WO2023284820A1 - 一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用 - Google Patents

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  • the tumor includes at least one of human brain glioma, breast cancer, pancreatic cancer, and melanoma.
  • Fig. 3 is a multiphoton laser scanning microscope observation diagram of human glioma sample tissue transparent and immunofluorescent labeling
  • the source of human glioma tissue samples The samples were obtained from the clinical biobank of Zhujiang Hospital, Southern Medical University. Three samples of human glioma surgical resection were randomly selected, including 2 males and 1 female, aged from 2 to 47 years old. The above samples were all from glioma patients who did not receive drug treatment or chemoradiotherapy. The tumor was removed during surgery, and the specimen was immediately rinsed with sterile saline, and the solid part of the tumor was selected and placed in a sterile sealed bottle, and fixed in 10% neutral formalin solution for preservation. All the above operations require aseptic technique. The samples were diagnosed by clinical pathologists and graded according to WHO classification (2 cases of WHO grade II: #1, #3, 1 case of WHO grade IV: #2).
  • Observation under a microscope Take a cell culture dish with a diameter of 60mm, place the stained tissue section sample flatly into the dish, add a few milliliters of OPTIClear solution so that it can immerse the front end of the objective lens, and place it in a multiphoton laser scanning microscope (Olympus Under FVMPE-RS, Japan), select the excitation wavelength 750nm (DAPI), 980nm (Alexa Fluor Plus 594) to observe the tissue, the objective lens used is x10 objective lens (XLPLN10XSVMP, 10X/0.6NA);
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Abstract

一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用，将组织透明方法和传统组织学方法联合使用可以打破对样本厚度的限制，选用厚度为500μm的组织，利用组织透明方法达到光学透明，同时联合传统组织学方法标记肿瘤组织内部的细菌，从而避开薄切片表面潜在的污染，并且可以完整构建大尺寸组织样本的高分辨率的、整体的三维图像，从而实现肿瘤内细菌的三维可视化，得到更准确的实验结果。

Description

