (A 및 C) 또는 10nM 합성 프로게스틴(Pg) R5020 (B 및 D)으로 처리하고, 면역 블롯팅 (A 및 B, 위), qRT-PCR (A 및 B, 아래), 또는MEL -18 프로모터 활성 분석 (C 및 D)을 행한 결과이다. TFF1와 ERE-luc 또는 HG- EGF와 PRE-luc가 각각 E2- 및 R5020-유도 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 오차 막대는 3회 중복 샘플의 평균±SD를 나타낸다. * P< 0.05 - 2-테일드 스튜던트 t-테스트에 기초하여 대조군(0h) 과 비교.
도 12는 유방암 세포의 에스트로겐 반응에 대한 MEL-18의 효과를 나타낸 일련의 데이터들로서,
도 12A는 세포가 10nM E2 또는 에탄올(부형제)로 처리되었고, MTT 분석에 의해서 세포 성장이 분석된 결과이다. 결과는 3회 중복 실험의 평균±SD로 제시된다. * 및 †, P< 0.05 - 각각 대조군(shCon 또는 Con) 및 부형제(E2-)와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 12B는 48h 동안 E2로 또는 E2 없이 처리된 제시된 셀라인에서 AKT 활성이 항-포스포-AKT 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해서 측정된 결과이다.
도 13은 생체내에서 에스트로겐-독립적 T-470 유방 종양 성장에 대한 MEL-18 고갈의 효과를 나타낸 일련의 데이터들로서, 대조군 (shCon) 또는 MEL-18 shRNA (shMEL)를 발현하는 T47D 세포가 E2 펠릿 주사 없이 NOD/SCID 마우스(n= 8)의 유방 지방층에 이식되었다. 8주 동안 종양 크기를 모니터하여 이종 이식된 마우스에서 종양 성장을 분석했다. 데이터는 평균±SEM으로 제시된다. **P< 0.01(그룹 x 일) - RM ANOVA에 기초.
도 14는 타목시펜에 대한 유방암 세포의 반응에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 14A는 세포가 5일 동안 제시된 용량(μM)의 타목시펜(Tam) 또는 에탄올(부형제)로 처리되었고, MTT 분석에 의해서 세포 성장이 분석된 결과이다. 데이터는 3회 중복 실험의 평균±SD로 제시된다. P< 0.05 - shCon 또는 Con과 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 14B는 ER-α를 안정하게 발현하는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포의 생성 후, 5일 동안 1μM 타목시펜으로 처리된 이들 세포의 성장이 MTT 분석에 의해서 분석한 결과이다 (좌). 대조군 또는 대조군(siCon) 또는 ER-α siRNA(siER)로 트랜스펙션된 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포를 3일 동안 10μM 타목시펜으로 처리하고(우), MTT 분석을 행했다. 오차 막대는 평균±SD(n= 3)를 나타낸다;
도 14C는 대조군(Con) 또는 MEL-18-과발현 MDA-MB-231 세포-기반 종양을 지닌 이종 이식된 마우스에 타목시펜(Tam) 또는 위약을 이식해서 생체내에서 타목시펜에 대한 TNBC 세포의 반응에 대한 MEL-18의 효과를 분석한 결과이다 (그룹당 n= 8). 종양 크기는 42일 동안 모니터되었다. 데이터는 평균±SEM으로 제시된다. P< 0.001(일), P< 0.001(그룹 x 일)- RM ANOVA에 기초. **P= 0.003, Con/Tam 대 MEL-18/Tam(포스트훅 LSD 테스트).
도 15는 타목시펜 반응의 MEL-18-매개 조절에 대한 AKT 활성의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 15A는 생체내에서 AKT 활성에 대한 MEL-18의 효과를 분석하기 위한 인산화된 AKT의 IHC 분석 결과 (위) 및 제시된 샘플에서 각각 세포 증식 및 세포 자살의 생체내 분석을 위한 Ki-67 및 TUNEL 분석 결과 (아래)이다;
도 15B는 48h 동안 세포를 10μM 타목시펜, 1μM BKM120(BKM), 또는 둘 다로 처리하고, MTT 분석을 행한 결과이다. 오차 막대는 3회 중복 측정의 평균±SD를 나타낸다. *P< 0.05 shCon와 비교; †P<0.05 Tam와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 15C는 E2 펠릿을 주사한 대조군 또는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포-기반 종양을 지닌 이종 이식된 마우스에 타목시펜, BKM, 또는 둘 다를 투여한 결과이다 (n= 5 E2 및 E2+Tam 그룹에 대해; n= 8 E2+BKM 그룹에 대해; n= 7 E2+Tam+BKM 그룹에 대해). 데이터는 평균±SEM으로 제시된다. P< 0.001(일), P< 0.001(그룹 x 일) - RM ANOVA에 기초. P= n.s(유의성 없음), shCon/E2+Tam 대 shCon/E2+BKM; †P= 0.019, shCon/E2+Tam 대 shCon/E2+Tam+BKM; **P= 0.009, shMEL/E2+Tam 대 shMEL/E2+BKM; ***P< 0.001, shMEL/E2+Tam 대 shMEL/E2+Tam+BKM (포스트훅 LSD 테스트).
도 16은 ESR1의 유전외적 상태나 ESR1 전사 인자의 전체 발현은 MEL-18 발현에 영향을 받지 않음을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 16A는 면역 블롯팅 (좌) 및 RT-PCR (우)이 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 ESR1 유전자 조절에 연루된 유전외적 변형제의 발현을 측정하기 위해 사용된 결과이다;
도 16B는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 히스톤 변형 상태 및 ESR1의 근위 프로모터 영역에 HDAC1과 DNMT 패밀리 단백질의 모집 수준을 보여주는 ChIP 분석 결과이다. 겔 이미지에서 수직 흰색 라인은 레인들이 연속적이지 않은 동일한 겔에서 전개되었음을 나타낸다;
도 16C는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포 및 MEL-18-과발현 MDA-MB-468 세포에서 PcG 단백질의 발현을 측정한 면역 블롯팅 (좌) 및 RT-PCR (우) 결과이다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 제시된다. *GAPDH, RT-PCR의 로딩 대조군;
도 16D는 제시된 셀라인에서 ESR1 전사 인자의 발현이 면역 블롯팅에 의해서 시험된 결과이다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 제시된다. 상대적 면역 블롯 및 RT-PCR 밴드 밀도는 각 밴드의 아래에 제시된다.
도 17은 MEL-18은 p53의 음성 SUMO E3 리가아제이지만 SP1은 아님을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 17A 및 B는 MEL-18과 ESR1 전사 인자 사이의 상호작용을 측정하기 위한 pCI-neo(Con) 또는 pCI-neo-MEL-18-FLAG(MEL-18-FLAG)로 트랜스펙션된 293T 세포의 Co-면역침전 결과이다. IB, 면역 블롯;
도 17C 및 D는 MEL-18의 존재 또는 부재하에 p53(C) 및 SP1(D)의 시험관내 SUMO화 분석 결과이다;
도 17E는 제시된 플라스미드 벡터로 공-트랜스펙션된 293T 세포에서 p53 및 SP1의 시험관내 SUMO화 분석 결과이다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다.
도 18은 전사 인자의 SUMO화 및 이들의 표적 유전자의 조절에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 18A는 두 마이크로어레이 결과의 비교에 기초한 MEL-18 및 p53/SP1의 공통 표적 유전자의 GO 분석(우리 데이터 대 GSE13291 데이터) 결과이다;
도 18B는 p53 또는 SP1의 WT 또는 SUMO화-결핍 돌연변이체 구성물과 ER 프로-루시페라제로 공-트랜스펙션된 MCF-7 세포에 루시페라제 리포터 분석을 행한 결과이다. *P< 0.05 Con와 비교; †P< 0.05 WT 단백질과 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 18C는 ESR1 프로모터 영역에 WT p53 및 SUMO화-결핍 p53 K386R 돌연변이체의 결합을 나타낸 결과이다. 48h 동안 293T 세포를 제시된 cDNA로 트랜스펙션하고, ChIP 분석을 행했다. *P< 0.05 p53 WT와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트). P53 K386R 돌연변이체에서 SUMO화의 결여가 면역 블롯팅에 의해서 확인되었다.
도 18D는 TNBC 세포에서 ESR1 전사 활성에 대한 SUMO화의 억제 효과를 나타낸 그래프이다. ESR1 프로모터 구성물과 MEL-18 cDNA 또는 빈 벡터로 공-트랜스펙션된 세포를 24h 동안 10μM 징콜산(gink)으로 처리하고, 루시페라제 리포터 분석을 행했다;
도 18E는 MEL-18-유도 ESR1 전사에 대한 p53 및 SP1의 효과를 분석하기 위해서 48h 동안 제시된 siRNA, cDNA 및 ESR1 프로모터 구성물로 트랜스펙션하고, 루시페라제 리포터 분석을 행한 결과이다. * 및 †, P< 0.05 - 각각 Con 및 siCon와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트). B-E에서 데이터는 3회 중복 측정의 평균±SD로 제시된다.
도 19는 표적 프로모터에서 전사 인자의 결합에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 19A 및 B는 ESR1(A) 또는 CDKN1A(B) 영역에서 제시된 단백질의 부화를 보여주는 ChIP 분석 결과이다. 데이터는 평균±SD(n= 3)로 제시된다. *P< 0.05 2-테일드 스튜던트 t-테스트에 기초하여 대조군(Con 또는 shCon)과 비교.
도 20은 SUMO화/탈SUMO화-조절 인자의 발현 및 활성에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 20A는 MEL-18-침묵화된(좌) 및 MEL-18-과발현(우) 셀라인에서 SUMO-관련 인자 발현의 면역 블롯팅 결과이다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 제시된다;
도 20B는 SENP1의 탈SUMO화 활성에 대한 MEL-18 발현의 효과를 나타낸 것이다. 시험관 내 탈SUMO화 분석의 경우, 대조군 및 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포의 세포 용해물이 방법 섹션에서 설명된 대로 HA-SUMO-1-VS와 함께 인큐베이션되었고, SENP1 항체를 사용하여 샘플에 면역 블롯팅이 행해졌다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다.
도 21은 SENP1의 발현 및 효소 활성은 ESR1 및 PR 전사의 조절에 중요하다는 것을 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 21A-C는 48h 동안 비-표적화된(siCon) 또는 SENP1 siRNA(siSENP1)로 트랜스펙션된 MCF-7 세포에서 ER-α 발현 수준을 측정하기 위해 면역 블롯팅(A), qRT-PCR(B) 및 루시페라제 리포터 분석(C)을 수행한 결과이다. SUMO화된 p53 및 SP1에 대한 면역 블롯팅의 경우, 20mM NEM으로 처리 후 세포 용해물이 제조되었다. 별도의 겔에서 시험된 병행 샘플이 (A)에 제시된다. 데이터는 평균±SD(n= 3)로 제시된다. *P<0.05 - siCon와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트);
도 21D는 FLAG-SENP1 WT(SENP1 WT) 또는 촉매 비활성 돌연변이체 SENP1(SENP1 Mut) 벡터로 트랜스펙션된 293T 세포에서 p53 및 SP1에 대한 생체내 SUMO화 분석 결과이다. 블롯에서 검은색 분할 라인은 레인들이 연속적이지 않은 동일한 겔로부터 유래했음을 나타낸다;
도 21E 및 F는 WT 또는 돌연변이체 SENP1 플라스미드(우)로 일시적으로 트랜스펙션된 MCF-7 세포에서 ESR1 및 PR 프로모터 활성의 분석 결과이다. 데이터는 평균±SD(n= 3)로 제시된다. * 및 †, P< 0.05 - 각각 대조군 및 WT SENP1와 비교(2-테일드 스튜던트 t-테스트).
