CN117629711A - 一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，涉及组织荧光染色和成像技术领域。本发明中所述足突形态学参数包括足突宽度、足突周长、足突面积；所述半自动测量方法包括图像采集、图像重构、足突宽度测量、足突周长/面积的测量。本发明的方法进行足细胞足突免疫染色，抗体渗透性和特异性均较好，允许抗体渗透到细胞内从而标记足细胞的足突，能够显示足细胞足突的形态结构和病理形态改变，为足细胞超微形态的研究提供新的技术手段，为临床上病理医师及肾内科医生进行患者个体化诊断、治疗和判断预后提供更加充足的证据。
Description
技术领域
本发明属于组织荧光染色和成像技术领域，具体为一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法。
背景技术
肾小球的滤过屏障主要负责把水、无机盐和小分子物质从管腔过滤进入包曼氏囊腔，白蛋白等中大分子留在肾小球的毛细血管内。蛋白尿的漏出和肾小球的滤过屏障受损有关，其中足细胞的足突（foot process，FP）和足突之间的裂隙膜组成了最后一层滤过屏障。蛋白尿的产生通常与由足细胞微丝系统重排驱动导致的不同程度的足细胞膜重塑，继而导致的足突融合（foot process effacement，FPE）和/或裂隙膜装置的破坏有关。
肾小球疾病包括微小病变肾病（minimal change disease，MCD）、局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulitis，FSGS）、膜性肾病（membranous nephropathy，MN），病理表现均包括不同程度的足突融合。
足突宽度是反应足突融合程度的重要指标。正常的足突的宽度是大约200nm左右，超过了光学衍射极限。因此几十年来，观察足突需要耗时的透射电镜（TEM）设备。然而透射电镜样本制备不同于用于光镜下观察的常规石蜡标本，需要额外的肾活检穿刺的标本以及特殊的固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等样本处理技术。另外，平均足突宽度（FPW，foot process width）是最常用的足细胞形态学测量指标。但是受限于电镜照片成像原理，对于平均足突宽度参数的测量为人工操作，因此在科研使用中采用双人背对背测量减少测量偏倚。可以看出，通过电镜设备观察足突仍存在如下问题和缺陷：1.电镜标本的制作比较复杂和耗时，需要专业的样本制备人员；2.电镜评估足细胞受限于电镜标本本身，用于光镜下观察的肾活检组织有15~25个肾小球，而电镜标本通常只有1~2个肾小球，因此对于局灶性病变的评估并不适用；3.电镜标本为超薄切片，只能观察到标本厚度约70nm的足突信息，成像范围局限；4.如果电镜标本取材不当（无肾小球）会使足细胞病的诊断陷于困境。5.对于足细胞足突形态学参数的测量为人工测量，缺乏客观性。
普通荧光显微镜的分辨率为200nm，不能对200nm以下的结构成像。在中国专利CN116558929中，通过ANGPTL4进行足细胞的染色和普通荧光显微镜的观察，只能观察到足细胞的一级和二级解剖结构，即足细胞的胞体/初级突起/次级突起，不能观察到足细胞的第三级结构，即足突。足突的观察和足突融合的识别是临床上评价足细胞病的重要指标，平均足突宽度的测量是科学研究中进行足细胞受损程度评估的金指标，既往以上指标的观察和测量只能通过电镜成像实现。因此，目前缺少一种简单直接的观察和半自动测量足细胞足突的方法。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，本发明可在超分辨显微镜下实现肾活检标本的足细胞足突的成像和形态学参数的测量，最大化利用所穿刺的肾活检标本中的所有肾小球，实现更全面、准确的足细胞损伤评估，为足细胞病的评估和预后提供更充分的依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，所述足突形态学参数包括足突宽度、足突周长、足突面积；所述方法为非诊断目的；所述方法包括如下步骤：
图像采集：制备足细胞免疫荧光染色切片，对所述免疫荧光染色切片进行结构光照明成像；
图像重构：拍摄成像后的图像，调整参数进行三维超分辨高保真重构；
足突宽度测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，对成像的单个足突的腰部进行画线，之后通过spiky插件对plot profile曲线进行高斯拟合，通过find peaks插件找到画线部位足突的波峰和波谷，最后通过高斯拟合后的曲线测量半高全宽即得该足突的宽度；
足突周长/面积的测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，将图像变为8-bit，而后对图像进行二值化处理，通过调整threshold的灰度阈值，选取所有足突部位，在set measurements中选择对应参数，通过插件analyze particles测量以上参数，读取具体数值。