一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用 技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其是涉及一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用。
背景技术
近年来，有越来越多的研究表明，微生物与肿瘤的关系远比人们预想的要大。随着微生物组表征工具的进步，人体微生态系统对肿瘤的发生发展、免疫反应、治疗效果及预后的影响逐渐引起了广泛的关注。感染相关癌症及瘤内微生物的存在也已在多种肿瘤类型中得到确认，后者被认为可能通过直接诱发癌变、调节致癌分子通路或调节宿主免疫系统等机制促进肿瘤的发生发展。
而近年来，对肿瘤内是否存在细菌、细菌是否会偏好某种瘤内微环境以及细菌丰度是否与其作用无关等等问题引发了强烈的讨论。“The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria”报道了Nejman等人采取多种方法对乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌和脑胶质瘤等七种实体肿瘤进行全面的细菌检测。他们发现在所有肿瘤类型中均可检测到细菌的LPS和16s rRNA，且细菌的丰度与类型存在明显的瘤种间差异。但这篇研究主要是基于石蜡切片这种薄切片做的免疫组化染色和荧光原位杂交以及测序等方法来检测细菌，这种方法体系都难以避免在样本处理过程中可能引入的污染问题，同时这些方法的破坏性加工可能导致对细菌数量和位置的误读。因此目前急需一套更完善的方法体系来提供更加明确的肿瘤内存在微生物的证据，并表征肿瘤微生物组的分布与功能。
目前，对厚的肿瘤组织样本进行微生物检测并三维重建，才能提供更有力、更直观的证据，从而更好地理解肿瘤微环境中微生物群体与肿瘤细胞的直接交互作用。而组织透明技术可以打破组织切片技术对样本厚度的限制(数微米)，并可避开薄切片表面潜在的污染，有助于在完整组织中以单细胞分辨率实现微生物群体的三维可视化。因此，将组织透明技术应用于微生物的检测是一次全新 的尝试，并有望提供高通量的、无污染的、无偏倚的肿瘤微生物检测方法。
组织透明技术是一种应用水溶性有机溶剂或者亲水性试剂，对固定组织通过浸泡、电泳或灌注等方式进行透化处理，然后应用高折射率介质匹配组织折射率，降低光散射，使组织达到光学透明，进而增加成像深度和图像对比度的技术。在保持组织结构完整前提下，组织透明技术能实现细胞水平的三维成像，避免了空间结构信息的丢失，因此组织透明技术是打开光学显微镜潜能的关键技术，也是绘制全器官或全身细胞图谱的最佳选择方案之一。因此，组织透明技术结合显微成像技术，极大推动了体积成像(全身或全器官成像)的进程，有助于加强对完整生物系统的综合理解，为生物医学研究领域提供了强有利的工具。
近年来，组织透明技术发展迅速，多种新型透明技术不断涌现，包括DISCO、Murray、uDISCO、Scale、SeeDB、CLARITY、CUBIC、iDISCO、FRUIT、TDE、PEGASOS、OPTIClear等，不同的透明技术具有特定的组织适用性。专门为人类组织研发的透明技术OPTIClear，能有效透明新鲜和甲醛固定石蜡包埋的人类脑组织(5mm厚)，对超微结构保存良好，并且与多种荧光染料和亲脂性染料兼容，结合亲脂性染料示踪，OPTIClear可对人类脑组织神经元投射和树突棘结构进行高分辨率三维成像。
Accu-OPTIClear技术是使组织达到光学透明，进而增加成像深度和图像对比度，然而对细菌的标记还是有赖于免疫荧光(Immunofluorescence，IF)、免疫荧光(Immunofluorescence，IF)和原位荧光杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等传统组织学方法，但是传统组织学方法以及目前新兴的测序技术都难以避免在样本处理过程中可能引入的污染问题，同时这些方法的破坏性加工可能导致对细菌数量和位置的误读。并且，现有技术中还未有将组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用等相关研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用，本发明将组织透明方法和传统组织学方法联合使用可以打破对样本厚度的限制(数微米)，从而避开薄切片表面潜在的污染；并且可以完整构建大尺寸组织样本的高分辨率的、整体的三维图像，从而实现肿瘤内细菌的三维可视化，展现肿瘤微环境中细菌的全貌，为未 来研究宿主的肿瘤细胞与微生物的互作关系打下基础。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用。
