CN109072285A - 扩展临床组织样本的方法 - Google Patents
扩展临床组织样本的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109072285A CN109072285A CN201780022105.9A CN201780022105A CN109072285A CN 109072285 A CN109072285 A CN 109072285A CN 201780022105 A CN201780022105 A CN 201780022105A CN 109072285 A CN109072285 A CN 109072285A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- swelling
- tissue
- polymers capable
- extension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 126
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 99
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 302
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 58
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 28
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 28
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 26
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 26
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 26
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 23
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical group O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 20
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 19
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 17
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 17
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 17
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 14
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- -1 2- ethoxy Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 9
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 9
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 8
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical group [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 2
- VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N (2s)-2-[2-[[(1s)-1,2-dicarboxyethyl]amino]ethylamino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NCCN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VKZRWSNIWNFCIQ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GBHSCKFAHCEEAZ-UHFFFAOYSA-N 2-[hydroxymethyl(methyl)amino]acetic acid Chemical class OCN(C)CC(O)=O GBHSCKFAHCEEAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N BAPTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 claims description 2
- 229920000727 Decyl polyglucose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims description 2
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 claims description 2
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 claims description 2
- PZZHMLOHNYWKIK-UHFFFAOYSA-N eddha Chemical compound C=1C=CC=C(O)C=1C(C(=O)O)NCCNC(C(O)=O)C1=CC=CC=C1O PZZHMLOHNYWKIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000002811 oleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 2
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940100515 sorbitan Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JDRSMPFHFNXQRB-IBEHDNSVSA-N decyl glucoside Chemical compound CCCCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JDRSMPFHFNXQRB-IBEHDNSVSA-N 0.000 claims 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 157
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 53
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 52
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 description 27
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 25
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 24
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 22
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 22
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 17
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 16
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 14
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 13
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 13
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 13
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 11
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 10
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 10
- JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-N 4-(trimethylammonio)butanoate Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC([O-])=O JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 9
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 4
- 201000005206 focal segmental glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229940048053 acrylate Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PQUXFUBNSYCQAL-UHFFFAOYSA-N 1-(2,3-difluorophenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC(F)=C1F PQUXFUBNSYCQAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 101150054472 HER2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N allyl alcohol Chemical compound OCC=C XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003591 cerebellar nuclei Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 208000037516 chromosome inversion disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000000877 corpus callosum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009928 nephrosis Diseases 0.000 description 2
- 231100001027 nephrosis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- GYHFUZHODSMOHU-UHFFFAOYSA-N nonanal Chemical compound CCCCCCCCC=O GYHFUZHODSMOHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229940047670 sodium acrylate Drugs 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000004062 tegmentum mesencephali Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RKMGAJGJIURJSJ-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-Tetramethylpiperidine Substances CC1(C)CCCC(C)(C)N1 RKMGAJGJIURJSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091006515 Anion channels Proteins 0.000 description 1
- 102000037829 Anion channels Human genes 0.000 description 1
- 241000586542 Aonidiella citrina Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 241000269420 Bufonidae Species 0.000 description 1
- 241000459479 Capsula Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 208000016718 Chromosome Inversion Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 206010067477 Cytogenetic abnormality Diseases 0.000 description 1
- 208000006402 Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000387312 Hemiberlesia lataniae Species 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 229940045713 antineoplastic alkylating drug ethylene imines Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000011803 breast fibrocystic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001159 caudate nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N ethenamine Chemical compound NC=C UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013210 evaluation model Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000001905 globus pallidus Anatomy 0.000 description 1
- 210000005086 glomerual capillary Anatomy 0.000 description 1
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000017445 musculoskeletal system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002787 omasum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N phthalimide Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000000557 podocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 210000002804 pyramidal tract Anatomy 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009418 renovation Methods 0.000 description 1
- 208000017443 reproductive system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