도 22는 생체내에서 임상 견본 및 이종 이식편에서 SENP1 발현에 대한 MEL-18의 효과를 보여주는 일련의 데이터들로서,
도 22A는 223 사람 유방 종양에서 SENP1 염색의 대표적인 IHC 이미지 (좌) 및 MEL18과 SENP1 발현 사이의 상관성을 보여주는 막대 그래프 (우)이다. 축척 막대: 100μm. *P < 0.05(피셔 이그젝트 테스트);
도 22B는 IHC에 의해서 결정된, E2 투여의 존재 또는 부재하에 대조군(shCon) 또는 MEL-18-침묵화된(shMEL) MCF-7 세포가 이식된 NOD/SCID 마우스에서 SENP1의 발현 상태를 나타낸 것이다;
도 22C는 4주 동안 타목시펜 투여된 NOD/SCID 마우스의 제시된 샘플에서 SENP1에 대한 IHC 분석 결과이다. B 및 C에서 데이터는 평균±SD(n= 3)로 제시된다. 축척 막대: 100μm.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
세포 배양 및 약물 치료 - 모든 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입했다. 사람 유방암 세포주를 10% FBS를 함유한 DMEM 결여 페놀 레드(Welgene)에서 배양했다. 293T 세포주는 종래 보고된 절차에 따라서 배양했다 (Park JH, Lee JY, Shin DH, Jang KS, Kim HJ, and Kong G. Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1alpha mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway. Oncogene. 2011;30(45):4578-89). CHX와 MG132는 Calbiochem에서 얻었고, 징콜산, E2, 4-하이드록시타목시펜, R5020, 및 LY294002는 Sigma-Aldrich에서 얻었다. E2 및 4-하이드록시타목시펜 처리시에는 세포를 10% 챠콜/덱스트란-처리된 FBS로 보충된 페놀-레드-프리 DMEM에서 배양했다. 범-PI3K 저해인자인 BKM120(A-1108)은 Active Biochemicals에서 구입했다.
유전자 발현 마이크로어레이 분석 - 전체 RNA를 대조군 또는 MEL-18 shRNA를 발현하는 MCF-7 세포로부터 분리하고, Illumina TotalPrep™ RNA 증폭 키트(Ambion, Inc.)를 사용해서 cDNA 및 바이오틴화된 cRNA의 다수의 카피를 생성했다. 정제 후, cRNA를 제조자의 지시에 따라서 다중-단계 과정을 통해 16h 동안 58 ℃에서 HumanHT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina)과 혼성화했다. 다음에, 칩을 세척하고 건조시켜 Bead Array Reader(Illumina)에서 스캔하고, GenomeStudio 버전 2011.1 소프트웨어(Illumina)를 사용해서 원 데이터를 추출했다. 존재/부재 호칭은 GenomeStudio에 의해서 계산된 검출 P 값에 기초한 분류 방법에 따랐다.
검출 P 값이 <0.05인 유전자를 존재로서 분류했고, 다른 유전자는 모두 부재로서 분류했다. 선택된 유전자 신호 값을 대수적으로 전환해서 분위법을 사용하여 정규화했다. 비교 그룹 간에 적어도 1.5의 절대 변화 배수를 나타낸 유전자는 모두 상이하게 발현된 것으로 간주했다. 이들 데이터를 Gene Expression Omnibus(GEO)에 기탁했고, 수탁 번호 GSE64716를 받았다. 상이한 생물학적 과정에 연루된 유전자들을 기능적으로 분류하기 위해 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery(DAVID)를 사용하여 추가 분석을 수행했다. 루미날 및 기저 서브타입으로 유방암 세포주의 분류를 위한 PAM305 유전자 리스트(46)와 GEO로부터의 p53 재활성화인자 RITA(GSE13297)로 처리된 MCF-7 세포의 유전자 발현 마이크로어레이 프로파일(36)을 우리의 마이크로어레이 데이터에 기초하여 확인된 MEL-18 표적 유전자와의 비교에 사용했다.
유방암 환자 집단으로부터 마이크로어레이 데이터세트의 데이터 수집 및 분석 - 사람 유방암 유전자 발현 마이크로어레이의 7개의 공개적으로 이용 가능한 데이터세트를 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo(Richardson et al., GSE7904(21); Li et al., GSE19615(22); MAQC-II project, GSE20194(23); Hatzis et al., GSE25066(24); Bos et al., GSE12276(27)), http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress(Chin et al., E-TABM-158(25)), 및 http://bioinformatics.mdanderson.org/pubdata.html(Gibson et al., MDA133(26))에서 다운로드해서 다시 분석했다. MEL -18, ESR1, PGR, FOXA1, 및 GATA3의 발현 프로파일을 이 독립적 데이터 세트로부터 추출했고, MEL-18의 발현과 이들 유전자 각각의 관계를 상관성 계수(r 값)를 계산하여 결정했다. ER, PR 및 HER2 상태에 기초한 유방암의 서브타입 분류(루미날, ER+/HER2-; HER2, ER+/HER2+ 또는 ER-/HER2+; 및 TNBC, ER-/PR-/HER2-)를 7개 데이터세트 중 6개에 대해 수행했으며, 그에 대한 IHC 결과는 3개 마커 모두에 대해 이용할 수 있어서 상이한 유방암 서브타입에서 MEL-18 발현 패턴을 비교할 수 있었다. MEL-18 mRNA 발현과 유방암 환자의 OS 및 DFS 간의 관계에 대한 메타 분석을 위하여 Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis)를 종래 보고된 바와 같이 사용했다 (Gyorffy B, Lanczky A, Eklund AC, Denkert C, Budczies J, Li Q, and Szallasi Z. An online survival analysis tool to rapidly assess the effect of 22,277 genes on breast cancer prognosis using microarray data of 1,809 patients. Breast cancer research and treatment. 2010;123(3):725-31).
크로마틴 면역침전( ChIP ) 분석 - ChIP 분석 키트(Upstate Biotechnology)에 제공된 제조자의 지시에 따라서 ChIP 분석을 수행했다. 전사 인자와 표적 프로모터의 결합을 ESR1의 근위 프로모터 (5'-CGCTCCAAATCGAGTTGTGCCT-3' 및 5'-CCGGGCCTCCAACTTTAAGTACTGG-3' 및 CDKN1A(p21) 프로모터 (5'-GCTGTGGCTCTGATTGGCTTT-3' 및 5'-ACAGGCAGCCCAAGGACAAA-3'에 특이적인 프라이머를 사용하여 검출했다. ESR1 프로모터의 체외 변형 영역을 표적화하는 프라이머는 종래 보고된 바와 같다 (Macaluso M, Montanari M, Noto PB, Gregorio V, Bronner C, and Giordano A. Epigenetic modulation of estrogen receptor-alpha by pRb family proteins: a novel mechanism in breast cancer. Cancer Res. 2007;67(16):7731-7). ChIP 신호의 부화를 정량적 실시간(qRT)-PCR(신호/입력 비)을 통해 검증했다.
SUMO화 / 탈SUMO화 분석 - 시험관내 SUMO화를 SUMOlink SUMO-1 키트(40120, Active Motif)에 관한 제조자의 지시에 따라서 평가했다. 재조합 GST-MEL-18 단백질을 Novus Biologicals에서 얻었다. 재조합 p53 및 SP1 단백질(PR-733)을 각각 Active Motif와 Jena Biosciences에서 얻었다. 생체내 SUMO화 분석의 경우, 293T 세포를 36h 동안 트랜스펙션했다. 세포 추출물을 항-SUMO-1 항체를 사용하여 면역 침전시켰고, 항-p53 또는 항-SP1 항체를 사용하여 면역 블롯팅을 통해 분석했다. 탈SUMO화 분석을 기존에 보고된 바대로 HA-SUMO-1-비닐-설폰(Boston Biochem)을 사용하여 분석했다 (Kolli N, Mikolajczyk J, Drag M, Mukhopadhyay D, Moffatt N, Dasso M, Salvesen G, and Wilkinson KD. Distribution and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem J. 2010;430(2):335-44).
생체내 유비퀴틴화 분석 - SENP1 단백질 유비퀴틴화를 검출하기 위한 생체내 유비퀴틴화 분석을 종래 보고된 바에 따라서 수행했다 (Qian T, Lee JY, Park JH, Kim HJ, and Kong G. Id1 enhances RING1b E3 ubiquitin ligase activity through the Mel-18/Bmi-1 polycomb group complex. Oncogene. 2010;29(43):5818-27). 요약하면, 293T 세포를 HA-유비퀴틴 및 FLAG-SENP1 플라스미드와 빈 벡터 또는 MEL-18-발현 벡터로 48h 동안 공-트랜스펙션했다. 세포 용해물을 항-FLAG 항체를 사용하여 면역 침전시켰고, 항-HA 또는 항-FLAG 항체를 사용하여 면역 블롯팅을 통해 분석했다. 내인성 SENP1 단백질 유비퀴틴화를 검출하기 위해서 MEL-18 또는 대조군 shRNA를 발현하는 MCF-7 세포를 6h 동안 40μM MG132로 처리했다. 다음에, 샘플을 항-SENP1 항체를 사용하여 면역 침전시켰고, 항-유비퀴틴 항체를 사용하여 면역 블롯팅했다.
동소 이종 이식편 및 조직병리학적 분석 - 5주령 암컷 비-비만 당뇨/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스를 한국생명공학연구원(대한민국 대전)에서 구입했다. 에스트로겐-독립적 종양 성장에 대한 MEL-18의 효과를 조사하기 위하여 렌티바이러스 MEL-18 또는 대조군 shRNA를 발현하는 4 x 106 MCF-7 또는 T47D 루미날 세포를 E2 펠릿의 이식 없이 좌측(대조군) 및 우측(MEL-18 shRNA)에서 암컷 NOD/SCID 마우스의 유방 지방층에 주사하고 종양 형성을 모니터했다. 항-에스트로겐 치료에 대한 MEL-18의 효과를 시험하기 위하여 암세포 이식 1주일 전에 마우스에 E2 펠릿(0.72mg/펠릿; 60-d 방출)을 피하 이식하거나 하지 않았다. 다음에, 대략 4 x 106 대조군 또는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포를 상기 설명된 대로 마우스의 지방층에 주사했다. 1주 후, 실험 동물에 타목시펜 펠릿 (5mg/펠릿; 60-d 방출)을 피하 주사하거나 하지 않았다. 이종 이식된 마우스를 PI3K 저해제와 타목시펜으로 병용 치료하기 위해서, E2 펠릿이 이식된 대조군 또는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포-기반 종양을 지닌 NOD/SCID 마우스에 상기 설명된 대로 타목시펜을 피하 주사하고, 및/또는 2주(6일 on/1일 off, 6IW) 동안 하루 1회 그리고 추가 2주 동안 매주 2회 경구 위관법을 통해 BKM120 (30mg/kg, 10% NMP와 90% PEG300의 새로 제조된 용액에 용해)로 치료했다. 생체 내에서 타목시펜에 대한 TNBC의 반응에 대한 MEL-18 과발현의 효과를 평가하기 위해서, NOD/SCID 마우스에 빈 벡터 또는 렌티바이러스 MEL-18 cDNA를 발현하는 1 x 106 MDA-MB-231 세포 또는 4 x 106 MDA-MB-468 세포를 동소 이종 이식했고, 세포 이식 1주일 후에 타목시펜 (5mg) 또는 위약 펠릿을 피하 주사했다. 4-7주 동안 매주 2회 종양 성장을 측정했다. 종양 체적을 1/2 x 길이 직경 x 짧은 직경2으로 계산했다. 종양을 절제한 후, 독립적인 3마리의 이종 이식된 마우스로부터 얻은 종양의 연속 단편을 사용하여 종래 보고된 바대로 IHC 분석을 수행했다 (Park JH, Lee JY, Shin DH, Jang KS, Kim HJ, and Kong G. Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1alpha mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway. Oncogene. 2011;30(45):4578-89). IHC 염색 부문에 설명된 대로 양성 세포의 퍼센트에 염색 강도를 곱해서 결과를 점수화했다. 합계 점수 4를 문턱값으로 선택했다. 양성 세포의 퍼센트를 측정하여 TUNEL 염색(Millipore)에 기초한 Ki-67 증식 지수 및 세포자살 지수의 결과를 정량했다.