与仅用传统组织学方法相比，本发明将组织透明方法和传统组织学方法联合的方法在检测肿瘤内细菌上可以得到更加可信的结果，采用联合方法制备的组织可用共聚焦显微镜进行三维重建，可直观的从三维角度展现细菌在肿瘤组织中的空间分布情况。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述组织透明方法包括疏水透明化方法或亲水透明化方法。更优选地，疏水透明化方法包括3DISCO、iDISCO、uDISCO、vDISCO等，不仅限于此；更优选地，亲水透明化方法包括Scale、SeeDB、CUBIC、CUBIC-X、Accu-OPTIClear等，不仅限于此。
本发明在OPTIClear的基础上，使用了Accu-OPTIClear透明化方法可以避免过度去脂化，并能减少组织透明的时间，减少组织损伤和更好的保存抗原。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述组织学方法包括免疫荧光标记法、免疫酶标记法、荧光原位杂交标记法中的一种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，检测肿瘤内细菌过程中采用的组织切片的厚度为400～600μm。
目前细菌的组织学检测方法多为石蜡切片的免疫组织化学以及荧光原位杂交技术，但因石蜡切片多为薄切片(4-6μm)，难以避免处理过程中的表面污染问题。本发明选用厚组织(400～600μm)，利用组织透明方法达到光学透明，同时联合传统组织学方法(例如免疫荧光标记法)标记肿瘤组织内部的细菌，从而得到更准确的实验结果，为研究肿瘤微环境中微生物群体与肿瘤细胞的直接交互作用打下坚实的基础。
更优选地，所述组织切片的厚度为500μm。
当组织切片的厚度为500μm时，利用组织透明技术达到光学透明，同时联合免疫荧光法标记肿瘤组织内部的细菌，从而得到最准确的实验结果。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肿瘤包括人脑胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤中的至少一种。
第二方面，本发明提供了一种组织透明方法和免疫荧光标记法联合应用于 肿瘤内细菌的检测方法，其包括以下步骤：
1)获得厚度为400～600μm的组织切片，配制OPTIClear组织透明试剂，再将洗涤剂溶于OPTIClear组织透明试剂中，获得混合液，将组织切片浸泡于混合液中，组织切片与混合液的体积比大于1:3，然后加入自发荧光淬灭剂，再用PBS溶液洗涤浸泡后的组织切片，再加入封闭剂孵育过夜；
2)将步骤1)处理后的组织切片置于孔板中，加入一抗稀释液孵育，孵育后的组织切片用缓冲液洗涤，再加入二抗稀释液孵育；
3)在加入二抗稀释液孵育的同时，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，然后用步骤2)相同的缓冲液洗涤组织切片；
4)将步骤3)处理的组织切片用PBS溶液洗涤，再加入OPTIClear组织透明试剂，避光孵育，最后镜下观察和三维图像重建。
更优选地，步骤1)中的洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，提高组织透明度和脱色的程度，其洗涤液还可以为其他种类。
将组织切片浸泡于混合液(组织切片与混合液的体积比大于1:3)中，可实现组织切片的光学透明；加入封闭剂封闭，使得封闭剂预先和组织切片中有交叉反应的位点发生结合，减少假阳性的出现；体系中加入自发荧光淬灭剂，可以排除组织中的自发性荧光物质的干扰。
步骤3)中，体系中加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)可以标记细胞核，使得得以观察细菌与细胞的相对位置。步骤4)中，再加入OPTIClear组织透明试剂，使得组织切片达到光学透明，易于在荧光显微镜下观察。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，步骤2)中一抗、二抗分别和稀释液的比例均为1:100，组织切片和稀释液的体积比为1:2-1:3，能浸泡到组织即可。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，步骤2)中的一抗为单克隆小鼠的脂多糖抗体，二抗为Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG抗体。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，步骤2)中加入一抗、二抗孵育至少2天。