- C08L101/12—Compositions of unspecified macromolecular compounds characterised by physical features, e.g. anisotropy, viscosity or electrical conductivity
- C08L101/14—Compositions of unspecified macromolecular compounds characterised by physical features, e.g. anisotropy, viscosity or electrical conductivity the macromolecular compounds being water soluble or water swellable, e.g. aqueous gels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/305—Fixative compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
- G01N2001/364—Embedding or analogous mounting of samples using resins, epoxy
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0072—Optical details of the image generation details concerning resolution or correction, including general design of CSOM objectives
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于制备适用于显微镜分析的扩展生物样本的方法。扩展生物样品可以通过将关键生物分子结合，例如，锚定，到聚合物网络并且使聚合物网络溶胀或扩展来实现，从而将生物分子分开，如下文进一步描述的。当生物分子锚定到聚合物网络时，聚合物网络的各向同性扩展保持生物分子的空间取向，导致扩展的或增大的生物样本。
Description
相关申请
本申请要求2016年2月25日提交的美国临时申请序列号62/299,754的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在病理学中，使用衍射限制的显微镜检查细胞结构和分子组成一直是诊断各种疾病前和疾病状态的关键。然而，生物分子本身在尺度上是纳米级的并且在整个细胞和组织中配置有纳米级精度。在基础科学中，已经开始使用先进的超分辨率显微镜方法以及电子显微镜方法探究，但是这种策略需要复杂的硬件，可能呈现陡峭的学习曲线，并且难以应用于大规模样品，诸如人组织。因此，超分辨率成像和纳米显微学尚未在病理学的临床实践中找到常规用途。
因此，需要可以与当前衍射限制的显微镜一起工作并且可以以纳米级精度光学放大样品，例如组织切片或肿瘤，的更高分辨率的显微镜检查。
发明内容
本发明提供了一种用于制备扩展生物样本的方法。扩展生物样本适合用于显微镜分析。通过“显微镜分析”是指使用任何技术分析样本，该技术提供对于用肉眼看不到的样本的方面的可视化，即不在正常眼睛的分辨率范围内。通过“制备扩展生物样本”，通常是指，生物样本相对于在暴露于本文所述的方法之前的样本物理地扩展或增大。扩展生物样品可以通过将关键生物分子结合，例如，锚定，到聚合物网络并且使聚合物网络溶胀或扩展来实现，从而将生物分子分开，如下文进一步描述的。当生物分子锚定到聚合物网络时，聚合物网络的各向同性扩展保持生物分子的空间取向，导致扩展的或增大的生物样本。
在一种实施方式中，用于制备可扩展生物样本的方法包括使样品与将结合样品内的生物分子的大分子接触的步骤；用双官能交联剂处理样本；用可溶胀聚合物的前体渗透样本；聚合前体以在样本内形成可溶胀的聚合物；将生物分子锚定在可溶胀的聚合物上；并且在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中将样品与1-100U/ml的非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂，约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂，和约0.05M至约1M的单价盐。可通过使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起可溶胀聚合物溶胀而扩展可扩展生物样本。在一种实施方式中，在处理步骤(a)之前，对样品热处理。通过“热处理”通常是指本领域技术人员已知的并且如下文进一步描述的任何合适的抗原修复工艺。
在一种实施方式中，用于制备可扩展生物样本的方法包括用双官能交联剂处理样本的步骤；用可溶胀聚合物的前体渗透样本；聚合该前体以在样本内形成可溶胀聚合物；并且将该样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中，在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂；约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂；和约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，该方法可以还包括使样品与将结合样品内的生物分子的大分子接触的步骤。在一种实施方式中，该方法可以还包括将生物分子锚定到可溶胀聚合物上的步骤。可通过使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起可溶胀聚合物溶胀而扩展可扩展样本。在一种实施方式中，在处理步骤(a)之前，对样品热处理。
在一种实施方式中，如下文进一步描述的用于扩展可溶胀材料包埋的生物样本的方法包括将该样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中，在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂；约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂；和约0.05M至约1.0M的单价盐；并且使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起可溶胀聚合物溶胀。
附图的简要说明
图1A至图1M描绘了扩展病理学的设计和验证(ExPath)。(A)ExPath工作流程示意图。(B)用宽视野落射荧光显微镜获得的并且用DAPI以及多种抗体染色的1.5mm正常人乳腺组织核心的扩展前图像。蓝色，DAPI；绿色，波形蛋白；红色，电压依赖性阴离子通道(VDAC)。(C)B样品的ExPath图像，在相同的视野内。(D和E)对于扩展前与扩展后图像，均方根(RMS)长度测量误差作为测量长度的函数(蓝色实线，DAPI通道的平均值；绿色实线，波形蛋白通道的平均值；阴影区域，平均值的标准误差；n＝3个不同的患者。平均扩展系数：4.3(SD：0.3))。(F)正常人乳腺组织的超分辨率结构照明显微镜(SR-SIM)图像，用DAPI和多种抗体染色。蓝色，DAPI；绿色，波形蛋白；红色，角蛋白-19(KRT19)。(G)用旋转盘共焦显微镜获得F样品的ExPath图像。(H和I)对于ExPath与SIM图像，RMS长度测量误差作为人乳腺组织的测量长度的函数(蓝色实线，DAPI通道的平均值；红色实线，KRT19通道的平均值；阴影区域，平均值的标准误差；n＝来自4个不同患者的样品的5个视场。平均扩展系数：4.0(SD：0.2))。(J)苏木精和伊红(H&E)染色的人乳腺样品，伴有非典型性导管增生(ADH)。插图(左上角)是由虚线框起的区域的放大视图。(K)J样品的ExPath宽视野荧光图像，用针对Hsp60(红色)波形蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)的抗体染色。(L)没有HER2扩增的人乳腺样品的ExPath宽视野荧光图像。蓝色，抗HER2抗体(不可见)；灰色，DAPI；绿色，针对17号染色体中心体的DNAFISH；红色，针对HER2的DNA FISH。(M)具有HER2扩增的人乳腺癌样品的ExPath宽视野荧光图像，如在L中的染色。比例尺：(B)200μm，(C)220μm(扩展后物理尺寸，900μm；扩展系数4.1)，(F)10μm，(G)10μm(扩展后物理尺寸，43μm，扩展系数4.3)。(J)5μm；插图1μm(K)5μm；插图1μm(扩展后物理尺寸，23μm；插图，4.6μm；扩展因子4.6)。(L)和(M)，扩展后物理尺寸20μm。
图2描绘了广泛的人组织样品的ExPath成像。来自人类患者的正常(左图像)和癌症(右图像)组织两者的各种组织类型的图像。从上到下，不同的行示出如标记的不同组织类型(例如，前列腺，肺，乳腺等)。在对给定组织×疾病类型的每个图像块内，示出了5个图像。5个图像的最左边的图像示出来自组织微阵列的核心(比例尺，200μm)。5个图像中的中间列示出两个图像，其顶部是小视场(比例尺，10μm)，并且其底部通过白色框(比例尺，2.5μm)缩放到顶部图像中标记的区域。5个图像中的右列示出与中间列中相同的视场，但是扩展后(黄色比例尺，顶部10-12.5μm，底部2.5-3.1μm；扩展后物理尺寸，顶部50μm，底部12.5μm；扩展系数4.0-5.0×，详见表2)。样品用DAPI和多种抗体染色。蓝色，DAPI；绿色，波形蛋白；红色，KRT19。
图3Ai至图3L描绘了影响人组织成功扩展的条件。(A)用DAPI(灰色)和针对波形蛋白(绿色)和ACTA4(红色)的抗体染色的人皮肤样品的图像。样品用含有25mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，1mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的8单位/mL蛋白酶K溶液在60℃下消化0.5小时(i-iii)或2小时(iv-vi)。(i和iv)消化0.5小时(i)或2小时(iv)后，在PBS缓冲液中的人皮肤-水凝胶杂样品的照片；(ii)来自(i)的样品的扩展前宽视野荧光图像。(iii)来自(i)的样品的扩展后宽视野荧光图像，用橙色虚线框突出显示扩展后的失真的波形蛋白网络和DAPI通道中自体荧光的区域，(v)与(ii)相同，其针对(iv)中的样品。(vi)与(iii)相同，其针对(iv)的样品，用橙色虚线框突出显示在DAPI通道中具有自体荧光的区域。(B)与(A)类似，除了样品用含有25mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的8单位/mL蛋白酶K溶液在60℃消化0.5小时(i-iii)和2小时(iv-vi)。(C)用基于1mM EDTA的方案(含有25mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，1mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的8单位/mL蛋白酶K溶液)在60℃下消化0.5小时和2小时的人肝脏样品的照片。(D)用基于25mM EDTA的方案((含有25mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的8单位/mL蛋白酶K溶液)在60℃下消化0.5小时和2小时人肝脏样品的照片。(E)用DAPI(灰色)和针对ACTA4(红色)的抗体染色的人肝脏样品的扩展前宽视野荧光图像。用基于1mM EDTA的方案同样消化1小时。(F)E中相同的样品的扩展后宽视野荧光图像。白色虚线勾勒出由失真引起的失焦区域。(G)用DAPI(灰色)和针对ACTA4(红色)的抗体染色的人肝脏样品的扩展前宽视野荧光图像。用基于25mM EDTA的方案同样消化0.5小时。(H)G中相同的样品的扩展后宽视野荧光图像。(I)用DAPI(蓝色)和针对波形蛋白(绿色)的抗体染色的并且用基于1mM EDTA的方案处理3小时的具有侵袭性乳腺癌的人淋巴结组织的扩展后共焦图像。(J)用基于25mM EDTA的方案处理的，与I中相同的组织扩展后共焦图像。(K)用丙酮固定，并且用针对胶原蛋白IV的抗体染色，并且在原位聚合之前用0.1mg/ml丙烯酰基-X处理的正常人肾脏组织的扩展后共焦图像。裂缝用白色箭头表示。(L)与K中相同的样品的扩展后共焦图像，在原位聚合之前用0.03mg/ml丙烯酰基-X处理。比例尺：Aii和iii，9.2μm(物理尺寸：40μm，扩展系数：4.33)。Av和vi，9.4μm(物理尺寸：40μm，扩展系数：4.28)。Bii和iii，9μm(物理尺寸：40μm，扩展系数：4.41)。Bv和vi，8.9μm(物理尺寸：40μm，扩展系数：4.51)。E和F，119μm(物理尺寸：500μm，扩展系数：4.22)；G和H，109μm(物理尺寸：500μm，扩展系数：4.58)。(I-L)40μm，物理尺寸。
图4在扩展处理之前和之后的良性乳腺病变苏木精和伊红(H&E)染色片的典型图像。对于扩展后图像，蓝色：DAPI，绿色：波形蛋白，红色：Hsp60(线粒体)。比例尺：左上，15μm；右上，65μm；左下，2.5μm；右下，12μm。
图5A至图5G临床相关的纳米级变化的ExPath分析：肾脏足细胞足突消失。(A)正常人肾脏样品的扩展前共焦图像，示出用旋转盘共焦显微镜获得并且用DAPI以及多种抗体染色的肾小球的一部分。蓝色，波形蛋白；绿色，辅肌动蛋白-4；红色，胶原蛋白IV；灰色，DAPI。橙色虚线表示在C中分析的线段的位置。(B)用相同显微镜的相同样品的ExPath图像。红色虚线表示在C中分析线段的位置。(C)沿(A)和(B)的橙色和红色虚线的辅肌动蛋白-4强度的谱。(D)来自正常人肾脏的临床活组织检查样品的电子显微照片。插图，由黑框勾勒的区域(虚线)的放大；插图内的虚线表示下面分析的线段的位置。下面，沿插图的线段的电子显微照片特征强度。(E)来自(D)中分析的相同的患者的，并且如(A)中染色的临床肾脏活组织检查样品的ExPath图像。蓝色，波形蛋白；绿色，辅肌动蛋白-4；红色，胶原蛋白IV；灰色，DAPI。插图，由白框勾勒的区域(虚线)的放大；插图内的虚线表示下面分析的线段的位置。下面，沿插图的线段的辅肌动蛋白-4强度。(F)与D一样，但患者患有MCD。(G)与E一样，但患者与F中的相同。比例尺：(A)5μm，(B)5μm(扩展后物理尺寸，23.5μm；扩展系数：4.7)，(D)1μm；插图，200nm，(E)1μm(扩展后物理尺寸，4.3μm；扩展系数：4.3)；插图，200nm，(F)1μm，插图，200nm，(G)1μm(扩展后物理尺寸，4.2μm；扩展系数：4.2)；插图，200nm。
图6A和图6B表明热处理改善了人肾脏样品上的辅肌动蛋白-4的免疫染色。(A)在柠檬酸盐缓冲液中有和没有热处理的人肾脏切片的宽视野荧光图像。(B)对应于左面板中由黄色虚线矩形表示的区域的放大区域。比例尺：1mm(A)，200μm(B)。
图7A至图7H表明抗辅肌动蛋白-4抗体特异性地染色三级足细胞足突。(A-D)用DAPI和抗体染色的人肾脏切片的扩展后宽视野图像。蓝色，波形蛋白；绿色，辅肌动蛋白-4；红色，突触足蛋白；灰色，DAPI。(E)(A-D)的合并图像。(F和G)来自取自B和C中的白色虚线方块的相同样品的辅肌动蛋白-4(F)和突触足蛋白(G)通道中的放大区域。(H)采取沿F和G的白色虚线段的荧光强度的谱。绿色，辅肌动蛋白-4红色，突触足蛋白。比例尺：1μm(4.5μm物理尺寸，扩展系数4.5)。
图8A至图8H肾脏FFPE样品的免疫染色图像。(A).用柠檬酸盐抗原修复方法(20mM柠檬酸钠，pH 8.0)处理的正常人肾脏FFPE样品的扩展后宽视野图像，放大区域(加框线)在(B)中放大。(C)用三羟甲基氨基甲烷-EDTA抗原修复方法(10mM三羟甲基氨基甲烷碱，1mMEDTA溶液，0.05％吐温20，pH 9.0)处理的正常人肾脏FFPE样品的扩展后宽视野图像，放大区域(加框线)在(D)中放大。(E)用柠檬酸盐抗原修复方法处理的正常人肾脏FFPE样品的扩展后共焦图像，放大区域(加框线)在(F)中放大。(G)用柠檬酸盐抗原修复方法处理的人肾脏微小病变FFPE样品的扩展后共焦图像，放大区域(加框线)在(H)中放大。所有样品用DAPI(灰色)和针对波形蛋白(蓝色)，辅肌动蛋白-4(绿色)和胶原蛋白IV(红色)的抗体染色。比例尺：(A)，(C)，(E)和(G)，40μm。(B)，(D)，(F)和(H)，8μm。