优选地，所述图像采集时使用100×油浸物镜NA1.4，采集大小为2048×2048像素，获得单层厚度为0.2μm的图像。
优选地，所述图像重构参数调整为：照明调制对比度1.8；高分辨率噪声抑制2.5；失焦模糊抑制0.25。
优选地，所述足细胞免疫荧光染色切片的制备方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用高压热修复处理组织切片5~15min后室温冷却20~30min封闭；依次用一抗、二抗孵育封闭处理后的切片，封片保存。
更优选地，所述高压热修复的缓冲液为pH9.0的Tris-EDTA。
更优选地，所述一抗为ANGPTL4抗体，所述二抗为FITC-羊抗兔抗体。
更优选地，所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS稀释后使用；所述ANGPTL4抗体的稀释浓度为1:40~60；FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度为1:400~1:600。
更优选地，所述封闭的条件为利用2%FBS、2%BSA和0.2%鱼明胶封闭处理组织切片20~40min。
更优选地，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯Ⅰ液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用二甲苯Ⅱ液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。
更优选地，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的方法成像方便，使用超分辨显微镜可获得足够的分辨率，可获得肾脏切片不同层面的足突信息，进行三维重建可获得足突的三维图像；
（2）相比电镜样本需要额外的组织和制样而言，本发明的方法无需额外的标本，可直接使用常规石蜡包埋的组织切片，节省了标本和制样时间；
（3）采用本发明的方法进行足细胞足突染色，抗体渗透性和特异性均较好，允许抗体渗透到细胞内从而标记足细胞的足突，显示足细胞的足突精细结构和病理形态改变，包括足突融合；
（4）本发明的方法免疫染色过程简单，为常用的间接免疫染色技术，对技术员的要求低，可行性高；
（5）使用本发明的方法进行光学下足细胞足突染色和成像，能够最大化利用肾脏标本，纳入全部肾小球和肾小球的更多层面来全面评估足细胞受损情况，为临床医生、研究和判断预后提供更加充足的证据。
附图说明
图1为不同抗原修复方法的对比图；
图2为瘤旁肾组织进行结构化照明成像后通过本发明重构参数和进行自动化重构的对比图。
图3为瘤旁肾组织经过本发明染色后显色和超分辨成像后的足细胞足突宽度等形态学参数测量示意图；
图4为微小病变肾病患者肾活检组织的足细胞足突在本发明染色方法和成像后与电镜图片对比图；
图5为膜性肾病患者肾活检组织的足细胞足突在本发明染色方法和成像后与电镜图片对比图；
图6为局灶阶段性肾小球硬化症患者肾活检组织的足细胞足突在本发明染色方法和成像后与电镜图片对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，所述足突形态学参数包括足突宽度、足突周长、足突面积；所述方法为非诊断目的；所述方法包括如下步骤：
图像采集：制备足细胞免疫荧光染色切片，对所述免疫荧光染色切片进行结构光照明成像；
图像重构：拍摄成像后的图像，调整参数进行三维超分辨高保真重构；
足突宽度测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，对成像的单个足突的腰部进行画线，之后通过spiky插件对plot profile曲线进行高斯拟合，通过find peaks插件找到画线部位足突的波峰和波谷，最后通过高斯拟合后的曲线测量半高全宽即得该足突的宽度；
足突周长/面积的测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，将图像变为8-bit，而后对图像进行二值化处理，通过调整threshold的灰度阈值，选取所有足突部位，对黑色区域进行测量，在set measurements中选择对应参数，通过插件analyzeparticles测量以上参数，读取具体数值。
在本发明的具体实施例中，所述灰度阈值的范围为85~255。
在本发明中，所述图像采集时使用100×油浸物镜NA1.4，采集大小为2048×2048像素，获得单层厚度为0.2μm的图像。
在本发明中，所述图像重构参数调整为：照明调制对比度（illuminationmodulation contrast；IMC）1.8；高分辨率噪声抑制（high resolution noisesuppression；HNS）2.5；失焦模糊抑制（out of focus blur suppression，OBS）0.25。