在本发明的技术方案中，一抗为单克隆小鼠的脂多糖抗体可以特异性的结合革兰氏阴性细菌的LPS，从而识别并标记细菌；Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG抗体与一抗结合，使得被一抗标记的细菌带上荧光。
实验初期，本发明人将组织透明方法与传统组织学方法结合在一起仍然存在一些障碍，主要表现为免疫荧光标记时的抗体渗透性，由于抗体和荧光基团分子量较大，在组织中的渗透速度缓慢，因此需要较长的孵育时间。因此，本发明人通过不断地进行实验，为了在较短的孵育时间内有较好的免疫染色质量，最终选择厚度为400～600μm的组织切片进行实验。另外，除了用厚的组织切片进行组织透明处理来观察组织深部的细菌，以便排除薄切片的表面潜在污染；此外利用荧光标记方法进行微生物检测还需要排除组织中的自发性荧光物质干扰，后者为脂褐素、线粒体和溶酶体等亚细胞结构在吸收光后自然发出的光，其形态与大小与细菌难以简单区分。本发明人采用了化学试剂淬灭的方法尽量排除其干扰，进而增加了实验结果的准确性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)与仅用传统组织学方法相比，本发明将组织透明方法和传统组织学方法联合的方法可以打破对组织样本厚度的限制(数微米)，从而避开薄切片表面潜在的污染，得到更加可信的结果；
2)本发明将组织透明方法和传统组织学方法联合的方法体系所制备的组织可用共聚焦显微镜或多光子激光扫描显微镜进行三维重建，可直观的从三维角度展现细菌在肿瘤组织中的空间分布情况；
3)本发明的联合方法中采用了化学试剂淬灭的方法尽量排除组织中的自发性荧光物质的干扰从而减少假阳性的结果，增加实验的准确性。
附图说明
图1为三种不同类型组织样本采用本发明检测方法透明前后的对比图；
图2为EGFP Tg/+小鼠脑组织切片的激光扫描共聚焦显微镜图(图2A为EGFP Tg/+小鼠脑组织切片的平面全景扫描图；图2B为EGFPTg/+小鼠的神经元突起与连接图；图2C为三维重建的EGFP Tg/+小鼠神经元连接图)；
图3为人脑胶质瘤样本组织透明与免疫荧光标记联合处理后的多光子激光扫描显微镜观察图；
图4为人脑胶质瘤样本组织透明与免疫荧光标记联合处理后的多光子激光扫描后三维重建图；
图5为小鼠肠道组织组织透明与免疫荧光标记联合处理后的共聚焦显微镜 观察图；
图6为人脑胶质瘤样本、C57BL/6小鼠脑组织及小肠组织样本石蜡切片免疫组化染色标记图；
图7为人脑胶质瘤样本、C57BL/6小鼠脑组织及小肠组织样本石蜡切片免疫荧光染色标记图；
图8为人脑胶质瘤样本、C57BL/6小鼠脑组织及小肠组织样本石蜡切片原位荧光杂交标记图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料预处理：
实验组：人脑胶质瘤组织(GBM)3例；
对照组：阳性对照组小鼠肠道组织1例+阴性对照组小鼠脑组织2例。
实验动物来源：2只C57BL/6小鼠(5-6周龄，18-22g，雄性)、1只EGFPTg/+小鼠(3月龄，雄性)来源于南方医科大学珠江医院实验动物中心(许可证号：SYXK(粤)2019-0215)，饲养于恒温、恒湿、且无特定病原体(SPF)动物房中，所使用的鼠笼、垫料、饲料等均经过高压蒸汽灭菌消毒处理并定期更换。本发明中的所有动物在体实验均严格遵守实验动物福利伦理原则进行。
小鼠肠道组织和脑组织取材及前处理：EGFP Tg/+小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(120mg/kg)并实施安乐死，经血管灌注0.9％生理盐水，然后使用4％(w/v)的多聚甲醛(PFA)灌注固定。立即进行解剖并采集大脑，用4％PFA在4℃下固定约1年。断颈处死1只C57BL/6小鼠后立即进行解剖并采集大脑，用4％PFA在4℃下固定约2-3周。第二只C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(120mg/kg)实施麻醉，以10ml/min的冷PBS(pH7.4)进行心脏灌注，再用10ml/min的4％PFA进行灌注。全肠解剖后，用4％PFA将肠内容物冲洗干净，并于4℃下不摇匀固定2天。组织透明化处理前，用3×30ml PBS/0.01％(w/v)在4℃下轻轻洗涤过夜，去除多聚甲醛残留。
人脑胶质瘤组织样本的来源：样本来源于南方医科大学珠江医院临床生物样本库。随机选择3例人脑胶质瘤手术切除样本，其中男性2例，女1例，年龄介于2岁至47岁。上述样本均来自未接受药物治疗或放化疗的胶质瘤患者。肿瘤于外科手术中切除，立即用无菌生理盐水漂洗标本并选取肿瘤实体部分放置在无菌密封瓶内，放入10％中性福尔马林溶液中固定保存。上述操作均需无菌操作。样本经临床病理医生确诊并根据WHO分类进行分级(WHOⅡ级2例：#1、#3，WHOⅣ级1例：#2)。此项目已南方医科大学珠江医院医学伦理委员会审查和批准(伦理号2018-SJWK-004，2020-YBK-001-02，),并经患者知情同意。且南方医科大学珠江医院临床生物样本库已通过中国人类遗传资源办公室的保藏审批(批件号[2017]2042号、[2020]BC0019号)。