통계 - 2-테일드 스튜던트 t-테스트를 사용하여 대조군과 실험 그룹 간 차이의 유의성을 결정했다. 다중 그룹 비교 및 생체내 데이터의 반복 측정을 위해, 부등 변량의 경우 Welch ANOVA 후 듀넷 T3 테스트, 또는 등 변량의 경우 반복-측정 ANOV(RMANOVA) 후 포스트훅 LSD 테스트를 각각 수행했다. 피셔 이그젝트 테스트를 사용하여 MEL-18 발현과 호르몬 수용체 및 SENP1의 발현 그리고 사람 샘플에서 임상병리학적 변량의 상관성을 시험했다. OS 및 DFS 분석의 Kaplan-Meier 곡선을 로그-랭크 테스트를 사용하여 평가했다. Cox 비례 위험 회귀 모델을 사용해서 일변량 및 다변량 생존 분석을 수행하여 독립적 예후 인자를 평가했다. 이들 분석은 SPSS 소프트웨어 (Ver. 12.0, SPSS)를 사용하여 수행했다. 유방암 서브타입들 간의 MEL-18 발현 수준의 차이를 페어와이즈 비교 방식으로 ANOVA를 통해 분석했다. 스피어만 랭크 상관 계수를 두 유전자 간의 상관성 분석에 사용했다. 이 두 분석은 R 통계 패키지를 사용하여 수행했다. SAS 소프트웨어를 사용하여 푸아송 분포를 계산해서 종양 발생률의 유의성을 평가했다. 모든 경우 < 0.05의 P 값을 유의한 것으로 간주했다.
한편, 본 발명에 있어서, 모든 동물 실험은 한양대학교 동물관리사용 위원회 (대한민국, 서울)의 규정에 따라서 승인된 절차를 준수하였다.
환자 및 수술 견본 - 생존 분석을 위해서 2000년 1월에서 2005년 12월 사이에 한양대학교 병원 (대한민국, 서울)에서 수술이 성공적으로 수행된 223명의 유방암 환자를 연속적으로 등록했다. 환자의 나이, 조직학적 타입, 종양 등급, 종양 크기, 림프절 상태, AJCC 단계, ER-α 및 PR 상태, HER2 상태, 보조 화학요법, 방사선요법 및 엔도크린 치료에 관한 정보 및 추적 데이터를 포함하는 조직병리학 및 임상 데이터를 병리학 보고서와 의료 기록으로부터 얻었다. 모든 사례는 원발성 및 산발성이었고 수술 전 치료는 없었다. 환자 샘플은 수술 과정, 수술후 요법 및 추적 일정과 관련하여 균등했다. 대부분의 환자는 변형된 방사선 유방절제술 또는 보존적 유방 수술을 액와 림프절을 절제하거나 하지 않고 받았으며, 이후 보조 화학요법 및/또는 호르몬 치료를 받았다. 호르몬 수용체에 대해 양성이었던 I 단계 암을 지닌 저위험 환자 그룹은 수술 후 타목시펜 치료만 받았다. I(고위험 그룹) 또는 II 단계 환자는 아드리아마이신과 시클로포스파미드(AC) 또는 시클로포스파미드와 메토트렉세이트와 5-플루오로우라실(CMF) 화학요법을 받았다. III 단계 암을 지닌 환자는 AC와 파클리탁셀 화학요법을 받았다. 보조 호르몬 치료로서 타목시펜을 화학요법 후 양성 ER-α 상태를 나타낸 환자에게 투여했다. 직경이 5cm를 초과하는 III 단계 또는 II 단계 종양을 지닌 환자는 방사선 요법을 수행했다. 평균 추적 기간은 75.7개월이었고, 이 기간 동안 32(14.3%)명의 환자가 사망했으며, 191(85.7%)명의 환자가 생존했다.
조직 마이크로어레이 및 IHC 염색 - 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 조직 블록의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 슬라이드를 사용하여 형태학적으로 가장 대표적이며 괴사되지 않은 영역을 한정했다. 단일-조직 코어(직경 2mm)를 각 파라핀 블록으로부터 샘플링하고, 조직 마이크로어레이(TMA) 기기(AccuMax array, ISU ABXIS)를 사용해서 레시피언트 파라핀 블록에 조립해 넣었다. 조직 단편을 두께 4μm 슬라이스로 잘라서 파라핀을 제거했다. 면역 블롯팅을 Bond Max 자동 면역염색장치(Vision BioSystems)를 사용하여 수행했다. 열-유도 에피토프 회수를 Bond Epitope Retrieval 용액을 사용하여 수행했다. 내인성 퍼옥시다아제 활성을 0.3% 과산화수소로 차단했다. 이 단편을 실온에서 15분 동안 MEL-18(1:50 희석, sc-10744; Santa Cruz Biotechnology) 및 SENP1(1:200 희석, AP1230; Abgent)에 대한 1차 항체를 사용하여 염색했다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 포스트-1차 시약 중에서 인큐베이션했다. BOND Polymer Refine Detection 시약을 사용하여 반응을 전개시킨 후, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB;Sigma-Aldrich)를 크로모겐으로 사용하여 비색 전개했다. MEL-18 및 SENP1 면역 반응성을 블라인드 방식으로 두 병리학자가 평가했다. German 반-정량 점수기록 시스템을 사용하여 염색 강도 및 면적을 정량했다. 각 샘플에서 점수는 양으로 염색된 세포의 퍼센트에 기초하여 배정되었으며, 다음과 같다: 염색되지 않은 세포 0점; 1 내지 24% 염색된 세포 1점; 25 내지 49% 염색된 세포 2점; 50 내지 74% 염색된 세포 3점; 및 75 내지 100% 염색된 세포 4점. 다른 점수는 염색 강도에 기초하여 배정되었고, 다음과 같다: 음성 염색 0점; 약한 염색 1점; 중간 염색 2점; 및 강한 염색 3점. 두 점수를 곱해서 최종 점수를 얻었다. 최종 점수가 4점 이상이면 발현 상태를 양성으로 간주했다.
플라스미드 및 siRNAs - FLAG-태그드 MEL-18 cDNA와 대략 1kb MEL-18 프로모터를 PCR에 의해서 생성하고, 각각 pCI-neo 벡터(Promega) 및 pGL3 루시페라제 리포터 벡터(Promega)에 삽입했다. ER-α cDNA와 ERE 루시페라제 구성물은 신인철(대한민국, 서울, 한양대학교; ref. 5)이 제공해 주었다. pGL3-염기성 벡터 중의 ESR1 프로모터 리포터 구성물 ER proAB, proC 및 prod는 하야시 신이치 (일본, 사이타마, 사이타마 암센터 연구소; ref. 1)가 제공해 주었다. ER proE와 proF (ref. 1)를 PCR에 의해서 생성하고, pGL3 벡터에 클로닝했다. PRE 루시페라제와 pcDNA3-HA-SUMO-1 구성물은 Addgene (미국 매사츄세츠 캠브릿지)로부터 얻었으며, 각각 도날드 맥도넬 (미국, 노스캐롤라이나, 더럼, 듀크 유니버시티; ref. 6)과 유안 주녕 (미국, 매사츄세츠, 보스턴, 하버드 메디컬 스쿨; ref. 7)이 기탁한 것이었다. FLAG-태그드 UBC9 cDNA는 김철근 (대한민국, 서울, 한양대학교)이 제공해 주었다. HA-태그드 유비퀴틴 구성물은 모세 오렌 (이스라엘, 레호보트, 웨이즈만 인스티튜트 오브 사이언스; ref. 8)이 제공해 주었다. RING1B 야생형과 C51W/C54S 돌연변이체 구성물 (강성만 제공, 대한민국, 서울, 고려대학교; ref. 9)을 pCI-neo 벡터에 삽입했다. p53 야생형과 SUMO화-결핍 K386R 돌연변이체 구성물을 PCR 및 돌연변이유발에 의해서 각각 생성하고, pCI-neo 벡터에 클로닝했다. SP1 야생형과 E18A 돌연변이체 구성물은 헝잔정 (대만, 타이난, 국립청강대학교; ref. 10)이 제공해 주었다. FLAG-태그드 SENP1 야생형 또는 비활성 돌연변이체 (R630L, K631M) 구성물은 Addgene로부터 얻었으며, 에드워드 예 (미국, 텍사스, 휴스턴, 더 유니버시티 오브 텍사스 엠디 엔더슨 캔서 센터: ref. 11)가 기탁한 것이었다. SENP1 안정 발현을 위해서 SENP1 야생형 cDNA를 pCI-neo 벡터에 서브클로닝했다. 일시적 녹다운 실험을 위해서 비-표적화 siRNA 및 siRNA 표적화 ER-α, BMI-1, p53, Sp1 및 SENP1을 Bioneer Corporation에서 구입했다. 대조군 및 MEL-18의 SmartPool siRNA는 Dharmacon RNA Technologies로부터 얻었다. 이들 siRNA를 제조자에 의해서 설명된 대로 48h 동안 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 함께 세포에 트랜스펙션했다.
항체 - 면역 블롯팅에 사용된 항체는 다음과 같았다: MEL-18(sc-10744), ER-α(sc-543), PR(sc-539), HER2(sc-284), SENP1(sc-46634), p53(sc-126), SP1(sc-59), CBP(sc-369), SUMO-1(sc-9060), BMI-1(sc-10745), Geminin(sc-13015), RING1B(sc-101109), EED(sc-28701), YY1(sc-7341), CBX2(sc-19297), HA(sc-805), HDAC1(sc-7872), HDAC2(sc-7899), DNMT1(sc-20701), DNMT3a(sc-20703), and pRb2/p130(sc-317)(Santa Cruz Biotechnology); HER2(NCL-L-CB11)(Leica Biosystems); TFF1(12419),EZH2(3147), AKT(9272) 및 유비퀴틴(3936)(Cell Signaling Technology); H3Ac(06-599), H4Ac(06-866), H3K27me3(07-449), p300(05-257) 및 c-JUN(06-225)(Millipore); SUZ12(ab12073), CBX7(ab21873), H3K9me3(ab8898) 및 p-AKT Ser473(ab66138)(Abcam); SAE1(AP1199), UBC9(AP1064), SUMO2/3(AP1224), PIAS1(AB1243), PIAS2(AP1246), PIAS4(AP1249), CBX4(AP2514), SENP2(AP1232) 및 SENP3(AP1234)(Abgent); β-액틴(Sigma-Aldrich).