图9A至图9C ExPath显着改善在早期乳腺病变中的计算诊断。(A)自动分割框架：图像预处理和核分割流程的步骤：使用滚球校正去除噪声→通过直方图均衡化增强对比度→通过最小误差阈值的核分割→通过多尺度高斯拉普拉斯算子(Laplacian of Gaussian)(LoG)滤波器的种子检测→通过标记物控制的分水岭的核分裂。(B)与扩展前样品相比，扩展样品中核的计算检测和分割显着地更准确：非典型性导管增生(ADH)的实例；绿色，真阳性；红色，假阴性；蓝色，假阳性)。(C)使用LI-正则化逻辑回归(GLMNET分类器)建立分类模型。分类精确度以通过交叉验证中分类模型实现的受试者工作曲线下面积(AUC)来衡量。ExPath改善了早期乳腺肿瘤病变中的自动诊断：我们将这种图像分类框架应用于扩展前的H&E和扩展图像两者，用于正常的，良性的和侵袭前恶性乳腺疾病的计算分化。两个数据集由105个图像组成，含有36个正常乳腺组织图像，31个良性乳腺组织图像(15个UDH和16个ADH)和38个非侵袭性乳腺癌组织图像(DCIS)。平均扩展系数：4.8(SD：0.3)。*P＜0.05，自举配对t检验。每个二进制比较的P值：正常与UDH(0.17)；正常与ADH(0.34)；正常与DCIS(0.24)；UDH与ADH(0.02)；UDH与DCIS(0.01)；ADH与DCIS(0.24)。
具体实施方式
提供了用于通过物理地而非光学地放大细胞和组织样品来成像他们的方法和组合物。2015年2月20日提交的国际专利申请序列号PCT/US15/16788，其通过引用并入本文，教导了通过物理地扩展样本(称为“扩展显微镜”(ExM)工艺)可以将传统光学显微镜的分辨率增加4-5倍。简言之，将生物样本包埋在可溶胀的水凝胶材料中，进行处理以破坏天然生物网络，并且然后扩展。ExM的优点包含组织清除，分辨率改善，以及由于样本在z轴上扩展而对切片误差的更高耐受性。然而，ExM工艺受物理扩展的增加倍数的限制，并且在这种情况下一个样品与下一个样品之前的扩展程度不一致。
本发明提供了扩展病理学方法(ExPath)，一种具有纳米级精度和分子同一性的用于临床活组织检查样品的光学询问的简单并且通用的方法。ExPath能够处理当前用于病理学的大多数临床样品，包含福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)，苏木精和伊红(H&E)染色的和/或新鲜冷冻组织样本，并且因此能够纳米级成像而无需超出传统实验室中找到的硬件。ExPath在广泛多样的组织类型上功能良好，并且在已知显示纳米级病理学的疾病的诊断中具有直接的临床应用。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“该”被定义为表示“一个或多个”并且包含复数，除非上下文另有明确规定。还应注意，可以草拟权利要求以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为对于与权利要求元素的叙述有关的如“唯一地”，“仅”等这种专用术语的使用或“否定”限制的使用的前置基础。对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和说明的每个单独实施方式具有离散的组成部分和特征，其可以容易地与任何其他若干实施方式的特征分离或组合而不背离本教导的范围或精神。任何列举的方法可以以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序实施。
对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和说明的每个单独实施方式具有离散的组成部分和特征，其可以容易地与任何其他若干实施方式的特征分离或组合而不背离本发明的范围或精神。任何列举的方法可以以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序实施。
本发明提供了一种用于制备扩展生物样本的方法。扩展生物样本适合用于显微镜分析。通过“显微镜分析”是指使用任何提供对于用肉眼看不到(即不在正常眼睛的分辨率范围内)的样本的方面的可视化的技术分析样本。通过“制备扩展生物样本”，通常是指，生物样本相对于在暴露于本文所述的方法之前的样本物理地扩展或增大。扩展生物样品可以通过将关键生物分子结合，例如，锚定，到聚合物网络并且使聚合物网络溶胀或扩展来实现，从而将生物分子分开，如下文进一步描述的。当生物分子锚定到聚合物网络时，聚合物网络的各向同性扩展保持生物分子的空间取向，导致扩展的或增大的生物样本。
在一种实施方式中，用于制备可扩展生物样本的方法包括使样品与将结合样品内的生物分子的大分子接触的步骤；用双官能交联剂处理样本；用可溶胀聚合物的前体渗透样本；聚合前体以在样本内形成可溶胀的聚合物；将生物分子锚定在可溶胀的聚合物上；并且在缓冲液中将样品与非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括金属离子螯合剂，非离子表面活性剂，和单价盐。可通过使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起可溶胀聚合物溶胀而扩展可扩展生物样本。在一种实施方式中，在接触步骤之前，使样品进行本领域技术人员已知的并且如下文进一步描述的任何合适的抗原修复工艺。在一种实施方式中，该方法包括在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中将该样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂；约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂；和约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，该样品在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时。
在一种实施方式中，用于制备可扩展生物样本的方法包括用双官能交联剂处理样本的步骤；用可溶胀聚合物的前体渗透样本；聚合前体以在样本内形成可溶胀的聚合物；并且在缓冲液中将样本与非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括金属离子螯合剂，非离子表面活性剂，和单价盐。在一种实施方式中，该方法可以还包括使样品与将结合样品内的生物分子的大分子接触的步骤。在一种实施方式中，该方法可以还包括将生物分子锚定到可溶胀聚合物上的步骤。可通过使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起可溶胀聚合物溶胀而扩展可扩展样本。在一种实施方式中，在处理步骤之前，使样品进行本领域技术人员已知的并且如下文进一步描述的任何合适的抗原修复工艺。在一种实施方式中，该方法包括在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中将该样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂；约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂；和约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，该样品在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时。
在一种实施方式中，用于扩展包埋在可溶胀材料中的生物样本的方法。在一种实施方式中，样本是如本文进一步描述的可溶胀材料包埋的生物样本。该方法包括在缓冲液中将样本与非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括金属离子螯合剂，非离子表面活性剂，和单价盐；并且使可溶胀聚合物与溶剂或液体接触，以引起可溶胀聚合物溶胀。在一种实施方式中，该方法包括在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中将该样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶一起温育，该缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂；约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂；和约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，该样品在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时。
术语“生物样本”或“生物样品”在本文中以广义使用，并且旨在包含含有核酸并且可以固定的来源。
示例性生物样品包含但不限于组织，包含但不限于肝脏，脾脏，肾脏，肺，肠，胸腺，结肠，扁桃体，睾丸，皮肤，脑，心脏，肌肉和胰腺组织。其他示例性生物样品包含但不限于活组织检查样品，骨髓样品，器官样品，皮肤碎片和生物体。从临床或法医领域获取的材料也在术语生物样品的预期含义内。在一种实施方式中，样品来源于人，动物或植物。在一种实施方式中，生物样品是组织样品，优选器官组织样品。在一种实施方式中，样品是人。样品可以例如从尸检，活组织检查或从手术中获取。它可以是实体组织，诸如，例如薄壁组织，结缔组织或脂肪组织，心脏或骨骼肌，平滑肌，皮肤，脑，神经，肾脏，肝脏，脾脏，乳腺，癌(例如肠，鼻咽，乳腺，肺，胃等)，软骨，淋巴瘤，脑膜瘤，胎盘，前列腺，胸腺，扁桃体，脐带或子宫。组织可以是肿瘤(良性或恶性)，癌或癌前组织。样品可以从受疾病或其他病理学影响或疑似受疾病或其他病理学影响(正常或患病)或被认为是正常或健康的动物或人受试者获取。如本文所用，术语“固定的生物样品，明确排除了无细胞样品，例如细胞提取物，其中分离来自细胞的细胞质和/或细胞核组分。
适合用于本文所述方法和系统的组织样本通常包含从活体或死亡受试者收集的任何类型的组织样本，诸如，例如活组织检查样本和尸检样本。可以使用本文所述的方法和系统收集和处理组织样本，并且在处理后立即进行显微镜分析，或者可以保藏并且在将来的时间进行显微镜分析，例如，在储存一段较长的时间后。在一些实施方式中，本文所述的方法可用于将组织样本保藏在稳定的，可取得的和充分完整的形式中，用于将来的分析。例如，组织样本，诸如，例如人脑组织样本，可以如上文所述处理，并且清除去除多种细胞组分，诸如，例如脂质，并且然后储存用于将来的分析。
已经保藏或固定的组织含有各种化学修饰，这些化学修饰可降低生物医学程序中蛋白质的可检测性。在一些实施方式中，本文所述的方法和系统可用于分析先前保藏的或储存的组织样本。先前保藏的组织样本包含例如病理学中使用的临床样品，包含福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)，苏木精和伊红(H&E)染色的和/或新鲜冷冻组织样本。如果先前保藏的样品具有盖玻片，则应去除盖玻片。处理样品以去除封固介质。这种用于去除封固介质的方法在本领域中是公知的。例如，用二甲苯处理样品以去除石蜡或其他疏水性封固介质。或者，如果样品封固在水基封固介质中，则用水处理样品。然后将样品然后再水化并且进行抗原修复。术语“抗原修复”指的是任何技术，其中表位的掩蔽被逆转并且表位-抗体结合被恢复，诸如但不限于酶诱导的表位修复，热诱导的表位修复(HIER)或蛋白水解诱导的表位修复(PIER)。例如，抗原修复处理可以在10mM柠檬酸钠缓冲液以及商业上可获得的目标修复溶液(Target Retrieval Solution)(DakoCytomation)或之类中执行。
“生物分子”通常是指但不限于组织或细胞内的蛋白质，脂质，类固醇，核酸和亚细胞结构。
“大分子”是指在样本内靶向生物分子的蛋白质，核酸或小分子。这些大分子用于检测样本内的生物分子和/或将生物分子锚定在可溶胀的聚合物上。例如，可以提供促进特定细胞生物分子，例如蛋白质，脂质，类固醇，核酸等，和亚细胞结构的可视化的大分子。在一些实施方式中，大分子是诊断性的。在一些实施方式中，大分子是预后的。在一些实施方式中，大分子可预测对疗法的反应性。在一些实施方式中，大分子是筛选中的候选剂，例如筛选将有助于疾病的诊断和/或预后，疾病的治疗等等的剂。
例如，样本可以与一种或多种多肽大分子接触，例如，抗体，标记的肽等等，其是对特定细胞生物分子特异性的并且将与特定细胞生物分子结合，用于通过颜色或免疫荧光直接或间接的标记。通过免疫荧光是指使用抗体与其抗原或结合伴侣的高度特异性结合以标记细胞内特异性蛋白质或其他分子的技术。用对目的生物分子特异性的一级抗体处理样品。荧光团可以直接与一级抗体或肽缀合。或者，可以使用与检测部分或荧光团缀合的第二抗体，其与第一抗体特异性结合。也可以采用对靶细胞生物分子特异性的并且与荧光体或其他检测部分缀合的肽。
可以作为大分子提供的一类剂的另一个实例是核酸。例如，可以使样本与反义RNA接触，该反义RNA与目的基因的转录物互补并且特异性杂交，例如，以研究样本细胞中的基因表达。作为另一个实例，可以使样本与DNA接触，该DNA与目的基因组材料互补并且特异性杂交，例如，以研究基因突变，例如杂合性缺失，基因复制，染色体倒位等等。杂交的RNA或DNA与检测部分(即可以在显微镜下直接或间接可视的剂)缀合。原位杂交技术的实例可以在例如，Harris和Wilkinson.In situ hybridization:Application to developmentalbiology and medicine,Cambridge University Press 1990；和Fluorescence In SituHybridization(FISH)Application Guide.Liehr,T,ed.,Springer-Verlag,BerlinHeidelberg 1990.中找到。
在一种实施方式中，可以用可检测标记标记生物样品或对生物样品加标签。典型地，标记或标签将化学地结合(例如，共价，氢键键合或离子键键合)到样品的生物分子或其组分。可检测标记可以对特异性靶点(例如，生物标记物或分子类别)具有选择性，这可以用抗体或其他靶点特异性结合剂实现。可检测标记可包括可见组分，如染料或荧光分子的典型组分；然而，也考虑了通过标记使用的任何信号装置。例如，荧光标记的生物样品是通过例如但不限于免疫荧光，免疫组织化学或免疫细胞化学染色的技术标记的生物样品，以有助于显微镜分析。在一种实施方式中，可检测标记化学地附连于生物样品或其靶点组分。在一种实施方式中，可检测标记是抗体和/或荧光染料，其中抗体和/或荧光染料还包括将样本附连或交联到可溶胀聚合物，诸如可溶胀的水凝胶，的物理，生物或化学锚部或部分。标记的样品还可包含多于一种的标记。例如，每个标记可以具有特定或可区分的荧光特性，例如可区分的激发和发射波长。另外，每个标记可以具有不同的靶点特异性结合剂，其对样品中的特异性和可区分的靶点或组分是选择性的。
如本文所用，双官能交联剂包括与样品内生物分子上的官能团(例如伯胺或巯基)的反应性基团。双官能交联剂用于化学地修饰具有可溶胀聚合物官能团的生物分子的胺基，这使样品内的抗体和其他内源性生物分子能够直接锚定到可溶胀聚合物或混入可溶胀聚合物中。在一种实施方式中，双官能交联剂是异型双官能交联剂。异型双官能交联剂在间隔臂的任一端拥有不同的反应性基团，即分离反应性基团的原子，间隔基或连接基。这些试剂不仅允许具有相应靶官能团的分子的单步缀合，而且它们还允许相继的(两步)缀合，其使不希望的聚合或自缀合最小化。
在一种实施方式中，双官能交联剂包括蛋白质反应性化学部分和凝胶反应性化学部分(即，可溶胀的聚合物反应性化学部分)。蛋白质反应性化学基团包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，硫醇，胺，马来酰亚胺，亚氨酸酯(imidoester)，吡啶基二硫醇，酰肼，邻苯二甲酰亚胺，双吖丙啶，芳基叠氮化物，异氰酸酯或羧酸，其，例如，可以与蛋白质或肽上的氨基或羧酸基团反应。在一种实施方式中，蛋白质反应性基团包含但不限于N-琥珀酰亚胺酯，五氟苯酯，羧酸或硫醇。凝胶反应性基团包含但不限于乙烯基或乙烯基单体，诸如苯乙烯及其衍生物(例如二乙烯基苯)，丙烯酰胺及其衍生物，丁二烯，丙烯腈，乙酸乙烯酯或丙烯酸酯和丙烯酸衍生物。
在一种实施方式中，将蛋白质直接锚定到任何可溶胀聚合物的化学物质是6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X，SE；缩写为“AcX”；Life Technologies)的琥珀酰亚胺酯。用AcX的处理使蛋白质上的胺被丙烯酰胺官能团修饰。丙烯酰胺官能团允许蛋白质在其原位合成时锚定到可溶胀聚合物。
在一种实施方式中，可以使用点击化学在分离的步骤中用蛋白质反应性基团和凝胶反应性基团修饰目的样品的蛋白质。点击化学，也称为打标签，是一类生物相容性反应，主要旨在将选择的底物与特异性生物分子接合。在该方法中，用包括点击基团的蛋白质反应性基团处理目的样品的蛋白质，并且然后用包括互补点击基团的凝胶反应性基团处理。互补基团包含但不限于叠氮基和末端炔烃(参见例如，H.C.Kolb；M.G.Finn；K.B.Sharpless(2001).“Click Chemistry:Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions”.Angewandte Chemie International Edition.40(11):2004-2021,其通过引用并入本文).