人脑胶质瘤组织的前处理：在人脑胶质瘤样本中随机选取多个远离肿瘤边缘的部位，可用活检打孔器(Integra Miltex，4mm)打孔取样，使用振动切片机(DOSAKA，DTK-2ER01N)或普通刀片将取样部位切割至厚度为500μm的人脑胶质瘤组织切片。
实施例1
一种组织透明方法和免疫荧光标记法联合应用于脑胶质瘤内细菌的检测方法，其包括以下步骤：
1)配制OPTIClear组织透明试剂(将20％(w/v)N-甲基葡萄糖胺(Sigma-Aldrich#66930)、32％(w/v)异己醇(Sigma-Aldrich#D2158)和25％-硫二乙醇(TDE)(Sigma-Aldrich#88559)溶液混合，用浓盐酸调整溶液的pH为7)，再将十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤剂溶于OPTIClear组织透明试剂中，获得浓度为4％的SDS-OPTIClear混合液(SDS：OPTIClear＝4：100)；
2)将上述获得的脑胶质瘤组织切片移入无菌EP管中，加入SDS-OPTIClear混合液，使得脑胶质瘤组织切片浸泡于SDS-OPTIClear混合液中，组织切片与SDS-OPTIClear混合液的体积比为1:3，在37℃孵育1-3天，然后在室温下滴加适量的苏丹黑溶液，避光振荡2h，再用PBS溶液洗涤浸泡后的组织切片3×10分钟，后于37℃下在BSA封闭剂中孵育过夜，再去除BSA封闭剂并用PBS溶液清洗组织；
3)将步骤2)处理后的组织切片置于24孔板中，加入单克隆小鼠的脂多糖 抗体(一抗)稀释液孵育，一抗与稀释液配比为1：100，组织切片和单克隆小鼠的脂多糖抗体稀释液的体积比为1：2，在37℃下孵育2天；脂多糖抗体稀释液孵育后的组织切片用0.2％PBS-Tween在摇床上洗涤6×30分钟，留最后一次洗涤液37℃过夜；
4)将步骤3)处理后的组织切片置于48孔板中，加入Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG(二抗)，二抗与稀释液配比为1：100，组织切片与Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG抗体稀释液的体积比为1：2，同时加入1μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，避光于37℃下孵育1天，用0.2％PBST溶液清洗组织6×30分钟；
5)用Kimwipes纸轻轻吸去步骤4)处理后的组织切片周围的溶液，将组织切片置于无菌EP管中，加入至少3倍体积的OPTIClear溶液使其完全浸没，避光在37℃下孵育约15小时；
6)镜下观察：取60mm直径的细胞培养皿，将染色好的组织切片样品平放入皿中，加入数毫升OPTIClear溶液，使其能浸没物镜镜头前端，置于多光子激光扫描显微镜(Olympus FVMPE-RS，日本)下，选择激发波长750nm(DAPI)，980nm(Alexa Fluor Plus 594)对组织进行观察，使用的物镜为x10物镜(XLPLN10XSVMP,10X/0.6NA)；
7)图像获取与三维重建：对于胶质瘤样本，在10倍物镜下对远离样品边缘的区域进行观察和拍摄，在Z-stack菜单下选择Begin\End设置起止点模式，在图像预览时浏览组织全层确定起止点。设置1μm的光切间隔，选择中层100μm的区域，并zoom再放大两倍后以1024x1024的分辨率进行逐层扫描成像；将获取的图像堆栈在iMaris软件中进行三维重建；
所有操作在生物安全柜中进行，试剂及耗材进行过滤灭菌及高温消毒。转移、清洗组织样本时需轻柔，避免损坏组织。
其中样本为3例人脑胶质瘤组织时，采用上述检测方法为实验组；样本为1例阳性对照组小鼠肠道和2例阴性对照组小鼠脑组织时，采用上述检测方法为对照组。
实验结果为：参照图1，将厚度1-2mm的EGFP Tg/+小鼠脑组织和C57BL/6小鼠脑组织切片进行经上述方法处理，肉眼可观察到组织透光度大大提高，形态改变较小。人脑胶质瘤切片(厚度500μm、1mm、2mm)在相同处理后透光度改 善较前二者小，且厚度越小透光度越好，选择500μm作为人脑胶质瘤样本的取样及处理厚度。透明化后的EGFP Tg/+小鼠脑组织切片可在共聚焦显微镜下观察到神经元的基本形态与突起并重建其3D结构(参考图2)。