프라이머 - RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같았다: MEL -18(PCGF2), 5'-GGCGGGATTTCTATGCAG-3' 및 5'-AATTCGATGGAGAGGCTGAC-3'; ESR1,5'-ACCATGACCCTCCACACCAAAGCATC-3' 및 5'-GTAGTTGTACACGGCGGGCTTGCTG-3'; TFF1 ( pS2 ), 5'-GTACACGGAGGCCCAGACAGA-3' 및 5'-AGGGCGTGACACCAGGAAA-3'; PR, 5'-GGCCATACCTATCTCCCTGGA-3' 및 5'-CTCCACGTCCGACAGCGACT-3'; SENP1, 5'-ACTGATAGTGAAGATGAATTTCCTGA-3' 및 5'-CATCCTGATTCCCATTACGAA-3'; GAPDH, 5'-CATGTTCCAATATGATTCCA-3' 및 5'-CCTGGAAGATGGTGATG-3'; HDAC1, 5'-GGAAATCTATCGCCCTCACA-3' 및 5'-CTCGGACTTCTTTGCATGGT-3'; HDAC2, 5'-GAGGTGGCTACACAATCCGT-3' 및 5'-TTCGACCTCCTTCTCCTTCA-3'; EP300(p300), 5'-AAACCCACCAGATGAGGAC-3' 및 5'-TATGCACTAGATGGCTCCGCAG-3'; DNMT1, 5'-ATGGCAGATGCCAACAGCCCC-3' 및 5'-CTCCTTCAGTTTCTGTTTGGGTG-3'; DNMT3A, 5'-GGGGACGTCCGCAGCGTCACAC-3' 및 5'-CAGGGTTGGACTCGAGAAATCGC-3'; SUV39H1, 5'-GGAGAAAGATGGCGGAAA-3' 및 5'-GACAAGAAAGCTTGGCTAGT-3'; RBL2 ( pRB2 /p130), 5'-GAGCTGTGCAGCCGCCTCAA-3' 및 5'-GGCTGTCGCCGCTGTTTCCT-3'.
바이러스 감염 및 안정한 트랜스펙션 - 안정한 MEL-18 과발현 또는 녹다운의 경우, 렌티바이러스 MEL-18 shRNA-감염된 셀라인과 레트로바이러스 MEL-18-과발현 셀라인을 각각 종래 보고된 바대로 확립했다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13; Park JH, Lee JY, Shin DH, Jang KS, Kim HJ, and Kong G. Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1alpha mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway. Oncogene. 2011;30(45):4578-89). MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 RING1B 활성을 억제하고 SENP1 발현을 회복하기 위하여 세포를 pCI-neo, pCI-neo-RNF2 C51W/C54S, 또는 pCI-neo-SENP1 벡터로 트랜스펙션하고, 1mg/ml G418 설페이트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 선택했다.
면역 블롯팅 및 면역 침전 - 세포를 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼에 용해했다. SUMO화된 단백질을 검출하기 위해서 세포를 20mM N-에틸말레이미드(NEM, Sigma-Aldrich)를 함유하는 RIPA 버퍼에서 추출하고 소니케이션했다. 면역 블롯팅은 종래 보고된 바대로 수행했다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13). 공-면역침전의 경우, pCI-neo 또는 pCI-neo-MEL-18-FLAG 벡터로 트랜스펙션된 293T 세포의 세포 용해물을 항-p53 또는 항-FLAG 항체를 사용하여 면역 침전시켰다. 침전물을 상기 설명된 대로 면역 블롯팅에 의해서 분석했다. AlphaEase FC 소프트웨어 (AlphaInnotech)를 사용하여 면역 블롯 밴드 밀도를 결정하고, 단백질 β-액틴의 발현에 대해 정규화했다.
역-전사(RT)- PCR 및 정량 실시간( qRT )- PCR - 전체 RNA 분리 및 RT-PCR을 종래 보고된 바대로 수행했다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13). RNA 발현 수준을 정량하기 위해서 7300 Real-Time PCR 시스템과 SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 qRT-PCR을 수행했다. 이들 데이터를 하우스키핑 유전자 GAPDH의 발현에 대해 정규화했다.
루시페라제 리포터 분석 - 루시페라제 리포터 분석의 경우, 세포를 12-웰 플레이트에 파종하고 리포터 구성물 및 β-gal 발현 벡터로 24h 또는 48h 동안 트랜스펙션했다. 다음에, 종래 보고된 바대로 루시페라제 리포터 분석을 수행했다 (Lee JY, Jang KS, Shin DH, Oh MY, Kim HJ, Kim Y, and Kong G. Mel-18 negatively regulates INK4a/ARF-independent cell cycle progression via Akt inactivation in breast cancer. Cancer Res. 2008;68(11):4201-9).
세포 증식 분석 - 타목시펜 처리시 유방암 세포 성장에 대한 MEL-18의 효과를 종래 보고된 바대로 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석 키트(Promega)를 사용하여 조사했다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13). 요약하면, 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고 에탄올 또는 타목시펜으로 처리했다. 처리 5일 후, 세포를 3h 동안 37°C에서 MTT 염료 용액에서 인큐베이션하고, 용해/중단 용액의 첨가에 의해서 반응을 종료시켰다. 570nM 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정했다.
결과
MEL-18의 손실은 사람 유방암의 불량한 예후와 삼중-음성을 표시한다.
유방암에서 MEL-18의 새로운 종양-억제 기능을 확인하기 위해 본 발명에서는 먼저 223건의 사람 원발성 유방암에서 MEL-18의 임상적 타당성을 조사했다. 낮은 MEL-18 발현은 큰 종양 크기 (P= 0.001)와 American Joint Committee on Cancer (AJCC)의 더 높은 단계(P= 0.021)와 상관되었다 (표 1 참조). 주목할 점은 MEL-18 발현이 유방암 서브타입 (도 1 및 표 1 참조) 중에서도 TNBC와 유의하게 관련되었다는 점이다 (P= 0.003). 특히, MEL-18 발현은 ER-α 및 PR 발현과는 강하게 상관되었지만 (각각 P= 0.001 및 0.029), HER2 과발현과는 상관되지 않았다 (P= 0.164) (도면 1B 및 표 1 참조).
임상병리학적 특징 n MEL-18 발현 P 값
(피셔 이그젝트 테스트)
음성 양성
AJCC 단계 0.021
I-II 단계 164 91 (55.5%) 73 (44.5%)
III-IV 단계 59 43 (72.9%) 16 (27.1%)
종양 크기 0.001
< 5 cm 117 58 (49.6%) 59 (50.4%)
> 5 cm 106 76 (71.7%) 30 (28.3%)
림프절 전이 0.497
음성 119 69 (58.0%) 50 (42.0%)
양성 104 65 (62.5%) 39 (37.5%)
조직학적 등급* 0.098
1-2 등급 138 81 (58.7%) 57 (41.3%)
3 등급 54 39 (72.2%) 15 (27.8%)
ER-α 상태 0.001
음성 97 70 (72.2%) 27 (27.8%)
양성 126 64 (50.8%) 62 (49.2%)
PR 상태 0.029
음성 103 70 (68.0%) 33 (32.0%)
양성 120 64 (53.3%) 56 (46.7%)
HER2 상태(IHC) 0.164
음성 181 113 (62.4%) 68 (37.6%)
양성 42 21 (50.0%) 21 (50.0%)
분자 분류** 0.003
루미날 125 64 (51.2%) 61 (48.8%)
HER2-양성 29 16 (55.2%) 13 (44.8%)
트리플 53 45 (84.9%) 8 (15.1%)
*침습적 유관 암종만.
** ER-α, PR 및 HER2 상태에 기초.
광범위한 임상 샘플에서 이들 결과를 더 검증하기 위해서 본 발명에서는 유방암 환자의 몇 개의 공개적으로 이용 가능한 유전자-발현 마이크로어레이 데이터세트를 분석했다. 본 발명의 임상 집단 결과와 일치하여, MEL-18 mRNA 수준은 이들 독립적인 데이터세트들에서 루미날 및 HER-2-양성 사례보다 TNBC 사례에서 유의하게 저하되었다 (도면 1C 참조). 더욱이, 상관성 분석은 MEL-18 발현이 루미날 마커 ESR1, PGR, GATA3 및 FOXA1의 발현과 양성적으로 관련되는 경향이 있음을 드러냈다 (도면 1D 및 표 2 참조).
데이터세트
(수탁 no.)		 Ref. n MELl-18 발현과의 비교
r 값 (P 값)
ESR1 PGR FOXA1 GATA3
Richardson et al., 2006 (GSE7904) 21 43 0.285
(0.025)		 0.400
(0.001)		 0.448
(<0.001)		 0.459
(<0.001)
Li et al., 2010
(GSE19615)		 22 115 0.427
(<0.001)		 0.465
(<0.001)		 0.504
(<0.001)		 0.505
(<0.001)
MAQC-II, 2010
(GSE20194)		 23 278 0.307
(< 0.001)		 0.182
(0.002)		 0.313
(< 0.001)		 0.239
(< 0.001)
Hatzis et al., 2011
(GSE25066)		 24 508 0.386
(< 0.001)		 0.252
(< 0.001)		 0.492
(< 0.001)		 0.434
(< 0.001)
Chin et al., 2006
(E-TABM-158)		 25 100 0.385
(< 0.001)		 0.255
(0.005)		 0.447
(< 0.001)		 0.425
(< 0.001)
Gibson et al., 2005
(MDA-133)		 26 133 0.291
(< 0.001)		 0.155
(0.074)		 0.399
(< 0.001)		 0.399
(< 0.001)
Bos et al., 2009
(GSE12276)		 27 204 0.379
(< 0.001)		 0.363
(< 0.001)		 0.420
(< 0.001)		 0.446
(< 0.001)
상관성 계수를 결정하기 위해 Affymetrix GeneChips 상에서 각 유전자에 대한 다중 프로브의 평균 발현이 사용되었다. r 값은 스피어만 랭크 상관 계수 분석을 통해 계산되었다. 점수: +1 = 완벽한 양성 상관성; 0 = 상관성 없음; 및 -1 = 완벽한 역 상관성. r> 0.3 및 P< 0.05는 유의한 양성 관계를 나타낸다.
Kaplan-Meir 방법과 로그-랭크 테스트와 Cox 회귀 모델을 차례로 사용하여 MEL-18 발현과 유방암 환자 생존의 관련성을 분석함으로써, MEL-18의 손실이 더 불량한 전체 생존률 (OS; 각각 P= 0.001 및 0.003) 및 질환 무관 생존률 (DFS; 각각 P= 0.011 및 0.003, 도면 1E 및 표 2)과 상관된다는 것을 추가로 확인했다. 게다가, 다변량 생존 분석은 MEL-18 손실이 불량한 OS의 독립적인 예후 인자임을 드러냈다 (표 3 참조).