在本发明中，所述足细胞免疫荧光染色切片的制备方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用高压热修复处理组织切片5~15min后室温冷却20~30min封闭；依次用一抗、二抗孵育封闭处理后的切片，封片保存；将所述切片置于结构光照明显微成像设备下观察足突的宽度、周长和面积。在本发明中，所述肾组织石蜡切片可通过常规石蜡切片制备方法获得，所述肾组织石蜡切片厚度优选为3μm；所述肾组织石蜡切片厚度在抗体的渗透性和免疫染色的分辨率上最佳。在本发明中，所述肾组织石蜡切片为肾活检组织石蜡切片。
在本发明中，所述高压热修复处理组织切片的时间优选为10min，所述热修复缓冲液为EDTA修复液（pH9.0）。加热抗原修复后必须经过室温自然冷却20~30min，使未折叠的ANGPTL4蛋白分子链恢复天然构型，如果采用快速冷却可能会使蛋白分子复性时破坏天然结构，影响免疫反应。另外在高压热修复处理时间上，处理时间过短足突的形态无法全部显示；处理时间过长，部分足突会脱落。本发明通过调整热修复的处理时间，进行一次抗原修复既能暴露全部抗原，保证全部足突结构完整成像，又不会丢失部分足突结构。
在本发明的具体实施例中，所述封片时采用的封片剂为DAPI（Cat#D5942 Sigma）。在封片前，需要用PBS缓冲液洗涤组织切片3次，每次3min，保证把非特异性吸附的二抗清洗干净，减少非特异性显色，保证背景干净，封片后避光保存。
在本发明中，所述一抗为ANGPTL4抗体，所述二抗为FITC-羊抗兔抗体；所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS溶液稀释后使用。在本发明中，所述ANGPTL4抗体于4℃条件下处理组织切片过夜；所述FITC-羊抗兔抗体于室温下处理组织切片0.5~1h。在本发明的具体实施例中，使用ANGPTL4抗体处理组织切片后，使用PBS缓冲液洗涤组织切片3次，每次3min，再使用FITC-羊抗兔抗体处理组织切片。在本发明中，所述ANGPTL4为血管生成素样蛋白4，本发明所述ANGPTL4购自proteintech公司，货号为51109-1-AP。本发明选择的ANGPTL4抗体作为一抗对组织切片进行标记可使得正常状态和所有疾病状态下的足细胞都染色和显像。
在本发明中，所述ANGPTL4抗体的稀释浓度优选为1:40~60；更优选为1:50；所述FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度优选为1:400~600，更优选为1:500。
在本发明中，所述封闭的条件为利用2%FBS、2%BSA和0.2%鱼明胶封闭处理组织切片20~40min，优选地处理组织切片25~35min，更优选为30min。
在本发明中，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯Ⅰ液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用二甲苯Ⅱ液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。本发明的方法使石蜡切片脱蜡完全，避免脱蜡不充分导致的抗原没有暴露，为之后染色提供良好基础。
在本发明中，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。本发明水化处理完全，更好地让组织还原为体内的状态，避免之后出现染色不均匀，产生非特异性背景着色等问题。
本发明基于结构化照明成像的半自动测量方法可实现对所有的足突染色和测量，不仅可以得到平均数值，还可以得到每个的数值，从而实现观察比较不同病人的足细胞形态学差异，而且能够观察比较同一病人不同肾小球之间的差异，从而实现精准化评估。
在本发明的具体实施例中，通过对足突周长和面积定量分析后，即通过上述自动测量方法分别计算足突的周长和面积，发现不同病因损伤的肾小球疾病的不同足突融合形态。例如，微小病变肾病的病变呈广泛融合，但面积和周长不如局灶节段肾小球硬化疾病中硬化区域融合明显，而后者病变局灶。膜性肾病的分期不同，融合形态不同，I期膜性肾病足突之间的面积和周长的球内差异大，但II期膜性肾病的足突之间的面积和周长的球内差异小。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，包括如下步骤：
图像采集：制备足细胞免疫荧光染色切片，将荧光染色后的切片置于100倍结构光照明超分辨显微镜下成像；所述图像采集时使用100×油浸物镜NA1.4，采集大小为2048×2048像素，获得单层厚度为0.2μm的图像；
图像重构：拍摄成像后的图像，调整参数进行三维超分辨高保真重构；所述图像重构参数调整为：照明调制对比度1.8；高分辨率噪声抑制2.5；失焦模糊抑制0.25；