三例人脑胶质瘤样本(厚度500μm)经过抗脂多糖(LPS)抗体免疫荧光染色及DAPI复染后，进行组织透明化及自发荧光淬灭处理，随后在多光子激光扫描显微镜下进行观察(10倍镜)，处理全程谨慎控制污染。
参考图3，在人脑胶质瘤样本组织内部不同层面可观察到细菌LPS的特异性红色信号(箭头所指)，样本表面密度较高而内部密度较低，结果提示阳性信号直径约为0.7-2.0μm，可呈梭形、圆形等，在细胞核旁及细胞间隙中分布。
参考图4，为排除样本表面潜在的细菌污染，取组织深部100μm进行重建并分析，可直观地看到细菌LPS特异性信号在人脑胶质瘤样本的空间分布，正如平面扫描中观察到的，LPS信号大多呈孤立点散在分布，形态不规则。
参考图5(图5(A)和图5(B)为透明化前后的小肠组织；图5(C)箭头所指为小鼠肠道样本中标记的细菌)，在显微镜下可观察到小鼠肠绒毛间隙中存在LPS和LTA的特异性信号，验证了所选用细菌LPS抗体的有效性。然而小鼠肠道细菌的免疫荧光形态与人脑胶质瘤内存在明显差异，与前者呈现的革兰氏阴性菌的典型特征与完整轮廓不同，后者常常散在分布，形态不规则，可为梭形、圆形。这可能是由于组织固定和透化过程中细菌形态的改变与破坏导致的染色偏差。同时有研究指出在肿瘤内，细菌往往为细胞壁缺陷状态或L型细菌，检测到的LPS可能为被吞噬的细菌碎片。
实施例2
一种免疫组织化学方法(IHC)应用于人脑胶质瘤内细菌的检测方法，其包括以下步骤：
(1)石蜡切片的制备：固定后的人脑胶质瘤样本经脱水、石蜡包埋(脱水：樱花，VIPJ-JR；包埋：樱花，TEC-5)后获得4μm厚度的连续切片(Leica，RM2245)；
(2)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15min、二甲苯II 15min、二甲苯III 15min、无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、85％酒精5min和75％酒精5min，然后蒸馏水洗；
(3)抗原修复：将组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的 修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min，保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；自然冷却后将玻片置于PBS溶液(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(4)阻断内源性过氧化物酶：组织切片放入浓度为3％的双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS溶液(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(5)封闭：在组化圈内滴加3％BSA溶液(封闭液)均匀覆盖组织，室温封闭30min，使得封闭液预先和组织中有交叉反应的位点发生结合，减少假阳性的出现；
(6)一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，在组织切片上滴加1：1000单克隆小鼠LPS(Lipopolysaccharide)抗体(HycultBiotech,WN1 222-5)和1:1000的单克隆小鼠LTA(Lipoteichoic acid)抗体(GeneTex，GTX16470)的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)；
(7)二抗孵育：将一抗孵育后的组织切片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；切片稍甩干后在圈内滴加HRP标记的驴抗小鼠IgG抗体覆盖组织，室温孵育50min；
(8)DAB显色：将二抗孵育后的组织切片置于PBS溶液(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；
(9)复染细胞核：使用苏木素复染步骤(8)的组织切片3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗；
(10)脱水封片：将组织切片依次放入75％酒精5min、85％酒精5min、无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、正丁醇5min、二甲苯I 5min中脱水透明，将组织切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
实施例3
一种免疫荧光方法(IF)应用于人脑胶质瘤内细菌的检测方法，其包括以下步骤：