 일변량 (Univariate) 다변량 (Multivariate)
HR 95% CI P 값 HR 95% CI P 값
DFS
단계
(I 또는 II vs. III 또는 IV)		 3.917 2.247-6.831 <0.001 3.104 1.308-7.366 0.01
등급 (1 또는 2 vs. 3) 0.979 0.504-1.900 0.949
LN 전이 2.33 1.307-4.152 0.004 1.063 0.440-2.565 0.893
ER-α (음성 vs. 양성) 0.566 0.324-0.989 0.046 0.692 0.390-1.228 0.208
PR (음성 vs. 양성) 0.692 0.397-1.206 0.194
HER2 (음성 vs. 양성) 0.951 0.462-1.957 0.891
MEL-18 (음성 vs. 양성) 0.349 0.174-0.698 0.003 0.524 0.253-1.084 0.082
OS
단계
(I 또는 II vs. III 또는 IV)		 4.874 2.406-9.876 <0.001 5.316 1.608-17.570 0.06
등급 (1 또는 2 vs. 3) 1.001 0.443-2.260 0.998
LN 전이 2.386 1.150-4.949 0.019 0.651 0.191-2.223 0.493
ER-α (음성 vs. 양성) 0.509 0.251-1.031 0.061
PR (음성 vs. 양성) 0.528 0.261-1.071 0.077
HER2 (음성 vs. 양성) 0.821 0.316-2.133 0.686
MEL-18 (음성 vs. 양성) 0.165 0.050-0.543 0.003 0.226 0.068-0.755 0.016
*Cox 회귀 위험 모델
HR = 위험비; CI = 신뢰 구간
MEL-18 발현을 나타낸 TNBC 환자는 또한 MEL-18 음성을 나타낸 환자보다 더 유리한 생존 성과의 경향을 나타냈지만, 이 차이는 유의하지 않았다 (OS, P= 0.083; DFS, P= 0.178) (도 1E 참조). 4,142명의 유방암 환자에 대한 생존 정보를 담은 메타-분석-기반 Kaplan-Meier Plotter에 기초하여, 본 발명에서는 또한 특히 루미날 서브타입에서 더 낮은 MEL-18 mRNA 수준과 불리한 생존 사이의 유의한 관련성을 확인했다 (도 8A 및 8B). 그러나, MEL-18 손실이 이미 나타났을 수 있는 기저 서브타입에서는 MEL-18을 높은 수준과 낮은 수준으로 발현한 그룹 사이에 유의한 생존 차이가 관찰되지 않았다 (도 8C). 종합하면 이들 데이터는 MEL-18이 사람 유방암의 예후 인자 및 새로운 마커로서 사용되며, 그것의 손실은 호르몬 수용체-음성 및 삼중-음성과 관련된다는 것을 시사한다.
MEL-18은 호르몬 수용체를 조절한다.
본 발명에서는 또한 MEL-18이 호르몬-수용체-양성 암 세포주에서 강하게 발현되지만, ER-α-음성 및 TNBC 셀라인에서는 그것의 발현이 약하거나 부재한 것을 확인했다 (도 9A). 다른 폴리콤 (polycomb) 그룹 (PcG) 단백질인 EZH2 및 BMI-1의 발현은 이들 세포주에서 호르몬 수용체 상태와 상관되지 않았다. 호르몬 수용체-양성 세포에서 MEL-18의 기능적 역할을 조사하기 위하여, MCF-7 루미날 유방암 세포로 shRNA 번역을 통한 MEL-18 녹다운 후 유전자-발현 마이크로어레이를 수행했다. 대조군과 비교하여 MEL-18의 고갈은 ESR1 및 PGR을 포함한 몇 개의 루미날 마커의 하향조절을 유도했고 (각각 1.6- 및 1.9-배 감소), CAV1, CAV2 및 KRT17을 포함한 다양한 기저 마커의 상향조절을 유도했다 (도 2A). 더욱이, 유전자 온톨로지 (GO) 분석은 MEL-18 표적 유전자가 호르몬 자극 및 유선 발생에 대한 반응을 비롯한 호르몬-관련 생리학적 과정에서 상당히 부화됨을 시사했다 (도 2B). ER-α 및 PR은 유방암의 호르몬 조절에 연루된 가장 우세한 인자이기 때문에 우리는 이들 호르몬 수용체에 대한 MEL-18의 효과를 더 시험했다. 유전자 발현 어레이의 결과와 일치하여, ER-α 및 PR의 감소된 단백질 및 mRNA 수준이 두 HER2-비증폭 루미날 유방암 세포주 MCF-7 및 T47D에서 MEL-18 녹다운 후 관찰되었다 (도 2C 및 D, 또한 도 9B). 더욱이, MEL-18 과발현은 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468 TNBC 세포에서 ESR1과 PR의 발현을 모두 유도했다 (도 2E 및 도 9B). 특히, TNBC 세포에서는 ER-α 단백질 수준이 MEL-18 과발현에 의해서 약간 회복되었다 (도 2C). HER2 발현에 대한 효과는 MEL-18-침묵화된 루미날 세포나 MEL-18-과발현 TNBC 세포에서 관찰되지 않았다. 이전에 특성화된 ESR1 프로모터를 사용한 루시페라제 리포터 분석에 기초하여, 추가로 MEL-18이 ESR1proAB로 명명된 근위 ESR1 프로모터의 활성을 조정한다는 것을 확인했다 (도 9C 및 9D). MEL-18 녹다운은 또한 PR 프로모터 활성을 감소시켰다 (도 9E). 종합하면 이들 데이터는 MEL-18이 루미날 유방암 및 TNBC 세포에서 모두 호르몬 수용체의 발현을 전사 조절한다는 것을 나타낸다.
MEL -18의 손실은 에스트로겐 독립성 및 항-호르몬 요법에 대한 내성을 부여한다.
또한, 본 발명에서는 MEL-18에 의한 ER-α 발현의 조절이 ER-α-의존적 전사 활성에 영향을 미치는지의 여부를 조사했다. MEL-18 녹다운은 MCF-7을 포함하는 루미날 유방암 세포주에서 17β-에스트라디올(E2)-유도 에스트로겐-반응 요소(ERE) 루시페라제 활성 및 ER-α 표적 유전자 TFF1 및 PGR의 발현을 사라지게 했다. 또한, MEL-18-과발현은 TNBC 세포주에서 E2-매개 ERE 활성 및 표적 유전자 발현을 회복시켰다 (도 3A-3C 및 도 10A 및 10B). 게다가, MEL-18 녹다운으로 인한 감소된 PR 발현은 PRE 루시페라제 활성에 영향을 미쳤다 (도 9F). 이들 데이터는 MEL-18이 이들의 발현을 조정함으로써 호르몬 수용체 활성화를 유도한다는 것을 나타냈다. 더 나아가 MEL-18 발현 및 호르몬 활성에 관한 잠재적 피드백 기전을 조사했다. 그러나, MEL-18 발현은 에스트로겐 또는 프로게스테론 치료에 반응하여 변경되지 않았다 (도 11A-11D). 다음으로, 호르몬 수용체-양성 암 세포에서 MEL-18 녹다운으로 인한 ER-α 발현 및 활성의 손실이 에스트로겐-의존적 표현형에서 에스트로겐-독립적 표현형으로의 진행을 초래하는지의 여부를 시험했다. MCF-7 및 T47D 세포에서 MEL-18 손실은 E2 처리와 무관하게 세포 성장을 증가시켰다 (도 12A). 반대로, MEL-18 과발현에 의해서 야기된 성장 지연은 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231 세포에서 E2 치료에 의해 완화되었는데, 이는 MEL-18 과발현으로 인한 TNBC 세포에서 E2 신호화의 회복을 의미한다. 또한, MEL-18이 E2 상태와 무관하게 이들 세포에서 AKT 인산화 수준을 음성적으로 조절한다는 것을 확인했는데, 이것은 MEL-18이 AKT-의존적 유방암 세포 성장을 억제한다는 종래 문헌의 내용과 일치한다 (Lee JY, Jang KS, Shin DH, Oh MY, Kim HJ, Kim Y, and Kong G. Mel-18 negatively regulates INK4a/ARF-independent cell cycle progression via Akt inactivation in breast cancer. Cancer Res. 2008;68(11):4201-9). 추가로, 생체 내에서 에스트로겐-독립적 유방 종양 성장에 대한 MEL-18의 효과를 확인했다. 주목할 점은 종양 발생률 및 성장 속도에 의해서 측정되었을 때 대조군 세포의 이종 이식편과 비교하여 MEL-18이 녹다운된 MCF-7 및 T47D 세포의 마우스 이종 이식편에서 E2 처리의 부재시 증가된 종양 형성이 관찰되었다는 점이다 (도 3D, 표 4, 도 13, 및 표 5 참조). 더욱이, IHC 분석은 E2 처리의 부재하에 대조군 마우스에서 형성된 종양이 MEL-18, ER-α 및 PR의 낮은 발현을 나타낸 것과 MEL-18 고갈이 ER-α를 더 하향 조절한 것을 증명했다 (도 3E).
그룹 종양 발생 (≥ 30 mm3, n = 8)
7일째 13일째 21일째 28일째 32일째
shCon 0/8 (0%) 0/8 (0%) 1/8 (12.5%) 6/8 (75%) 8/8 (100%)
shMEL 1/8 (12.5%) 4/8 (50%) 5/8 (62.5%) 7/8 (87.5%) 8/8 (100%)
P 값 <0.0001
E2 주사의 부재하에 대조군(shCon) 또는 MEL-18 shRNA(shMEL)을 발현하는 MCF-7이 주사된 NOD/SCID 마우스에서 종양 발생률. 종양 발생률 차이의 유의성은 푸아송 분포 분석을 통해 결정되었다.
그룹 종양 발생 (n = 8)
7일째 15일째 22일째 29일째 36일째 43일째 52일째
shCon 0/8(0%) 0/8(0%) 0/8(0%) 1/8(12.5%) 2/8(25%) 2/8(25%) 2/8(25%)
shMEL 0/8(0%) 1/8(12.5%) 2/8(25%) 6/8(75%) 7/8(87.5%) 7/8(87.5%) 7/8(87.5%)
P 값 <0.0001
E2 주사의 부재하에 대조군(shCon) 또는 MEL-18 shRNA(shMEL)를 발현하는 T47D 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스에서 종양 발생률. 종양 발생률 차이의 유의성은 푸아송 분포 분석을 통해 결정되었다.