足突宽度测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，对成像的单个足突的腰部进行画线，之后通过spiky插件对plot profile曲线进行高斯拟合，通过find peaks插件找到画线部位足突的波峰和波谷，最后通过高斯拟合后的曲线测量半高全宽即得该足突的宽度；
足突周长/面积的测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，在Fiji菜单中的Image→Type→8-bit将图像变为8-bit，而后对图像进行二值化处理，在Fiji菜单中的Adjust→Threshold中，通过调整threshold的灰度阈值，阈值范围为85~255；选取所有足突部位，在set measurements中选择area/perimeter参数，通过插件analyze particles测量以上参数，读取具体数值；
所述足细胞免疫染色切片的制备方法，包括以下步骤：
肾活检组织石蜡切片免疫标记前的处理：
1）肾活检组织石蜡切片：患者肾活检组织使用常规4.5%福尔马林固定，进行常规石蜡包埋后的切片至厚度为3μm；
2）脱蜡、水化：石蜡切片依次过二甲苯及酒精缸：二甲苯40min，二甲苯40min，100%酒精10min，100%酒精10min，95%酒精5min，95%酒精5min，80%酒精2min，然后PBS洗涤3次，每次3min；
3）抗原修复：使用EDTA修复液（pH9.0）进行高压热修复，10分钟。其中，EDTA高压修复的具体方法为：高压锅，将石蜡组织切片放入高压锅EDTA修复液（pH9.0）中，加热至沸腾；盖上压力阀至喷汽后持续10分钟。加热抗原修复后必须经过室温自然冷却20~30min，降至室温后进行PBS洗涤3次，每次3min；
4）封闭：2%FBS、2%BSA和0.2%鱼明胶室温封闭30min。
石蜡切片足突进行免疫标记处理：
1）一抗处理：用PBS按稀释浓度1:50稀释兔抗人ANGPTL4抗体，使用稀释后的抗体于4℃条件下孵育组织切片过夜；
2）二抗处理：使用PBS洗涤组织切片3次，每次3min，用PBS按稀释浓度1:500稀释FITC-羊抗兔抗体，用稀释后的抗体于室温下孵育组织切片1h。
3）DAPI-封片剂封：PBS洗涤组织切片3次，每次3min，使用含有DAPI的封片剂进行封片，封片后避光保存。
实施例2
与实施例1不同的是，足细胞免疫染色切片的制备方法中高压修复时间为5min，其余步骤不变。其中，高压修复的方法为：高压锅，将石蜡切片放入高压锅EDTA修复液（pH9.0）中，加热至沸腾；盖上压力阀至喷汽后持续5分钟。
实施例3
与实施例1不同的是，足细胞免疫染色切片的制备方法中高压修复时间为15min，其余步骤不变。其中，高压修复的方法为：高压锅，将石蜡切片放入高压锅EDTA修复液（pH9.0）中，加热至沸腾；盖上压力阀至喷汽后持续15分钟。
对比例1
与实施例1不同的是，足细胞免疫染色切片的制备方法中抗原修复为高温EDTA修复，其余步骤不变。其中，高温EDTA修复的方法为：微波炉，微波火力调为100W加热至沸腾，取出烧杯，将组织切片放入沸腾的EDTA修复液（pH9.0）里，再次放入微波炉内，减小火力为40W，加热10min。
对比例2
与实施例1不同的是，足细胞免疫染色切片的制备方法中抗原修复为胃酶修复37℃ 40min，其余步骤不变。其中，胃酶修复的方法为：将切片浸泡在胃蛋白酶水溶液（0.4%）中，37℃孵育40min。
根据图1中不同抗原修复方法的对比图结果可以看出，高压EDTA修复5min（图1A），足突抗原暴露80%，部分足突结构不能清楚辨别；图1B为本发明实施例1使用高压EDTA修复10min，足突抗原暴露100%，所有足突结构均能清楚显示；高温EDTA修复15min（图1C），足突抗原全暴露，但非足突抗原成分亦暴露，为过度抗原修复，造成实验结果假阳性。高温EDTA修复10min（图1D），足突抗原暴露70%，部分足突结构不能清楚辨别，且已显示足突的免疫荧光信号弱；胃酶修复（图1E），足突抗原暴露80%，部分足突结构不能清楚辨别。其中，图1的标尺为5μm；细节图标尺为2μm。
对比例3
与实施例1不同的是，足细胞免疫染色切片进行结构化照明成像后的重构参数不同，其余步骤不变。其中，自动化重构参数分别为：照明调制对比度0.0；高分辨率噪声抑制5.0；失焦模糊抑制0.05。
根据图2中不同重构参数的对比图结果可以看出，（图2A）结构化照明成像后原图，足突不能辨别；图2B为本发明实施例1使用本专利中的重构参数即照明调制对比度（illumination modulation contrast；IMC）1.8；高分辨率噪声抑制（high resolutionnoise suppression；HNS）2.5；失焦模糊抑制（out of focus blur suppression，OBS）0.25重构后的图像，所有足突结构均能清楚显示；细节图为（图1D）。图2C为本发明实施例1经自动化重构后的图像，足突结构不能清楚显示；细节图为（图1E）。