将生物样本包埋在可溶胀的聚合物中。通过“可溶胀聚合物”是指可以交联或“聚合”，以形成三维(3D)聚合物网络，其当与液体，诸如水或其它溶剂接触时扩展的亲水性单体，预聚物或聚合物。例如，可以使用一种或多种可聚合材料，单体或低聚物，诸如选自由含有可聚合烯属不饱和基团的水溶性基团组成的组的单体。单体或低聚物可包括一种或多种取代或未取代的甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，乙烯醇，乙烯胺，烯丙胺，烯丙醇，包含其二乙烯基交联剂(例如N,N-亚烷基双丙烯酰胺)。前体也可包括聚合引发剂和交联剂。
在一种实施方式中，可溶胀材料在3个围度上均匀地扩展。附加地或替代地，材料是透明的以使在扩展时，光可以穿过样品。在一种实施方式中，可溶胀聚合物是可溶胀的水凝胶。在一种实施方式中，可溶胀材料由其前体原位形成。
通过“可溶胀聚合物的前体”，“水凝胶亚单元”或“水凝胶前体”是指可交联或“聚合”的亲水单体，预聚物或聚合物，以形成三维(3D)水凝胶网络。在一种实施方式中，可溶胀聚合物是聚电解质。在一种实施方式中，可溶胀聚合物是聚丙烯酸酯或聚丙烯酰胺及其共聚物或交联共聚物。
不受科学理论的束缚，据信在水凝胶亚单元存在下生物样本的这种固定将样本的生物分子与水凝胶亚单元交联，从而将分子组分固定在适当的位置，保留组织架构和细胞形态。
可通过任何方便的方法将可溶胀聚合物的前体递送至生物样本，包含但不限于渗透，灌注，浸制，浸泡，添加或样品与可溶胀材料的前体的其他相互混合。以这种方式，可溶胀材料的前体在生物样本中饱和，该前体在整个样本的生物分子之间和周围流动。
在渗透样本后，可溶胀的聚合物前体聚合，即共价或物理交联，以形成聚合物网络。聚合物网络在样本内和整个样本中形成。以这种方式，可溶胀材料在生物样本中饱和，其在整个样本的生物分子之间和周围流动。
聚合可以通过任何方法进行，包含但不限于热交联，化学交联，物理交联，离子交联，光交联，辐射交联(例如，x射线，电子束)等等，并且可以基于所用水凝胶的类型和本领域的知识选择。在一种实施方式中，聚合物是水凝胶。聚合后，形成聚合物包埋的生物样本。
在一些实施方式中，如本文所述的锚定到灌注于整个样品中的可溶胀聚合物的天然蛋白质在扩展后可以保持表位功能性并且被标记，如果ExM的非特异性蛋白质水解用改良的凝胶化后均质化处理代替。这些途径可以克服在天然组织的拥挤环境中递送抗体所固有的限制。
通过将样本包埋入可溶胀的聚合物中，该聚合物物理上支持样本的超微结构，该技术保留了在其三维分布中的生物分子(例如，样本中的蛋白质，小肽，小分子和核酸)，由聚合物网络固定。通过绕过样本的破坏性切片，可以分析亚细胞结构。此外，样本可以是重复染色的，未染色的，和用其他试剂重新染色的用于综合分析。
在已将生物样品锚定到可溶胀聚合物之后，样本受到内源性生物分子(或生物样品的物理结构)的破坏，留下保留完整并且锚定在可溶胀聚合物上的靶生物分子的信息的大分子，例如标记或标签。以这种方式，样本-可溶胀聚合物复合物的机械性能在空间上更均匀，允许更大和更一致的各向同性扩展。
样本的内源性物理结构或生物样本的内源性生物分子的破坏通常指的是样品的机械的，物理的，化学的，生物化学的或酶促消化，破坏或破碎，以使其将不会抵抗扩展。在一种实施方式中，非特异性蛋白酶用于均质化样品-可溶胀聚合物复合物。
在一种实施方式中，非特异性蛋白酶在具有约4至约12的pH的缓冲液中。可以使用任何合适的缓冲剂，包含但不限于三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸盐，磷酸盐，碳酸氢盐，MOPS，硼酸盐，TAPS，N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸，三(羟甲基)甲基甘氨酸，HEPES，TES和MES。在一种实施方式中，缓冲液包括非特异性蛋白酶，金属离子螯合剂，非离子表面活性剂和单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约1U/ml至约100U/ml的非特异性蛋白酶，约5mM至约100mM的金属离子螯合剂，约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂，和约0.05M至约1M的单价盐。在一种实施方式中，将样品在缓冲液中在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时。在一种实施方式中，将样品在缓冲液中温育直至样品完全消化。
非特异性蛋白酶是本领域技术人员熟知的。非特异性蛋白酶包含但不限于蛋白酶K，枯草杆菌蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶。在一种实施方式中，缓冲液包括约1U/ml至约100U/ml的非特异性蛋白酶。在一种实施方式中，缓冲液包括约1U/ml至约50U/ml的非特异性蛋白酶。在一种实施方式中，缓冲液包括约1U/ml至约25U/ml的非特异性蛋白酶。在一种实施方式中，缓冲液包括约1U/ml至约10U/ml的非特异性蛋白酶。
螯合剂是本领域技术人员熟知的。螯合剂包含但不限于EDTA，EGTA，EDDHA，EDDS，BAPTA和DOTA。在一种实施方式中，缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂。在一种实施方式中，缓冲液包括约5mM至约75mM的金属离子螯合剂。在一种实施方式中，缓冲液包括约5mM至约50mM的金属离子螯合剂。
非离子表面活性剂是本领域技术人员熟知的。非离子表面活性剂包含但不限于曲拉通X-100，吐温20，吐温80，脱水山梨糖醇，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，PEG，癸基葡糖苷，癸基多聚葡萄糖和椰油酰胺DEA。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1％至约0.75％的非离子表面活性剂。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1％至约0.5％的非离子表面活性剂。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1％至约0.3％的非离子表面活性剂。
单价阳离子盐是本领域技术人员熟知的。单价阳离子盐含有阳离子，其包含但不限于Na+，K+，铵和Cs+。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.05M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.75M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1M至约1.0M的单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.1M至约0.7M的单价盐。在一种实施方式中，缓冲液包括约0.05M至约0.8M的单价盐。
优选破坏不影响可溶胀聚合物的结构，但破坏样本的结构。因此，样本破坏应该对可溶胀聚合物基本上是惰性的。消化的程度可足以损害样本的机械结构的完整性，或者它可以是完全的以至样本-可溶胀聚合物复合物基本上不含样品的程度。
然后将样本-可溶胀聚合物复合物扩展，例如，通过使可溶胀的聚合物与溶剂或液体接触，然后其被可溶胀的聚合物吸收并且引起溶胀。在可溶胀聚合物是水可溶胀的情况下，可以使用水溶液。可溶胀聚合物的溶胀导致样本本身扩展(例如，变得更大)。这是因为聚合物包埋整个样本，因此，随着聚合物溶胀(生长)，它扩展并且引起锚定的生物分子从各自拉开(即移开)。在一种实施方式中，可溶胀聚合物各向同性地扩展(溶胀)；因此，锚定的生物分子保持样本内的相对空间取向。
溶胀的生物样本-聚合物复合物可以在任何光学显微镜上成像，允许低于经典衍射极限的特征的有效成像。因为生成物样本可以是透明的，所以能够大体积，宽视野，3D扫描的定制显微镜也可以与扩展的样品共同使用。该方法还提供了包括扩增可检测标记的任选步骤。
使用所述方法，试剂，试剂盒，系统和装置，普通技术人员将能够制备任何生物样本以用于显微镜分析。方法，试剂，试剂盒，系统和装置可用于从任何植物或动物制备样本，包含但不限于转基因动物，例如脊椎动物或无脊椎动物，例如昆虫，蠕虫，非洲爪蟾蜍，斑马鱼，哺乳动物，例如马，牛科动物，绵羊，犬，猫科动物，鼠科动物，啮齿动物，非人灵长类动物或人类。可以从活体受试者(例如，活组织检查样品)收集组织样本，或者可以从死亡受试者(例如，尸检或验尸样品)收集组织样本。样本可以是任何组织类型，例如造血的，神经的(中枢或外周)，神经胶质的，间充质的，皮肤的，粘膜的，基质的，肌肉(骨骼的，心脏的或平滑的)，脾脏，网状内皮组织的，上皮的，内皮的，肝脏的，肾脏，胰腺的，胃肠的，肺的，纤维原细胞和其他细胞类型。在某些情况下，样本是整个生物体，例如，蠕虫，昆虫，斑马鱼。在其他情况下，样本是完整的器官，例如啮齿动物的全脑。在其他情况下，样本是器官的一部分，即活组织检查，例如移植组织的活组织检查。样本可以是新鲜分离的或保藏的，例如，快速冷冻。在一些实施方式中，样本可以是先前保藏的样本，诸如，例如来自组织库的保藏样本，例如从组织收集计划获取的人脑的保藏样本。在一些情况下，样本可以来自已知患有指定的疾病或病症的受试者，诸如，例如来自自闭症人的脑组织样品。在其他情况下，样品可以来自未患有特异性疾病或病症的“正常”受试者。在一些情况下，样品可以来自转基因受试者，诸如，例如转基因小鼠。
因为样本的细胞和/或生物分子锚定在物理上支持样本的超微结构的可溶胀聚合物上，所以通常提供结构支持但阻碍亚细胞蛋白质和分子可视化的细胞组分(例如脂质)可以在保留细胞和组织的三维架构的同时被去除。这种去除使得生物样本的内部基本上可透过光和/或大分子，允许样本的内部，例如，细胞和亚细胞结构，在显微镜下可视化，无需耗费时间的和组织的破坏性切片。此外，样本可以是重复染色的，未染色的，和用其他试剂重新染色的用于综合分析。
本主题方法有很多用途。例如，本主题方法可以应用于制备用于研究中枢神经系统的连接性的样本。如本文所用的“连接性”通常是指神经元之间的连接，并且包含单细胞水平的连接，例如突触，轴突末端，树突棘等，以及神经元群和CNS的作为主要轴突束的区域之间的连接，例如胼胝体(CC)，前连合(AC)，海马连合(HC)，锥体交叉，锥体束，外囊，内囊(IC)，大脑脚(CP)等。全脑和/或脊髓样本或其区域(例如大脑(即大脑皮层)，小脑(即小脑皮质)，前脑的腹侧区域(例如纹状体，尾状核，壳核，苍白球，伏核；隔核，丘脑底核)；丘脑和下丘脑的区域和核；深小脑(例如齿状核，球状核，栓状核，顶核)和脑干(例如黑质，红核，脑桥，橄榄核，颅神经核)的区域和核；和脊柱区域(例如前角，侧角，后角))可以通过本主题方法在死后制备，并且在显微镜下分析其中的神经元的连接性，例如，获取，储存，呈现，使用和操纵，例如，以提供死亡后的脑的完全连接性，例如人脑。这些研究将大大有助于理解脑如何在健康中和在疾病期间发展和起作用，以及理解认知和个性的基础。
作为另一个实例，可以采用本主题方法来评估，诊断或监测疾病。如本文所用的“诊断”通常包含受试者对疾病或疾患的易感性的预测，关于受试者目前是否受疾病或疾患影响的确定，受疾病或疾患影响的受试者的预后(例如，癌状态识别，癌症阶段，患者将死于癌症的可能性)，受试者对疾病或疾患的治疗的反应性(对，例如，同种异体造血干细胞移植，化学疗法，放射疗法，抗体疗法，小分子化合物疗法的，例如，阳性反应，阴性反应，根本没有反应)的预测和治疗监测(therametrics)的使用(例如，监测受试者的状况以提供关于疗法的效果或功效的信息)。例如，可以从癌组织制备活组织检查并且在显微镜下分析以确定癌症的类型，癌症已发展的程度，癌症是否将对治疗的干预有反应等。
作为另一个实例，可以从患病组织制备活组织检查，例如，肾脏，胰腺，胃等，以确定组织的状况，疾病已发展的程度，治疗将成功的可能性等。本文使用术语“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”等等通常意指获取所需的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有其的受试者中；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；或(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前，期间或之后施用。治疗稳定或减少患者的不良临床症状的持续疾病的治疗特别令人感兴趣。期望在受影响的组织中完全丧失功能之前执行这种治疗。本主题疗法将期望在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。术语“个体”，“受试者”，“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断，治疗或疗法的任何哺乳动物的受试者，特别是人。适合于使用本主题方法和系统以评估，分析，诊断，预后和/或治疗的疾病的实例包含但不限于癌症，免疫系统疾患，神经精神性疾病，内分泌/生殖疾病，心血管/肺疾病，肌肉骨骼疾病，胃肠疾病等等。
本主题方法还可用于评估正常组织，器官和细胞，例如以评估正常组织样本的细胞和组织之间的关系，例如，取自未知患有特定疾病或病症的受试者的组织样本。本主题方法可以用于探究，例如，胎儿发育期间细胞和组织之间的关系，诸如，例如，在神经系统的发育和成熟期间，以及在发育已完成后探究细胞和组织之间的关系，例如，充分发育的成年样本的神经系统的细胞和组织之间的关系。
本主题方法还提供了用于筛选候选治疗剂对组织或疾病的其效果的有用的系统。例如，受试者，例如小鼠，大鼠，狗，灵长类动物，人类等可以与候选试剂接触，器官或其活组织检查可以通过本主题方法制备，并且在显微镜下分析制备的样本的一种或多种细胞或组织参数。参数是细胞或组织的可量化的组分，特别是可以期望在高通量系统中准确测量的组分。
本主题方法也可用于在亚细胞分辨率下可视化整个组织中基因编码的标记物的分布，例如，染色体异常(倒位，重复，易位等)，基因杂合性的缺失，表示倾向于疾病或身体健康，对疗法的反应性的可能性，血统等等的基因等位基因的存在。这种检测可以用于，例如，诊断和监测疾病，例如，如上文所述，在个性化医疗中，和在研究亲子鉴定中。
如本文所用的短语“诊断(diagnostic)”是指识别病理状况的存在或性质。诊断方法在其敏感性和特异性方面不同。诊断测定的“敏感性”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。通过该测定未检测到的患病个体是“假阴性”。未患病并且在测定中测试阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为那些测试阳性而未患疾病的人的比例。虽然特定的诊断方法可能无法提供病症的明确诊断，但如果该方法提供有助于诊断的积极指示，它就足够了。
如本文所用的短语“诊断(diagnosing)”指的是对疾病或症状分类，确定该疾病的严重程度，监测疾病进展，预测疾病的后果和/或复原的前景。术语“检测”还可任选地包括上文任何一种。
在一些实施方式中，可以将增大的样品重新包埋入不可溶胀的聚合物中。“重新包埋”包括用不可溶胀的聚合物渗透(诸如，灌注，浸制，浸泡，添加或其他相互混合)样品，优选通过添加其前体。替代地或附加地，将样品包埋入不可溶胀的聚合物中包括在整个样品中渗透一种或多种单体或其他前体，并且使单体或前体聚合和/或交联以形成不可溶胀的聚合物或聚合物。以这种方式，例如，第一个增大的样品包埋入不可溶胀的聚合物中。尽管盐浓度改变，但将扩展的样品包埋入不可溶胀的聚合物中预防测序期间的构象变化。不可溶胀的聚合物可以是电中性的水凝胶。例如，它可以是聚丙烯酰胺水凝胶，由丙烯酰胺单体，双丙烯酰胺交联剂，过硫酸铵(APS)引发剂和四甲基乙二胺(TEMED)促进剂组成。