ER-α 손실이 항-호르몬 요법 내성의 주요 원인이기 때문에, 본 발명에서는 유방암 세포에서 타목시펜 치료에 대한 MEL-18의 효과를 조사했다. MEL-18 녹다운은 루미날 유방암 세포에 타목시펜 내성을 부여했으며, 주목할 점은 MEL-18 과발현이 타목시펜에 대한 TNBC 세포의 민감성을 회복시켰다는 점이다 (도 4A 및 도 14A). 이런 효과는 ER-α에 의해서 매개되었는데, 이는 ER-α 발현의 회복이 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 타목시펜 내성을 없앴기 때문이다 (도 14B). 더욱이, 대조군 MCF-7 세포에서 siRNA에 의한 일시적 ER-α 녹다운의 효과는 MEL-18 녹다운의 효과와 유사했다. 이들 시험관내 결과와 일치하여, 타목시펜 처리는 성장 곡선 분석과 Ki-67 및 TUNEL 염색에 의해서 확인된 대로 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포의 마우스 이종 이식편에서 항-증식 및 항-세포자살 효과를 가져왔다 (도 4B 및 도 15A). MEL-18 고갈은 또한 E2 및/또는 타목시펜으로 처리된 마우스에서 ER-α 및 PR 발현의 감소를 지속시켰고, AKT 활성을 증가시켰다 (도 4C 및 도 15A). 더욱이, MEL-18-과발현 MDA-MB-468 TNBC 세포 종양을 지닌 마우스는 타목시펜 치료에 대한 민감성을 획득했지만, 대조군과 MEL-18-과발현 세포 이종 이식편 간에 전체 종양 성장의 차이는 관찰되지 않았다 (도 4D). 이종 이식편 모델에서 MDA-MB-468 세포보다 더 빠른 종양 성장을 나타낸 MDA-MB-231 세포가 주사된 마우스에서도 MEL-18 과발현은 종양을 타목시펜에 대해 약간 민감하게 만들어 장기적 종양 성장을 저해했다 (도 14C). 따라서, 이들 시험관내 및 생체내 데이터는 MEL-18이 타목시펜에 대한 루미날 유방암과 TNBC 모두의 반응에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 몇 개의 에스트로겐-독립적 성장 인자와 이들의 하류 표적, 예컨대 PI3K/AKT 경로의 것들은 유방암에서 항-에스트로겐 내성에 기여한다는 것이 보고된 바 있다 (Osborne CK, and Schiff R. Mechanisms of endocrine resistance in breast cancer. Annu Rev Med. 2011;62(233-47)). 본 발명에서는 AKT가 E2 및/또는 타목시펜 처리와 무관하에 MEL-18-침묵화된 루미날 유방암 세포에서 일정하게 활성화된다는 것을 관찰했기 때문에 (도 5B 및 15A), PI3K/AKT 신호화가 타목시펜 반응의 MEL-18-매개 변경에 연루되는지의 여부를 더 조사했다. PI3K 저해제인 BKM120에 의한 MCF-7 세포의 이종 이식편 종양의 생체내 처리는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포-기반 종양이 대조군 세포-기반 종양과 비교하여 타목시펜에 대해서보다 BKM120에 대해 더 민감했음을 드러냈다 (도 15C). 더욱이, BKM120과 타목시펜의 병용 치료는 시험관내 및 생체내 모두에서 이들 종양에 대해 상승작용적 항-종양 효과를 가져왔다 (도 15B 및 15C). 종합하면 이들 결과는 ER-α 손실 및 AKT 활성화가 MEL-18-손실-매개 타목시펜 내성에 필요하다는 것을 나타낸다. 우리는 또한 타목시펜을 받은 음성 MEL-18 발현을 가진 ER-α-양성 환자의 하위군(n= 103)이 더 불량한 OS 및 DFS를 포함해서 양성 MEL-18 발현을 가진 환자들보다 유의하게 악화된 성과를 나타낸 것을 확인했다 (OS, P= 0.034 및 0.048; DFS, P= 0.033 및 0.026; 각각 로그-랭크 테스트 및 Cox 회귀) (도 4E). 종합하면 이런 발견들은 MEL-18 손실로 인한 연속적인 ER-α 하향조절과 대용 성장 신호화 활성화가 에스트로겐 결핍 및 항-호르몬 요법에 대한 내성을 야기함으로써 호르몬 수용체-음성 유방암의 특징을 부여한다는 것을 의미한다.
MEL-18은 ESR1 발현을 유도할 수 있는 p53 및 SP1의 SUMO화를 저해한다.
다음으로, MEL-18이 ER-α 전사를 조절하는 분자 기전을 조사했다. MEL-18에 의해서 조절되는 ESR1의 근위 프로모터 영역은 몇 개의 체외 및 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유한다. 그러나, ESR1 유전자 및 PcG 단백질의 공지된 체외 변형제의 발현 또는 ESR1 프로모터에서 H3K27me3 및 DNA 메틸화를 포함하는 히스톤 변형의 상태에서 대조군과 MEL-18-침묵화된 세포 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 16A-C). 또한, P53, SP1 및 c-Jun을 포함하는 주요 ESR1 전사 인자의 전체 발현도 변하지 않았다 (도 16D).
MEL-18은 UBC9 및 그것의 기질 모두와의 직접 결합에 의해서 항-SUMO E3 리가아제로 기능하며, 전사 인자의 SUMO화는 주로 전사 저해에 연루된다. 따라서, 본 발명에서는 MEL-18이 SUMO화의 저해를 통해서 ESR1 전사를 조절할 수 있다는 가설을 세웠다. 우리는 먼저 UBC9의 직접 표적이라고 보고된 p53과 SP1이 MEL-18의 새로운 기질인지의 여부를 결정했다. MEL-18은 시험관내에서 직접 상호작용하여 SUMO-1과 p53 단백질의 결합을 저해했지만, SP1 단백질에 대해서는 저해하지 않았으며 (도 17A-D), 반면 생체내에서 SUMO화 분석은 MEL-18이 p53 및 SP1 모두에 대한 SUMO-1의 콘쥬게이션을 저해하는 것으로 나타났다 (도 17E). 더욱이, 내인성 SUMO화된 p53 및 SP1 단백질은 MCF-7 및 MDA-MB-468 세포에서 모두 MEL-18에 의해서 역으로 조절되었는데 (도 5A), 이것은 MEL-18이 간접적인 SUMO화-조절 경로를 통해서 SP1 SUMO화를 조절할 수 있음을 시사한다. CBP 및 c-Jun의 SUMO화된 형태는 이들 세포에서 검출되지 않았다. 이들 결과는 MEL-18이 p53 및 SP1 SUMO화를 직접적으로 또는 간접적으로 저해함을 의미한다. p53과 SP1가 모두 보편적인 전사 조절인자이기 때문에 우리는 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에 대한 우리의 마이크로어레이 결과와 p53 및 SP1의 협력 활성을 유도하여 이들의 표적 유전자를 전사 조절하는 소 분자인 RITA로 처리된 MCF-7 세포에 대한 GEO 데이터세트 (Grinkevich et al; GSE13291)의 유전자 발현 프로파일을 비교함으로써 MEL-18과 p53/SP1의 공통 표적 유전자를 결정했다. 전사 조절과 세포 증식에 연루된 몇 개의 유방암 서브타입-특이적 마커 및 유전자가 MEL-18과 p53/SP1의 공통 표적이었다 (도 5B 및 도 18A). ESR1이 이들 데이터세트에서 공유된 표적 유전자였기 때문에 우리는 다음으로 p53 및 SP1 SUMO화가 ESR1 전사에 영향을 미치는지의 여부를 결정했다. 근위 ESR1 프로모터의 활성은 MCF-7 세포에서 이들의 야생형(WT) 형태의 발현과 비교하여 p53(K386R) 또는 SP1(E18A)의 SUMO화-결핍 성숙체 형태의 발현에 의해서 증강되었다 (도 18B). 더욱이, p53 K386R은 WT p53과 비교하여 유의한 ESR1 프로모터-결합 능력을 나타냈다 (도 18C). p53 점 돌연변이를 지닌 TNBC 세포에서 (MDA-MB-468, R273H; MDA-MB-231, R280K), SUMO 저해제인 징콜산 처리를 통한 SUMO화의 저해가 또한 ESR1 프로모터 활성을 증진시켰다 (도 18D). 유사하게, MCF-7 세포에서 MEL-18 녹다운으로 인한 ESR1 프로모터 활성의 감소는 p53 또는 SP1의 성숙체 형태의 발현에 의해서 구제되었다 (도 5C). p53과 SP1 성숙체가 공-발현되었을 때 상승작용적 효과가 관찰되었다. 이와 일치하여 TNBC 세포에서 siRNA를 사용한 p53 또는 SP1의 침묵화는 MEL-18-유도 ESR1 프로모터 활성을 부분적으로 저해했고, p53과 SP1의 공-억제는 이 저해작용을 완전히 없앴다 (도 18E). 더욱이, ESR1 프로모터에 대한 p53 및 SP1의 모집은 루미날 세포에서 MEL-18 녹다운에 의해서 저해되었고, TNBC 세포에서는 MEL-18 과발현에 의해서 유도되었다 (도 5D). 이들 세포에서 검출 가능하게 SUMO화되지 않았던 c-JUN 및 CBP와 이 프로모터의 결합은 MEL-18에 의해서 영향을 받지 않았다 (도 19A). 게다가, 본 실시예의 마이크로어레이 데이터에 기초해서는 MEL-18에 의해서 표적화되지 않았던 p53의 주요 표적 유전자인 CDKN1A의 프로모터와 결합하는 p53 및 SP1의 능력은 MEL-18 녹다운 후 MCF-7에서 ESR1 프로모터 결합과 비교하여 감소되었는데 (도 19B), 이는 ESR1이 SUMO화의 MEL-18-매개 조정에서 우선적인 표적임을 시사한다. 우리는 또한 징콜산 처리에 의해서 유도된 p53 및 SP1의 SUMO화의 감소가 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 ER-α 발현을 회복시킨 것을 확인했다 (도 5E). 종합하면 이들 데이터는 MEL-18 손실로 인한 전사 인자 p53 및 SP1의 SUMO화가 ESR1 프로모터에 대한 이들의 모집을 손상시켰고, 이로써 ER-α 발현이 감소한 것을 시사한다.
MEL -18은 SENP1의 유비퀴틴 - 프로테아솜 분해를 저해함으로써 탈SUMO화를 증진시킨다.
MEL-18이 SUMO화를 조절하는 기전을 더 확인하기 위하여 SUMO-관련 인자의 발현에 대한 MEL-18의 효과를 시험했다. MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서는 SUMO E2 효소 UBC9의 39-kDa SUMO-1-콘쥬게이팅 형태의 수준이 증가하였지만, UBC9의 18-kDa 유리 형태의 수준은 감소되었다 (도 20A). 반대로, MEL-18 과발현은 TNBC 세포에서 UBC9 및 SUMO-1의 유리 형태의 발현을 증가시켰다. 주목할 점은 SUMO-1/센트린-특이적 프로테아제 1(SENP1)의 발현 및 탈SUMO화 효소 활성이 MEL-18에 의해서 양성적으로 조절되었다는 점이다 (도 20A 및 B). 이들 데이터는 MEL-18이 SENP1-매개 탈SUMO화를 증진시키고, UBC9-매개 SUMO-1 콘쥬게이션을 저해함으로써 SUMO화를 저해한다는 것을 시사한다. SENP1 mRNA 수준이 MEL-18에 의해서 변경되지 않았기 때문에 (도 6A), 우리는 다음에 MEL-18이 전사-후 수준에서 SENP1 발현을 조정하는 기전을 시험했다. 우리는 MEL-18 녹다운이 단백질 합성 저해제인 시클로헥시미드(CHX)로 MCF-7의 처리 후 가속된 SENP1 단백질 분해를 유도했음을 발견했다 (도 6B). 더욱이, 프로테아솜 저해제 MG132 처리는 이들 세포에서 SENP1 발현을 회복시켰고 (도 6C), MEL-18은 생체내 유비퀴틴화 분석에 의해서 측정된 대로 유비퀴틴화된 SENP1 단백질을 외인 및 내인적으로 모두 차단했다 (도 6D 및 E). 따라서, 이런 결과는 MEL-18 손실이 SENP1의 유비퀴틴-매개 프로테아솜 분해를 증진시킴을 시사한다. MEL-18에 의한 SENP1 단백질 안정화의 분자 기전을 확인하기 위해서, 우리는 다음에 MEL-1에 의해서 음성적으로 조절되는 BMI1/RING1B 유비퀴틴 리가아제 복합체가 SENP1 단백질을 표적화하는지의 여부를 조사했다. 도 6F에 나타낸 대로, WTRING1G와는 다르게 RING1B(C51W/C54S) 촉매 비활성 돌연변이체의 과발현은 SENP1 단백질 수준을 회복시켰고, 결과적으로 MEL-18-침묵화된 MCF-7 세포에서 ER-α 발현을 증가시켰다. RING1B 보조인자 BMI-1이 MCF-7 세포에서 siRNA에 의해 침묵화되었을 때도 유사한 효과가 관찰되었는데 (도 6G), 이것은 MEL-18이 BMI-1/RING1B를 저해함으로써 SENP1의 유비퀴틴-매개 프로테아솜 분해를 방지함을 나타낸다.