(1)组织切片制备：固定后的人脑胶质瘤样本经脱水、石蜡包埋(脱水：樱花，VIPJ-JR；包埋：樱花，TEC-5)后获得4μm厚度的连续切片(Leica，RM2245)， 即石蜡切片；
(2)石蜡切片脱蜡水化：依次将切片放入二甲苯I 10min、二甲苯II 10min、二甲苯III 10min、无水乙醇5min、95％酒精5min、85％酒精5min和75％酒精5min，然后蒸馏水洗3次，每次5min；
(3)抗原修复：将组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火5min至沸，停火5min，保温再转中低火5min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；自然冷却后将玻片置于PBS溶液(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(4)自发荧光淬灭：滴加组织自发荧光淬灭剂A液(Servicebio,G1221)，室温孵育30min，纯水洗5min；
(5)封闭：后将组织切片使用3％BSA(Biofroxx,4240GR025)封闭2h，然后倾去血清；
(6)一抗孵育：用1：1000单克隆小鼠LPS(Lipopolysaccharide)抗体(HycultBiotech,WN1 222-5)在4℃条件下孵育12-18h，室温下复温30min；
(7)二抗孵育：用1:1000 Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG抗体(Invitrogen，AB_2762826)在37℃条件下进行恒温孵育；
(8)自发荧光淬灭：用PBS溶液洗涤3次，每次3min，向组织切片滴加组织自发荧光淬灭剂B液(Servicebio,G1221)置于室温下5min，流水冲洗3min；
(9)复染，封片：最后用DAPI(ABCAM,ab104139)复染细胞核，指甲油封片，15min后镜检。
实施例4
一种荧光原位杂交方法(FISH)应用于人脑胶质瘤内细菌的检测方法，使用直接荧光细菌原位杂交检测试剂盒(EUB338探针)进行检测，其包括以下步骤：
(1)石蜡切片脱蜡水化：将石蜡切片放于72℃烤片2小时，经二甲苯脱蜡，无水乙醇、85％乙醇、70％乙醇依次水化5min；浸入PBS溶液，5min/次，2次；
(2)暴露核酸：将0.2mol/LHCL滴加在组织切片上，室温静置20min；吸去HCL，滴加TritonX-100，室温静置15min；吸去TritonX-100，在PBS溶液中浸泡5min；滴加5mmol/L蛋白酶K，室温静置20min，然后在PBS溶液中浸 泡5min；
(3)封闭：在组织切片上滴加约200μl Blocking Buffer，置于湿盒中，于恒温箱55℃封闭2小时；
(4)探针准备：封闭快结束时，将探针与25％Hybridization Buffer按1:100稀释，混合均匀后，88℃变性3min，37℃平衡5min；
(5)杂交：封闭结束后，吸去Blocking Buffer，滴加15～30μl平衡后的探针，盖上盖玻片，用Rubber Cement封片，37℃杂交48小时；
(6)洗涤与脱水：Washing Buffer(10×)与蒸馏水按1：9混合均匀，配成工作液，揭去Rubber Cement，将玻片放入Washing Buffer Ⅰ工作液，5min后，盖玻片会自动脱落，再将玻片移至新的Washing Buffer Ⅰ工作液(预热至60℃)，洗涤2min，再移到室温的Washing Buffer Ⅱ工作液，洗涤15min；将标本依次浸入70％、85％、100％乙醇中个脱水2min，室温干燥；
(7)封片：滴加20μl DAPI Anti-fade solution，盖上盖玻片后用指甲油封片，在暗处静置15min后，共聚焦显微镜下观察。
实施例2-4中的石蜡切片均采用上述的人脑胶质瘤样本石蜡切片。
结果显示：参照图6(图6(A)和图6(B)分别对人脑胶质瘤连续切片进行细菌LPS和LTA免疫组化染色；图6(C)和图6(D)分别对C57BL/6小鼠脑组织连续切片进行细菌LPS和LTA免疫组化染色(阴性对照)；图6(E)和图6(F)分别对C57BL/6小鼠小肠组织连续切片进行细菌LPS和LTA免疫组化染色(阳性对照))，实施例2(IHC)提示细菌LPS阳性信号在3例脑胶质瘤样本中均被检出，并呈现相似空间分布情；而细菌LTA并未被检出，这与先前报道一致，且在阴性对照样本中未观察到LPS及LTA阳性信号，在阳性对照样本中观察到LPS和LTA阳性信号均被检出。