在一些实施方式中，对固定的生物样品进行钝化。如本文所用的术语“钝化”指的是使样品与固定剂中含有的组分反应性降低的过程，诸如通过用化学试剂使固定剂官能化以中和其中的电荷。例如，可用于可溶胀凝胶中的丙烯酸酯的羧基可以抑制下游的酶促反应。用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理由丙烯酸酯组成的可溶胀凝胶允许伯胺共价结合羧基以形成电荷中性酰胺并且钝化可溶胀凝胶。
该创新基于临床组织样本的独特的物理和化学特性使常见临床组织样本能够物理的扩展。临床组织样本通常是高度固定的，紧密附连在急速冷冻玻璃载玻片上，并且包埋入石蜡中(或染色并封固在封固介质中)用于长期储存。一些临床组织样本用染料染色，诸如苏木精和伊红(H&E)，它们与荧光成像是不兼容的。为了将ExM应用于临床样品，将去石蜡化，抗原修复和积极性蛋白酶消化整合到综合工作流程中以处置各种常见临床样本。去石蜡化和抗原修复解决了归档临床样品的复原，而积极性蛋白酶消化对于样品扩展的成功至关重要，因为大多数人组织含有丰富的难以消化的结构蛋白，诸如胶原蛋白和纤维连接蛋白，其妨碍样品的均匀扩展。总之，本发明允许ExM对大量归档临床样品的应用，并且通过传统光学显微镜实现对大范围的疾病机制的超分辨率光学询问。
本发明提供了综合的工作流程，以便于用于超分辨率分子成像的常见类型的临床样品的扩展。本文所述的方法将导致最佳后果，诸如适当的免疫染色，组织的充分消化，高质量的聚合物合成，和在扩展期间目的蛋白质的维持。
本发明还描述了经典H&E染色的载玻片的再利用，用于纳米级水平的进一步生物分子询问。通常，H&E染色的载玻片由于难以去除染色和封固介质而不被认为适合于进一步的下游处理。因此，本发明描述了一种独特的并且划算的途径来克服该障碍并且能够从所用的H&E载玻片中提取更多信息。在一种实施方式中，扩展H&E染色的载玻片以进一步利用的方法结合了与二甲苯-乙醇-水顺序洗涤，蛋白质锚定和原位聚合物合成。
实施例
人样品
本研究中使用的乳腺病理样本来自贝斯以色列女执事医疗中心(Beth IsraelDeaconess Medical Center)的病理学档案，并且在BIDMC IRB协议#2013p000410下用于AHB。冷冻肾脏病理样品由布里格姆和女性(Brigham and Womam)的档案在BWH IRB协议#2011P002692下提供给AW。其他人组织样品和组织微阵列购自商业来源(参见表1)。
表1.从商业来源购买的人样品
未识别档案样本的使用不需要受试者的知情同意。
抗原修复前的样品制备
对于石蜡包埋的临床样品
在一种实施方式中，工作流程总结在图1中。在实施方式中，其中临床组织样品包埋在石蜡中，需要去石蜡化。通过将载玻片置于科普林缸(Coplin jar)中并且使用以下溶液依次洗涤临床组织样品来执行去石蜡化：(a)2×二甲苯，(b)1:1二甲苯:100％乙醇，(c)2×100％乙醇，(d)95％乙醇，(e)70％乙醇，(f)50％乙醇，和最后(g)冷自来水。在一些实施方式中，将临床组织样品在每种溶液中洗涤3分钟。在一些实施方式中，临床组织样品在室温下洗涤。在实施方式中，其中石蜡包埋的临床组织样品在玻璃载玻片上，该载玻片在本文所述的溶液中依次洗涤。在一些实施方式中，石蜡包埋的临床样品是组织微阵列的一部分。在一些实施方式中，石蜡包埋的临床样品是组织微阵列。在一些实施方式中，使用去石蜡化溶液(QIAGEN)使石蜡包埋的临床样品脱石蜡。
在一些实施方式中，对于福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)临床样品，将样品依次置于一系列溶液中，每个步骤3min：2×二甲苯，2×100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，和最后的双去离子水。所有步骤均在室温(RT)下执行。
对于染色和封固的永久性载玻片
在实施方式中，其中临床组织样品被染色并且封固在永久性载玻片上，首先小心地去除载玻片的盖玻片。可以用任何合适的工具，例如剃刀刀片，去除盖玻片，并且如果盖玻片难以去除，则用二甲苯溶液预处理将有助于松开盖玻片。然后用上文讨论的基于二甲苯的去石蜡化溶液依次洗涤载玻片。在一些实施方式中，临床组织样品用H&E染色。
在一些实施方式中，将载玻片像上文讨论的FFPE样品一样处理。
在临床组织样品用水溶性染色剂，诸如伊红染色的实施方式中，染色剂可以用水洗掉。在临床组织样品用不溶性染色剂染色的实施方式中，进一步用不溶性染色剂，诸如苏木精染色，可通过用上文讨论的基于二甲苯的去石蜡化溶液洗涤临床组织样品来去除不溶性染色剂，或者这种不溶性染色剂可以存留在样品中，但在原位聚合物合成，消化和扩展步骤后可以被氧化和去除。
在一些实施方式中，可通过将包括临床组织样品的载玻片置于0.1M HCl溶液中直至完全去除不溶性染色剂来去除不溶性染色剂。在一些实施方式中，不溶性染色剂是苏木精。在0.1M HCL溶液中去除不溶性染色剂的缺点是组织可能在后面的步骤中从玻璃载玻片上脱离。
在将临床组织样品固定并且冷冻在玻璃载玻片上的实施方式中，将临床组织样品置于室温下以允许冷冻切割介质融化。如果将临床组织样品包埋在石蜡中，则如上文所讨论的将样品脱石蜡。
在一个实施方案中，在最佳切割温度(OCT)溶液(Tissue-Tek)中的未固定的冷冻组织载玻片最初在冰冷的丙酮中在-20℃下固定5-10min，然后3×PBS洗涤。对于已经固定和冷冻的临床组织切片，将载玻片置于RT下2min，使OCT溶液融化并且用PBS溶液洗涤3×。
一旦临床组织样品已经脱石蜡，或者如果临床组织样品未包埋在石蜡中但是用多聚甲醛或类似的基于醛的化学物质固定，则然后临床组织样品继续进行抗原修复步骤。
抗原修复
在通过福尔马林或类似的基于醛的化学物质固定的临床样品的实施方式中，临床组织样品必须在免疫染色步骤之前用抗原修复程序处理。如果临床组织样品不是石蜡包埋的，或已经脱石蜡，并且没有通过福尔马林或类似的基于醛的化学物质固定，则临床组织样品可以进行免疫染色步骤。
在必须用抗原修复程序处理临床组织样品的实施方式中，本领域技术人员已知的任何热诱导的表位修复或酶诱导的表位修复方法或它们的任何种类的组合可用于抗原修复。例如，在一些实施方式中，可将临床组织样品在RT下置于10mM柠檬酸钠溶液(pH 8.5)中5min，然后转移至10mM柠檬酸钠溶液(pH 8.5)中，在80-100℃下保持30min。
在一种实施方式中，将组织载玻片置于约100℃的20mM柠檬酸钠溶液(pH 8.5)中，并且在60℃温育室中冷却30min。
免疫组化
一旦临床组织样品已经脱石蜡并且必要时进行抗原修复，然后通过本领域技术人员已知的任何方法对临床组织样品免疫染色。在一些实施方式中，首先用MAXblockTM封闭介质(MAXblockTM Blocking Medium)(Active Motif)在37℃下封闭样品1小时，然后以10μg/mL的浓度在MAXstainTM染色介质(MAXstainTM Staining Medium)(Active Motif)中与一级抗体在约0℃至约40℃下温育约1分钟至约数天,取决于组织厚度和抗体。在一些实施方式中，将临床组织样品与一级抗体温育6-24小时。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约室温至约37℃下温育。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约室温下温育。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约37℃下温育。然后将临床组织样品在MAXwashTM洗涤介质(MAXwashTM Washing Medium)(Active Motif)中洗涤四次，每次5-30分钟，改变其间的溶液。然后将临床组织样品与大约10μg/mL浓度的适当的第二抗体以及MAXstainTM染色介质(MAXstainTM Staining Medium)中的300nM DAPI一起在约0℃至约40℃下温育约1分钟至约数天,取决于组织厚度和抗体。在一些实施方式中，将临床组织样品与一级抗体温育6-24小时。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约室温至约37℃下温育。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约室温下温育。在一些实施方式中，临床组织样品与一级抗体在约37℃下温育。然后将临床组织样品在MAXwashTM洗涤介质(MAXwashTM Washing Medium)中洗涤数次。
蛋白质保藏的化学处理
一旦临床组织样品已经脱石蜡并且必要时进行抗原修复，并且临床组织样品被免疫染色，可以处理样品以进行蛋白质保藏，如WO 2017/027368中所述的，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，通过在含有0.03-0.2mg/ml丙烯酰基X丙烯酰基-X，SE(6-((丙烯酰基)氨基)己酸，琥珀酰亚胺酯，此处缩写为AcX；(Thermo Fisher Scientific)的PBS缓冲液中温育2-12小时来处理临床组织样品。
在一种实施方式中，将AcX以10mg/mL的浓度溶解在无水DMSO中，等分并且在干燥环境中冷冻储存。将组织载玻片与在PBS缓冲液中稀释的0.03-0.1mg/ml AcX(对于用非醛固定剂固定的样品为0.03mg/ml，对于用醛固定剂固定的样品为0.1mg/ml)在RT下温育超过6小时。
原位聚合物合成
一旦临床组织样品已经脱石蜡并且必要时进行抗原修复，并且临床组织样品被免疫染色，并且任选地对蛋白质持续性处理，临床组织样品进行原位聚合物合成。简略地，在原位聚合物合成之前制备包含1×PBS，2M NaCl，8.625％(w/w)丙烯酸钠，2.5％(w/w)丙烯酰胺，0.10％(w/w)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(均来自Sigma Aldrich)的单体溶液并等分。将组织载玻片与单体溶液在4℃下温育约1小时，以允许单体溶液完全扩散并且预防过早凝胶化。将作为抑制剂的4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(Sigma Aldrich)，作为促进剂的四甲基乙二胺和作为引发剂的过硫酸铵依次添加到单体溶液，各自达到0.2％(w/w)。最后，将样品在37℃与湿润空气下温育1.5-2小时以完成凝胶化。
在一些实施方式中，在原位聚合物合成之前制备包含丙烯酸钠，丙烯酰胺和双丙烯酰胺，盐和缓冲剂的单体溶液。可以将单体溶液在4℃冷却以预防过早凝胶化。将作为引发剂的过硫酸铵，作为促进剂的四甲基乙二胺和作为抑制剂的4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基添加到单体溶液中，各自达到0.2％(w/w)。将组织载玻片与单体溶液在4℃下温育(取决于厚度的可变时间)以允许单体溶液扩散，并且然后在37℃与湿润空气下温育1-2小时以使能够凝胶化。
在聚合完成后，使用剃刀刀片或适当的工具切割目的区域(对于载玻片样品，组织残余附连在载玻片上)。在一些实施方式中，可以在样品已扩展后切出来自样品的目的区域。在一些实施方式中，在扩展之前切出来自样品的目的区域。
样品消化和扩展
一旦临床组织样品已进行原位聚合物合成，临床组织样品在4-32U/ml蛋白酶K(New England Biolabs)中在包括50mM三羟甲基氨基甲烷(pH8)，5-100mM EDTA，0.25％曲拉通X-100，和0.4M盐酸胍的改良消化缓冲液中温育。在一些实施方式中，将临床组织样品在50℃下温育至少8小时直至消化完成。
在一些实施方式中，临床组织样品难以消化，因为用于蛋白酶K消化的常规缓冲液对临床组织样品不能很好地起作用；因此，难以确保样品可靠的消化。因此，本发明还描述了“扩展期间的消化”方法以克服该问题。在一些实施方式中，临床组织样品和蛋白酶K在包括50mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M盐酸胍的改良消化缓冲液中温育。盐浓度维持在低离子强度，这促进消化期间组织样品的适度扩展，并且使消化酶能够更好地渗透到组织内。为了进一步帮助消化，使用高浓度的乙二胺四乙酸的二钠盐(EDTA)来螯合任何残留的二价阳离子，其维持组织中结构蛋白的结构完整性，诸如胶原蛋白和纤维连接蛋白。设定温育温度以增加酶活性。
在一些实施方式中，将样品在8U/ml蛋白酶K(New England Biolabs)中在含有50mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100,0.4M盐酸胍(或0.4MNaCl)的改良消化缓冲液中温育，并且将组织在60℃下温育0.5-3小时或直至消化完成。将消化的样品用1×PBS缓冲液洗涤一次，并且用PBS缓冲液中的300nM DAPI染色1小时，然后用1×PBS洗涤至少两次，每次洗涤至少20分钟。最后，将凝胶置于双去离子水中10min以扩展。该步骤在淡水或0.002％～0.01％叠氮化钠溶液中重复3-5次(以预防细菌生长)，直至扩展样品的尺寸保持不变。
在一些实施方式中，临床组织样品消化的完成导致载玻片上组织的松散脱离。在一些实施方式中，可以将临床组织样品与载玻片分离。在一些实施方式中，临床组织样品可以用DAPI或其他化学核染色剂染色。在一种实施方式中，在消化后用1×PBS缓冲液洗涤临床组织样品一次，并且用PBS缓冲液中的300nM DAPI染色1小时，然后用1×PBS洗涤至少两次，每次洗涤至少20分钟。如果样品在原位聚合物合成之前用DAPI或其他化学核染色剂染色，则染色剂将在消化缓冲液中扩散开。为了复原核染色，在消化后用1×PBS缓冲液洗涤样品一次，并且用PBS缓冲液中的300nM DAPI染色1小时，然后用1×PBS洗涤至少两次，每次洗涤至少20分钟。最后，通过用Milli Q水反复洗涤使样品扩展。
DNA FISH
在一些实施方式中，为了进一步处理用于DNA FISH的扩展样品，将消化的凝胶样品在85℃下置于含有1×PBS，15％碳酸亚乙酯，20％硫酸葡聚糖，600mM NaCl和0.2mg/ml单链鲑鱼精子DNA的杂交缓冲液中30min，然后与在85℃下预热10min的30μL含有SureFISH探针(Agilent/Dako)的杂交缓冲液混合。然后将混合物在45℃下温育过夜。第二天，样品用含有1×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)和20％碳酸亚乙酯的严格洗涤缓冲液在45℃下洗涤15min，然后用2×SSC在45℃下洗涤3次，每次10min。最后，将凝胶样品用0.02×SSC洗涤多次(每次5min)直至扩展完成。
成像
在一些实施方式中，扩展的临床组织样品的成像可以用传统荧光，共焦显微镜或其他所需的镜完成。通过将扩展前和扩展后的临床组织样品置于玻璃底六孔板(In VitroScientific)中，在Andor Revolution的旋转盘式共焦上获得临床组织样品的扩展前和扩展后的图像，并且通过用1％琼脂糖封固来保持在位置上。在具有1×或1.5×变焦的40×1.10NA(Nikon)水物镜上拍摄图像，并且图2中示出了石蜡包埋的组织微阵列的扩展并且图4中示出了H&E染色的载玻片的再次使用和扩展。