MCF-7 세포에서 SENP1 과발현이 MEL-18-고갈-매개 ER-α 하향조절을 역전시키기 때문에 (도 6H), 우리는 SENP1 발현과 호르몬 수용체 발현에 대한 그것의 탈SUMO화 활성의 효과를 더 검증했다. siRNA에 의한 SENP1 침묵화는 p53과 SP1의 SUMO화를 모두 증가시켰고, 계속해서 WT MCF-7 세포에서 전사 수준에서 ER-α 및 PR 발현을 하향 조절했다 (도 21A-C). 더욱이, SENP1의 촉매 비활성 성숙체(R630L/K631M)는 p53과 SP1의 탈SUMO화를 손상시켰고, ESR1 또는 PR 전사를 증가시키지 않았다 (도 21D-F). 이들 데이터는 MEL-18이 SENP1의 유비퀴틴-프로테아솜 분해를 저해함으로써 p53 및 SP1의 탈SUMO화를 증진시켜 ER-α 및 PR 발현을 조절한다는 것을 증명한다.
우리는 또한 223건의 사람 유방 종양 (도 22A, P= 0.001) 및 마우스 이종 이식편 모델 (도 22B 및 C)에서 SENP1 단백질 발현과 MEL-18 발현의 양성 상관성을 확인했다. 더욱이, SENP1 음성은 TNBC (P= 0.001), ER-α 음성 (P< 0.001), 더 높은 조직학적 등급 (P= 0.010), 및 더 큰 종양 크기 (P= 0.032)와 관련되었다 (표 6).
임상병리학적 특징
 n
 SENP1 발현 P 값
(피셔 이그젝트 테스트)
음성 양성
AJCC 단계 0.649
단계 1-II 164 88 (53.7%) 76 (46.3%)
단계 III-IV 59 29 (49.2%) 30 (50.8%)
종양 크기 0.032
< 5 cm 117 53 (45.3%) 64 (54.7%)
> 5 cm 106 64 (60.4%) 42 (39.6%)
림프절 전이 0.350
음성 119 66 (55.5%) 53 (44.5%)
양성 104 51 (49.0%) 53 (51%)
조직학적 등급* 0.010
등급 1-2 138 66 (47.8%) 72 (52.2%)
등급 3 54 37 (68.5%) 17 (31.5%)
ER-α 상태 <0.001
음성 97 64 (66.0%) 33 (34.0%)
양성 126 53 (42.1%) 73 (57.9%)
PR 상태 0.080
음성 103 61 (59.2%) 42 (40.8%)
양성 120 56 (46.7%) 64 (53.3%)
HER2 상태 (IHC) 0.735
음성 181 94 (51.9%) 87 (48.1%)
양성 42 23 (54.8%) 19 (45.2%)
분자 분류** 0.001
루미날 125 53 (42.4%) 72 (57.6%)
HER2-양성 29 17 (58.6%) 12 (41.4%)
트리플-음성 53 37 (69.8%) 16 (30.2%)
*침습적 유관 암종만.
** ER-α, PR 및 HER2 상태에 기초.
그러나, 다변량 분석은 SENP1 발현이 생존에 대한 강한 독립적 예후 인자가 아니었음을 나타냈다 (표 7). 따라서, 이들 데이터는 유방암 진행에서 MEL-18-매개 SENP1 조절의 중요성을 나타내며, SENP1과 MEL-18을 ER-α 음성의 새로운 마커로서 제안한다.

 일변량 (Univariate) 다변량 (Multivariate)
HR 95% CI P 값 HR 95% CI P 값
DFS
단계
(I 또는 II vs. III 또는 IV)		 3.917 2.247-6.831 <0.001 3.692 1.557-8.751 0.003
등급 (1 또는 2 vs. 3) 0.979 0.504-1.900 0.949
LN 전이 2.33 1.307-4.152 0.004 1.051 0.429-2.578 0.913
ER-α (음성 vs. 양성) 0.566 0.324-0.989 0.046 0.683 0.384-1.214 0.194
PR (음성 vs. 양성) 0.692 0.397-1.206 0.194
HER2 (음성 vs. 양성) 0.951 0.462-1.957 0.891
SENP1 (음성 vs. 양성) 0.581 0.323-1.043 0.069 0.595 0.327-1.083 0.089
OS
단계
(I 또는 II vs. III 또는 IV)		 4.874 2.406-9.876 <0.001 7.346 2.126-25.376 0.002
등급 (1 또는 2 vs. 3) 1.001 0.443-2.260 0.998
LN 전이 2.386 1.150-4.949 0.019 0.590 0.164-2.123 0.419
ER-α (음성 vs. 양성) 0.509 0.251-1.031 0.061
PR (음성 vs. 양성) 0.528 0.261-1.071 0.077
HER2 (음성 vs. 양성) 0.821 0.316-2.133 0.686
SENP1 (음성 vs. 양성) 0.722 0.353-1.478 0.373 0.688 0.336-1.409 0.306
*Cox 회귀 위험 모델
HR = 위험비; CI = 신뢰 구간
고찰
본 발명에서는, MEL-18이 삼중-음성 및 항-호르몬 요법 내성의 예측인자로서 사용될 수 있다는 점을 입증하고 있다. 더욱이, 본 발명에서는 MEL-18이 ESR1 유전자를 조절하는 새로운 기전을 확인했다. MEL-18은 SENP1의 유비퀴틴-프로테아솜 분해를 통해 SUMO-1 콘쥬게이션을 억제하거나 탈SUMO화를 활성화함으로써 ESR1 전사 인자 p53 및 SP1의 SUMO화를 저해하며, 이것은 ESR의 트랜스활성화를 증진시켜 결과적으로 PR을 상향 조절한다 (도 7A). 종합하면 이런 결과는 MEL-18에 의한 SUMO-매개 호르몬 수용체 조절이 유방암 진행에 중요하다는 것을 나타낸다.
상기 실시예에 따른 데이터는 호르몬 수용체 의존성의 MEL-18 손실-유도 결여가 유방암의 진행에서 중요한 사건임을 시사한다 (도 7B). MEL-18 손실은 호르몬 독립성을 얻을 수 있는 대안적 에스트로겐-독립적 신호화 경로를 활성화할 수 있다. 수용체 티로신 키나아제 (RTK)의 과발현 및 RTK의 하류 신호화 경로, 예컨대 PI3K/AKT 경로는 유방암에서 에스트로겐 독립성 및 엔도크라인 요법 내성과 밀접히 연결된다. 실제로, 상기 실시예에 따른 데이터는 MEL-18 고갈이 호르몬 또는 항-호르몬 치료와 무관하게 AKT 인산화의 증가된 수준을 지속한다는 것과 PI3K/AKT 경로의 저해가 MEL-18 손실-매개 타목시펜 내성을 없앤다는 것을 보여주고 있다. 따라서, 본 발명에서는 MEL-18로 인한 지속적인 ER-α 하향조절 및 RTK-관련 신호화 활성화가 에스트로겐 독립성과 항-에스트로겐 요법 내성을 부여할 수 있다고 제안한다. 본 발명자들에 의한 최근 연구에 따르면, MEL-18 손실이 CD44+/CD24-줄기-형 세포 집단 및 EMT의 확장을 유도한다는 점이 보고되었는데, 이는 호르몬-독립적 기저-형 유방암의 특징이다 (Won HY, Lee JY, Shin DH, Park JH, Nam JS, Kim HC, and Kong G. Loss of Mel-18 enhances breast cancer stem cell activity and tumorigenicity through activating Notch signaling mediated by the Wnt/TCF pathway. FASEB J. 2012;26(12):5002-13; Park JH, Lee JY, Shin DH, Jang KS, Kim HJ, and Kong G. Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1alpha mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway. Oncogene. 2011;30(45):4578-89; Lee JY, Jang KS, Shin DH, Oh MY, Kim HJ, Kim Y, and Kong G. Mel-18 negatively regulates INK4a/ARF-independent cell cycle progression via Akt inactivation in breast cancer. Cancer Res. 2008;68(11):4201-9; Lee JY, Park MK, Park JH, Lee HJ, Shin DH, Kang Y, Lee CH, and Kong G. Loss of the polycomb protein Mel-18 enhances the epithelial-mesenchymal transition by ZEB1 and ZEB2 expression through the downregulation of miR-205 in breast cancer. Oncogene. 2014;33(10):1325-35). 더욱이, MEL-18이 p53, PTEN, PI3K, Wnt, Notch, 및 miR-205을 포함하는 기저-형 암 또는 TNBC와 관련된 몇몇 분자의 조절에 강하게 연루된다는 것을 증명한 연구들도 있다. 예를 들어, 높은 퍼센트의 TNBC 사례는 PTEN 발현을 결여하며, MEL-18 손실이 PTEN 하향조절 및 PI3K/AKT 활성화를 유도한다는 사실도 입증된 바 있다. p53 기능의 손실은 TNBC의 특징으로서, MEL-18은 p53이 TNBC 세포에서 성숙체 형태로 발현되었을 때도 p53 전사를 활성화함으로써 p53 기능과 관련된다. 또한, 이러한 증거는 MEL-18이 유선에서 루미날 및 기저-형 세포 운명의 조절에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하며, 이러한 가능성은 유전자 조작된 MMTV 마우스 모델을 사용하여 더 시험되어야 한다. 종합하면, 호르몬-의존성 유방암에서 MEL-18의 손실이 호르몬 수용체의 발현 또는 활성을 변경함으로써 유방암의 공격성을 악화시킨다는 점을 알 수 있다.
본 발명에서는, MEL-18에 의한 ESR1의 SUMO화-관련 전사 조절에 대한 최초의 증거를 제공한다. p53 전사 활성에 대한 SUMO화의 효과는 논란이 있지만, 본 발명에 따르면, p53 SUMO화가 그 전사 활성의 손실과 관련성이 있다는 점을 알 수 있다. p53은 SP1, c-JUN 및 CBP를 포함하는 다른 전사 인자와 전사 활성 복합체를 형성함으로써 ESR1 전사를 조절한다. 본 발명에서는, p53 및 SP1이 ESR1의 독립적 전사 활성화인자이며, MEL-18에 의한 p53과 SP1 모두의 SUMO화의 조절이, ESR1 프로모터에 대한 c-JUN 또는 CBP의 결합에는 영향을 미치지 않으면서도, ESR1 프로모터 조절에 대해 상승작용적 효과를 발휘한다는 점을 보여주고 있다. 따라서, 이러한 사실들은 ESR1 전사의 조절에서 p53 및 SP1 단백질의 MEL-18-매개 변형의 중요성을 반증하는 것이다. 돌연변이 p53 (R273H 및 R280K)은 그 기능을 유지하기 때문에, ESR1 전사를 조절하기 위해서 SUMO화 경로를 표적으로 하는 것은 야생형과 돌연변이 p53-발현 세포들에서 모두 효과적일 수 있다. 더욱이, 본 발명에서는 MEL-18이 SUMO화 과정을 조절하는 기전을 해명했다. 즉, 본 발명에서는 MEL-18이 SENP1 단백질 발현의 조정을 통해서 SUMO화의 간접적 조절에 관여한다는 것을 보여준다. 더욱이, 본 발명에서는, SENP1이 PRC-1 복합체를 함유하는 MEL-18의 새로운 유비퀴틴화 표적이며, 또한 ESR1의 전사 인자의 탈SUMO화를 증진시킴으로써 ESR1 조절에 중요하다는 점을 보여준다. 그러나, 생존 분석에 기초할 때, SENP1은 MEL-18보다 임상적으로 덜 관련되는데, 아마도 SENP1이 ER-α의 조절에서 MEL-18의 하류 표적이기 때문인 것으로 판단된다. 더 나아가, 본 발명에 따르면, 후성적 제제와 조합하여 MEL-18 및 SENP1 과발현을 통한 SUMO화의 저해가 호르몬 수용체-음성 유방암 요법에서 ESR1 재발현을 증진시킬 수 있는 가능성이 제공된다.