根据图3可以看出，经本发明实施例1的染色显色成像、半自动测量后，SIM成像（单层厚度为0.2μm）可清晰分辨足突结构。其中，图3b是细节图中ANGPTL4染色和SIM成像后得到的足突的细节图。图3c为常规电镜图，图3d为FIJI软件进行二值化处理后的8-bit灰度图，图3e为使用FIJI软件的Threshold调整阈值范围选择足突结构，图3f为使用FIJI软件的analyze particles插件测量单个足突周长和面积的图，其中足突的轮廓被勾勒，足突数量标注在足突上。图3g为本发明通过ANGPTL4免疫染色来显示足细胞足突以及通过ANGPTL4染色测量足突宽度的示意图。图3h为在两个相邻足突横线处（图3b）使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度值，以及将该图3i为该曲线进行高斯拟合，取半高全宽（FWHM）得到突起的宽度图。图3i是既往常规使用电镜图片进行平均足突宽度测量的示意图，即人工进行在肾小球基底膜上进行划线（示意线为黄线），测量该线段的长度，然后进行人工计数该线段上的足突个数，然后通过公式mFPW＝π/4×∑GBM length/∑foot process，图3k为在电镜图片两个相邻足突横线处（图3c）使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度值。图3i无法进行高斯拟合，电镜图片不易通过该测量方法测量每个足突的宽度值。
试验例1
来源于瘤旁肾组织的健康足细胞分别进行本发明实施例1的染色显色成像、半自动测量法以及超薄切片的电镜图片，观察足细胞足突的形态。所有足细胞足突经本方法染色后均可清晰显示，超薄切片可显示足突，但只能显示数个毛细血管襻。本发明实施例1的方法染色后可见纤细的足突[宽度：0.330±0.090μm；周长：0.883μm（0.633-1.229）；面积：0.055μm2（0.030-0.099）]规则地排列在毛细胞血管襻上。具体通过图3可以看出，图3a和图3b为该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片和细节图，图片为厚度0.2μm的切片信息。电镜图片（图3c）为厚度为70nm的超薄切片的信息，可显示足细胞，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球（足突宽度：0.345±0.060μm）。
试验例2
来自肾病期的微小病变肾病患者肾活检组织分别进行本发明实施例1的染色显色成像、半自动测量法以及超薄切片的电镜图片。观察足突的形态：所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示广泛的足突融合[宽度：0.8453±0.619μm；周长：0.978μm（0.700-1.633）；面积：0.068μm2（0.035-0.141）]；超薄切片可显示足细胞和广泛融合的足突，但视野有限（足突宽度：0.989±0.399μm）。本发明的方法染色后可见肾小球足细胞的足突呈现不同程度的足突融合。具体通过图4可以看出，图4a和图4b为该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片和细节图，图片为厚度0.2μm的切片信息。电镜图片（图4c）厚度为70nm，可显示足细胞足突融合，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球。
试验例3
来自肾病期的膜性肾病患者肾活检组织分别进行本发明实施例1的染色显色成像、半自动测量法以及超薄切片的电镜图片。观察足突的形态：所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示正常足突和融合的足突[宽度：0.952±0.752μm；周长：1.113μm（0.748-2.29）；面积：0.080μm2（0.040-0.227）]；超薄切片只能显示融合的的足突，且视野有限（足突宽度：1.036±0.219μm）。本发明的方法染色后可见肾小球足细胞的足突呈现正常状态和不同融合程度的足突。具体通过图5可以看出，图5a和图5b为该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片和细节图，图片为厚度0.2μm的切片信息。电镜图片（图5c）厚度为70nm，可显示足细胞足突广泛融合，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球。对比本发明的染色图像和电镜图像，本发明的染色图像不仅观察到足突融合，还观察到正常足突，因此该发明方法不仅在足突数量上显示优势，在足突细节上能够提供更多信息，因此更能代表患者肾脏组织足细胞受损全貌。
试验例4