扩展后的荧光显微镜
样本的低放大倍率图像在具有SPECTRA X光引擎(Lumencor)的Nikon Ti-E落射荧光显微镜和由NIS-Elements AR软件控制的具有4×0.13NA空气物镜或10×0.2NA空气物镜(Nikon)的5.5Zyla sCMOS相机(Andor)上成像。对于一些图像，使用40×1.15NA水浸物镜(Nikon)在同一显微镜上获得图像。使用以下滤光片立方体(Semrock，Rochester，NY)：DAPI，DAPI-11LP-A-000；Alexa Fluor 488，GFP-1828A-NTE-ZERO；Alexa Fluor 546，FITC/TXRED-2X-B-NTE；Atto 647N或CF 633，Cy5-4040C-000。
另外，所有其他呈现的荧光图像使用Andor旋转盘式(CSU-X1 Yokogawa)共焦系统在具有40×1.15NA水浸物镜的Nikon TI-E显微镜本体上成像。DAPI用405nm激光在450/50发射滤光片的情况下激发。Alexa Fluor 488用488nm激光在525/40发射滤光片的情况下激发。Alexa Fluor 546用561nm激光在607/36发射滤光片的情况下激发。Atto 647N和CF633用的640nm激光在685/40发射滤光片的情况下激发。
明场显微镜
在具有DS-Ri2sCMOS 16mp彩色相机(Nikon)和白色LED灯，具有4×0.13NA空气物镜或10×0.2Na空气物镜的Nikon Ti-E显微镜上获得低放大倍率图像。在具有40×0.95NA空气物镜(Zeiss)的Pannoramic Scan II(3DHistech)上获得H&E载玻片的高放大倍率图像。
自体荧光分析
在分析之前，通过从空白区域减去平均像素值，从所有图像中去除组织无关的背景。对于每个荧光通道，选择10个含有最亮荧光信号的目的区域和一个含有自体荧光信号的区域，由病理学家的目视检查判断，并且用于计算信号与背景的比例。
测量误差量化
不同z平面中的相同的视场首先在扩展前和扩展后成像。为了匹配扩展前和扩展后的z平面，对扩展前和扩展后的z平面(或z投影)对的所有可能的组合生成尺度不变特征变换(SIFT)关键点。使用VLFeat开源库生成SIFT关键点并且通过随机样品一致性(RANSAC)过滤，其几何模型仅限于旋转，平移和缩放。具有最多SIFT关键点的一对扩展前和扩展后的图像用于通过旋转，平移和均匀缩放进行图像配准，以及扩展因子和矢量变形场的计算。通过在任意两点减去所得到的矢量，对点到点定位误差的可能测量值的整个群体采样，并且将这种测量值的均方根误差绘制为测量长度的函数。
计算核异型性分析
以下是用于将扩展的乳腺组织图像分类为不同类别的建议框架：正常乳腺，乳腺良性病变(UDH和ADH)和非侵袭性乳腺癌。该图像分类框架由四个组成部分组成：图像预处理，核分割，特征提取和图像分类。图像预处理和核分割流程如图9A所示。
图像预处理
在用DAPI对核的组织扩展和生物标记物染色后，使用共焦显微镜以40×放大倍率执行图像采集。由于采集了多个不重叠的图块并且缝合以产生单一图像，这些图块展示了滚球背景噪声。在图像预处理期间，应用球尺寸作为平均核尺寸的滚球背景校正算法以去除不均匀的背景噪声。在去除背景噪声之后，通过自适应直方图均衡化增强核与背景的对比度。通过半径为10的中值滤波器平滑这些增强的图像。
核分割
核分割程序由三个步骤组成。首先，使用基于泊松分布的最小误差阈值法分割核。由于核和背景区域的高可变性，标准和全局阈值法作为最小误差阈值法不是有效的。为了解决该问题，该局部自适应阈值算法通过使用图像直方图对两个泊松模型的混合建模来选择阈值。通过最小化图像直方图和泊松混合模型之间的相对熵来计算阈值。然后通过一系列形态学操作改善核的初始分割，包含空穴填充和形态学闭合以填充空穴并且组合核的小碎片以形成一个单个核，和形态学打开以去除小的非核区域(例如血管，碎片核的部分和人工制品)。这种分割方法可细分相互接触的聚集的核。其次，为了分离接触和重叠的核，我们使用尺度自适应多尺度高斯拉普拉斯算子(Laplacian of Gaussian)(MSLoG)滤波器来产生局部最大值并且选择核的种子点。在选择局部最大值点的情况下，恒定尺度产生不精确的核种子点，因为核尺寸在早期乳腺瘤形成病变中显着变化。为了解决这个问题，在给定数量的尺度上应用尺度自适应MSLoG滤波器，并且选择尺度-空间响应中的局部最大值点作为种子点。最后，将这些种子点用作对标记物控制的分水岭算法的标记物，以分离接触和重叠的核。
特征提取
在核分割后，为每个核提取形态学一阶统计和二阶统计特征。形态学特征包含反映核的表型信息的形状和几何特征。计算的形态学特征是面积，凸面积，周长，等效周长，偏心率，取向，坚固性，范围，紧密度，主轴长度，短轴长度，椭圆小和主半径。一阶统计特征确定了核区域内灰度值的分布。计算的一阶统计特征是平均值，中位数，平均绝对偏差，标准偏差，四分位差，偏度和峰度。二阶统计特征确定了核纹理内部的变化。
使用灰度Haralick共生和游程长度矩阵计算两种类型的二阶统计特征。共生矩阵GLCM(i，j；d，θ)是具有维度Ng的正方形，其中Ng是图像中灰度的总数。矩阵中第i和第j列的值是通过计数在距离d和角度θ处具有值i的像素与具有值j的像素邻接的总次数产生的。然后将整个矩阵除以已经作出的这种比较的总数。替代地，GLCM矩阵的每个元素被认为是在距离d和角度θ处发现具有灰度i的像素与具有灰度j的像素的概率。用一个位移矢量在四个方向(垂直，水平，左和右对角线)中定义邻接，其产生四个GLCM矩阵。纹理信息是旋转不变的。因此，采用所有四个方向上的平均值并且产生一个GLCM矩阵。随后，根据GLCM计算Haralick建议的14个特征以便更紧密地识别纹理。这14个特征是自相关性，相关性，对比度，集群阴影，集群突出，能量，熵，齐次性，归一化逆差，归一化逆差矩，差异性，最大概率，信息度量相关性1和信息度量相关性2。
在给定方向上共线的具有相同灰度的连续像素的集合构成灰度游程长度矩阵GLRLM(i，j；θ)。GLRLM的维度是Ng×R，其中Ng是灰度的数量以及R是最大游程长度。与GLCM类似，计算四个方向的GLRLM并且随后平均它们。从GLRLM导出的11个游程长度特征是短游程因子(SRE)，长游程因子(LRE)，灰度不均匀度(GLN)，游程长度不均匀度(RLN)，比率百分比(RP)，低灰度游程因子(LGLRE)，高灰度游程因子(HGLRE)，短游程低灰度因子(SRLGLE)，短游程高灰度因子(SRHGLE)，长游程低灰度因子(LRLGLE)和长游程高灰度因子(LRHGLE)。总共计算了每个核的45个特征。最后，通过计算包含每个图像的每个特征的平均值，中值，平均绝对偏差，标准偏差，四分位差，偏度和峰度的一阶统计量，在图像水平归总这些特征，每个图像产生315个归总特征。
图像分类
在框架的最后部分期间，用Lasso正则化执行逻辑回归，以建立基于多变量图像特征的模型，以对正常，良性和侵袭前恶性组织图像分类。使用glmnet包在R中实现分析。与从标准逻辑回归所获取的那些相比，Lasso正则化用于创建更简单的模型，不易过度拟合。Lasso程序包含执行具有L1正则化惩罚的逻辑回归，其具有将最小预测特征的回归权重缩小到0的效果。惩罚量(和模型中的非零特征的数量)通过正则化参数λ确定。该方法已被证明在共线性设置中执行良好，并且已被广泛用于从转化癌症研究中的高维数据建立预测模型。使用glmnet中的选定设置，在模型构建之前，在培训和验证数据集中单独地标准化特征。评估具有6倍交叉验证(6F-CV)的模型性能。为了验证，在培训倍数据集上选择在交叉验证中实现曲线下最大面积(AUC)的λ值，并且将该固定模型应用于验证倍数据集。通过计算真阳性与假阳性的受试者工作曲线下面积(AUC)来评定模型性能，其中完美分类器将实现1的AUC，而随机分类器将实现0.5的AUC。
框架的评估也使用另外两种机器学习分类器执行，其通常用于生物医学研究。随机森林分类器在数据集的各种子样品上拟合许多决策树，并且使用平均来提高预测精确度和控制过拟合。树的数量(numTrees)，树的最大深度(maxDepth)和随机选择中使用的特征数(numFeatures)是影响随机森林性能的三个参数。在实验中，使用numTrees＝100，maxDepth＝30和numFeatures＝20。最后一个分类器是朴素贝叶斯(Naive Bayes)，其是基于应用贝叶斯定理(Bayes'theorem)的概率分类器，具有特征之间很强的独立性假设。由于预测值是类别标记(例如，我们正在追求分类问题)，与回归相比，独立性假设对分类的限制较少。
图像分类结果
图像分类框架应用于扩展前和扩展图像两者。两个数据集由105个图像组成，含有36个正常乳腺组织图像，31个非侵袭性病变乳腺组织图像(15个UDH和16个ADH)和38个侵袭前乳腺组织图像(DCIS)。因此这105个图像属于4个不同的类别(正常，UDH，ADH和DCIS)。病例的总数为131个；分析了105例并且排除了26个，因为它们被判定为临界诊断的病例。为了区别正常乳腺组织与每种非侵袭性和侵袭前乳腺组织类型，对所有类别执行二元分类并且结果如图9C所示。为了区别正常乳腺组织与UDH，ADH和DCIS组织，GLMNET分类器报告了与扩展前数据的AUC分别为0.86,0.82和0.75相比，扩展数据的AUC分别为0.95,0.96和0.94。为了区分非非典型乳腺组织(UDH)与非典型乳腺组织(ADH和DCIS)，GLMNET分类器报告了与扩展前数据的AUC分别为0.71和0.82相比，扩展数据的AUC分别为0.93和0.89。为了区别非典型良性乳腺组织(ADH)与侵袭前乳腺癌组织(DCIS)，GLMNET分类器报告了与扩展前数据的AUC为0.84相比，扩展数据的AUC为0.95。
临床样品和病理学-优化的扩展显微镜
在设计一系列步骤时考虑了临床和病理组织样品的三个起始状态，以使不同的临床样品都将达到用于ExM处理的优化的条件(图1A)：福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)，H&E染色的组织切片和新鲜冷冻组织，均假设组织被薄切片并且在玻璃载玻片上。首先测试FFPE样品，因为假定对于其他三个类别所需的所有步骤都是对于FFPE组织处理所需的步骤的子集或排列。评估二甲苯处理是否去除石蜡，然后再水化和相当标准的抗原修复步骤(例如，将样品在100℃下置于pH 8的20mM柠檬酸钠中，并且然后立即转移到60℃的室中，保持30min)，可以使样品能够被处理。发现即使在去除石蜡之后，大量福尔马林固定的人组织也未在方案下均匀扩展，除非执行消化。检测EDTA在1mM与25mM浓度下对包含皮肤，肝脏，乳腺和肺的人样品的消化的影响，包含丙酮固定的以及FFPE样品(图3；表2)。
表2.EDTA浓度对人组织/水凝胶杂样品的蛋白酶K消化的影响。
*消化条件：8单位/mL蛋白酶K溶液，含有25mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8)，0.25％曲拉通X-100,0.4M NaCl，在60℃下3小时。
√完全消化。
×不完全消化。
探究了在两种条件下消化时间对人皮肤和肝脏FFPE样品的影响，样品含有独特的细胞外基质组分并且由于福尔马林固定的细胞外基质(ECM)蛋白质，在蓝色和绿色荧光发射通道中显示强自体荧光。
表3 EDTA浓度对人组织/水凝胶杂样品的蛋白酶K消化的影响，作为消化时间的函数。
发现用25mM EDTA辅助的蛋白酶K消化在0.5小时内完全消化并充分扩展人皮肤和肝脏样品两者。另一方面，如残留自体荧光所示(图3Aiii，Avi)，在1mM EDTA的情况下，任一类型的组织中ECM未被充分消化。不完全消化会引起微观和宏观尺度两者的失真。至于其他类型的组织，两种方法都足够。
这种具有二甲苯处理和增加的EDTA的FFPE流程可以制备用于本文所述方法的样品，通过评定用FFPE保藏制备的正常人乳腺组织的整个流程来验证。用宽视野(图1B)或SR-SIM(图1F)显微镜在扩展前成像，然后分别在宽视野(图1C)或共焦(图1G)显微镜上在扩展后成像，产生百分之几的低失真水平(图1D，1E，1H和1I)。因此，这种扩展病理学(ExPath)方案能够扩展石蜡包埋的和高度醛固定的样品。
制定了基本的ExPath流程后，也需要制备H&E染色的样品。对于封固的样品，必须去除盖玻片和封固介质(硬质物质，由聚苯乙烯制成)；因为二甲苯处理作为对扩展显微镜的预处理是可接受的，所以添加二甲苯预处理步骤以溶解掉封固介质并且导致盖玻片的去除。
H&E染色的组织显示出高背景荧光，说明去除伊红和苏木精对于之后的荧光抗体染色将是重要的。使用ExPath方案，随着处理的时间进程，伊红和苏木精都被自然去除。因此，表明了可以使用有非典型性导管增生(ADH)(图1J，1K)的人乳腺组织的H&E载玻片，通过可视化核DNA(消化后用DAPI染色)，以及应用针对线粒体蛋白质Hsp60和波形蛋白的抗体染色剂来制备封固的H&E样品。
最后，对于用丙酮固定保藏的新鲜冷冻切片；发现，将AcX的浓度从0.1mg/mL降低到0.03mg/mL使能够更好的处理(图3K，3L)，可能因为没有用醛处理的组织中可用的游离胺数量更多。
制定了基本的ExPath方案后，该方案延伸到了实验环境。例如，DNA荧光原位杂交(FISH)通常用于评定乳腺癌中的HER2基因扩增。DAPI能够在扩展后染色DNA，与扩展样品中DNA的凝胶保留一致；因此，检查了扩展后DNA FISH是否可行。大尺寸的传统双链细菌人工染色体(BAC)为基础的FISH探针(例如靶向HER2的基于BAC的FISH探针的长度大约为220kb)阻碍了扩展样品的染色，因此选择靶向HER2的商业上可获得的SureFISH探针(其是平均尺寸为～150个碱基的单链寡核苷酸库)和(作为对照的)17号染色体的中心体。对于商业上可获得的没有HER2扩增的乳腺癌样本(图1L)和对于HER2扩增的癌症(图1M)，观察到SureFISH探针扩散到乳腺ExPath样品中并且与染色体DNA杂交，在HER2扩增的情况下明显有更多的DNA杂交。因为DNA FISH是作为该过程的最后步骤执行的，它不会干扰在方案中较早发生的免疫染色。将乳腺样品与针对HER2蛋白的抗体共染色，并且证实HER2蛋白表达与HER2基因扩增的相关性(图1L，1M)。
ExPath，因为它使分子分隔开并且还导致消除不需要的分子，与传统免疫染色相比呈现几个优点。例如，尽管存在自体荧光减少方法，组织自体荧光仍然在病理学分析中对免疫荧光和荧光原位杂交的临床应用具有挑战性。用ExPath处理的样本为>99％水，并且因此是透明的且折射率与水匹配。因此，ExPath的分子清除，消除了有助于自体荧光的非锚定生物分子(包含潜在的蛋白质以及小分子两者)，具有非常实际的后果：即，在一些光谱通道中自体荧光与信号相比减少了一个数量级。
将ExPath应用于含有来自各种器官的数十个样品的市场上可获得的组织微阵列，检查来自8个不同器官(乳腺，前列腺，肺，结肠，胰腺，肾脏，肝脏和卵巢)的含癌与正常组织，在所有情况下获取～4-5×的扩展，平均扩展系数4.7(标准偏差(SD)0.2)。扩展变差小于10％，表示在不同类型的人组织中扩展的一致性能。ExPath揭示了中间丝角蛋白和波形蛋白的亚衍射限制结构，其在上皮-间充质转换、癌症进展和转移的起始中是至关重要的(图2)。鉴于波形蛋白是基质组织的标准标记物并且角蛋白是上皮组织的标准标记物，ExPath将提供一种简单并且方便的方式来观察来自广泛的人器官的临床活组织检查样品中的不仅核酸，还有蛋白质生物标记物的亚衍射形态。
ExPath使人足细胞三级足突能够可视化