본 발명에 따른 데이터는 사람 유방암에서 MEL-18의 임상적 유의성을 뒷받침한다. 종래 연구들은 MEL-18 발현이 정상 유방 조직에서보다 사람 유방암 조직에서 더 낮다는 것을 증명했지만 (Riis ML, Luders T, Nesbakken AJ, Vollan HS, Kristensen V, and Bukholm IR. Expression of BMI-1 and Mel-18 in breast tissue--a diagnostic marker in patients with breast cancer. BMC cancer. 2010;10(686; Guo BH, Zhang X, Zhang HZ, Lin HL, Feng Y, Shao JY, Huang WL, Kung HF, and Zeng MS. Low expression of Mel-18 predicts poor prognosis in patients with breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2010;21(12):2361-9; Lee JY, Jang KS, Shin DH, Oh MY, Kim HJ, Kim Y, and Kong G. Mel-18 negatively regulates INK4a/ARF-independent cell cycle progression via Akt inactivation in breast cancer. Cancer Res. 2008;68(11):4201-9), 상이한 유방암 서브타입에서 MEL-18의 임상적 중요성은 평가되지 않았다.
본 발명에서는, 다양한 유방암 집단으로부터 다수의 독립적 마이크로어레이 데이터세트의 유전자 발현 프로파일과 유방암 견본의 IHC 분석에 기초하여, MEL-18 단백질 및 mRNA 수준과 TNBC 서브타입의 음성 상관성을 증명했다. 더욱이, MEL-18의 발현과 호르몬 수용체 사이의 상관성은 아직 논란이 있지만, Guo et al.가 이들의 유방암 코호트에서 MEL-18과 ER-α 발현 사이의 어떤 관련성을 검출하는데 실패했다는 점을 고려하면 (Guo BH, Zhang X, Zhang HZ, Lin HL, Feng Y, Shao JY, Huang WL, Kung HF, and Zeng MS. Low expression of Mel-18 predicts poor prognosis in patients with breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2010;21(12):2361-9), 본 발명에서 제시된 데이터와 이들 마이크로어레이 데이터세트는 MEL-18 발현과 ER-α 사람 유방암의 다른 루미날 마커 발현의 유의한 상관성을 드러낸다.
더 나아가, 본 발명에서 제시된 임상 데이터는 MEL-18이 TNBC보다 루미날 유방암의 더 귀중한 예후 마커임을 증명했다. TNBC 또는 기저 유방암 서브타입을 가진 환자에서 MEL-18의 고 발현 그룹과 저 발현 그룹 사이에 생존률 차이의 제한된 유의성은 TNBC 그룹에서 MEL-18의 배타적인 하향조절과 그것의 하류 표적 ER-α의 결여 또는 TNBC의 분자 이종성 및 매우 공격적인 특징으로 인한 것일 수 있다. 주목할 점은 MEL-18 손실을 나타내는 유방암 환자는 타목시펜 요법으로부터 치료 효과를 달성할 가능성이 적었다는 점이다. 엔도크라인 요법에 대한 내성은 유방암 치료의 주요 합병증이며, ER-α은 엔도크라인 요법의 성과를 예측하기 위한 현재 가장 중요한 임상 바이오 마커이다. 몇몇 연구는 ER-α 하향조절이 ER-α-양성 유방암에서 타목시펜 내성을 초래한다는 점을 증명한 바 있다 (Ahn BY, Elwi AN, Lee B, Trinh DL, Klimowicz AC, Yau A, Chan JA, Magliocco A, and Kim SW. Genetic screen identifies insulin-like growth factor binding protein 5 as a modulator of tamoxifen resistance in breast cancer. Cancer Res. 2010;70(8):3013-9; Parra-Palau JL, Pedersen K, Peg V, Scaltriti M, Angelini PD, Escorihuela M, Mancilla S, Sanchez Pla A, Ramon YCS, Baselga J, et al. A major role of p95/611-CTF, a carboxy-terminal fragment of HER2, in the down-modulation of the estrogen receptor in HER2-positive breast cancers. Cancer Res. 2010;70(21):8537-46). 또한, TNBC를 가진 환자에서 ER-α를 재활성화하고 타목시펜의 치료 효과를 회복시키는 것을 목표로 한 몇몇 임상 시험 (NCT01194908)이 진행 중이기도 하다. 이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 데이터는 MEL-18 과발현이 TNBC 세포에 타목시펜 민감성을 부여한다는 것을 보여주며, 이는 항-호르몬 요법에 대한 TNBC의 민감성을 회복시킬 수 있는 치료 표적으로서 MEL-18의 가능성을 뒷받침한다. 따라서, 본 발명에 따르면, MEL-18이 중요한 종양 억제인자 및 ER-α의 새로운 조절제로서 작용하며, 타목시펜 치료의 성과에 대한 새로운 예후 마커로서 사용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
종합하면, 본 발명에서는 MEL-18이 SUMO-의존적 호르몬 수용체 전사의 조절인자로서 기능하며, 항-호르몬 요법에 대한 반응과 TNBC의 새로운 예후 마커 및 예측인자임을 증명했다. 따라서, MEL-18은 항-호르몬 요법에 대한 유방암의 내성을 변경할 수 있는 유망한 분자 표적이 된다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Biomarker for diagnosis and treatment of antiestrogen-resistant or triple negative breast cancer and composition comprising the same <130> JKP-0440 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1035 <212> RNA <213> human mel-18 <400> 1 atgcatcgga ctacacggat caaaatcaca gagctgaacc cccacctcat gtgtgccctc 60 tgcggggggt acttcatcga cgccaccact atcgtggagt gcctgcattc cttctgcaaa 120 acctgcatcg tgcgctacct ggagaccaac aaatactgcc ccatgtgtga cgtgcaggtc 180 cataaaaccc ggccgctgct gagcatcagg tctgacaaaa cacttcaaga cattgtctac 240 aaattggtcc ctgggctttt taaagatgag atgaaacggc ggcgggattt ctatgcagcg 300 taccccctga cggaggtccc caacggctcc aatgaggacc gcggcgaggt cttggagcag 360 gagaaggggg ctctgagtga tgatgagatt gtcagcctct ccatcgaatt ctacgaaggt 420 gccagggacc gggacgagaa gaagggcccc ctggagaatg gggatgggga caaagagaaa 480 acaggggtgc gcttcctgcg atgcccagca gccatgaccg tcatgcatct tgccaagttt 540 ctccgcaaca agatggatgt gcccagcaag tacaaggtgg aggttctgta cgaggacgag 600 ccactgaagg aatactacac cctcatggac atcgcctaca tctacccctg gcggcggaac 660 gggcctctcc ccctcaagta ccgtgtccag ccagcctgca agcggctcac cctagccacg 720 gtgcccaccc cctccgaggg caccaacacc agcggggcgt ccgagtgtga gtcagtcagc 780 gacaaggctc ccagccctgc caccctgcca gccacctcct cctccctgcc cagcccagcc 840 accccatccc atggctctcc cagttcccat gggcctccag ccacccaccc tacctccccc 900 actccccctt cgacagccag tggggccacc acagctgcca acgggggtag cttgaactgc 960 ctgcagacac catcctccac cagcaggggg cgcaagatga ctgtcaacgg cgctcccgtg 1020 ccccccttaa cttga 1035 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> human mel-18 <400> 2 Met His Arg Thr Thr Arg Ile Lys Ile Thr Glu Leu Asn Pro His Leu 1 5 10 15 Met Cys Ala Leu Cys Gly Gly Tyr Phe Ile Asp Ala Thr Thr Ile Val 20 25 30 Glu Cys Leu His Ser Phe Cys Lys Thr Cys Ile Val Arg Tyr Leu Glu 35 40 45 Thr Asn Lys Tyr Cys Pro Met Cys Asp Val Gln Val His Lys Thr Arg 50 55 60 Pro Leu Leu Ser Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Gln Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Val Pro Gly Leu Phe Lys Asp Glu Met Lys Arg Arg Arg Asp 85 90 95 Phe Tyr Ala Ala Tyr Pro Leu Thr Glu Val Pro Asn Gly Ser Asn Glu 100 105 110 Asp Arg Gly Glu Val Leu Glu Gln Glu Lys Gly Ala Leu Ser Asp Asp 115 120 125 Glu Ile Val Ser Leu Ser Ile Glu Phe Tyr Glu Gly Ala Arg Asp Arg 130 135 140 Asp Glu Lys Lys Gly Pro Leu Glu Asn Gly Asp Gly Asp Lys Glu Lys 145 150 155 160 Thr Gly Val Arg Phe Leu Arg Cys Pro Ala Ala Met Thr Val Met His 165 170 175 Leu Ala Lys Phe Leu Arg Asn Lys Met Asp Val Pro Ser Lys Tyr Lys 180 185 190 Val Glu Val Leu Tyr Glu Asp Glu Pro Leu Lys Glu Tyr Tyr Thr Leu 195 200 205 Met Asp Ile Ala Tyr Ile Tyr Pro Trp Arg Arg Asn Gly Pro Leu Pro 210 215 220 Leu Lys Tyr Arg Val Gln Pro Ala Cys Lys Arg Leu Thr Leu Ala Thr 225 230 235 240 Val Pro Thr Pro Ser Glu Gly Thr Asn Thr Ser Gly Ala Ser Glu Cys 245 250 255 Glu Ser Val Ser Asp Lys Ala Pro Ser Pro Ala Thr Leu Pro Ala Thr 260 265 270 Ser Ser Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Pro Ser His Gly Ser Pro Ser 275 280 285 Ser His Gly Pro Pro Ala Thr His Pro Thr Ser Pro Thr Pro Pro Ser 290 295 300 Thr Ala Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ala Asn Gly Gly Ser Leu Asn Cys 305 310 315 320 Leu Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Arg Gly Arg Lys Met Thr Val Asn 325 330 335 Gly Ala Pro Val Pro Pro Leu Thr 340

Claims (17)

  1. Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Mel-18 유전자의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Mel-18 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 Mel-18 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 Mel-18 단백질에 특이적인 단클론 (monoclonal) 항체 또는 다클론 (polyclonal) 항체인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 Mel-18 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 제제는 RORC 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 조성물.
  7. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단용 키트.
  8. 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해서, 환자의 시료로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시료인 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    환자의 시료로부터 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 정상 대조군 시료 내 Mel-18 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 Mel-18 유전자의 mRNA의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것임을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 Mel-18 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 것임을 특징으로 하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암의 진단 또는 예후 분석용 마커의 검출 방법.
  13. Mel-18의 mRNA 발현을 증가시키기 위한 성분, 또는 Mel-18 단백질을 유효 성분으로 포함하는 항호르몬제 내성 및 삼중-음성 유방암 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 유방암 치료용 항-호르몬 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 유방암 치료용 항-호르몬 치료제 및 PI3K 억제제를 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 항-호르몬 치료제는 타목시펜 (tamoxifen)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 PI3K 억제제는 BKM120인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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