来自肾病期的局灶节段性肾小球硬化症肾病患者肾活检组织分别进行本发明实施例1的染色显色成像、半自动测量法以及超薄切片的电镜图片。观察足突的形态：所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示相对正常足突和融合的足突[宽度：0.920±0.851μm；周长：0.911μm（0.633-1.524）；面积：0.056μm2（0.031-0.124）]；超薄切片只能显示融合的足突，且视野有限（宽度：1.254±0.509μm）。本发明的方法染色后可见肾小球足细胞的足突呈现正常状态和不同融合程度的足突。具体通过图6可以看出，图6a和图6b为该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片和细节图，图片为厚度0.2μm的切片信息。电镜图片（图6c）厚度为70nm，可显示足细胞足突亦呈两种状态：相对正常足突和融合足突。但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球。
综上对比可知，电镜样本需要额外的组织和制样，本发明无需额外的标本，可直接使用常规石蜡包埋的组织切片，节省了标本和制样时间；采用本发明的方法进行足细胞足突染色，能够清晰显示足突的超微结构和超微形态改变包括经典的足突融合，打破了足突只能在电镜下观察的传统观念和技术壁垒；同时可实现单个的足突的宽度、周长和面积测量，超越了以往只能通过电镜图片测量平均足突宽度的限制。本发明的方法成像使用结构光照明超分辨显微镜，既可获得足够的分辨率，又提高了成像效率，充分利用穿刺到的肾活检标本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种半自动测量足细胞足突形态学参数的方法，其特征在于，所述足突形态学参数包括足突宽度、足突周长、足突面积；所述方法为非诊断目的；所述方法包括如下步骤：
图像采集：制备足细胞免疫荧光染色切片，对所述免疫荧光染色切片进行结构光照明成像；
图像重构：拍摄成像后的图像，调整参数进行三维超分辨高保真重构；
足突宽度测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，对成像的单个足突的腰部进行画线，之后通过spiky插件对plot profile曲线进行高斯拟合，通过find peaks插件找到画线部位足突的波峰和波谷，最后通过高斯拟合后的曲线测量半高全宽即得该足突的宽度；
足突周长/面积的测量：在重构后的3D-SIM图像上，使用开源软件FIJI，将图像变为8-bit，而后对图像进行二值化处理，通过调整threshold的灰度选择阈值，选取所有足突部位，在set measurements中选择对应参数，通过插件analyze particles测量以上参数，读取具体数值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述图像采集时使用100×油浸物镜NA1.4，采集大小为2048×2048像素，获得单层厚度为0.2μm的图像。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述图像重构参数调整为：照明调制对比度1.8；高分辨率噪声抑制2.5；失焦模糊抑制0.25。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述足细胞免疫荧光染色切片的制备方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用高压热修复处理组织切片5~15min后室温冷却20~30min封闭；依次用一抗、二抗孵育封闭处理后的切片，封片保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高压热修复的缓冲液为pH9.0的Tris-EDTA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一抗为ANGPTL4抗体，所述二抗为FITC-羊抗兔抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS稀释后使用；所述ANGPTL4抗体的稀释浓度为1:40~60；FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度为1:400~1:600。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述封闭的条件为利用2%FBS、2%BSA和0.2%鱼明胶封闭处理组织切片20~40min。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯Ⅰ液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用二甲苯Ⅱ液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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