鉴于纳米级成像在病理学中尚未普及，本文所述的ExPath方法可用于探究正常与异常样品，然后对关键特征传统或自动检查，既用于精确定位新的病理机制，也用于疾病分类和精确诊断。例如，通常经由电子显微镜诊断或证实肾脏疾病，诸如微小病变(MCD)和局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)(和与肾病综合征相关的其他病变)。在MCD中，肾脏三级足细胞足突，通常覆盖肾小球毛细血管袢的表面，如交叉突指状物，失去其特点形态并且在电子显微镜下出现连续——这种现象称为足突消失(FPE)。单个足突的宽度约为200nm，超出了使用传统光学显微镜的分辨率极限。确定ExPath是否可以帮助足细胞足突可视化。首先识别在三级足细胞足突中特异性的且丰富的蛋白质靶点，检查选择的报告的足细胞足突标记物的免疫荧光。在示出特异性的和强烈的足细胞足突染色的潜在蛋白质靶点中，在ExPath环境中，用于免疫染色之前热处理的丙酮固定的冷冻肾脏样品(图6和7)的是辅肌动蛋白-4。还识别了适用于ExPath成像的抗突触足蛋白23抗体(图7)。与丙酮固定的冷冻肾脏样品相比，用柠檬酸盐或三羟甲基氨基甲烷-EDTA抗原修复方法处理的肾脏FFPE样品(图8)的抗辅肌动蛋白-4抗体的免疫染色质量略有下降。免疫染色质量的下降可能是由于福尔马林诱导的交联引起的抗原性退化。用抗辅肌动蛋白-4抗体，以及针对波形蛋白(肾小球标记物)和胶原蛋白IV(毛细血管基底膜的标记物)的抗体共染色人肾脏样品，允许观察肾小球的显微解剖(图5A与B)，用ExPath揭示了在正常人肾脏样品中(图5C)中三级足细胞足突的超细结构(图5B)与传统的共焦成像(图5A)。因此，来自有正常肾脏的患者以及患有MCD或FSGS的患者的新鲜冷冻的肾脏切片被染色和扩展。获得ExPath图像并且与对应情况的电子显微镜图像比较。与非临床人肾脏样品的结果类似，观察到来自正常情况的肾脏中的三级足突的超细结构(图5E)，但在MCD情况中观察到足突消失(图5G)，与来自相同样品的对应EM图像中所见的足突形态(图5D和5F)一致。因此，在样品扩展后，可以用传统的衍射限制光学显微镜可视化肾病疾病的人临床样品之间的纳米级差异。
为了在盲法研究中检查ExPath是否能够准确识别来自MCD和FSGS两种情况的足突消失，包含五位病理学家和两位非病理学家的七名观察者首先研究扩展前和扩展后状态两者中的肾脏肾小球的免疫荧光图像的样品集，并且然后检查来自正常受试者的3个样本，来自MCD患者的2个样本和来自FSGS患者的1个样本的肾脏肾小球的10个不同的扩展前和10个扩展后免疫荧光图像。对于未扩展样品，分类精确度仅为65.7％(标准偏差(SD)17％)，但如果替代地使用扩展后图像(p＝0.0088，双尾t检验)，则分类精确度显着增加至90％(SD8％)。为了评定观察者之间的一致性，对观察者对两组数据的分类评级计算Fleiss kappa值。发现对扩展后数据的观察者的评级的很强的一致性，在95％置信水平下kappa值为0.68±0.14，而对扩展前数据的观察者之间的一致性(0.35±0.13,95％置信水平)较差——事实上，鉴于临床可接受的阈值为0.40，kappa值是处于边缘的。ExPath使观察者之间能够根据单一扩展后图像(在临床实践中，当然，肾脏病理学家通常检查多个选定的EM图像以准确诊断)准确并且一致地评估该图像是来自正常还是异常状态的样品。结果表明，使用ExPath的大规模盲法研究可能与简化肾病的肾脏疾病，和涉及已知的纳米级病理学的可能的其他疾病的诊断或证实，以及帮助在改变太小而不能用普通的显微镜分辨时早期疾病的检测高度相关。
ExPath显着改善了早期乳腺病变的计算诊断
乳腺病理学中最具挑战性的问题领域之一是早期乳腺病变的分类。例如，一项研究表明，专家病理学家和在社区中实践的病理学家之间的一致率在乳腺的非侵袭性病变的分类中可以变化很大，对于非典型乳腺病变的一致性仅为约50％11。这些病变的病理分类提供了极其重要的诊断信息，以预防过度治疗和治疗不足，并且以指导临床管理。
推测，当前分类方法的问题是由于两个问题：第一，诊断标准主要是定性的和主观的；第二，图像中含有的信息受传统光学显微镜的光学衍射限制的限制。为了开始解决第一个问题，开发了可以区别良性和恶性导管内增生性乳腺病变的计算病理学模型。然而，这些模型的功效受到衍射限制图像可提取的信息的限制。因此，ExPath用于检查早期乳腺病变的病理分类，因为从扩展样品获取的额外信息可能导致更高质量的提取特征，进而导致侵袭前乳腺病变的可再现的分类的改善。
自动分割框架应用于扩展前的H&E染色的图像，以及用对扩展后DAPI染色的图像优化的核检测和分割算法更新的图像分类框架(图9A)。用于扩展后DAPI染色的图像的图像分类框架包含前景检测，核种子检测和核分割(图9A)。在应用该框架后，从扩展前和扩展后图像两者的每个分割核中提取三种特征：核形态特征，核强度特征和核纹理特征。
两个数据集(扩展前和扩展后)中的每一个都由105个图像组成：36个正常乳腺组织图像，31个增生性病变(良性)图像(15个普通型导管增生(UDH)，16个非典型性导管增生(ADH))和38个原位导管癌(DCIS)。所有样品均扩展～4-5×，平均扩展系数为4.8(SD：0.3)。评定了ExPath对来自扩展前和扩展的数据集两者的31个图像的子集的核检测和分割算法的性能的影响(6个正常，9个UDH，9个ADH和7个DCIS；图9B)。扩展样品中核的计算检测明显更准确(图9B)，与非扩展样品相比，真阳性率增加11％，阳性预测值增加22％，并且f分数增加16％，并且分割也明显改善，f分数增加14％，kappa增加77％并且全局一致性误差(GCE)减少66％。核检测和分割的这种改善的精确度将有助于支持改善的计算病理学分析。为此，与扩展前数据相比，当模型在扩展后数据上运行时，分类性能改善(图9C)。特别地，当检查真阳性与假阳性的受试者工作曲线下面积(AUC)时(其中完美分类器将实现1的AUC，而随机分类器将实现0.5的AUC)，与对扩展前组织仅为0.71相比，在扩展样品上的该流程能够将病变(诸如UDH)与非典型病变(诸如ADH)区别开，AUC为0.93。
这些发现表明，在扩展后图像上实现的改进的核分割导致了更多信息特征，这进而导致更高性能的分类模型。因此，ExPath可以促进增生性乳腺病变的计算病理学分化，提供可潜在地预防过度诊断和诊断不足并指导临床管理的诊断信息。
虽然已经参考其优选实施方式详细示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离由所附权利要求所包含的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上对本文做各种改变。
Claims (21)
1.一种用于制备可扩展生物样本的方法，包括以下步骤
(a)使所述样品与将与所述样品内的生物分子结合的大分子接触；
(b)用双官能交联剂处理所述样本；
(c)用可溶胀聚合物的前体渗透所述样本；
(d)聚合所述前体以在所述样本内形成可溶胀聚合物；
(e)将所述生物分子锚定到所述可溶胀聚合物上；以及
(f)将所述样品与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中，在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时，所述缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂，约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂，和约0.05M至约1.0M的单价盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起所述可溶胀聚合物溶胀而扩展所述可扩展样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本是先前保藏的临床样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)或苏木精和伊红(H&E)染色的组织样品，或新鲜冷冻的样品，并且其中，在接触步骤(a)之前，所述方法还包括以下步骤
(i)如果所述样品是封固的，将所述样品去盖玻片；
(ii)如果所述样品是封固的，对所述样品进行封固介质去除；
(iii)如果执行了步骤(ii)，对所述样品进行再水化；以及
(iv)对所述样品进行抗原修复。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白酶选自蛋白酶K，枯草杆菌蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸盐，磷酸盐，碳酸氢盐，MOPS，硼酸盐，TAPS，N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸，三(羟甲基)甲基甘氨酸，HEPES，TES和MES。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述螯合剂选自EDTA，EGTA，EDDHA，EDDS，BAPTA和DOTA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面活性剂选自曲拉通X-100，吐温20，吐温80，脱水山梨糖醇，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，
PEG，癸基葡糖苷，癸基多聚葡萄糖和椰油酰胺DEA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐选自Na+，K+，铵和Cs+。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述样品在包括8U/ml蛋白酶K，50mM三羟甲基氨基甲烷，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的缓冲液中温育。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述双官能交联剂是6-((丙烯酰基)氨基)己酸(AcX)的琥珀酰亚胺酯。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述接触步骤(a)之前，对所述样品进行抗原修复。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述样品在约100℃下在20mM柠檬酸钠溶液中加热。
14.一种制备可扩展生物样本的方法，包括以下步骤
(a)用双官能交联剂处理所述样本；
(b)用可溶胀聚合物的前体渗透所述样本；
(c)聚合所述前体以在所述样本内形成可溶胀聚合物；以及
(d)将所述样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中，在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时，所述缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂，约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂，和约0.05M至约1.0M的单价盐。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，通过使所述可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起所述可溶胀聚合物溶胀而扩展所述可扩展样本。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，将所述样品在包括8U/ml蛋白酶K，50mM三羟甲基氨基甲烷，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的缓冲液中温育。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，在所述处理步骤(a)之前，对所述样品进行抗原修复。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述双官能交联剂是6-((丙烯酰基)氨基)己酸(AcX)的琥珀酰亚胺酯。
19.一种用于扩展可溶胀材料包埋的生物样本的方法，包括：
(a)将所述样本与约1至约100U/ml的非特异性蛋白酶在具有约4至约12之间的pH的缓冲液中，在约50℃至约70℃下温育约0.5至约3小时，所述缓冲液包括约5mM至约100mM的金属离子螯合剂，约0.1％至约1.0％的非离子表面活性剂，和约0.05M至约1.0M的单价盐；以及
(b)使所述可溶胀聚合物与溶剂或液体接触以引起所述可溶胀聚合物溶胀。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，将所述样本在包括8U/ml蛋白酶K，50mM三羟甲基氨基甲烷，25mM EDTA，0.25％曲拉通X-100和0.4M NaCl的缓冲液中温育。
21.一种用于制备可扩展生物样本的方法，包括以下步骤
(a)使所述样品与将与所述样品内的生物分子结合的大分子接触；
(b)用双官能交联剂处理所述样本；
(c)用可溶胀聚合物的前体渗透所述样本；
(d)聚合所述前体以在所述样本内形成可溶胀聚合物；
(e)将所述生物分子锚定到所述可溶胀聚合物上；以及
(f)在包括金属离子螯合剂，非离子表面活性剂和单价盐的缓冲液中将所述样品与非特异性蛋白酶一起温育。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662299754P | 2016-02-25 | 2016-02-25 | |
| US62/299,754 | 2016-02-25 | ||
| PCT/US2017/019372 WO2017147435A1 (en) | 2016-02-25 | 2017-02-24 | Methods for expanding clinical tissue specimens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109072285A true CN109072285A (zh) | 2018-12-21 |
Family
ID=58267171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780022105.9A Pending CN109072285A (zh) | 2016-02-25 | 2017-02-24 | 扩展临床组织样本的方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20190064037A1 (zh) |
| EP (1) | EP3420103A1 (zh) |
| JP (1) | JP6909227B2 (zh) |
| CN (1) | CN109072285A (zh) |
| CA (1) | CA3015363A1 (zh) |
| WO (1) | WO2017147435A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023025318A1 (en) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | Westlake University | Methods and formulations for expansion proteomic analysis of biological samples |