参照图7(图7(A)、图7(B)和图7(C)分别对人脑胶质瘤、C57BL/6小鼠脑组织(阴性对照)、小肠组织(阳性对照)连续切片进行细菌LPS免疫荧光染色)，实施例3(IF)与实施例1用的是同一种抗体，在薄的石蜡切片上同样能观察到3例胶质瘤样本中均存在LPS，在肿瘤组织中常定位于细胞内，而阴性对照样本中未观察到LPS阳性信号，在阳性对照样本中观察到同样的LPS阳性信号，这从侧面验证了抗体的有效性及特异性，也为胶质瘤内存在革兰氏阴性菌这一实验结果增添了新的证据。
参照图8(图8(A)和图8(B)分别对人脑胶质瘤连续切片进行细菌16s rRNA标记，左边为阳性探针结果，右侧为阴性探针结果；图8(C)和图8(D)分别对C57BL/6小鼠脑组织连续切片进行细菌16s rRNA标记，左边为阳性探针结果，右侧为阴性探针结果(阴性对照)；图8(E)和图8(F)分别对C57BL/6小鼠小肠组织连续切片进行细菌16s rRNA标记，左边为阳性探针结果，右侧为阴性探针结果(阳性对照))，实施例4(FISH)提示在人脑胶质瘤样本中细菌16s rRNA可被检出，并分布在细胞核旁，而在阴性对照样本中未观察到细菌16s rRNA阳性信号，在阳性对照样本中观察到同样的16s rRNA阳性信号。
综上所述，与仅用传统组织学方法相比，本发明将组织透明方法和传统组织学方法联合的方法可以打破对组织样本厚度的限制(数微米)，从而避开薄切片表面潜在的污染，得到更加可信的结果；本发明联合的方法中采用了化学试剂淬灭的方法尽量排除组织中的自发性荧光物质的干扰，减少假阳性，进一步增强实验的准确性。所制备的组织可用激光扫描显微镜和多光子激光扫描显微镜成像，并进行三维重建与分析，可直观的从三维角度展现细菌在肿瘤组织中的空间分布情况，展现肿瘤微环境中细菌的全貌，为未来研究宿主的肿瘤细胞与微生物的互作关系打下基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

  1. 一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用。
  2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组织透明方法包括疏水透明化方法或亲水透明化方法。
  3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组织学方法包括免疫荧光标记法、免疫酶标记法、荧光原位杂交标记法中的一种。
  4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，检测肿瘤内细菌过程中采用的组织切片的厚度为400～600μm。
  5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述组织切片的厚度为500μm。
  6. 如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括人脑胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤中的至少一种。
  7. 一种组织透明方法和免疫荧光标记法联合应用于肿瘤内细菌的检测方法，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
    1)获得厚度为400～600μm的组织切片，配制OPTIClear组织透明试剂，再将洗涤剂溶于OPTIClear组织透明试剂中，获得混合液，将组织切片浸泡于混合液中，组织切片与混合液的体积比大于1:3，然后加入自发荧光淬灭剂，再用PBS溶液洗涤浸泡后的组织切片，再加入封闭剂孵育过夜；
    2)将步骤1)处理后的组织切片置于孔板中，加入一抗稀释液孵育，孵育后的组织切片用缓冲液洗涤，再加入二抗稀释液孵育；
    3)在加入二抗稀释液孵育的同时，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核，然后用步骤2)相同的缓冲液洗涤组织切片；
    4)将步骤3)处理的组织切片用PBS溶液洗涤，再加入OPTIClear组织透明试剂，避光孵育，最后镜下观察和三维图像重建。
  8. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中一抗、二抗分别和稀释液的比例均为1:100，组织切片和稀释液的体积比为1:2-1:3。
  9. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中的一抗为单克隆小鼠的脂多糖抗体，二抗为Alexa Fluor Plus 594耦联的驴抗小鼠IgG抗体。
  10. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中加入一抗、二抗孵育至少2天。
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