| WO2023039702A1 (en) * | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Shenzhen Xpectvision Technology Co., Ltd. | X-ray imaging in expansion microscopy |
| CN117893612A (zh) * | 2024-03-15 | 2024-04-16 | 葫芦岛天力工业有限公司 | 一种用于中厚板吊具夹取过程的视觉定位方法 |
| CN117893612B (zh) * | 2024-03-15 | 2024-05-24 | 葫芦岛天力工业有限公司 | 一种用于中厚板吊具夹取过程的视觉定位方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11408890B2 (en) | 2015-04-14 | 2022-08-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Iterative expansion microscopy |
| WO2018157048A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy |
| US11180804B2 (en) | 2017-07-25 | 2021-11-23 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ ATAC sequencing |
| US10221444B1 (en) * | 2017-11-05 | 2019-03-05 | URIT Medical Electronic Co., Ltd. | Methods and systems for production of DNA libraries directly from FFPE tissue |
| US11873374B2 (en) | 2018-02-06 | 2024-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof |
| KR102368585B1 (ko) * | 2018-09-28 | 2022-03-03 | 서울대학교산학협력단 | 온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징 |
| WO2020172247A1 (en) * | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Iterative direct expansion microscopy |
| US11802822B2 (en) | 2019-12-05 | 2023-10-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed expansion (MultiExM) pathology |
| WO2021183956A1 (en) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | Yale University | Methods and systems for physical expansion and imaging of biological samples |
| CN111593047B (zh) * | 2020-06-24 | 2021-08-20 | 申翌生物科技(杭州)有限公司 | 适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法 |
| US11333588B1 (en) * | 2020-12-07 | 2022-05-17 | Nebulum Technologies Co., Ltd. | Matrix-assisted methods and compositions to prepare biological samples for super-resolution imaging |
| WO2022262311A1 (en) * | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Westlake University | Methods for physical expansion of samples and uses thereof |
| CN113804667A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 上海交通大学 | 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 |
| KR20240042887A (ko) * | 2022-09-26 | 2024-04-02 | 연세대학교 산학협력단 | 고배율의 세포 확대 분석을 위한 세포 필름, 이의 제조용 조성물 및 제조 방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102435728A (zh) * | 2011-09-07 | 2012-05-02 | 福州大学 | 一种用于免疫组化过程质量检控的阳性参照物的制备方法 |
| WO2015127183A2 (en) * | 2014-02-21 | 2015-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Expansion microscopy |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006130632A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Invitrogen Corporation | Separation and purification of nucleic acid from paraffin-containing samples |
| EP3332258B1 (en) | 2015-08-07 | 2020-01-01 | Massachusetts Institute of Technology | Protein retention expansion microscopy |
-
2017
- 2017-02-24 CN CN201780022105.9A patent/CN109072285A/zh active Pending
- 2017-02-24 CA CA3015363A patent/CA3015363A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-24 JP JP2018544314A patent/JP6909227B2/ja active Active
- 2017-02-24 WO PCT/US2017/019372 patent/WO2017147435A1/en active Application Filing
- 2017-02-24 EP EP17710640.8A patent/EP3420103A1/en active Pending
- 2017-02-24 US US16/080,127 patent/US20190064037A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102435728A (zh) * | 2011-09-07 | 2012-05-02 | 福州大学 | 一种用于免疫组化过程质量检控的阳性参照物的制备方法 |
| WO2015127183A2 (en) * | 2014-02-21 | 2015-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Expansion microscopy |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FEI CHEN等: "Expansion microscopy", 《SCIENCE》 * |
| PAUL W TILLBERG等: "Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies", 《NAT BIOTECHNOL》 * |
| RITA STRACK等: "Bigger is better for super-resolution", 《NAT METHODS》 * |
| 段翠密等: "抗原修复在陈旧石蜡切片乳腺珠蛋白免疫组化检测中的应用", 《军事医学》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023025318A1 (en) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | Westlake University | Methods and formulations for expansion proteomic analysis of biological samples |
| WO2023039702A1 (en) * | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Shenzhen Xpectvision Technology Co., Ltd. | X-ray imaging in expansion microscopy |
| CN117893612A (zh) * | 2024-03-15 | 2024-04-16 | 葫芦岛天力工业有限公司 | 一种用于中厚板吊具夹取过程的视觉定位方法 |
| CN117893612B (zh) * | 2024-03-15 | 2024-05-24 | 葫芦岛天力工业有限公司 | 一种用于中厚板吊具夹取过程的视觉定位方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3420103A1 (en) | 2019-01-02 |
| CA3015363A1 (en) | 2017-08-31 |
| JP2019511914A (ja) | 2019-05-09 |
| US20190064037A1 (en) | 2019-02-28 |
| JP6909227B2 (ja) | 2021-07-28 |
| WO2017147435A1 (en) | 2017-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109072285A (zh) | 扩展临床组织样本的方法 | |
| US20200041514A1 (en) | Methods for Diagnosing Neoplastic Lesions | |
| Zhao et al. | Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy | |
| CN104350372B (zh) | 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 | |
| US11802872B2 (en) | Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy | |
| US20200271556A1 (en) | Iterative direct expansion microscopy | |
| CN111699510A (zh) | 数字病理学图像的变换 | |
| US20210196856A1 (en) | Dimethylacrylamide (DMAA) Hydrogel for Expansion Microscopy (ExM) | |
| US20210130882A1 (en) | Membrane Probes for Expansion Microscopy | |
| TW202102832A (zh) | 分析組織標本的方法 | |
| CN110139922A (zh) | 用于清除组织的组合物和方法 | |
| He et al. | Toward surface quantification of liver fibrosis progression | |
| US20210190652A1 (en) | Multiplexed Expansion (MultiExM) Pathology | |
| Liu et al. | High-resolution microscopy for imaging cancer pathobiology | |
| US10641782B2 (en) | Methods for visualization and quantification of fiber-like structures | |
| WO2022015728A1 (en) | Cellular diagnostic and analysis methods | |
| Michalska et al. | Uncovering brain tissue architecture across scales with super-resolution light microscopy | |
| Reijntjes et al. | Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis | |
| KR102223490B1 (ko) | 조직 투명화를 이용한 암 조직에서의 신생혈관 형성 평가 방법 | |
| Susaki et al. | Challenges and opportunities in hydrophilic tissue clearing methods | |
| Lin et al. | Large tissue archiving solution for multiplexed labeling and super-resolution imaging | |
| Khang et al. | Automated Prediction of Fibroblast Phenotypes Using Mathematical Descriptors of Cellular Features | |
| Karz et al. | MetFinder: a neural network-based tool for automated quantitation of metastatic burden in histological sections from animal models | |
| Xu | Computer-aided-diagnosis of liver fibrosis using non-linear optics microscopy | |
| Bhattacharjee et al. | Using Microscopy to Unravel the Hallmarks of Cancer Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20181221 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |