KR20060011817A - 세포 수준 검출 및 질병 상태의 식별 - Google Patents

세포 수준 검출 및 질병 상태의 식별 Download PDF

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KR20060011817A
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모노젠, 인크.
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Abstract

본 발명은 높은 감도 및 특이성으로 질병 상태를 검출 및 구별하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의해, 세포에 기초한 샘플이 비정상 세포를 함유하는지의 여부를 결정할 수 있으며, 특정 질병의 경우에는 존재하는 질병의 조직학적 유형을 결정할 수 있다. 본 방법에서는 세포에 기초한 샘플에서의 분자 마커의 발현 수준 및 발현 패턴에서의 변화를 검출한다. 패널 선택 및 유효화 절차도 제공한다.
Figure 112005013102219-PCT00059
Figure 112005013102219-PCT00060
Figure 112005013102219-PCT00061
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Figure 112005013102219-PCT00071

Description

세포 수준 검출 및 질병 상태의 식별{CELL-BASED DETECTION AND DIFFERENTIATION OF DISEASE STATES}
본 발명은 환자의 일반적인 질병 상태의 조기 검출에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정한 질병 상태를 초기 단계와 말기 단계로 식별(구별)하는 것에 관한 것이다.
관련 출원에 관한 전후 참조
본 출원은 2001년 3월 12일자로 출원된 미국 가 출원 제 60/274,638 호의 이점을 청구하는, 2002년 3월 12일자로 출원된 미국 출원 제 10/095,298 호의 일부 계속 출원으로, 이들 출원의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
특정한 질병 상태의 조기 검출은 상기 질병을 여전히 국소적으로 한정시키고 그의 병리 효과를 해부학적으로, 생리학적으로 및 임상적으로 제한시키면서 조기 진단 및 조기 치료를 허용함으로써 환자의 생존 기회를 크게 개선시킬 수 있다. 임의의 시험 또는 질병 검출 방법의 2 가지 중요한 평가 척도는 감도(감도 = 참 양성/(참 양성 + 거짓 음성)) 및 특이성(특이성 = 참 음성/(거짓 양성 + 참 음성))으 로, 이들은 상기 시험이 모든 병에 걸린 개인을 예외 없이, 표적 질병을 갖지 않는 개인을 거짓으로 포함하지 않고 얼마나 잘 정확하게 검출하는지를 측정한다. 역사적으로, 많은 진단 시험들이 불충분한 감도와 특이성으로 인해 비난받아왔다.
감도는 시험받는 개인에서 표적 질병을 정확하게 검출하는 시험 능력에 대한 척도이다. 불충분한 감도를 갖는 시험은 거짓 음성, 즉 질병이 있지만 상기 특정한 질병은 없는 것으로 거짓으로 확인된 개인의 비율을 높인다. 거짓 음성의 잠재적인 위험은 상기 병에 걸린 개인을 진단되지 않은 채로 두어 상당한 기간 동안 치료하지 않게 된다는 것이며, 이 기간 동안 상기 질병은 치료(존재하는 경우)가 덜 효과적일 수도 있는 말기로 진행할 수 있다. 이 결과 보다 건강이 나빠진 환자가 나타날 수 있다. 감도가 낮은 시험의 예로 HIV에 대한 단백질-수준 혈액 시험이 있다. 이러한 유형의 시험은 불충분한 감도를 나타내는데, 그 이유는 상기 시험은 질병이 잘 확립되어 바이러스가 혈류에 상당수 침입할 때까지 상기 바이러스의 존재를 검출하지 못하기 때문이다. 대조적으로, 감도가 높은 시험의 예는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 바이러스 부하 검출이다. 이러한 유형의 시험은 매우 작은 양의 바이러스를 검출할 수 있기 때문에 높은 감도가 달성된다(Lewis, D.R. et al. "분자 진단학: 오래된 약과 신약간의 게놈 브리지: 진단 기술과 서비스 산업에 관한 백서" Thomas Weisel Partner, June 13, 2001).
다른 한편으로, 특이성은 질병 상태가 없는 환자를 정확하게 확인하는 시험 능력의 척도이다. 특이성이 불충분한 시험은 거짓 양성, 즉 질병을 갖는 것으로 거짓으로 확인된 개인의 비율을 높인다. 거짓 양성의 결점은 상기가 환자에게, 부수적인 위험, 감정적 및 재정적 스트레스가 따르고 환자의 건강에 역효과를 미칠 수 있는 불필요한 의료 절차를 겪게 한다는 것이다. 특이성이 높은 진단 시험의 개발을 어렵게 만드는 질병의 특징은 질병 기전이 종종 다수의 유전자 및 단백질을 포함한다는 것이다. 또한, 특정 단백질이 질병 상태와 관련 없는 이유들로 인해 상승될 수도 있다. 높은 특이성을 갖는 시험의 예로, p53 돌연변이를 검출할 수 있는 유전자 수준 시험이 있다. p53 돌연변이는 암세포가 존재하지 않는 한 결코 검출되지 않을 것이다(Lewis, D.R. et al. "분자 진단학: 오래된 약과 신약간의 게놈 브리지: 진단 기술과 서비스 산업에 관한 백서" Thomas Weisel Partner, June 13, 2001).
세포 마커는 건강한 세포와 질병 세포를 특성화하거나 구별하는데 사용되고 이들 세포에서 발견될 수 있는 세포 내 천연 분자 구조물이다. 이들의 존재는 상기 마커와 결합하는, 인간에 의해 발명되고 개발된 탐침에 의해 검출될 수 있으며, 상기 탐침은 상기 마커를 가시화를 통해 검출하고/하거나 영상화 시스템을 사용하여 정량화할 수 있게 한다. 4 개의 세포 수준 마커 검출 기술 군으로 세포 병리학, 세포 측정, 세포 유전학 및 프로테오믹스가 있으며, 이들을 하기에 나타내고 기술한다.
세포 병리학은 염색된 완전 세포 집단 내의 세포 형태 변화에 대한 인간 전문가의 가시적인 평가에 따른다. 일례로 각각 세포 기술자 및 세포 병리학자에 의한 파파니콜로-염색된(즉 Pap 바른 표본) 경부-질 시편의 세포학적 선별 및 세포진단이 있다. 세포 유전학, 프로테오믹스 및 세포 측정과 달리, 세포 병리학은 정량적인 도구가 아니다. 임상적인 진단 세포학에서 상기는 최고의 기술 수준에 있지만, 이는 주관적이며 진단 결과가 종종, 특히 초기 암 상태(예를 들어 ASCUS, LSIL)에서 그다지 민감하지도 재현적이지도 않다.
형태학적 분석에 의존하는 시험은 광학 현미경 하에서 환자의 세포 샘플을 관찰하여 세포 및 핵 모양, 크기, 광학적 조직 또는 염색 양상을 확인함을 포함한다. 현미경을 통해 관찰 시, 정상적인 성숙한 상피 세포는 압축된 핵을 가지며, 크고 잘 분화되어 보인다. 그러나, 형성이상을 특징으로 하는 세포는 다양한 분화 단계에 있을 수 있고, 일부 세포는 매우 미성숙하다. 마지막으로, 침습성 암종을 특징으로 하는 세포는 종종 미분화된 것으로 보이며, 세포질이 매우 적고 핵이 상대적으로 크다.
형태학적 분석에 의존하는 진단 시험의 결점은 세포 형태가 느린 지표라는 것이다. 형태는 기능의 결과로서 발생하기 때문에, 종종 질병 상태는 상기 질병이 형태학적 분석에 의해 자명해지는 때에 이미 결정적이거나 진행된 단계로 진행되어 있다. 질병의 초기 단계는 분자 수준의 화학적 변화를 포함한다. 현미경 하에서 세포 특징을 관찰함으로써 탐지할 수 있는 변화는 전형적으로는 질병의 말기 단계까지 분명하지 않다. 따라서, 분자 수준의 화학적 변화를 측정하는 시험("분자 진단" 시험이라 지칭함)은 형태학적 분석에만 의존하는 시험보다 더 이른 검출을 제공하는 듯 하다.
세포 측정은 용액 중에서 일렬로 이동하는 형광 염색된 세포의 유식-미세형광측정 장치 분석(유식 세포 측정), 또는 유리 현미경 슬라이드 상에 부착된 염색 된 세포에 대한 컴퓨터-지원된 현미경 장치 분석을 근거로 한다. 유식 세포 측정 용도는 백혈병 및 림프종 면역표현형 분석을 포함한다. 영상 세포 측정 용도는 DNA 배수성, 암-관련된 변화(MAC), 세포-주기 동력학 및 S-기 분석을 포함한다. 상기 유식 및 영상 세포 측정 접근법은 현탁액 중의 또는 유리 현미경 슬라이드 상의 세포를 특성화하는 정량적인 데이터를 제공한다. 유식 및 영상 세포 측정은 사용된 세포 염색 및 유식/영상 측정 특징의 감도 및 특이성에 따른 양호한 마커 검출 및 식별 결과를 제공할 수 있다.
암-관련된 변화(MAC)는 1900년대 초-중반 이래로 정성적으로 관찰되고 보고되어 왔다(OC Gruner: "특정한 악성 질병 사례에서 백혈구가 직면한 변화에 관한 연구" in Brit J Surg 3: 506-522, 1916)(HE Neiburgs, FG Zak, DC Allen, H Reisman, T Clardy: "인간 및 동물 조직의 물질에서 체계적인 세포 변화" in Transactions, 7th Ann Mtg Inter Soc Cytol Council, pp137-144, 1959). 1900년대 중반에서 1975년까지, MAC는 구강 점막 및 구강 바른 표본(Nieburgs, Finch, Klawe), 십이지장(Nieburgs), 간(Elias, Nieburgs), 거대 핵 세포(Ramsdahl), 경부(Nieburgs, Howdon), 피부(Kwitiken), 혈액 및 골수(Nieburgs), 단핵구 및 백혈구(van Haas, Matison, Clausen), 및 폐 및 담(Martuzzi and Oppen Toth)에 있어서 독립적인 정성적 조직학 및 세포학 연구에 문헌 보고되었다. 1975년 이전에 이들 정성적인 연구는 76%에서 97%까지의 특정 질병 검출에 대한 MAC-수준 감도와 50%에서 90%까지의 특이성을 보고하였다. 1975년에 오펜 토트(Oppen Toth)는 정성적인 담 분석 연구에서 76%의 감도 및 81%의 특이성을 보고하였다.
MAC-수준 탐침 분석에 관한 정량적인 관찰은 2, 30년 전에 시작되었다(H Klawe, J Rowinski: "객관적인 영상 분석에 의해 검출된 구강 바른 표본의 세포에서 암 관련된 변화(MAC)" in Acta Cytol 18:30-33, 1974)(GL Wied, PH Bartels, M Bibbo, JJ Sychra: "중간 세포에서 자궁암에 대한 세포형태측정 마커" in Analyt Quant Cytol 2:257-263, 1980)(G Burger, U Jutting, K Rodenacker: "경부암 및 그의 전조의 사례에서 양성 집단의 변화" in Analyt Quant Cytol 3:261-271, 1981). MAC는 독립적인 정량적 조직학 및 세포학 연구에서 구강 점막 및 바른 표본(Klawe, Burger), 경부(Wied, Burger, Bartels, Vooijs, Reinhardt, Rosenthal, Boon, Katzke, Haroske, Zahniser), 유방(King, Bibbo, Susnik), 방광 및 전립선(Sherman, Montironi), 결장(Bibbo), 폐 및 담(Swank, MacAulay, Payne), 및 코 점막(Reith)에 있어서 70% 내지 89%의 MAC-수준 감도 및 52% 내지 100%의 특이성을 문헌 보고하였다. 마렉과 나코스틴(Marek and Nakhosteen, 1999, American Thoracic Society annual meeting)은 (a) 89%의 감도 및 92%의 특이성, 및 (b) 91%의 감도 및 100%의 특이성을 나타내는 2 개의 정량적인 폐(기관지 세척물) 연구에 대한 결과를 보였다.
명백하게, 암-관련된 변화(MAC)는 영상-세포 측정 마커 검출 기술로부터 유래한 잠재적으로 유용한 탐침이다. DNA-염색된 핵으로부터의 MAC-수준 특징은 다른 분자 진단 탐침과 함께 사용되어 폐암 및 다른 질병 상태의 검출 및 식별에 최적화된 분자 진단 패널을 생성시킬 수 있다.
세포 유전학은 예를 들어 제자리 하이브리드화(ISH) 기술을 사용하여 특정한 염색체-수준 세포 내 변화를 검출한다. ISH 기술은 형광성(FISH), 다-색 형광성(M-FISH) 또는 광-흡수-수준 발색 영상화(CHRISH) 기술을 기본으로 할 수 있다. ISH 기술 군은 클로닝된 세균 또는 배양된 진핵 세포에서 상보적인 DNA 서열의 존재를 검출하기 위해 DNA 또는 RNA 탐침을 사용한다. FISH 기술은 예를 들어 특정한 암과 관련된 유전 이상의 검출에 사용될 수 있다. 예로서 삼염색체 8 및 HER-2 neu에 대한 탐침이 있다. 다른 매우 민감할 뿐만 아니라 특이적인 기술, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 B-세포 및 T-세포 유전자 재배열의 검출에 사용될 수 있다. 세포 유전학은 병리 상태를 생성시키는 원인 또는 "촉발" 분자 사건을 탐지하기 때문에 매우 특이적인 마커 검출 기술이다. 상기는 일반적으로는 탐지할 사건이 보다 적게 존재하기 때문에 다른 마커 검출 기술보다 덜 민감할 수도 있다. 제자리 하이브리드화(ISH)는 유전자 수준 분석을 사용하여 유전자 수준의 이상, 예를 들어 돌연변이, 염색체 이상 또는 특정 병원균에 의해 삽입된 유전자 물질을 검출하는 분자 진단 방법이다. 예를 들어 제자리 하이브리드화는 환자의 세포 샘플을 특정한 mRNA에 하이브리드화하도록 고안된 표지된 프라이머로 처리하고, 결합되지 않은 프라이머를 씻어내고 상기 표지의 신호를 측정함으로써 특정한 mRNA의 수준을 측정함을 포함할 수 있다. 유전자 서열의 독특함으로 인해, 유전자 서열의 검출을 포함하는 시험은 높은 특이성을 가질 듯 하며, 이는 매우 적은 거짓 양성을 제공할 것이다. 그러나, 세포 샘플 중의 유전자 물질의 양이 매우 낮을 수도 있기 때문에, 단지 매우 약한 신호만이 수득될 수도 있다. 따라서, 전-증폭 기법을 사용하지 않는 제자리 하이브리드화 시험은 불충분한 특이성을 가질 듯 하며, 이는 많은 거짓 음성을 제공할 것이다.
프로테오믹스는 정상 또는 비정상 세포 유형의 집단에서 독특하거나 특이적인 단백질의 과 발현, 불충분 발현, 또는 이의 존재/부재로부터 발생하는 식별 및 세포 특징에 의존한다. 프로테오믹스는 단백질의 동정 및 정량화뿐만 아니라, 상기 단백질의 국소화, 변경, 상호작용, 화학적 활성 및 세포/세포 외 기능의 측정을 포함한다. 면역화학(IC)(세포에서 면역세포화학 및 조직에서 면역조직화학(IHC))은 항체를 사용하여 항원(즉 프로테옴)을 염색하는데 정성적으로 또는 정량적으로(QIHC) 사용되는 기술이다. 면역염색 과정은 검출 지표로서 염료를 사용한다. IHC 용도의 예로는 ER(에스트로젠 수용체), PR(프로제스테론 수용체), p53 종양 억제 유전자, 및 EGRF 예후 마커가 있다. 프로테오믹스는 전형적으로는 세포 유전학보다 더 민감한 마커 검출 기술인데, 그 이유는 세포 유전학을 사용하여 검출하기 위한 세포 유전학적 돌연변이 또는 유전자-서열 변경보다 프로테오믹스를 사용하여 검출하기 위한 단백질 분자가 더 많은 정도로 존재하기 때문이다. 그러나, 프로테오믹스는 다수의 병리상태들이 단백질 과 발현 또는 불충분 발현에서 유사한 변화를 생성시킬 수 있기 때문에 세포 유전학 마커 검출 기술보다 더 불충분한 특이성을 가질 수도 있다. 면역화학은 각각 조직 섹션 또는 세포 제제 중의 면역반응성 물질의 조직학적 또는 세포학적 국소화를 포함하며, 종종 탐침 시약으로서 표지된 항체를 사용한다. 면역화학을 사용하여, 세포를 질병 마커 상의 에피토프에 특이적인 표지된 항체(탐침)와 같은 작용제로 처리하고 이어서 결합되지 않은 항체를 씻어내고 상기 표지의 신호를 측정함으로써 상기 세포 샘플 중의 질병 마커(특 이적인 단백질)의 농도를 측정할 수 있다. 면역화학은 암 세포가 건강한 세포와 다른 수준의 특정한 질병 마커를 갖는 성질을 기본으로 한다. 암 세포 중의 질병 마커의 농도는 일반적으로 큰 신호를 발생시키기에 충분히 크다. 따라서, 면역화학에 의존하는 시험은 높은 감도를 가질 것이며, 이는 거짓 음성을 거의 제공하지 않는다. 그러나, 상기 질병 상태 이외에 다른 인자들이 질병 마커의 농도를 상승시키거나 낮출 수도 있기 때문에, 특이적인 질병 마커의 면역화학적 분석에 의존하는 시험은 불충분한 특이성을 가질 것이며, 이는 거짓 양성의 비율을 높일 것이다.
본 발명은 감도와 특이성이 모두 높은 비 침습성 질병 상태의 검출 및 식별 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자의 선별에 유용하다. 본 발명은 또한 감도와 특이성이 모두 높은 질병 상태의 검출 및 식별 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자의 진단 및 치료 모니터링에 유용하다. 상기 방법은 질병 세포를 함유하는 것으로 의심이 가는 세포검사 샘플 또는 다수의 샘플들을, 각각 특이적인 질병 마커와 정량적으로 결합하는 다수의 작용제들을 포함하는 탐침 패널들과 접촉시키고 상기 탐침 작용제의 결합 패턴을 검출 및 분석함을 포함한다. 본 발명은 또한 특정한 질병(또는 질병 그룹)을 검출하기 위한 탐침 패널을 제작 및 비준하고 그의 다양한 질병 상태들을 식별하는 방법을 제공한다. 폐암을 검출하고 다양한 유형의 폐암을 식별하기 위한 예시적인 패널들을 또한 제공한다. 예시적인 패널 또는 다른 암 및 비 암 질병 상태를 또한 제공한다.
인간의 질병은 신체 세포, 조직, 기관 또는 계 내에 비정상적인 구조 또는 기능을 생성시키는 외부(즉 국소 또는 전체적인 환경) 또는 내부 손상을 중화시키 기 위한 인간 유기체의 적응 기전의 실패로부터 발생한다. 질병을 하기 표 1에 예시하는 바와 같이 공유하는 원인 기전에 의해 분류할 수 있다.
Figure 112005013102219-PCT00001
질병 상태는 하위 세포, 세포, 조직, 기관 또는 인간의 해부학적 또는 생리학적 체계 수준의 비정상적인 변화(즉 병리학적 증상)에 의해 야기되거나 또는 이러한 변화를 발생시킨다. 많은 질병 상태들(예를 들어 폐암)은 하위 세포 또는 세포 수준의 비정상적인 변화를 특징으로 한다. 시편(예를 들어 경구 Pap 바른 표본, 배출된 뇨, 혈액, 담, 결장 세척물)을 질병 상태가 의심되는 환자로부터 수거하여 상기 질병 상태의 존재 및 유형에 대해 상기 환자들을 진단할 수 있다. 분자 병리학은 이들 세포 수준 질병들과 관련된 분자 변화를 확인하고 진단학적으로 이용하고자 하는 학문 분야이다.
폐암은 고 위험 집단 및 위험한 상태의 개인의 선별을 진단 시험(예를 들어 분자 진단 패널 분석)을 사용하여 수행하여 질병 상태의 존재를 검출할 수 있는 상기 질병 상태의 전형적인 예이다. 또한, 폐암 또는 다른 질병 상태가 이들 수단에 의해 검출되었던 환자의 경우, 관련된 진단 시험을 사용하여 특정한 질병 상태를, 관련되거나 동시에 발생한 질병 상태와 식별할 수 있다. 예를 들어, 상기 폐암의 예시에서, 추가적인 분자 진단 패널 분석은 상기 환자의 질병 상태가 하기의 폐암 유형들 중 하나와 일치할 가능성을 가리킬 수 있다: (a) 폐의 편평 세포 암종, (b) 폐의 선암종, (c) 폐의 대 세포 암종, (d) 폐의 소 세포 암종, 또는 (e) 중피종. 세포 수준 질병 상태의 조기 검출 및 식별은 환자의 결과를 개선시키기 위해 가정된 수단이다.
암은 종양 질병으로, 그의 자연적인 과정은 치명적이다. 암 세포는 양성 종양 세포와 달리, 침습성과 전이성을 나타내며, 매우 미분화성이다. 암은 암종(즉 상피 세포 수준 암), 육종(예를 들어 뼈 수준 암) 및 혈액 수준 암(예를 들어 백혈병 및 림프종)의 3 개의 넓은 범주를 포함하지만, 사용 시 상기 3 가지 유형은 각각 암종과 동의어로 지칭된다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면, 암은 매년 1000만 명 이상이 걸리며 이로 인해 620만 명이 넘게 사망한다.
암은 실제로는 실질적으로 신체의 어떠한 부분에서도 발생할 수 있는 질병들의 이질적인 수집물이다. 결과적으로, 상이한 치료들이 모든 암 또는 심지어 특정 유형 암의 단계들에 동등하게 효과적이지 않다. 진단학의 진보(예를 들어 유방 조영술, 경부 세포검사 및 혈청 PSA 시험)는 일부의 경우에, 보다 많은 수의 치료 선택권이 존재하고 치료법들이 보다 효과적인 경향이 있는 경우 암의 조기 검출을 허용하여 왔다. 충실성 종양이 작고 국소화된 경우에, 수술만으로도 치유가 충분할 수 있다. 그러나, 상기 종양이 퍼진 경우 수술은 기껏해야 단지 제한된 이점을 제공할 뿐이다. 상기와 같은 경우 화학요법 및/또는 방사선 요법을 추가로 사용하여 전이성 질병을 치료할 수도 있다. 비-혈액 수준의 전이성 질병에 걸린 환자의 치료는 삶을 연장시키는데는 다소 효과적이지만, 좀처럼 치유되지 않는다. 초기 반응이 있을 수 있다 하더라도, 시간이 지남에 따라 상기 질병은 진행하여 상기 환자는 궁극적으로 상기 질병의 영향 및/또는 상기 치료의 독성 효과로 인해 사망한다.
입증되지는 않았지만, 일반적으로 조기 검출 및 치료가 암의 질병률, 사망률 및 비용을 낮출 것으로 인정된다. 조기 검출은 많은 경우에 치료를 전이에 앞서 허용할 것이다. 더욱 또한, 보다 많은 수의 치료 선택권이 존재하기 때문에, 치유를 달성하거나 장기적인 생존이 크게 개선될 가능성이 보다 높다.
"위험한 상태"의 집단을 선별하는데 사용될 수 있는 시험의 개발은 건강 종사자들의 오랜 목표였다. 유방암의 경우 유방 조영술, 전립선 암의 경우 PSA 시험 및 경부 암의 경우 Pap 바른 세포와 같은 일부의 성공이 있었지만, 대부분의 경우에 암은 환자가 징후를 보이고 질병이 거의 항상 치명적인 비교적 말기에 검출된다. 대부분의 암의 경우, 시험이나 시험들의 병행은 질병 초기 단계 환자의 비용 효과적인 확인을 허용하는데 필요한 감도 및 특이성을 나타내지 못했다.
성공적이면서 환자, 의사 및 제 3 지불인에게 받아들여지는 암 선별 프로그램을 위해서, 상기 시험은 이점을 포함해야하고(성과를 변화시키는), 널리 이용될 수 있어야 하며 일반적인 헬쓰케어의 체제 내에서 쉽게 수행될 수 있어야 한다. 상기 시험은 비교적 비 침습성이어서, 적절한 응낙을 도출시켜야 하며, 높은 감도 및 적당한 특이성 및 예견치를 가져야 한다. 또한, 상기 시험은 비교적 저렴한 비용으로 이용될 수 있어야 한다.
암에 걸린 것으로 의심이 가는 환자에 대해서, 상기 진단은 확인되어야 하고 의사들이 적합한 치료 중재를 수행하도록 종양을 세포학적으로 및 임상적으로 적합하게 단계화해야 한다. 그러나 진단 및 암의 단계화에 현재 사용되는 일부 시험들은 충분한 감도 또는 특이성이 부족하며, 집단 수준의 선별 시험으로서 이들의 사용을 정당화하기에는 너무 침습적이거나 또는 너무 비용이 높다. 예를 들어 하기 표 2 및 3에 폐암 진단의 감도 및 특이성에 대한 평가와 폐암의 검출에 사용되는 진단 시험의 추정 비용(US 달러)을 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00002
Figure 112005013102219-PCT00003
가슴 방사선 사진(X-선)은 종종 그의 적당한 감도, 높은 특이성 및 저렴한 비용으로 인해 암 병변의 검출 및 위치 측정에 사용된다. 그러나, 작은 병변들은 종종 검출하기 어려우며 보다 큰 종양이 가슴 필름 상에서 비교적 쉽게 보이더라도 검출 시에는 대부분 이미 전이되어 있다. 따라서, 가슴 X-선은 조기 검출 방법으로서 사용하는데 필요한 감도가 부족하다.
컴퓨터 단층 촬영술(CT)은 폐 결절의 확인 및 특성화에 유용하며 종종 표준 가슴 X-선 상에서 놓치는 미세한 이상들을 검출할 수 있게 한다[2]. CT 및 나선형 CT 방법은 특히 이전에 악성 담 세포검사 결과 또는 성대 마비가 있는 환자가 아직 시험을 선택하지 않으면 안 된다. 통상적인 가슴 필름에 비해 감도가 개선된 CT는 중심 기도를 영상화하는데 주요한 도구가 되고 있다[3]. CT는 넓은 면적을 검사할 수 있는 반면, 요오드화된 콘트라스트 물질의 사용을 통해 개선된 해상도를 달성할 수 있지만 심장 및 호흡기 운동으로 인해 인공물을 가해야 한다.
나선형 CT는 암 병변을 통상적인 CT나 X-선에 비해 보다 신뢰성 있게 조기 검출하는 능력을 갖는 보다 신속하고 민감한 형태의 CT이다. 나선형 CT는 질병의 조기 진단에서 크게 개선된 감도를 갖는 것으로 보인다. 그러나, 상기 시험은 거짓 양성 비율이 20%인 비교적 낮은 특이성을 갖는다[4]. 나선형 CT 장비의 해상도가 공학 기술의 진보로 개선되고 있지만, 상기 거짓 양성 비율은 증가하는 듯 하다. 나선형 CT는 또한 모든 폐암의 1/3을 대표하는 중추 병변의 검출에 덜 민감하다. 더욱 또한, 초기 시험 비용은 비교적 저렴한 반면($300), 잇따르는 비용은 적어도 그 정도가 보다 클 수 있다. 분자 진단 패널 분석을 사용하는 세포검사는 나선형 CT-의심 가는 폐 결절로부터 미세침 흡인(FNA) 또는 생검(FNB)의 평가를 통해 거짓 양성 결과를 최소화함으로써 나선형 CT 시험의 특이성을 개선시키는데 나선형 CT에 대한 부속 시험으로서 중요한 전망을 제공한다.
형광 기관지경술은 통상적인 백색광 기관지경술에 대해 증가된 감도를 제공하며, 이는 중추 기도내의 작은 병변들의 검출을 개선시킨다.
그러나, 형광 기관지경술은 말초 병변들을 검출할 수 없으며, 환자의 기도를 검사하는데 시간이 오래 걸리고, 비용이 많이 드는 과정이다. 또한, 상기 과정은 보통으로 침습성이어서, 집단 수준 선별 시험으로서 사용하기에는 이겨내기 어려운 장벽을 발생시킨다.
양전자 방출 단층 촬영술은 폐 내의 암 세포의 존재를 확인하기 위해 방사성 글루코스를 사용하는 매우 민감한 시험이다. 시험 설비를 설립하는 비용이 크며 현지 또는 부근에 사이클로트론이 필요하다. 또한, 집중된 시험의 실행은 논리적으로 문제가 있다. 이는 높은 시험 비용과 연결되어 질병의 조기 검출보다는 폐암 환자를 분류하는 것으로 PET 스캔의 사용을 제한시킨다.
담 세포검사는 얼마간은 폐암의 선별 수단으로서 사용되었지만, 그의 낮은 감도 및 질병-특이성 사망률의 감소 실패로 인해 단지 제한된 성공을 누렸다. 통상적인 담 세포검사에서, 병리학자들은 암 세포를 확인하고 암을 진단하기 위해 세포 형태의 특징적인 변화를 이용한다. 오늘날 '위험한 상태'에 있거나 또는 폐암이 있는 것으로 의심이 가는 환자의 단지 15% 만이 담 세포검사 시험을 받고 있으며, 중복 평가는 5% 미만이 받고 있다[9]. 종양 크기, 위치, 분화 정도, 세포 응집, 세포 및 담을 외부 환경으로 방출시키는 제거 기전의 비효율성, 및 상기 담 내에서의 세포의 불량한 안정성을 포함한 다수의 인자들이 상기 시험의 전반적인 불량한 성능에 기여한다.
암 진단학은 전통적으로 단일 분자 마커의 검출에 의존하여 왔다. 불행하게도, 암은 전형적으로 단일 마커가 많은 형태의 질병을 검출하거나 식별하는데 실패한 질병 상태이다. 따라서, 단지 단일의 마커만을 인식하는 탐침은 주로 비효과적인 것으로 나타났다. "마법의 탄환" 진단 시험에 대한 철저한 연구가 수 십 년 동안 진행되어 왔지만 지금까지 보편적으로 성공적인 마법의 탄환 탐침은 발견되지 않았다.
본 발명의 대 전제는 세포 수준의 암 진단학 및 다른 질병 상태들의 선별, 진단 및 치료 모니터링이 다 수의 동시적으로 표지된 탐침들의 키트보다는 단일 마커/탐침 분석을 사용하는 최첨단 기술 수준에 비해 크게 개선될 것이라는 것이다. 이러한 다중적인 분석학적 접근법은 암이 단일 질병이 아니기 때문에 암 진단학에 특히 매우 적합하다. 더욱 또한, 상기 다중 인자성 "패널" 접근법은 세포학적으로 및 임상적으로 암의 이질적인 성질과 일관된다.
패널 접근법을 세포 수준 진단 시험으로 성공적으로 실행하기 위한 요소는 다양한 질병 상태들을 특성화하고 식별하는 마커들의 패턴을 화학적으로 인식할 수 있는 최적화된 탐침 패널들의 고안과 개발이다. 본 특허 출원은 상기와 같은 새롭고 최적화된 패널들을 고안 및 개발하기 위한 효율적이고 독특한 방법을 개시한다.
시편 수집(예를 들어 담 세포검사의 경우 치유 시점의 믹서) 및 준비(예를 들어 새로운 세포검사 보존 및 수송 유체, 및 액체-기재 세포검사 준비 장비)를 위한 개선된 방법들이 개발 중이며 상업적으로 입수할 수 있게 될 것이다. 기존 및 상기 신흥 방법들과 함께, 이러한 분자 진단학 세포 수준 패널 분석의 성공적인 실행은 (a) 악성 종양 및 다른 질병 상태들의 분자 프로파일의 특성화, (b) 개선된 조기 암 및 다른 질병 상태의 검출 및 식별 방법, 및 (c) 개선된 임상적 진단, 예지, 맞춤식 환자 치료, 및 치료 모니터링의 기회를 도출시킬 것이다.
발명의 요약
본 발명은 세포 수준 진단을 사용하는 일반적인 질병 상태의 검출 또는 특정 질병 상태들간의 식별을 위한 패널에 관한 것이다. 상기 패널은 다수의 탐침들을 포함하며, 이들 탐침은 각각 일반적이거나 특정한 질병 상태들과 관련된 마커와 결합하고, 이때 세포검사 시편 중의 세포에 대한 상기 패널의 구성 탐침들의 결합 패턴이 상기 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단한다. 본 발명은 또한 세포 수준 진단을 사용하여 환자에서 질병 상태를 검출하거나 또는 질병 상태들을 식별하기 위한 패널을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 각각의 탐침이 질병 상태와 관련된 마커 라이브러리의 구성원과 특이적으로 결합하는 상기 탐침들의 결합 감도 및 특이성을 측정하고, 상기 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단하는 결합 패턴을 갖는 제한된 복수 개의 상기 탐침들을 선택함을 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 질병의 검출 또는 질병 상태들간의 식별 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질병 상태의 특징인 비정상 세포를 갖는 것으로 의심이 가는 세포검사 샘플을 청구의 범위 제 1 항에 따른 패널과 접촉시키고 상기 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단하는 상기 탐침들의 결합 패턴을 검출함을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 폐암의 상이한 조직 유형을 확인하기 위해 패널에 포함시키기에 바람직한 마커들인 분자 마커들을 나타낸다. "%" 표시된 컬럼은 특정 마커를 발현하는 종양 시편의 퍼센트를 가리킨다.
도 2는 폐암의 특정한 유형들을 식별하기 위해 상이한 마커들을 사용할 수 있는 가능한 방법들을 나타낸다. SQ는 편평 세포 암종을 가리키고, AD는 선암종을, LC는 대 세포 암종을, SC는 소 세포 암종을, ME는 중피종을 가리킨다. 각 세포에 나타낸 숫자들은 다른 세포 유형에 대한 하나의 세포 유형에서의 마커 변화 도수를 나타낸다. 표에 포함되기 위해서, 상기 비율은 2.0 이상 또는 0.5 미만이어야 한다. 100 보다 큰 수는 일반적으로 두 번째 마커가 발현되지 않음을 가리킨다. 상기와 같은 경우에 분석을 위해서 분모를 0.1로 고정시켰다. 마지막으로, 빈 세포는 발현에 차이가 없거나 또는 발현 데이터의 부재를 나타낸다.
도 3은 대조용 조직 및 암 조직에서 탐침 7 및 15에 대한 H-점수들간의 비교를 나타낸다. X-축은 H-점수를 나타내는 반면 Y-축은 사례의 퍼센트를 나타낸다.
도 4는 상관성이 한 쌍의 변수들간의 1차적인 관련성의 크기를 측정하는 상관성 매트릭스를 나타낸다. 상기 매트릭스에서 50% 이상의 상관성 수치를 갖는 모든 마커들은 서로 관련이 있는 마커들로 간주된다. 상기 상관성 매트릭스의 모든 대각선 요소들은 상기 요소들이 자기-상관성 값(즉 탐침 N에 대한 탐침 N의 상관성)을 나타내기 때문에 1.0(즉 참)의 값을 가짐에 유의한다. 또한, 상기 매트릭스가 대각선으로 대칭적임(즉 M에 대한 탐침 N의 상관성 값은 N에 대한 탐침 M의 상관성 값과 일치한다)에 유의한다.
도 5는 패널 조성, 짝을 이루는 방식(pair-wise)의 식별 패널 조성 및 연합 식별 패널 조성의 검출을 나타낸다. 결정 수 분석, 계단식 LR 및 계단식 LD를 사용하는 패널 조성을 나타낸다. 어두운 박스는 이들 독립적인 분석 방법들 중 2 개 이상에 의해 유효한 것으로 입증된 탐침들을 나타냄을 유의한다.
도 6은 탐침 7이 탐침으로서 포함되지 않은 패널 조성의 검출을 나타낸다. 결정 수 분석, 계단식 LR 및 계단식 LD를 사용하는 패널 조성을 나타낸다. 어두운 박스는 이들 독립적인 분석 방법들 중 2 개 이상에 의해 유효한 것으로 입증된 탐침들을 나타냄을 유의한다.
도 7은 단지 상업적으로 바람직한 탐침들만을 사용한 패널 조성의 검출을 나타낸다. 결정 수 분석, 계단식 LR 및 계단식 LD를 사용하는 패널 조성을 나타낸다. 어두운 박스는 이들 독립적인 분석 방법들 중 2 개 이상에 의해 유효한 것으로 입증된 탐침들을 나타냄을 유의한다.
도 8a 내지 8c는 폐암, 결장직장암, 방광암, 전립선암, 유방암 및 경부암의 검출 및/또는 진단을 위한 패널에 바람직한 마커들(탐침들)에 대한 요약이다.
1. 도입
본 발명은 감도 및 특이성이 높은 비 침습성 질병 상태의 검출 및 식별 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 또는 조직 샘플 또는 질병 세포를 함유하는 것으로 의심이 가는 샘플을 다수의 작용제들(이때 상기 작용제들은 각각 질병 마커와 정량적으로 결합한다)을 포함하는 패널과 접촉시키고 상기 작용제들의 결합 패턴을 검출함을 포함한다. 상기 패턴은 상기 패널의 구성 탐침들의 결합 위치 및 결합 밀도/농도를 포함한다. 본 발명은 또한 질병의 검출 및 또한 질병 상태들간의 식별을 위한 패널뿐만 아니라 폐암의 조기 검출 및 폐암의 상이한 유형들간의 식별을 위한 패널의 제조 방법을 제공한다. 패널 시험은 의학적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 패널을 혈액 혈청 분석에 사용한다. 그러나, 세포검사 분석은 개별적인 세포 및 조직 내의 특정한 마커들의 영상화 및 위치 측정을 수반하기 때문에, 본 발명 이전에는 상기 패널 접근법이 세포 또는 조직 샘플에 유효할 것임은 자명하지 않았다. 또한, 임의의 통계적 분석을 탐침의 최적화된 세포 수준 진단 패널의 고안 및 개발에 적용시킬 수 있는지의 여부도 명백하지 않았다.
세포검사 수준 선별 프로그램의 몇 가지 예들 중 하나로 Pap 바른 표본이 있는데, 이는 경부 암을 선별한다. 50 년 이상 동안 상기 방법이 실행되어 왔으며 오늘날 규칙적인 Pap 바른 표본을 갖는 여성들은 거의 경부 암으로 인해 사망하지 않는다는 사실에 크게 기여하였다. 그러나, 상기 Pap 바른 표본 선별 프로그램에도 결점이 있다. 예를 들어, Pap 바른 표본은 노동 집약적이며, 인간 실행과 관련하여 변하기 쉬우며, 보편적으로 이용될 수가 없다. 탐침 패널을 사용하는 본 발명의 분자 진단 세포 수준 선별 방법은 이러한 결점이 없다. 상기 방법은 완전히 자동화될 수 있으며 이에 의해 비용이 덜 들고 재현 가능하며, 이는 이러한 유형의 시험에 대한 접근성을 증가시킨다.
본 발명은 질병 상태의 검출 및 질병 상태들간의 식별에 대한 특이성과 감도가 모두 높은 방법을 제공한다. 본 발명을 임의의 세포 수준 질병 상태, 예를 들어 암 및 감염성 질병에 적용할 수 있다.
상기 패널은 상기 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단한다. 본 발명은 비용을 저렴하게 유지하면서 세포검사 샘플에서 질병 세포의 검출 및 식별을 신속하고, 정확하며, 비교적 침습적이지 않고 용이하게 함으로써 공지된 질병 상태 검출 방법의 한계 및 결점을 극복한다.
본 발명의 패널을 제조하기 위한 본 발명 방법의 특징은 상기 패널을 신속하게 개발할 수 있다는 것이다.
질병 상태의 검출 및 질병 상태 유형들간의 식별을 위한 방법에서 작용제들을 패널을 사용하는데 다수의 이점들이 존재한다. 하나의 이점은 작용제들의 패널이 질병 상태의 검출 및 특성화를 허용하기에 충분한 여분을 가져서 상기 시험의 감도 및 특이성을 증가시킨다는 것이다. 많은 질병 상태들의 이질성이 주어지는 경우 단일의 작용제는 막대한 대다수의 사례들을 확인할 수 없다.
패널을 사용하는 추가적인 이점은 패널의 사용이 특정한 발현 패턴(탐침 국소화 및 밀도/농도)을 근거로 다양한 유형의 질병 상태들간의 식별을 허용한다는 것이다. 다양한 유형의 질병이 그의 진행 속도, 치료 반응, 및 치명성에 있어서 극적인 차이를 나타낼 수 있기 때문에, 특정한 유형에 대한 지식은 의사가 최적의 치료학적 접근법을 선택하는데 도움을 줄 수 있다.
2. 패널
본 발명의 패널은 다수의 작용제들을 포함하며, 이들 작용제는 각각 질병 마커와 정량적으로 결합하고, 이때 상기 패널의 구성 작용제들의 결합 패턴(국소화 및 밀도/농도)이 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단한다. 따라서, 상기 패널은 검출 패널 또는 식별 패널일 수 있다. 검출 패널은 일반적인 질병 상태가 세포 샘플에 존재하는지의 여부를 측정하는 반면, 식별 패널은 상이한 유형의 질병들을 포함하는 질병 상태에 의해 감염된 것으로 공지된 세포의 샘플에서 상이한 특정한 질병 상태를 식별한다. 검출 패널과 식별 패널간의 차이는 패널이 포함하는 특정한 작용제들에 있다. 검출 패널은 질병 상태의 존재를 진단하는 결합 패넌을 갖는 작용제를 포함하는 반면, 식별 패널은 상기 질병 상태의 특정한 성질(즉 각각의 유형)을 식별할 수 있게 하는 결합 패턴을 갖는 작용제를 포함한다.
패널은 정의 상 하나 이상의 구성원을 함유한다. 일반적인 질병 상태의 검출 또는 특정 질병 상태들간의 식별을 위해 단지 하나의 마커만을 사용하기보다는 마커들의 패널을 사용하는 것이 유리한 이유는 여러 가지가 있다. 한 가지 이유는, 모든 질병 세포 중에 존재하지만 건강한 세포에는 존재하지 않고 그의 반응 양상을 높은 특이성 및 감도로 측정하여 정확한 시험 결과를 제공할 수 있는 하나의 단일 마커에 대한 탐침이 존재할 것 같지 않다는 것이다. 만일 상기와 같은 단일 탐침이 특정 질환의 검출에 높은 감도 및 특이성으로 존재한다면, 상기는 이미 임상 시험에 사용되었을 지도 모른다. 오히려, 상기는 임상적으로 적합한 시험을 보증하는 검출 능력 범위를 함께 제공할 수 있는 다수 개의 탐침들로 이루어진 지정된 패널 시험 선택이다.
그럼에도 불구하고 하나 또는 매우 소수의 탐침을 포함하는 패널 시험을 제작하기로 선택한 경우, 임의의 이유(예를 들어 생물학적 변이성에 기인한 시편 세포의 감소된 반응성; 탐침 시약 로트들간의 고유한 변이성; 약하거나, 구식이거나 결함이 있는 가공 시약; 상기 탐침에 대한 부적합한 가공 시간 또는 조건)로 인한 임의의 단일 마커/탐침 조합의 표지 기능 수행 실패는 표적 질병의 검출 또는 식별을 위한 상기 시험을 완전히 실패시킬 수 있다. 각 패널 시험에 다수, 심지어는 과다한 탐침을 포함시키는 것은 임의의 하나의 탐침의 실패가 상기 시험의 완전한 실패를 일으키지 않을 가능성을 크게 향상시킨다.
탐침은 질병 마커에 결합하는 임의의 분자 구조물 또는 하위 구조물이다. 본 발명에 사용된 "작용제"란 용어는 또한 질병 마커에 결합하는 분자 구조물 또는 하위 구조물을 지칭할 수 있다. 분자 탐침은 특정한 질병 상태를 가리키는 마커들을 검출하고 위치 측정하기 위해 생물학자 및 임상의에 의해 사용되는 자동 추적 장치이다. 예를 들어, 소 세포 폐 암에 대한 마커로서 앞서 동정된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체 탐침은 적합한 면역화학 프로토콜 및 배양을 사용함으로써 질병에 걸린 것으로 의심이 가는 환자의 세포 및 조직에서 표적 단백질 마커를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 상기 항체 탐침이 화학량론적 방식(즉 정량적)으로 그의 표적 마커에 결합하고 발색 또는 착색 "태그"로 표지되는 경우, 상기 탐침 및 간접적으로 그의 표적 마커의 국소화 및 정량화를 광학 현미경 및 영상 세포측정 기법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명은 통상적인 숙련가가 이용할 수 있는 임의의 다수의 방법들을 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 분자 마커 발현의 변화를 검출함을 고려한다. 전형적인 탐침은 다클론 또는 단클론 항체 또는 그의 단편이거나 또는 패널 중의 분자 마커를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열일 수 있다. 탐침은 또한 염색, 예를 들어 DNA 염색일 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체들 중 다수는 마커 물질로서 다양한 세포 표면 또는 세포 내 항원에 특이적이다. 상기 항체들을 당해 분야의 숙련가들에게 일반적으로 공지된 기법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어 항체를 상기 마커에 처음 올린 후에, 상기 항체를 서열화하고 이어수 재조합 기법에 의해 제조할 수 있다. 한편으로, 항체를 구입할 수도 있다.
본 발명의 실시태양에서, 탐침은 표지를 함유한다. 표지를 함유하는 탐침을 종종 본 발명에서 "표지된 탐침"으로서 지칭한다. 상기 표지는 탐침이 마커에 결합하는 경우 신호를 방출하거나 또는 표지된 탐침이 인간 관찰자 또는 분석 장비에 의해 검출될 수 있도록 상기 탐침에 부착될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 상기 표지를 또한 "태그"로서 지칭할 수도 있다. 상기 표지를 판독 수단을 사용하여 가시화할 수 있다. "판독 수단"이란 용어는 탐침의 검출에 사용되는 분석 장비를 지칭한다. 본 발명에 의해 기도되는 표지는 신호를 방출하여 샘플 중의 성분을 확인할 수 있게 하는 임의의 표지이다. 바람직한 표지로는 방사성, 형광, 발색 또는 효소 잔기가 있다. 따라서, 가능한 검출 방법에는 비 제한적으로 면역세포화학, 면역조직화학, 제자리 하이브리드화, 형광 제자리 하이브리드화, 유식 세포 측정 및 영상 세포 측정이 포함된다. 상기 표지된 탐침에 의해 생성된 신호는 의료 종사자에 의해 검출되기에 충분한 강도를 갖는다.
"마커", "질병 마커" 또는 "분자 마커"는 질병 상태 또는 병원체와 상관이 있는 임의의 분자 구조물 또는 하위 구조물이다. "항원"이란 용어는 "마커"와 호환적으로 사용될 수 있다. 마커는 광범위하게 정의하자면 특정 증상, 사건 또는 물질의 존재 또는 빈도 및/또는 크기를 밝히거나 검출하거나 측정하기 위해 관찰자 또는 장비에 의해 신중하게 사용될 수 있는 생물 지표이다. 예를 들어 뉴클레오타이드 염기의 특이적이고 독특한 서열을 유전자 마커로서 사용하여 개인 및 가족을 통한 유전성의 패턴을 추적할 수 있다. 유사하게, 분자 마커는 세포 또는 조직 내의 존재가 특정한 질병 상태를 가리키는 특이적인 분자, 예를 들어 단백질 또는 단백질 단편이다. 예를 들어 증식하는 암 세포는 동일한 유형의 정상 세포 상에 결합되지 않은 새로운 세포-표면 단백질을 발현하거나, 또는 증가하거나 감소하는 풍부성(예를 들어 각각 과 발현 또는 불충분 발현)이 특정한 질병 상태에 대한 마커로서 작용할 수 있는 특이적인 분비 단백질을 과 발현할 수 있다.
세포검사 패널에 적합한 마커는 핵, 세포질 또는 세포막 내에 또는 이들 위에 위치하는 물질이다. 마커는 또한 세포 중의 상기 위치들 중 임의의 위치에 위치한 세포 기관에 국소화될 수 있다. 핵 내에 위치한 전형적인 마커로는 비 제한적으로 망막모세포종 유전자 산물(Rb), 사이클린 A, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제/nm23, 흑색종 항원-1(MAGE-1), 뮤신 1, 계면 활성제 아포단백질 B(SP-B), ER 관련된 단백질 p29 및 흑색종 항원-3(MAGE-3)이 있다. 세포막 내에 위치한 전형적인 마커로는 비 제한적으로 VEGF, 트롬보모듈린, CD44v6, E-카데린, 뮤신 1, 인간 상피 관련된 항원(HERA), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 간세포 성장 인자 수용체(C-MET), BCL-2, N-카데린, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 글루코스 운반인자-3(GLUT-3)이 있다. 세포질의 세포 기관 내에 위치한 마커의 예는 미토콘드리아 막 중에 위치한(부분적으로) BCL-2이다. 핵의 세포 기관 내에 위치한 마커의 예는 핵소체 중에 위치한 p120(증식 관련된 핵 항원)이다.
발현 변화가 질병 진행 중에 일찍 발생하고, 대부분의 질병 세포에 의해 나타나며, 소정의 질병 유형의 75%를 초과하여, 가장 바람직하게는 90%를 초과하여 검출되고/되거나 질병 상태의 상이한 유형들의 성질간의 식별을 허용하는 마커가 바람직하다.
본 발명의 패널을 탐침의 패널 또는 마커의 패널로서 지칭할 수 있는데, 그 이유는 상기 탐침들이 마커에 결합하기 때문임에 주목한다. 따라서, 상기 패널은 다수의 마커들을 포함하거나 또는 특정한 마커들에 결합하는 다수의 탐침들을 포함할 수 있다. 일관성을 위해서, 본 발명의 패널을 탐침의 패널로서 지칭하지만; 상기를 또한 마커의 패널로서 지칭할 수도 있다.
마커는 또한 세포핵의 암-관련된 변화(MAC)와 같은 특징 또는 환자의 암 가족력과 관련된 특징을 포함할 수 있다. 암-관련된 변화, 또는 MAC는 전형적으로는 암 세포 부근에 위치한 정상으로 보이는 세포들에서 일어나는 가시 수준 이하의 변화이다. 세포핵에서의 이러한 과도하게 민감한 변화는 생물학적으로 핵 기질과 염색질 분포 패턴의 변화로부터 발생할 수 있다. 상기는 훈련된 관찰자에 의해서 조차도 개별 세포의 가시적인 관찰을 통해서 인식되지 않고, 고도로 자동화된 컴퓨터 고속 영상 세포측정을 사용하여 세포 집단의 통계적인 분석으로부터 측정할 수 있다. MAC의 검출 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 문헌[Gruner, O.C. Brit J. Surg. 3 506-522(1916); Neiburgs, H.E. et al., Transaction, 7th Annual Mtg. Inter. Soc. Cytol. Council 137-144(1959); Klawe, H. Acta, Cytol. 18: 30-33(1974); Wied, G.L., et al., Analty. Quant. Cytol. 2 257-263(1980); 및 Burger, G., et al., Analyt. Quant. Cytol. 3 261-271(1981)]에 보다 상세히 개시되어 있다.
본 발명은 질병 상태와 서로 관련이 있는 임의의 마커를 포함한다. 개별적인 마커 자체는 단지 본 발명의 도구에 불과하다. 따라서, 본 발명은 특정한 마커로 제한되지 않는다. 마커들을 분류하는 한가지 방식은 다른 분자들에 대한 이들의 작용 관계에 의한 것이다. 본 발명에 사용된 "작용적으로 관련된" 마커는 관심 마커와 동일한 생물 과정 또는 경로를 갖는 성분이며 당해 분야의 숙련가들에 의해 상기 관심 마커와 함께 비정상적으로 발현되는 것으로 공지될 수 있다. 예를 들어 다수의 마커들, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자(FGF)(혈관 내피세포 증식 인자) VEGF, 사이클린 A 및 사이클린 D1이 세포 증식 경로와 관련이 있다. 다른 마커는 글루코스 운반인자, 예를 들어 Glut-1 및 Glut-3이다.
당해 분야의 숙련가는 작용적으로 관련된 마커를 측정할 지식을 잘 갖추고 있으며 다양한 마커들을 연구하거나 마커의 작용 양상을 측정하는 실험을 수행할 수 있다. 비 제한적인 예로서 마커를 혈관형성에 관여하는 분자, 막 통과 당단백질, 세포 표면 당단백질, 폐 계면활성제 단백질, 핵 DNA-결합 인단백질, 막 통과 Ca2+ 의존성 세포 유착 분자, 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 조절 서브유닛, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제, 리보 핵 단백질 효소, 정상 및 종양 세포의 증식에서 발현되는 핵 단백질, DNA 폴리머라제 델타에 대한 보조인자, 정상 조직에서는 활동하지 않지만 악성 종양에서 발현되는 경우 자가이식성이고 종양 지향성이며 특이적인 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식되는 유전자, 글라이코실화된 분비 단백질, 위장 관 또는 비뇨 생식기 관, 폐 계면활성제의 소수성 단백질, 막 통과 당단백질, 증식, 분화 및 혈관형성에 관여하는 분자, 원발암 유전자, 유사영역 전사 인자, 미토콘드리아 막 단백질, 빠르게 증식하는 세포의 핵에서 발견되는 분자, 글루코스 운반인자, 또는 에스트로젠-관련된 열 충격 단백질로서 분류할 수 있다.
생물 마커 및 탐침의 부류에는 비 제한적으로 (a) 형태학적 생물 마커, 예를 들어 DNA 배수성, MAC 및 전암성 병변; (b) 유전성 생물 마커, 예를 들어 DNA 부가물, DNA 돌연변이 및 세포사멸 지수; (c) 세포 주기 생물 마커, 예를 들어 세포 증식, 분화, 조절 분자 및 세포사멸 마커, 및 (d) 분자 및 생화학적 생물 마커, 예를 들어 종양 유전자, 종양 억제 인자, 종양 항원, 성장 인자 및 수용체, 효소, 단백질, 프로스타글란딘 수준 및 유착 분자가 있다.
"질병 상태"는 임의의 세포 수준 질병일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 질병 상태는 암이다. 다른 실시태양에서, 상기 질병 상태는 감염성 질병이다. 암은 임의의 암, 예를 들어 비 제한적으로 폐, 비뇨기, 위장, 및 생식기로부터의 상피 세포 수준 암; 충실성 및/또는 분비성 종양 수준 암, 예를 들어 육종, 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암, 및 전립선 암; 및 혈액 수준 암, 예를 들어 백혈병 및 림프종일 수 있다. 본 발명에 의해 검출될 수 있는 전형적인 암은 폐, 방광, 위장, 경부, 유방 또는 전립선암이다. 검출될 수 있는 전형적인 감염성 질병은 감염성 미생물이 바이러스, 세균, 원생동물, 기생충 또는 진균인 세포 수준 질병이다. 상기 감염성 질병은 예를 들어 HIV, 간염, 독감, 수막염, 단핵구증, 결핵 및 성매개 질환(STD), 예를 들어 클라미디아, 트리코모나스, 임질, 헤르페스 및 매독일 수 있다.
본 발명에 사용된 "일반적인 질병 상태"란 용어는 여러 유형의 특정한 질병들, 예를 들어 폐암, 성매개 질병 및 면역 수준 질병을 포함하는 질병을 지칭한다. 특정한 질병 상태를 또한 조직학적 유형의 질병으로서 지칭한다. 예를 들어 "폐암"이라는 용어는 다수의 특정한 질병들을 포함하며, 특히 편평 세포 암종, 선암종 대 세포 암종, 소 세포 폐 암 및 중피종이 있다. "성매개 질병"이란 용어는 다수의 특정한 질병들, 특히 임질, 인간 유두종 바이러스(HPV), 헤르페스 및 매독을 포함한다. "면역 수준 질병"이란 용어는 다수의 특정한 질병들, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스(루푸스), 류마티스성 관절염 및 악성 빈혈을 포함한다.
본 발명에 사용된 "고 위험 집단"이란 용어는 가정이나 직장에서 질병 원인 인자, 예를 들어 발암성 물질에 노출되는(즉 폐암에 대한 "고 위험 집단"은 흡연, 간접 흡연 및 직업상 노출에 노출되는) 개인들의 그룹을 지칭한다. "고 위험 집단"에서 개인들은 또한 유전적 소인을 가질 수도 있다.
"위험한 상태"란 용어는 증상은 없지만 가족력이나 상당한 노출로 인해 질병 상태를 나타낼 위험성이 큰 개인을 지칭한다(즉 폐암의 경우 >30 갑-해(pack-year) 흡연 경력이 있는 개인은 위험한 상태이며; "갑-해"는 하루에 피운 담배 갑의 수에 상기 노출된 해의 수를 곱하여 산출한 측정 단위이다).
암은 세포가 예를 들어 변경된 유전자 발현에 기인하여 통제 없이 분할하는 질병이다. 본 발명의 방법 및 패널에서, 암은 임의의 기관에서 임의의 악성 성장일 수 있다. 예를 들어 상기 암은 폐, 방광, 위장, 경부, 유방 또는 전립선암일 수 있다. 각각의 암은 질병들의 수집물 또는 조직학적 유형의 암을 포함할 수 있다. "조직학적 유형"이란 용어는 상이한 조직학을 갖는 암을 지칭한다. 암에 따라 하나 또는 다수의 조직학적 유형이 있을 수 있다. 예를 들어 폐암은 비 제한적으로 편평 세포 암종, 선암종, 대 세포 암종, 소 세포 암종 및 중피종을 포함한다. 환자가 걸린 암의 조직학적 유형에 대한 지식은 상기 지식이 의료 종사자가 상기 질병을 국소화하고 특성화하며 최적의 치료 전략을 결정하는 것을 돕기 때문에 매우 유용하다.
감염성 질병은 감염성 미생물이 바이러스, 세균, 원생동물, 기생충 또는 진균인 세포 수준 질병을 포함한다.
전형적인 검출 및 식별 패널은 일반적인 질병 상태인 폐암을 검출하는 패널, 및 특정한 질병 상태인 단일 폐암 유형을 모든 다른 유형의 폐암 및 거짓 양성들에 대해 식별하는 패널이다. 거짓 양성은 상이한 유형의 전이성 암, 예를 들어 전이된 간, 신장 또는 췌장암을 포함할 수 있다.
3. 패널의 제조 방법
환자에서 일반적인 질병 상태를 검출하거나 또는 특정한 질병 상태들을 식별하기 위한 패널의 제조 방법은 일반적이거나 특정한 질병 상태와 관련이 있는 마커들의 라이브러리에 대한 탐침의 결합 감도 및 특이성을 측정하고 상기 질병 상태의 존재 또는 특정한 성질을 진단하는 결합 패턴(국소화 및 밀도/농도)을 갖는 다수 개의 상기 탐침을 선택함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 임의의 예비 추림 및 준비 단계를 수행한다. 본 발명의 패널의 제조 방법은 공지된 조직 병리학 샘플, 즉 절대 표준에서 마커에 대한 탐침의 결합 패턴을 분석함을 포함한다. 절대 표준 데이터 상에 고안된 분류기를 사용하여 세포측정, 특히 자동화된 세포측정을 위한 분류기를 고안할 수 있다. 따라서, 병리학 분석으로부터 선택된 마커 탐침 세트를 사용하여 세포검사 샘플, 예를 들어 담, 미세침 흡인, 뇨 등으로부터 취한 새로운 훈련 데이터 세트를 준비한다. 특정한 병변들로부터 발산된 세포를 상기 절대 표준과 유사한 방식으로 염색할 것이다. 본 원에 개시된 방법은 최상의 특징 세트를 선택함에 있어서 실험 오차를 제거하는데 그 이유는 절대 표준 조직 병리학 샘플을 근거로 하는 진단의 완전성이 높기 때문이다. 원칙적으로는 패널의 제조를 위해 세포검사 샘플을 사용할 수도 있지만, 이는 세포검사 샘플이 부스러기를 함유하고, 세포검사 샘플에서 세포의 퇴화가 있을 수 있으며 진단 병리학을 임상적으로 확인하기가 어려울 수 있기 때문에 덜 바람직하다.
마커들의 라이브러리는 마커들의 그룹이다. 상기 라이브러리는 임의의 수의 마커를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 라이브러리 중의 마커들의 수는 기술적 및/또는 상업적 실용성, 예를 들어 시편 크기에 의해 제한된다. 예를 들어 일부 실시태양에서 각각의 시편을 패널 중의 모든 마커들에 대해 시험한다. 따라서, 상기 마커들의 수는 시편으로 분할되는 샘플들의 수보다 크지 말아야 한다. 또 다른 기술적 실용성은 시간이다. 전형적으로는, 상기 라이브러리는 60 개미만의 마커를 함유한다. 바람직하게는, 상기 라이브러리는 50 개미만의 마커를 함유한다. 보다 바람직하게는 상기 라이브러리는 40 개미만의 마커를 함유한다. 가장 바람직하게는 상기 라이브러리는 10 내지 30 개의 마커를 함유한다. 가능한 패널 구성원들의 라이브러리는 상기 패널의 성능을 최적화할 기회가 존재하도록 10 개 이상의 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용된 "약"이란 용어는 +/- 3의 마커를 의미한다.
일부 실시태양에서, 라이브러리를 다양한 마커 및 상기 마커들과 일반적인/특정한 질병 상태들간의 상관성에 대한 정보를 함유하는 출처를 참조하여 수득한다. 전형적인 출처로는 실험 결과, 이론 또는 예상 분석 및 문헌 출처, 예를 들어 저널, 책, 카탈로그 및 웹사이트가 있다. 이들 다양한 출처는 조직검사 또는 세포검사를 이용할 수 있으며 세포 유전학, 예를 들어 제자리 하이브리드; 프로테오믹스, 예를 들어 면역조직화학; 세포 측정, 예를 들어 MAC 또는 DNA 배수성; 및/또는 세포 병리학, 예를 들어 형태학에 의존할 수 있다. 상기 마커들은 세포 내 또는 세포 상의 어디에나 국소화될 수 있다. 예를 들어, 마커들은 핵, 세포질 또는 세포막 내 또는 이들 상에 국소화될 수 있다. 상기 마커는 또한 임의의 상기 언급한 위치들 내의 세포 기관에 국소화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 라이브러리는 부적합한 크기를 가질 수도 있다. 따라서, 기본적인 패널 제조 방법을 개시하기에 앞서 하나 이상의 추림 단계가 필요할 수 있다. 상기 추림 단계는 하나 또는 다 수의 연속적인 추림 단계들을 포함할 수 있다. 하나의 추림 단계는 예를 들어 감도 및/또는 특이성에 대해 임의적인 한계를 정함을 포함할 수 있다. 따라서, 실험 또는 예견 감도 및/또는 특이성이 상기 한계 아래에 있는 임의의 마커를 상기 라이브러리로부터 제거할 수 있다. 단독으로 또는 다른 추림 단계와 차례로 수행될 수 있는 다른 전형적인 추림 단계들은 검출 기술 요건, 입수 구속성 및 보고된 결과의 비 재현성에 따를 수 있다. 검출 기술 요건에 관하여, 특정한 마커를 검출하는데 필요한 기계류를 입수할 수 없을 가능성이 있다. 입수 구속성에 관하여, 사전 허가 제한이 특정 마커에 결합하는 탐침의 입수를 어렵거나 불가능하게 만들 수 있다. 일부 실시태양에서, 합당한 성실한 연구를 각각의 마커에 대해 수행한다.
일부 실시태양에서, 기본적인 패널 제조 방법을 시작하기에 앞서, 준비 단계를 수행할 필요가 있을 수 있다. 전형적인 준비 단계로는 라이브러리에서 마커들의 객관적인 정량적 검출을 위해 프로토콜을 최적화하고 조직검사 시편들을 수거함을 포함한다. 상기 마커의 객관적인 정량적 검출을 위한 프로토콜의 최적화는 통상적인 숙련가의 기술 내에 있다. 예를 들어, 필요 시약 및 준비물, 예를 들어 완충제, 시약, 소프트웨어 및 장비를 입수해야 한다. 시약의 농도를 조절할 필요가 있을 수도 있다. 예를 들어, 비-특이적인 결합이 관찰되는 경우, 당해 분야의 숙련가는 탐침 용액의 농도를 희석할 수 있다.
일부 실시태양에서, 조직검사 시편은 절대 표준이다. "절대 표준"이란 용어는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 상기 시편의 조직학적 및 임상적 진단이 공지되어 있음을 의미하는 것으로 공지되어 있다. 상기 절대 표준을 종종 "훈련" 데이터 세트로서 지칭한다. 상기 절대 표준은 식별 과정에 기여할 수 있는 모든 특징들의 측정 또는 신뢰성 있는 평가 세트를 포함한다. 상기와 같은 특징들을 공지된 질병 상태를 갖는 전형적인 수의 환자들로부터 수집한 샘플로부터 수집한다. 상기 표준 샘플은 세포검사 샘플일 수 있지만 패널 선택에는 덜 바람직하다.
상기 조직검사 샘플을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 기법, 예를 들어 생검법에 의해 수득할 수 있다. 일부 실시태양에서, 환자 당 시편의 크기는 라이브러리 중의 각각의 마커를 시험하기 위해 충분한 조직 섹션을 얻을 수 있도록 충분히 클 필요가 있다.
일부 실시태양에서, 시편들을 각각의 특정한 질병 상태를 갖는 것으로 진단된 다수의 환자들로부터 얻는다. 환자 당 하나의 시편을 얻거나, 또는 환자 당 다수의 시편을 얻을 수 있다. 다수의 시편을 환자 개인으로부터 얻는 실시태양에서, 외과 의사의 전문적인 지식은 단일 환자로부터 얻은 각각의 시편이 상기 환자로부터 얻은 다른 시편들과 유사하다는 설정에 의존한다. 시편을 또한 환자 대조군으로부터 얻는다. 상기 환자 대조군은 건강한 환자이거나 또는 시험하려는 일반적인 또는 특정한 질병 상태가 없는 환자일 수 있다.
상기 기본적인 방법의 첫 번째 단계는 목적하는 질병 상태와 관련된 마커들의 라이브러리에 대한 탐침의 결합 감도 및 특이성을 측정하는 것이다. 이 단계에서, 상기 라이브러리 중의 각각의 마커에 특이적인 탐침을 환자의 시편 샘플에 적용시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서 예를 들어 라이브러리 중에 30 개의 마커가 존재하는 경우, 각각의 환자의 시편을 30 개의 샘플로 분할하고 각각의 샘플을 상기 30 개 마커들 중 하나에 특이적인 탐침으로 처리할 것이다. 상기 탐침은 가시화될 수 있는 표지를 함유한다. 따라서, 상기 마커에 대한 탐침의 결합 패턴 및 수준을 검출할 수 있다. 상기 결합 패턴 및 수준을 정량적으로, 즉 분석 장비에 의해서 또는 정성적으로, 인간, 예를 들어 병리학자들에 의해서 검출할 수 있다.
일부 실시태양에서, 객관적 및/또는 정량적인 득점 방법을 개발하여 마커에 대한 탐침의 결합 패턴과 수준을 검출한다. 상기 득점 방법을 발견적으로 고안할 수 있다. 득점 방법을 사용하여 예를 들어 병리학자에 의해 주관적인 해석을 객관화한다. 적합한 득점 방법을 결정하는 것은 통상적인 숙련가의 기술 내에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 득점 방법은 특징들, 예를 들어 마커 탐침 염색의 밀도를 없음, 약함, 보통 또는 강함으로서 분류함을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 이들 특징을 현미경 슬라이드 영상에 대해 실행되는 연산을 사용하여 측정할 수 있다. 전형적인 득점 방법은 비율 및 밀도를, 강도를 없음 = 0, 약함 = 1, 보통 = 2, 강함 = 3으로서 등급화하고, 세포 퍼센트를 0-5% = 0, 6-25% = 1, 26-50% = 2, 51-75% = 3, >75% = 4로서 등급화하고, 이어서 상기 두 등급을 함께 곱하여 수득한 단일 "H 점수"로 통합하는 것이다. 예를 들어, 50% 약한 염색 + 50% 보통 염색은 6 = (1 x 2) + (2 x 2)를 득점할 것이다. 상기 "H 점수"는 본 발명자들 중 한 사람인 고 헐치 케네츠 에스를 기린다.
통상적인 숙련가는 병리학자 및 샘플과 관련된 잠재적인 편향들을 최소화하는 것에 관한 쟁점들을 처리할 수 있다. 예를 들어, 랜덤화를 사용하여 시스템 오류가 있을 가망성을 최소화시킬 수 있다. 맹검법을 사용하여 실험을 수행하는 사람들에 의한 실험 편향을 제거할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 병리학자들에 따른 편차를 이중 맹검 연구를 수행하여 최소화시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 "이중 맹검 연구"란 용어는 편향을 피하기 위해 잘 확립된 방법이며, 이때 데이터 수집 및 데이터 분석을 독립적으로 수행한다. 다른 실시태양에서, 샘플에 따른 편차를 상기 샘플들을 랜덤화함으로써 최소화시킨다. 예를 들어, 샘플들을 병리학자가 분석하기 전에 랜덤화한다. 또한 실험 프로토콜과 관련된 랜덤화가 존재한다. 일부 실시태양에서, 각각의 샘플을 2 명 이상의 병리학자에 의해 분석한다. 각각의 환자에 대해서, 마커에 대한 탐침의 결합에 대한 신뢰성 있는 평가가 얻어진다. 하나의 실시태양에서, 신뢰성을 검사하기 위해 환자 당 2 명의 병리학자를 사용하여, 적임의 병리학자에 의해 상기 진단을 수행한다.
신뢰성 있는 고안 및 신뢰성 있는 통계학적 성능 평가를 수행하기 위해 충분한 수의 샘플을 수집해야 한다. 얼마나 많은 샘플이 신뢰성 있는 고안 및 신뢰성 있는 통계학적 성능 평가의 수행에 충분할 수 있는 지에 대한 결정은 통상적인 숙련가의 기술 내에 있다. 대부분의 표준 분류기 고안 패키지는 상기 성능 평가의 신뢰성을 측정하기 위한 방법들을 가지며 샘플 크기를 신뢰성 있는 평가가 달성될 때까지 점진적으로 증가시켜야 한다. 예를 들어, 신뢰성 있는 고안의 생성에 충분한 평가는 수집된 200 개의 샘플 및 각 샘플로부터 평가된 27 개의 상이한 특징들에 의해 달성될 수 있다.
두 번째 단계는 제한된 다수 개의 탐침을 선택하는 것이다. 상기 선택 단계는 통계학적 분석 및/또는 패턴 인식 기법을 사용할 수 있다. 상기 선택 단계를 수행하기 위해서, 데이터를 데이터베이스에 통합시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 탐침들에 번호를 매겨 상기 탐침의 유효성을 분석하는 동안 그의 작용 방법을 보이지 않게 만들어 편향을 더욱 최소화시킬 수 있다. 상기 방법에 의해 생성되는 다량의 데이터로 인해 엄밀한 통계 기법을 사용한다. 임의의 통계학적 방법을 사용할 수 있으며 통상적인 기술의 통계 전문가는 어떤 방법 및 얼마나 많은 방법이 적합한가를 확인할 수 있을 것이다.
임의의 수의 통계학적 분석 및/또는 패턴 인식 방법을 사용할 수 있다. 데이터의 구성을 처음에는 알지 못하고 상이한 분류기 고안 방법들이 상이한 구성들을 보다 잘 수행하기 때문에, 상기 데이터에 대해 2 개 이상의 고안 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 3 개의 상이한 방법을 사용할 수 있다. 데이터 세트의 통계적 분석 및/또는 패턴 인식 분야의 통상적인 기술 중 하나는 특정한 통계학적 방법이 다른 것들보다 더 효율적인 결과를 제공할 것 같은 데이터 세트 구성의 특징들을 인식할 것이며, 이때 상기 경우에서 효율은 목적하는 수의 탐침에 대해 특정한 수준의 감도 및 특이성을 달성함을 의미한다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 통계학적 분석 및/또는 방법의 효율성이 데이터 의존성임을 알 것이다. 전형적인 통계학적 분석 및/또는 패턴 인식 방법을 하기에 개시한다:
a) C4.5로서 공지된 결정 수 방법.
C4.5는 http://www.cse.unsw.edu.au/∼quinlan/으로부터 ftp를 통해 입수할 수 있는 공개된 도메인 소프트웨어이다. 상기는 특정한 특징들에 대해 결정 역치를 차례로 순차적으로 적용시킴으로써 가장 잘 분류될 수 있는 데이터에 매우 적합하다. 이는 서로 관련이 없는 데이터에 대해 가장 잘 작용하며; 평방편차가 상이한 것을 조건으로 하여 유사한 평균을 갖는 데이터를 처리한다. 상기 C4.5 패키지를 사용하여 본 원에 나타낸 예들을 제공하였다.
b) 선형 식별 분석.
이는 부류들을 가장 잘 분리시키는 특징들의 가중 조합을 발견함을 포함한다. 이러한 방법은 상관이 있는 데이터들에 대해 잘 작용하나, 유사한 평균 및 상이한 평방편차를 갖는 데이터에 대해서는 그렇지 않다. 다수의 통계 패키지들(SPSS, SAS 및 R)을 필요한 성능 평가 및 그래프 출력에 따라 사용하였다. 피셔의 선형 식별 함수를 사용하여 오류 비율을 최소화한 분류기를 수득하였다. 기준 식별 함수를 사용하여 결정 역치의 변화에 따른 감도와 선택성간의 흥정을 나타내는 수신기 작동 특징(ROC) 곡선을 추정하였다.
c) 로지스틱 곡선 회귀.
이는 선형 회귀 모델의 비-선형적인 변형이다: 종속 변수는 로그 홀수 비율(logit)로 치환된다. 식별 분석과 같이 선형 회귀는 선형 모델에 근거한 통계학적 방법의 부류에 속한다. 상기와 같은 모델은 해석 변수들간의 1차적인 관계를 바탕으로 한다.
충분한 수의 샘플들의 경우, 상기 기법 및 소프트웨어 패키지를 사용하여 상기 부류들간의 양호한 식별을 제공하는 특징들의 조합을 찾을 수 있다. 다른 전형적인 통계학적 분석 및/또는 패턴 인식 방법은 SPSS에서 선형 식별 함수 방법 및 R 및 SAS에서 로지스틱 곡선 회귀 방법이다. SPSS는 정식 제품명이며 SPSS 인코포레이티드 본사(SPSS, Inc. Headquarters, 233 S. Wacker Drive, 11th floor, Chicago, Illinois 60606(www.spss.com))에 위치한 SPSS 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다. SAS는 정식 제품명이며 SAS 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute, Inc., 100 SAS Campus Drive, Cary, NC27513-2414, USA(www.sas.com))로부터 입수할 수 있다. R은 정식 제품명이며 프리 소프트웨어(Free Software)로서 더 프리 소프트웨어 파운데이션스 GNU(the Free Software Foundation's General Public License, http://www.r-project.org/)라는 이름으로 입수할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상관성 매트릭스가 수득된다. 상관성은 한 쌍의 변수들간의 1차 관련성의 크기를 측정한다. 상관성 매트릭스는 하나의 마커에 의해 수득된 데이터를 또 다른 마커에 의해 수득된 데이터에 상관시킴으로써 수득된다. 역치 상관 수를 예를 들어 50% 상관성으로 고정시킬 수 있다. 이 경우에, 50% 이상의 상관 수를 갖는 모든 마커들을 상호 관련 있는 마커로서 간주할 것이다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 사용자 공급된 가중 인자들을 사용하여 최적화된 패널을 수득할 수 있다. 가중은 임의의 인자에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 특정한 마커를 비용, 상업적인 고려사항, 오 분류 또는 오류 비율, 지리학적 위치에서 일반적인 질병 상태의 만연, 지리학적 위치에서 특정한 질병 상태의 만연, 탐침의 과잉 및 입수성에 기인하여 다른 것들보다 더 가중시킬 수 있다. 특정한 마커를 다른 것들보다 더 가중하도록 사용자를 장려하는 비용 관련된 일부 인자는 탐침 및 상업적인 입수 쟁점, 예를 들어 허가 가격 및 조건의 비용이다. 특정한 마커를 다른 것들보다 더 가중하도록 사용자를 장려하는 상업적인 고려사항과 관련된 일부 인자는 연구 개발(R&D) 시간, R&D 비용, R&D 위험률, 즉 탐침이 작용할 확률, 최종 분석 장비의 비용, 최종 성능 및 매매 시기이다. 검출 패널에서, 예를 들어 일부 마커를 다른 것들보다 더 가중하도록 사용자를 장려하는 오 분류 또는 오류 비율과 관련된 일부 인자는 상기가 거짓 음성을 최소화하는데 바람직할 수 있다는 것이다. 다른 한편으로, 식별 패널에서, 거짓 양성을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 마커를 다른 것들보다 더 가중하도록 사용자를 장려하는 지리학적 영역에서 일반적인 또는 특정한 질병 상태의 만연과 관련된 일부 인자는 일부 지리학적 위치들에서 특정한 일반적인 또는 특정한 질병의 발생률이 더 또는 덜 우세하다는 것이다. 과잉에 관하여, 일부의 경우에 상기 패널이 과잉물을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 어떤 이유로 인해 하나의 탐침이 검출되지 않는 경우, 패널 중의 마커들의 생물학적 변이성에 기인하여 질병 상태가 여전히 다른 마커에 의해 검출될 것이다. 일부 실시태양에서, 바람직하게 과잉인 마커들을 보다 크게 가중시킬 수 있다.
본 발명은 비용 또는 공급 문제가 최선의 조합을 허용할 수 없는 특징들의 유용성에 융통성이 있다. 하나의 실시태양에서, 대체 조합을 찾기 위해서 본 발명을 이용 가능한 특징들에 간단히 적용시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 연산 방식을 사용하여 최소 비용 해법에 도달하도록 비용 가중치를 선택 과정에 포함시킬 수 있게 하는 특징들을 선택한다. 실시예에, 수집된 모든 마커들 중에서 선택된 조합 또는 단지 상업적으로 바람직한 탐침 그룹에 대한 마커 성능 평가를 나타낸다. 상기 실시예는 또한 어떻게 C4.5 패키지가 높은 비용을 기준으로 특정한 탐침들을 하향 가중시키기는데 사용될 수 있는가를 설명한다. 이러한 탐침 조합뿐만 아니라 최적의 조합도 수행할 수 없지만, 성능은 비용이 중요한 인자인 상황에서 허용될 수도 있다.
사용된 방법들 중 일부는 상기 부류들에 가중치의 적용을 허용한다. 이는 수(tree) 디자인이 비용을 최적화할 수 있는 C4.5에서 이용될 수 있다. 또한, 식별 함수 방법은 목적하는 거짓 양성 또는 거짓 음성 확률을 제공하기 위해 사용될 수 있는 단일 매개변수 출력을 제공한다. 상이한 역치 조절점들에 대한 이들 매개변수들의 플롯은 수신기 작동 특징(ROC) 곡선으로서 공지되어 있다. ROC 곡선은 분류기의 상이한 역치 수준에 대해서 참 양성 점수에 대한 거짓 양성의 추정 퍼센트를 나타낸다.
많은 일반적인 질병 상태의 이질적인 특징으로 인해, 시험이 충분한 감도, 특이성, 양성 예견 치(양성 예견 치 = 참 양성/(참 양성 + 거짓 양성)) 및 음성 예견 치(음성 예견 치 = 참 음성/(거짓 음성 + 참 음성))를 가져서 집단 수준 선별로서 이들의 사용을 정당화하도록 패널을 과잉 정도로 제작할 수 있다. 그러나, 국소 및 지역적인 차이는 세계 시장의 상이한 구획들에서 상기 시험의 특정한 용도를 지시할 수 있으며, 따라서 일정한 시장에 대한 최종 패널 시험의 제작에 사용되는 기준에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 임상적 유용성의 최적화는 극도의 중요성을 갖는 반면, 입수 가능성(비용), 기술 적성, 실험실 및 헬쓰케어 준비자 방책, 작업흐름 쟁점, 인력 요건, 및 탐침 및 표지의 유용성을 포함한 국소적인 인자들은 패널에 사용되는 마커들의 최종의 국소적인 선택에 기여할 것이다. 널리 공지된 선형 식별 함수 분석을 사용하여 모든 잠재적인 선택 인자들을 포함시키고 평가하며, 이에 의해 각각의 국소 인자들을 방정식의 항으로 나타내고 각각을 그의 국소적으로 측정된 유의수준에 따라 가중시킨다. 이런 식으로, 하나의 세계 지역에 사용하기 위해 최적화된 패널 시험은 다른 지역에 사용하기 위해 최적화된 패널 시험과 상이할 수 있다.
일단 상술한 방법을 사용하여 검출 또는 식별 패널을 고안하였으면, 다음 단계는 공지된 세포검사 샘플을 사용하여 상기 패널을 확인하는 것이다. 확인에 앞서, 임의의 최적화 단계를 수행할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 세포검사 샘플의 수집 방법을 개선시킬 수 있다. 이는 샘플을 환자로부터 수득하는 방법뿐만 아니라 상기 세포검사 샘플의 혼합 방법을 포함한다. 다른 실시태양에서, 세포검사 제공 방법을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 최적의 정착액(보존 유체) 또는 운송 유체를 동정할 수 있다.
절대 표준 조직 샘플을 사용하여 제조한 패널의 확인에 사용되는 세포검사 샘플은 진단이 공지된 세포검사 샘플이다. 이러한 샘플을 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 임의의 방법을 사용하여 수집할 수 있다. 예를 들어, 담 샘플을 자발적인 생성, 유도된 생성에 의해서 및 담 생성을 촉진시키는 작용제의 사용을 통해 수집할 수 있다. 상기 샘플을 패널 중의 각각의 탐침과 접촉시키고 상기 탐침의 결합 수준 및 패턴을 분석하여 상기 패널의 성능을 측정한다. 일부 실시태양에서, 상기 패널을 추가로 최적화하는 것이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 상기 패널로부터 탐침을 제거하는 것이 필요할 수도 있다. 또는, 상기 패널에 추가적인 탐침의 첨가가 필요할 수도 있다. 또한, 상기 패널 상의 하나의 탐침을 또 다른 탐침으로 교체할 필요가 있을 수도 있다. 새로운 탐침을 첨가하는 경우, 상기 탐침은 상관성 매트릭스로부터 측정된 바와 같은 상관성 마커일 수 있다. 한편으로, 상기 탐침은 작용 상 유사한 마커일 수 있다. 일단 상기 패널이 최적화되면, 상기 패널을 임상 연구에서 추가의 시험을 위해 진행시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 상기 패널을 최적화시키는 것이 필요하지 않다. 세포검사 샘플에 의한 결과가 조직검사 샘플로부터의 결과와 상관이 있는 경우, 상기 패널을 최적화할 필요가 없을 수 있으며 상기 패널을 임상 연구에서 추가의 시험을 위해 진행시킬 수 있다.
4. 사용 방법
일단 상술한 방법을 사용하여 패널이 수득되었으면, 상기를 세포검사 샘플에 적용시킬 수 있다. 상기 방법을 설명하기 위해서, 암, 특히 폐암을 예시할 것이다. 유사한 단계 및 과정들이 다른 질병 상태들에 적용될 것이다. 특정한 병변들로부터 발산된 세포를 유사한 방식으로 염색할 것이며 상기 세포는 세포검사 샘플, 예를 들어 미세침 흡인, 담, 뇨에서, 상기 패널의 수득에 사용된 조직 병리학 샘플과 유사한 방식으로 나타날 것이다.
본 발명의 기본적인 방법은 2 개의 단계를 포함한다. 첫 번째, 질병 세포를 함유하는 것으로 의심이 가는 세포검사 샘플을 다수의 작용제를 함유하는 패널과 접촉시키며, 이때 상기 작용제들은 각각 질병 마커에 정량적으로 결합한다. 이어서, 질병 마커에 대한 각 작용제의 결합 수준 또는 패턴을 검출한다. 상기 검출 결과를 사용하여 일반적인 질병의 존재를 진단하거나 또는 특정한 질병 상태를 식별할 수 있다. 선택적인 예비 단계는 세포검사 샘플에서 질병의 검출 또는 질병 상태들간의 식별을 도울 작용제들의 최적화된 패널을 확인하는 것이다.
세포검사 시편은 비 제한적으로 체액, 예를 들어 혈액, 뇨, 척수액, 및 림프계로부터 수집된 세포 샘플; 상피 세포 수준 기관계, 예를 들어 허파관, 예를 들어 폐 담, 뇨 관, 예를 들어 방광 세척물, 생식기 관, 예를 들어 경부 Pap 바른 표본, 및 위장 관, 예를 들어 결장 세척물; 및 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐와 같은 기관 및 계 중의 충실성 조직 부위로부터의 미세침 흡인; 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐와 같은 기관 및 계 중의 충실성 조직 부위로부터의 생검; 및 외과적 생검으로부터의 조직과 같은 조직검사 시편을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 작용제 패널은 세포검사 샘플에서 악성 세포의 정확한 검출을 허용하는 임의의 수의 작용제를 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 분자 마커는 악성 세포의 검출을 돕는 임의의 분자일 수 있다. 마커를 상기 마커의 발현 수준 또는 패턴의 변화와 관련 있는 다수의 상이한 기준을 근거로 패널에 포함시키기 위해 선택할 수 있다. 발현 변화가 질병 진행 중에 일찍 발생하고, 대부분의 종양 세포에 의해 나타나며, 소정의 종양 유형의 75%를 초과하여, 가장 바람직하게는 90%를 초과하여 검출되고/되거나 암의 조직 유형들간의 식별을 허용하는 분자 마커가 바람직하다.
상기 기본적인 방법의 첫 번째 단계는 세포검사 샘플에서 작용제 패널의 발편 수준 또는 패턴의 변화를 검출하는 것이다. 이 단계는 전형적으로는 상기 세포검사 샘플을 작용제, 예를 들어 표지된 다클론 또는 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 핵산 탐침과 접촉시키고 개별적인 세포에서 신호를 관찰함을 포함한다. 신호 변화가 존재하는 세포의 검출은 표지 탐침이 향하는 분자 마커의 발현 수준 변화를 암시한다. 상기 변화는 검사하려는 조직 또는 부위로부터 수득된 비 악성 세포에 대한 발현 수준의 증가 또는 감소를 기본으로 한다.
작용제 패널의 발현 수준 또는 패턴의 변화에 대한 분석은 숙련가가 악성 세포가 세포검사 샘플 중에 존재하는지의 여부를 높은 감도와 높은 특이성으로 측정할 수 있게 한다. "감도"란 용어는 질병이 있는 사람이 임상 시험에 의해 정확하게 확인될 조건부 확률을 지칭한다(참 양성 및 거짓 음성 결과의 수에 의해 나뉘어진 참 양성 결과의 수). 따라서, 암 검출 방법이 높은 감도를 갖는 경우, 검출된 암의 퍼센트는 높다, 예를 들어 80%, 바람직하게는 90% 이상이다. "특이성"이란 용어는 질병이 없는 사람이 임상 시험에 의해 정확하게 확인될 조건부 확률을 지칭한다(참 음성 및 거짓 양성 결과의 수에 의해 나뉘어진 탐 음성 결과의 수). 따라서, 암 검출 방법이 높은 특이성, 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 특이성을 갖는 경우, 상기 방법이 생성시키는 거짓 양성의 퍼센트는 낮다. "세포검사 샘플"이란 용어는 환자의 세포를 함유하는 상기 환자로부터 수집된 임의의 샘플을 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 세포검사 샘플의 예로는 체액, 상피 세포 수준 기관 계 세척물, 찰과 표본, 솔질 표본, 바른 표본 또는 삼출 표본, 및 미세침 흡인 및 생검이 있다.
본 발명에 개시된 마커들의 용도는 적합한 세포검사 샘플을 통상적으로 얻을 수 있고 상기 샘플들을 후속 평가를 위해 적합하게 보존할 수 있음을 나타낸다. 상기 세포검사 샘플을 가공하여 적합한 보존제 중에서 보관할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포검사 샘플을 보존제를 함유하는 바이알에 수집한다. 상기 보존제는 세포 형태를 유지하고 세포 단백질 및 핵산의 분해를 억제 또는 차단하는 것으로 공지된 임의의 분자 또는 분자들의 조합이다. 적합한 고정을 위해서, 상기 샘플을 상기 수집 부위에서 고속으로 혼합하여 상기 샘플을 분해시키고/시키거나 차단 물질, 예를 들어 점액을 분해시켜 상기 세포를 보존제에 노출시킬 수 있다.
일단 시편의 수득되었으면, 상기를 적합한 혼합 장치를 사용하여 균질화시키는 것이 바람직하다. 이는 하나 이상의 시험 부위로 분액들을 보낼 뿐만 아니라 다수의 슬라이드 및/또는 하나의 슬라이드 상의 다수의 침착을 준비할 가능성을 포함하여, 복합적인 목적에 분액을 사용할 것을 허용한다. 사용 전 상기 시편 및 각 분액의 초기 균질화는 각각의 개별적인 슬라이드가 실질적으로 동일한 세포 분포를 갖게 하여, 하나의 슬라이드에서 또 다른 슬라이드의 결과들에 대한 비교를 의미 있게 할 것이다.
분석 시편의 준비는 샘플을, 비 제한적으로 바른 표본, 원심분리 또는 세포 단층의 침착을 포함한 방법을 사용하여 현미경 슬라이드에 적용시킴을 포함한다. 상기와 같은 방법은 수동적이거나, 반-자동적이거나 또는 완전히 자동적일 수 있다. 세포 현탁액을 흡인하여 세포를 필터 및 추가의 평가를 위해 가공될 수 있는 준비된 슬라이드로 옮겨진 세포의 단층 상에 침착시킬 수 있다. 상기 과정을 반복함으로써 추가적인 슬라이드들을 필요에 따라 준비할 수 있다. 본 발명은 슬라이드 당 하나의 분자 마커의 검출을 포함한다. 슬라이드 당 여러 개의 분자 마커의 검출이 또한 고려된다. 바람직하게는, 슬라이드 당 하나 내지 6 개의 마커가 검출된다. 일부 실시태양에서, 슬라이드 당 2 개의 마커가 검출된다. 다른 실시태양에서, 슬라이드 당 3 개의 마커가 검출된다.
본 발명은 통상적인 숙련가가 이용할 수 있는 임의의 다수의 방법을 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 분자 마커 발현의 변화를 검출함을 고려한다. 세포검사 샘플에서 상기 분자 마커의 발현 수준 또는 패턴의 변화에 대한 검출은 일반적으로 세포검사 샘플을 다클론 또는 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 패널 중의 분자 마커를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열, 집합적으로 "탐침" 또는 표지와 접촉시킴을 포함한다. 전형적으로, 상기 탐침 및 패널 요소들은 상기 탐침이 분자 마커와 반응하는 경우 신호를 방출하도록("표지된 탐침") 작용적으로 연결된다. 본 발명에 의해 고려되는 표지는 신호를 방출하거나 낼 수 있고 샘플 중의 성분을 확인할 수 있게 하는 임의의 표지이다. 바람직한 표지는 방사성, 형광, 발색 또는 효소 잔기를 포함한다. 따라서, 가능한 검출 방법은 비 제한적으로 면역세포화학; 프로테오믹스, 예를 들어 면역화학; 세포유전학, 예를 들어 제자리 하이브리드화, 및 형광 제자리 하이브리드화; 방사성검출, 세포측정 및 전계 효과, 예를 들어 MAC 및 DNA 배수성(자동화된 컴퓨터에 의한 세포측정을 사용한 화학량론적으로 염색된 핵 DNA의 정량분석); 및 세포병리학, 예를 들어 형태학을 근거로 하는 정량적인 세포병리학을 포함한다. 상기 표지된 탐침에 의해 발생된 신호는 바람직하게는 의료 종사자 또는 기술자에 의해 검출이 허용될 정도로 충분한 강도를 갖는다.
일단 슬라이드가 준비되었으면, 의료 종사자는 암 진단의 특징인 마커 발현 변화를 나타내는 세포를 동정하기 위해 상기 슬라이드를 현미경에 의해 관찰한다. 상기 의료 종사자는 관심 세포를 동정하기 위해서 영상 분석 시스템과 자동화된 현미경을 사용할 수 있다. 상기 데이터의 분석은 의사가 명확한 진단을 수행하고 최적의 치료 접근법을 선택하는 것을 돕는 정보 관리 시스템 및 연산 방식을 사용할 수 있다. 의료 종사자는 또한 표지된 작용제의 존재를 검출할 수 있는 장치 대를 사용하여 상기 샘플을 검사할 수 있다.
분자 진단 패널 분석은 표지된 세포 및/또는 조직 섹션을 갖는 하나 이상의 유리 현미경 슬라이드를 생성시킬 것이다. 이들 (세포)병리학 다중 표지된-세포 제제를 객관적으로 및 임상적으로 의미 있는 결과를 사용하여 평가하기 위한 인간 전문가의 도전은 임의의 인간의 경우 실질적으로 이겨내기 어려운 검출 및 인식 문제이다.
컴퓨터 지원된 영상화 시스템(즉 포토닉 마이크로스코프스(Photonic MicroscopesTM)을 개발 사용하여 탐침-표지된 세포 및 조직의 양 및 위치를 정량적으로 및 재현 가능하게 평가할 수 있다. 상기와 같은 포토닉 마이크로스포프스TM는 인간의 가시화에 의해서 필적할만한 감도 및 정밀도로 수득할 수 없는 세포 기준 탐침 함량 및 국소화 데이터를 검출하기 위해 로봇식 슬라이드-취급 능력, 데이터 관리 시스템(예를 들어 의료 정보 과학) 및 정량적인 디지털(광학 및 전자) 영상 분석 하드웨어 및 소프트웨어 모듈을 겸비한다. 이러한 탐침 데이터를 사용하여 다양한 질병 상태에 대해서 세포 샘플 각각의 세포 수준 마커에서의 상기 샘플들의 관련된 특징 및 차이를 근거로 상기 세포 샘플들을 특성화 및 식별할 수 있다.
본 발명의 방법은 분자 진단 패널을 세포 수준 시편 및 샘플에 적용시키고 컴퓨터 지원된 영상화 시스템을 후속적으로 사용하여 상기 분자 진단 패널 시험의 결과를 정량 분석 및 보고하는 방법이다. 상기와 같은 영상화 시스템을 사용하여 세포 수준 샘플을 평가할 수 있으며, 상기 시스템에서 소정의 슬라이드 수준 샘플에 대해 다수의 탐침들을 동시적으로 사용하고 상기 탐침들은 현미경 세포검사 또는 조직 검사 슬라이드 상에서 색상에 의해 식별되기 때문에 상기 탐침들을 별도로 분석, 정량화 및 보고할 수 있다.
상기 샘플 중의 표지된 작용제에 의해 발생된 신호를, 상기 신호가 적합한 유형의 것이고 충분한 강도를 갖는다면, 표준 현미경 또는 컴퓨터 지원식 현미경을 사용하여 인간 관찰자(예를 들어 병리학자)가 검출할 수 있다[167]. 상기 컴퓨터-지원식 현미경은 현미경 작동(예를 들어 단 이동, 초점 맞추기)에 대한 마우스-구동식 제어를 핵심 기능(예를 들어 슬라이드 주사 패턴)의 컴퓨터화된 자동화와 통합시키는 인간 환경 공학적, 컴퓨터 인터페이스 접촉된 워크스테이션이다. 집중된 데이터 관리 시스템은 관련된 환자 정보뿐만 아니라 모든 시편 선별 및 병리학자 관찰 결과를 저장, 정리 및 전시한다. 바코드로 찍고 샘플 슬라이드에 부착된 확인 번호는 데이터 베이스에서 각 샘플을 독특하게 확인시키며, 상기 샘플을 원래의 시편 및 환자와 관련시킨다.
바람직한 실시태양에서 샘플 중의 표지된 작용제에 의해 발생된 신호는 집중된 데이터 관리 시스템에 인터페이스로 연결된 자동화된 영상 분석 시스템 또는 포토닉 마이크로스코프를 사용하여 검출되고 정량화될 것이다. 상기 포토닉 마이크로스코프는 현미경 작동의 충분한 자동화된 소프트웨어 제어를 제공하며, 매우 희미한 신호 또는 방사성표지된 잔기로부터의 신호와 같이, 인간 관찰자에 의해 검출될 수 없는 신호의 정량분석에 적합한 검출기 및 다른 요소들을 포함한다. 검출된 신호의 위치를 자동화된 장비에 의한 신속한 재배치, 및 컴퓨터-지원된 현미경을 사용하는 인간의 관찰을 위해 전자적으로 저장한다[168].
집중된 데이터 관리 시스템은 바-코드화된 확인 번호를 사용하여 모든 환자 및 샘플 데이터를 모아 보관한다. 상기 데이터는 다수의 사이트로부터 비 동시적으로 습득될 수 있으며, 인간 세포학자 및/또는 자동화된 분석기에 의해 다수의 관찰 및 분석으로부터 유래될 수 있다. 이러한 데이터는 앞서 균질화된 단일의 환자 시편의 분액들을 나타내는 다수의 샘플 슬라이드로부터의 결과를 포함할 수 있다. 상기 데이터의 일부 또는 전부를 병원의 실험실 정보 시스템으로 또는 상기로부터 이동시켜 보고, 저장, 광고 또는 조절 요건을 만족시킬 수 있다. 패널 시험과 인간 관찰로부터의 통합된 결과를 갖는 단일의 포괄적인 보고서가 만들어져 하드 카피로 또는 네트워크된 컴퓨터 또는 인터넷을 통해 의사에게 전자적으로 전달될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 상이한 질병들, 예를 들어 암의 상이한 조직 유형들을 차별적으로 식별할 수 있게 한다. "조직 유형"이란 용어는 특정한 질병 상태들을 지칭한다. 일반적인 질병 상태에 따라, 하나 또는 여러 개의 조직 유형들이 있을 수 있다. 예를 들어, 폐암은 비 제한적으로 편평 세포 암종, 선암종, 대 세포 암종, 소 세포 암종 및 중피종을 포함한다. 환자가 걸린 암의 조직 유형에 대한 지식은 의료 종사자가 상기 질병을 국소화 및 특성화하고 광학적 치료 전략을 결정하는 것을 돕기 때문에 매우 유용하다.
특정한 질병 상태를 측정하기 위해서, 특정한 질병 상태들을 식별할 수 있게 하는 마커들의 패널을 선택한다. 예를 들어, 분자 마커의 패널 내에서 암의 특정한 조직 유형을 가리키는 발현 패턴을 확인할 수 있다. 상기 분자 마커 패널의 발현 수준의 검출은 상술한 방법들에 의해 성취된다. 바람직하게는 1 내지 20 개의 분자 마커 패널을 사용하여 폐암의 다양한 조직 유형들을 식별한다. 그러나, 가장 바람직하게는 4 내지 7 개의 마커를 사용한다. 마커 발현 패턴을 근거로 상이한 조직 유형들의 식별을 돕기 위해 결정 수를 개발할 수 있다.
세포검사 샘플에서 악성 세포의 검출을 허용하는 것 이외에, 본 발명은 상기 질병 상태의 분자 특성화에 대한 유용성을 갖는다. 상기와 같은 정보는 종종 예후의 의미를 가지며 의사가 특정 환자에 대한 최적의 치료 접근법을 선택하는데 일조할 수 있다. 또한, 본 발명에 개시된 마커의 패널은 환자의 재발을 모니터하거나 또는 질병의 치료에 사용될 요법의 효능을 측정하는데 유용할 수 있다.
비 제한적인 예로서, 폐암의 존재를 폐암 검출 패널에 의해 검출할 수 있으며 폐암의 특정한 유형을 식별 패널에 의해 검출할 수 있다. 의료 종사자가 악성 세포가 세포검사 샘플 중에 존재함을 결정한 경우, 폐암의 조직 유형에 대한 추가의 분석을 수행할 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 폐암의 조직 유형으로는 비 제한적으로 편평 세포 암종, 선암종, 대 세포 암종, 소 세포 암종 및 중피종이 있다. 도 1은 폐암의 상이한 조직 유형들을 확인하기 위해 패널에 포함시키기에 바람직한 마커들인 분자 마커들을 예시한다. "%" 표시된 컬럼은 특정 마커를 발현하는 종양 시편의 퍼센트를 가리킨다.
폐암의 다양한 조직 유형들을 측정함에 있어서, 마커의 상대적인 발현 수준을 분석한다. 도 2는 상이한 마커들을 사용하여 암의 상이한 조직 유형들을 어떻게 식별할 수 있는지를 예시한다. 이 표에서, SQ는 편평 세포 암종을 가리키고, AD는 선암종을, LC는 대 세포 암종을, SC는 소 세포 암종을, ME는 중피종을 가리킨다. 각 세포에 나타낸 숫자들은 다른 세포 유형에 대한 하나의 세포 유형에서의 마커 변화 도수를 나타낸다. 표에 포함되기 위해서, 상기 비율은 2.0 이상 또는 0.5 미만이어야 한다. 100 보다 큰 수는 일반적으로 두 번째 마커가 발현되지 않음을 가리킨다. 상기와 같은 경우에 분석을 위해서 분모를 0.1로 고정시켰다. 마지막으로, 빈 세포는 발현에 차이가 없거나 또는 발현 데이터의 부재를 나타낸다.
수집된 데이터를 분석하는 한 가지 방법은 결정 수를 작성하는 것이다. 반응식 1 내지 4는 발현 패턴을 사용하여 폐암의 조직 유형을 차별적으로 결정할 수 있게 하기 위해서 작성될 수 있는 결정 수의 예들이다. 본 발명은 결코 반응식 1 내지 4에 나타낸 결정 수들로 제한되지 않는다. 마커의 상대적인 발현 수준은 상이한 조직 유형의 악성 세포에서 분자 마커의 발현 수준으로서 보다 높거나, 보다 낮거나 동일(ND)할 수 있다. 각각의 반응식은 분자 마커의 지시된 패널을 사용하여 폐암의 5 가지 조직 유형들을 구별할 수 있게 한다.
예를 들어, 반응식 1에서 패널은 HERA, MAGE-3, 트롬보모듈린 및 사이클린 D1으로 이루어진다. 먼저 샘플을 HERA쪽으로 배향된 표지된 탐침과 접촉시킨다. HERA의 발현이 대조군보다 낮으면, 상기 시험은 폐암의 조직 유형이 중피종(ME)임을 가리킨다. 그러나, 상기 발현이 대조군보다 높거나 이와 동일한 경우, 상기 샘플을 MAGE-3쪽으로 배향된 탐침과 접촉시킨다. MAGE-3의 발현이 대조군보다 낮으면, 상기 샘플을 사이클린 D1쪽으로 배향된 표지된 탐침과 접촉시키며 소 세포 암종(SC) 또는 선암종(AD)의 결정이 가능하다. MAGE-3의 발현이 대조군보다 높거나 이와 동일하다면, 상기 샘플을 트롬보모듈린쪽을 향해 배향된 표지된 탐침과 접촉시키며, 편평 세포 암종(SC) 또는 대 세포 암종(LC)의 결정이 가능하다.
Figure 112005013102219-PCT00004
반응식 2에서, 패널은 E-카데린, 폐 계면활성제 B 및 트롬보모듈린으로 이루어진다. 먼저 샘플을 E-카데린쪽으로 배향된 표지된 탐침과 접촉시킨다. E-카데린의 발현이 대조군보다 낮으면, 상기 시험은 폐암의 조직 유형이 중피종(ME)임을 가리킨다. 그러나, 상기 발현이 대조군보다 높거나 이와 동일한 경우, 상기 샘플을 폐 계면활성제 B쪽으로 배향된 탐침과 접촉시킨다. 폐 계면활성제 B의 발현이 대조군보다 낮으면, 상기 샘플을 트롬보모듈린쪽으로 배향된 표지된 탐침과 접촉시키며 편평 세포 암종(SQ) 또는 대 세포 암종(LC)의 결정이 가능하다. 폐 계면활성제 B의 발현이 대조군보다 높거나 이와 동일하다면, 상기 샘플을 CD44v6쪽으로 배향된 표지된 탐침과 접촉시키며 선암종(AD) 또는 소 세포 암종(SC)의 결정이 가능하다. (결정 수의 추가의 예에 대해서 반응식 3 및 4를 참조하시오).
Figure 112005013102219-PCT00005
Figure 112005013102219-PCT00006
Figure 112005013102219-PCT00007
바람직한 방법은 발현 패턴의 차이가 폐암의 다양한 조직 유형들간의 식별을 허용하는 분자 마커의 패널을 사용함을 포함한다.
다수의 상이한 결정 수들을 작성하여 마커 발현의 패턴을 분석할 수 있다. 이러한 정보는 의사나 다른 헬쓰케어 준비자에 의해 사용되어 환자 관리를 결정하고 최적의 치료 전략을 선택할 수 있다.
5. 패널 분석의 결과에 대한 보고
상기 패널 분석의 결과를 여러 방식으로 보고할 수 있다. 예를 들어, 상기 결과를 간단히 "예" 혹은 "아니오"의 결과로서 보고할 수 있다. 한편으로, 상기 결과를 시험 결과가 정확할 확률로서 보고할 수도 있다. 예를 들어, 검출 패널 연구의 결과는 환자가 일반적인 질병 상태를 가질지 혹은 갖지 않을지를 가리킬 수 있다. 상기 패널이 또한 특이성과 감도를 보고하기 때문에, 결과를 또한 환자가 일반적인 질병 상태를 가질 확률로서 보고할 수 있다. 식별 패널 분석의 결과는 특정한 질병 상태들을 식별할 것이다. 상기 결과를 상기 특정 질병 상태의 존재 여부에 대해서 "예" 혹은 "아니오"로서 보고할 수 있다. 한편으로, 상기 결과를 특정 질병 상태가 존재할 확률로서 보고할 수 있다. 한 환자의 시편에 대해 다수의 식별 패널 분석을 수행하고 존재하는 질병 상태가 다른 가능성에 대해 특정 질병 상태일 확률의 프로파일을 보고하는 것도 또한 가능하다. 다른 가능성은 거짓 양성을 또한 포함할 수 있다.
상기 존재하는 각 특정 질병 상태의 확률 프로파일을 생성시키는 실시태양에서, 여러 가지 가능한 결과들이 존재한다. 예를 들어 상기 확률이 전부 매우 작은 확률일 수 있다. 이 경우에, 의사가 환자의 시편 진단이 거짓 양성인 것으로 결정하는 것이 가능하다. 또한 상기 확률이 전부 80 내지 90% 이상인 것을 제외하고 낮은 것도 또한 가능하다. 이 경우에, 의사가 상기 시험이 환자가 높은 확률을 가리키는 특정 질병 상태를 가짐을 입증한다고 결정할 수 있다. 상기 확률의 대부분이 낮지만, 유사하게 높은 확률이 2 개의 특정 질병 상태에 대해 보고될 수도 있다. 이 경우에, 의사는 정확한 질병 상태를 확인할 수 있도록 보다 광범위한 패널 시험을 권장할 수 있다. 또 다른 가능성은 보고된 모든 확률이 낮고, 하나만 나머지보다 약간 높지만 80-90% 범위 내에 있기에는 충분히 높지 않다는 것이다. 이 경우에, 의사는 정확한 질병 상태를 확인하고/하거나 상이한 암 유형의 떨어져 있는 1기 종양으로부터 전이성 암을 배제시키기 위해서 보다 광범위한 패널 시험을 권장할 수 있다.
하기의 실시예는 질병 검출 패널, 질병 식별 패널의 선택, 상기 패널들의 확인, 및 질병의 선별 및 상기 질병의 상이한 서브유형들간의 식별을 위한 진료소에서의 상기 패널의 용도를 위한 본 발명의 방법을 예시한다. 이러한 예시적인 실시예를 위해서, 부분적으로는 세계 보건에 대한 중요성으로 인해 폐암을 선택하였으나, 유사한 과정이 상기 일반적인 내용에 따라 다른 유형의 암과, 감염성, 퇴행성 및 자가면역 질병에도 적용될 것임을 알 것이다.
I. 폐암
본 발명의 방법을 사용하여 폐암 검출 패널뿐만 아니라 단일 폐암 유형의 특정한 식별 패널을 개발하였다. 폐암은 2 개의 주요 군으로 분리될 수 있는 질병들의 매우 복잡한 수집물이다. 모든 폐암의 약 70 내지 80%를 차지하는 비-소 세포 폐암종(NSCLC)은 편평 세포 암종, 선암종 및 대 세포 암종을 포함한 3 개의 주요 조직 유형들로 추가 세분될 수 있다. 폐암 환자의 나머지 20 내지 30%는 소 세포 폐 암종(SCLC)을 나타낸다. 또한, 늑막 공간의 악성 중피종이 석면에 노출된 개인에서 나타날 수 있으며 종종 널리 확산되어 다른 가슴 조직을 침습할 것이다. 폐암의 상이한 형태들은 폐의 상이한 영역에 국소화되고, 상이한 예후를 가지며 다양한 형태의 요법에 상이하게 반응하는 경향이 있다.
세계 보건 기구의 최근 통계(Globocan 2000)에 따르면, 폐암이 남성과 여성 모두에 있어서 가장 흔한 치명적 암이 되고 있으며, 매년 124만 건의 새로운 사례 와 110만 명이 사망하는 것으로 추정된다. 미국 국립 암 연구소의 보고에 따르면 미국에서만 대략 186,000 건의 새로운 폐암 사례가 있고 매년 162,000 명의 상기 질병으로 사망하며, 이는 모든 암 관련 사망률의 25%를 차지한다고 한다. 미국에서, 폐암 환자의 전체 1 년 생존률은 40%이지만, 14%만이 5년을 생존한다. 세계의 다른 지역에서, 5 년 생존률은 현저히 낮아진다(영국에서 5%). 폐암의 높은 사망률은 대부분의 환자(85%)가 치료 선택권이 제한되고 질병이 전이되었을 것 같은 시기의 진행된 병으로 진단된다는 사실에 기인할 수 있다. 이들 환자에서 5 년 생존률은 진단 시 단계에 따라 2 내지 30%이다. 이는 환자가 조기 진단되어 5 년 생존률이 75% 이상인 경우와 뚜렷이 대조된다. 다수의 새로운 화학요법제가 진행된 폐암의 치료를 위해 임상 실행에 도입된 것은 사실이지만, 지금까지 어떤 것도 장기 생존률에 현저한 개선을 제공하지 못하고 있다. 초기 단계의 질병을 갖는 환자는 추정 상 수술에 의해 치유될 수 있다 하더라도, 이들은 제 2의 암이 나타날 확률이 높기 때문에 여전히 상당히 위험한 상태에 있다. 따라서, 폐암 환자의 경우 조기 검출 및 치료에 이은 적극적인 모니터링이 사망률 및 비용의 감소와 함께 장기 생존률에 현저한 개선을 이룰 최상의 기회를 제공한다.
요즘에 환자는 X-선 상의 의심스러운 병변 때문에 또는 환자가 증상을 나타내기 때문에 폐암을 가진 것으로 짐작된다. 그 결과, 대부분의 환자들은 비교적 늦은 단계의 질병으로 진단된다. 또한, 대부분의 방법들은 조기 질병 검출과 관련하여 충분한 감도가 부족하기 때문에 미국 국립 암 연구소(NCI), 국립 보건 연구소의 현재 정책은 상당히 위험한 환자의 집단에서조차도 폐암에 대한 선별을 권장 한다. 그러나, 본 발명의 상기 실시태양에서는 폐암의 조기 검출을 위해 담 세포검사를 사용하여 비교적 비 침습적이고, 보다 효과적이며 비용 효과적인 수단을 제공한다.
담 세포검사의 특이성은 비교적 높다. 최근의 연구는 노련한 세포검사 기사들이 고도의 정확성과 신뢰성으로 악성 또는 심한 이상 세포를 인식할 수 있음을 지적하였다[10]. 검출률은 80 내지 90% 정도로 높을 수 있지만, 샘플을 비교적 진행된 질병의 환자로부터 수집하는 경우[11,12], 전체적으로, 담 세포검사는 단지 30 내지 40%의 감도를 갖는다[13,14]. 담 세포검사의 낮은 감도는 시편의 수득 및 준비에 비용이 비교적 많이 든다고 가정하면 특히 중요하다. 더욱 또한, 암 검출의 실패는 치료를 상당히 지연시켜 치유 달성 기회를 감소시킬 수 있다.
"위험한 상태" 집단의 선택이 또한 선별 도구로서 담 세포검사의 가치에 영향을 미칠 수 있다. 상당히 위험한 상태인 개인으로는 앞서 폐암 진단을 받은 자, 장기 흡연자 또는 이전 흡연자(>30 갑-해) 및 석면이나 폐 발암물질에 장기 노출된 자가 있다. 유전 성향이나 가족력이 있는 사람들도 또한 "위험한 상태" 집단에 포함된다. 상기와 같은 개인들은 시험에서 이득을 얻을 듯 하다. 위험성이 보다 낮은 개인을 포함시키면 검출되는 사례의 절대수가 증가할 수 있지만, 헬쓰케어 비용의 상당한 증가를 정당화하기는 힘들 것이다.
통상적인 담 세포검사의 비교적 불량한 성능에 기여하는 다른 인자들로는 병변의 위치, 종양 크기, 조직 유형 및 샘플의 질이 있다. 편평 세포 암종은 모든 1 기 폐종양의 31%를 차지한다. 이들 종양의 대부분은 구역 기관지로부터 발생하 며 가까운 엽과 먼 구역 가지로 연장된다[15]. 이러한 이유 때문에, 담 세포검사는 이들 병변의 검출에 상당히 유효하다(79%). 현재, 편평 세포 암종은, 딱지 형성된 세포가 보다 더 평가에 소용이 되는 듯 하므로, 제자리 및 방사선학적으로 숨은 단계[15]에서 세포검사 측정을 받을 수 있는 유일한 유형의 폐암으로서 간주된다. 환자가 가슴 X-선과 담 세포검사를 수행한 하나의 대규모 연구에서, 모든 폐암의 23%가 세포검사만으로 검출되었으며, 이는 상기 종양이 초기 단계이고 방사선학적으로 숨어 있음을 시사한다[16]. 또 다른 연구[17]에서, 담 세포검사는 환자의 76%를 방사선학적으로 숨은 종양으로 검출하였다.
선암종의 사례에서, 종양의 70%가 폐의 말초부위에서 발생하며 이는 악성 세포가 통상적인 담 시편에 발견될 가능성을 적게 만든다. 이러한 이유로 인해, 선암종은 담 세포검사에 의해 드물게 검출되며(45%)[12,18,19], 선암종의 발병률은 특히 여성에서 증가하는 것으로 보이기 때문에 중요한 고려사항이다[20-22].
종양 크기가 또한 정확한 진단을 달성할 가능성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 무증상 개인에서 질병을 검출하기 위한 선별 시험을 고려할 때 특히 중요한 인자이다. <24 ㎜의 종양이 참 양성으로서 판독될 가능성은 단지 50%인 반면, 보다 큰 병변이 검출될 확률은 84%를 초과한다[12].
최근의 보고는 또한 시편의 세포질이 담 세포검사의 감도에 영향을 미칠 것임을 지적한다[14,23]. 일반적으로, 편평 세포 암종을 갖는 환자들은 상당한 수의 종양 세포를 갖는 시편을 제공하며, 이에 의해 정확한 진단 가능성이 증가한다[14,23]. 선암종 환자의 경우, 담 시편에서 종양 세포의 존재는 시편의 95%에서 10% 미만이고 시편의 75%에서 2% 미만인 것으로 보고되며, 이는 진단을 훨씬 더 어렵게 만든다.
분화 정도가 또한, 특히 선암종 사례에서 악성 세포를 검출하는 병리학자의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 잘 분화된 종양 세포는 흔히 종양이 아닌 호흡기 상피 세포를 닮는다. 소 세포 폐 암종의 경우에 담 샘플은 종종 분명한 외관을 갖는 느슨하게 집단을 이룬 세포의 둥지를 함유한다. 그러나, 담 샘플의 처리에 현재 사용되는 기법은 세포를 분해하는 경향이 있으며, 이는 진단을 보다 어렵게 만든다.
샘플의 질이 담 세포검사의 낮은 감도에 기여할 수 있는 또 다른 인자이다. 최근의 보고는 대상자의 70 내지 85%에서 적합한 샘플을 입수할 수 있음을 제시한다. 그러나, 이러한 측정을 성공적으로 달성하기 위해서는 종종 환자가 다수의 시편을 제공할 것을 요한다[13]. 이러한 과정은 불편하며, 시간 소모적이고 비용이 든다. 환자들에게 수일에 걸쳐 빈번한 채집이 요구되므로 환자의 순응성이 또한 일반적으로 낮다[13]. 이전의 흡연자가, 폐암이 발병할 위험성이 상당하지만 종종 적합한 시편의 제공에 실패한다는 관찰은 똑같이 중요하다. 샘플 관찰 및 처리는 진단 시험으로서 담 세포검사의 가치에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 중요 인자이다.
마지막으로, 적합한 샘플을 수득하여 최적으로 준비할 수 있다 하더라도, 세포 검사 기사는 일반적으로 여전히 시편 당 2 내지 4 개의 슬라이드를 관찰해야 하며, 이들 각각에 대해 4 분 이하가 소요된다[24]. 통상적인 담 세포검사의 낮은 감도, 높은 기술적 복잡성 및 노동 집약성으로 인해, 상기 시험이 폐암의 조기 검출을 위한 집단-수준 선별로서 거의 보편적으로 거부되었음은 놀라운 일이 아니다[25].
이러한 기술적 쟁점이 해결되었다 하더라도, 담 세포검사의 낮은 감도는 여전히 중대한 문제로 남아있다. 거짓 음성 결과의 높은 발생률은 잠재적으로 치유적인 요법을 받을 환자를 상당히 지연시킬 수 있다. 보다 큰 감도를 갖는 시험을 개발하는 것도 가능할 수 있지만, 상기와 같은 개선이 특이성을 대가로 나와서는 안 된다. 거짓 양성 결과 수의 증가는 환자에게 불필요하고, 종종 침습적이며 비용이 드는 추적을 가할 것이며 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칠 것이다. 본 발명은 폐암의 조기 검출을 위한 담 세포검사의 사용과 관련된 한계를 포함하여, 암 조기 검출의 선행 방법과 관련된 많은 한계들을 극복한다.
폐암은 질병들의 이질적인 수집물이다. 시험이 집단 수준 선별로서 그의 사용을 정당화하는데 필요한 수준의 감도 및 특이성을 갖게 하도록, 본 발명은 예를 들어 패널의 개발에 10 내지 30 개의 세포 마커들의 라이브러리를 사용함을 고려한다. 본 발명의 라이브러리의 선택은 대부분의 경우 예후의 발현과 연계시키고자 마커 발현을 폐암에 걸린 환자로부터 취한 생검 시편에서 측정하는 관련 과학 문헌의 고찰 및 재분석을 근거로 하였다.
예를 들어 환자의 담에서 폐암의 조기 검출, 특성화 및/또는 모니터링에 바람직한 패널은 발현 변화가 종양 시편의 75% 이상에서 발생하는 분자 마커를 포함할 수 있다. 전형적인 패널에는 VEGF, 트롬보모듈린, CD44v6, SP-A, Rb, E-카테 린, 사이클린 A, nm23, 텔로머라제, Ki-67, 사이클린 D1, PCNA, MAGE-1, 뮤신, SP-B, HERA, FGF-2, C-MET, 갑상선 전사 인자, Bcl-2, N-카데린, EGFR, Glut-1, ER-관련된 것(p29), MAGE-3 및 Glut-3 중에서 선택된 마커들이 포함된다. 가장 바람직한 패널은 발현 변화가 종양 시편의 85% 이상에서 발생하는 분자 마커를 포함한다. 전형적인 패널에는 Glut1, HERA, Muc-1, 텔로머라제, VEGF, HGF, FGF, E-카데린, 사이클린 A, EGF 수용체, Bcl-2, 사이클린 D1 및 N-카데린 중에서 선택된 분자 마커가 포함된다. Rb 및 E-카데린을 제외하고, 폐암의 진단은 마커 발현의 증가와 관련이 있다. 본 발명에 사용되는 탐침/마커의 라이브러리에 대한 간단한 설명을 하기 표 4에 제공한다. 하기 표에서 항체의 넘버링은 본 실시예 전체를 통해서 항체/탐침/마커의 번호와 일치함에 유의한다.
Figure 112005013102219-PCT00008
바람직한 패널에서 각각의 분자 마커를 하기에 개시한다. 폐암의 각 유형에 대한 조직 중의 마커 발현 %의 인용을 본 섹션의 끝에 제공한다.
글루코스 운반 단백질(Glut 1 및 Glut3)[26-28]
글루코스 운반인자-1(Glut 1) 및 글루코스 운반인자-3(Glut-3)은 어디에서나 발현되는 고 친화성 글루코스 운반인자이다. 종양 세포는 종종 정상 세포보다 높은 호흡률, 글루코스 흡수, 및 글루코스 대사를 나타내며, 종양 세포에서 상승된 글루코스 흡수는 글루코스 운반인자에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 몇몇 유형의 GLUT 동형들의 과 발현이 폐암에서 보고되었다. Glut 1의 세포 위치는 세포막이다. GLUT-1 및 GLUT-3은 질병 상태의 검출에 유용한 질병 마커이다.
악성 세포는 글루코스 운반인자 단백질(Glut) 계열에 의해 매개되는 것으로 보이는 글루코스 흡수의 증가를 나타낸다. 종양 유전자 및 성장 인자들은 이들 단백질의 발현뿐만 아니라 이들의 활성도 조절하는 듯 하다. Glut 계열 단백질의 구성원들은 다양한 인간 조직에서 다양한 분포 패턴을 보이며 빠른 증식은 종종 이들의 과 발현과 관련된다. 최근의 증거는 Glut1이 큰 퍼센트의 ESCLC 및 대다수의 SCLC에 의해 발현됨을 제시한다.
Glut3의 발현이 NSCLC 및 SCLC 모두에서 비교적 낮은 반면, 대 세포 암종의 상당한 퍼센트(39.5%)가 상기 단백질을 발현한다. I 기 종양에서, 83%는 일부 수준에서 Glut 1을 발현하고 사례의 25%에서 75 내지 100%의 세포 염색을 갖는다. 이러한 데이터는 Glut1 과 발현이 종양 진행에서 비교적 초기의 사건임을 암시할 수 있다. Glut1 면역반응성이 또한 II 기 및 IIIA 기 암의 >90%에서 검출되었다. 또한 Glut1 및 Glut3 면역반응성과 종양 분화간에 역 상관성이 있는 듯 하다. 높은 수준의 Glut 1을 발현하는 종양은 불량한 예후와 관련하여 특별히 공격적인 듯 하다. 종양이 단백질에 대해 음성적인 경우에 보다 양호한 생존률이 관찰되었다.
인간 상피 관련 항원(HERA)[29,30]
HERA는 아직까지 기능이 알려지지 않은 막통과 당단백질이다. HERA는 대부분의 정상 및 악성 상피 상에 존재한다. 최근의 보고는 HERA 발현이 NSCLC의 모든 조직 유형들에서 높은 동시에 이는 검출 마커로서 유용함을 제시한다. 대조적으로 HERA 발현이 중피종에서는 존재하지 않으며 따라서 이는 식별 마커로서 유용성을 가짐을 시사한다. HERA의 세포 위치는 세포 표면이다.
염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF)[31-34]
염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 헤파린과 다른 글리코스아미노글리칸에 대해 높은 친화성을 갖는 폴리펩티드 성장 인자이다. 암에서, FGF는 효능 있는 분열 촉진 물질로서 작용하며, 혈관형성, 분화 및 증식에 한 역할을 하고, 종양의 진행 및 전이에 관여한다. FGF 과 발현은 SCLC 및 편평 세포 암종에서 빈번히 발생한다. 많은 경우(62%)에 상기 세포는 또한 FGF 수용체를 발현하며, 이는 오토크린 루프의 존재를 시사한다. 1 기 종양의 48%가 FGF를 발현한다. II 기 폐암에서 FGF의 빈도수는 84%이다. 상기 성장 인자 또는 그의 수용체의 발현은 불량한 예후와 관련되었다. I 기 질병을 갖는 환자들의 5 년 생존률은 FGF를 발현하는 경우 73% 대 FGF가 음성인 경우 80%였다. 상기의 세포 위치는 세포막이다.
텔로머라제[35-42]
텔로머라제는 진핵 염색체의 말단 소립을 연장 및 유지시키는 리보 핵단백질 효소이다. 상기는 역 전사효소 활성을 갖는 촉매 단백질 서브유닛과 역 전사효소 활성을 갖는 RNA 서브유닛 및 말단 소립 연장에 대한 주형으로서 작용하는 RNA 서브유닛으로 이루어진다. 텔로머라제를 발현하지 않는 세포는 각각 세포 분열과 함께 연속적으로 단축되는 말단 소립들을 가지며, 이는 궁극적으로 염색체 불안정성, 노화 및 세포사를 일으킨다. 텔로머라제의 세포 위치는 핵이다.
텔로머라제의 발현은 불멸 세포에서 일어나며 효소 활성은 악성 표현형의 공통적인 특징이다. 폐종양의 약 80 내지 94%는 높은 수준의 텔로머라제 활성을 나타낸다. 또한, 과다형성증의 71%, 화생의 80% 및 형성이상의 82%는 효소 활성을 발현한다. 모든 제자리 암종(CIS) 시편은 효소 활성을 나타낸다. 전암성 조직에서의 낮은 발현 수준은 추정 상 샘플 중의 단지 작은 퍼센트(5 및 20%)의 세포만이 효소 활성을 발현한다는 사실과 관련된다. 이는 세포의 20 내지 60%가 효소 활성을 발현할 수 있는 종양과 대조적이다. 제한된 수의 샘플을 근거로 텔로머라제 활성의 발현이 또한 SCLC에서는 통상적인 것으로 나타났다.
증식 세포 핵 항원(PCNA)[43-51]
PCNA는 DNA 폴리머라제 델타에 대한 보조인자로서 작용한다. PCNA는 세포 주기의 S 기와 DNA 복구와 관련된 DNA 합성기간 모두에서 발현된다. PCNA는 광범위한 정상 및 악성 조직 중의 증식 세포에서 발현된다. PCNA의 세포 위치는 핵이다.
PCNA의 발현은 빠르게 분열하는 세포들의 공통적인 특징이며 종양의 98%에서 검출된다. 면역조직화학 염색은 보통 내지 짙게 염색되는 핵에 있으며 이는 NSCLC의 83%에서 검출된다. 짙은 PCNA 염색은 p53-음성 종양의 51%에서 관찰되었다. 그러나, PCNA(세포 염색의 >50%) 및 p53이 모두 과 발현되는 경우(염색된 세포의 >10%), 예후는 진행에 보다 짧은 시간이 걸려 보다 불량한 경향이 있다. PCNA에 대한 짙은 염색은 모든 단계의 폐암에서 흔히 검출되지만 전이성 질병에서 보다 통상적이다. CIS의 31%가 또한 PCNA를 과 발현한다.
CD44[51-58]
CD44v6는 세포 유착 분자로서 작용하는 세포 표면 당단백질이다. 상기는 상피, 중피 및 조혈 조직에서 광범위한 정상 및 악성 세포 상에서 발현된다. 특정한 CD44 접목 변체들의 발현은 특정한 인간 암에서 전이 및 불량한 예후와 관련되는 것으로 나타났다. 상기는 편평 세포 암종과 선암종의 검출 및 이들간의 식별에 사용이 예상된다. CD44는 종양 침습 및 전이에 한 역할을 하는 것으로 보이는 세포 유착 분자이다. 교대로 접목된 결과 다수의 변형 동형들이 발현된다. CD44 발현은 일반적으로 SCLC에서 결여되며 NSCLC에서 다양하게 발현된다. 최고 수준의 발현은 편평 세포 암종에서 발생하며, 따라서 이는 종양 유형들간의 식별에 귀중하다. 비종양성 조직에서, CD44 염색은 기관지 상피 세포, 대식세포, 림프구, 및 폐포 폐세포에서 관찰된다. CD 발현과 종양 단계, 재발, 또는 특히 초기 단계의 질병에서 과 발현이 일어나는 경우 생존률간에 현저한 상관성은 없다. 전이성 병변에서 편평 세포 암종의 100% 및 선암종의 75%가 강한 CD44v6 양성을 나타내었다. 이러한 데이터는 CD44 발현의 변화가 종양 진행에서 비교적 늦게 발생하며 이는 조기 검출 마커로서 그의 가치를 제한할 수 있음을 가리키는 경향이 있다. 최근의 발견은 CD44v8-10 변체가 대다수의 NSCLC에 의해 발현되며, 이는 상기를 가능한 후보 마커로 만듦을 시사한다.
사이클린 A[59-62]
사이클린 A는 세포 주기의 특정 단계에서 전이 점을 조절하는 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 조절 서브유닛이다. 상기는 S 기 및 G2 기로 진행되는 과정에서 검출될 수 있다. 사이클린 A의 세포 위치는 핵이다.
사이클린 및 사이클린-의존성 키나제로 이루어진 단백질 복합체는 세포 주기 진행을 조절하는 작용을 한다. 사이클린 발현의 변화는 CCDN1 유전자에 영향을 미치는 유전자 변경과 관련이 있다. 사이클린이 조절 분자로서 작용하는 반면, 사이클린-의존성 키나제는 Rb를 활성화 및 불활성화시키는 촉매 서브유닛으로서 작용한다.
면역조직화학 분석은 사이클린의 과 발현이 높은 Ki-67 표지 지수에 의해 지시되는 바와 같이 세포 증식의 증가와 관련됨을 밝혔다. 사이클린 과 발현은 NSCLC의 75%에서 일어나며 종양 진행에서 비교적 일찍 발생하는 것으로 보인다. 최근의 보고는 I/II 기 종양의 66.7% 및 III 기 종양의 70.9%가 사이클린 A를 과 발현함을 지적한다. 핵 염색은 불충분하게 분화된 종양에서 통상적이다. 사이클린 A의 발현은 종종 평균 생존 시간의 감소 및 약물 내성의 발생 경향과 관련된다. 그러나, 증가된 발현은 또한 독소루비신에 대한 보다 큰 반응성과 관련되었다.
사이클린 D1[63-73]
사이클린 D1은 사이클린 A와 같이 세포 주기의 특정 단계에서 전이 점을 조절하는 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 조절 서브유닛이다. 사이클린 D1은 세포가 세포 주기의 S 기로 들어가는 것을 조절한다. 이러한 유전자는 광범위한 인간 암에서 빈번히 증폭되고/되거나 그의 발현이 하향 조절된다. 사이클린 D1의 세포 위치는 핵이다.
사이클린 A처럼 사이클린 D1은 세포 주기 진행을 조절하는 작용을 한다. 사이클린 D1의 염색은 우세하게는 세포질에 있으며 조직 유형과 무관하다. 보고서는 사이클린 D1 과 발현이 NSCLC의 40 내지 70% 및 SCLC의 80%에서 일어남을 제시한다. 사이클린 D1 염색은 I 기 종양의 37.9%, II 기 종양의 60% 및 III 기 종양의 57.9%에서 관찰되었다. 사이클린 D1 발현이 또한 형성이상 및 과다형성 조직에서 관찰되었으며 이는 이러한 변화가 종양 진행의 비교적 초기에 발생한다는 증거를 제공한다. 사이클린 D1을 과 발현하는 환자는 보다 짧은 평균 생존시간과 보다 낮은 5 년 생존률을 나타낸다.
간세포 성장 인자 수용체(C-MET)[74-77]
C-MET는 HGF에 대한 막통과 수용체 티로신 키나제를 암호화하는 원발암유전자이다. HGF는 간세포 및 내피 세포에 대한 분열촉진물질이며 상피 기원의 다수의 세포 유형에 대해 다형질발현 활성을 발휘한다. C-MET의 세포 위치는 세포 표면이다.
간세포 성장 인자/산란 인자(HGF/SF)는 광범위한 상피 세포를 자극하여 상기 세포가 증식, 이동, 및 혈관형성을 포함한 복잡한 분화 프로그램을 수행할 수 있게 한다. HGF/SF는 c-MET 종양 유전자에 의해 암호화된 수용체에 결합한다. 정상 및 악성 조직 모두 상기 HGF 수용체를 발현하지만, HGF/SF의 발현은 악성 조직으로만 제한되는 듯 하다.
인간 폐는 일반적으로 HGF/SF를 낮은 수준으로 발현하지만, NSCLC에서는 현저하게 발현이 증가한다. 웨스턴 블럿 분석의 사용에 따르면 폐암의 88.5%가 단백질 발현의 증가를 나타내었다. 종양의 모든 조직 유형들은 상기 단백질을 증가된 농도로 발현하였다. 단백질 수준의 증가는 상기 질병의 모든 단계에서 발생하지만, 최근의 증거는 암 세포 이외에, 간질 세포 및/또는 염증 세포가 상기 성장 인자의 생산에 기여할 수 있음을 제시한다.
뮤신-MUC-1[78-82]
뮤신-1은 기관 기관지 나무, 위장 관 및 비뇨생식관을 피복하고 보호하는 점액성 젤의 주요 단백질 구성성분을 포함하는 고도로 글리코실화된 분비 단백질의 계열로부터 나온다. 뮤신-1은 상피 종양에서 비 전형적으로 발현된다. 뮤신-1의 세포 위치는 세포질 및 세포 표면이다.
뮤신은 막 결합되거나 분비되는 다양한 분비 상피 세포에 의해 합성되는 고 분자량 당단백질 계열이다. 호흡기 관 내에서, 상기 단백질은 기관기관지 나무를 피복하고 보호하는 점액성 겔에 기여한다. 뮤신 발현의 변화는 통상적으로 폐암을 포함한 악성 전환과 함께 발생한다. 이러한 변화가 세포 성장 조절의 변경, 면역계에 의한 인식 및 종양의 전이 잠재성에 기여할 수 있음을 제시하는 증거가 존재한다.
정상적인 암 조직은 MUC-1을 발현하지만, 폐암에서는 훨씬 더 높은 수준의 발현이 발견되며 선암종에서 가장 높은 수준이 나타난다. 염색은 단계와 무관하게 발생하는 듯 하며 이전 흡연자 또는 비 흡연자에서보다 흡연자에서 더 통상적이다. 일부 전암성 병변들이 또한 증가된 MUC-1 발현을 나타낸다.
갑상선 전사 인자-1(TTF-1)[83,84]
TTF-1은 갑상선-특이성 및 폐-특이성 분화 유전자를 활성화시키는 유사영역 전사 인자 계열에 속한다. TTF-1의 세포 위치는 핵이다.
TTF-1은 타이로글로불린의 전사를 매개하는 것으로 최초로 밝혀진 단백질이다. 최근에, TTF-1 발현이 또한 간뇌 및 세기관지 폐포 상피에서 발견되었다. 폐 내에서 TTF-1은 계면활성제 단백질 및 클라라 분비 단백질의 합성을 조절하는 전사 인자로서 작용한다. TTF-1의 과 발현은 대다수의 폐 선암종에서 일어나며 1 기 폐암과 폐로 전이하는 암간의 구별을 도울 수 있다. TTF-1을 발현하고 사이토케라틴 7 양성 및 사이토케라틴 20 음성인 선암종을 95% 감도로 검출할 수 있다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)[33,61,85-89]
VEGF는 종양 진행과 전이를 촉진시키는 혈관형성에 중요한 역할을 한다. 여러 형태의 VEGF가 존재하며; 2 개의 보다 작은 동형들은 분비된 단백질이고 확산제로서 작용하는 반면, 보다 큰 2 개는 세포와 결합된 채로 남아 있다. VEGF의 세포 위치는 세포질, 세포 표면 및 세포 외 기질이다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 중요한 혈관형성 인자 및 내피 세포-특이성 분열촉진물질이다. 혈관형성은 발암, 종양 진행의 후기에서 중요한 과정이며 떨어져 있는 전이의 발생에 특히 중요하다. VEGF는 종종 성장 인자를 발현하는 종양 중에 존재하는 특정 수용체 Flt에 결합하며 이는 오토크린 루프의 존재를 암시한다.
면역조직화학 분석은 VEGF를 발현하는 세포가 확산성이고 세포질에 있는 염색 패턴을 나타냄을 밝힌다. VEGF는 비 종양 세포에 의해서 발현되지는 않지만 대부분의 NSCLC 및 보다 작은 퍼센트의 SCLC에 존재한다. 다수의 보고서들이 초기 폐암에서 VEGF의 높은 수준을 입증하였다.
VEGF의 발현은 증가된 전이 빈도수와 관련되었다. 연구는 VEGF 발현이 편평 세포 암종에서는 아닌 선암종에서 불량한 예후와 보다 짧은 무 질병 간격을 가리킴을 입증하였다. 높은 수준의 VEGF를 발현하는 그룹에서 3 년 및 5 년 생존률은 낮은 VEGF 그룹의 경우 각각 90.9% 및 77.9%에 비해 50% 및 16.7%였다.
상피 성장 인자 수용체(EGFR)[90-104]
상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 막통과 당단백질이며, 다양한 리간드와 결합하고 이에 의해 활성화된다. 결합은 DNA 합성, 세포 증식 및 세포 분화를 생성시키는 일련의 사건들을 개시시킨다. EGFR은 광범위한 정상 조직에서 입증되었으며 EGFR 과 발현은 다양한 종양에서 발견된다. 증가된 발현이 폐의 선암종 및 대 세포 암종에서 관찰되었지만 소 세포 폐암종에서는 관찰되지 않았다. EGFR의 세포 위치는 세포 표면이다.
EGFR은 세포 성장 및 분화에서 중요한 역할을 한다. EGFR은 기저 세포 층에서는 균일하게 존재하지만 조직학적으로 정상인 기관지 상피의 보다 많은 표면 층에서는 그렇지 않다. 이를 제외하고는, 정상 조직과 일치하는 염색이 존재하지 않는다. 최근의 증거는 EGF 수용체의 과 발현이 침습성 폐암의 발생에 절대적인 요건이 아닐 수도 있음을 시사한다. 그러나, EGFR 과 발현이 일어나는 경우에 이는 비교적 초기 사건이며 보다 진행된 질병에서 보다 큰 염색 강도를 갖는다.
침습성 암종 환자의 경우, 종양의 50 내지 77%가 EGF를 염색한다. EGFR의 과 발현은 선암종에서보다 편평 세포 암종에서 보다 흔하며 SCLC에서 흔하다. EGFR은 I/II 기 종양에서 나타나는 EGFR 농도의 약 2 배를 갖는 말기 및 전이성 질병과 함께 최고 수준으로 발생한다. 평가는 I 기 종양에서 관찰된 EGFR 수준이 종상 조직에서 나타나는 것의 약 2 배임을 제시한다. 또한, 화생, 이형성, 형성이상 및 CIS를 포함하여 기관지 병변의 48%가 EGFR 염색을 나타낸다. 상기 동일한 암 환자의 "정상" 기관지 점막에서, EGFR의 과 발현이 사례의 39%에서 관찰되었지만 비 암의 기관지 상피에서는 존재하지 않았다. 또한, EGFR의 과 발현은 특히 편평 세포 암종의 경우에 비 흡연자에서보다 흡연자의 종양에서 보다 흔히 발생한다.
다수의 연구들이 EGRF의 과 발현이 불량한 예후와 관련됨을 시사하였지만, 다른 연구들은 이러한 상관성을 만들어내지 못했다.
뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제/nm23[105-111]
뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제(NDP 키나제)/nm23은 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제이다. 전이 가능성이 높은 종양 세포는 종종 nm23 단백질이 결여되거나 또는 단지 적은 양을 발현하며, 따라서, 상기 nm23 단백질은 전이 억제 단백질로서 개시되어 왔다. nm23의 세포 위치는 핵 및 세포질이다.
nm23/뉴클레오사이드 다이포스페이트/키나제 A(nm23)의 발현은 종양 진행의 마커로 발현 잠재성과 전이 잠재성간에 역관계가 존재한다. I 기 종양이 nm23을 과 발현하는 경우 평균 35 개월의 추적 기간 동안 전이의 증거는 보이지 않았다. 면역조직화학 분석은 확산성이고, 세포질에 있으며 일반적으로 악성 세포로 제한되는 염색을 밝힌다. 폐포 대식세포가 또한 상기 단백질을 발현한다. 높은 수준의 발현이 낮은 전이 잠재성과 관련되지만, 현재 정상 상피 세포가 nm23을 발현하지 못하는 이유에 관해서는 어떠한 설명도 존재하지 않는다.
NSCLC 특히 대 세포 폐암의 높은 퍼센트 및 SCLC의 74%에서 짙은 염색이 관찰되었으며 이는 상기 단백질이 종양 진행에 중요한 역할을 함을 암시한다. 편평 세포 암종을 제외하고, 염색 강도는 단계에 따라 증가하는 경향이 있다. 입수할 수 있는 증거를 근거로, nm23은 SCLC 및 NSCLC 모두에서 예후 인자인 것으로 볼 수 있다.
Bcl-2[101,112-125]
Bcl-2는 세포사멸의 억제에 중심 역할을 하는 미토콘드리아 막 단백질이다. bcl-2의 과 발현은 프로그램화된 세포사가 정지된 세포의 통상적인 특징이다. Bcl-2의 세포 위치는 세포 표면이다.
Bcl-2는 세포의 말단 분화를 촉진시키고, 비 순환 세포의 생존을 연장시키고 순환 세포의 세포사멸을 차단시키는데 한 역할을 하는 것으로 여겨지는 원발암유전자이다. Bcl-2는 동종이량체로서 존재하거나 또는 Bax와 이종이량체를 형성할 수 있다. 동종이량체로서 Bax는 세포사멸을 유발시키는 작용을 한다. 그러나, Bax-bcl-2 복합체의 형성은 세포사멸을 차단한다. 세포사멸을 차단시킴으로써 bcl-2 발현은 감염된 세포에 생존 이점을 부여하는 듯 하다. Bcl-2 발현은 또한 약물 내성의 발생에 한 역할을 할 수도 있다. bcl-2의 발현은 p53에 의해 음으로 조절된다.
bcl-2의 면역조직화학 분석은 세포질 염색의 이질적인 패턴을 밝힌다. 선암종에서, bcl-2의 발현은 보다 작은 종양(<2 ㎝) 및 보다 낮은 증식 활성과 상당히 관련되었다. bcl-2의 발현은 신경내분비 분화와 더욱 밀접하게 관련되는 듯 하며 높은 비율의 SCLC에서 발생한다.
bcl-2의 과 발현은 전암성 병변 중에 존재하지 않으며 이는 bcl-2의 변화가 종양 진행에서 비교적 늦게 발생함을 시사한다. 종양 세포 이외에, blc-2 면역염색은 또한 기저 세포 및 정상 세기관지의 관내 표면상에서 발생하나 보다 분화된 세포 유형에서는 일반적으로 검출되지 않는다.
bcl-2 면역반응성과 NSCLC에서 개선된 예후와의 관련성은 논의의 여지가 있다. 다수의 보고서는 bcl-2를 발현하는 종양을 갖는 환자가 보다 우수한 예후와 재발에 보다 긴 시간을 가짐을 제시하였다. 여러 보고서는 bcl-2 발현이 전이성 질병이 발병된 환자들에서 보다 낮아지는 경향이 있음을 지적한다. 편평 세포 암종 환자의 경우, bcl-2의 발현은 5 년 생존률의 개선과 연계되었다. 그러나, 3 개의 비교적 대규모 연구에서 특히 초기 단계 질병에 걸린 환자의 경우 bcl-2 발현과 연계된 생존 이점은 존재하지 않았다.
에스트로젠 수용체-관련 단백질(p29)[126]
ER 관련된 단백질 p29는 에스트로젠-수용체의 발현과 상관되는 것으로 밝혀진 에스트로젠-관련된 열 충격 단백질이다. p29의 세포 위치는 세포질이다.
에스트로젠-의존성 세포 내 과정들은 정상 조직의 성장 조절에 중요하며 암의 조절에 한 역할을 할 수 있다. 하나의 연구에서 p29의 발현은 111 개 폐암 중 109 개(98%)에서 검출되었다. p29 발현과 생존 시간간의 관계는 남성과 여성의 경우 상이하였다. p29의 발현은 특히 I 기 및 II 기 질병의 여성에서 보다 불량한 생존률과 관련되었다. 남성에서는 p29 발현과 장기 생존간에 상관성이 없었다.
망막모세포종 유전자 산물(Rb)[68,73,123,127-141]
망막모세포종 유전자 산물(Rb)은 핵 DNA-결합 인단백질이다. 인산화된 Rb와 DNA 종양 바이러스의 종양 단백질 및 조절 단백질의 결합 하에서 DNA 복제가 억제된다. Rb 단백질은 전사를 조절함으로써 작용할 수 있으며; Rb 기능의 상실은 조절되지 않은 세포 성장을 도출시킨다. Rb의 세포 위치는 핵이다.
망막모세포종 단백질(pRb)은 망막모세포종 유전자에 의해 암호화되고 세포 주기 의존 방식으로 인산화 및 탈인산화되는 단백질이다. pRb는 G0/G1에서 세포 주기를 조절하는 작용을 하는 중요한 종양 억제 유전자로 간주된다. pRb는 그의 저인산화된 상태에서 G1에서 S로의 이행을 억제한다. G1 단계 동안 pRb의 성장 억제성질의 불활성화가 발생하며 이때 사이클린 의존성 키나제(CDK)는 상기 단백질을 인산화한다. pRb의 과인산화는 상기가 DNA 합성에 필요한 전사 인자 단백질로서 작용하는 E2F와의 복합체의 형성을 방지한다.
망막모세포종(Rb) 유전자의 불활성화는 폐암을 포함한 다양한 유형의 암에 대해 문헌 보고되었다. 소 세포 암종은 pRb를 염색하지 못하며 이는 Rb 기능의 상실을 가리킨다. 전반적으로, 상기 종양의 17.6%가 단계 또는 결절 상태와 상관 없이 pRb를 발현하지 못한다. 염색의 감소가 또한 형성이상 기관지 생검의 31%에서 보였다. 그러나, pRb 발현과 형성이상의 중증도간에는 상관성이 없는 듯 하다. 대조적으로, 종양에 인접한 영역으로부터 취한 세포 및 정상 기관지 상피는 pRb 양성 핵을 발현하였다. 이러한 데이터는 Rb 단백질의 발현의 변경이 일부 폐암의 발병에서 조기에 발생할 수도 있음을 시사한다.
Rb-양성 암종을 갖는 환자는 다소 양호한 예후를 갖는 경향이 있지만, 대부분의 연구에서 그 차이는 의미가 없다. 그러나, pRb 음성이고 p53 또는 ras 양성인 종양을 갖는 선암종 환자는 5 년 생존률의 감소를 나타낸다. 유사한 관계가 편평 세포 암종에서는 발생하지 않는다. pRb 음성 종양은 Rb-양성 암종보다 더 독소루비신에 대해 내성을 나타내는 듯 한 것으로 보고되었다.
트롬보모듈린[142-147]
트롬보모듈린은 막통과 당단백질이다. 그의 단백질 C의 가속화된 활성화(이는 차례로 단백질 S와 트롬빈을 결합시킴으로써 항응고제로서 작용한다)를 통해서 TM의 합성은 내피 세포 표면상의 덩어리 형성을 감소시키는데 중요한 다수의 기전들 중 하나이다. 트롬보모듈린의 세포 위치는 세포 표면이다.
순환하는 종양 세포에 의한 숙주 혈소판의 응집은 전이 과정에서 중요한 역할을 하는 듯 하다. 트롬보모듈린은 트롬빈에 의한 항응고 단백질 C의 활성화에 중요한 역할을 하며 혈관 내 응고의 중요한 조절인자이다. 정상 편평 내피에서의 발현 이외에 트롬보모듈린의 발현은 또한 편평 상피 화생, 제자리 암종, 및 침습성 편평 세포 암종에서 일어난다. 1 기 편평 세포 암종 중 74%에 존재하지만, 전이성 병변의 단지 44%만이 트롬보모듈린을 염색하였다. 이러한 데이터는 진행에 따라 트롬보모듈린 발현이 감소됨을 시사한다. 보다 높은 수준의 발현은 불충분하게 분화된 종양에 비해 잘 분화된 종양 및 보통으로 분화된 종양에서 발생하는 경향이 있다.
트롬보모듈린-음성 편평 세포 암종 환자는 악화된 예후를 갖는 경향이 있다. 트롬보모듈린-음성 환자는 종양이 상기 단백질을 양성으로 염색하는 경우의 60%에 비해 18%가 5 년 생존률을 갖는다. 전이성 질병으로의 진행이 또한 트롬보모듈린-음성 종양에서 더 통상적이었으며(69% 대 37%) 이들 종양은 가슴 외 부위에서 발생하는 경향이 보다 크게 존재하였다. 따라서, 트롬보모듈린 발현의 상실은 편평 세포 암종의 경우 예후인 것으로 보인다. 트롬보모듈린 발현의 변화가 NSCLC의 말기에서 발생하고 상기 단백질이 정상 기관지 상피 세포에 의해 발현된다는 관찰은 조기 검출용 마커로서 그의 유용성을 제한하는 경향이 있을 수 있다. 그러나, 대부분의 중피종과 단지 작은 퍼센트의 선암종이 트롬보모듈린을 발현하기 때문에, 상기 마커는 이들 2 개의 종양 유형들간을 식별하는데 잠재적인 유용성을 갖는다.
E-카데린 & N-카데린[148-151]
E-카데린은 막통과 Ca2+ 의존성 세포 유착 분자이다. 상기는 조직 구조의 조절 기전과 조직 보존의 유지를 통해 세포의 성장 및 발달에 중요한 역할을 한다. E-카데린은 상피 세포의 세포간 유착, 상피 분극의 확립, 샘 분화 및 층화에 기여한다. E-카데린 발현의 하향 조절이 다수의 암종에서 관찰되었으며 이는 대개 진행된 단계 및 진행과 관련된다. E-카데린의 세포 위치는 세포 표면이다.
E-카데린은 칼슘 의존성 상피 세포 유착 분자이다. E-카데린 발현의 감소는 종양 탈분화 및 전이 및 감소된 생존률과 관련되었다. 감소된 발현은 보통으로 및 불충분하게 분화된 편평 세포 암종 및 SCLC에서 관찰되었다. 선암종에서는 E-카데린 발현의 변화가 없었다. 더욱 또한, 선암종은 E-카데린을 발현하는 반면, 상기 종양은 E-카데린은 발현하지 못하고 N-카데린을 발현하는 중피종과 대조적으로 N-카데린을 발현하지 못한다. 따라서, 이들 마커를 사용하여 선암종과 중피종을 식별할 수 있다.
E-카데린의 발현을 또한 편평 세포 암종 환자의 예후를 평가하는데 사용할 수 있다. E-카데린을 발현하는 종양을 갖는 환자의 60%가 3 년을 생존한 반면, 발현의 감소를 나타내는 환자의 단지 36% 만이 3 년을 생존하였다.
MAGE-1 및 MAGE-3[152-156]
흑색종 항원-1(MAGE-1) 및 흑색종 항원-3(MAGE-3)은 정상 조직에서는 통상적으로 침묵하지만 악성 종양에서 발현 시 자가, 종양 지향성, 특정한 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 인식되는 유전자 계열의 일원이다. MAGE-1 및 MAGE-3의 세포 위치는 세포질이다.
MAGE-1, MAGE-3 및 MAGE-4 유전자 산물은 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 종양-관련된 항원들이다. 그 자체로서 이들은 NSCLC에서 면역요법용 표적으로서 유용성을 가질 수 있다. MAGE 단백질은 또한 일부 SCLC에 의해서 발현되지만 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는다. MAGE 발현 빈도수가 검출 마커로서 사용하기에 필요한 수준 이하에 있지만, 조직 유형들간의 발현 패턴의 차이는 MAGE 발현이 식별 마커로서 유용성을 가질 수 있음을 암시한다. 이러한 유용성은 또한 편평 세포 암종의 50%에서 종양 세포의 90% 이상이 종양에 대해 30%의 MAGE-3 과 발현의 증거(이는 세포의 50%에서의 과발현을 나타낸다)를 보인다는 관찰에 의해 지지된다.
핵소체 단백질(p120)[157]
p120(증식-관련된 핵소체 항원)은 초기 G1 단계 동안 빠르게 증식하는 세포의 핵소체에서 발견된다. p120의 세포 위치는 핵이다.
핵소체 단백질 p120은 기능이 아직 밝혀지지 않은 증식-관련 단백질이다. 강한 염색이 종양 조직에서 검출되었지만 대식세포나 정상 조직에서는 검출되지 않았다. p120의 과 발현은 선암종 또는 대 세포 암종에서보다 편평 세포 암종에서 더 흔하였으며, 이는 상기 마커가 종양 유형들간의 식별에 유용성을 가질 가능성을 증가시킨다.
폐 계면활성제[83,158-166]
폐 계면활성제는 폐포-액체 계면의 표면 장력을 감소시켜 환기에 필요한 폐포 안정성을 제공하는 작용을 하는 인지질-풍부 혼합물이다. 계면활성제 단백질은 기도에서 독점적으로 발현되는 듯 하며 폐포 유형 II 세포에 의해 생산된다. 비 종양성 폐에서 전-계면활성제-B 면역반응성은 정상 및 과다형성증 폐포 유형 II 세포 및 일부 비-섬모 세기관지 상피 세포에서 검출된다. 선암종의 60%가 강한 세포질 면역반응성을 함유하였으며 이때 종양 세포의 10 내지 50%는 대부분의 경우 염색을 나타내었다. 편평 세포 암종 및 대 세포 암종은 전-계면활성제-B를 염색하지 못했다.
계면활성제 아포단백질 B(SP-B)는 유형 II 폐포 세포에 의해 분비되는 인지질과 단백질 복합체인 폐 계면활성제를 구성하는 4 개의 소수성 단백질들 중 하나이다. 폐의 편평 세포 및 대 세포 암종 및 비 폐 선암종은 SP-B를 발현하지 않는다. SP-B의 세포 위치는 세포질이다.
SP-A는 날숨의 끝에서 폐포가 붕괴되지 못하게 하는데 필수적인 역할을 하는 폐 계면활성제 단백질이다. SP-A는 폐포 상피 세포(II 유형 폐세포)의 독특한 식별 마커이며; 상기 항원은 종양 상태에서조차도 보존된다. SP-A의 세포 위치는 세포질이다.
폐 계면활성제 A는 비-점액 기관지-폐포 암종에 특이적인 듯 하며 100% 염색을 가지며 이는 점액 유형의 것들 중 어느 것과도 비교되지 않는다. 폐 계면활성제는 폐암을 폐로 전이된 다른 암들과 구별하는데 잠재적인 유용성을 갖는다. 종양 세포 이외에, 비-종양성 폐세포는 또한 폐 계면활성제 A를 염색한다. 폐 계면활성제 B의 경우와 같이 폐 계면활성제 A의 염색은 선암종에서는 통상적이나 NSCLC의 다른 형태들 또는 SCLC에서는 그렇지 않다. 중피종은 또한 폐 계면활성제 A를 발현하지 못하며 이는 폐 계면활성제 A가 선암종과 중피종간의 식별에 유용성을 가질 수 있다는 암시를 도출시킨다.
Ki-67
Ki-67은 증식하는 정상 및 종양 세포에서 발현되고 무활동 세포에서는 하향 조절되는 핵단백질이다. 상기는 세포 주기의 G1, S, G2 및 M 기에 존재하며, G0 기에서는 존재하지 않는다. 증식 마커로서 통상적으로 사용된다. Ki-67의 세포 위치는 핵이다.
Figure 112005013102219-PCT00009
a. 적합한 크기를 갖는 마커 라이브러리의 획득
폐암과 상관 있는 적합한 크기의 마커 라이브러리를 획득하기 위해서 예비 추림 단계들이 필요하였다. 폐암과 상관 있는 100 개 이상의 마커들이 문헌에 공지되어 있다. 문헌에 나타나있고 패널에 포함 가능성에 대해 평가된 후보 탐침들의 부분 목록으로 bax, Bcl-2, c-MET(HGFr), CD44S, CD44v4, CD44v5, CD44v6, cdk2 키나제, CEA(암-배아 항원), 사이클린 A, 사이클린 D1, E-카데린, EGFR, ER-관련된 것(p29), erbB-1, erbB-2, FGF-2(bFGF), FOS, Glut-1, Glut-2, Glut-3, Glut-4, Glut-5, HERA(MOC-31), HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-51, 인테그린 VLA2, 인테그린 VLA3, 인테그린 VLA6, JUN, 케라틴, 케라틴 7, 케라틴 8, 케라틴 10, 케라틴 13, 케라틴 14, 케라틴 16, 케라틴 17, 케라틴 18, 케라틴 19, A-유형 라민스(A; C), B-유형 라민스(B1; B2), MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, 흑색종 관련된 항원 클론 NKI/C3, mdm2, mib-1(Ki-67), 뮤신 1(MUC-1), 뮤신 2(MUC-2), 뮤신 3(MUC-3), 뮤신 4(MUC-4), MYC, N-카데린, NCAM(신경 세포 유착 분자), nm23, p16, p21, p27, p53, p120, P-카데린, PCNA, 망막모세포종, SP-A, SP-B, 텔로머라제, 트롬보모듈린, 갑상선 전사 인자 1, VEGF, 비멘틴 및 waf1에 대한 항체들이 있다. 마커의 초기 목록들을 초기 평가에 의해, 문헌으로부터, 조기 암 세포 검출, 상이한 암 상태의 세포들간의 식별 및 표지를 표적 암 세포에 국소화시킴에 있어서 탐침의 명백한 유효성에 의해 추려내었다. 이러한 마커 목록을, 제조 또는 획득이 어렵거나, 부적합한 검출 기술 요건 또는 보고된 결과의 불량한 재현성으로 인해 실행을 위해 줄이기 곤란할 수 있는 유용성을 갖는 마커들을 제거함으로써 추가로 추려내었다. 상기 모든 추림 단계를 완료한 후에, 27 개 마커들의 라이브러리를 획득하였다.
b. 프로토콜의 최적화 및 절대 표준 폐암 샘플의 획득
예비 준비 단계들이 또한 패널의 획득에 앞서 필요하였다. 적합한 표지들을 함유하는 탐침들을 상업적인 판매자로부터 입수할 수 있었다. 상기 탐침의 프로토콜을 최적의 객관적인 정량분석 검출을 위해 분석하였다. 예를 들어, PCNA의 농도가 너무 낮게 측정되었다. 처음에는 PCNA를 S809 완충액으로 1:4000으로 희석하였다. 두 번째 희석을 S809 중에서 1:3200으로 수행하였다. 각 마커에 대해 최적화된 프로토콜을 하기에 나타낸다. 두 번째 컬럼은 표지된 "항체 명칭"을 나타낸다. MOC-31을 제외하고, 상기 목록에서 탐침들을 마커 명칭으로 기입하였는데 그 이유는 많은 판매자들이 항체를 마커의 명칭으로 지칭하기 때문이다. 이들 시약을 기입할 수 있는 또 다른 방식은 예를 들어 항-VEGF, 항-트롬보모듈린, 항-CD44v6 등임에 유의한다.
절대 표준 조직 시편을 UCLA로부터 수득하였다. 조직 시편을 2 개의 출처로부터 입수하였다. 사례들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)-염색된 슬라이드 및 임상력의 고찰을 포함하여 표준 과정을 사용하여 진단하였다. 시편 슬라이드를 코드화하고 임의의 번호로 표지하여 상기 연구 병리학자가 병력 진단 및 항체 마커를 알 수 없게 하고 환자 비밀성을 보호하였다.
암 및 비 암(대조군) 조직으로부터의 조직 섹션을 갖는 시편 슬라이드를 사용하였다. 총 175 개의 별도의 사례들을 분석하였다. 이 세트 내에서, 표 6에 나타낸 하기의 진단들을 하기 빈도수와 함께 나타내었다:
Figure 112005013102219-PCT00010
c. 분자 마커 패널의 발현 수준의 측정
슬라이드 당 오직 하나의 탐침만이 시험되도록 충분한 시편 슬라이드를 각 사례에 대해 준비하였다. 일반적으로, 특정한 분자 마커에 대해 지정된 하나 이상의 표지된 탐침들과 접촉된 세포검사 샘플을 함유하는 현미경 슬라이드를 준비한다. 독립적으로, 각 연구 병리학자들은 각각의 사례에 대한 진단을 수행하기 위해서 H&E 염색된 슬라이드를 조사하고, 이어서 탐침 결합 수준을 평가하기 위해서 각각의 탐침-반응되고 면역화학적으로 염색된 슬라이드를 검사하여, 결과를 규격화된 데이터 양식에 기록하였다.
보다 상세히, 포르말린 고정되고, 파라핀 매몰된(FFPE) 조직에 대해 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 조직 섹션을 폴리-L-라이신 코팅된 슬라이드 상에서 4-마이크론 두께로 절단하고 실온에서 밤새 건조시켰다. 상기 조직 섹션의 파라핀 제거 및 재 수화를 하기와 같이 수행하였다: 상기 시편으로부터 깊이 박힌 매질을 모두 완전히 제거하기 위해서, 상기 슬라이드를 각각 5 분 동안 2 개의 연속적인 자일렌-대용물(Histoclear) 욕에서 배양시켰다. 상기 슬라이드로부터 모든 액체를 가볍게 두드려 제거한 후에 각각 3 분 동안 2 개의 연속적인 100% 시약 등급 알콜 욕에서 배양시켰다. 다시 한번 모든 과잉의 액체를 상기 슬라이드로부터 가볍게 두드려 제거한 후에 각각 3 분 동안 최종적으로 2 개의 95% 시약 등급 알콜 욕에서 배양시켰다. 95%의 최종 욕에 이어서 상기 슬라이드를 수돗물로 세척하고 세척 완충액(1:10 희석된 DAKO 자동 염색기 세척 완충액, 코드 S3306에 상응하는 0.05% 트윈 20을 함유하는 트리스-완충된 염수 세척 완충액)에서 유지시켰다. 하기 표 7은 상응하는 제품 코드 번호와 함께 상기 연구에 사용된 시약들의 완전한 목록을 제공한다. 상기 연구에 사용된 검출 시스템은 DAKO 엔비젼(EnVision)+ HRP 마우스(코드 K4007) 또는 토끼(코드 K4003) 및 LSAB+ HRP(코드 K0690)이었다. 면역분석에 대한 프로토콜은 패키지 삽입물에 따라 수행하였다. 키트는 액체 2 성분 DAB+ 기질 색소원(코드 K3468)을 함유하였다.
Figure 112005013102219-PCT00011
전처리는 폐조직에 대해 상기 항체들을 최적화하는데 중요하였다. 효소 절단이 필요한 항체들의 경우, DAKO 프로테이나제 K(코드 S3020)를 실온에서 5 분간 사용하였다. 열 유도된 표적 검색이 필요한 항체에 DAKO 표적 추적 용액(코드 S1700) 또는 DAKO 고 pH 표적 추적 용액(코드 S3307)을 제공하였다. 조직들을 예열시킨 표적 추적 용액에 넣고 특정한 프로토콜에 따라 20 또는 40 분간 95 ℃ 수욕에서 배양시켰다. 이어서 조직 섹션들을 추가로 20 분 동안 실온에서 냉각시켰다.
파라핀 제거, 재 수화 및 조직 전처리 후에, 모든 시편들을 3% 과산화 수소 용액에서 배양시켜 내생적인 퍼옥시다제 활성을 억제시켰다. 차단 시약들을 불특정한 배경을 최소화하기 위해서 특히 2 개의 항체 FGF 및 텔로머라제에 대해 사용하였다.
하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 조직 시편들을 명시된 시간 동안 200 ㎕의 최적으로 희석된 1 차 항체와 함께 배양시켰다. 표 8의 마커/항체에 대한 넘버링은 본 문헌 전체를 통해 항체 탐침 및 마커의 넘버링과 일치함에 유의한다. 이어서 슬라이드를 DAKO 1X 자동 염색기 완충액(코드 S3306)으로 세척하였다. 항체에 따라, 바른 검출 시스템을 적용시켰다. DAKO 엔비젼+ HRP 및 LSAB+ HRP 검출 시스템에 대한 단계 및 총 배양 시간을 하기 표 9에 나타낸다. 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 색 반응을 전개시켜 반응 부위에서 갈색 침전물을 생성시킨다.
Figure 112005013102219-PCT00012
Figure 112005013102219-PCT00013
면역염색에 따라 모든 슬라이드를 3 분간 DAKO 헤마톡실린(코드 S3302)에서 배양시키고 DAKO 마운트 마운팅(Mount Mounting) 배지(S3025)를 사용하여 커버 슬립을 씌었다. 모든 프로토콜을 IHC 소프트웨어 버전 3.0.2를 사용하여 DAKO 자동 염색기(일련 번호 3400-6612-03 & 3400-6142R-03) 상에서 실행하였다.
면역염색을 광 현미경 하에서 관찰하여 대조군의 정확한 염색과 조직의 완전성을 측정하였다. 슬라이드를 표지하고 상자에 넣어 결과의 해석을 위해 지정된 병리학자에게 보냈다. 숙련된 병리학자는 샘플에서 보이는 암 또는 다른 병변의 유형을 확인하였다. 숙련된 병리학자는 염색 밀도 및 염색된 세포의 비율을 평가함으로써 마커 탐침에 대한 감도를 평가하였다. 이러한 점수들을 상기 환자에 대한 데이터 시트에 기록하였다. 상기 병리학자들은 원래의 진단 및 면역염색에 사용된 항체 마커를 보지 못했다. 각각의 슬라이드를 2 명 이상의 병리학자에 의해 판독하고 결과를 데이터 수집 양식에 기록하였다. 상기 과정에 대한 추가의 완전성을 제공하기 위해서, 상기 방법을 제 2 또는 제 3 병리학자에 의해 반복한다. 이어서 획득된 점수들을 조화시켜 데이터 기입 오류를 확인할 수 있다. 상기 추가의 데이터는 또한 보다 양호한 분류기 고안을 용이하게 만든다.
각각의 사례에 대해서, 27 개 이하의 슬라이드를 분석하였으며, 각각 1 내지 17 번, 19 내지 28 번으로 코드화한 마커를 염색하였다. 마커 18(C-MET)에 대한 염색을 최적화할 수 없었으며 따라서 상기 마커/탐침을 사용하지 않았다. 병리학자 1은 모든 175 개 사례들로부터의 슬라이드를 점수로 기록하였다. 병리학자 2는 99 개의 사례들로부터의 슬라이드를 점수로 기록하였다. 병리학자 3은 80 개의 사례들로부터의 슬라이드를 점수로 기록하였다.
하기 표 10은 얼마나 많은 사례들이 각각의 병리학자 기록된 슬라이드들로부터 진단되었는가를 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00014
일부 선택된 통계학적 분석 기법들을 위해서, 존재하는 27 개 슬라이드 모두에 대한 점수를 갖는 사례들만을 고려할 필요가 있었다. 하기 표 11은 얼마나 많은 각각의 진단 사례들이 27 개 슬라이드 전부의 점수를 갖는 것에 대해서 완벽한가를 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00015
상기 표로부터, 각 병리학자들이 점수로 기록한 하기의 완벽한 사례의 총 수를 계산할 수 있다. 병리학자 1은 119 개의 사례에 대해 모두 27 개의 슬라이드를 점수로 기록하였다. 병리학자 2는 83 개의 사례에 대해 모두 27 개의 슬라이드를 점수로 기록하였다. 병리학자 3은 23 개의 사례에 대해 모두 27 개의 슬라이드를 점수로 기록하였다.
암 데이터 점수의 총 수는 172이다. 이는 병리학자 1로부터 113 데이터 점수 및 병리학자 2로부터 60 데이터 점수를 포함한다. 대조군 데이터 점수의 총 수는 101이다. 이는 병리학자 1로부터의 62 데이터 점수 및 병리학자 2로부터의 39 데이터 점수를 포함한다.
도 3은 대조용 조직 및 암 조직에서 탐침 7 및 15의 H-점수들간의 비교를 나타낸다. x-축은 H-점수를 나타내는 반면 y-축은 상기 특정한 H-점수를 갖는 사례의 %를 나타낸다. H-점수들의 차이가 분명하다.
각 환자에 대해서 상기 점수들을 진단, 염색된 세포의 비율 및 염색 밀도와 함께 환자의 신원을 나타내는 데이터 베이스에 통합시키는 병리학 고찰 양식에 전자적으로 기입하였다. 상기 비율 및 밀도는 강도를 없음 = 0, 약함 = 1, 보통 = 2, 강함 = 3으로, 세포 퍼센트를 0-5% = 0, 6-25% = 1, 26-50% = 2, 51-75% = 3, >75% = 4로서 등급화하고, 이어서 상기 두 등급을 함께 곱하여 수득한 단일의 "H 점수"로 통합시켰다. 예를 들어, 50% 약한 염색 + 50% 보통 염색은 10 = 2x2 + 2x3의 득점을 할 것이다. 이는 또 다른 득점 시스템을 연구하는 하기 "다른(비-H-점수) 객관적 득점 매개변수들의 사용 효과" 표제 하의 섹션 3(f)를 제외하고, 분석 전체를 통해 표준 득점 시스템이다.
표준 분류 과정을 사용하여 탐침들의 최상의 조합을 찾았다. 전형적으로는 상기 과정은 식별력을 갖는 시험에 따라 랭크되고 유의수준의 시험에 따라 사절두한 최상의 특징들의 요인을 찾기 위해서 "분기 및 통합 연산"과 같은 탐색 절차를 사용하였다. 상기 과정은 또한 최상의 분류를 위한 결정 규칙 또는 규칙들을 규정한다.
이러한 특징들에 따라 고안된 분류기의 성능을 상기 분류기의 고안에 사용된 데이터로부터 평가할 수 있다. 상기 분류기에 상기 모든 고안 데이터를 그대로 적용시키면 매우 불확실한 성능 평가치가 제공한다.
본 실시예에서 수집된 데이터의 분석은 최상으로 분리된 최적의 탐침 선택을 제공한다. 따라서, 상기 분석을 수행하는데 단지 몇 개의 탐침만이 필요한 패널을 획득하였다. 그러나, 상기 데이터는 최적에 가까운 성능이 다른 탐침들의 조합과 함께 수득될 수 있음을 보였다. 따라서, 본 발명은 비용 또는 공급 문제가 충분히 최상인 조합을 허용하지 않을 수도 있는 탐침들의 입수 가능성에 대해서도 적용할 수 있는 융통성이 있다. 일부의 경우에, 본 발명을 대체 조합을 찾기 위해서 입수할 수 있는 특징들에 간단히 적용시킬 수 있다. 다른 경우에, 상기 연산을 사용하여 저렴한 비용 해법에 도달하기 위해 비용 가충치를 상기 선택 과정에 포함시키는 특징들을 선택할 수도 있다.
데이터 수집 및 분석 실험의 디자인은 데이터 수집 및 데이터 분석을 독립적으로 수행하는 잘 확립된 이중 맹검 과정을 통해 편향되지 않게 선택하였다.
첫 번째 사례에서 병리학자들은 통상적인 염색으로 슬라이드를 관찰하여 진단을 수행하였다. 이러한 진단을 병리학 고찰 양식에 기입하였다. 이어서 상기 병리학자들은 염색된 세포의 퍼센트 및 상기 염색의 상대적인 강도의 점수 기록을 위해서 마커 탐침들에 의해 염색된 슬라이드를 무작위로 제공하였다. 상기 슬라이드에 번호를 매겨 상기 병리학자들로부터의 상기 탐침에 대한 정보를 배제시켰다. 데이터 완전성을 검사하기 위해서 2 명의 병리학자들이 모든 환자들을 관찰하였다.
데이터를 데이터베이스에 통합시키고 이어서 이를 한 팀의 통계 전문가들에 의해 고찰시켰다. 탐침들에 번호를 매겨 상기 탐침들의 유효성을 분석하는 동안 이들의 작용 방법을 볼 수 없게 만들었다.
상기 분석의 첫 번째 단계는 각각의 환자에 대한 기입사항들을 비교함으로써 상기 데이터의 완전성을 검사하는 것이었다. 큰 차이가 발견된 경우, 상기 데이터 기입사항들을 검사하고 임의의 명백한 오류들을 보정하였다. 이유가 밝혀지지 않은 차이는 상기 데이터에 남겨두었다.
이어서 상기 데이터를, 상이한 통계 방법들이 상이한 유형의 상기 데이터 중의 정보 식별에 적합하다는 점을 인식하여 상이한 기법들을 사용하여 4 명의 통계 전문가들에 의해 별도로 분석시켰다.
최상의 탐침 조합을 선택하는 과정의 첫 번째 단계는 데이터를 2 개의 세트로 나누는 것으로, 하나는 분류기의 디자인을 위한 것이고 다른 하나는 상기 분류기의 성능을 시험하기 위한 것이다. 상기 디자인(훈련) 세트를 사용하여 제조된, 그러나 상기 시험 세트 상에서 평가된 최상의 성능을 나타내는 디자인을 선택함으로써 상기 분류기가 상기 데이터의 구성에 대해 보편화되었고 상기 훈련 세트에서 보이는 특정한 사례들에는 적합하지 않다는 확신을 내릴 수 있다.
신뢰성을 시험하기 위해서 상기 분석을 전형적으로는 훈련 데이터 및 시험 데이터의 다수의 랜덤하게 선택된 세트를 사용하여 반복하였다. 이러한 접근법은 양호한 분류기 성능 평가가 제공됨에 따라 일반적으로 허용된다. 상기 시험이 일관되지 않는 탐침들의 선택을 나타낸 경우, 상기와 같은 탐침 선택은 신뢰할 수 없는 것으로서 제외시켰다.
d. 통계학적 분석 및/또는 패턴 인식
1. 데이터 분석에의 도입
a. 입력 데이터
i. 원 데이터
각각의 환자에 대해서 상기 점수들을 진단, 염색된 세포의 비율 및 염색 밀도와 함께 환자의 신원을 나타내는 데이터 베이스에 통합시키는 병리학 고찰 양식에 전자적으로 기입하였다.
ii. 산정된 데이터
상기 분석에 사용된 각 탐침의 점수 효율을 상기 강도/퍼센트 표로부터 산정한다. 상기 비율 및 밀도를 간단한 규칙 H = 염색된 비율 x (강한 경우 3 + 보통인 경우 2 + 약하게 염색된 경우 1)를 사용하여 단일의 "H-점수"에 통합시킨다. 이는 상기 탐침과 관련된 특징 값이다.
iii. 또 다른 산정된 데이터 매개변수
상술한 H-점수는 발견적으로 유도된 것이며, 퍼센트와 강도를 보다 양호하게 결합시키기 위한 방법을 찾기 위한 간단한 분석은 H-점수에 대해 현저한 개선("다른(비-H-점수) 객관적 득점 매개변수들의 사용 효과" 표제 하의 섹션 3(f))을 보이지 못하였다. 앞으로는 보다 큰 데이터 베이스가 보다 양호한 규칙의 풀이를 허용할 수 있다.
iv. 마커당 사용자 공급된 가중 기준
본 발명은 비용 또는 공급 문제가 충분히 최상인 조합을 허용하지 않을 수도 있는 특징들의 입수 가능에 대해서도 적용할 수 있는 융통성이 있다. 예를 들어, 본 발명을 대체 조합의 발견을 위해 입수할 수 있는 특징들에 간단히 적용시킬 수 있다. 한편으로, 특징들의 선택에 사용되는 연산은 저렴한 비용 해법에 도달하기 위해 비용 가충치를 상기 선택 과정에 포함시킬 수 있다. 마커 성능 평가는 수집된 모든 마커들로부터 선택된 조합 또는 단지 하나의 공급자로부터의 조합을 제시한다. 상기는 또한 C4.5 패키지를, 고 비용을 근거로, 특정 탐침들의 하향 가중에 사용할 수 있는 방법을 제시한다. 이러한 탐침 조합뿐만 아니라 최적의 조합도 수행하지 못하지만, 성능은 비용이 중요한 인자인 상황에서 허용될 수도 있다.
v. 부류 당 사용자 공급된 가중 기준
사용된 방법들 중 일부는 상기 부류들에 가중치의 적용을 허용한다. 이는 수(tree) 디자인이 비용을 최적화할 수 있는 C4.5에서 이용될 수 있다. 또한, 식별 함수 방법은 목적하는 거짓 양성 또는 거짓 음성 확률을 제공하기 위해 사용될 수 있는 단일 매개변수 출력을 제공한다. 상이한 역치 조절점들에 대한 이들 매개변수들의 플롯은 수신기 작동 특징 곡선으로서 공지되어 있다.
vi. 검출 패널-가정
거짓 음성의 낮은 확률은 암 검출 과정에 바람직한 것으로 추정되었다(양성 환자들이 재선별을 요할 수 있는 증가된 수의 거짓 양성의 대가로 생략되는 것을 피하기 위해서). 암 식별 과정이 보다 낮은 거짓 양성 점수를 필요로 할 수 있음이 또한 추정되었다(잘못된 치료를 받는 환자들을 최소화하기 위해서).
허용 가능한 성능을 달성하기 위해서 6 개 이상의 탐침을 필요로 하는 검출 패널은 비용 효과적이지 않을 수 있는 것으로 추정되었다. 또한 5% 이상의 거짓 음성 오류율을 갖는 검출 패널은 허용될 수 없는 것으로 추정되었다. 상기 구간 밖에 있는 패널은 허용되지 않는다. 이러한 가정은 세포측정 패널이 여기에서 분석된 조직분석 기본 패널보다 더 나쁜 성능을 가질 수도 있음을 인정한다. 궁극적인 목표는 20% 오류율(이는 대략적으로 경부 Pap 바른 표본 선별기의 성능이다)보다 양호하게 수행하는 세포측정 패널일 것이다.
vii. 식별 패널-가정
6 개 이상의 탐침을 요하는 패널은 비용 효과적이지 않으며 20% 보다 양호한 오류율이 요구되는 것으로 추정되었다. 상기 구간 밖에 있는 패널은 허용되지 않았다.
b. 출력 데이터
본 분석에 의해 제공된 출력은 하기를 포함하였다:
·혼동 매트릭스
시험 세트로부터의 데이터가 참 양성, 거짓 양성, 참 음성 또는 거짓 음성으로 어떻게 분류되었는지를 나타낸다. 이를 실제 카운트로서 또는 퍼센트로서 나타낼 수 있다. 혼동 매트릭스는 "성능 매트릭스" 표제 하의 섹션 2(d)에서 논의된다. 혼동 매트릭스는 시험 세트로부터의 데이터가 참 양성, 거짓 양성, 참 음성 또는 거짓 음성으로 어떻게 분류되었는지를 나타낸다. 결정 수에 의해 분석된 데이터로부터 수득된 예시적인 혼동 매트릭스를 하기 표 12에 선암종, 편평 세포 암종, 대 세포 암종, 중피종 및 소 세포 암종의 동시 식별에 대해서 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00016
·오류율
상기 혼동 매트릭스 중의 데이터를, 수행된 총 분류 수에 의해 나뉘어진 모든 거짓 분류의 합으로서 요약한 것으로, 퍼센트로 나타낸다.
·수신기 작동 특징(ROC) 곡선
분류기에서 상이한 역치 수준들에 대해 추정된 거짓 양성 및 거짓 음성 점수들의 퍼센트(또는 단위 확률 당)를 나타낸다. 무작위 선택보다 양호하게 식별할 수 없는 중립 분류기는 동일한 참 및 거짓 판독치를 갖는 ROC 곡선을 제공할 것이다. 상기 곡선 아래의 면적은 50%(0.5의 확률)일 것이다.
·곡선 아래 면적(AUC)
종종 분류기 성능의 전반적인 평가로서 사용되며 대부분의 표준 식별 함수 패키지가 상기 AUC 형상을 제공한다. 완벽한 분류기는 100% 곡선 아래 면적을 가질 것이며 쓸모 없는 분류기는 50% 부근(0.5의 확률)의 AUC를 가질 것이다.
·감도 및 특이성(상기 혼동 매트릭스로부터 유도될 수 있다)
"감도 및 특이성" 표제 하의 섹션 2(d)(iii)을 참조하시오.
·마커 상관성 매트릭스
도 4를 참조하시오.
i. 검출 패널: 조성
상기 패널을 2 개의 부류, 즉 5 가지 암 중 임의의 것을 갖는 환자와 상기 암 중 어느 것도 갖지 않는 환자로 분류된 데이터 상에서 훈련한다. 모든 환자들에 대해 모든 탐침들이 존재하는 것은 아니었다. 하나 이상의 탐침이 특정 분석에 생략된 경우 이러한 사례를 상기 데이터로부터 삭제시켰다. 따라서, 분석을 감소된 수의 탐침 상에서 착수한 경우, 상기 데이터 세트는 약간 더 많은 사례들을 포함시킬 수도 있다.
분석에 포함시킨 탐침의 수는 27이었다. 많은 경우에 거짓 탐침이 첨가되지만, 이때 상기 탐침에 투입시킨 데이터는 0에서 12 사이의 번호를 균일하게 발생시키는 무작위 번호 발생기 세트로부터의 것이었다. 이러한 거짓 탐침을 탐침 선택 과정에서의 완전성을 보장하기 위해서 초기 분석에 많이 포함시켰다. 상기 거짓 탐침을 또한 하나의 접근방법에 사용하여 상기 분석으로부터의 탐침을 점진적으로 제거하였다. 상기 거짓 탐침보다 적은 정보를 제공하는 탐침을 쉽게 확인할 수 있으며 선택 과정에서 제외시킬 수 있었다. 상기와 같은 탐침의 조기 제거는 상기 분석의 속도를 높이며 상기 탐침에 의해 야기된 결과(잡음)의 변화에 덜 취약하게 만든다.
ii. 검출 패널 성능
상기 연구로부터의 출력으로서, 혼동 매트릭스, 오류율% 및 AUC에 관하여 평가된 상이한 방법 및 성능에 의해 선택된 탐침 조합들의 평가치를 기록한다.
iii. 검출 패널-또 다른 조성
검출 패널을 또한 감소된 탐침 세트로부터 선택하였다. 하나의 패널 세트에서, 상업적으로 바람직한 마커에 가중치를 둔 패널의 성능 크기를 얻었다. 새로운 식별 탐침들의 조합을 찾기 위해 최상의 탐침이 상기 분석으로부터 제거되었을 때 획득된 성능을 또한 분석하였다. 단독으로 작용하는 단일 탐침의 성능이 매우 높은 것으로 밝혀졌다(탐침 7). 그러나, 1차 식별 분석을 사용하여 평가된, 하기 표 13의 성능 도식에 나타낸 바와 같이 보다 많은 마커를 첨가함에 따라 성능이 개선되었다. 탐침들의 최상의 서브세트를 최상의 서브세트 로지스틱 회귀를 사용하여 결정하였다. 상기 개선은 통계학적으로 유의수준이다.
Figure 112005013102219-PCT00017
최선 및 차선 프로브 서브세트(최선 서브세트 로지스틱 회귀를 사용하여 결정되고 로지스틱 회귀를 사용하여 평가됨)를 아래에 나타낸다. AUC는 ROC 곡선의 아래 면적이다. 평균 AUC는 무작위 트레이닝 및 시험 구역(70%:30%)에 걸친 100번의 시도의 평균이다. 그 결과를 하기 표 14에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00018
ⅳ. 판별 패널-조합
본 연구 부분을 위하여, 5개의 분류자가 설계되고, 시험되었고, 각각은 모든 암환자로부터 하나의 암의 존재를 검출하도록 설계되었다. 이러한 5 방식 쌍-방식 시스템을 적용하면 의심스러운 케이스가 분석에서 한번 이상 나타나거나, 전혀 나타나지 않는다. 이러한 케이스들이 식별되어 정교한 정밀조사, 재시험 또는 대안적인 시험 관리에 들어간다.
연구에 사용된 프로브의 수는 여전히 27이고, 분석에서 수를 줄이기 위하여 거짓 프로브는 조기 단계에 사용한다.
ⅴ. 판별 패널-성능
위에서 설명된 성능 추정자를 사용하여 다른 기법에 의하여 발견된 최선 프로브 조합의 성능을 나타낸다.
ⅵ. 판별 패널-선택적 조합
상업적으로 바람직한 프로브를 포함하는 프로브 조합에 대해 상기 분석을 반복하였다. 성능은 떨어졌지만, 몇몇 감소된-세트 분류자에 있어서 이상한 일은 아니다. 아래에, (최선의 서브세트 로지스틱 회귀를 이용하여 결정된) 프로브 7을 포함하지 않는 최선의 프로브 서브세트를 도 15에 나타낸다. 데이터는 선형 판별 분석을 이용하여 평가되었다.
Figure 112005013102219-PCT00019
프로브 7을 포함하는 최선 및 차선 프로브 서브세트(최선 서브세트 로지스틱 회귀를 사용하여 결정되고 로지스틱 회귀를 사용하여 평가됨)를 아래에 나타낸다. AUC는 ROC 곡선의 아래 면적이다. 평균 AUC는 무작위 트레이닝 및 시험 구역(70%:30%)에 걸친 100번의 시도의 평균을 나타낸 것이다. 그 결과를 하기 표 16에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00020
2. 데이터 분석 방법론
이번 섹션에서는, 이용된 상이한 방법론으로부터의 결과를 해석하는데 안내로서 데이터의 구조의 초기 이해를 얻는 절차가 설명된다.
a. 편차의 분석
ⅰ. 병리학자대 병리학자 변동성 및 병리학자 스코어 풀링(pooling)
(1) t-시험
두 병리학자가 이 임상 시도에서 각각의 환자의 슬라이드를 조사하였다. 병리학자 1은 모든 환자를 조사하였고, 병리학자 2는 또한 이러한 세트의 약 절반의 환자를 조사하였고, 병리학자 3은 나머지 환자를 조사하였다. 병리학자의 수행의 일관성은 두개의 독립적인 H-스코어의 추정으로 시험될 수 있다.
용이하게 이용가능한 통계 도구를 사용하여 병리학자 사이의 변동성을 시험하였다. 이것이 쌍-샘플 t-시험이다. 이것은 각 쌍의 추정치 사이의 차이를 구하고, 이들을 평균을 내어 총 편차들중 비율로서 나타낸다. 이어서, t-시험은 이 비율을 두 개의 샘플 세트가 동일한 모집단으로부터 도출될 가능성을 추정하는 확률로 변환시킨다(P-값).
이 시험은 병리학자 1 및 병리학자 2에 의하여 조사된 모든 케이스 및 병리학자 1 및 병리학자 3에 의하여 조사된 모든 케이스에 대하여 각각의 마커 프로브에 대한 스코어에 적용하였다. (모든 프로브를 포함하도록) 적용된 27 시험 후, P=0.01의 낮은 값을 '유의적 임계값'으로 선택하였다. 각각의 프로브 및 두 쌍의 병리학자에 대한 P 스코어를 나타내는 결과를 다음의 표 17, 18, 19 및 20에 나타낸다. 병리학자 1 및 2가 병리학자 1 및 3보다 더욱 일관성이 있다는 점이 명백하다.
Figure 112005013102219-PCT00021
Figure 112005013102219-PCT00022
Figure 112005013102219-PCT00023
Figure 112005013102219-PCT00024
H 스코어는 주관적이기 때문에, 스케일 인자의 차이와 끝 케이스에서 노이즈가 있기 마련이다. 병리학자 1과 병리학자 2 사이의 통계적으로 다른 스코어를 보여주는 세 개의 특징에도 불구하고, 이 결합된 데이터는 대표적인 측정 도구로 허용되었다. 병리학자 1과 병리학자 2는 분석 절차에서 단일 데이터 세트로 결합되었다. 병리학자 3에 대한 결과는 독립적인 시험 목적으로 보류되었다. 병리학자 3의 데이터를 이용한 이러한 시험은 상당한 차이점 때문에 열등한 성능을 나타내는 것으로 편견을 가지게 된다.
병리학자 1 및 병리학자 2로부터 나온 데이터는 별도의 케이스로 간주하여 결합시키고, 변동성은 임의의 한가지 케이스에 대한 결과들 사이의 독립성의 정도를 제공한다. 상기 데이터로 시험할 때, 성능 추정은 더욱 낙관적인 값쪽으로 가게 될 것이다. 이는 동일한 환자로부터 발생하는 샘플은 트레이닝 및 시험 서브세트에서 동시에 발생하기 때문이다. 하지만, 이것이 특징들의 최적의 조합을 발견하는데 이용된 절차를 무의미한 것으로 하는 것은 아니고, 성능의 추정에 대하여 편견을 갖게 하는데 불과하다.
(2) H-스코어의 편차의 분석
(a) 배경
많은 이유로 인하여 각각의 프로브에서 H-스코어는 다양할 수 있다. 질병의 유형으로 인하여 일관적으로 변하는 한 유용하고, 무작위 편차가 편차의 이전의 두 소스를 검출하는데 한계를 설정하는데 반하여, 병리학자가 슬라이드를 읽음으로 발생한 편차는 유용하다.
편차의 분석(Analysis of Variance; ANOVA)은 데이터에서 편차의 소스를 분할하고, 통계적인 유의수준을 시험하기 위한 표준 기법이다. ANOVA는 편차의 구체적 소스 또는 원인이라고 생각될 수 있는 항들의 합으로서 데이터 세트의 총 편차를 요약한다.
ANOVA는 많은 통계 팩키지에 사용가능하다. 공유 팩키지 "R"("통계적 계산을 위한 R 프로젝트", http://www.R-project.org/)을 선택한다.
(b) 목적
병리학자 1 및 2로부터 H-스코어 데이터에 대한 ANOVA 분석을 수행하고, 이 데이터가 패널의 선택을 위한 추가의 분석을 위해 하나의 일관된 세트로 안전하게 병합될 수 있는지의 여부를 고려하기 위한 것이다.
(c) 방법론
이 데이터베이스로부터, 데이터는 병리학자 1과 병리학자 2로부터 선택되었다. 주어진 프로브에 대해 완성된 유일한 데이터는 상기 프로브를 위한 ANOVA에 이용되었다.
폐공기종, 육아종병 및 간질 폐 질병의 대조 카테고리를 함께 그룹화하고 '정상'으로 칭하며, 인자 질병 안에서 6개의 레벨을 부여한다.
병리학자는 두 개의 레벨(병리학자 1, 병리학자 2)을 갖는 인자로 암호화되었다.
R 스크립트를 작성하여 다음의 인자들, 즉 질병, 병리학자, 및 상호작용 항 질병:병리학자를 이용하여 순서대로 각각의 프로브에 대하여 표준 ANOVA 분석을 수행하였다. 그 결과가 아래의 표 21에 도시된다. "Df"는 자유도로 정의된다. n개 관찰자의 데이터세트중, 평균으로부터 n-1개의 편차를 알면 n번째는 자동으로 결정된다. N-1은 자유도의 개수이다. 합계 Sq 및 평균 Sq는 편차의 측정기준이다. F는 F 분포를 기준으로 한 2개의 편차의 균등성에 관한 시험 통계이다. Pr(>F)는 변동성이 통계적으로 유의수준인지 아닌지를 결정하는데 이용되는 확률이다.
Figure 112005013102219-PCT00025
Figure 112005013102219-PCT00026
Figure 112005013102219-PCT00027
Figure 112005013102219-PCT00028
Figure 112005013102219-PCT00029
Figure 112005013102219-PCT00030
(d) 결과의 분석
모든 경우(프로브 21은 제외)에서 프로브의 응답은 질병과 관련되었다. 프로브들이 이러한 목적으로 예상하에 선택된 것이기 때문에 놀라운 일은 아니다. 어떤 경우에도 병리학자와 관련된 프로브의 응답은 존재하지 않았다(p=0.05 레벨에서). 이것은 이 데이터들의 병합이 안전하고, 데이터 상의 두개의 측정치로서 두 병리학자를 이용할 수 있다는 것을 의미한다.
프로브 7, 14, 17의 몇몇 케이스에서 상호작용 항이 유의성을 갖는다는 몇가지 증거가 있다. 이것은 몇몇 질병의 스코어를 매길 때 병리학자들 사이의 일부 차이가 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 몇몇 케이스는 데이터에서 가끔 있는 특이한 값으로 인한 것일 가능성이 많다.
(e) 결론
상기 결과는 추가 분석을 위하여 이 데이터를 병합하는 것이 안전함을 알려준다. 데이터는 일부 케이스에서 병리학자와 질병 사이에 미소한 상호 작용이 무작위 소스에 기인한 것으로 나타난다는 것을 알려준다.
ⅱ. 환자대 환자 변동성
환자대 환자 변동성은 섹션 2(a)(ⅰ)(2)의 질병:질병 변동성에 의해 측정된다(상기 "H-스코어의 편차의 분석"을 참고하라).
ⅲ. 마커대 마커 변동성
대조군대 암에 대해서 각각의 프로브에 대한 마커 스코어의 분포를 도시하는 막대그래프가 도시되었다(PathologistData.xls, 워크시트:막대그래프).
b. 마커 상관행렬 분석
모집단 상관 계수("Applied Multivariate Statistical Analysis", R. A. Johnson and D. W. Wichern, 2nd Ed, 1988, Prentice-Hall, N.J.)는 한 쌍의 무작위 변수 사이의 선형 연관성의 양을 측정한다. 전형적으로 무작위 변수의 분포 및 연관 파라미터는 알려져 있지 않고, 모집단 상관 계수는 직접 계산될 수 없다. 이 경우, 샘플 데이터로부터 샘플 상관 계수를 계산하는 것이 가능하다. 도 4를 참고하라. 하지만, 샘플 상관 계수는 모집단 상관 계수의 추정에 불과하다. 게다가, 샘플 데이터를 기초로 계산되기 때문에, 실제로는 대응하는 무작위 변수들 사이의 실질적인 관계가 없다고 하더라도, 순전히 우연히 강한 긍정 또는 강한 부정의 상관관계를 가리킬 가능성이 존재한다("Modern Elementary Statistics", J. E. Freund, 6th Ed, 1984, Prentice-Hall, N. J.).
상관 계수는 하나의 변수가 다른 것을 예측하는 능력을 측정한다. 하지만, 강한 선형의 연관성은 인과적 관계를 의미하는 것이 아니다. 상관 계수의 제곱은 결정계수로 칭한다. 이변량(bivariate) 데이터 세트용으로 계산된 결정계수는, 나머지에 대한 선형 관계에 의하여 계산될 수 있는 하나의 변수에서 변동성의 비율을 측정한다. 다양한 변수들을 처리할 경우, 상관 계수는 차례대로 각각의 쌍에 대하여 계산될 수 있고, 계수의 세트는 상관행렬로 알려진 행렬로 기록될 수 있다. 도 4를 보라.
개개의 마커에 대한 H-스코어는 무작위 변수로 설계될 수 있다. 이 다변량 데이터 세트에 대한 샘플 상관행렬은 위의 '입력 데이터'로 명명된 섹션에서 설명된 입력 데이터로부터 계산될 수 있다.
c. 패턴 인식
통계적 패턴 인식은 정량적 측정을 기본으로 한 분류 신호 또는 기하학적 대상으로의 접근이다(특징으로 불림). 통계적 패턴 인식은 필수적으로 관심 대상의 카테고리 또는 부류에 상응하는 영역으로 n-차 특징 공간을 나누는 문제로 환산된다. 본 연구에서 채택된 3가지 상이한 분류자 방법론은 데이터 내에서 다른 구조 형태에 민감하다.
결정 트리법(decision tree method)에서, 상이한 데이터 조합의 우선 분석은 검출 패널을 위한 C4.5에 의해 결코 이용되지 않는 마커들을 식별한다. 이들은 분석에서 제외되고, 더욱 일관성 있는 결과, 즉 노이즈가 선택 방법에 도움이 되게만 하는 제외된 프로브를 나타내는 일관성 있는 결과를 생성한다.
유사하게, 검출 패널에 이용된 프로브의 우선 분석은 세부 분석에 앞서서 제거를 위해 노이즈 있는 프로브를 식별하였다.
SPSS에서 선형 판별 함수법(Linear Discriminant Function method)은 분석에서 마커의 수를 줄이기 위하여 고유한 순차적 프로세스를 갖는다. 전형적으로, 이는 분석에 이용된 프로브를 2 내지 7까지 줄였다.
R 및 SAS에서 로지스틱 회귀법은 변수 선택을 위한 순차적 절차를 수행한다. SAS에서, 최선의 서브세트 변수 선택 옵션이 또한 제공된다. R에서, 순차적 방법론이 다중 무작위 시도와 결부되어, 주어진 특징이 트레이닝 및 시험 데이터(각각, 구역 70%:30%)의 100개의 무작위 선택에 사용되는 회수를 기준으로 변수들을 선택하기 위한 발전적 방법을 개발하기 위해 사용되었다. 인위적인 무작위 특징의 개수에 필적할 만한 개수의 특징들을 특징의 최소한의 일관성 세트가 100회 수행에 걸쳐 달성될 때까지 누진적으로 제거하였다.
ⅰ. 통계적 방법
다변량 통계 분석의 관점으로부터, 문제는 고차원 공간에서 밀도 함수를 추정하는 것( 및 이 공간을 관심있는 영역으로 분할하는 것)의 하나이다. 무작위 (특징) 벡터의 분포가 알려져 있다고 가정하면, 이론적으로 최선의 분류자는 분류 오류의 가능성을 최소한으로 한다는 이유로, 베이스(Bayes) 분류자이다(K. Fukunaga, 'Statistical Pattern Recognition', 2nd Ed., Academic Press 1990, p.3). 불행하게도 베이스 분류자는, 특히 특징 공간의 차원이 높을 때, 그 복잡성 때문에 그 실행이 어렵다. 실제로, 더욱 단순한 파라미터 분류자가 이용된다. 파라미터 분류자는 기본적인 밀도 또는 판별 함수에 관한 가정에 기초를 둔다. 가장 일반적인 분류자는 선형 및 이차 분류자이다. 다변량 통계 분석에서 이러한 분류자는 판별 분석의 방향과 일치한다. 판별 분석 기술은 다변량 선형 회귀 모델 및 일반화된 선형 모델(로지스틱 및 다항 회귀를 포함)과 밀접하게 연관된다.
(1) 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀
(a) 배경
검출 패널에 사용되는 마커의 세트를 선택하는데 문제는 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀의 문제로 공식화될 수 있다. 응답 변수는 정상인(암이 아닌) 경우 및 비정상적인(암인) 경우의 두개의 레벨을 갖는 인자이다. 설명적 변수는 마커 H-스코어이다.
또한, 암 판별 패널에 이용되는 마커의 세트를 선택하는데 문제도 이항 응답을 갖는 로지스틱 회귀의 문제로 공식화될 수 있다. 응답 변수는 정상인(관심 대상인 암이 아닌) 경우와 비정상적인(관심 대상의 암인) 경우의 두 개의 레벨을 갖는 인자이다. 설명적 변수는 마커 H-스코어이다.
순차적인 변수 선택이 두개의 부류 사이를 판별하는데 이용하기 위한 원래의 변수(마커)의 서브세트를 선택하는데 이용된다. 이것은 계산적으로 비싼 시행이고, 컴퓨터에 가장 적합하다. 여러 시판되는 공유 소프트웨어 팩키지-예를 들면, R, S-플러스, 및 SAS-가 순차적인 로지스틱 회귀를 실행한다.
특징 선택에 대한 두개의 상이한 접근이 R 및 SAS 각각에서 발견되는 순차적인 변수 선택 절차에 기초하여 연구되었다.
(b) 실험 데이터
본 분석에 사용된 데이터는 병리학자 1 및 병리학자 2에 의하여 조사된 케이스에 대해 마커 1 내지 17, 및 19 내지 28에 대한 H-스코어로 구성되고, 이러한 기록으로 본 발명의 다른 곳에서도 설명되었다. 또한, 무효 마커 18을 데이터 세트에 추가하였다. 무효 마커는 균일한 분포로부터 무작위로 선택된 0에서 12까지의 정수로 구성된다.
(c) 방법 1: R 팩키지(버젼 1.4.1)를 사용
컴퓨터로 처리된 모델 피팅(fitting) 절차는 일반적으로 분실 자료를 다룰 수 없다. 이것은 R에 이용되는 glm(glm은 일반화된 선형 모델을 의미한다) 절차를 위한 케이스이다. 결과적으로 glm을 이용하여 모델을 피팅할 때, 하나 이상의 분실 값이 있는 모든 케이스는 제외해야 한다. 초기 전체 모델을 피팅할 때, 27개의 실제 마커 및 한개의 무효 마커를 포함하므로, 이것은 단지 202 케이스로 데이터 세트를 줄인다. 몇 번의 관찰에서, 변수 선택을 수행하고 선택된 변수를 이용하여 분류자를 트레이닝하고, 그 성능을 평가하기 위한 최선의 방법은 트레이닝 및 시험 세트로의 데이터의 무작위 분할에 대해 100회 시행을 수행하는 것이라고 결정되었다.
(ⅰ) 데이터를 트레이닝 및 시험 세트로 분할
각각의 시행의 시작 시, 데이터는 시험 세트 및 트레이닝 세트로 분할된다. 이것은 무작위로 30%의 비정상인 것과 30%의 정상적인 것을 선택하여 수행되어 시험 세트를 형성하고, 나머지 관찰치를 사용하여 트레이닝 세트를 형성한다.
(ⅱ) 변수(마커) 선택
각각의 시도의 시작 시, 모든 변수(마커)를 포함하는 전체 모델을 트레이닝 데이터에 피팅한다. R에서 로지스틱 회귀 모델은 glm을 이용하여 피팅된다. 이용된 코드 프레그먼트는 다음과 같다:
my.model <- Class ~X1 + X2 + X3 + X4 + X5 + X6 + X7 + X8 + X9 + X10 + X11 + X12 + X13 + X14 + X15 + X16 + X17 + X18 + X19 + X20 + X21 + X22 + X23 + X24 + X25 + X26 + X27 + X28
my.glm <- glm(my.model, family=binomial(link=logit), data=training.data)
이어서, stepAIC 절차를 사용하여 아카이케 정보 기준(Akaike Information `Croteria; AIC)에 기초한 순차적 변수 선택을 수행하였다. 이 절차는 공적으로 이용가능한 MASS 라이브러리의 일부이다. 라이브러리 및 절차는 문헌["Modern Applied Statistics with S-PLUS"(W. N. Venables and B. D. Ripley, Springer-Verlag, Pathologist Yew York, 1999)]에 설명되어 있다. 이것을 수행하는 R 코드 프레그먼트는 다음과 같다.
my.step <- stepAIC(my.glm, direction=both)
결과 모델은 시험 데이터에 대해 평가된다. 이용된 코드 프레그먼트는 다음과 같다.
probability_is_abnormal <-
predict(my.step, testing.data,type="response")
분류자의 성능은 오분류의 실제 에러율(actual error rate of misclassification; AER) 및 ROC 곡선 아래의 면적(AUC)으로 기록된다. 100회의 시도 후, 100개의 모델과 연관된 AER 및 AUC가 남는다. 빈도표는 100개의 모델에서 각각의 변수가 몇 번 발생했는지를 기록하도록 구성된다. 예를 표 22에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00031
이 표는 어떤 마커가 폐기되는지를 결정하는데 이용된다. 첫째, 10 이하의 빈도를 갖는 모든 마커는 폐기된다. 다음으로, 탈락되는 빈도는 무효 마커의 빈도에 기초해서 선정된다(일반적으로 무효 마커의 1 또는 1.5배이다). 이 탈락 값보다 작은 빈도를 갖는 모든 마커는 폐기된다. 무효 마커와 함께 남아 있는 마커는 또 다른 100회의 시도를 위한 전체 모델로 이용되고, 삭감 절차가 반복된다. 필요하다면, 하나 이상의 마커가 모델을 벗어나게 강제하도록 삭감의 엄격함이 증가될 수 있다. 필요하다면, 남은 마커가 다른 100회의 시도를 위한 전체 모델로 이용될 수도 있다. 삭감은 패널 맴버의 의도하는 수가 도달했거나 현재 모델의 평균 AUC가 진행된 모델의 평균 AUC보다 적을 때 중지된다.
삭감 방법을 설명하기 위하여 상기 표를 참고한다. 상기 표는 검출 패널 데이터를 이용하여 얻어졌다. 어두운 부분은 삭감 후에 잔류한 마커를 가리킨다. 다른 100회의 시도가 다음의 전체 모델을 이용하여 수행된다:
my.model <- Class ~ X6 + X7 + X8 + X12 + X16 + X18 + X23 + X25
또한, 빈도 표, 표 23을 작성한다:
Figure 112005013102219-PCT00032
어두운 부분은 (47의 탈락을 이용한) 삭감 후에 잔류한 마커를 가리킨다. 다른 100회의 시도가 다음의 전체 모델을 이용하여 수행된다.
my.model <- Class ~ X6 + X7 + X8 + X12 + X18 + X23 + X25
또한, 빈도 표, 표 24를 작성한다:
Figure 112005013102219-PCT00033
이 시점에서 50의 탈락이 선택된다. 어두운 부분은 5 맴버 패널상에 사용하기 위한 잔류 마커를 나타낸다. 각각의 단계에서, 평균 AUC는 증가한다: 94.37% -> 95.45% -> 95.78%.
(ⅲ) 패널의 성능 평가
패널의 성능을 평가하기 위하여, 앞에서 보듯이 순차적 선택 절차없이 100회의 시도가 수행되었다. 각각의 시도에 대하여, AUC, 민감도(sensitivity), 및 특이성(specificity)이 기록된다. 위의 검출 패널 예에 대한 결과는 다음과 같다:
Figure 112005013102219-PCT00034
요약하면, 패널은 97.37%의 민감도 및 97.49%의 특이성을 갖는다. ROC 이하의 면적은 96.01%이다.
(d) 모델 2: SAS(버젼 8.2)를 이용
로지스틱 회귀가 LOGISTIC 절차를 이용하는 SAS으로 수행될 수 있다. 응답 변수가 두개의 레벨 요소일 때, 절차는 이항 로짓 모델(binary logit model; equivalent to glm in R with family = binomial and link = logit)을 피팅한다. SAS는 특정된 모델에 대하여 모든 분실된 다변량 관찰값을 자동으로 제외시킨다. R과 달리, SAS는 최선 서브세트 변수 선택 절차를 수행하는데 이용될 수 있다. 이를 수행하는데 필요한 SAS의 코드 프레그먼트는 다음과 같다:
PROC LOGISTIC DATA = WORK.panel;
CLASS Class;
MODEL Class = X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28/SELECTION= SCORE BEST = 28;
RUN;
이 절차는 전체 데이터 세트에 적용된다. 파라미터 BEST=28은 최선의 28 단일 변수 모델, 최선의 28 이-변수 모델, 최선의 28 삼-변수 모델에서 최선 28, 28-변수 모델을 찾기 위한 SAS를 가리킨다.
(ⅰ) 패널의 성능을 평가
방법 1에 설명된 절차는 각각의 패널의 성능을 평가하는데 이용된다. 다음의 표 25는 검출 패널 데이터로부터 작성되었다. 두개의 최선 1-, 2-, 3-, 4-, 5 마커 패널만을 위한 결과를 보여준다.
Figure 112005013102219-PCT00035
(2) 선형 판별 분석법
(a) 배경
상업적으로 유통되는 통계 팩키지 SPSS는 간단한 선형 판별 함수가 디자인되고 시험될 수 있게 하는 절차를 갖는다.
흔히 사용되는 방법은 피셔 선형 판별 함수(Fisher's Linear discriminant function)이다. 이 방법으로 부류의 양호한 분리를 제공하는 특징 공간에서 하이퍼-플레인(hyper-plane)을 찾아낼 수 있다. 부류 분포가 상이한 평균을 갖지만 유사한 다변량 가우스 분포(Gaussian distribution)를 갖는 2개의 부류 문제에 있어서, 이러한 분류자는 최적 성능을 제공한다. 이 방법은 다중-부류의 문제로까지 볼 수도 있는데 이 연구에서는 적용되지 않았다.
이 방법은 그 접근에 있어서 극단적으로 단순화한 것이지만 많은 수의 특징을 포함하는 데이터 세트의 경우에 관련된 문제에 강하다(케이스 번호 27에서 프로브는 단지 2백개의 표본(케이스)를 포함하는 데이터 세트에 대한 문제를 나타낸다).
상기 팩키지는 판별 과정에 잘 기여하는 특징들을 식별하기 위한 절차를 갖는다. 일단 이러한 "순차적 방법"은 특징을 가장 잘 판별한다. 다른 특징들을 서열적으로 더하고 분류자에 대해 평가한다. 조합은 최종 솔루션이, 더욱 양호한 조합이 발견된다면 초기에 선택된 특징들을 제외하도록 이루어진다. 특징의 수는, 통계적 시험이 나머지 특징들이 분류 과정에 신뢰할 정도로 기여하지 않음을 나타낼 때까지, 점차적으로 증가한다.
성능의 추정은 리브 원 아웃 방법(leave one out method)에 의해 이루어진다. 이 방법은 트레이닝 세트를 형성하기 위해 데이터 세트로부터 하나의 샘플을 제거한다. 제외된 샘플은 시험 세트로서 보유되고, 분류자에 적용되며, 결과 분류치는 혼돈행렬(confusion matrix) 안에 축적한다. 절차를 상기 데이터의 케이스에 대해 반복한다. 이러한 절차는 성능의 공평한 추정을 가능케하지만, 이러한 추정은 높은 편차를 가질 것이다.
SPSS에서, 분석을 위한 적절한 데이터 세트를 선택한 후, 표에서 'Analyze', 'Classify', 'Discriminant...'를 선택하고, 'Fishers method', 'leave one out testing' 그리고 'use stepwise method'를 선택한다. 그룹핑 변수로서 진단법을 입력하고, 독립인자로서 모든 특징을 입력한다. 'OK'를 입력하여 분석을 완료한다. 다른 파라미터를 위한 프리-세트 값이 설정된대로 남아 있다.
분석 결과는 분석에서 사용된 특징들의 목록 및 정규 판별 함수(canonical discriminant function), 혼돈행렬 및 정-분류율(correct-classification rate)을 포함한다(1-에러율).
ROC 곡선을 계산하기 위해서, 정규 판별 함수를 선택된 특징들에 적용하여 새로운 특징을 만들어 낸다. SPSS에서는 이 곡선을 만들기 위해 Graphs, ROC를 사용한다.
ii. 계층적 방법: 결정 트리분석(Decision tree)
(1) 배경
결정 트리분석(Decision tree) 학습은 귀납적 추리에 가장 널리 이용되고 실용적인 방법이다. 이 방법은 노이즈가 있는 데이터에 강한 방법이며 선언(disjunctive) 명제들을 학습할 수 있다(Tom M. Mitchell, 'Machine Learning', McGraw-Hill, New York, NY, 1997.).
가장 대중적이고, 손쉽게 이용할 수 있는 기계 학습 팩키지는 "C4.5"라는 것이고, 그 소스 코드가 문헌(J. Ross Quinlan, 'C4.5 : Programs for Machine Learning', Morgan Kaufmann, San Mateo CA, 1993)에 실려 있다.
결정 트리를 트레이닝하면(트레이닝 데이터에 적용시키면), 이 알고리듬은 최선의 결정을 내리기 위해서 결정 트리의 각 결절(node)에서 어떤 데이터의 속성을 어느 결절에서 사용할 것인지를 결정하게 된다. 따라서, 결정 트리가 완전히 작성되면, 사용할 만한 세트와 무시될 다른 것을 선택할 것이다. 이러한 적용으로, 결정 트리를 이용하여, 분자 프로브로부터 얻어진 측정치를 처리하고, 효과적으로 프로브의 패널을 선택하며, 데이터의 분류를 잘 나타낼 수 있는 프로브 스코어들을 조합하는 방법을 선택하게 된다. 공평한 패널 수행의 추정을 위해서는 결과적인 트리는 트레이닝에 사용되지 않은 데이터상에서 평가되어야 한다. 이러한 평가를 수행하기 위한 표준적인 기법으로서 교차검증이 있다. 10-배 교차검증이 사용되었다.
교차검증은 제한된 데이터를 최대한 잘 이용하는 기법이다. 10-배 교차검증에서는, 데이터가 무작위로 10개의 가장 비슷한 크기의 구역으로 나누어져, 각 구역에 걸쳐 한 부류에서 거의 동수의 케이스들을 갖도록 관리하게 된다. 그 후, 결정 트리가 결합된 구역 2-9상에서 트레이닝되고 구역 1에서 시험된 후, 결합된 구역 1, 3-9에서 트레이닝되고 구역 2에서 시험되고, 계속해서 데이터를 통해 보유된 시험 세트를 한번 회전하는 10회 시도를 수행한다. 이러한 방식으로 시험은 보유 데이터상에서 연속적으로만 수행되고 따라서 공평하고, 모든 데이터는 정확히 1회 시험되어 전체 데이터 세트에 걸친 집합 에러율(aggregate error rate)이 계산될 수 있다.
트리는 통상적으로 트레이닝 데이터에 가장 잘 피팅될 때까지 작성되고, 이후 '노이즈가 있는' 가지들과 잎들을 잘라냄으로써 '삭감'된다. 이는 보이지 않았던 데이터들에 대해서도 결정 트리의 일반화 능력을 향상시키고 이는 양호한 성능을 얻기 위해 필수적인 것이다. C4.5 팩키지는 트리를 삭감하는 2가지 방법을 포함하는데, 하나는 표준 트리 삭감 알고리듬(standard tree pruning algorithm)이고, 두번째는 규칙 추출 알고리듬(rule extraction algorithm)이다. 일반적으로 트리를 기본으로 하는 방법은 이 데이터에 대해 우수한 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 여기에서는 규칙-기본 방법은 기록하지 않는다.
(2) 자료 준비
정상 조직과 다섯가지 다른 종류의 암(샘암종, 거대세포 암종, 중피종, 소세포 폐암, 및 편평세포암종)에 대한 여러 개의 프로브의 응답에 대한 데이터가 다른 곳에서 언급한 바와 같이 얻어졌다. 프로브 1-28, 및 병리학자들 병리학자 1 및 병리학자 2에 대한 H-스코어를 데이터베이스로부터 추출해 플랫 데이터 파일에 넣었다. 결정 트리 분석시, 각 데이터 포인트(동일 물리적 슬라이드에 대한 두 병리학자에 의해 공정한)를 염색에 대한 질병의 효과의 독립적인 관찰자로 취하였다. 이것은 분류의 수행에 약간의 긍정적 편견을 가져올 수는 있으나 패널 선택에 영향을 주지는 않는다.
·폐공기종, 육아종병 및 간질 폐 질병의 대조 카테고리를 함께 그룹화하고, "정상"으로 칭한다.
·검출 패널로서 모든 암을 함께 그룹화하고 "비정상"이라 칭하고 이를 2-부류 문제로 만든다.
·단일 판별 패널로서, 데이터로부터 정상 케이스들을 꺼내어 5-부류 문제를 형성한다.
·보류 판별 패널로서, 각 암들을 차례로 보류하고, 남아있는 암들에 대해서는 '기타'로 그룹화시켜 5개의 2-부류 문제 세트를 만들었다.
C4.5는 본 분석에 포함될 데이터와 그 속성에 대해서 기술해 줄 수 있는 '.names' 파일이 필요하다. 판별 패널에 대한 네임 파일의 예는 하기 표 26에 나타나 있다.
Figure 112005013102219-PCT00036
프로브 18이 데이터로부터 빠져있어 'ignore'로 설정되었다. 네임 파일에서 속성을 'ignore'로 설정하는 것은 패널들로부터 프로브를 정리할 수 있는 쉽고도 효율적인 방법이라 데이터 분석에서 사용된다.
(3) 데이터 분석
팩키지를 위한 C4.5. 표준(default) 파라미터가 제공된 'xval.sh' 스크립트를 이용하여 각 데이터 세트에 대해서 10배 교차검증을 수행하였다. 교차검증은 작은 데이터 세트에 대한 분류자 트레이닝 및 시험을 위해 개발된 기법이다. 이 기법은 데이터를 무작위로 N개의 같은 크기의 구역으로 나누는 것을 포함한다. 이후 분류자는 N-1 구역들에 대해서 함께 트레이닝을 실시하게 되고, 남아있는 구역에 대해 시험하게 된다. 이것은 N번 반복된다.
하나의 교차검증(CV) 시도에서 트레이닝된 결정 트리가 다른 CV(선택된 프로브와 트리 계수가 다른)에서 얻어진 트리와 다를 수도 있기 때문에, 각 프로브가 트리에 의해 10번의 시도에서 선택되는 회수가 계산된다.
10번의 CV 시도중에서 삭감된 트리에서 5회 이상 발생하지 않는 프로브를 'ignore'로 세팅시켜 프로브를 첫 번째로 추려낸다.
그후, 후보 프로브들의 더 작은 세트에 대해서 교차검증을 반복한다. 10번의 CV 시도중에서 삭감된 트리에서 5회 이상 발생하지 않는 프로브를 'ignore'로 세팅시켜 프로브를 두 번째로 추려낸다. 임의의 추가의 프로브가 누락되면, 세 번째의 CV를 실시한다.
패널들은 다양한 수행을 통해 선택되었고, 추정된 에러 수행 또한 아래 결과 표에 나타내었다. 결정 트리 분석에 대한 패널 수행 결과를 아래 표 27에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00037
소세포폐암과 다른 남아있는 4가지 유형의 암 사이를 판별하기 위해, 아래 표 28 및 29에 예시적 결정 트리 구조를 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00038
Figure 112005013102219-PCT00039
순차적 선형 판별에 대한 패널 수행결과를 아래 표 30에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00040
순차적 로지스틱 회귀 분석법에 대한 패널 수행 결과를 다음 표 31에 나타낸다.
Figure 112005013102219-PCT00041
iii. 신경 네트워크 및 대안 방법
인공 신경 네트워크 ANN's는 패턴 인식 기술의 후보로서 본 발명과 관련된 특징을 선택하고 분류자(classifier)를 디자인하는데 바로 적용할 수 있다. 그러나, 이러한 기술은 데이터의 구조 및 LDF가 제공하는 방식에서의 특별한 프로브(probe)의 영향에 대한 여하한 정보를 제공하지 못한다. 따라서, 이러한 부류의 알고리즘은 본 연구에서는 사용되지 않았다. LDF는 선형 판별식(discriminant) 함수, 그 결과가 분류를 결정하는데 시발점이 되는 특징의 선형 조합을 의미한다.
이러한 부류의 기술은 다층구조인식자(Multi-Layer Perceotron, MLP), 백프롭(Back Prop), 코호넨의 자기 조직화 맵(Kohonen's Self-Organizing Maps), 학습벡터 양자화(Learning Vector Quantization), K-nearest Neighbors 방법 및 유전자 알고리즘(Genetic Algolithm)과 같은 알고리즘을 포함한다.
iv. 특별한 토픽
(1) 가정
ㆍ선형 판별식 분석
ㆍ상기 두가지 분류를 위한 공분산 매트리스가 동일하다고 가정하라.
ㆍ상기 두가지 분류들이 다변수 정규(multivariate normal)일 경우에만 오분류(misclassification)의 코스트(cost)를 최소화하라.
ㆍ설명변수는 비연속 범주형이라기보다 연속이라고 가정하라(본 연구에서, 실제로(즉, 자동화된 시스템에서) 세기는 연속적인 스케일로 얻어질 수 있지만 H-스코어는 비연속 범주형이다)
ㆍ로지스틱 회귀(이명법 일반화된(binorminal generalized) 선형 모델)
Venerables와 Ripley의 7장("Modern Applied Statistics with S-Plus"(W.N. Venerables and B.D. Ripley, Springer-Verlag, Newyork, 1999))를 참조하라.
(2) 마커 기각(Marker rejection)
판별식 분석 및 퇴보 절차의 컴퓨터처리된 임플러멘테이션(implementation)은 점진적인 변수선택 절차; 즉, R에서의 stepAIC를 포함한다. 이러한 절차는 설명 변수로서 사용하기 위한 변수들의 최선의 부분집합을 선택하기 위해 디자인된다. 실제로, 이러한 절차의 단계적인 특성때문에 최선의 변수들이 예상을 위해 선택된다는 것을 보장할 수는 없다(Johnson and Wichern, p.299). 그럼에도 불구하고 이러한 절차는 마커 선택 및 비선택(de-selection)을 위한 기초를 제공한다.
(3) 쌍별 테스트(pairwise test)
다분류 분류자를 귀자인하는데 있어서 원천적인 문제는 "Applied Multivariate Stastical Analysis", R.A. Johnson and D.W.Wichern, 2nd Ed, 1988, Prentice Hall, N.J에 논의되고 있다. 이는 몇몇의 별개의 2분류 분류자(차별화 패널)를 개발하는 동기가 된다.
(4) 패널 구성에 있어서 고려의 잉여
"선형모델은 고전 통계학의 핵심을 구성하며 통계적인 실무에 있어서 여전히 근간을 형성한다." "Modern Applied Statistics with S-PLUS"(W.N. Venerables and B.D. Ripley, Springer-Verlag, Newyork, 1999). 선형 모델은 t-테스트, 분산의 분석(ANOVA), 회귀분석은 물론 판별식 분석을 포함하는 다양한 다변량 법(multivariate methods)의 기초가 된다. 설명변수들은 1차 텀(term)으로서 상기 모델에 입력될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 이는 (비선형) 로지스틱 회귀에서도 사실이다. 로지스틱 회귀모델은 선형 회귀 모델의 단순한 비선형 변형이다: 의존 변수는 로그 오즈 비(log odds ratio)(logit)에 의해 대체된다. 요약하면 이러한 통계법은 설명변수들 간의 선형 상관관계에 기초한다. 따라서, 패널들에 있어서의 잉여를 찾는 한가지 방법은 고도로 상호관련된 변수(마커들)를 확인하는 것이다. 패널에 있어서 유사한 성능을 달성하기 위해, 하나의 마커를 다른 마커로 대체하는 것이 가능할 수 있다.
패널들에 있어서의 잉여를 찾는 또 다른 방법은 "최상의 부분집합" 회귀분석을 채택하는 것이다. 관심의 대상이 되는 모든 설명변수들을 통해 모델을 시작한다고 가정했을 때, 그 목적은 최상의 단일-변수 회귀 모델, 최상의 이중-변수 회귀 등을 찾는 것이다. 이들 방법론은 SAS 통계 패키지에 제공된다.
(5) 가중치 점수(weighting scores)의 이용
(a) 상업적 및 임상적 고려
전략 및 상업적 요소; 코스트;입수용이성;사용편이성 등의 다양한 이유로 인해, 패널에 있어서 임의의 프로브를 선택하는 것을 독려하고 다른 프로브의 선택에 벌점을 줌과 동시에, 패널 크기 또는 성능에 대비하여 이들을 상쇄시키는 것은 바람직할 수 있다.
(b) 속성 코스팅(attribute costing)
그러한 속성 가중치(결정 수형도(decision tree)에 있어서의)를 위한 방법은 배경지식의 포함과 같은 다른 문맥에서의 기계 학습 문헌(M.Nunez,"The Use of Background Knowledge", Machine Learning 6 : 231-250, 1991.) 및 로보틱 센서로부터 정보를 얻는 차별적인 코스트(M.Tan,"Cost-sensitive Learning of Classification Knowledge and its Applications in Robotics", Machine Learning.13 :7-33, 1993)에 제안되었다.
이러한 코스트-의존 알고리즘은 "C4.5 (J. Ross Quinlan,"C4. 5 : programs for machine learning", Morgan Kaufmann, CA. 1993)으로 알려져 있는 표준 기계학습 소프트웨어 패키지에 대한 미세한 변화에 의해 문헌에 제공되었다. 편의를 위해, 이러한 접근은 Nunez의 "EG2" 알고리즘의 제공에 이르게 되었다.
C4.5 결정 수형도 시공단계에 있어서, 알고리즘은 개개의 가능한 속성을 스플릿 온(split on)에 비교하고 얻어지는 정보 Gi를 최대화하는 단일 속성을 선택한다. EG2 알고리즘에 있어서, (2 Gi -1)/(Ci+1)는 최대화되고, 속성 i를 위한 정보 코스트 Ci를 포함한다. 가중치의 벡터는 사용자에 의해 a priori로 세팅될 필요가 있다.
(i) 코드 수정
C4.5 소스 코드는 M. Nunez에 의해 제안된 economic generalizer "EG2" 알고리즘을 제공하기 위해 수정되었다(The Use of Background Knowledge, Machine Learning 6 :2-) 1-250, 1991).
C4.5 패키지의 정확한 수정은 이하와 같다.
"R8/Src/contin.c" (J. RossQuinlan,"C4. 5 : programs for machine learning", MorganKaufmann, CA.1993) 파일에서 이하의 라인 다음에
Figure 112005013102219-PCT00042
이하의 새로운 라인이 삽입된다.
Figure 112005013102219-PCT00043
상기에서, 속성 코스트의 벡터는 사용자에 의해 유지되어온 텍스트 파일로부터 사전에 읽혀진다.
(ii) 실험적인 방법론
상업적으로 선호되는 프로브는 2, 4,5, 6,8,10, 11, 12, 16, 19, 20, 22, 23, 28이다.
예를 들어, 상기 프로브들이 코스트때문에 상업적으로 선호되고, 이러한 코스트를 고려하여 탐지 패널(detection panel)을 다시 선택하는 것이 바람직하다고 가정한다.
수정된 C4.5 결정 수형도 소프트웨어는 상업적으로 선호되는 프로브에 제로 페널티(penalty of zero)를 부여하고 비-상업적으로 선호되는 프로브에는 투 페널티(penalty of two)를 부여하기 위해 사용되었다. 10-중 교차타당 패널 선택 방법론(10-fold cross validated panel selection methodology)(이는 여하한 곳에 기술되어 있다)은 상기 수정된 C4.5 알고리즘을 이용하여 작동되었다.
(iii) 결과
상기 표준 결정 수형도 탐지 패널은 프로브 3, 7, 19, 25, 28로 구성된다. 결론적인 패널 멤버들은 2, 6, 7, 10, 19, 25, 28이며, 2 만을 P7 및 P25의 상업적으로 선호되는 프로브로 사용하였다. 이러한 프로브들은 이러한 데이터에 대한 뛰어난 성능때문에 증가된 그들의 코스트에도 불구하고 선택되었다는 것에 주목하라. 패널은 처음의 5에서 7 프로브로 커졌다. 비록 성능이 이제 프로브의 할인된 코스트에 대한 상쇄로서 최적에 가깝게(sub-optimal) 되더라도 이러한 데이터에 대한 패널 성능의 눈에 띄는 하락은 없다.
(iv) 결론
패널 선택 방법론(panel selection methodology)에, 프로브를 사용하는 코스트를 합산하기 위한 직접적인 방법을 설립하였다.
(c) 오분류 코스팅(Misclassification costing)
(i) 배경
다양한 이유로 인해, 별개의 종류의 분류 에러에 대한 코스트는 다양할 수 있다는 것을 염두에 두고 최적의 패널을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하나의 질병(큰세포 암종(Large cell crcinoma))에 대한 증가된 만감도를 갖는 패널을 선택하고 오분류 매트릭스(confusion matrix)의 다른부분에서 저하된 특이성 및 민감도에 대하여 이를 상쇄시키는 것이 바람직할 수 있다.
오분류 코스트의 매트릭스에 대한 이론(오분류 매트릭스와 같은 차원에 대한)에 있어서, 모든 가능한 코스트의 조합을 포함시키는 것이 필요할 수 있다. 실제로, 단일이 아닌(non unity)(default) 코스트만이 입력된다.
상업적인 결정 수형도 소프트웨어 See5.((RuleQuest Research Pty Ltd, 30 Athena Avenue, St Ives Pathologist 3SW 2075, Australia. (http :,/wwsv. rulequest. com) )는 이러한 능력을 포함하며, 이하의 실연(demonstration)에서 사용되었다.
(ii) 목적
표준 결합 판별 패널(standard joint discrimination panel)(여하한 곳에 기서술되어 있음)은 P2, 3, 4,5, 12, 14,16, 19, 22, 23, 28 멤버들로 이루어져 있으며 이하의 평가된 오분류 매트릭스를 제공한다.
Figure 112005013102219-PCT00044
큰세포 암종의 민감도는 26%로서 낮다. 새롭게 디자인된 패널에서 이러한 민감도를 증가시키기 위해서는 이하의 방법이 사용될 수 있다.
(iii) 방법론
이하의 코스트 파일이 생성되었다.
Figure 112005013102219-PCT00045
상기 파일은 다른 암들에 비해 10 팩터(factor)로, 큰세포 암종의 오분류를 가중시킨다. 이는 이들 분류의 검출에 대한 민감도를 증가시키는 경향이 있지만(다른 부분에서는 성능을 감소시킴과 동시에), 웨이팅(weighting)은 완벽한 분류를 장담할 수는 없다.
표분 결정 수형도 패널 선택 방법론이 적용되었다(C4.5 대신에 See5를 사용하여)
(iv) 결과
이하의 평가된 성능을 가지는 새로운 패널 멤버는 P2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 17, 25, 28이다.
Figure 112005013102219-PCT00046
상기 표는 큰세포 암종의 평가된 민감도가 이젠 48%로 증가되었다는 것을 나타낸다.
(v) 결론
패널 선택 방법론에 오분류의 차별적인 코스트를 포함시키기 위한 직접적인 방법이 실연되었다.
d. 성능 계량(Performance metrics)
개개 방법의 평가된 성능을 나타내는 상기 분석에 의해 제공되는 결과는 이하를 포함한다.
i. ROC 분석
수신자 작동 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선은 분류자에서 각기 다른 한계수준에서의 위양성과 위음성 스코어의 예측 퍼센티지(유닛 당 확률)를 보여준다. 무작위선택 이상으로 구별할 수 없는 중립적인 분류자는 동 참과(equal true) 거짓 리딩(false reading)을 나타내는 ROC 곡선을 나타낸다. 이 곡선의 하단은 50% 가 된다(0.5의 확률)
곡선 이하 면적(Area Under the Curve, AUC)는 종종 분류자 성능의 전체적의 예측으로 사용되고 대부분의 상업적인 판별식 함수 패키지들은 이 표를 계산한다. 완벽한 분류자는 100% 의 곡선 이하 면적을 가진다. 쓸모없는 분류자는50%(0.5 의 확률) 가까이의 AUC를 가진다.
ii. 오분류 매트리스(Confusion matrices): 개수 및 백분율
오분류 매트리스는 테스트 세트에서 데이터가 어떻게 분류되는지를 보여준다. 쌍별 테스트에서 이것은 참양성(true positive), false positive(위양성), 참음성(true negative) 또는 위음성(false negative) 스코어들의 합이다. 이것은 실제의 개수 또는 백분율로 나타난다. 하나의 패널을 가진 독특한 분석을 하기 위해 사용되는 다중 패널의 경우 오분는 각각의 올바른 분류를 설명한다. 예를 들면, 매번 작은세포 암종(Small Cell carcinoma)이 마치 매트리스의 하나의 대각선에 들어가는 것처럼 나타난다. 잘못된 스코어, 예를 들면 얼마나 종종 작은 세포 암종이 비늘로 덮혀 있는 세포암으로 잘못 확인되지는가 매트리스의 적절한 역대각선 요소에 반영된다. 에러율은 오분류 매트릭스에서 데이터를 요약하기 위해 사용되는데, 사용된 분류의 총수로 나누어진 모든 잘못된 분류의 합으로서, 분류의 총수는 백분율로 표시된다.
iii. 민감도와 특이성
특이성은 유효하지 않은 케이스들을 배제하는 정의의 정도를 의미한다. 만약 하나의 정의가 특이성이 약하다면 그것은 위양성이 높다는 것이다. 이것은 현재 디스오더(disorder)가 없는데 마치 디스오더를 가지고 있는 것처럼 개개들을(individuals) 규정한다. 민감도는 여하한 정의도 모든 유효한 케이스를 포함한다는 정도를 가리킨다. 만약 어떤 정의가 민감도가 약하다고 하면 위음성이 높다는 것이다(현재 디스오더를 가지고 있는 개개들이 디스오더를 가지고 있지 않은 것처럼 잘못 진단된다)
3. 데이터 분석 및 결과
a. 샘플 크기 및 변동성
ㆍ Pathologist 1 및 Pathologist 2 데이터 셋이 조합된 것 중 354 케이스들에서 단지 202 케이스만 모든 마커에 H 스코어를 가졌다(변수 및 특성에서)
ㆍ작은 수의 완전한 관찰 및 많은 수의 변수들이 예측 문제를 야기한다(차원성의 저주). 그러므로 분류자를 만들기 위해 사용된 변수들의 숫자를 줄이는게 필요하다.
ㆍ작은 수의 관찰 때문에 데이터를 별개의 트레이닝과 테스팅셋(분류자의 퍼포먼스를 충분히 예측하는데 필요한)으로 나누는 것은 신중하지 못하다. 이러한 이유로 리셈플링 방법을 사용하는게 필요했다.(가령 교차타당(cross-alidation)과 다중의 무작위 시도들을 의미함)
ㆍ암을 구별하는데 사용하는 다중분류 분류자의 고안은 각각의 암의 형태에 대한 관찰(임상)이 매우 적기 때문에 어렵다.
b. 비선택된 마커들(De-selected markers)
마커들은 위에서 설명한 방법을 이용하여 비선택된다. 비선택된 마커는 패널들에서 선택안됨(non-selection)으로 나타난다.
c. 검사 패널 구성(Detection panel (s) composition)
i. 선택된 마커 검사
[0360] 위에서 설명된 3가지 방법을 위한 선택된 마커 검사는 도 5에 요약되어 있다.
ii.최소한의 선택된 마커 셋(Minimum selected marker set)
검사패널에 관한한 프로브 7이 하나의 마커에서는 가장 뛰어난 검색 성능을 나타내는게 분명하다. 프로브들의 조합은 하나의 믿을만 패널이 더 많은 프로브들로 얻어질 수 있는지를 알아보기 위해 분석되어 졌다.
(l) 방법
로지스틱 회귀법은 성능 측정 면에서 가장 뛰어난 서브셋을 만든다(Fisher'score). 이 분석은 1에서 5까지의 프로브들의 조합들을 선택하기 위해 사용되었다. 피셔의 선형 판별식 함수 및 과 로짓 모델(로지스틱 회귀) 는 이러한 조합들의 성능을 나타내기 위해 사용된다. 데이터는 상기에 나타나있다.
(2) 결론
프로브 7은 분류자로서 우수하게 수행한다; 그러나, 프로브 7을 사용하는 것의 결점은 프로브 7이 높은 위음성 스코어를 갖는다는 것이다. 피셔의 선형 판별식 함수를 분류자로서 사용한 최상의 성능은 프로브 7과 16이었다. 다른 조합을 사용하는 패널들의 결과의 가변성은 더 많은 특징이 부과된 노이즈는 분류 스코어를 향상시키는 어떠한 포텐셜(potential)을 능가한다는 것을 보여준다. 잘못 점수가 나온 샘플들의 작은 개수는 이들 드문 결과들의 통계적인 빈곤함을 보여준다. 더 많은 케이스로 디자인된 분류자(classifier)는 더 좋은 분류자가 디자인될 수 있다는 것을 보여준다. 다른 분류자를 사용한 검사의 최선의 조합을 선택하는 기술은, 데이터의 구조에 달려있는, 다른 최선의 패널을 생산할 수 있다.
iii. 보조 마커들
패널은 다른 프로브의 가능성을 적합하게 하기 위해 고안될 수 있다. 이 부분집합(subsets)을 선택하는데 다른 방법론이 사용될 수 있다: 즉 결정 수형도, 논리 회귀 및 선형 판별식 함수. 데이터는 위에서 제시되어 있다.
SPSS를 사용한 피셔의 1차판별식은 패널로부터 획득된 스코어에 적용되어졌는데 상기 패널에서 제한들은 제한에의 접근때문에 적용되었다. 예컨대, 모든 프로브는 하나의 벤더(vendor)로부터 나온다. 그리고 점차적인 선택은 특성의 최선의 조합을 발견하기 위해 선택되었다. 성능은 Leave-One-Out cross validation 테스트를 사용하여 평가되었다.
iv. 대안 마커들: 생물학적 행동메카니즘 (기능적으로 등가인 마커들)
[0366] 당해 분야의 통상의 지식을 가지는 자는 기능적으로 등가의 마커들을 결정할 수 있다. 패널에 사용된 표지의 기능적 행위는 본 명세서 전체에 기술된다.
v. 마커 국지화
이 연구에서 사용된 여러 마커들의 국지화는 이 문서 어디서든지 기술되어 있다.
vi. 패널 성능(Panel Performance)
이러한 방법론의 성능은 위해서 보여진다.
vii. 패널 성능의 해석상 제한
ㆍ적은 데이터 세트와 재샘플하는 방법을 사용할 필요성 때문에 분류자는 과도하게 사용될(over-trained) 위험이 있다(데이터가 너무 가깝게 됨).
ㆍ세포학 표본을 사용한 패널 성능은 정확하게 예상하기 어렵다. 왜냐하면 침 세포학 샘플이 생물조직학적 확인 연구에서 분석되는 대표적인 세포들의 적당한 숫자를 내포하고 있을지 불확실하기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 셀룰로즈 샘플 크기가 주어지면 세포학 표본과 유사하게 활용되는 최적의 패널을 예상할 수 있다.
d. 판별식 패널 조합
i. 모든 암에 적용되는 단일한 5방식 패널
세가지 분석기술 중에서, 단지 결정 수형도가 단일 5방식 패널에 적합하다. 하나의 결정 수형도가 모든 타입의 폐암을 동시에 분류하도록 짜여졌다. 패널 숫자는 5로 주어진다. 패널 성능은 패널 성능이블에 주어져 있다.
ii. 모든 다른 것들에 대해 폐암의 단일 유형을 분별하는 패널
선형 판별식 함수는 동시적인 다분류 분별을 하기에는 적합하지 않다. 모든 암들의 집합세트로부터 하나의 암을 분류하기 위해 고안된 다섯가지 분류자의 성능이 분석되었다. 그러한 조합은 후보군 암 중의 하나를 가짐으로써 어떠한 케이스도 분류할 수 없을 가능성을 가진다. 혹은 둘 이상의후보군 암을 가짐으로써 하나의 케이스를 분류할 수 있을 가능성을 가진다. 이것은 더 이상의 검토를 위해 일치하지 않는 게이스를 동일화시키는데 이점을 가질 수 있다.
모든 타입의 암에 적용되는 단일한 판별 패널의 전반적인 오류율은 꽤 높게 보여졌다(5방식 분류자). 위에서 보여진 패널 실행에 있어서, 5 pair-wise 분류자의 실행(그 분류자 각각은 4개의 다른 가능한 암으로부터 하나를 결정하기 위해 고안된 것임)이 주어져 있다. 이러한 접근은 결정 수형도 및 선형 판별식 함수를 사용하는 분석에 적합하다. 이 기술은 그것이 적용되면, 더 많은 의학적 검사가 필요한 환자를 위한 둘 이상의 진단결과를 주는 모호한 결과를 도출할 가능성이 있다. 그 기술은 어떠한 결과를 줄 수 없거나 더 많은 검사를 제안할 수도 있다(아마 검출 패널을 이용한 재검출)
iii. 검출패널로부터의 잘못된 포지티브한 케이스의 가능성을 고려하는 패널
어떤 패널은 잘못된 포지티브한 케이스들(검출패널로부터)과 다섯가지 암유형을 구별하기 위해 트레이닝될 수 있다. 이것은 비정상적인 것으로서 잘못 분류된 검출패널로부터 그러한 개별케이스를 선택하는 것을 포함한다. 이것은 이러한 '특별한' 케이스를 검출하는 '더 어려운' 문제에 헌신하는 분류자를 트레이닝시킨다. 그러나, 이는 이론적으로 평범한 일인 반면에 상기 데이터 셋은 이들 케이스들 중에서 4가 산출되고, 모집단은 분석을 위하여 과소진출된(under-represented) 것으
그러나 이것이 이론적으로는 문제없는 작업으로 보이지만, 그 데이터 세트로는 원하는 케이스가 4건밖에 확인되지 않았고 모집단도 분석을 시행하기에는 충분하지 않았다.
선택된 마커
모든 3가지 방법을 위한 선택된 마커 검사들은 도표 5에 요약되어 있다.
v. 최소한의 선택된 마커 세트
이토픽은 "다른 방법을 사용하여 동일한 결과를 얻음으로서 표시되는 접근방법의 로버스트니스" 라는 것으로 밑에 다루어진다.
vi. 보충 마커
이 토픽은 "다른 방법을 사용하여 동일한 결과를 얻음으로서 표시되는 접근방법의 로버스트니스" 라는 것으로 밑에 다루어진다.
대안적인 마커스: 행위의 생물학적 메커니즘
예술에 있어 통상적인 기술의 사람은 기능적으로 동등한 감적을 결정할 수 있다. 패널에 이용된 이 감적의 기능적 행동은 이 서류에서 설명된다.
viii. 마커의 위치측정
이 서류에서 이용된 이연구에서 여러가지 마커들의 위치측정이 기술된다.
ix. 패널 실행
세가지 방법의 실행이 표5에 요약되어있다.
e. 매개변수에 가중치를 두는 효과
마커 또한 먼저 언급된 것과 같이 질병상태(종류들)를 위한 가중치 표준이외에, 사람은 또한 이원의 가중치계획을 이용할 수 있다. 예를 들면, 만약 모두 non-DAKO에 공급된 프로브들이 무게가 0이고 그리고 DAKO에 공급된 프로브들의 무게가 1이라면 완벽하게 활용된 패널은 오직 DAKO에 공급된 프로브들을 포함할 것입니다. 이것은 오직 그들의 공급품들을 사용하는 분자 진단 패널 키트(molecular diagnostic panel kits) 들을 개발하고 시장에 내놓으려고 한 벤더(vendor)를 위해 중요한 생산설계 가능성입니다.
f. 다른 (H-스코어가 아닌 ) 객관적 득점 매개변수(objective scoring parameters)를 사용하는 효과
i. 배경
병리 검토 시트는 표 32에서 나타내는 바와 같이 일련의 수치를 포함한다
Figure 112005013102219-PCT00047
표준 득점 시스템은 강도를 등급을 매겨서 다음과 같이 얻어지는 "H 점수" 를 이용한다: 없음=0, 약함=1, 적당=2, 강함=3, 또한 백분율 세포는 다음과 같다: 0-5%=0, 6-25% =1, 26-50% = 2, 51-75% = 3, > 75% = 4, 그리고 2개의 급을 함께 곱한다. 예를 들면, 50%의 약하게 착색된것과 50%의 적당한 착색을 더하면 10= 2X2+ 2x3 을 얻게된다.
ii. 방법
선택적 득점방식은 아래와 같은 낮음, 중간, 높음으로 분류된 응답에 의해 분석된다..
(a) 만약 세포의 50%이상이 적당하거나 그이상의 착색제를 포함한다면 높음
(b) 만약 세포의 50%이상이 착색제를 포함하지 않고있다면 낮음
(c) 그외 --> 중간
[0383] 결정 트리 검출패널 선택 방법론은 H-스코어 대신 이러한 세가지 수준 요인을 사용하여 반복된다. 트리는 이것에 의하여 필요한 경우 각 결절(node)에서 세개의 가지로 나뉘어지는 원인이 된다.
iii. 결과
선택된 패널은 : 프로브 3, 7, 10, 11, 16,19, 20, 28. 추정된 성과로서 :
Figure 112005013102219-PCT00048
이것은 H-스코어s로 된 참조결과와 비교되어야 한다.
Figure 112005013102219-PCT00049
iv. 결론들
ㆍ제시되는 대안 스코어링 시스템이 사용될 때 실행(더 큰 패널들, 보다 낮은 감도 그리고 보다 낮은 특이성들)의 실질적인 손실이 있다.
ㆍ연속적 가변(범위 0부터 12에서)에서 H-스코어를 취급하는 것은 시험된 데이터의 패널 선택을 위해서는 가장 최선으로 보인다.
ㆍ다른 많은 스코어링 시스템들은 시험되지는 않았으나, 실험적으로 테스트된 패널 디자인과 발달 방법론에 알맞게 적용 가능할지도 모른다.
4 . 페암검출과 구별 패널
상기 설명적인 보기에 의해 결정된 본보기 폐암 검출과 구별 패널들은 아래에 목록화된다. 비록 목록화된 패널들이 특성프로브들을 상세 설명한다 하더라도 각 특성 프로브는 관련 프로브 또는 기능적으로 관련되어진 프로브로 대체될지도 모르는것에 주의하여야한다.
검출(강제없음)
ㆍ한개 이상 추가적인 프로브를 가지고 결합한 항사이클린 A
ㆍ항인간 상피 관련 항원 (MOC-31)인 항사이클린 A
ㆍ항ER-관련 P29인 항사이클린 A
ㆍ항숙성계면활성제 결손단백질 B인 사이클린 A
ㆍ항원관련 항인상피(MOC-31)이며 항VEGF인 항사이클린A
ㆍ항원관련 항인상피(MOC-31)이며 항mature계면활성제 결손단백질 B인 항사이클린 A
ㆍ항숙성계면활성제 결손단백질 B이며 항원관련 항인상피(MOC-31)이고 항VEGF인 항사이클린 A.
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 항인간 상피관련항원(anti-human epithelial related antigen , MOC-31)이고 항계면활성제 ㆍ결손단백질A(anti-surfactant apoprotein A )인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B) 이며 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen , MOC-31)이고 항VEGF이며, ㆍ항계면활성제 결손단백질 A(anti-surfactant apoprotein A )인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 항원관련 항인상피 (anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이고 항VEGF이며 항시이클린D1인 항사이클린 A.
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브와 결합한 항원관련 항인상피 (anti-human epithelial related antigen, MOC-31)인 항사이클린 A
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브와 결합한 항ER-relatedP29인 항사이클린 A
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브와 결합한 항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)인 항사이클린 A
ㆍ항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이며 하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항내피성장인자(anti-VEGF)인 항사이클린 A
ㆍ항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이며 하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이고 하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항내피성장인자(anti-VEGF)인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 하나이상의 추가적인 프로브와 결합한 항계면활성제 결손단백질 A인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이고 항내피성장인자(anti-VEGF) 하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항계면활성제 결손단백질A인 항사이클린 A
ㆍ항숙성 계면활성제 결손단백질 B(anti-mature surfactant apoprotein B)이며 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)이고 항VEGF이며 하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항사이클린D1인 항사이클린 A
검출(W/O 항 사이클린 A)
ㆍ하나이상의 추가적인프로브와 결합한 항Ki-67
항내피성장인자(anti-VEGF), 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항EGFR , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택되어진 어느 하나의 프로브와 결합된 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항EGFR , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택되어진 어느 두개의 프로브와 결합된 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항EGFR , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택되어진 어느 세개의 프로브와 결합된 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항EGFR , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택되어진 어느 네개의 프로브와 결합된 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택되어진 어느 다섯개의 프로브와 결합된 항Ki-67
ㆍ항Ki-67, 항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 프로브와 결합하거나 하나이상의 추가적인 프로브를 가진 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 두개의 프로브와 결합하거나 하나이상의 추가적인 프로브를 가진 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 세개의 프로브와 결합하거나 하나이상의 추가적인 프로브를 가진 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 네개의 프로브와 결합하거나 하나이상의 추가적인 프로브를 가진 항Ki-67
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 그리고 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 다섯개의 프로브와 결합하거나 하나이상의 추가적인 프로브를 가진 항Ki-67
ㆍ항Ki-67, 항내피성장인자(anti-VEGF) , 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 항TTF-1 , 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) , 항숙성 계면활성제 결손단백질B(anti-mature surfactant apoprotein B) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
상업적으로 우위를 가진 프로브를 사용한 검출
ㆍ하나이상의 추가적인프로브들과 결합된 항Ki-67
ㆍ하나이상의 추가적인프로브들과 결합된 항TTF-1
ㆍ하나이상의 추가적인프로브들과 결합된 항표피성장인자수용체(anti-EGFR)
ㆍ하나이상의 추가적인프로브들과 결합된 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)
ㆍ항Ki-67, 항TTF-l, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 그리고 항증식세포 핵 ㆍ항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)로 구성된 그룹으로부터 선택된 두개의 프로브들
ㆍ항Ki-67, 항TTF-l, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 그리고 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)로 구성된 그룹으로부터 선택된 세개의 프로브들
ㆍ항Ki-67, 항TTF-l, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 그리고 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)
ㆍ항Ki-67, 항TTF-l, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 그리고 항증식세포 핵 ㆍ항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)로 구성된 그룹으로부터 선택된 두개의 프로브들과 그리고 하나이상의 추가적인프로브들
ㆍ항Ki-67, 항TTF-l, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 그리고 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)로 구성된 그룹으로부터 선택된 세개의 프로브들과 그리고 하나이상의 추가적인프로브들
선암과 다른 폐암사이의 구별
ㆍ반점액소 1(anti-mucin 1 ) 과 항TTF-l
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 프로브로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 두개의 프로브로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 세개의 프로브로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 네개의 프로브로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항mucin 1 ,TTF-1 , 항내피성장인자(anti-VEGF), 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3
ㆍ항mucin 1,항TTF-1 그리고 하나이상의 부가적인 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 프로브로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1 그리고 하나이상의 추가적인프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 두개의 프로브들로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 세개의 프로브들로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 네개의 프로브들로 결합된 항mucin 1 and 항TTF-1 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항계면활성제 결손단백질(anti-surfactant apoprotein A) , 항mucin 1 , 항TTF-1, 항BCL2, 항ER-related P29 and 항Glut 3 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
편평상피세포암(Squamous Cell Carcinoma)과 다른 폐암과의 구별
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 프로브와 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 두개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 세개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3)로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 네개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항CD44v6, 항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3)
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 프로브와 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 두개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 세개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3( anti-melanoma- associated antigen 3) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 네개의 프로브들과 결합한 항CD44v6
ㆍ항CD44v6, 항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin , 항Glut 1, 항ER-related P29 그리고 항흑색종연합 antigen 3(anti-melanoma- associated antigen 3) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들
큰세포암과 다른 폐암과의 구별
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항내피성장인자(anti-VEGF)
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF)와 항pl20
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF)와 항Glut 3.
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항p 120 그리고 항사이클린 A.
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항p 120 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들.
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항Glut 3 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들.
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF) , 항p120 , 항사이클린 A 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들.
중피종(Mesothelioma)과 다른 폐암과의 구별
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항CD44v6.
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear)
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31)
ㆍ항CD44v6, 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) 그리고 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) , 이들과 결합한 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 두개의 프로브
ㆍ항CD44v6, 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) 그리고 항원관련 항인상피(anti-human epithelial related antigen, MOC-31) 그리고 하나이상의 추가적인 프로브들.
작은세포와 다른 폐암과의 구별
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear)
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항BCL2
ㆍ하나이상의 추가적인 프로브들과 결합한 항표피성장인자수용체(anti-EGFR)
ㆍ항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) , 항BCL2 그리고 항표피성장인자수용체 (anti-EGFR)로 구성된 그룹으로부터 선택된 두개의 프로브.
ㆍ항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) , 항BCL2 그리고 항표피성장인자수용체 (anti-EGFR)
ㆍ항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) , 항BCL2 그리고 항표피성장인자수용체 (anti-EGFR) 와 하나이상의 추가적인 프로브들로 구성된 그룹으로부터 선택된 두개의 프로브
ㆍ항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear) , 항BCL2 , 항표피성장인자수용체 (anti-EGFR) 및 하나이상의 부가적인 프로브들.
선암(Adenocarcinoma), 편평상피세포 암(Squamous Cell Carcinoma), 큰 세포 암(Large Cell Carcinoma), 중피종(Mesothelioma) 및 작은 세포 암의 동시 구별
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin, 항CD44v6, 항계면활성제 결손단백질A(anti-surfactant apoprotein A) , 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear antigen), 항mucin1, 항인간상피관련항원(anti-human epithelial related antigen , MOC-31) , 항TTF-l, 항N-cadherin, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 및 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)으로부터 선택된 두개이상의 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin, 항CD44v6, 항계면활성제 결손단백질A(anti-surfactant apoprotein A) , 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear antigen), 항mucin1, 항인간상피관련항원(anti-human epithelial related antigen : MOC-31) , 항TTF-l, 항N-cadherin, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) 및 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen)
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin, 항CD44v6, 항계면활성제 결손단백질A(anti-surfactant apoprotein A) , 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear antigen), 항mucin1, 항인간상피관련항원(anti-human epithelial related antigen , MOC-31) , 항TTF-l, 항N-cadherin, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 및 이들과 결합한 하나이상의 추가적인 프로브들로부터 선택된 두개이상의 프로브들
ㆍ항내피성장인자(anti-VEGF), 항thrombomodulin, 항CD44v6, 항계면활성제 결손단백질A(anti-surfactant apoprotein A) , 항증식세포 핵 항원(anti-proliferating cell nuclear antigen), 항mucin1, 항인간상피관련항원(anti-human epithelial related antigen , MOC-31) , 항TTF-l, 항N-cadherin, 항표피성장인자수용체(anti-EGFR) , 항증식세포 핵 항원(anti- proliferating cell nuclear antigen) 및 이들과 결합한 하나이상의 추가적인 프로브들
5. 결론들
a. 분자진단법에의 패널접근의 타당성
i. 비직관적인 해결책
히스토그램들은(PathologistData.xls, worksheet :Histograms) 제어vs암에 대한 각각의 프로브를 위하여 감적점수(marker scores)의 분배를 보여주기위해 계획되었다. 특정패널을 위한 프로브의 직관적인 선택이 명백하지않거나, 기술된 발명이 명백한 방법이 없다고 보여지는 경우에있어 효과적인 결합을 허용한다는 것은 이러한 히스토그램으로부터 명확해진다.
ii. 다양한 제품 적용을 위한 최적화
iii. 접근의 강건(Robustness of approach)은 다른 방법을 사용하는 유사한 결과에 의해 설명된다.
표들과 도면들로 요약되어진 리포트의 본문에 있는 각종분석에 의해 얻어진 결과의 상세하고 면밀한 조사는 다음 발견을 보여준다.
1. 독자적인 프로브의 주의깊은 면밀한 조사는 누군가 홀로 면밀히 조사한것보다 더 잘 일을 수행할지도 모르는 명백한 프로브조합을 만들지 않는다.
2. 모든 3가지 분류 방법론은 유사한 기능집합에서 혼(hone)을 평가하였다. 작은차이는 다른 하나로 한 개의 분류자에게 편드는 테이터구조에 기인한다.
3. 이러한 방법의 하나로 디자인된 모든 분류자는 설계과정 동안에 보이지안지만 자율적인 병리학자의 자료로 테스트되어질 때 좋은 성과를 보였다. 이것은 발명품에 높은 신뢰를 준다.
4. 프로브7에 근거한 검출 패널은 홀로 높은 성과를 가져온다.
5. 만약 프로브7이 프로브16 또는 프로브25와 결합한다면 보다 바람직한 성과가 얻어진다.
6. 프로브7과 다른 프로브들의 조합이 성과를 더 개량하는 것처럼 보이는 반면 획득한 여분의 케이스의 수는 대표적이지 않을지도 모르며 그렇게 디자인된 분류자는 일반적이지않게 계획된것인지도 모른다.
7. 프로브7을 제외한 프로브들로부터 선택된 패널의 성과는 휴먼스크리닝을 사용하여 현재 실행되고 있는 것과 비교하여보면 충분히 좋지만 미래의 임상 진단 세포학 세계에서 자동화된 cytometer에 있어서는 아마 충분치가 못하다.
8. 프로브들의 다른 조합은 유용하지만 보다 적은 성과를 제공한다.
9．만약 몇몇 프로브들이 이용할수 없게 된다면 이 발명은 다른 프로브들의 조합의 선택을 허용한다. 이것은 오직 상업적으로 선취권이 있는 일련의 프로브들에 근거한 분류자 디자인에 의해서 설명된다. 도7을 보십시오
10. 본 발명은 첨가물이 손실이 큰 프로브에 대해 적용되는 것을 허용한다. 만약 그들의 조력이 중요한 경우 분석으로부터 전적으로 그들을 배제하기보다는 패널에의 그들의 포함을 허용한다.
11. 본 발명은 모든 다른 암으로부터 폐암의 1가지의 유형을 감별할 수 있는 한 개 폐암타입 특정구분패널의 디자인을 제공한다.
12. 5개의 암을 분류하는 싱글패널의 성과의 분석은 구분은 가능하나 다른것들로부터 하나의 암을 구분하기위해 각각 디자인된 5개의 패널세트 보다 오류율은 더 나쁘다는 것을 보여준다.
13. 매우 유용한 분류법은 5개의 양용 분류자의 조합에 의해서 얻어졌다.
14. 프로브의 일반적 세트는 5개의 구분패널을 다시 이 결과에 확신을 주는 3개의 분류 방법론에 의해 선정되었다.
15. 선암의 케이스들을 분리하기위한 프로브들은 4, 14,19, 20,25, 및 27이다.
16. 편평상피세포암(Squamous Cell cancer)의 케이스들을 분리하기 위한 프로브들은 1,2, 3, 24,25, 및 26이다.
17. 큰영창암(Large Cell cancer)의 케이스들을 분리하기 위한 프로브들은 1 과7 또는1 과21이다
18. 중피종(Mesothelioma)의 케이스들을 분리하기 위한 프로브들은 3, 12 및 16이다.
19. 작은영창암(Small Cell cancer)의 케이스들을 분리하기위한 프로브들은 12, 20 및 23이다.
20. 모든 암을 동시에 인식하기 위한 프로브들은 1,2, 3, 4,12, 14,19,22, 23, 및 28이다.
21. 이 발명에 의해 정의되는 것과 같이 배수 페어와이즈 패널들을 사용하기의 이점은 의심스러운 케이스들이 5개의 패널들의 어느것에도 기록되지 않을지도 모른다는 것이며 또한 혼동되는 케이스들이 두개 또는 이상의 패널들에 보여질지도 모른다는 것이다. 그러한 일관성없는 리포트는 한층 더한 분석이 명시되어진 세포학자에게 경고할 것입니다.
iv. 위험 관리 연구
이 연구에서 적용된 모든 테스트들은 실제로 통계적이었다. 실행에서의 작은 성과에 근거하여 선택된 프로브가 새로운 자료에 시험된때 통계적인 순열(variations)을 가지고있을 위험이 있다. 결과에 대한 확신을 주기 위해 병리학자 1 및 병리학자2의 테이타에 선형 판별 분석 (Linear Discriminant analysis) 에서 발생하는 가장 좋은 분류자를 테스트한다. 병리학자3의 데이터가 통계적으로 병리학자1및 병리학자2의 데이터와 다르다는 것을 기억해야만하고 만약 병리학자3의 데이터를 사용한 테스트에서 좋은 성과는 얻어진다면 이것은 실로 장려될만하다.
(1) 보이지 않는 자료검출패널의 시험 보고
(a) 방법
"검출패널(들)구성"이란 상기 표제가 붙은 부분에서 우리는 좋은 분류가 특징 7과 16에 얻어진다는 것을 보여주었다. 병리학자3의 모든 데이터 SPSS를 사용하여 both7 및 16의 H scores가 선택되었다. 그후 변형과 계산을 통해 정준구별기능(the canonical discrimination function)이 새로운 특징으로서 생성되었다. 이 특징의 성능은 독자적으로 후에 시험되었다.
(b) 결과들
이것은 병리학자 1과 병리학자 2의 자료에 디자인된 분류자를 시험하고 병리학자 3의 자료를 시험한 결과이다. 분류자는 선형식별함수(linear discriminant function)를 사용하여 디자인되었다. 정준의 병리학자 2 기능(The Canonical Pathologist 2 function )은 =0.965 * 프로브7- 0.298 * 프로브16이다.
프로브 7 및 16을 이용한 Pathologist 3 데이터에 대한 분류 결과
Figure 112005013102219-PCT00050
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 89.7%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 89.7%가 옳게 분류되었다.
상기의 결과는, 단지 프로브 7에 대한 Pathologist 3 데이터가 이하와 같다
는 것을 고려할 때에 훨씬 나은 결과임을 알 수 있다.
프로브 7만을 이용한 Pathologist 3 데이터에 대한 분류 결과
Figure 112005013102219-PCT00051
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 86.8%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 86.8%가 옳게 분류되었다.
(c) 결론
상기의 결과는 7 및 16에 기초하는 2-프로브 분류자가 프로브 7 단독보다 우수하다는 것을 보여준다.
(2) 보이지 않는 데이터와 관련된 테스트에 대한 보고-판별 패널
(a) 배경
이하의 내용은 LDF를 사용하여 얻은 Pathologist 1 및 Pathologist 2 데이터와 함께 디자인되고, 보이지 않는 Pathologist 3 데이터로 테스트된 분류자의 성능에 대한 것이다. 디자인 단계에서 케이스들의 숫자는 상대적으로 작았으며 테스트 데이터에서의 숫자도 또한 작았다. 따라서 첫 번째와 두 번째 세트의 성능에 대한 우수한 변이성(variability)이 기대될 수 있다.
(b) 방법
SPSS에 있어서, "패턴 인식(pattern recognition)"이라는 제목하의 부분에서 유래된 표준적 판별 함수는 모든 5가지 분류의 암에 대하여 Pathologist 3 데이터에 관해 형성되고 테스트되었다.
(c) 결과
중피종 LDF=probe3sc *.385-probel2s *.317 + probel6s * 1.006. 의 분류결과
Figure 112005013102219-PCT00052
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 93.8%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 93.8%가 옳게 분류되었다.
작은세포 암종 LDF= probel2s *.575-probe20s *. 408 - probe22s *.423 +probe23s*.344.의 분류결과
Figure 112005013102219-PCT00053
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 91.7%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 91.7%가 옳게 분류되었다.
편평세포 암종 LDF = - probelsc*.328 - probe2sc*.295 + probe3sc *.741 + probe24s *.490 + probe25s *.393 + probe26s *.426의 분류결과
Figure 112005013102219-PCT00054
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 87.0%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 87.0%가 옳게 분류되었다.
큰세포 암종 LDF= probelsc * .847 + probe7sc * .452.의 분류결과
Figure 112005013102219-PCT00055
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 59.6%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 59.6%가 옳게 분류되었다.
디자인된 분류자에 대하여 낮긴하지만 여전히 유용한 성능테스트가 행해졌으며, 큰세포 암종에 대한 매우 적은 개수의 케이스들에 대하여 테스트가 행해졌는데 이 결과는 여전히 매우 고무적이다.
샘 암종 LDF=-probe4sc *.515+probe5sc*. 299-probe l4s* .485 probel9s *.347 + probe20s *.723 +probe25s *.327-probe27s *.327. 의 분류결과
Figure 112005013102219-PCT00056
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 89.6%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 89.6%가 옳게 분류되었다.
(d) 결론
이들 분류자들은 보이지 않는 데이터를 적용하는 테스트에까지 두루 아우를 수 있는 성능을 가진다는 것은 고무적인 일이다. 이러한 결과는 개개의 암종을 검출할 수 있는 능력에 대해 확신을 줄 수 있다.
(3) 별개의 환자 및 패톨로지스트로부터 얻은 데이터에 대한 트레이닝 및 테스트
로버스트성(robustness) " 파이날 파이날" 테스트로서, Pathologist 1 및 Patholgist 2 양자로부터 검토된 데이터에 대하여 LDF를 트레이닝해 보았다. 이는 Pathologist 3으로부터 검토된 데이터를 삭제한다. 따라서 테스트 및 트레이닝을 위한 동일한 환자로부터 얻어진 데이터를 사용한 Pathologist 3 더하기 Patholgist 1 데이터에 의해 검토된 데이터에 대한 테스트는 편향(biased)되지 않는다.
LDF는, 포함되지 않은 프로브 4를 제외한 특성의 동일한 세트를 생성하였다.
LDF=probelsc * .288 + probe7sc * .846 - probe15s * .249 - probe16s * .534의 분류 결과
곡선 이하 면적= .977
Figure 112005013102219-PCT00057
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 86.4%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 86.4%가 옳게 분류되었다.
[0425] Pathologist 3 단독의 데이터에 대하여 프로브 7만을 이용하여 여전히 합리적이지만, 유사하며, 곡선 이하 면적이 작은 결과가 얻어졌다.
곡선 이하 면적= .908
Figure 112005013102219-PCT00058
a 교차 타당은 분석에서만 행해진다. 교차타당에 있어서, 개개의 케이스는 그 케이스 자체를 제외한 다른 모든 케이스들로부터 유래된 함수에 의해 분류된다.
b 최초 그룹화된 케이스들의 87.9%가 옳게 분류되었다.
c 교차 타당하게 그룹화된 케이스들의 87.9%가 옳게 분류되었다.
내장의 상피 종양은 사망률 및 전세계적인 사망 중요한 원인이다. 결장(직장을 포함하여)은 신체에 어떠한 다른 기관보다 더욱 주요한 신생물들에의 주인이다. 결장직장암(Colorectal cancer)은 암 킬러들 사이에서 둘째로 기관지유래암종(bronchogenic carcinoma)을 평가한다. 선암(Adenocarcinomas)은 결장직장암의 대다수를 구성하며 위장(GI) 지역에서 일어나는 모든 악성의 70%를 대표한다. 작은 창자는 그것의 큰 길이와 나눈 점막 세포들의 거대한 풀(pool)에도 불구하고 인자하거나 악성종양을 위한 드문 위치이다. (Crawford, J.M., The Gastrointestinal Tract, in Robbins Pathologic Basis of Disease, R.S. e. a. Cotran, 편집자. 1999년, W.B. Saunders Company: 필라델피아. p.775-843).
결장직장암의 발생의 정점은 환자의 나이가 60세에서 79세이다. 50세전에 발생하는 경우는 20 %보다 적은 수이다. 결장직장암이 젊은사람에게 발견된경우 선재궤양성 대장염(pre-existing ulcerative colitis) 또는 폴립증후군(polyposis syndromes)의 하나로 의심되어야한다. 결장직장암은 전세계적으로 분포구역을 가지고 있다. 가장 높은 사망률들은 멕시코, 남미 그리고 아프리카에 비율보다 10 배까지 크게 미국과 동양 유럽인 국가들중에서 발견된다. 환경 계수(특히 식사 실행들)는 이 인상적인 지리적인 대조에 관련된다. 추가로, 많은 학문은 결장암(colon cancer)에 대한 위험요소로서 비만과 육체적 비활동성을 관련시킨다.(Crawford, J.M., The Gastrointestinal Tract, in Robbins Pathologic Basis of Disease, R. S. E. A. Cotran, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p. 775-843).
대장에서 찾아낸 거의 모든 암(98%)은 선암(adenocarcinomas)이다. 사실상 모든 대장(colorectal)암들은 선종성 결장폴립증(adenomatous polyposis coli, APC)에 E-cadherin와 -catenin을 포함하여 유전학적인 변경들을 보인다. ; 인간의 잘못 짝짓기 수리 유전인자들, hMSH2, hlMLHl 그리고 부모한테 물려받은 non-polyposis 콜론 암(HNPCC)에 hPMS2들 ; 그리고, K-ras와 p53 유전인자들의 돌연변이. (Crawford, J. M., The Gastrointestinal. Tract, in Robbins Pathologic Basis of Disease, R. S. E. A. Cotran, Editor. 1999,W. B. Saunders Company: Philadelphia. p. 775-843). 이 암들이 피로, 빈혈증, 복부고통 그리고 혈변(bloody stools)들과 같은 특정한 임상 증상들과 나타나기 때문에 빠른시기에 결장직장암을 진단하는것은 의학 전문가들에게 첫째 도전 중의 하나이다. 현재, 중요한 진단 방법은 시각적으로 종기 덩어리가 있는지 없는지를 검사하는 결장 내시경술이다. 그러나, 이것은 무의식을 완수하기 위하여 진행동안 계속해서 환자와 마취에 의해 colon-prepping을 포함한 침략적인 진행이다. 환자의 수락이 중요한 문제점인것이다. 불운하게, 유효한 대소변잠혈시험(fecal occult blood tests) 또는 Guaic시험은 충분히 특정하지 않다. 그러므로, 결장직장암에 대한 널리 알려진 발견 방법 (결장내시경술(colonoscopy) 또는 구불결장경검사(sigmoidoscopy))은 진행의 침입성, 정확성의 관계물 부족 그리고 불쌍한 환자의 수용 상태때문에 부적당한 의학검사 도구들인 것으로 판명되었다. 게다가, 시험하는 비침범성 대소변잠혈은 (FOBT) 효과적이지 않고 감도 또는 특이성의 부족으로 고통받는다.
결장직장암의 분자진단은 이 암의 대분분이 유전적 이상들을 가지고 있기 때문에 많은 관심을 받는다. 기술중 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 과 면역 세포 화학(ICC)은 결장직장의 발암을 평가하기에 널리 사용된다. 다양한 결장직장 종양 감적은 적시, 정확한 진단을 하고자하는 의사를 도와주며, 현저하게 더 나은 환자 관리를 제공키 위해 발견되었다. 불운하게, 이 종양 감적은 높은감도와 특이성 둘 다에 "해결책"이 아니다. 그러므로 진단정확도를 향상시키는 대안이 필요하다.
진단 정확성을 향상하는 대안은 결장직장암과 연관된 표지를 특정하게 묶어놓은 프로브의 복수를 포함하는 패널을 발전시키는 것이다. 모든 프로브후보자 조사는 ICC 기술에 시험될 것이다. 몇몇 통합체에서(In some embodiments) 견본은 결장직장워싱에서 얻어질지도 모른다. 비록 종종 조직단면보다 더 적은 세포로 결장직장워싱으로 세포학상의 견본이 얻어지기는 하지만, 다클론 또는 단일클론항체의 사용은 좋은 분석실험 성과를 지키기 위하여 채택될지도 모른다. 몇몇 통합체에서 실제로 환자견본이 테스트를 받기전에 테스트스라이드로 종양세포에서 세포현탁액을 만들지모른다. 다른 통합체에서는, 종종 조직 단면보다 더 적은 세포로 결장직장워싱함에 의한 제한은 나이 성, 진단, 종양 급료, 종양 크기, 임상 단계 등등과 되도록 가깝게 일치하는 환자에 대한 연구를 통해서 극복될지도 모른다.
일단 견본들이 모아지면, 견본들은 처리되고 그리고 분석될것이다. 통계 분석은 폐암에 있어 위에 기술한바 처럼 디자인패널에 이용될 것이다. 처리 과정에서 몇몇 통합체에 세포얼룩 또는 워싱중 접착되지않고 미끄러지는 덩어리들(pellets)과 같은 기술적인 문제가 생길지도 모른다. 그러나 그러한 문제들을 감소시키기 위해 소프트웨어의 조작 또는 의정서의 변경에서 쉽게 대처할수 있다. 몇몇 통합체에서는 자동으로 견본을 만들고 진단을 위하여 슬라이드를 준비한 장치를 사용하여 처리되고 분석될 것이다. 프로브의 넓은메뉴가 처음으로 활용될것으로 예기된다. 프로브의 수는 감도와 특이성의 높은 수준을 유지하기 위해 적절히 규격화된 패널에 잘라진것이다. 마지막 프로브의 선택은 양성종양세포(positive stained tumor cells)의 백분율의 미리정의된 출발점에 근거할 것이다. 정교한 통계 분석은 이 결정들을 하기 위해 채택될 것이다. 악성을 검출하기에 패널시험접근법(panel-assay approach) 단단한 종양에 적절하며 같은 종양 감적의 몇몇이 패널에 있기때문에 이 방법은 연속적 뿐만 아니라 평행선에서 실행될지도 모른다. 이와 같이 분석실험 발달 과정은 촉진되어질 수 있다.
5개의 특수형(선암(adenocarcinoma), 편평상피세포(quamous cell carcinoma), 작은영창암(small cell carcinoma), 큰영창암(large cell carcinoma), 그리고 중피종(mesothelioma)) 이 있는 폐암과 비교해 결장직장 상피종암(colorectal epithelial tumors)은 주로 선암종이다. 이것은 결장직장종암 패널이 오직 1가지 타입의 암에서 특정하게 목표로 되는 것을 허락한다. 패널은 생체조직검사를 실시하거나(biopsied) 결장조직 절제술(colectomy tissue)중 하나의 테스트를 받을 수 있기 때문에 많은 세포학상의 검사가 필요치 않다.
프로브/감적(Markers)의 도서관
암 감적에 관하여 정보를 포함하는 각종 근원은 검토되었다. 20%의 임의 표준 또는 결장직장암의 더 큰 확실성(positivity)은 결장직장암의 검출 및/또는 진단을 위해 선취패널(a preferred panel)을 선택된 프로브들에 이용되었다. "20% 또는 더큰 확실성"의 의미는 만약 100개의 종기 실례가 연구되었으면 20 또는 이 경우들의 더 많은 양이 개인적인 감적(marker)에 나타냄을 의미한다. 반면에 잔여 80의 실례는 개인적인 감적의 존재를 보여주지않는 것이다. 선취권의 패널은 다음과 같은 것으로부터 선택된 분자감적을 포함한다.
AKT, p-카테닌, 뇌 유형 글리코겐 인산화효소(BPG), 카베올린-1, CD44v6, cFLIP, 크립토-1, 암피게굴린, 사이클린Dl, 고리 산소화 효소(COX-2), 시토케라틴 20(ＣＫ２０），　암종배아성　항원(CEA), E-카드헤린, Bcl-2, Bax, hMLH1, hMSH2, 표피성장팩터수용기(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), 에프린-B2(Eph-B2), 에프린-B4(Eph-B4), 파스엘（FasL）, HMGI (Y), Ki-67, 리소자임, 마트릴리신(MMP-7), p16, p68, 망막모세포종(Rb), cdk2/cdc2, S10OA4, YB-1 그리고 p53.
존재보기에서 이용된 프로브/감적의 도서관의 간단한 설명은 아래에 제공된다.
이는 세포고사저해 활동(anti-apoptotic activity)을 갖는 원형암유전자(proto-oncogen)이다. 상기 세리-트레오닌 키나제(serine-threonine kinase)는 다양한 암종에서 과발현된다. Roy et al은 노르말(normal) 결장 점막층 및 과다형성(hyerplastic) 폴립들(polyps)은 중요치 않은 AKT 발현을 보인다고 발표하였는데, 이는 결장암(57% 양성) 에서 볼 수 있는 극적인 AKT 면역반응력에 비교할 때 대단히 대조적인 것이다. 또한, AKT는 샘종의 57%에서 검출되었는데 이는 원형암유전자의 과발현을 결장 발암 진행시의 초기현상으로서 나타내는 것이다.(Roy, H. K., et al., . AKT proto-oncogene overexpression is an early event dzcring sporccdic colon carcinogenesis. Carcinogenesis, 2002. 23(1) : p. 201-5).
종양 억제 유전자, 샘종성 폴립증 코일(adenomatous polyposis coil, APC)은 산발성 결장 암종의 80%에서 검출되었다. 이들은 작은 크기의 샘종에 발생하며 제일 작은 변병에서 조차 신생물(neoplasia), 형성이상(dysplastic) 이상음와병소(aberrant crypt foci)의 위험을 동반하며 일어난다. APC 유전자의 산물은 세포간 베타 카테닌을 조절한다. 여러 연구들이 변이된 APC가 턴오버 속도(turn over rate)를 감소시키며 베타 카테닌의 축적을 유발한다고 밝혀낸 바 있다. Herter et al은 베타 카테닌의 선형 증가 발현 레벨(linear increased expression level)뿐만 아니라, 대부분의 케이스에서 샘종으로부터 종양까지 베타 카테닌의 다른 위치에 대해서도 발견해냈다. 경증 샘종 및 중등 형성이상에서, 베타 카테닌은 핵에만 존재한다. 중증 형성이상 샘종 및 종양에서는 세포질과 핵에 모두 존재한다. 노르말의 결장 점막층(colonic mucosa)에서, 세포와 세포 경계막 및 세포질에 단순히 약한 염색(staining)이 존재한다. 이러한 결과들은 진단 및 치료 목적에 있어서 중요할 수 있는데, 그 이유는 베타 카테닌의 핵내 존재는 결장암에 대한 최초의 분자적 증거가 될 수 있기 때문이다.(Herter, P., et al., Intracellular distribution of beta-catenine in colorectal adenomas, carcinomas and Peutz-Jeghers polyps. J Cancer Res Clin Oncol, 1999. 125(5): p.297-304)
브레인 타입 글리코겐 포스포릴라아제 (BPG)
브레인 타입 글리코겐 포스포릴라아제(BPG)는 독특한 장내 악성종양 마커로서, 주로 3개의 이성형태: 근육, 간 및 브레인 유형으로 되어 있다. 이전까지는 면역조직화학(IHC) 기술을 거쳐, 위암이 브레인 타입 글리코겐 포스포릴라아제(BPG)의 비정상적 발현에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다. Tasima 등의 새로운 연구에서는 BPG가 IHC에 의한 직장결장암종의 83%에 존재한다는 것이 최초로 증명되었다. 더욱 흥미로운 것은 원격 부위로부터 얻어진 정상 결장점막은 BPG에 대해서 네거티브인 반면, 종양 인근의 외견상 정상으로 보이는 점막은 포지티브인 점이다[Tashima, S. 등, Expressionof brain-type glycogen phosphorylase is a potentiallynovel early biomarlcer in the ccarcinogenesis of human colorectal carcinomas. Am J Gastroenterol, 2000.95(1):p.255-63].
카베올린-1(Caveolin-1)
이것은 형질막(plasma membrane)의 소포 함입부인 카베올래(caveolae)의 주된 구조단백질이다. 연구결과, 카베올린의 계통원에는, 카베올린-스카프 폴딩이라고 불리우며 예컨대 G-단백질, Ha-ras, Src-계통 티로신 키나제 및 표피성장인자 리셉터(EGFR)을 포함한 시그날 분자들을 조직화하는 기능을 하는 보통의 도메인이 함유되는 것으로 증명되었다. 실험실내 및 생체내 동물실험에서는 세포 형질변환 및 유방암발생에 있어서 카베올린-1의 억제효과가 입증된 반면, 사람의 유방암 및 전립선암을 포함한 다른 연구에서는 카베올린-1의 발현이 종양의 발생 및 진행에 대하여 포지티브 결합을 하는 것으로 밝혀졌는 바, 이는 종양촉진기능을 가지는 것을 의미한다. Fine 등의 연구에서는 결장 아데노카르시노마의 88%가 IHC에 의한 카베올린-1에 대하여 포지티브인 것으로 밝혀졌다[Fine, S.W. 등, Eleviated expression of caveolin-1 in adenocarcinoma of the colon, Am. J. Clin Pathol., 2001.115(5):p.719-24].
CD44v6
이것은 광범위하게 발현되는 세포표면 당단백질로서, 세포 대 세포, 및 세포 대 매트릭스 상호작용에 포함될 수 있는 것이다. CD44v6는 정상 표피세포와 조혈세포원에 풍부히 존재한다. 대조적으로, 교번식으로 스플라이싱된 CD44v6 변종(CD44v6v)은 표피의 세포 및 종양에서 현저하게 발현된다. 지금까지 CD44v6의 발현과 진행된 단계의 직장결장 카르시노마에 관한 몇가지 보고가 있었다. Ishida는 IHC기술에 의해 63명의 직장결장 카르시노마 환자들을 연구하였고, 그중 59%의 경우에 CD44v6에 대하여 포지티브인 것을 밝혀내었다. 정상적인 결장 점막은 CD44v6에 대하여 네거티브이다[Ishida, T., Immunohistochemical expression of the CD44 varant 6 in colorectal adenocarcinoma. Surg. Today, 2000. 30(1):p28-32].
세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)
세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)은 Fas-중개의 아포프토시스에 대한 내인성 억제조절자이다. 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)의 생리학적 기능은 아직 밝혀지지 않았으나, 종양을 포함한 질병에 있어서의 병리학적 관련성은 예견되었다. 또한, 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)의 과잉발현이 T-세포 면역성으로부터 종양세포가 도피하게 되는 결과를 초래하여 종양의 발생과 성장에 관련될 수 있다는 것이 최근에 보고되었다. Ryu 등은 결장 아데노카르시노마의 100%(52/52)가 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)에 대하여 포지티브임을 증명하였다. 정상 결장상피, 선종성 폴립은 염색강도가 훨씬 낮다[Ryu, B.K. 등, Increased expression of cFLIP(L) in adenocarcinoma. J. Pathol., 2001. 194(1):p15-9].
크립토(Cripto)-I 및 앰피레글린(Amphiregulin)
크립토(Cripto)-I(CR-I) 및 앰피레글린(Amphiregulin; AR)은 표피성장인자(EGF)-관련 펩티드이다. 수차의 보고서에서, AR과 CR-I은 실험실내 사람 결장상피세포내에서 자가분비 성장인자로서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히, AR과 CR-I중의 어느 하나가 과잉발현은, 사람의 직장 아데노마와 카르시노마의 약 70%에서 IHC에 의해 발견되었다[De Angelis, E. 등, Expression of cripto and amphiregulin in colon mucosa from high risk colon cancer families, Int. J. Oncol., 1999. 14(3):p.437-40].
사이클린(cyclin) D1
이 단백질은 세포의 증식에 있어서 중요한 역할을 한다. 사이클린(cyclin) D1의 변이 및/또는 변형발현은 네오플라시아(neoplasia)에 속한다. 사이클린(cyclin) D1의 증가된 발현은 인후두암, 뇌암, 목암, 간암, 유방암 및 결장암에서 관찰된다. Arber 등의 연구에서는 결장직장 아데노카르시노마의 30%와 선종성 폴립의 34%에서 사이클린(cyclin) D1의 염색도가 증가하였으나 과다형성 폴립 또는 정상 점막에서는 증가가 관찰되지 않았다[Arber, N. , et al., Increased expression of cyclinDI is ccn early event in mzcltistezge colorectccl carcinogenesis. Gastroenterology, 1996.110(3): p. 669-74].
사이클로옥시게나제(COX-2)
이것은 아라키돈산 대사에 관련된 포스타글란딘(postaglindin) 합성효소이다. 결장암에 대한 비스테로이드성 항염증 약제의 종양-억제효과(NSAID)를 나타내는 증거들이 있으므로, 사이클로옥시게나제(COX-2)는 자체 활성의 감소로 인해 NSAID의 종양억제 효과를 나타내는 점에서 주목을 받아왔다. Sakuma 등은 직장암중 38%가 COX-2 포지티브임을 증명하였다. COX-2 염색은 암이 없는 조직에서보다 암 조직 영역에서 강력하다. 어떤 시편에서는 암에 근접한 조직이 암으로부터 훨씬 멀리 떨어진 조직보다 강력하게 염색된다[Sakuma, K. 등, Cyclooxygenase(COX)-2 immunoreactivity and relationshipto p53 and Ki-67 expression in colorectal cancer. J Gastroenterol,1999.34(2) : p. 189-94].
사이토케라틴 20 (CK20) 및 카르시노엠브리오 항원 (CEA)
이것들은 널리 알려진 직장결장암 마커들이다. 이것들은 매우 과학적인 많은 논문들에 보고된 바 있다. 이것들은 결장 종양에 대해서 특이적이지는 않지만, 일단 Langendijk 등의 논문을 보면 면역조직화학적으로 CK20과 CEA가 전이성 결장 아데노카르시노마와 유방암 및 초기 자궁암을 구별하는 2개의 결정적인 주요 마커임을 알 수 있게 될 것이다[Lagendijk, J. H. 등, Immunohistochemical differentiation between primary adenocarcinomasof the ovary and ovarian metcvstcases of colonic cnd breast origin. Comparison between a statistical and an intuitive approach. J Clin Pathol, 1999. 52(4) : p.283- 90].
E-카드헤린, p53, Bcl-2, Bax, hMLH1,hMSH2
Kapiteijin 등과 Bukholm 등은 별도로 수행된 각각의 연구에서, 결장암의 온코진 형성에 연루된 다수의 온코진과 종양억제 유전자들을 발견하였다. E-카드헤린, p53, Bcl-2, Bax는 종양세포에서 20% 이상의 면역염색도를 나타내었다. 미스매치 수복 유전자인 hMLH1,hMSH2도 또한 현격하게 증가한다. 이 수복유전자들은 DNA 복제과정중에 유전적으로 "프루프 리딩(proof reading)"에 포함되므로, "관리유전자"로 호칭되기도 한다. 상기 유전자들의 변이는 위장관의 악성 초기진행 단계에 포함되는 것으로 밝혀졌다[Kapiteijn, E. , et al., Mechanisms ofoncogenesis in colon versusrectal cancer. J Pathol, 2001.195(2) : p. 171-8;Buldlolm, I. K. and J. M.Nesland, Protein e, xpression of p53, p21 (WAF1/CIP1), bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch, 2000.436 (3) : p.224-8]. Yantiss 등은 E-카드헤린과 p53이아데노마를, 공격적 아데노카르시노마를 가지는 아데노마로부터의 잘못위치된 상피와 구별짓는 2가지 중요한 마커이며, 이는 직장결장 세포들에 대한 상기 2개 마커들의 특이성을 지시해주는 것이다[Yantiss, R. K., et al., Utility of MMP-1, p53, E-cadeherin, and collagen IV immunohistochemical stains in the differential diagnosis of adenomas with misplaced epithelium versus adenomas with invasive adenocircinoma. Arn J Surg Pathol,2002. 26(2) : p.206-15]. 이 마커들은 거의 모든 고형 종양에 대해서 일반적이다.
표피성장인자 수용체(EGFR)
표피성장인자 수용체(EGFR)는 170kD의 전이막 세포표면 수용체이다. 이것은 c-erb B-2, c-erb B3 및 c-erb B4와 함께 티로신 키나아제 활성을 가지며, c-er B 프로토온코진에 의해 코드화된다. 항-EGFR 단클론성 키메라 항체는 진행된 단계의 결장 아데노카르시노마에 대한 실험적 치료법이다. 상승된 수준의 EGFR은 직장결장암, 폐, 두부, 경부, 목, 유방, 전립선 및 담낭의 편평세포 카르시노마를 포함하는 많은 고형 종양에서 발견된다. Goldstein 등의 논문에 따르면, 결장 아데노카르시노마의 75%는 EGFR 면역조직화학적 포지티브를 가지는 것으로 나타났다[Goldstein, N. S. and M. Armin, Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on CancerStage IY colon adenocarcinoma : implicationsfor a standardized scoring system. Cancer,2001. 92 (5): p. 1331-46].
에프린-B2 (Eph-B2) 및 에프린-B4 (Eph-B4)
에리트로포이에틴을 제조하는 증폭된 서열(Eph) 계통은 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 최대 하위 패밀리이다. 에프린-B2 (Eph-B2) 및 에프린-B4 (Eph-B4)는 Eph에 결합하는 리간드이다. 에프린-Eph 시스템은 발생학적 전개와 신경 및 순환계의 분화에 있어서 중요하다. 몇가지 연구에서는, 에프린의 고수준의 발현이 종양의 성장, 종양발생 및 전이에 대한 증가된 역가와 관련되어 있을 수 있다. 면역조직화학적 분석법을 사용하여, Liu 등은 Eph-B2와 Eph-B4가 연구 경우의 100%(515)에서 인접 정상 점막들보다 강한 염색 강도를 가지게 된다[Liu, W. 등, Coepression of ephrin-Bs and their receptors in colon carcinoma. Cancer, 2002.94 (4): p. 934-9].
FasL
이것은 종양괴사인자의 상위 속(family)의 전이막 단백질로서, 자체의 수용체인 Fas(CD9O/MO-I)을 발현하는 아포프토시스-민감성 세포내에서 세포의 사멸을 유발한다. FasL이 몇가지 타입의 암에 있어서 상한이 조절된다는 것은 얼리 입증된 바 있다. 또한, 실험실내 및 생체내 연구에서, FasL이 항-종양 면역 이펙터 세포에 있어서 아포프토시스를 유발함으로써 암세포로 하여금 Fas 역공을 가능하게 하여 면역반응에 손상을 줄 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 발견은 암세포에 의한 FasL 발현이 항-종양 면역반응의 억제에 중요한 인자일 수 있음을 시사하는 것이다. Belluco 등은 FasL 발현이 카르시노마와 직장결장 종양발생에 있어서 비교적 초기 경우인 것으로 밝혔다. FasL 발현은 과다증식 폴립의 28%, 저급 폴립의 76% 및 고급 폴립의 93%에서 발견되었다[Belluco, C. 등, Fas ligand isup-regzllatedduring the colorectal adenoma-carcinoma sequence. Eur J Surg Oncol,2002.28 (2): p. 120-5]. 결과는 FasL 발현이 카르시노마의 81% 및 아데노마의 41%에서 검출된다는 다른 발견들과 일련적인 것이다. 또한, FasL은 저급 아데노마에서보다 고급 형성이상 아데노마에서 훨씬 빈번하게 발현되었다.
HMGI(Y)
HMG-I, HMG-Y 및 HMGI-C 단백질들은 고도의 이동성 그룹 I 단백질 패밀리를 구성한다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다.
Ki-67
Ki-67은 세포증식 핵 마커이다. 이것은 직정결장암을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. Sakuma 등의 직장결장암의 48%가 Ki-67에 대하여 포지티브였다[Sakuma, K 등, Cyclooxygenase(COX)-2 immunoactivity and relationship to p53 and ki-67 expression in colorectal cancer, J. Gastroenterol., 1999. 34(2):p.189-94].
리소자임
리소자임은 항박테리아 활성의 넓은 스펙트럼을 가지는 효소이다. 이것은 타액, 눈물, 젖, 혈청, 위액 및 소장의 소화액을 포함한 사람의 다양한 조직액 및 분비액에 존재한다. 리소자임은 정상적인 결장 상피에는 존재하지 않는다. 흥미로운 것은, 다수의 면역조직화학적 연구에서, 위의 아데노마 및 아데노카르시노마 종양세포에서 리소자임의 발현이 입증되었다는 것이다. 다수의 연구에서, 결장암의 리소자임 양성도가 28 내지 80%인 반면, 아데노카르시노마에 인접한 정상적 결장 선에서는 리소자임 단백질 발현이 전혀 관찰되지 않았다[Yuen, S. T. 등, Up-regclcation of lysozymeproduction in colonic adenomasand aclenocarcinomcas. Histopathology, 1998. 32 (2): p.126-32].
마트릴리신(MMP-7)
마트릴리신은 MMP 유전자 속의 일원이고, 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴 및 카세인과 같은 범위의 기질에 대하여 단백질분해 활성을 가진다. 이것은 예컨대 인후두, 직장결장, 위, 두부, 목, 폐, 전립선 및 헵토셀룰라(heptocellular) 카르시노마와 같은 악성 종양세포에 의해서 제조된다. 면역조직화학적 연구에서는, 마트릴리신의 발현이 위 및 직장결장의 카르시노마에서 노드(nodal) 또는 원거리 전이와 상호관계가 있음을 밝혀주었다. Masaki 등의 연구에 따르면, 직장결장 카르시노마의 34%가 마트릴리신에 대하여 포지티브였다[Masaki, T. 등, Matrilysin(MMP-7) as a significant determinant of malignant potential of early invasive colorectal carcinomas, Br. J. Cancer, 2001, 84(10):p1317-21].
p16
이것은 세포 사이클 억제제이고, 주요 종양억제단백질이다. 관찰 결과, 장의 종양에 있어서 p16의 역할은 프로모터 영역이 사람의 결장 종양의 하위 세트에서 메틸화되도록 하는 것으로 제안되었다. Dai 등은 p16 발현이 정상의 점막, 28개중 18개 초기 결장 카르시노마 및 5개중 5개 전이성 결장 카르시노마 에서 매우 낮은 사실을 밝혔다. 또한, Ki-67, 사이클린 A 및 레티노블라스토마 단백질과 역으로 상호연관된 p16 염색은 세포 사이클의 진행이 억제됨을 시사한다[Dai, C.Y. 등, p16(INK4a) expression begins early in human colon neoplasia and corellates inversely with markers of cell proliferation. Gastroenterology, 2000, 119(4):p.929-42].
p68
이것은 인터페론을 유발시킬 수 있는 단백질 키나아제로서, 바이러스 및 세포 단백질 합성 모두의 조절에 있어서 주된 인자이다. 이것의 발현은 정상 세포주나 안세포주 모두에 있어서 세포의 분화와 상관된다. Singh 등은 p68이 직장결장 카르시노마 환자의 76%에게서 포지티브였음을 알게 되었다. 정상의 결장 점막에서는 약한 p68 염색이 나타났을 뿐이다. 고도의 p68발현은 개선된 생존률을 지향하는 경향을 입증하였다. p68을 높은 수준(3 내지 4+)으로 발현하는 종양을 앓는 환자들은 p68 발현률이 낮은 환자들에 비해 생존률이 5년 더 길었다[Singh, C. 등, Expression of p68 in humccn colon cancer. Tumour Biol, 1995.16 (5): p.281-9].
Rb 및 cdl/cdc7
레티노블라스토마 (Rb) 유전자는 종양억제 유전자이고, 이것의 산물인 pRB는 세포 사이클의 네거티브 조절제로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 유전자 변형에 의해 pRB 발현이 결여되면 골육종 및 폐, 유방 및 담낭의 카르시노마를 포함하는 몇가지 악성종양이 발생될 수 있는 것으로 판단된다. 반대로, 직장결장암은 이 유전자의 간헐적 비활성화를 나타내는 것으로 보고된 바 있으며, 서던블롯 분석에서는 직장결장암의 약 30%에서 Rb 유전자 증폭을 입증하였다. Yamamoto 등은 웨스턴 블롯에 의해서 Rb 및 이것의 관련 키나아제 cdk2 및 cdc2에 관해 연구하여 직장결장암에서 과포스포릴화된 형태의 pRB와 상승된 수준의 cdk2/cdc2를 발견하였다. 또한, 면역조직화학적 연구에서는 cdc2/cdc2가 pRB에 대하여 포지티브인 암세포에 포괄적으로 발현되는 것을 밝혔다. 이러한 결과는 직장결장암에서 cdk2/cdc2의 발현이 증가되어 pRB가 세포 사이클이 포스포릴화를 거치지 못하도록 차단할 수 있음을 시사하는 것이다[Yamamoto, H. 등, Coexpression of cdk2/cdc2 and retinoblastoma gene products in colorectal cancer. Br J Cancer, 1995.71 (6): p.1231-6).
S1OOA4
이것은 칼슘 결합단백질로서, 세포의 불멸화, 세포성장, 포유동물 상피 줄기세포가 근육상피 계통의 세포로 분화되는 것, 및 섬유세포형성에 관여된다. 또한, S1OOA4는 전이성 종양세포에서 특이적으로 발현하는 것으로 보고되었다. Takenaga 등은 국소적 카르시노마의 44%와 아데노카르시노마의 94%가 면역적으로 포지티브인 반면, 어떠한 아데노마도 포지티브가 아닌 것으로 관찰하였다. 흥미로운 점은, 면역양성 세포의 발생이 침습의 깊이에 따라 증가하고, 간의 14 전이에 거의 모든 카르시노마 세포가 포지티브인 것이다. 이러한 결과로부터, S10OA4는 아데노마를 아데노카르시노마와 구별시키는 양호한 마커이고, 직장결장 종양세포의 진행 및 전이과정에 포함될 수 있음을 알 수 있다[Takenaga, K. 등, Increased expression of SlOOA4, a metastasis-associatedgene, in humun colorectal adenocarcinomas. Clin Cancer Res,1997. 3 (12 Pt1): p.2309-16].
Y-box Binding Protein (YB-1)
Y-box 결합 단백질(YB-1)은 고도로 보존적인 냉쇼크 도메인을 포함하고 있고 역전 CCAAT 박스(Y 박스)와 상호작용을 하는 DNA 결합단백질 계열의 일원이다. YB-1은 광범위한 유형의 세포에서 발현되며, 세포의 증식에 포함되는 다양한 유전자의 조절에 연루되어 있다. 이것은 또한 과잉발현된 인시스플라틴(incisplatin)-내성 암세포주로서, YB-1가 전사인자로서의 자체의 역할 이외에 DNA 수복 또는 DNA 손상 반응에도 관여될 수 있다는 것을 의미한다. Shibao 등은 YB-1이 정상적 점막에 비해 거의 모든 경우의 직장결장 카르시노마에 있어서 과잉발현된 것을 밝혔다[Sllibao, K. 등, Enhanced coe: cpression of YB-1 and DN topoisomerase II alpha genes in humancolorectal carcinomas. Int J Cancer, 1999.83 (6): p.732-7].
직장결장 카르시노마 패널의 활용
직장결장 카르시노마 패널에는 직장결장 카르시노마의 초기 검출용 마커뿐만 아니라 전이성 잠재 및 예후를 추정하기 위한 마커도 포함된다. 예를 들어, 포지티브 CEA(carcinoembryonic antigen) 반응은 직장결장 카르시노마의 분화의 등급과 상당한 관련성을 가지지만, 이러한 항원의 세포내 확산성 발현은 종양이 장관벽을 너머 림프구를 공격하는 것을 지시하는 경우도 있다. 발현된 조직 항원의 수는, 장관벽을 통해 퍼진 종양의 정도에 현저하게 관련된다[Lorenzi,M. 등, Histopathological and prognostic evaluation of immunohistochemical findings in colorectal cancer. Int J Biol Markers,1997, 12 (2): p. 68-74]. 또한, 혈청 CEA 수준 및 p53 단백질의 발현은 직장결장암에 대한 보충적 예후 정보를 제공한다. p53의 포지티브 면역염색 및 상승된 CEA 수준은 누적식 무병 생존도가 낮은 것과 관련되며, 독립적 예후의 중대성을 가지는 것으로 나타났다[Diez, M. 등, Time-clependency of the prognostic effect of carcinoembryonic antigen andp53protein in colorectal adenocarcinoma. Cancer, 2000.88(1):p. 35-41]. Nasierowska-Guttmejer and associates[Nasierowska-Guttmejer, A., The comparison of immunohistochemical proliferation and apoptosis marlcers in rectclcarcinoma treated suricczlly or by preoperative radio-chemotherapy. Pol J Pathol, 2001. 52(1-2) : p.53-61]는 Ki-67의 낮은 발현과 Bax 발현의 높은 수준이 종양 덩어리의 치료 및 완화에 대한 직장결장암의 전체적 또는 거의 전체적인 반응과 상관되어 있음을 밝혔다. 그러나, 이 경우들의 2/3 이하는 낮은 발현의 p53, MIB1, bax and bcl-2와 관련된다. 또다른 연구에서는 더 높은 수준의 p53 및 Ki67 값이 예후적으로 부족한 저직병리학적 특징들과 관련을 가지게 됨을 밝혔다[Saleh, H. A. , H. Jackson 및 M. Banerjee, Immunohistochemical expression of bcl-2 and p53 oncoproteins : correlation with K167 proliferation index and prognostic histopathologic parameters in colorectal neoplasia. Appl Immunohistochem MolMorphol, 2000. 8(3): p. 175-82]. 또한, 직장결장암에서 cyclinD 1, CD4Av6 및 matrilysin (MMP-7)의 발현은 높은 재발률, 재발병 방지의 감소 및 전반적으로 취약한 생존률과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다[McKay, J. A. 등, Analysisof lcey cell-cycle checkpointproteins in colorectal tumours. J Pathol, 2002.
196 (4):p.386-93; Ropponen, K.M. 등, Expression of CD44 and variantproteins in hDlman colorectal cancer and its relevance for prognosis. Scand J Gastroenterol, 1998. 33 (3): p. 301-9; Bhatavdekar, J. M. 등, Molecular markers are predictors of recurrence and survival in patients with Dukes B and Dukes C colorectal adenocarcinoma. Dis Colon Rectum,2001.44 (4): p.523-3; 및 Adachi, Y. 등, Clinicopathologic and prognostic significance of matrilysinexpression at the invasivefront in human colorectal cancers. Int J Cancer, 2001.95(5): p.290-4). 연구들로부터, 직장결장암에 있어서 p53, MMP-7, -카텐(caten) n의 발현증가 및 pf E-카데린(Cadherin)의 발현감소는 자체의 전이 포텐셜의 증가와 연루되어 있다는 점이 증명되었다[Zeng, Z. S. 등, Matrix metalloproteinase-7 expression in colorectal cancer liver metastases: evidence for involvement of MMP-7 activation in human cancer metastases. Clin Cancer Res, 2002.8(1): p. 144-8; Ikeguchi,M. 등, Reduced E-cadherin expression and anlargement of cancer nuclei strongly correlate with hematogenic metastasis in colorectal adenocarcinoma. Scand J Gastroenterol,2000. 35 (8): p.839-46; Sory, A. 등, Does p53 overexpression cause metastases in early invasive colorectal adenocarcinomal Eur J Surg, 1997.163 (9): p. 685-92; 및 Hiscox, S. and W. G. Jiang, Expression of E-cadherin, alpha, beta and gamma-catenin in human colorectal cancer. Anticancer Res, 1997.17(2B) : p. 1349-54). 따라서, 직장결장암 패널들은 진단적 및 예후적 값을 가지게 될 것이고, 임상치료에 있어서 가이드를 하기 위한 환자 위험단계를 제공할 수 있을 것이다.
바람직한 프로브/마커
직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 바람직한 패널들은 상기의 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 보다 바람직한 패널들은 fromp-catenin, E-cadherin, hMSH2, hMLHl,p53 및 사이토케라틴으로부터 선택되는 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암의 실질적으로 전부는 유전적 변형을 나타내므로, 조기 검출의 기회를 제공하게 된다. E-Cadherin과 dp-catenin은 APC (adenomatous polyposis Coli) 종양억제 유전자와 긴밀한 상호작용을 한다. APC 유전자의 결실은 FAP(familial adenomatous polyposis) 및 가드너 증후군(Gardner syndrome)과 관련되며, 직장결장암의 발병률이 높아진다. 직장결장암에 있어서의 다른 유전적 변형은 DNA 수복 유전자이다. 2가지 중요한 미스매치 수복 유전자 hMSH2 및 hMLHI는 DNA 복제중에 "proof-reading"을 담당한다. 다른 마커 p53은 17번 염색체에 존재하고, 직장결장암의 70% 이상은 염색체 17p에 결실이 있다. 사이토케라틴(Cytokeratin) 20(CK20)은 직장결장암에서 일관성 있게 발현되고, 네거티브 사이토케라틴(cytokeratin) 7(CK7) 염색과 커플링되며, 그 조합(CICO+/CK7-)은 직장결장암에 대하여 고도로 특이적이다(Chu, P. E. Wu, 및 L.M. Weiss, Cytokeratin 7 and cytokeratin 20 expression in epithelial neoplasms: a survey of435 cases. Mod Pathol, 2000. 13 (9): p. 962-72). 직장결장암에 대한 이러한 종양 마커들의 중요성은 후술한다.
β-카테닌(catenin)
하기의 유전성 선종성결장폴립증(FAP) 및 가드너 증후군의 유전적 결함은 APC rumor-억제유전자의 부위인 5q21에 위치지정된다. APC 단백질은 세포 부착분자 복합체내의 세포 구조단백질로서 세포간 부착 분자인 E-카테린을 포함하는 β-카테닌에 결합된다. p-카테닌은 또한 온코진으로서도 활동한다. E-카테린에 결합되지 않을 때(따라서, 세포-세포 부착에 관여될 때), p-카테닌은 T 세포 인자-림포이드 증강인자(Tcf-Lef) 단백질로서 공지된 t-계열의 단백질 파트너에 결합되어, 다른 유전자를 활성화시킨다. 이러한 p-카테닌:Tcf 복합체에 의해 활성화된 유전자는 세포의 증식과 억제 아포프토시스를 자극하는 것들을 포함하는 것으로 생각된다. p-카테닌에 대한 APC 결합은 분리되는 경향을 가지게 되므로 p-카테닌:Tcf 시그날 경로를 억제하게 된다. APC 유전자의 변이는 β-카테닌에 대한 APC 단백질의 친화도를 저하시켜서 일면에 있어서는 세포간 접촉의 결손을 초래하고, 다른 면에서는 β-카테닌의 세포질 풀을 증가시킨다. 결과적으로 Tcf-중개의 세포증식의 증강은 카르시노마를 전개시키는 경우의 서열을 시작하게 되는 것이다[Peifer, M., Beta-catenin as oncogene: the smoking gun. Science, 1997.275(5307): p.1752-3]. 그러므로, APC는 "게이트-키퍼" 유전자로서 간주된다. APC상의 변이는 FAP에 있게 되며, 산발성 결장암의 진화시에 직장결장암의 85%에서 발견되는 변이들과 함께 조기에 나타나게 된다[Crawford, J.M. 등, The Gastrointestinal Tract, in RobbinsPathologic Basis of Disease, R. S. e. a. Cotran, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia) p.775-843]. APC에 변이를 가지지 아니하는 대부분의 종양은 β-카테닌에서 변이를 나타낸다.
hMSH2 및 hTvILH I
DNA 수복에 포함된 모든 유전자들내의 유전적 변이는 HNPCC의 유전적 증후군에 관련되는 것으로 추정된다. 이러한 수복 유전자들 FISH2,hi LLHl은 DNA 복제중에 비유전적 "proof-reading"에 포함되므로, "관리"유전자로 불리운다. 사람의 게놈에는 50,000 내지 100,000개의 디누클레오디트 반복 서열이 있고, 미스매치 수복 유전자상의 변이는 상기 반복에 있어서 보편적인 변형의 존재에 의해 검출될 수 있다. 이것은 마이크로사텔라이트 불안정성(microsatellite instability)으로 지칭된다. 변이체 DNA 수복 유전자를 유전받은 환자는 남아있는 정상 대립 유전자로 인해 정상적인 수복 활성을 가지게 된다. 그러나, 어떤 기관들(결장, 위, 자궁내막)에서의 세포는 야생형 대립 유전자를 불활성화시키는 2차적 체세포변이를 받게 된다. 변이는 대부분의 HNPCC 종양의 대부분이 마이크로사텔라이트 불안정성을 나타낼 때까지 보통 1000배까지 일어날 수 있다. 이 유전자 변이는 위장관암의 초기 전개시에 포함될 수 있다[Kapiteijn, E. 등, Vlechanisms of oncogenesis in colon versus rectal cancer. J Pathol,2001. 195 (2): p. 171-8; Bulcholm, I. K. 및 J. M. Nesland, Prortein expression of p53, p21 (WAF1/CIP1), bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch, 2000.436(3) : p. 224-8).
p53
염색체 17p의 결실은 70 내지 80%의 결장암에서 발견된다. 이 염색체 결실은 p53 유전자에 영향을 미치며, p53에서의 변이가 나중에 결장암 발생에서 일어나는 것을 시사한다. 널리 알려진 바와 같이, p53은 세포 사이클의 제어에 결정적인 역할을 한다. 결장암 카르시노겐 형성에 관한 멀티-힛 개념은 가설화되었다. APC 변이는 대개 가장 초기에 있게 되며, 산발성 결장암의 약 80%의 경우에 미스매치 수복유전자내의 변이로부터 보다 적은 빈도로 시작될 수 있다. 아데노마로부터 카르시노마로 이행되는 과정중에 예컨대 염색체 17p상의 p53 또는 염색체 18q상의 DCC 영역에서 이형접합의 결실(LOH)이나 늦은 변이와 같은 추가의 변이가 수행될 수 있다. 그러므로, 게놈내의 누적적 변형은 형성이상의 크기와 수준에 있어서 점진적 증가에 도달할 수 있고, 종양 병소에 대한 공격적 포텐셜을 달성할 수 있다[Crawford, J.M., The Gastrointestinal Tract, in Robbins Pathologic Basis of Disease, R.S. e.a. Cotran, Editor. 1999, W.B.Saunders Company: Philadelphia. p. 775-843].
Cytokeratin 20 (CK 20)
CK20은 저분자량의 중재 필라멘트이다. 이것은 발현 범위가 제한되어 있어서 특히 관심의 대상이 된다. CK 20은 정상 및 악성의 상피에서 지속적으로 발현된다. 발현은 위 및 장관의 상피와 Merkel 세포로 제한된다. 면역조직화학적 기술로 다양한 기관계의 수백가지 상피종양을 망라한 연구로부터 실제로 모든 경우의 직장결장암은 CK 20 포지티브이다[Chu, P. , E. Wu, 및 L. M. Weiss, Cytolceratin 7 andcyto% ceratin 20 expression in epithelial neoplasms: survey of 435 cases. Mod Pathol, 2000.13 (9): p.962-72]. CK 20/CK 7 면역특성의 조합은 세포 시편의 전이성 종양의 초기 위치를 확인하는데 있어서 특히 유용하다. CK 20+/CK 7-은 직장결장암이 초기 위치에 있는 세포블록에서만 관찰된다(Blumenfeld, W. 등, Utility of cytokercatin 7 and 20 subset analysis as an aid in the identification of primary site of origin of malignancy in cytologic specimens. Diagn Cytopathol, 1999.20 (2): p.63-6). Ascoli와 연구팀은 면역조직화학에 의해 발현된 CK20이 결장으로부터의 악성 삼출물에서 지속적으로 관찰되는 것으로 결정하였다(Ascoli, V. 등, Utilityof cytokercctin 20 in identifyingthe origin of metastatic carcinonzas in efficsions. Diagn Cytopathol, 1995.12 (4): p.303-8].
본 실시예에서는 다음과 같은 약어들을 사용하였다: APC = 선종성 결장폴립증, AR = 앰피레굴린(AMPHIREGULIN), BGP = 브레인-타입 글리코겐(Brain-type glycogen) 포스포릴라아제, CD44v6 = CD44 스플라이스 변종(Splice Variant) 6, CEA = Carcinoembryonic Antigen, CFLIP = Cellular FLICE-LIKE inhibitory protein, CK = Cytokeratin, COX = Cyclooxygenase, CR-I = Cripto, EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor, EphB = ERYTHROPOIETIN-PRODUCING Amplified Sequence, FasL = Fas Ligand, F. QBT-FECAL Occult Blood Test, HNPCC = Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer, ICC = IMMUNOCYTOCHEMISTRY, IHC = Immunohistochemistry, NILH = Human Mismatch Repair Genes, MMP = MATRILYSIN (MMP-7), MSH = Human Mismatch Repair Genes, PLAP = Placental Alkaline Phosphatase, Rb = Retinoblastoma and YB = Y-box Binding Protein.
III. 방광암(Bladder Cancer)
종양은 생물학적 또는 임상적 기회를 제공한다. 미국에서의 이러한 상피 종양은 지난 몇년간 꾸준히 증가하였으며, 현재 매년 50,000건 이상 새로 발생되고 있다. 이러한 종양의 검출 및 관리기술이 개선됨에도 불구하고, 사망자는 매년 약 10,000명에 달한다[Crawford, J. M. and R. S. Cotran, THE LOWER URINARV TRACT, in ROBBINS PATHOLOGIC BASIS OF DISEASE, T. Collins, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p.1003-1008]. 현재, 방광암을 스크리닝 및 검출할만한 신뢰할 수 있는 방법은 존재하지 않는 실정이다. 그러므로, 이환율과 치사율을 감소시키기 위해 초기에 방광암을 검출해낼 수 있는 개선된 방법이 필요하다.
방광암의 95% 이상은 상피에 문제가 있는 경우이며, 나머지는 중간엽세포 종양이다. 상피 종양의 약 90%는 전이성 세포로 구성되며, 전이세포 카르시노마(TCC) 라고 지칭되는 반면, 나머지 10%는 편평세포 및 선 종양이다. TCC는 미국에서 5번째로 가장 보편적이인 악성 종양이고, 2번째로 보편적인 비뇨기계 카르시노마이다. TCC는 2개의 주요 등급으로 구분된다: 저급 및 고급. 낮은 등급의 TCC는 항상 정상의 전이성 상피를 반복하는 돌기를 가지는 비공격성 병소이다. 이 경우는 탁월한 예후 기능을 나타낸다. 고급 TCC는 돌기 형상이거나 절을 이루거나 2가지 모두를 가질 수 있고, 상당한 세포 다형성(pleomorphism) 및 역형성(anaplasia)을 나타낸다. 이것들은 방광 종양의 50%를 차지하고, 전이잠재성을 가지며, 10년 이내의 진단을 받은 경우들중 60%가 사망하였다[Crawford, J. M. and R. S. Cotran, The Lower Urina7 Tract,in Robbins Pathologic Basis of Disease, T. Collins, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p.1003-1008)].
방광 세포학은 통상의 스크리닝 방법이며, 고급 방광암에 대한 유용한 진단 정보를 제공한다[Koss, L. G. 등, Diagnostic value of cytology of voided urine. Acta Cytol, 1985. 29(5): p. 810-6). 그러나, 저급 종양에서는 형태학적 변형이 결여되기 때문에, 저급 돌기 전이세포 카르시노마(TCC)를 검출하기 위한 자체의 효율은 신뢰가 보다 낮다[Busch, C. 등, Malignancy grading of epithelial bladder tumours. Reproducibility of grading and comparison between forceps biopsy, aspiration biopsy andexfoliative cytology. Scand J UrolNephrol, 1977.11 (2): p. 143-8; Murphy,W. M. 등, Urinary cytologyand bladder cancer. The cellularfeatures of transitional cell neoplasms. Cancer,, 1984.53 (7): p.1555-65; Shenoy, U. A., T.V. Colby, and G. B. Schumann, Reliability ofurinary cytodiagnosis in vcrothelial neoplasms. Cancer, 1985. 56 (8): p. 2041-5]. 방광경 검사는 환자에게는 공격적이고 성가신 것일 수 있다. 외측 종양은 평판 TCC 이외의 방광경 검사에 의해 신뢰도 높게 진단할 수 있으며, 특히 카르시노마(carcinoma in situ)는 내시경 딜레머remains an endoscopic 에 빠지게 된다[Lin, S. 등, Cytokeratin20 as animmunocytochemical markerfor detection of urothelial carcinoma inatypical cytology : p^eliminary retrospective stucly on archived urine slides. Cancer Detect Prev, 2001. Invest, 2000.60(4): p.275-82]. 전형적으로, 방광세포학과 방광내시경을 필요에 따라 생검법과 함께 사용하여 진단의 감도를 최적화한다. 이러한 실험은 단독으로나 연합하여 질병의 재발 또는 진행을 조기에 검출 또는 평가하기에 불충분하다.
면역세포화학(ICC)은 공격적이지 않고 방광세포학에 비해서 감도가 증가되어왔기 때문에 인기를 더해가고 있다. 방광내시경의 사용시에 직면하게 되는 제한이 있었음에도 불구하고 핵 매트릭스 단백질(NiVIP22) 및 사람 보족인자 H-관련 단백질(BTA stat)에 대한 뇨 테스트는 수년간 시판되어 왔다. NIP22는 BTA 방법보다 감도는 높지만 특이성이 불충분하고 문제성이 있는 거짓-포지티브 비율이 있는 점이 있다.[Ramakumar, S., et al. , Comparison of screening methods in the detection of bladder cancer. J Urol, 1999.161 (2): p. 388-94 ; Ross, J. S. and M. B. Cohen, DETECTING RECURRENT BLADDER CANCER : NEW METHODS AND. BIOMCARKERS. Expert Rev Mol Diagn, 2001. 1 (1) : P. 39-52). 그러나, FDA는 최근 MATRITECH로부터 개선된 ImmunoCyt의 NMP22 검정법을 승인하였다. 이 새로운 검정법은 2가지 항체와 가정용 임신진단 테스트와 같은 기구를 포함한다. 상기 검정법은 뇨에 혈액이 있어도 영향을 받지 않기 때문에 거짓-포지티브 비율이 포함되지 않으며, 방광내시경에 비할만한 진단정확도가 개선되었다. ImmunoCyt는 형광 마커로 표지화된 3개 종양 마커의 혼합물이다. 이것은 뮤신의 당단백질과 방광내 종양세포에 의해 발현된 형태의 CARCINOEMBRONYONIC ANTIGEN (CEA)이 들어 있다. 그러나, 이것은 재발 방광암의 모니터링용이지 스크리닝용이 아니며, 가시화를 위한 형광 현미경이 필요하다[MIAN, C. , et al., IMMUNOCYT : A NEW TOOLFOR DETECTING TRANSITIONAL CELL CANCER OFTHE ZLRINARY TRACT. J UROL, 1999.161 (5): p. 1486-9].
면역조직화학(IHC)은 임상 비뇨기과용으로 방광암의 평가를 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법이다. 지금까지 연구되고 방광암의 임상적 결정과정에 중요한 역할을 하는 대부분의 종양 마커는 IHC의 적용으로부터 진화되었다 [Williams, S. G., M. Buscarini, and J. P. Stein, MOGCU/AR MARKERSFOR DIAGNOSIS, STAGZNG, AND PROGNOSIS OF BLCADCLER cancer. Oncology (HUNTINGT), 2001.15 (11) : p. 1461-70, 1473-4, 1476; discussion 1476-84]. 불행히도, 방광암 검출용 마커중 어느 것도 감도와 특이성 모두가 높은 "요술공"이 아니었다. 진단의 정확도를 높이는 다른 방법이 필요하게 되었다.
진단의 정확도를 높이는 다른 방법은 복수개의 프로브로 이루어지고 그 각각이 방광암에 관련된 마커와 특이적으로 결합하는 패널을 전개시키는 것이었다.
각각의 후보 프로브들은 IHC 또는 ICC에 의해 시험하였다. ICC용으로, 시료는 뇨 시료를 사용하였다. IHC보다 ICC를 수행하는 장점은 뇨의 세포학적 시료가 조직 시편보다 적다는 점이다. 어떤 실시예에 있어서, 고품질의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 우수한 성능의 검정을 수행할 수 있다. 다른 실시예에서는, 나이, 성, 진단, 종양 등급, 종양의 크기, 임상 단계 등이 근접한 환자들을 대상으로 연구를 수행하였다. 다른 구현예에서, 동일한 환자의 뇨 채취분을 의사가 지정한 빈도수로 준수하여 사용하였다. 추가로, 슬라이드는 종양 세포를 세포현탁액으로 제조하고, 실제 환자의 시편을 시험하기 전에 시험하여 제조하였다.
혈청 CEA 수준 및 p53 단백질의 발현은 직장결장암에 대한 보충적 예후 정보를 제공한다. p53의 포지티브 면역염색 및 상승된 CEA 수준은 누적식 무병 생존도가 낮은 것과 관련되며, 독립적 예후의 중대성을 가지는 것으로 나타났다. Ki-67의 낮은 발현과 Bax 발현의 높은 수준은 종양 덩어리의 치료 및 완화에 대한 직장결장암의 전체적 또는 거의 전체적인 반응과 상관되어 있다. 그러나, 이 경우들의 또다른 연구에서는 더 높은 수준의 p53 및 Ki67 값이 예후적으로 부족한 조직병리학적 특징들과 관련을 가지게 된다.
5개의 하위 타입(ADENOCARCINOMA, squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, large cell carcinoma, mesothelioma)을 가지는 폐암의 경우와 비교했을 때, 방광암의 90% 이상은 전이성 세포 카르시노마이다. 이는 방광종양 패널이 일유형의 암을 표적화할 때 더욱 특이적일 수 있도록 한다. 또한, 방광종양의 검출 및 진단은 FFPE-기초로 및/또는 세포-기초로 수행될 수 있다.(뇨 세포학).
프로브/마커 라이브러리
암 마커에 관한 정보를 가진 다양한 간행물을 조사하였다. 방광암에 대한 양성도의 20% 이상의 임의적 기준을 사용하여 방광암의 검출 및/또는 진단용으로 바람직한 패널용 프로브를 선택하였다. "20% 이상의 양성도"는 100건의 종양을 연구하였을 때 20건 이상이 개별적 마커의 존재를 나타내며, 나머지 80건 이하는 개별적 마커의 존재를 나타내지 않는다는 것이다. 바람직한 패널로서는 BL2-LODL, C-ERBB-2, CD44s Standard, Splice Variant CD44v6, Splice Variant CD44v3, CAVEOLIN-1, Collagenase, Cyclin D1, Cyclooxygenase-1 (COX-1), Cyclooxygenase-2 (COX-2), Cytokeratin 20 (CK20), E-CADHERIN, Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), Heat Shock Protein-90 (HSP-90), IL-6, IL-10, HLA-DR, Human Mis-Match Repair Gene (hMSH2), Lewis X, MDM2, Nuclear Matrix Protein 22 (NMP-22), P53, PCNA, MIB1 (KI-67), Retinoblastoma (Rb), SURVIVIN, TRANSFORMING GROWTH FACTOR-L, TRANSFORMING GROWTH Factor- 1 Receptor I, TRANSFONNING Growth Factor-1 Receptor II 및 UBC(CK8 and CK18)로부터 선택된 마커가 있다. 본 발명의 실시예에 사용되는 프로브/마커의 라이브러리에 대한 간략한 설명을 이하에 제공한다.
BL2-10D1
이것은 IgM 항체이다. 브레인 타입 글리코겐 포스포릴라아제(BPG)는 독특한 장내 악성종양 마커로서, 주로 3개의 이성형태: 근육, 간 및 브레인 유형으로 되어 있다. 이전까지는 면역조직화학(IHC) 기술을 거쳐, 위암이 브레인 타입 글리코겐 포스포릴라아제(BPG)의 비정상적 발현에 연관되어 있느 것으로 알려져 왔다. Tasima 등의 새로운 연구에서는 BPG가 IHC에 의한 직장결장암종의 83%에 존재한다는 것이 최초로 증명되었다. 더욱 흥미로운 것은 원격 부위로부터 얻어진 정상 결장점막은 BPG에 대해서 네거티브인 반면, 종양 인근의 외견상 정상으로 보이는 점막은 포지티브인 점이다 [Tashima, S. 등, Expressionof brain-type glycogen phosphorylase is a potentiallynovel early biomarlcer in the ccarcinogenesis of human colorectal carcinomas. Am J Gastroenterol, 2000.95(1):p.255-63].
C-ERBB-2
이것은 형질막(plasma membrane)의 소포 함입부인 카베올래(caveolae)의 주된 구조단백질이다. 연구결과, 카베올린의 계통원에는, 카베올린-스카프 폴딩이라고 불리우며 예컨대 G-단백질, Ha-ras, Src-계통 티로신 키나제 및 표피성장인자 리셉터(EGFR)을 포함한 시그날 분자들을 조직화하는 기능을 하는 보통의 도메인이 함유되는 것으로 증명되었다. 실험실내 및 생체내 동물실험에서는 세포 형질변환 및 유방암발생에 있어서 카베올린-1의 억제효과가 입증된 반면, 사람의 유방암 및 전립선암을 포함한 다른 연구에서는 카베올린-1의 발현이 종양의 발생 및 진행에 대하여 포지티브 결합을 하는 것으로 밝혀졌는 바, 이는 종양촉진기능을 가지는 것을 의미한다. Fine 등의 연구에서는 결장 아데노카르시노마의 88%가 IHC에 의한 카베올린-1에 대하여 포지티브인 것으로 밝혀졌다[Fine, S.W. 등, Eleviated expression of caveolin-1 in adenocarcinoma of the colon, Am. J. Clin Pathol., 2001.115(5):p.719-24].
CD44 Standard (CD44S) and Splice Variants CD44v6 and CD44v3
이것은 광범위하게 발현되는 세포표면 당단백질로서, 세포 대 세포, 및 세포 대 매트릭스 상호작용에 포함될 수 있는 것이다. CD44v6는 정상 표피세포와 조혈세포원에 풍부히 존재한다. 대조적으로, 교번식으로 스플라이싱된 CD44v6 변종(CD44v6v)은 표피의 세포 및 종양에서 현저하게 발현된다. 지금까지 CD44v6의 발현과 진행된 단계의 직장결장 카르시노마에 관한 몇가지 보고가 있었다. Ishida는 IHC기술에 의해 63명의 직장결장 카르시노마 환자들을 연구하였고, 그중 59%의 경우에 CD44v6에 대하여 포지티브인 것을 밝혀내었다. 정상적인 결장 점막은 CD44v6에 대하여 네거티브이다[Ishida, T., Immunohistochemical expression of the CD44 varant 6 in colorectal adenocarcinoma. Surg. Today, 2000. 30(1):p28-32].
Caveolin-1
이것은 형질막(plasma membrane)의 소포 함입부인 카베올래(caveolae)의 주된 구조단백질이다. 연구결과, 카베올린의 계통원에는, 카베올린-스카프 폴딩이라고 불리우며 예컨대 G-단백질, Ha-ras, Src-계통 티로신 키나제 및 표피성장인자 리셉터(EGFR)을 포함한 시그날 분자들을 조직화하는 기능을 하는 보통의 도메인이 함유되는 것으로 증명되었다. 실험실내 및 생체내 동물실험에서는 세포 형질변환 및 유방암발생에 있어서 카베올린-1의 억제효과가 입증된 반면, 사람의 유방암 및 전립선암을 포함한 다른 연구에서는 카베올린-1의 발현이 종양의 발생 및 진행에 대하여 포지티브 결합을 하는 것으로 밝혀졌는 바, 이는 종양촉진기능을 가지는 것을 의미한다. Fine 등의 연구에서는 결장 아데노카르시노마의 88%가 IHC에 의한 카베올린-1에 대하여 포지티브인 것으로 밝혀졌다[Fine, S.W. 등, Eleviated expression of caveolin-1 in adenocarcinoma of the colon, Am. J. Clin Pathol., 2001.115(5):p.719-24].
콜라게나제(COLLAGENASE)
콜라게나제(COLLAGENASE)는 Fas-중개의 아포프토시스에 대한 내인성 억제조절자이다. 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)의 생리학적 기능은 아직 밝혀지지 않았으나, 종양을 포함한 질병에 있어서의 병리학적 관련성은 예견되었다. 또한, 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)의 과잉발현이 T-세포 면역성으로부터 종양세포가 도피하게 되는 결과를 초래하여 종양의 발생과 성장에 관련될 수 있다는 것이 최근에 보고되었다. Ryu 등은 결장 아데노카르시노마의 100%(52/52)가 세포 FLICE-류 억제단백질(cFLIP)에 대하여 포지티브임을 증명하였다. 정상 결장상피, 선종성 폴립은 염색강도가 훨씬 낮다[Ryu, B.K. 등, Increased expression of cFLIP(L) in adenocarcinoma. J. Pathol., 2001. 194(1):p15-9].
사이클린(CYCLIN) D 1
사이클린(CYCLIN) D 1 유전자 생성물은 세포의 증식에 있어서 중요한 역할을 한다. 사이클린(cyclin) D1의 변이 및/또는 변형발현은 네오플라시아 (neoplasia)에 속한다. 사이클린(cyclin) D1의 증가된 발현은 인후두암, 뇌암, 목암, 간암, 유방암 및 결장암에서 관찰된다. Arber 등의 연구에서는 결장직장 아데노카르시노마의 30%와 선종성 폴립의 34%에서 사이클린(cyclin) D1의 염색도가 증가하였으나 과다형성 폴립 또는 정상 점막에서는 증가가 관찰되지 않았다[Arber, N. , et al., Increased expression of cyclinDI is ccn early event in mzcltistezge colorectccl carcinogenesis. Gastroenterology, 1996.110(3): p. 669-74]. 크립토(Cripto)-I(CR-I) 및 앰피레글린(Amphiregulin; AR)은 표피성장인자(EGF)-관련 펩티드이다. 수차의 보고서에서, AR과 CR-I은 실험실내 사람 결장상피세포내에서 자가분비 성장인자로서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히, AR과 CR-I중의 어느 하나가 과잉발현은, 사람의 직장 아데노마와 카르시노마의 약 70%에서 IHC에 의해 발견되었다[De Angelis, E. 등, Expression of cripto and amphiregulin in colon mucosa from high risk colon cancer families, Int. J. Oncol., 1999. 14(3):p.437-40].
사이클로옥시게나제-1 (COX-1) 및 사이클로옥시게나제-2 (Cox-2)
사이클로옥시게나제(CYCLOOXYGENASES)는 아라키돈산 대사에 관련된 포스타글란딘(postaglindin) 합성효소이다. 결장암에 대한 비스테로이드성 항염증 약제의 종양-억제효과(NSAID)를 나타내는 증거들이 있으므로, 사이클로옥시게나제 (COX-2)는 자체 활성의 감소로 인해 NSAID의 종양억제 효과를 나타내는 점에서 주목을 받아왔다. Sakuma 등은 직장암중 38%가 COX-2 포지티브임을 증명하였다. COX-2 염색은 암이 없는 조직에서보다 암 조직 영역에서 강력하다. 어떤 시편에서는 암에 근접한 조직이 암으로부터 훨씬 멀리 떨어진 조직보다 강력하게 염색된다[Sakuma, K. 등, Cyclooxygenase(COX)-2 immunoreactivity and relationshipto p53 and Ki-67 expression in colorectal cancer. J Gastroenterol,1999.34(2) : p. 189-94].
사이토케라틴 20 (CK 20)
공지의 20가지 사이토케라틴중 사이토케라틴 20 (CK 20)은 매우 과학적인 많은 논문들에 보고된 바 있다. 이것들은 결장 종양에 대해서 특이적이지는 않지만, 일단 Langendijk 등의 논문을 보면 면역조직화학적으로 CK20과 CEA가 전이성 결장 아데노카르시노마와 유방암 및 초기 자궁암을 구별하는 2개의 결정적인 주요 마커임을 알 수 있게 될 것이다[Lagendijk, J. H. 등, Immunohistochemical differentiation between primary adenocarcinomasof the ovary and ovarian metcvstcases of colonic cnd breast origin. Comparison between a statistical and an intuitive approach. J Clin Pathol, 1999. 52(4) : p.283- 90].
E-카드헤린
E- 카드헤린(CADHERIN)은 종양세포에서 20% 이상의 면역염색도를 나타내었다. 미스매치 수복 유전자인 hMLH1,hMSH2도 또한 현격하게 증가한다. 이 수복유전자들은 DNA 복제과정중에 유전적으로 "프루프 리딩(proof reading)"에 포함되므로, "관리유전자"로 호칭되기도 한다. 상기 유전자들의 변이는 위장관의 악성 초기진행 단계에 포함되는 것으로 밝혀졌다[Kapiteijn, E. , et al., Mechanisms ofoncogenesis in colon versusrectal cancer. J Pathol, 2001.195(2) : p. 171-8;Buldlolm, I. K. and J. M.Nesland, Protein e, xpression of p53, p21 (WAF1/CIP1), bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch, 2000.436 (3) : p.224-8]. Yantiss 등은 E-카드헤린과 p53이아데노마를, 공격적 아데노카르시노마를 가지는 아데노마로부터의 잘못위치된 상피와 구별짓는 2가지 중요한 마커이며, 이는 직장결장 세포들에 대한 상기 2개 마커들의 특이성을 지시해주는 것이다[Yantiss, R. K., et al., Utility of MMP-1, p53, E-cadeherin, and collagen IV immunohistochemical stains in the differential diagnosis of adenomas with misplaced epithelium versus adenomas with invasive adenocircinoma. Arn J Surg Pathol,2002. 26(2) : p.206-15]. 이 마커들은 거의 모든 고형 종양에 대해서 일반적이다.
표피성장인자 수용체(EGFR)
표피성장인자 수용체(EGFR)는 170kD의 전이막 세포표면 수용체이다. 이것은 c-erb B-2, c-erb B3 및 c-erb B4와 함께 티로신 키나아제 활성을 가지며, c-er B 프로토온코진에 의해 코드화된다. 항-EGFR 단클론성 키메라 항체는 진행된 단계의 결장 아데노카르시노마에 대한 실험적 치료법이다. 상승된 수준의 EGFR은 직장결장암, 폐, 두부, 경부, 목, 유방, 전립선 및 담낭의 편평세포 카르시노마를 포함하는 많은 고형 종양에서 발견된다. Goldstein 등의 논문에 따르면, 결장 아데노카르시노마의 75%는 EGFR 면역조직화학적 포지티브를 가지는 것으로 나타났다[Goldstein, N. S. and M. Armin, Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on CancerStage IY colon adenocarcinoma : implicationsfor a standardized scoring system. Cancer,2001. 92 (5): p. 1331-46].
표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR)
표피성장인자 수용체(EGFR)는 170kD의 전이막 세포표면 수용체이다. 이것은 c-erb B-2, c-erb B3 및 c-erb B4와 함께 티로신 키나아제 활성을 가지며, c-er B 프로토온코진에 의해 코드화된다. 항-EGFR 단클론성 키메라 항체는 진행된 단계의 결장 아데노카르시노마에 대한 실험적 치료법이다. 상승된 수준의 EGFR은 직장결장암, 폐, 두부, 경부, 목, 유방, 전립선 및 담낭의 편평세포 카르시노마를 포함하는 많은 고형 종양에서 발견된다. Goldstein 등의 논문에 따르면, 결장 아데노카르시노마의 75%는 EGFR 면역조직화학적 포지티브를 가지는 것으로 나타났다[Goldstein, N. S. and M. Armin, Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on CancerStage IY colon adenocarcinoma : implicationsfor a standardized scoring system. Cancer,2001. 92 (5): p. 1331-46].
열쇼크 단백질(Heat Shock Protein)-90 (HSP-90), IL-6 and IL-10
방광암의 초기단계에서, 결장암의 온코진 형성에 연루된 다수의 온코진과 종양억제 유전자들을 발견하였다. E-카드헤린, p53, Bcl-2, Bax는 종양세포에서 20% 이상의 면역염색도를 나타내었다. 미스매치 수복 유전자인 hMLH1,hMSH2도 또한 현격하게 증가한다. 이 수복유전자들은 DNA 복제과정중에 유전적으로 "프루프 리딩(proof reading)"에 포함되므로, "관리유전자"로 호칭되기도 한다. 상기 유전자들의 변이는 위장관의 악성 초기진행 단계에 포함되는 것으로 밝혀졌다[Kapiteijn, E. , et al., Mechanisms ofoncogenesis in colon versusrectal cancer. J Pathol, 2001.195(2) : p. 171-8;Buldlolm, I. K. and J. M.Nesland, Protein e, xpression of p53, p21 (WAF1/CIP1), bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch, 2000.436 (3) : p.224-8]. Yantiss 등은 E-카드헤린과 p53이아데노마를, 공격적 아데노카르시노마를 가지는 아데노마로부터의 잘못위치된 상피와 구별짓는 2가지 중요한 마커이며, 이는 직장결장 세포들에 대한 상기 2개 마커들의 특이성을 지시해주는 것이다[Yantiss, R. K., et al., Utility of MMP-1, p53, E-cadeherin, and collagen IV immunohistochemical stains in the differential diagnosis of adenomas with misplaced epithelium versus adenomas with invasive adenocircinoma. Arn J Surg Pathol,2002. 26(2) : p.206-15]. 이 마커들은 거의 모든 고형 종양에 대해서 일반적이다.
HLA-DR
HLA-DR을 제조하는 증폭된 서열(Eph) 계통은 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 최대 하위 패밀리이다. 에프린-B2 (Eph-B2) 및 에프린-B4 (Eph-B4)는 Eph에 결합하는 리간드이다. 에프린-Eph 시스템은 발생학적 전개와 신경 및 순환계의 분화에 있어서 중요하다. 몇가지 연구에서는, 에프린의 고수준의 발현이 종양의 성장, 종양발생 및 전이에 대한 증가된 역가와 관련되어 있을 수 있다. 면역조직화학적 분석법을 사용하여, Liu 등은 Eph-B2와 Eph-B4가 연구 경우의 100%(515)에서 인접 정상 점막들보다 강한 염색 강도를 가지게 된다[Liu, W. 등, Coepression of ephrin-Bs and their receptors in colon carcinoma. Cancer, 2002.94 (4): p. 934-9].
Human Mis-Match Repair Gene (hMSH2)
이것은 종양괴사인자의 상위 속(family)의 전이막 단백질로서, 자체의 수용체인 hMSH2을 발현하는 아포프토시스-민감성 세포내에서 세포의 사멸을 유발한다. FasL이 몇가지 타입의 암에 있어서 상한이 조절된다는 것은 얼리 입증된 바 있다. 또한, 실험실내 및 생체내 연구에서, hMSH2이 항-종양 면역 이펙터 세포에 있어서 아포프토시스를 유발함으로써 암세포로 하여금 Fas 역공을 가능하게 하여 면역반응에 손상을 줄 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 발견은 암세포에 의한 FasL 발현이 항-종양 면역반응의 억제에 중요한 인자일 수 있음을 시사하는 것이다. Belluco 등은 FasL 발현이 카르시노마와 직장결장 종양발생에 있어서 비교적 초기 경우인 것으로 밝혔다. FasL 발현은 과다증식 폴립의 28%, 저급 폴립의 76% 및 고급 폴립의 93%에서 발견되었다[Belluco, C. 등, Fas ligand isup-regzllatedduring the colorectal adenoma-carcinoma sequence. Eur J Surg Oncol,2002.28 (2): p. 120-5]. 결과는 FasL 발현이 카르시노마의 81% 및 아데노마의 41%에서 검출된다는 다른 발견들과 일련적인 것이다. 또한, FasL은 저급 아데노마에서보다 고급 형성이상 아데노마에서 훨씬 빈번하게 발현되었다.
Lewis X
Lewis X는 고도의 이동성 그룹 I 단백질 패밀리를 구성한다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다
MDM2
MDM2는 세포증식 핵 마커이다. 이것은 직정결장암을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. Sakuma 등의 직장결장암의 48%가 Ki-67에 대하여 포지티브였다 [Sakuma, K 등, Cyclooxygenase(COX)-2 immunoactivity and relationship to p53 and ki-67 expression in colorectal cancer, J. Gastroenterol., 1999. 34(2): p.189-94].
핵 매트릭스 단백질(Nuclear Matrix Protein) 22 (NMP-22)
핵 매트릭스 단백질(Nuclear Matrix Protein) 22 (NMP-22)는 고도의 이동성 그룹 I 단백질 패밀리를 구성한다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다.[Wu, T. T. , et al., The role OF BC1-2 PS3, AND KI-67 INDESR IN predicting tumor recurrence for low grade superficial transitional cell bladder carcinoma. J Urol, 2000. 163) : p. 758-60].
PCNA 및 MIB 1 (Ki-67)
Ki-67은 세포증식 핵 마커이다. 이것은 직정결장암을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. Sakuma 등의 직장결장암의 48%가 Ki-67에 대하여 포지티브였다[Sakuma, K 등, Cyclooxygenase(COX)-2 immunoactivity and relationship to p53 and ki-67 expression in colorectal cancer, J. Gastroenterol., 1999. 34(2):p.189-94].
레티노블라스토마(Retinoblastoma) (Rb)
Rb는 레티노블라스토마 유전자 이고, 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸, 엘라스틴, 라미닌, 피브로넥틴 및 카세인과 같은 범위의 기질에 대하여 단백질분해 활성을 가진다. 이것은 예컨대 인후두, 직장결장, 위, 두부, 목, 폐, 전립선 및 헵토셀룰라(heptocellular) 카르시노마와 같은 악성 종양세포에 의해서 제조된다. 면역조직화학적 연구에서는, 마트릴리신의 발현이 위 및 직장결장의 카르시노마에서 노드(nodal) 또는 원거리 전이와 상호관계가 있음을 밝혀주었다. Masaki 등의 연구에 따르면, 직장결장 카르시노마의 34%가 마트릴리신에 대하여 포지티브였다[Masaki, T. 등, Matrilysin(MMP-7) as a significant determinant of malignant potential of early invasive colorectal carcinomas, Br. J. Cancer, 2001, 84(10):p1317-21].
SURVIVIN
SURVIVIN은 세포증식 핵 마커이다. 이것은 직정결장암을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. Sakuma 등의 직장결장암의 48%가 Ki-67에 대하여 포지티브였다(LEHNER, R. , et AL., Immunohistochemical localization of the IAP protein survivin in bladder mucosa and transitional cell carcinoma. Appl Immunohistochem Mol MORPHOL, 2002.10 (2): p. 134-8).
형질전환 성장인자(Transforming Growth FACTOR)-ß 1, 및 리셉터 I 및 II
TGF-ß 1은 고도의 이동성 그룹 I 단백질 패밀리를 구성한다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다.(Kim, J. H. , et al., Predictive value of EPRESSION OF TRANSFORMINGGROWTHFCACTOR- beta(I) and its receptors in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Cancer, 2001. 92 (6) : p. 1475-83).
UBC (CK8 and CK18)
UBC (CK8 and CK18)는 항박테리아 활성의 넓은 스펙트럼을 가지는 효소이다. 이것은 타액, 눈물, 젖, 혈청, 위액 및 소장의 소화액을 포함한 사람의 다양한 조직액 및 분비액에 존재한다. 리소자임은 정상적인 결장 상피에는 존재하지 않는다. 흥미로운 것은, 다수의 면역조직화학적 연구에서, 위의 아데노마 및 아데노카르시노마 종양세포에서 리소자임의 발현이 입증되었다는 것이다. 다수의 연구에서, 결장암의 리소자임 양성도가 28 내지 80%인 반면, 아데노카르시노마에 인접한 정상적 결장 선에서는 리소자임 단백질 발현이 전혀 관찰되지 않았다 (Heicappell, R., et al., Evaluation of urinary bladder cancer antigen as a marker for diagnosis of transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Scand J Clin Lab Invest, 2000. 60 (4): p. 275- 82).
조직-기반의 마커
SURVIVIN은 세포증식 핵 마커이다. 이것은 직정결장암을 포함하는 다양한 종양에서 발현된다. Sakuma 등의 직장결장암의 48%가 Ki-67에 대하여 포지티브였다(LEHNER, R. , et AL., Immunohistochemical localization of the IAP protein survivin in bladder mucosa and transitional cell carcinoma. Appl Immunohistochem Mol MORPHOL, 2002.10 (2): p. 134-8). 형질전환성장인자 및 리셉터 I 및 II는 고도의 이동성 그룹 I 단백질 패밀리를 구성한다. 전자의 2개 단백질은 교번식 스플라이싱을 거쳐서 동일한 유전자 HMGI (Y)에 의해 코드화되는 반면, HMGI-C는 다른 유전자의 산물이다. HMGI 유전자는 양성 및 악성 종양의 발생에 관련되어 있다. 종래의 보고에 따르면, HMGI (Y) 단백질은 결장 카르시노마 세포주 및 조직에서는 다량으로 발현되지만, 정상의 결장 점막에서는 발현되지 아니한다. Chiappetta 등은 36개 직장결장 카르시노마가 IHC에 의한 HMGI (Y)에 대하여 모두 포지티브인 반면, 정상의 결장 점막에서는 발현이 전혀 검출되지 아니함을 발견하였다. 아데노마에 있어서 HMGI (Y) 발현은 세포의 비정형도와 밀접하게 상호연관되어 있다. 시험된 비-종양성 폴립 18개체중에서 단 2개만이 HMGI (Y)-포지티브였다[Chiapp. etta, G. 등, High mobility group HMGI (Y) protein expression in human colorectal hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer, 2001.91 (2): p.147-51]. 이러한 결과는, HMGI (Y) 단백질의 도입이 직장 세포의 종양 형질변환의 초기단계와 관련되고, 직장 세포의 과대증식과는 단지 드물게 관련되어 있다는 것을 시사하는 것이다.(Crawford, J. M. and R. S. Cotran, THE LOWER URINATY TRACT, in ROBBINS PATHOLOGIC BASIS OF DISEASE, T. Collins, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p. 1003-1008 ; Williams, S. G., M. Buscarini, and J. P. Stein, Molecular markers for diagnosis, staging, and prognosis of bladder cancer. Oncology (Huntingt), 2001. 15 (11) : p. 1461-70, 1473-4, 1476; discussion 1476-84; Lehner, R. , et AL., IMMNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF THE IAP protein SVERVIVIN IN BLADDER MZCCOSA AND TRANSITIONAL CELL CARCINOMA. APPL IMMUNOHISTOCHEM MOL Morphol, 2002. 10 (2) : p. 134-8).
세포-기반의 면역세포화학적 마커
방광암 패널에는 직장결장 카르시노마의 초기 검출용 마커뿐만 아니라 전이성 잠재 및 예후를 추정하기 위한 마커도 포함된다. 예를 들어, 포지티브 CEA(carcinoembryonic antigen) 반응은 방광 카르시노마의 분화의 등급과 상당한 관련성을 가지지만, 이러한 항원의 세포내 확산성 발현은 종양이 장관벽을 너머 림프구를 공격하는 것을 지시하는 경우도 있다. 발현된 조직 항원의 수는, 장관벽을 통해 퍼진 종양의 정도에 현저하게 관련된다[Lorenzi,M. 등, Histopathological and prognostic evaluation of immunohistochemical findings in colorectal cancer. Int J Biol Markers,1997, 12 (2): p. 68-74]. 또한, 혈청 CEA 수준 및 p53 단백질의 발현은 직장결장암에 대한 보충적 예후 정보를 제공한다. p53의 포지티브 면역염색 및 상승된 CEA 수준은 누적식 무병 생존도가 낮은 것과 관련되며, 독립적 예후의 중대성을 가지는 것으로 나타났다[Diez, M. 등, Time-clependency of the prognostic effect of carcinoembryonic antigen andp53protein in colorectal adenocarcinoma. Cancer, 2000.88(1):p. 35-41]. Nasierowska-Guttmejer and associates[Nasierowska-Guttmejer, A., The comparison of immunohistochemical proliferation and apoptosis marlcers in rectclcarcinoma treated suricczlly or by preoperative radio-chemotherapy. Pol J Pathol, 2001. 52(1-2) : p.53-61]는 Ki-67의 낮은 발현과 Bax 발현의 높은 수준이 종양 덩어리의 치료 및 완화에 대한 직장결장암의 전체적 또는 거의 전체적인 반응과 상관되어 있음을 밝혔다. 그러나, 이 경우들의 2/3 이하는 낮은 발현의 p53, MIB1, bax and bcl-2와 관련된다. 또다른 연구에서는 더 높은 수준의 p53 및 Ki67 값이 예후적으로 부족한 저직병리학적 특징들과 관련을 가지게 됨을 밝혔다[Saleh, H. A. , H. Jackson 및 M. Banerjee, Immunohistochemical expression of bcl-2 and p53 oncoproteins : correlation with K167 proliferation index and prognostic histopathologic parameters in colorectal neoplasia. Appl Immunohistochem MolMorphol, 2000. 8(3): p. 175-82]. 또한, 직장결장암에서 cyclinD 1, CD4Av6 및 matrilysin (MMP-7)의 발현은 높은 재발률, 재발병 방지의 감소 및 전반적으로 취약한 생존률과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다[McKay, J. A. 등, Analysisof lcey cell-cycle checkpointproteins in colorectal tumours. J Pathol, 2002.
196 (4):p.386-93; Ropponen, K.M. 등, Expression of CD44 and variantproteins in hDlman colorectal cancer and its relevance for prognosis. Scand J Gastroenterol, 1998. 33 (3): p. 301-9; Bhatavdekar, J. M. 등, Molecular markers are predictors of recurrence and survival in patients with Dukes B and Dukes C colorectal adenocarcinoma. Dis Colon Rectum,2001.44 (4): p.523-3; 및 Adachi, Y. 등, Clinicopathologic and prognostic significance of matrilysinexpression at the invasivefront in human colorectal cancers. Int J Cancer, 2001.95(5): p.290-4). 연구들로부터, 직장결장암에 있어서 p53, MMP-7, -카텐(caten) n의 발현증가 및 pf E-카데린(Cadherin)의 발현감소는 자체의 전이 포텐셜의 증가와 연루되어 있다는 점이 증명되었다[Zeng, Z. S. 등, Matrix metalloproteinase-7 expression in colorectal cancer liver metastases: evidence for involvement of MMP-7 activation in human cancer metastases. Clin Cancer Res, 2002.8(1): p. 144-8; Ikeguchi,M. 등, Reduced E-cadherin expression and anlargement of cancer nuclei strongly correlate with hematogenic metastasis in colorectal adenocarcinoma. Scand J Gastroenterol,2000. 35 (8): p.839-46; Sory, A. 등, Does p53 overexpression cause metastases in early invasive colorectal adenocarcinomal Eur J Surg, 1997.163 (9): p. 685-92; 및 Hiscox, S. and W. G. Jiang, Expression of E-cadherin, alpha, beta and gamma-catenin in human colorectal cancer. Anticancer Res, 1997.17(2B) : p. 1349-54). 따라서, 직장결장암 패널들은 진단적 및 예후적 값을 가지게 될 것이고, 임상치료에 있어서 가이드를 하기 위한 환자 위험단계를 제공할 수 있을 것이다.
바람직한 프로브/마커
직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 바람직한 패널들은 상기의 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 보다 바람직한 패널들은 fromp-catenin, E-cadherin, hMSH2, hMLHl,p53 및 사이토케라틴으로부터 선택되는 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암의 실질적으로 전부는 유전적 변형을 나타내므로, 조기 검출의 기회를 제공하게 된다. E-Cadherin과 dp-catenin은 APC (adenomatous polyposis Coli) 종양억제 유전자와 긴밀한 상호작용을 한다. APC 유전자의 결실은 FAP(familial adenomatous polyposis) 및 가드너 증후군(Gardner syndrome)과 관련되며, 직장결장암의 발병률이 높아진다. 직장결장암에 있어서의 다른 유전적 변형은 DNA 수복 유전자이다. 2가지 중요한 미스매치 수복 유전자 hMSH2 및 hMLHI는 DNA 복제중에 "proof-reading"을 담당한다. 다른 마커 p53은 17번 염색체에 존재하고, 직장결장암의 70% 이상은 염색체 17p에 결실이 있다. 사이토케라틴(Cytokeratin) 20(CK20)은 직장결장암에서 일관성 있게 발현되고, 네거티브 사이토케라틴(cytokeratin) 7(CK7) 염색과 커플링되며, 그 조합(CICO+/CK7-)은 직장결장암에 대하여 고도로 특이적이다(Chu, P. E. Wu, 및 L.M. Weiss, Cytokeratin 7 and cytokeratin 20 expression in epithelial neoplasms: a survey of435 cases. Mod Pathol, 2000. 13 (9): p. 962-72).
본 실시예에서는 다음의 약어들이 사용되었다: CD44s = CD44 Standard, CD44v6 = CD44 splice variant 6, CD44v3) = CD44 splice variant 3, CK = Cytokeratin, COX-1 = Cyclooxygenase-1, Cox-2 = Cyclooxygenase-2, EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor, ELISA = Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, FFPE = Formalin Fixed Paraffin Embedded, FNA = Fine Needle Aspiration, FNB = Fine Needle Biopsy, HLA-DR = Human Leukocyte ANTIGEN-DR, HMSH2 = Human Mismatch Repair Gene, HNPCC = Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer, HSP-90 = Heat Shock Protein-90, IL-6 = Interlukin-6, IL-10 = INTERLUKIN-10,. ICC = Immunocytochemistry, IHC = IMMUNOHISTOCHEMISTRY, ISH = In Situ Hybridization, NMP22;= Nuclear matrix proteins, PCNA = Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCR = Polymerase Chain Reaction, TCC = Transitional Cell Carcinoma, TGF = Transforming Growth Factor, STDs = Sexual Transmitted Diseases and Rb = Retinoblastoma.
IV. 전립선암
전립선 종양은 생물학적 또는 임상적 기회를 제공한다. 미국에서의 이러한 상피 종양은 지난 몇년간 꾸준히 증가하였으며, 현재 매년 50,000건 이상 새로 발생되고 있다. 이러한 종양의 검출 및 관리기술이 개선됨에도 불구하고, 사망자는 매년 약 10,000명에 달한다[Crawford, J. M. and R. S. Cotran, THE LOWER URINARV TRACT, in ROBBINS PATHOLOGIC BASIS OF DISEASE, T. Collins, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p.1003-1008]. 현재, 전립선암을 스크리닝 및 검출할만한 신뢰할 수 있는 방법은 존재하지 않는 실정이다. 그러므로, 이환율과 치사율을 감소시키기 위해 초기에 전립선암을 검출해낼 수 있는 개선된 방법이 필요하다.
전립선암의 95% 이상은 상피에 문제가 있는 경우이며, 나머지는 중간엽세포 종양이다. 상피 종양의 약 90%는 전이성 세포로 구성되며, 전이세포 카르시노마(TCC) 라고 지칭되는 반면, 나머지 10%는 편평세포 및 선 종양이다. TCC는 미국에서 5번째로 가장 보편적이인 악성 종양이고, 2번째로 보편적인 비뇨기계 카르시노마이다. TCC는 2개의 주요 등급으로 구분된다: 저급 및 고급. 낮은 등급의 TCC는 항상 정상의 전이성 상피를 반복하는 돌기를 가지는 비공격성 병소이다. 이 경우는 탁월한 예후 기능을 나타낸다. 고급 TCC는 돌기 형상이거나 절을 이루거나 2가지 모두를 가질 수 있고, 상당한 세포 다형성(pleomorphism) 및 역형성(anaplasia)을 나타낸다. 이것들은 전립선 종양의 50%를 차지하고, 전이잠재성을 가지며, 10년 이내의 진단을 받은 경우들중 60%가 사망하였다[Crawford, J. M. and R. S. Cotran, The Lower Urina7 Tract,in Robbins Pathologic Basis of Disease, T. Collins, Editor. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p.1003-1008)].
전립선 세포학은 통상의 스크리닝 방법이며, 고급 전립선암에 대한 유용한 진단 정보를 제공한다[Koss, L. G. 등, Diagnostic value of cytology of voided urine. Acta Cytol, 1985. 29(5): p. 810-6). 그러나, 저급 종양에서는 형태학적 변형이 결여되기 때문에, 저급 돌기 전이세포 카르시노마(TCC)를 검출하기 위한 자체의 효율은 신뢰가 보다 낮다[Busch, C. 등, Malignancy grading of epithelial bladder tumours. Reproducibility of grading and comparison between forceps biopsy, aspiration biopsy andexfoliative cytology. Scand J UrolNephrol, 1977.11 (2): p. 143-8; Murphy,W. M. 등, Urinary cytologyand bladder cancer. The cellularfeatures of transitional cell neoplasms. Cancer,, 1984.53 (7): p.1555-65; Shenoy, U. A., T.V. Colby, and G. B. Schumann, Reliability ofurinary cytodiagnosis in vcrothelial neoplasms. Cancer, 1985. 56 (8): p. 2041-5].
전립선 검사는 환자에게는 공격적이고 성가신 것일 수 있다. 외측 종양은 평판 TCC 이외의 전립선경 검사에 의해 신뢰도 높게 진단할 수 있으며, 특히 카르시노마(carcinoma in situ)는 내시경 딜레머remains an endoscopic 에 빠지게 된다[Lin, S. 등, Cytokeratin20 as animmunocytochemical markerfor detection of urothelial carcinoma inatypical cytology : p^eliminary retrospective stucly on archived urine slides. Cancer Detect Prev, 2001. Invest, 2000.60(4): p.275-82]. 전형적으로, 전립선세포학과 전립선내시경을 필요에 따라 생검법과 함께 사용하여 진단의 감도를 최적화한다. 이러한 실험은 단독으로나 연합하여 질병의 재발 또는 진행을 조기에 검출 또는 평가하기에 불충분하다.
면역세포화학(ICC)은 공격적이지 않고 전립선세포학에 비해서 감도가 증가되어왔기 때문에 인기를 더해가고 있다. 전립선내시경의 사용시에 직면하게 되는 제한이 있었음에도 불구하고 핵 매트릭스 단백질(NiVIP22) 및 사람 보족인자 H-관련 단백질(BTA stat)에 대한 뇨 테스트는 수년간 시판되어 왔다. NIP22는 BTA 방법보다 감도는 높지만 특이성이 불충분하고 문제성이 있는 거짓-포지티브 비율이 있는 점이 있다.[Ramakumar, S., et al. , Comparison of screening methods in the detection of bladder cancer. J Urol, 1999.161 (2): p. 388-94 ; Ross, J. S. and M. B. Cohen, DETECTING RECURRENT BLADDER CANCER : NEW METHODS AND. BIOMCARKERS. Expert Rev Mol Diagn, 2001. 1 (1) : P. 39-52).
그러나, FDA는 최근 MATRITECH로부터 개선된 ImmunoCyt의 NMP22 검정법을 승인하였다. 이 새로운 검정법은 2가지 항체와 가정용 임신진단 테스트와 같은 기구를 포함한다. 상기 검정법은 뇨에 혈액이 있어도 영향을 받지 않기 때문에 거짓-포지티브 비율이 포함되지 않으며, 전립선내시경에 비할만한 진단정확도가 개선되었다. ImmunoCyt는 형광 마커로 표지화된 3개 종양 마커의 혼합물이다. 이것은 뮤신의 당단백질과 전립선내 종양세포에 의해 발현된 형태의 CARCINOEMBRONYONIC ANTIGEN (CEA)이 들어 있다. 그러나, 이것은 재발 전립선암의 모니터링용이지 스크리닝용이 아니며, 가시화를 위한 형광 현미경이 필요하다[MIAN, C. , et al., IMMUNOCYT : A NEW TOOLFOR DETECTING TRANSITIONAL CELL CANCER OFTHE ZLRINARY TRACT. J UROL, 1999.161 (5): p. 1486-9].
면역조직화학(IHC)은 임상 비뇨기과용으로 전립선암의 평가를 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법이다. 지금까지 연구되고 전립선암의 임상적 결정과정에 중요한 역할을 하는 대부분의 종양 마커는 IHC의 적용으로부터 진화되었다 [Williams, S. G., M. Buscarini, and J. P. Stein, MOGCU/AR MARKERSFOR DIAGNOSIS, STAGZNG, AND PROGNOSIS OF BLCADCLER cancer. Oncology (HUNTINGT), 2001.15 (11) : p. 1461-70, 1473-4, 1476; discussion 1476-84]. 불행히도, 전립선암 검출용 마커중 어느 것도 감도와 특이성 모두가 높은 "요술공이 아니었다. 진단의 정확도를 높이는 다른 방법이 필요하게 되었다.
진단의 정확도를 높이는 다른 방법은 복수개의 프로브로 이루어지고 그 각각이 전립선암에 관련된 마커와 특이적으로 결합하는 패널을 전개시키는 것이었다.
바람직한 프로브/마커
직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 바람직한 패널들은 상기의 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암을 검출 및 진단하기 위한 보다 바람직한 패널들은 fromp-catenin, E-cadherin, hMSH2, hMLHl,p53 및 사이토케라틴으로부터 선택되는 1 이상의 종양 마커이다. 직장결장암의 실질적으로 전부는 유전적 변형을 나타내므로, 조기 검출의 기회를 제공하게 된다. E-Cadherin과 dp-catenin은 APC (adenomatous polyposis Coli) 종양억제 유전자와 긴밀한 상호작용을 한다. APC 유전자의 결실은 FAP(familial adenomatous polyposis) 및 가드너 증후군(Gardner syndrome)과 관련되며, 직장결장암의 발병률이 높아진다. 직장결장암에 있어서의 다른 유전적 변형은 DNA 수복 유전자이다. 2가지 중요한 미스매치 수복 유전자 hMSH2 및 hMLHI는 DNA 복제중에 "proof-reading"을 담당한다. 다른 마커 p53은 17번 염색체에 존재하고, 직장결장암의 70% 이상은 염색체 17p에 결실이 있다. 사이토케라틴(Cytokeratin) 20(CK20)은 직장결장암에서 일관성 있게 발현되고, 네거티브 사이토케라틴(cytokeratin) 7(CK7) 염색과 커플링되며, 그 조합(CICO+/CK7-)은 직장결장암에 대하여 고도로 특이적이다(Chu, P. E. Wu, 및 L.M. Weiss, Cytokeratin 7 and cytokeratin 20 expression in epithelial neoplasms: a survey of435 cases. Mod Pathol, 2000. 13 (9): p. 962-72). 직장결장암에 대한 이러한 종양 마커들의 중요성은 후술한다.
34J3E12
34J3E12는 세포 사이클 억제제로서, 주요 종양억제단백질이다. 관찰 결과, 장의 종양에 있어서 p16의 역할은 프로모터 영역이 사람의 결장 종양의 하위 세트에서 메틸화되도록 하는 것으로 제안되었다. Dai 등은 p16 발현이 정상의 점막, 28개중 18개 초기 결장 카르시노마 및 5개중 5개 전이성 결장 카르시노마 에서 매우 낮은 사실을 밝혔다. 또한, Ki-67, 사이클린 A 및 레티노블라스토마 단백질과 역으로 상호연관된 p16 염색은 세포 사이클의 진행이 억제됨을 시사한다[Dai, C.Y. 등, p16(INK4a) expression begins early in human colon neoplasia and corellates inversely with markers of cell proliferation. Gastroenterology, 2000, 119(4):p.929-42]. 이것은 인터페론을 유발시킬 수 있는 단백질 키나아제로서, 바이러스 및 세포 단백질 합성 모두의 조절에 있어서 주된 인자이다. 이것의 발현은 정상 세포주나 안세포주 모두에 있어서 세포의 분화와 상관된다. Singh 등은 p68이 직장결장 카르시노마 환자의 76%에게서 포지티브였음을 알게 되었다. 정상의 결장 점막에서는 약한 p68 염색이 나타났을 뿐이다. 고도의 p68발현은 개선된 생존률을 지향하는 경향을 입증하였다. p68을 높은 수준(3 내지 4+)으로 발현하는 종양을 앓는 환자들은 p68 발현률이 낮은 환자들에 비해 생존률이 5년 더 길었다 (Wojno, K. J. and J. I. Epstein, The UTILIIY of basal cell-specific anti-cytokeratin antibody (34 beta E12) in the diagnosis of prostate cancer. A review OF 278 CASES. AM J Surg Pathol, 1995. 19 (3) : p. 251-60).
B72. 3
B72. 3은 칼슘 결합단백질로서, 세포의 불멸화, 세포성장, 포유동물 상피 줄기세포가 근육상피 계통의 세포로 분화되는 것, 및 섬유세포형성에 관여된다. 또한, B72. 3은 전이성 종양세포에서 특이적으로 발현하는 것으로 보고되었다. Takenaga 등은 국소적 카르시노마의 44%와 아데노카르시노마의 94%가 면역적으로 포지티브인 반면, 어떠한 아데노마도 포지티브가 아닌 것으로 관찰하였다. 흥미로운 점은, 면역양성 세포의 발생이 침습의 깊이에 따라 증가하고, 간의 14 전이에 거의 모든 카르시노마 세포가 포지티브인 것이다. 이러한 결과로부터, S10OA4는 아데노마를 아데노카르시노마와 구별시키는 양호한 마커이고, 직장결장 종양세포의 진행 및 전이과정에 포함될 수 있음을 알 수 있다(Myers, R. B. , et al., Expression of tumor-associated glycoprotein 72 in prostatic intraepithelial neoplasia and prostatic ADENOCARCINOMA. Mod Pathol, 1995.8 (3) : p. 260-5).
C-erb-B2
C-erb-B2는 온코 유전자(종양발생 유전자)이고, 이것의 산물인 pRB는 세포 사이클의 네거티브 조절제로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 유전자 변형에 의해 pRB 발현이 결여되면 골육종 및 폐, 유방 및 담낭의 카르시노마를 포함하는 몇가지 악성종양이 발생될 수 있는 것으로 판단된다. 반대로, 직장결장암은 이 유전자의 간헐적 비활성화를 나타내는 것으로 보고된 바 있으며, 서던블롯 분석에서는 직장결장암의 약 30%에서 Rb 유전자 증폭을 입증하였다. Yamamoto 등은 웨스턴 블롯에 의해서 Rb 및 이것의 관련 키나아제 cdk2 및 cdc2에 관해 연구하여 직장결장암에서 과포스포릴화된 형태의 pRB와 상승된 수준의 cdk2/cdc2를 발견하였다. 또한, 면역조직화학적 연구에서는 cdc2/cdc2가 pRB에 대하여 포지티브인 암세포에 포괄적으로 발현되는 것을 밝혔다. 이러한 결과는 직장결장암에서 cdk2/cdc2의 발현이 증가되어 pRB가 세포 사이클이 포스포릴화를 거치지 못하도록 차단할 수 있음을 시사하는 것이다 (Arai, Y. , T. Yoshiki, and 0. Yoshida, C-ERBB- 2 ONCOPROTEIN : A POTENTIAL BIOMCCRKER OF CADVANCEDPROSTAIE CCANCER. Prostate, 1997. 30 (3) : p. 195- 201).
E-카드헤린(Cadherin)
E-Cadherin은 Kapiteijin 등과 Bukholm 등은 별도로 수행된 각각의 연구에서, 결장암의 온코진 형성에 연루된 다수의 온코진과 종양억제 유전자들을 발견하였다. E-카드헤린, p53, Bcl-2, Bax는 종양세포에서 20% 이상의 면역염색도를 나타내었다. 미스매치 수복 유전자인 hMLH1,hMSH2도 또한 현격하게 증가한다. 이 수복유전자들은 DNA 복제과정중에 유전적으로 "프루프 리딩(proof reading)"에 포함되므로, "관리유전자"로 호칭되기도 한다. 상기 유전자들의 변이는 위장관의 악성 초기진행 단계에 포함되는 것으로 밝혀졌다[Kapiteijn, E. , et al., Mechanisms ofoncogenesis in colon versusrectal cancer. J Pathol, 2001.195(2) : p. 171-8;Buldlolm, I. K. and J. M.Nesland, Protein e, xpression of p53, p21 (WAF1/CIP1), bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch, 2000.436 (3) : p.224-8]. Yantiss 등은 E-카드헤린과 p53이아데노마를, 공격적 아데노카르시노마를 가지는 아데노마로부터의 잘못위치된 상피와 구별짓는 2가지 중요한 마커이며, 이는 직장결장 세포들에 대한 상기 2개 마커들의 특이성을 지시해주는 것이다[Yantiss, R. K., et al., Utility of MMP-1, p53, E-cadeherin, and collagen IV immunohistochemical stains in the differential diagnosis of adenomas with misplaced epithelium versus adenomas with invasive adenocircinoma. Arn J Surg Pathol,2002. 26(2) : p.206-15]. 이 마커들은 거의 모든 고형 종양에 대해서 일반적이다. (Bryden, A. A. , et al., E-cadherin and beta-catenin are down-regulated in prostatic bone metastases. BJU Int, 2002. 89 (4): p. 400-3 ; Umbas, R., et AL., Decreased E- cadherin expression is associated with poor prognosis in patients with prostate cancer. Cancer Res, 1994. 54 (14): p. 3929-33).
EGFR
표피성장인자 수용체(EGFR)는 170kD의 전이막 세포표면 수용체이다. 이것은 c-erb B-2, c-erb B3 및 c-erb B4와 함께 티로신 키나아제 활성을 가지며, c-er B 프로토온코진에 의해 코드화된다. 항-EGFR 단클론성 키메라 항체는 진행된 단계의 결장 아데노카르시노마에 대한 실험적 치료법이다. 상승된 수준의 EGFR은 직장결장암, 폐, 두부, 경부, 목, 유방, 전립선 및 담낭의 편평세포 카르시노마를 포함하는 많은 고형 종양에서 발견된다. Goldstein 등의 논문에 따르면, 결장 아데노카르시노마의 75%는 EGFR 면역조직화학적 포지티브를 가지는 것으로 나타났다[Goldstein, N. S. and M. Armin, Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on CancerStage IY colon adenocarcinoma : implicationsfor a standardized scoring system. Cancer,2001. 92 (5): p. 1331-46]. 에프린-B2 (Eph-B2) 및 에프린-B4 (Eph-B4)는 Eph에 결합하는 리간드이다. 에프린-Eph 시스템은 발생학적 전개와 신경 및 순환계의 분화에 있어서 중요하다. 몇가지 연구에서는, 에프린의 고수준의 발현이 종양의 성장, 종양발생 및 전이에 대한 증가된 역가와 관련되어 있을 수 있다. 면역조직화학적 분석법을 사용하여, Liu 등은 Eph-B2와 Eph-B4가 연구 경우의 100%(515)에서 인접 정상 점막들보다 강한 염색 강도를 가지게 된다. 이와 같은 발견은 암세포에 의한 FasL 발현이 항-종양 면역반응의 억제에 중요한 인자일 수 있음을 시사하는 것이다. Belluco 등은 FasL 발현이 카르시노마와 직장결장 종양발생에 있어서 비교적 초기 경우인 것으로 밝혔다. FasL 발현은 과다증식 폴립의 28%, 저급 폴립의 76% 및 고급 폴립의 93%에서 발견되었다(Cohen, D. W., et AL., Expression of transforming growth factor-alpha and the epidermal growth factor receptor in HZIMCAN PROSTATE TISSUES. J UROL, 1994. 152 (6 Pt 1) : p. 2120-4).
지방산 신타제(FAS)
지방산 신타제(FAS) 또는 종양-항원 519(OA-519)는 핵심적인 지방 생성(lipogenic) 효소이다. 이는 최근까지 유방암의 나쁜 예후에 관련되었다. 셔바지 일행[셔바지(Shurbaji, M.S.), 칼브플라이쉬(J.H. Kalbfleisch) 및 서몬드(T.S. Thurmond), Immunohistochemical detection of a fatty acid synthase (OA-519) as a predictor of progression of prostate cancer. Hum Pathol, 1996. 27(9): p. 917-21]은 전립선 암의 57%에서 FAS가 발현되었고 FAS 양성 암이 FAS 음성 암보다 더욱 진행될 가능성이 많았음을 입증하였다. 스위넨의 연구[스위넨(Swinnen, J.V.) 등, Overexpression of fatty acid synthase is an early and common event in the development of prostate cancer. Int J Cancer, 2002. 98(1): p. 19-22]에서, 양성 과다형성 샘 구조체는 모두 FAS 염색에서 음성이었으며, 면역조직화학적 신호는 25개의 낮은 등급 전립선 상피 종양(PIN) 병소중 24개에서, 26개의 높은 등급 PIN 병소중 26개에서, 87개의 침습성 암종중 82개에서 뚜렷하였다. 염색 강도는 낮은 등급에서 높은 등급 PIN으로, 침습 암종으로 증가하는 경향이 있었다. FAS 발현이 높은 암은 전반적으로 높은 증식 지수를 가졌다. 다른 연구에서, FAS는 전립선 암에 대한 중요한 예측 마커이고, 글리슨(Gleason) 등급을 능가하는 추가적인 예측 정보를 제공하는 몇 안되는 마커중 하나인 것으로 밝혀졌다[엡스타인(Epstein, J.I.), 카마이클(M. Carmichael) 및 파틴(A.W. Partin), OA-519 (fatty acid synthase) as an independent predictor of pathologic state in adenocarcinoma of the prostate. Urology, 1995. 45(1): p. 81-6].
ID-1
나선-고리-나선 단백질 ID-1은 기본 나선-고리-나선 전사 인자가 DNA에 결합하지 못하게 하여 분화 관련 유전자의 전사를 억제하는 역할을 한다. 유방암, 식도암, 췌장암 및 갑상선 수질 암 같은 특정 종양에서는 ID-1이 과발현되는 것으로 보고되어 있다. 오양 일행[오양(Ouyang, X.S.) 등, Over expression of ID-1 in prostate cancer. J Urol, 2002. 167(6): p. 2598-602]은 면역조직화학적 연구 및 원위치에서의 하이브리드 형성시 정상 전립선 또는 BPH 조직에서 ID-1의 음성 내지 약한 발현이 관찰되었음을 보고하였다. 대조적으로, 모든 전립선암 생검에서는 메신저 RNA 및 단백질 수준에서 종양 세포에서 상당한 양성 ID-1 발현을 보여주었다. 뿐만 아니라, ID-1의 발현은 잘 분화된 암종보다 불량하게 분화된 암종에서 더욱 강하여, ID-1 발현 수준이 종양 등급과 관련될 수 있음을 암시하였다.
칼리크레인 2
인간의 샘 칼리크레인 2(hK2)는 세린 프로테아제의 다중 유전자 부류의 일원이다. 이는 전립선 상피에서 발현되고, 안드로겐에 의해 조절된다. 칼리크레인 2는 혈청 및 정액에 존재한다. 이는 내인성 프로테아제 저해제(예컨대, 알파2-매크로글로불린 및 알파1-안티키모-트립신)와 착체를 형성할 수 있다. 연구 결과, 칼리크레인 2가 전립선-특이적 항원(PSA)과 결합할 때 전립선 암 검출의 특이성이 증가되는 것으로 밝혀졌다[파틴(Partin, A.W.) 등, Use of human glandular kallikrein 2 for the detection of prostate cancer: preliminary analysis. Urology, 1999. 54(5); p. 839-45]. 다른 연구에서는, 인간의 샘 칼리크레인과 유리 전립선-특이적 항원(PSA)의 조합으로 인해, 적당히 증가된 총 PSA를 갖는 환자에서 전립선암과 양성 전립선 과다형성의 식별이 향상되었음을 보여주었다[맥클라라(Magklara, A.) 등, The combination of human glandular kallikrein and free prostate-specific antigen (PSA) enhances discrimination between prostate cancer and benign prostatic hyperplasia in patients with moderately increased total PSA. Clin Chem, 1999. 45(11): p. 1960-6]. 남 일행[남(Nam, R.K.) 등, Serum human glandular kallikrein-2 protease levels predict the presence of prostate cancer among men with elevated prostate-specific antigen. J Clin Oncol, 2000. 18(5): p. 1036-42]은 인간의 혈청 샘 칼리크레인 2 수준이 높아진 PSA를 갖는 인간 중에서 전립선암의 존재를 예측하는 것으로 보고하였다.
Ki-67
이는 정상 세포 및 종양 세포 증식시 발현되는 핵 단백질이다. Ki-67 발현은 후기 G1, S, M 및 G2로 명명된 세포 주기의 기간동안 이루어지나, G0 기간에는 이루어지지 않는다[캐토레티(Cattoretti, G.) 등, Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol, 1992. 168(4): p. 357-63]. Ki-67은 세포 증식 마커로서 흔히 사용되며, 핵에 위치한다. 연구 결과, 전립선암에서의 Ki-67 염색은 근치 전립선 절제술 후에 독립적인 예측 정보를 제공하며, Ki-67 면역 반응성은 전립선암 생존율에 대한 예측 수단인 것으로 밝혀졌다[할보슨(Halvorsen, O.J.) 등, Maximum Ki-67 staining in prostate cancer provides independent prognostic information after radical prostatectomy. Anticancer Res, 2001. 21(6A): p. 4071-6; 스태틴(Stattin, P.) 등, Cell Proliferation assessed by Ki-67 immunoreactivity on formalin fixed tissues is a predictive factor for survival in prostate cancer. J Urol, 1997. 157(1): p. 219-22].
Leu 7
이 항원은 비-암성 및 암성 전립선 상피뿐만 아니라 천연 킬러 세포 및 말이집 신경에 존재한다. 류 일행[류(Liu, X.) 등, Immunohistochemical study of HNK-1 (Leu-7) antigen in prostate cancer and its clinical significance. Chin Med J (Engl), 1995. 108(7): p. 516-21]은 전립선암의 94%가 Leu 7에 대해 양성임을 발견하였다. 잘 분화된 암은 가장 높은 양성 암 세포 백분율 및 가장 강한 염색을 나타낸 반면, 불량하게 분화된 암은 가장 낮은 양성 암 세포 백분율 및 가장 약한 염색을 나타내었다. 다른 연구에서는, 전립선 암에서의 Leu 7의 발현이 전립선 암 환자에게 유용한 예측 인자일 수 있음을 암시하였다[류 등, The prognostic value of the HNK-1 (leu-7) antigen in prostatic cancer--an immunohistochemical study. Hinyokika Kiyo, 1993. 39(5): p. 439-44].
MDM2
이는 세포의 원발암 유전자 생성물이다. MDM2는 p53에 결합하여, 유비퀴틴을 거치는 열화를 촉진시키고 그의 트랜스 활성화(transactivation) 도메인을 차폐하고 세포 주기 정지 및 세포자멸사에 관련된 유전자의 전사 활성화를 억제한다[모맨드(Momand, J.) 및 잠베티(G.P. Zambetti), Mdm-2: "big brother" of p53. J Cell Biochem, 1997. 64(3): p. 343-52]. MDM2 유전자의 증폭 또는 MDM2 단백질의 과발현은 종양의 발달에 연루되어 있고, MDM2 과발현은 더욱 공격적인 질병 및 더욱 불량한 생존율에 연관된다[프리드맨(Freedman, D.A.), 우(L. Wu) 및 레빈(A.J. Levine), Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol Life Sci, 1999. 55(1): p. 96-107]. 레이트 일행[레이트(Leite, K.R.) 등, Abnormal expression of MDM2 in prostate carcinoma. Mod Pathol, 2001. 14(5): p. 428-36]은 MDM2가 전립선 선암종 경우의 41%에서 과발현되었음을 보여주었다. p53 및 MDM2 둘 다에 대해 양성인 종양은 더욱 컸고 더욱 진행된 단계였다. 결과는, MDM2-양성/p53-양성 표현형이 공격적인 양상을 나타내는 전립선 암을 확인함을 암시한다.
N-카드헤린
E-카드헤린과 유사하게, 이는 세포 부착 분자이다. 세포-세포 상호작용의 변화는 암 진행 과정에서 중요하다. 마찬가지로, 세포 부착 분자 E-카드헤린의 발현 손실은 전립선암을 비롯한 다수의 암종의 등급, 단계 및 예후와 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다. E-카드헤린-매개되는 상호작용이 손상되면 침습성 표현형이 생성된다. 그러나, 세포-세포 접촉 및 통신의 단순한 상실만이 E-카드헤린-매개되는 접촉의 상실과 나쁜 임상 결과 사이의 관찰된 상호관계의 근거가 되는 것은 아니다[구니야스(Kuniyasu, H) 등, Relative expression of type IV collagenase, E-cadherin, and vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in prostatectomy specimens distinguishes organ-confined from pathologically advanced prostate cancers. Clin Cancer Res, 2000. 6(6): p. 2295-308; 브라덴(Bryden, A.A.) 등, E-cadherin and beta-catenin are down-regulated in prostatic bone metastases. BJU Int, 2002. 89(4): p. 400-3; 움바스(Umbas, R.) 등, Decreased E-cadherin expression is associated with poor prognosis in patients with prostate cancer. Cancer Res, 1994. 54(14): p. 3929-33]. 부스메이커즈 일행[부스메이커즈(Bussemakers, M.J.) 등, Complex cadherin expression in human prostate cancer cells. Int J Cancer, 2000. 85(3): p. 446-50]은 N-카드헤린이 인간 전립선 암세포주에서 상향 조절됨을 입증하였다. 다른 연구에서는, N-카드헤린이 정상적인 전립선 조직에서는 발현되지 않았으나 전립선 암의 경우에는 N-카드헤린이 불량하게 분화된 구역(이는 주로 이상 E-카드헤린 염색 또는 음성 E-카드헤린 염색을 나타내었음)에서 발현된 것으로 나타났음을 입증하였다[도미타(Tomita, K.) 등, Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer Res, 2000. 60(13): p. 3650-4].
P504S
알파-메틸아실-코A 라세마제(P504S)는 세포질 단백질이다. 이는 전립선 암종으로부터의 고처리량 마이크로어레이 선별과 함께 cDNA 라이브러리 공제에 의해 최근 확인되었다. 지앙 일행[지앙(Jiang, Z.) 등, P504S: a new molecular marker for the detection of prostate carcinoma. Am J Surg Pathol, 2001. 25(11): p. 1397-404]은 양성 및 암성 전립선 조직 상에서 면역세포화학법에 의해 P504S를 조사하였다. P504S는 글리슨 등급 및 확산에 관계없이 전립선 암종의 100%에서 강한 세포질 과립상 염색을 나타내었다. 대조적으로, 양성 전립선의 경우 67개중 56개(84%) 및 암에 인접한 양성 샘의 경우 127개중 115개(91%)를 포함하여 양성 전립선의 경우 194개중 171개(88%)가 P504S에 대해 음성이었다. 다른 연구에서는, P504S가 전립선 선암종과 전립선의 비정형 선종형 과다형성을 구별해내는 매우 유용한 마커라고 밝혔다[양(Yang, X.J.) 등, Expression of alpha-Methylacyl-CoA racemase (P504S) in atypical adenomatous hyperplasia of the prostate. Am J Surg Pathol, 2002. 26(7): p. 921-5].
p53
이는 종양 억제 유전자이다. p53의 불활성화는 모든 인간의 암중 절반을 넘는 경우의 종양 발생에 연루되어 있다. 이는 방추 검사점, 중심체 항상성 및 G2-M 상 전이의 조절에 일익을 담당하는 동시에, DNA 손상에 응답하는 세포의 G1 상 성장 정지에 관련된 전사 조절제로서의 기능을 한다. 이는 또한 다수의 세포 유형에서 전사-의존 및 독립 메카니즘에 의해 세포자멸사를 유도하고 종양 혈관형성을 조절한다[키르쉬(Kirsch, D.G.) 및 카스탄(M.B. Kastan), Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and prognosis. J Clin Oncol, 1998. 16(9): p. 3158-68; 아가왈(Agarwal, M.L.) 등, The p53 network. J Biol Chem, 1998. 273(1): p. 1-4; 리버만(Liebermann, D.A.), 호프만(B. Hoffman) 및 스타인만(R.A. Steinman), Molecular controls of growth arrest and apoptosis: p53-dependent and independent pathways. Oncogene, 1995. 11(1): p. 199-210]. 톰슨 일행[톰슨(Thompson, S.J.) 등, P53 and Ki-68 immunoreactivity in human prostate cancer and benign hyperplasia. Br J Urol, 1992. 69(6): p. 609-13]은 p53을 갖는 전립선 암 시편이 염색되는 반면 양성 전립선 과다형성(BPH)에서는 염색이 관찰되지 않음을 밝혔다. 다른 연구에서는, p53의 핵 축적이 전립선 암에 대한 중요한 예측 지시자임을 보여주었다[퀸(Quinn, D.I.) 등, Prognostic significance of p53 nuclear accumulation in localized prostate cancer treated with radical prostatectomy. Cancer Res, 2000. 60(6): p. 1585-94].
전립선 산 포스파타제(PAP)
전립선 특이적 항원(PSA)인 전립선 산 포스파타제(PAP)는 원발성 또는 전이성 전립선 암종의 신뢰성있는 진단 가능성을 크게 높였다. 한 연구에서는, PAP의 진단 감도가 90 내지 100%이고, 그의 특이성이 87 내지 100%이며, PAP가 진행된 전립선 암종의 유용한 예측 지시자임을 보여주었다[스반홀름(Svanholm, H.) 및 홀더(M. Horder), Clinical application of prostatic markers. I. Classification of prostatic tumours using immunohistochemical techniques. Scand J Urol Nephrol Suppl, 1988. 107: p. 65-70; 사카이(Sakai, H.) 등, Prostate specific antigen and prostatic acid phosphatase immunoreactivity as prognostic indicators of advanced prostatic carcinoma. J Urol, 1993. 149(5): p. 1020-3].
전립선 인히빈 펩타이드(PIP)
전립선 인히빈 펩타이드(PIP)는 전립선에 의해 합성되는 폴리펩타이드이다. 이는 전립선 성장 및 분화에 관련되어 있다. PIP 유전자는 다수의 깨지기 쉬운 부위를 함유하는 7q34 영역에 편재되어 있다. 전립선 암종에서는 PIP 유전자의 재배열이 발견되었다[오티어로(Autiero, M.) 등, Abnormal restriction pattern of PIP gene associated with human primary prostate cancers. DNA Cell Biol, 1999. 18(6): p. 481-7]. 가드 일행[가드(Garde, S.V.) 등, Prostate inhibin peptide (PIP) in prostate cancer: a comparative immunohistochemical study with prostate-specific antigen (PSA) and prostatic acid phosphatase (PAP). Cancer Lett, 1994. 78(1-3): p. 11-7]은 PIP가 전립선 암종 진단시 PSA 및 PAP만큼 민감하고 특이적인 면역조직화학적 마커임을 보여주었다. 또한, PIP의 안드로겐에 의존하지 않는 특성으로 인해 안드로겐 융해제에 노출된 종양에서 PSA/PAP보다 유리할 수 있다.
전립선 특이적 항원(PSA)
전립선 특이적 항원(PSA)은 전립선 상피의 생성물로서, 통상 정액에 분비된다. 이는 사정후 형성되는 정액 응고물을 절단 및 액화시키는 기능을 하는 세린 프로테아제이다. PSA는 기관 특이적이지만 암 특이적이지는 않다. 따라서, PSA 수준은 암뿐만 아니라 비-종양 상태(예: 전립선의 결절 과다형성 및 전립선염)에서도 높아진다. PSA 자체만으로는 초기 암의 검출에 사용될 수 없다. 그러나, 직장 검사 및 경직장 초음파 촬영술과 조합되는 경우에는, PSA 수준 측정이 초기 단계 암의 검출에 유용한 것으로 생각된다[크로포드(Crawford, J.M.) 및 코트란(R.S. Cotran), The Male Genital Tract, in Robbins Pathologic Basis of Disease, 코트란, 쿠만 및 콜린즈 편집. 1999, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p. 1011-1034]. 더 많은 증거에 의해, 유리 혈청 PSA가 전립선 암종 진단시 전PSA보다 더 정확한 것으로 생각된다[카탈로나(Catalona, W.J.) 등, Use of the percentage of free prostate-specific antigen to enhance differentiation of prostate cancer from benign prostatic disease: a prospective multicenter clinical trial. Jama, 1998. 279(19): p. 1542-7]. 전립선 암종 진단을 위한 PSA의 면역 조직화학 연구 또한 매우 민감하고 특이적이다. 스반홀름 일행[스반홀름 및 호더, Clinical application of prostatic markers. I. Classification of prostatic tumours using immunohistochemical techniques. Scand J Urol Nephrol Suppl, 1998. 107: p. 65-70]은 전립선 암종 진단시 PSA의 감도가 94 내지 100%이고 그의 특이성이 100%임을 입증하였다.
V. 유방암
유방암 선별 수단으로서의 비침습성 유방조영술은 효과적이지 못하다[고췌(Gotzsche, P.C.) 및 올슨(O. Olsen), Is screening for breast cancer with mammography justifiablel Lancet, 2000. 355(9198): p. 129-34]. 따라서, 유방암을 선별하기 위한 다른 기법이 연구되어 왔다. 다양한 유방암 마커가 발견되어 의사들이 시기 적절하게 정확히 진단하는데 도움을 주고 환자를 매우 더 잘 치료할 수 있게 되었다. 불행하게도, 이들 종양 마커중에는 고감도 및 높은 특이성을 둘 다 갖는 "해결책"은 없다. 따라서, 진단 정확도를 향상시키는 다른 방법이 필요하다.
진단 정확도를 향상시키는 다른 방법은 각각 유방암에 수반되는 마커와 특이적으로 결합되는 다수의 프로브를 포함하는 패널을 개발하는 것이다. ICC 및/또는 IHC 기법으로 모든 후보 프로브를 시험할 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 미세 침 흡인(FNA)으로부터 시편을 수득할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 미세 침 생검(FNB)으로부터 시편을 수득할 수 있다. 초음파 및 다른 영상 유도 기법에 의해 FNA 및 FNB 절차에 의한 적절한 위치 결정 및 종양 샘플 채취를 도울 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 유관(breast duct) 세척에 의해 시험 세포를 수득한다. 이를 위한 장치는 용이하게 구입할 수 있고, 수동 착유기와 유사한 흡인기를 통해 세포를 수집함으로써 작동될 수 있다. 작은 흡입 컵을 사용하여 유두를 통해 흡출된 액(NAF)을 빨아낸다. NAF의 존재는 유두 표면상의 자연적인 유관 구멍의 위치를 알아내는데 도움이 된다. 이어, 유관을 뒤덮은 세포를 수집하기 위하여 세척되어야 하는 유관내로 작은 가요성 미소 카테터를 약 1/2인치 삽입한다.
시편을 수집한 후에는, 시편을 처리 및 분석한다. 통계학적 분석을 이용하여 폐암에 대해 상기 기재된 바와 같이 패널을 디자인한다. 처리하는 동안, 몇몇 실시태양에서는 세차게 세척하는 동안 슬라이드에 부착되지 않는 세포 표본 또는 펠렛 같은 기술적 문제가 발생할 수 있다. 그러나, 이러한 문제는 소프트웨어를 조작하거나 염색 절차를 바꾸어 이러한 문제를 경감시키는 것으로 쉽게 해결할 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 시편을 자동 채취하고 진단용 슬라이드를 제조하는 장치를 사용하여, 시편을 처리 및 분석한다. 처음에는 광범위한 프로브가 이용될 것으로 생각된다. 높은 감도 수준 및 특이성 수준을 유지하기 위하여 프로브의 수를 적절한 크기의 패널로 정리한다. 양성으로 염색된 종양 세포의 백분율의 미리 규정된 문턱치에 기초하여 최종 프로브를 선택한다. 복잡한 통계적 분석을 이용하여 이러한 결정을 내린다. 종양을 검출하기 위한 패널-분석 방법을 고형 종양에 적용할 수 있고, 몇몇 동일한 종양 마커가 상이한 패널에 존재하기 때문에, 이 방법을 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 방식으로, 분석 개발 과정을 촉진시킬 수 있다.
프로브/마커의 라이브러리
암 마커에 대한 정보를 함유하는 다양한 출처를 검토하였다. 유방암의 20% 이상에서 양성이라는 임의적인 기준을 사용하여 유방암의 검출 및/또는 진단에 바람직한 패널용 프로브를 선택하였다. "20% 이상 양성"이라는 용어는 100가지 종양 경우를 연구할 때 이들 경우중 20개 이상이 개별 마커의 존재를 나타내는 반면 나머지 80개 이하의 경우가 개별 마커의 존재를 나타내지 않음을 의미한다. 바람직한 패널은 AE1/AE3, BCA-225, Bcl-2, BRCA-1, 암 항원 15.3(CA 15.3), 카텝신 D, 암 배아 항원(CEA), C-erb-B2, E-카드헤린, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 에스트로겐 수용체(ER), 대낭 질병 액 단백질 15(GCDFP-15), HOX-B3, Ki-67, MUC-1, p53, p65, 프로게스테론 수용체(PR), 망막모세포종(Rb) 및 트랜스글루타미나제 K(TGK)로부터 선택되는 분자 마커를 포함할 수 있다. 본 예에 사용되는 프로브/마커의 라이브러리가 아래에 간략히 기재되어 있다.
AE1/AE3
이는 항-케라틴 항체의 칵테일이다. 케라틴은 유관 상피 같은 상피 세포의 중간 필라멘트를 형성하는 비수용성 단백질 군이다. 항-케라틴 AE1은 산성 아군의 56 및 40kD 케라틴을 인지한다. 항-케라틴 AE3은 염기성 아군을 인지한다. AE1 및 AE3은 유관 암종으로부터의 림프절 전이를 확인함에 있어서 다른 항-사이토케라틴보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다[엘슨(Elson, C.E.), 쿠페(D. Kufe), 및 존스턴(W.W. Johnston), Immunohistochemical detection and significance of axillary lymph node micrometastases in breast carcinoma. A study of 97 cases. Anal Quant Cytol Histol, 1993. 15(3): p. 171-8]. 코월릭(Kowolik) 일행[코월릭(Kowolik, J.H.) 등, Detection of micrometastases in sentinel lymph nodes of the breast applying monoclonal antibodies AE1/AE3 to pancytokeratins. Oncol Rep, 2000. 7(4): p. 745-9]은 유방암 전이를 갖는 겨드랑 림프절의 33개 경우중 32개가 AE1/AE3 면역 조직화학적 염색에 의해 올바르게 예측되었음을 보여주었다. AE1/AE3은 또한 침윤성 소엽상 유방 암종의 결절에서 잠재 전이를 검출하는데 가장 민감한 마커임이 밝혀졌다[카인즈(Kainz, C.) 등, Infiltrating lobular breast carcinoma: detection of occult regional lymph node metastasis by immunohistochemistry. Anticancer Res, 1993. 13(1): p. 73-4].
BCA-225
이 항체는 다른 유방 암종 항원과는 크기 및 분포 면에서 상이한 당단백 BCA-225에 관련된 인간의 유방 암종을 인식한다. 그러나, 유방 암종 항원에 대한 다른 암종 항체와는 달리, BCA-225는 양성 또는 악성 위장 조직과 반응하지 않는다. 한 연구에서는 유방 암종의 94%가 BCA-225에 양성임을 보여주었으나[메사-테자다(Mesa-Tejada, R.) 등, Immunocytochemical distribution of a breast carcinoma associated glycoprotein identified by monoclonal antibodies. Am J Pathol, 1988. 130(2): p. 305-14], 다른 연구에서는 면역세포화학법에 의해 유방 암종을 함유하는 삼출액의 78%가 BCA-225에 대해 양성이고, 모든 양성 삼출액이 BCA-225에 대해 음성이었음을 밝혔다. BDA-225는 매우 특이적인 식별자로서, 선 암종 및 반응성 중피 세포의 감별 진단에 매우 유용하다[로이(Loy, T.S.), 디아즈-아리아스(A.A. Diaz-Arias) 및 빅클(J.T. Bickel), Value of BCA-225 in the cytologic diagnosis of malignant effusions: an immunocytochemical study of 197 cases. Mod Pathol, 1990. 3(3): p. 294-7].
Bcl-2
외부 인자 또는 자극 및 세포내 분자에 의해 제공되는 세포 사멸 억제 신호와 세포 사멸 촉진 신호 사이의 균형에 의해 세포의 생존율 문턱치를 결정한다. Bcl-2는 이러한 결정에 중심적인 열할을 하고, 그의 생성물은 항-세포자멸사 분자로서 작용한다[다이돈(Daidone, M.G.) 등, Clinical studies of Bcl-2 and treatment benefit in breast cancer patients. Endocr Relat Cancer, 1999. 6(1): p. 61-8]. Bcl-2 단백질은 c-myc, ras 또는 바이러스 유전자와 협력하여 세포를 변환 및 불멸화시킬 수 있기 때문에 종앙 발생에 기여하는 것으로 밝혀졌다[델 버팔로(Del Bufalo, D.) 등, Bcl-2 overexpression enhances the metastatic potential of a human breast cancer line. Faseb J, 1997. 11(12): p. 947-53]. Bcl-2 발현은 가장 통상적으로는 대부분의 소포성 림프종에서 t(14; 18) 전위에 관련된다. 더욱 최근에는, 비-혈액암에서 Bcl-2가 확인되었다. 알사베 일행은 Bcl-2가 원발성 폐암 및 위암으로부터 전이되는 유방암을 식별하는데 유용한 마커일 뿐만 아니라 유용한 예측 지시자인 것으로 결정하였다[알사베(Alsabeh, R.) 등, Expression of bcl-2 by breast cancer: a possible diagnostic application. Mod Pathol, 1996. 9(4): p. 439-44].
BRCA-1
이는 염색체 17의 긴 분지상에 위치하는 종양 억제 유전자이다. 종양 억제 유전자는 세포 성장을 조절하는데 결정적인 역할을 한다. BRCA-1은 핵 인단백으로서, 통상 세포 주기의 부정적인 조절자로서의 기능을 나타내고 신생물 진행의 활성 억제제일 수 있다. 가족 유방암의 80%에서 BRCA1 유전자의 변이가 발견되었다. 유방암주 및 유방암 조직의 산발적인 경우에서 감소된 mRNA 수준 또는 BRCA1의 이상 세포하 위치가 확인되었다. BRCA1은 난소암에도 관련되어 있다[리(Lee, W.Y.) 등, Immunolocalization of BRCA1 protein in normal breast tissue and sporadic invasive ductal carcinomas: a correlation with other biological parameters. Histopathology, 1999. 34(2): p. 106-12]. 자비스 일행[자비스(Jarvis, E.M.), 커크(J.A. Kirk) 및 클라크(C.L. Clarke), Loss of nuclear BRCA1 expression in breast cancer is associated with a highly proliferative tumor phenotype. Cancer Genet Cytogenet, 1998. 101(2): p. 109-15]은 BRCA-1의 핵 염색이 대부분의 산발적인 종양에서 관찰되었지만, 가족 유방암 및 조기 발생 유방암의 대부분에는 핵 BRCA-1이 감소되었거나 존재하지 않음을 발견하였다. 핵 BRCA-1과 증식 마커 Ki-67의 발현 사이에서 상당한 역의 관계가 발견되었다. 다른 연구에서는, BRCA-1 발현이 p53, c-erb-B2, Bcl-2, ER, 조직학적 등급, 종양 크기, 겨드랑 림프절 상태 및 연령을 비롯한 다른 예측 마커와 상호 관련되어 있음을 밝혔다[리 등, Immunolocalization of BRCA1 protein in normal breast tissue and sporadic invasive ductal carcinomas: a correlation with other biological parameters. Histopathology, 1999. 34(2): p. 106-12].
암 항원 15.3(CA-15.3)
암 항원 15.3은 혈청 탄수화물 항원이다. CA-15.3의 혈청 농도 증가는 유방 암종뿐만 아니라 통상적인 유방 질환 및 양성 유방 질환에 관련되어 있다. 그러나, CA-15.3의 수준은 통상적인 유방 질환 또는 양성 유방 질환보다 유방 암종에서 상당히 더 높다[바락(Barak, M.) 등, CA-15.3, TPA and MCA as markers for breast cancer. Eur J Cancer, 1990. 26(5): p. 577-80]. 마토니 일행[마토니(Martoni, A.) 등, CEA, MCA, CA 15.3 and CA 549 and their combinations in expressing and monitoring metastatic breast cancer: a prospective comparative study. Eur J Cancer, 1995. 31A(10): p. 1615-21]은 CA 15.3이 전이성 유방암을 검출하는데 있어서 다른 암 마커보다 더 높은 감도를 갖는다고 보고하였다.
카텝신 D
이는 가용성 리소솜 아스파트산 프로테이나제이다. 이는 프리프로카텝신 D로서 세포질 세망에서 합성된다. 만노즈-6-포스페이트 택을 갖기 때문에, 프로카텝신 D는 만노즈-6-포스페이트 수용체에 의해 인지된다. 산성 리소솜에 들어갈 때, 단일 쇄 프로카텝신 D(52kD)가 카텝신 D로 활성화된다. 카텝신 D의 근본적인 역할은 세포내 단백질 및 내화 단백질의 열화이다. 최초로, 80대 중반의 몇 명의 인간 신생물 조직에서 카텝신 D의 증가된 수준(mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서의 증가)이 보고되었다. 이들 발견에 따라 신생 과정에서의 카텝신 D의 가능한 역할에 대해 광범위한 연구가 이루어졌다. 카텝신 D 농도의 강력한 예측 가치가 유방암 및 다수의 다른 종양 유형에서 발견되었다[벳빅카(Vetvicka, V.) 등, Analysis of the interaction of procathepsin D activation peptide with breast cancer cells. Int J Cancer, 1997. 73(3): p. 403-9; 벳빅카, 벳빅코바(J. Vetvickova) 및 푸젝(M. Fusek), EFfect of procathepsin D and its activation peptide on prostate cancer cells. Cancer Lett, 1998. 129(1): p. 55-9]. 뉴 일행[뉴(Niu, Y.) 등, Potential markers predicting distant metastasis in axillary node-negative breast carcinoma. Int J Cancer, 2002. 98(5): p. 754-60]은 캅테신 D가 겨드랑 결절-음성 유방암 환자에서 원위 전이를 예측하는 강력한 마커임을 발견하였다.
암 배아 항원(CEA)
암 배아 항원(CEA)은 결장직장암의 진단 및 추적검사에서의 그의 역할이 널리 공지되어 있다. 유방암의 CEA 양성 또한 보고되었다. 알렉셰브[알렉셰브(Alexiev, B.A.) 등, Immunocytochemical detection of carcinoembryonic antigen in fine-needle aspirates from patients with diverse breast diseases. Diagn Cytopathol, 1993. 9(4): p. 377-82] 일행은 원발성 유방암의 90%가 CEA에 대해 양성 세포질 염색을 나타낸 반면 양성 유방암은 미세 침 흡출물 및 파라핀-매립 조직 절편에서 양성이 아닌 것으로 보고하였다. 다른 연구에서는, CEA가 25% 내지 64%의 섬유선종 및 낭 변화 질병에서 양성이었음을 보고하였다[위트킨드(Wittekind, C.), 본 클라이스트(S. Von Kleist) 및 샌드리터(W. Sandritter), CEA positivity in tissue and sera of patients with benign breast lesions. Oncodev Biol Med, 1981. 2(6): p. 381-90].
C-erb-B2
이는 종양 유전자이고, 그의 생성물은 종양 단백질로 알려져 있다. Her2/neu로도 알려져 있는 C-erb-B2는 c-erb-B1, c-erb-B2 및 c-erb-B3를 포함하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 부류에 속한다. c-erb-B2의 과발현은 유방, 난소, 폐, 전립선, 위장 및 침샘 내에서 발병되는 높은 비율의 인간 암종과 관련되어 있다. c-erb-B2 같은 성장 인자를 과발현시키는 종양은 소량의 성장 인자의 성장-촉진 효과에 대해 매우 민감하고 따라서 더욱 공격적인 것으로 생각된다. 이 가설은 유방암 세포에서의 c-erb-B2 단백질의 높은 수준이 나쁜 예후의 전조라는 관찰에 의해 뒷받침된다[미첼(Mitchell, R.N.) 및 코트란(R.S. Cotran), Neoplasia, in Robbins Pathologic Basis of Disease, 코트란, 쿠마 및 콜린즈 편집. 1999, W. B. Sauders Company; Philadelphia, p. 260-327]. 이나지 일행[이나지(Inaji, H.) 등, ErbB-2 protein levels in nipple discharge: role in diagnosis of early breast cancer. Tumor Biol, 1993. 14(5): p. 271-8]은 유두 배출물중 c-erb-B2 종양 단백질의 수준이 유방암 환자에서는 상승됨을 발견하였다. 한 연구에서는, 유방암의 미세 침 흡출물의 34% 및 모든 상응하는 조직 절편이 c-erb-B2 종양 단백질에 대해 양성임을 밝혔다[조르다(Jorda, M.), 간제이(P. Ganjei) 및 나지(M. Nadji), Retrospective c-erbB-2 immunostaining in aspiration cytology of breast cancer. Diagn Cytopathol, 1994. 11(3): p. 262-5].
E-카드헤린
이 단백질은 유선에서 주요 세포 부착 분자인 것으로 생각된다. 세포질에서, E-카드헤린은 세포 골격의 결합을 매개하는 알파- 및 베타-카테닌에 연결되어 있다. 또한, c-erbB-2 종양 단백질은 베타-카테닌 포스포릴화를 통해 세포 부착 시스템을 붕괴시킨다[나개(Nagae, Y.) 등, Expression of E-cadherin catenin and C-erbB-2 gene products in invasive ductal-type breast carcinomas. J Nippon Med Sch, 2002. 69(2): p. 165-71]. 유방암에서는 E-카드헤린의 발현 감소가 발견된다[미첼 및 코트란, Neoplasia, in Robbins Pathologic Basis of Disease, 코트란, 쿠마 및 콜린즈 편집, W. B. Sauders Company: Philadelphia. p. 260-327].
상피 성장 인자 수용체(EGFR)
상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 막통과 당단백이다. 이는 세포 성장 및 분화에 중요한 역할을 한다. EGFR 발현은 넓은 정상 조직 스펙트럼에서 발견되는 반면, 과발현은 다양한 신생물과 관련되어 있다. 수 일행[수(Sue, Z.) 등, Type 1 protein tyrosine kinases in benign and malignant breast lesions. Histopathology, 1998. 33(6): p. 514-21]은 유방암 조직에서 4가지 EGFR 군의 발현 패턴을 조사한 결과, 유방암 조직의 53%가 EGFR에 강한 양성임을 발견하였다(양성 종양도 EGFR 단백질을 발현하기는 하지만 기껏해야 더 낮은 보통 수준이었음). EGFR 발현과 종양 등급 증가 사이의 관련이 침습성 관암종 군에서 발견되었다.
에스트로겐 수용체(ER)
에스트로겐은 다양한 생리학적 과정 및 질병-관련 과정, 가장 현저하게는 생식, 뼈 재형성 및 유방암을 제어하고, 이들의 효과는 에스트로겐 수용체(ER)로 일컬어지는 전통적인 수용체를 통해 도입된다. 이 단클론 항체는 에스트로겐 수용체의 67kD 폴리펩타이드 쇄의 N-말단 도메인(A/B 영역)과 반응하고, 세포질 반응성은 거의 또는 전혀 없이 핵 염색 패턴을 나타낸다. 종양 조직에서, ER은 유방암 및 다른 에스트로겐-의존 조직으로부터 유도되는 인간의 신생물의 상피 세포와 강하게 반응한다. 일반적으로, 핵에서 ER을 발현하는 세포를 갖는 암은, 이들 양성 신생 세포가 더욱 우수하게 분화되고 호르몬 조작에 대해 응답할 수 있기 때문에, 더욱 우수한 예후를 갖는다. 약물인 타목시펜이 이러한 목적으로 종종 사용된다[반즈(Barnes, D.M.) 등, Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of different methods of assessment of staining and correlation with clinical outcome of breast cancer patients. Br J Cancer, 1996. 74(9): p. 1445-51; 피쳔(Pichon, M.F.) 등, Prognostic value of steroid receptors after long-term follow-up of 2257 operable breast cancers. Br J Cancer, 1996. 73(12): p. 1545-51].
대낭 질병 액 단백질 15(GCDFP-15)
대낭 질병 액 단백질 15(GCDFP-15)는 아포크린 땀샘, 샘분비샘, 작은 침샘, 기관지 샘 및 유방의 변형 상피에 의해 발현되는 당단백(15kD)이다. 아포크린 특징을 갖는 유방암(원발성 병소 및 전이성 병소)은 GCDFP-15 항원을 발현한다. GCDFP-15는 유방외 파제트(Paget's) 병에서 양성인 반면, 다른 종양은 음성인 것으로 시험되었다. 다수의 조직병리학적 연구에서, GCFDP-15는 수술 시편에서 유방암에 대한 특이적인 마커인 것으로 밝혀졌다. 피엘 일행[피엘(Fiel, M.I.) 등, Value of GCDFP-15 (BRST-2) as a specific immunocytochemical marker for breast carcinoma in cytologic specimens. Acta Cytol, 1996. 40(4): p. 637-41]은 또한 GCFDP-15가 세포학 시편에서 유방암에 대한 특이적인 면역세포화학적 마커임을 입증하였다.
HOX-B3
호메오박스(HOX) 유전자는 61개 아미노산 DNA-결합 호메오도메인을 함유하는 단백질을 코딩하고, 통상적인 종양 발생 및 조직 발생시 다른 유전자의 전사 조절에 관련되어 있다. 부류 I HOX 유전자는 인간에서 상이한 염색체상에 4개의 덩어리로 구성되어 있으며, 이들 각각의 덩어리 내에서 유전자의 순서는 고도로 유지된다. 광범위한 신생 형질전환 세포에서 HOX 유전자 생성물의 재발현이 보고되었고, 이는 HOX 유전자가 정상적인 발달 및 암형성뿐만 아니라 종양 진행에 관련된 종양 성 태아성(oncofetal) 항원의 다른 부류를 나타낼 가능성이 높은 것으로 보인다. HOX-3은 HOX 유전자 생성물(HOX-B3, -B4 및 -C6)중 하나이다. 한 연구에서는, 유방암의 90% 이상이 HOX-B3에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다[보디(Bodey, B.) 등, Immunocytochemical detection of the homeobox B3, B4, and C6 gene products in breast carcinomas. Anticancer Res, 2000. 20(5A): p. 3281-6].
Ki-67
이는 정상 세포 및 신생 세포를 증식시킬 때 발현되는 핵 단백질이다. 후기 G1, S, M 및 G2로 지칭되는 세포 주기의 기간동안 Ki-67 발현이 일어난다. 그러나, G0 기간동안, 항원은 검출될 수 없다. 연구 결과, Ki-67의 발현이 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체와 역으로 관련되어 있어, 높은 Ki-67 수준이 더욱 공격적인 표현형 및 나쁜 예후를 특징적으로 나타냄을 암시하는 것으로 밝혀졌다[세카렐리(Ceccarelli, C.) 등, Quantitative P21 (waf-1)/p53 immunohistochemical analysis defines groups of primary invasive breast carcinomas with different prognostic indicators. Int J Cancer, 2001. 95(2): p. 128-34; 세카렐리 등, Retinoblastoma (RB1) gene product expression in breast carcinoma. Correlation with Ki-67 growth fraction and biopathological profile. J Clin Pathol, 1998. 51(11): p. 818-24].
MUC-1
상피 뮤신은 상피 세포 및 이들의 암종에 의해 분비되는 당단백이다. 9개 이상의 뮤신 유전자가 확인되었으며, 이들의 생성물인 MUC1 내지 MUC9는 다양한 상피에서 발현된다. MUC1은 유방 상피 세포에서 발현되는 뮤신인 반면, MUC2 및 MUC3은 주로 위장관 뮤신이다. MUC-1 항원은 세포 표면 당단백이다. 이 항원은 인간 유방암의 90%에서 정상 조직에는 존재하지 않는 형태로 풍부하게 존재한다[디아즈(Diaz, L.K.), 와일리(E.L. Wiley) 및 모로우(M. Morrow), Expression of epithelial mucins Muc1, Muc2, and Muc3 in ductal carcinoma in situ of the breast. Brest J, 2001. 7(1): p. 40-5]. 한 연구[크로스(Croce, M.V.) 등, Expression of tumour associated antigens in normal, benign and malignant human mammary epithelial tissue: a comparative immunohistochemical study. Anticancer Res, 1997. 17(6D): p. 4287-92]에서는, 양성 유방 조직이 꼭대기 세포 표면 막 및 관내강 조직파편으로 제한된 MUC-1을 낮은 강도로 발현함을 보여주었다.
p53
이는 종양 억제 유전자이다. 다수의 종양 및 종양 세포주에서 높은 농도의 p53 단백질이 발생되나, 이는 정상 세포 및 조직에서는 아주 소량으로만 존재한다. p53 단백질의 변이에 의해 또는 다른 단백질과의 착체 형성에 의해 종양 세포에서의 발현이 증가될 수 있다. p53 유전자는 유방, 폐, 직장, 난소, 고환, 방광, 뇌 종양, 흑색종, 특정 유형의 백혈병 및 신경섬유육종의 대립유전자 손실이 빈번한 부위인 염색체 17p상에 위치한다. 핵 염색 패턴을 나타내는 면역-조직 화학법에 의해 p53 단백질의 종양 세포 발현을 검출할 수 있다. p53 종양 단백질의 발현은 유방암의 나쁜 예후와 관련되어 있는 것으로 보인다[리 등, Immunolocalization of BRCA1 protein in normal breast tissue and sporadic invasive ductal carcinomas: a correlation with other biological parameters. Histopathology, 1999. 34(2): p. 106-12; 미듈라(Midulla, C.) 등, Immunohistochemical expression of p53, nm23-HI, Ki67 and DNA ploidy: correlation with lymph node status and other clinical pathologic parameters in breast cancer. Anticancer Res, 1999. 19(5B): p. 4033-7].
p65
이 65kD 종양성 태아성 단백질은 아직 알려지지 않은 리간드를 갖는 유전자의 스테로이드/갑상선 상과의 새로운 일원으로서 확인되었다. 이 수용체가 종양의 발달에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 생각된다. p65의 변화된 형태는 유방암을 야기할 수 있는 특정 호르몬의 과생성에 연관되어 있다[하노섹(Hanausek, M.) 등, The oncofetal protein p65: a new member of the steroid/thyroid receptor superfamily. Cancer Detect Prev, 1996. 20(2): p. 94-102]. 미로우스키 일행[미로우스키(Mirowski, M.) 등, Serological and immunohistochemical detection of a 65-kDa oncofetal protein in breast cancer. Eur J Cancer, 1994. 30A(8): p. 1108-13]은 p65가 면역조직화학법에 의해 평가될 때 유방암 환자로부터의 혈청의 90%에서 양성이고 상응하는 생검 조직의 80%에서 양성임을 밝혔다. 이 결과는, p65가 유방암에 대한 강력한 혈청 및/또는 면역조직화학적 마커일 수 있음을 나타낸다.
프로게스테론 수용체(PR)
프로게스테론 수용체(PR)에 대한 단클론 항체는 핵 염색 패턴을 나타낸다. 종양 조직에서, PR 발현은 유방암의 상피 세포 및 다른 프로게스테론-의존성 조직으로부터 유도된 인간의 신생물에서 강력한 반면, 정상 조직에서는 유선 및 자궁에서 양성이다. 유방암에서 PR 양성의 확인의 중요성은 잘 알려져 있지 않다. 일반적으로, ER 양성인 암은 또한 PR 양성이다. 그러나, PR 양성이지만 ER 양성이 아닌 암종은 더 나쁜 예후를 가질 수 있다[블랑코(Blanco, G.) 등 Estrogen and progesterone receptors in breast cancer: relationships to tumour histopathology and survival of patients. Anticancer Res, 1984. 4(6): p. 383-9]. 한 연구에서는, PR이 모든 피부 전이성 유방암에서 양성인 반면 한 종양만 ER에 대해 양성임을 발견하였다[월래스(Wallace, M.L.) 및 스몰러(B.R. Smoller), Differential sensitivity of estrogen/progesterone receptors and BRST-2 markers in metastatic ductal and lobular breast carcinoma to the skin. Am J Dermatopathol, 1996. 18(3): p. 241-7].
망막모세포종(Rb)
이는 종양 억제 유전자중 하나이다. 망막모세포종 단백질(pRb)은 망막모세포종 유전자에 의해 코팅되는 단백질로서, G0/G1에서 세포 주기를 조절하는 기능을 한다. Rb 기능을 상실하면 조절되지 않은 세포 성장이 이루어진다. 유방암을 비롯한 다양한 유형의 암에서 망막모세포종 유전자의 불활성화가 증명된다. 망막모세포종 유전자 저발현은 유방암 공격성 및 신속한 종양 세포 증식을 촉진시킨다[비체(Bieche, I.) 및 리더류(R. Lidereau), Loss of heterozygosity at 13q14 correlates with RB1 gene underexpression in human breast cancer. Mol Carcinog, 2000. 29(3): p. 151-8]. 세카렐리 일행[세카렐리 등, Retinoblastoma (RB1) gene product expression in breast carcinoma. Correlation with Ki-67 growth fraction and biopathological profile. J Clin Pathol, 1998. 51(11): p. 818-24]은 침습성 유방암에서의 pRb 발현 및 종양 마커 Ki-67, ER/PR, p53 및 EGFR을 연구하였으며, pRb 발현이 대부분의 시험된 유방암에서 증식 활성에 필적하여, 이들 경우에 이 단백질이 통상 세포 주기를 조절하는데 작용함을 암시한다는 것을 발견하였다. 반대로, pRb 면역 염색의 상실의 경우, 특이적인 고도로 공격적인 인자(예: EGFR 및 p53 발현, 에스트로겐 수용체/프로게스테론 수용체 음성 상태 및 높은 K67)의 조합된 발현은 더욱 공격적인 표현형을 특징적으로 나타내는 것으로 보인다.
트랜스글루타미나제 K(TGK)
트랜스글루타미나제 K는 유방암 진단에 대해 잘 연구되어 있지 않다. 그러나, 프리드리히 일행[프리드리히(Friedrich, M.) 등, Correlation between immunoreactivity for transglutaminase K and for markers of proliferation and differentiation in normal breast tissue and breast carcinomas. Eur J Gynaecol Oncol, 1998. 19(5): p. 444-8]은 30가지 유방 암종중 17개에서 약하거나 강한 막 염색이 검출된 반면, 정상적인 유방 조직의 90%는 TGK에 대해 면역 반응성을 나타내지 않음을 보여주었다. 이 결과는 유방 암종에서의 TGK의 상향 조절이 세포-기질 상호작용을 조절함으로써 또는 기질의 회합과 조직 재형성을 촉진시킴으로써 종양 세포 침습성을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 암시한다.
VI. 자궁경부암
다양한 자궁경부암 마커가 발견되어 의사가 시기 적절하게 정확히 검진하는데 도움을 주고 환자를 더욱 잘 치료할 수 있게 하였다. 불행하게도, 이들 종양 마커중에는 고감도 및 높은 특이성을 둘 다 갖는 "해결책"은 없다. 따라서, 진단 정확도를 향상시키는 다른 방법이 필요하다.
진단 정확도를 향상시키는 다른 방법은 각각 자궁경부암에 수반되는 마커와 특이적으로 결합되는 다수의 프로브를 포함하는 패널을 개발하는 것이다. ICC 및/또는 IHC 기법으로 모든 후보 프로브를 시험할 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, Pap 바르기를 이용하여 시편을 수득할 수 있다. 통상적인 Pap 바르기에서는 주걱 및 솔을 사용하여 자궁경부 세포를 수집한다. 액체 제제(LBP) Pap 시험을 위해, 비, 솔 또는 풍선을 사용하여 세포를 수집할 수 있다. 예를 들어, 사이틱(Cytyc)의 ThinPrep(등록상표) 제품 및 트리패쓰(TriPath)의 SurePrep(상표명) 제품을 사용할 수 있다. 또한, 자궁경부 세포를 수집하는데 몰레큘라 다이아그노스틱스(Molecular Diagnostics)의 "e2 Collector(상표명)"를 이용할 수 있다. 이는 자궁경부의 거울상 같은 형상을 갖는 실리콘 풍선이다. 이를 자궁경부를 향해 팽창시키면, 세포가 풍선의 표면에 접착하게 되고, 하나의 단계로 내자궁경부 세포 및 외자궁경부 세포를 수집하게 된다.
시편을 수집한 후에는, 시편을 처리 및 분석한다. 통계학적 분석을 이용하여 폐암에 대해 상기 기재된 바와 같이 패널을 디자인한다. 처리하는 동안, 몇몇 실시태양에서는 세차게 세척하는 동안 슬라이드에 부착되지 않는 세포 표본 또는 펠렛 같은 기술적 문제가 발생할 수 있다. 그러나, 이러한 문제는 소프트웨어를 조작하거나 염색 절차를 바꾸어 이러한 문제를 경감시키는 것으로 쉽게 해결할 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 시편을 자동 채취하고 진단용 슬라이드를 제조하는 장치를 사용하여, 시편을 처리 및 분석한다. 처음에는 광범위한 프로브가 이용될 것으로 생각된다. 높은 감도 수준 및 특이성 수준을 유지하기 위하여 프로브의 수를 적절한 크기의 패널로 정리한다. 양성으로 염색된 종양 세포의 백분율의 미리 규정된 문턱치에 기초하여 최종 프로브를 선택한다. 복잡한 통계적 분석을 이용하여 이러한 결정을 내린다. 종양을 검출하기 위한 패널-분석 방법을 고형 종양에 적용할 수 있고, 몇몇 동일한 종양 마커가 상이한 패널에 존재하기 때문에, 이 방법을 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 방식으로, 분석 개발 과정을 촉진시킬 수 있다.
역학 연구에서는, 성적으로 전달되는 약제에 의해 자궁경부의 암종이 야기됨을 암시하고, 인간의 파필로마바이러스(HPV)가 가장 의심된다. 약 70개의 유전학적으로 먼 유형의 HPV를 확인하였다. 유형 16 및 18, 덜 통상적이긴 하지만 유형 31, 33, 35 및 51이 침습성 겨드랑 세포 암 및 그의 전구체(심각한 형성이상 및 원위치에서의 암종)의 약 85%에서 발견된다. 자궁경부암과 대조적으로, 악성일 가능성이 낮은 생식기 사마귀는 "위험이 적은" 유형 HPV-6 및 HPV-11에 관련되어 있다[미첼 및 코트란, Neoplasia, in Robbins Pathologic Basis of Disease, 코트란, 쿠마 및 콜린즈 편집. 1990, W. B. Saunders Company: Philadelphia. p. 260-327].
HPV 감염증의 분자 진단은 통상적인 Pap 바르기보다 더욱 민감하고 특이적이며, 확실하지 않은 Pap 바르기 결과가 나온 여성을 검사하는데 더욱 가치를 갖는다. 다이젠(Digene)의 하이브리드 캡쳐 II HPV DNA 시험(Hybrid Capture II HPV DNA test)은 높은 등급의 형성이상을 갖는 환자를 검출하는데 매우 효과적이다[솔로몬(Solomon, D.), 쉬프맨(M. Schiffman) 및 타론(R. Tarone), Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance: baseline results from a randomized trial. J Natl Cancer Inst, 2001. 93(4): p. 293-9]. 다른 HPV 방법은 몰레큘라 다이아그노스틱스에서 개발한 HPV 16 및 HPV 18의 E6 및 E7 단백질의 검출이다. HPV-16 및 HPV-18의 종양 발생 가능성은 이들 두 초기 바이러스 유전자 생성물에 관련되어 있다[휘브렉츠(Huibregtse, J.M.) 및 보데논(S.L. Beaudenon), Mechanism of HPV E6 proteins in cellular transformation. Semin Cancer Biol, 1996. 7(6): p. 317-26; 및 하우젠(zur Hausen, H.), Papillomavirus and p53. Nature, 1998. 393(6682): p. 217]. 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)는 최근 인스티튜트 파스퇴르(Institute Pasteru)로부터 HPV 시험 특허를 획득하였다.
프로브/마커의 라이브러리
암 마커에 대한 정보를 함유하는 다양한 출처를 검토하였다. 유방암의 20% 이상에서 양성이라는 임의적인 기준을 사용하여 유방암의 검출 및/또는 진단에 바람직한 패널용 프로브를 선택하였다. "20% 이상 양성"이라는 용어는 100가지 종양 경우를 연구할 때 이들 경우중 20개 이상이 개별 마커의 존재를 나타내는 반면 나머지 80개 이하의 경우가 개별 마커의 존재를 나타내지 않음을 의미한다. 바람직한 패널은 암 배아 항원(CEA), C-erb-B2, 사이클린 E, E6/E7, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Ki-67, p16, p53, 증식 세포 핵 항원(PCNA), 서바이빈, 텔로머라제 및 혈관 상피 성장 인자로부터 선택되는 분자 마커를 포함할 수 있다. 본 예에 사용되는 프로브/마커의 라이브러리가 아래에 간략히 기재되어 있다.
암 배아 항원(CEA)
이 암 배아 항원은 다수의 인간 종양에서 과발현되는 고도로 당화된 세포 표면 단백질로서, 결장직장암 환자의 질병 진행에 대한 종양 마커로서 사용되어 왔다. 이전의 보고에서는 자궁경부암 환자에서 높은 혈청 CEA 수준(그러나, 이는 질병 진행과 관련되지 않았음)을 발견하였다[보래스(Borras, G.) 등, Tumor antigen CA 19.9, CA 125, and CEA in carcinoma of the uterine cervix. Gynecol Oncol, 1995. 57(2): p. 205-11]. 사란다코 일행[사란다코(Sarandakou, A.) 등, Tumour-associated antigens CEA, CA125, SCC and TPS in gynaecological cancer. Eur J Gynaecol Oncol, 1998. 19(1): p. 73-7]은 자궁경부암 환자의 혈청 CEA 수준이 양성 부인과 질병을 앓는 환자에 비해 상당히 증가되었음을 입증하였다. 다른 연구에서는, 이들 환자의 혈청 CEA 수준은 증가되지 않았지만, 면역조직 화학적 염색에 의해 자궁경부 상피내 신생물(CIN III) 및 원위치에서의 암종(CIS)에서의 CEA 발현이 증가되었음을 보고하였다. 이 결과는, CEA 면역 염색이 혈청 CEA보다 더욱 민감하여 자궁경부 형성이상 또는 암을 초기 단계에서 진단할 수 있음을 암시한다[텐들러(Tendler, A.), 코프만(H.L. Kaufman) 및 캐디쉬(A.S. Kadish), Increased carcinoembryonic antigen expression in cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and in cervical squamous cell carcinoma. Hum Pathol, 2000. 31(11): p. 1357-62].
C-erb-B2
이 종양 단백질은 185kD의 막-결합 당단백이다. 이는 상피 성장 인자 수용체(c-erb-B1)에 대해 동종인 세포질 막상의 수용체이다. c-erb-B2 종양 단백질은 몇 개의 군에 의해 독립적으로 발견되었으며, 결과적으로 HER2 및 neu를 비롯한 다양한 이름으로 불린다[쿠센스(Coussens, L.) 등, Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 1985. 230(4730): p. 1132-9; 바그만(Bargmann, C.I.), 헝(M.C. Hung) 및 바인버그(R.A. Weinberg), The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature, 1986. 319(6050): p. 226-30]. c-erb-B2의 과발현은 자궁경부암 환자의 14% 내지 38%에서 관찰되었고, 나쁜 예후와 관련된 것으로 밝혀졌다[헤일(Hale, R.J.) 등, Prognostic value of c-erbB-2 expressiion in uterine cervical carcinoma. J Clin Pathol, 1992. 45(7): p. 594-6]. 다른 연구[샤마(Sharma, A.) 등, Frequent amplification of C-erbB2 (HER-2/Neu) oncogene in cervical carcinoma as detected by non-fluorescence in situ hybridization technique on paraffin sections. Oncology, 1999. 56(1): p. 83-7; 미트라(Mitra, A.B.) 등, ERBB2 (HER2/neu) oncogene is frequently amplified in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Cancer Res, 1994. 54(3): p. 637-9] 결과, 자궁경부암에서 c-erb-B2의 빈번한 증폭을 발견하였다. C-erb-B2 발현은 효소-결합 면역 흡수 분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(IHC)에 의해 측정된 자궁경부 암종에서 증가된다[킴(Kim, J.W.), 킴(Y.T. Kim) 및 킴(D.K. Kim), Correlation between EGFR and c-erbB-2 oncoprotein status and response to neoadjuvant chemotherapy in cervical carcinoma. Yousei Med J. 1999. 40(3): p. 207-14; 엔건(Ngan, H.Y.) 등, Abnormal expression of epidermal growth factor receptor and c-erbB2 in suqamous cell carcinoma of the cervix: correlation with human papillomavirus and prognosis. Tumour Biol, 2001. 22(3): p. 176-83].
사이클린 E
사이클린으로 알려져 있는 단백질 및 사이클론-의존성 키나제(CDK)로 불리는 관련 조절 단백질 군은 핵심 검사점을 조절한다. 사이클린 E는 세포 주기의 후기 G1 기간에 CDK2와 착체를 형성하는 50kD 단백질이다. 종양 발생은 세포 주기의 규칙 철폐를 특징으로 한다. p53이 여전히 인간의 종양에서 가장 중요한 세포 주기 조절자이지만, 사이클린 및 사이클린-의존성 키나제(CDK) 저해제의 이상 발현이 다양한 인간 암의 악성 변환의 가장 중요한 현상중 하나로 간주됨을 나타내는 증거가 많아지고 있다. 조 일행[조(Cho, N.H.), 킴(Y.T. Kim) 및 킴(J.W. Kim), Correlation between G1 cyclins and HPV in the uterine cervix. Int J Gynecol Pathol, 1997. 16(4): p. 339-47]은 정상적인 자궁경부 상피의 경우에는 사이클린 E 발현이 존재하지 않지만 HPV-양성인 경우에는 상당히 더 높았음을 발견하였다. 다른 연구에서는, 침습성 자궁경부암 또는 자궁경부 형성이상을 갖는 환자가 대조용 환자보다 상당히 더 높은 사이클린 E 지수(CEI)를 가짐을 밝혔다[킴(Tae Kim, Y.) 등, Expression of cyclin E and p27 (KIP1) in cervical carcinoma. Cancer Lett, 2000. 153(1-2): p. 41-50].
E6/E7
인간의 파필로마바이러스(HPV) 감염은 자궁경부암과 관련이 있다. E1 및 E2 파필로마바이러스 단백질은 감염의 초기 단계에서 발현되어 DNA 복제를 조절한다. E2 단백질은 상이한 HPV 프로모터로부터의 전사를 활성화시키고 억압한다. 바이러스성 DNA가 세포 게놈 내로 통합되는 몇몇 단계에서, E2 유전자는 붕괴되거나 불활성화된다. 이러한 현상으로 인해 E6 및 E7 바이러스성 종양 유전자가 감퇴된다. E6 및 E7은 세포 증식, 유전자 발현 및 종양으로의 진행에 영향을 끼친다[로잘레스(Rosales, R.), 로페즈-콘트레라스(M. Lopez-Contreras) 및 코르테즈(R.R. Cortes), Antibodies against human papillomavirus (HPV) type 16 and 18 E2, E6 and E7 proteins in sera: correlation with presence of papillomavirus DNA. J Med Virol, 2001. 65(4): p. 736-44]. 연구 결과, HPV 16 또는 18에서, E6/E7 mRNA는 양성 자궁경부 질환에서 검출되지 않았다. 그러나, 원위치에서의 자궁경부 선암종(ACIS)의 60% 및 자궁경부 선암종의 24%는 HPV 16 종양 유전자를 발현하였다. ACIS의 27% 및 침습성 자궁경부암의 51%에서 HPV 18 종양 유전자 발현이 검출되었다[리트도르프(Riethdorf, S.) 등, Analysis of HPV 16 and 18 E6/E7 oncogene expression in cevical and endometrila glandular neoplasias. Cancer Detection and Prevention, 2000. 24(Supplement 1)]. 로잘레스 일행[로잘레스, 로페즈-콘트레라즈 및 코르테즈, Antibodies against human papillomavirus (HPV) type 16 and 18 E2, E6 and E7 proteins in sera: correlation with presence of papillomavirus DNA. J Med Virol, 2001. 65(4): p. 736-44]은 HPV 감염증을 앓는 여성 172명을 연구한 결과, HPV 16의 E6 및 E7 단백질에 대한 항체가 각각 환자의 52% 및 37%에서 발견됨을 알아내었다. HPV 18의 E6 및 E7 단백질에 대한 항체는 각각 환자의 35% 및 45%에서 발견되었다. 다른 연구에서는, HPV 16 및 HPV 18에서, 효소-결합된 면역 흡수 분석법(ELISA)을 이용하여, 자궁경부암 환자로부터의 자궁경부 질 세척액의 48% 및 혈청의 29%에서 E6/E7 단백질이 검출되었음을 밝혔다.
상피 성장 인자 수용체(EGFR)
상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 막통과 당단백이다. 이의 리간드와의 결합은 DNA 합성, 세포 증식 및 세포 분화를 일으키는 일련의 사건을 개시시킨다. EGFR의 활성화는 다수의 상이한 유형의 고형 종양의 성장 및 전파에 기여하는 것으로 보인다. EGFR의 상향 조절 및 과발현은, 조절되지 않은 세포 증식 및 세포자멸사의 방지를 비롯하여, 암과 관련된 여러 과정과 관련되어 있다[우(Wu, X.) 등, Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human colorectal carcinoma cell line and its delay by insulin. J Clin Invest, 1995. 95(4): p. 1897-905]. 다수의 상피 종양은 높은 EGFR을 발현하고, 이는 자궁경부암 및 위암뿐만 아니라 직장결장암, 뇌암 및 인후암을 비롯한 진행된 질병 및 나쁜 임상적 예후와 관련되어 있다[살로몬(Salomon, D.S.) 등, Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol, 1995. 19(3): p. 183-232]. 킴 일행[킴 등, Expression of epidermal growth factor receptor in carcinoma of the cervix. Glynecol Oncol, 1996. 60(2): p. 283-7]은 침습성 자궁경부암 환자 40명중 29명(72%)에서, 자궁경부 상피내 종양(CIN) 환자 20명중 5명(25%)에서 EGFR의 과발현이 발견되었음을 보여주었다. EGFR의 과발현은 HPV16/18의 존재와 무관하게 바람직하지 못한 예측 인자인 것으로 보인다[케지아(Kedzia, W.) 등, [Immunohistochemical examination oncogenic c-erb-b2, egf-r proteins and antioncogenic p53 protein in vulvar cancers HPV-16 positive and negative]. Ginekol Pol, 2000. 71(2): p. 63-9].
Ki-67
이는 정상 세포 및 종양 세포의 증식시 발현되는 핵 단백질이다. Ki-67 발현은 후기 G1, S, M 및 G2로 명명된 세포 주기의 기간동안 이루어진다. 그러나, G0 기간 동안에는, 항원이 검출될 수 없다[캐토레티 등, Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol, 1992. 168(4): p. 357-63]. 바 일행[바(Bar, J.K.) 등, Relations between the expression of p53, c-erbB-2, Ki-67 and HPV infection in cervical carcinomas and cervical dysplasias. Anticancer Res, 2001. 21(2A): p. 1001-6]은 특히 형성이상의 증식 활성 증가를 수반하는 HPV 감염이 악성 과정으로 발전되기 쉬운 세포 부분모집단을 한정할 수 있다고 보고하였다. 이는, 암종 및 형성이상을 갖는 HPV-음성 환자보다 HPV-양성인 환자에서 더 높은 비율로 Ki-67 활성이 발견됨을 나타내는 결과에 의해 뒷받침된다.
p16
이 유전자는 사이클린-의존성 키나제 저해제(CDKI)이고, 종양 억제제로서 작용함으로써 세포 주기를 부정적으로 조절할 수 있다. 인간 파필로마바이러스(HPV)의 고위험 유형을 통한 잠복기가 긴 감염에 의해 자궁경부 형성이상이 유도된다. 형성이상 병소의 성장은 두 가지 바이러스성 종양 유전자 E6 및 E7(둘 다 다양한 세포 주기 조절 단백질과 작용함)의 발현 증가에 의해 유발된다. 이들 중에 E7에 의해 불활성화되는 망막모세포종 유전자 생성물 pRB가 있다. pRB 생성물은 사이클린-의존성 키나제 저해제 유전자 p16(INK4a)의 전사를 억제한다. 형성이상 자궁경부 세포에서의 바이러스성 종양 유전자의 발현 증가는 p16(INK4a)의 발현 증가에 의해 반영된다. 사노 일행[사노(Sano, T) 등, Immunohistochemical overexpression of p16 protein associated with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia. Pathol Int, 1998. 48(8): p. 580-5]은 몇 개의 낮은 등급 CIN 병소를 제외한 모든 CIN 및 침습성 암의 경우에 핵 및 세포질 둘 다에서 P16 단백질에 대한 강한 면역-반응성이 관찰되었음을 입증하였다. 다른 연구는 또한 p16(INK4a)의 과발현이 자궁경부의 형성이상 및 신생 상피 세포에 대한 특이적인 마커이고, p16이 Ki-67 및 사이클린 E와 함께 HPV-관련 자궁경부 신생물에 대한 대용 생체 마커로서 우대됨을 보여주었다[클래스(Klaes, R.) 등, Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer, 2001. 92(2): p. 276-84; 키팅(Keating, J.T.), 인스(T. Ince) 및 크럼(C.P. Crum), Surrogate biomarkers of HPV infection in cervical neoplasia screening and diagnosis. Adv Anat Pathol, 2001. 8(2): p. 83-92].
p53
이는 널리 알려진 종양 억제 유전자중 하나이다. p53 유전자는 정상 세포 및 조직에는 미량으로 존재하지만, 다수의 종양 및 종양 세포주에서는 고농도로 발생한다. 따라서, 면역 조직 화학법(핵 염색)에 의해 이를 검출할 수 있다. 다른 단백질과의 착체 형성에 의해 또는 p53 단백질의 변이에 의해 종양 세포의 농도를 증가시킬 수 있다. p53의 유전자는 다수의 종양에서 대립유전자 손실이 빈번한 부위인 염색체 17p에 위치한다. 바살로 일행[바살로(Vassallo, J.) 등, High risk HPV and p53 protein expression in cervical intraepithelial neoplasia. Int J Gynaecol Obstet, 2000. 71(1): p. 45-8]은 CIN에서의 p53 단백질 과발현이 위험성이 높은 HPV 감염과 관련되어 있다고 보고하였다. 웨스턴 블롯 분석 및 면역 조직 화학법을 이용함으로써, 원발성 자궁경부암에서 과발현된 p53 단백질을 갖는 p53 유전자의 재배열을 발견하였다[사후(Sahu, G.R.) 등, Rearrangement of p53 gene with overexpressed p53 protein in primary cervical cancer. Oncol Rep, 2002. 9(2): p. 433-7].
증식 세포 핵 항원(PCNA)
이 증식 세포 핵 항원(PCNA)은 DNA 폴리머라제 델타에 대한 보조인자이다. PCNA는 세포 주기의 S 기간 및 DNA 쌍과 관련된 DNA 합성 기간동안 발현된다. PCNA는 광범위한 정상 조직 및 악성 조직의 증식 세포에서 발현된다. PCNA의 위치는 핵이다. 고바야시 일행은 심각한 형성이상 및 원위치에서의 암종에서 PCNA와 유사분열지수 사이에 긴밀한 상호관계가 있음을 입증하였다[고바야시(Kobayashi, I.) 등, The proliferative activity in dysplasia and carcinoma in situ of the uterine cervix analyzed by proliferating cell nuclear antigen immunostaining and silver-binding argyrophilic nucleolar organizer region staining. Hum Pathol, 1994. 25(2): p. 198-202; 스멜라(Smela, M.), 코시아(M. Chosia) 및 도마갈라(W. Domagala), Proliferation cell nuclear antigen (PCNA) expression in cervical intraepithelial neoplasia (CIN). An immunohistochemical study. Pol J Pathol, 1996. 47(4): p. 171-4]. 다른 연구에서는 PCNA가 Ki-67보다 CIN에 대한 더욱 우수한 면역 반응성 마커임을 보여주었다[매다(Maeda, M.Y.) 등, Relevance of the rates of PCNA, Ki-67 and p53 expression according to the epithelial compartment in cervical lesions. Pathologica, 2001. 93(3): p. 189-95].
서바이빈
이는 142개 아미노산의 단백질이고, 세포 주기의 G2/M 기간에 발현된다. 이는 통상적인 인간 암에서는 선택적으로 과발현되지만 정상 조직에서는 그렇지 않은 세포자멸사의 저해제이며, 공격적인 질병 및 바람직하지 못한 결과와 관련되어 있다[레너(Lehner, R.) 등, Immunohistochemical localization of the IAP protein survivin in bladder mucosa and transitional cell carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2002. 10(2): p. 134-8]. 서바이빈 mRNA는 자궁경부 암 조직에서 검출된다[사이토(Saitoh, Y.), 야기누마(Y. Yaginuma) 및 이시카와(M. Ishikawa), Analysis of Bcl-2, Bax and Survivin genes in uterine cancer. Int J Oncol, 1999. 15(1): p. 137-41]. 양성 자궁경부 점막, 자궁경구 형성이상 및 침습성 겨드랑 세포 암종에서의 서바이빈의 면역 조직 화학적 편재화는 정상 점막, 낮은 등급의 형성이상 및 높은 등급의 형성이상에서 핵 염색이 검출되었음을 보여주었다. 염색 강도는 HPV 감염의 형태학적 증거의 경우에 가장 컸다[프로스트(Frost, M.) 등, Immunohistochemical localization of survivin in benign cervical mucosa, cervical dysplasia, and invasive squamous cell carcinoma. Am J Clin Pathol, 2002. 117(5): p. 738-44].
텔로머라제
이는 진핵 세포 염색체의 텔로머를 연장 및 유지시키는 리보핵산단백 효소이다. 텔로머라제를 발현하지 않는 세포는 각 세포 분열시 연속적으로 짧아지는 텔로머를 가지며, 이에 의해 궁극적으로는 염색체 불안정, 노화 및 세포 사멸에 이르게 된다. 다른 세포 현상과 함께 위험성이 높은 인간의 파필로마바이러스(HPV)에 의한 감염이 자궁경부암의 발달에 결정적인 역할을 한다는 가설이 세워져 왔다. 텔로머 반복체를 합성하는 텔로머라제 효소 착체의 활성화는 시험관내에서 불멸인 표현형의 획득에 연관되어 있고, 인간의 암에서 통상적으로 관찰된다[앤더슨(Anderson, S.) 등, Telomerase activation in cervical cancer. Am J Pathol, 1997. 151(1): p. 25-31]. 연구 결과, 텔로머라제는 자궁경부암 및 자궁경부 상피내 신생물 등급 III 병소의 일부에만 존재하고, 정상적인 자궁경부 조직에는 존재하지 않음이 밝혀졌다. 텔로머라제의 활성화는 고-위험도-HPV 감염, 불활성 p53 단백질의 축적 및 자궁경부 병소에서의 증가된 세포 증식과 관련된 것으로 보인다[스니더즈(Snijders, P.J.) 등, Telomerase activity exclusively in cervical carcinomas and a subset of cervical intraepithelial neoplasia grade III lesions: strong association with elevated messenger RNA levels of its catalytic subunit and high-risk human papillomavirus DNA. Cancer Res, 1998. 58(17): p. 3812-8; 네어(Nair, P.) 등, Telomerase, p53 and human papillomavirus infection in the uterine cervix. Acta Oncol, 2000. 39(1): p. 65-70]. 다른 연구는 자궁경부암 샘플의 96% 및 전암성 자궁경부 찰과의 69%에서 텔로머라제 활성이 검출되었지만 대조용 자궁절제 샘플 및 정상적인 건강한 환자의 자궁경부 찰과에서는 검출되지 않음을 보여준다. 이는 텔로머라제가 자궁경부암 선별에 매우 민감하고 특이적인 분자 마커임을 보여준다[레디(Reddy, V.G.) 등, Telomerase-A molecular marker for cervical cancer screening. Int J Gynecol Cancer, 2001. 11(2): p. 100-6].
혈관 상피 성장 인자(VEGF)
혈관 상피 성장 인자(VEGF)는 중요한 혈관 생성 인자 및 상피 세포-특이적 분열촉진물질이다. 혈관형성은 종양 발생 및 종양 진행의 말기 단계에서 중요한 과정이며, 원거리 전이의 발달에 특히 중요하다. VEGF는 가장 중요한 혈관 형성 유도체중 하나로 알려져 있고, 자궁경부의 암종에서 상향조절된다. 로페즈-오세조 일행[로페즈-오세조(Lopez-Ocejo, O.) 등, Oncogenes and tumor angiogenesis: the HPV-16 E6 oncoprotein activates the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene promoter in a p53 independent manner. Oncogene, 2000. 19(40): p. 4611-20]은 HPV-16 E6-양성 세포가 통상 VEGF 메시지를 높은 수준으로 발현함을 입증하였으며, VEGF 유전자의 직접적인 자극에 의해 HPV 종양 단백질 E6이 종양 혈광 형성에 기여할 수 있을 가능성을 제시한다. 다른 연구에서는, VEGF의 발현이 자궁경부암의 혈관 생성 촉진에 관여하고 초기 암 침습에 중요한 역할을 하는 것으로 입증하였다[고다마(Kodama, J.) 등, Vascular endothelial growth factor is implicated in early invasion in cervical cancer. Eur J Cancer, 1999. 35(3): p. 485-9].
VII. 실시예 I 내지 VI의 요약
상기 기재된 실시예 I 내지 VI은 폐암, 직장결장암, 방광암, 전립선암, 유방암 및 자궁경부암을 검출 및/또는 진단하기 위한 패널에 포함되어야 하는 바람직한 프로브/마커를 제공한다. 도 8a 내지 도 8c는 각 암 유형에 대해 바람직한 프로브/마커의 요약이다. 도 8a 내지 도 8c는 또한 어느 마커가 포괄적인 암 검출 용도에 유용한지를 밝힐 뿐만 아니라 특정 암 유형에 대한 특이성 때문에 더욱 중요한 마커를 나타낸다. 예를 들어, EGFR 및 Ki-67은 포괄적인 암 검출에 유용하다. 반면, BL2-10D1, CD44v3, 콜라게나제, COX-1, HLA-DR, HSP-90, IL-6, IL-10, 루이스 X, NMP-22, TGF-β1, TGF-1I, TGF1II 및 UBC는 방광암의 검출 및/또는 진단에 유용하고; AE1/AE3, BCA-225, BRCA-1, CA-15.3, 카테스핀 D, GCDFP-15, HOX-B3, p65, PR 및 TGK는 유방암의 검출 및/또는 진단에 유용하며; 사이클린 E, E6 및 E7은 자궁경부암의 검출 및/또는 진단에 유용하며; AKT, 암피레굴린, β-카테닌, Bax, BPG, Cdk/2/cdc2, cFLIP, 크립토-I, 에프린-B4, Fas-L, HMGI(Y), hMLH1, 라이소자임, 마트리리신, p68, S100A4 및 YB-1은 직장결장암의 검출 및/또는 진단에 유용하고; C-MET, 사이클린 A, FGF-2, 글루트-1, 글루트-3, HERA, MAGE-1, MAGE-3, Mucin 1, Nm23, p120, SP-1, SP-B, 트롬보모둘린 및 TTF-1은 폐암의 검출 및/또는 진단에 유용하고; 34βE12, B72.3, FAS, ID-1, 칼리크레인 2, Leu 7, P504S, PAP, PIP 및 PSA는 전립선암의 검출 및/또는 진단에 유용하다.

Claims (35)

  1. 세포에 기초한 진단법을 이용하여 포괄적인 질병 상태를 검출하거나 특이적인 질병 상태를 식별하기 위한 패널로서, 이 때 각각 포괄적인 질병 상태 또는 특이적인 질병 상태에 수반되는 마커와 특이적으로 결합하는 다수의 프로브를 포함하고, 패널의 구성요소 프로브가 세포학 시편의 세포에 결합하는 패턴이 질병 상태의 존재 또는 특이적인 특성을 진단하는데 도움이 되는 패널.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 포괄적인 질병 상태가 암 및 감염성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 암이 상피세포계 암, 고형 종양계 암, 분비 종양계 암, 및 혈액계 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 감염성 질병이, 감염성 생물체가 바이러스, 세균, 원생동물, 기생생물 또는 진균인 세포계 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  5. 제 1 항에 있어서,
    비용, 지리적 위치에서 포괄적인 질병 상태의 이환율, 지리적 위치에서 특이적인 질병 상태의 이환율, 프로브의 입수가능성 및 상업적 고려사항으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비중있는 인자를 이용함으로써 최적화시킨 패널.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로브 각각이 검출가능한 라벨을 포함하는 패널.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 프로브가 항체를 포함하는 패널.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 라벨이 발색단, 형광 발색단, 염료, 방사성 동위원소 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 라벨이 베타선, 감마선, X선, 자외선, 가시광, 적외선 및 극초단파로 이루어진 군으로부터 선택되는 전자기선을 사용하여 검출되는 발색단인 패널.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합 패턴이 광학 현미경 검사법을 이용하여 검출되는 패널.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 광학 현미경 검사법이 감마선, X선, 베타선, 자외선, 가시광, 적외선 및 극초단파로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전자기선을 이용하는 패널.
  12. 제 1 항에 있어서,
    성적으로 전염되는 질병을 검출하고, 클라미디아, 트리코모나스, 임질, 헤르페스 및 매독을 식별하는 패널.
  13. (a) 각각이 질병 상태에 수반되는 마커의 라이브러리의 일원과 특이적으로 결합하는 프로브의 결합 감도 및 특이성을 결정하는 단계; 및
    (b) 결합 패턴이 상기 질병 상태의 존재 또는 특이적인 특성을 진단하는데 도움이 되는 제한된 복수개의 상기 프로브를 선택하는 단계를 포함하는,
    세포에 기초한 진단법을 이용하여 환자에서 질병 상태를 검출하거나 질병 상태를 식별하기 위한 패널을 제조하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 결정하는 단계가,
    (a) 상기 질병을 앓고 있는 것으로 알려진 환자로부터의 조직학적 또는 세포학적 샘플 및 상기 질병을 앓지 않는 것으로 알려진 환자로부터의 조직학적 또는 세포학적 샘플을 상기 각각의 프로브와 별도로 접촉시키고;
    (b) 상기 마커가 상기 샘플의 세포에 존재하는 것으로 알려져 있는 위치에서 각 프로브와 프로브의 상보적인 질병 마커의 특이적인 결합량을 측정한 다음;
    (c) 상기 각각의 양을 상기 질병의 존재 또는 특이적인 특성과 연관시킴을 포함하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 선택하는 단계가 통계학적 분석 방법, 패턴 인지 방법 및 신경망 분석법중 하나 이상을 포함하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 선택하는 단계가 비중있는 인자를 사용함을 포함하는 방법.
  17. (a) 질병 상태에 특징적인 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포학적 샘플을 제 1 항에 따른 패널과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 질병 상태의 존재 또는 특이적인 특성을 진단하는데 도움이 되는 상기 프로브의 결합 패턴을 검출하는 단계를 포함하는,
    질병을 검출하거나 질병 상태를 식별하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포학적 샘플이 체액, 상피세포에 기초한 기관 시스템, 미세 침 흡인 또는 생검으로부터 수집된 세포 샘플인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 세포학적 샘플이 가래인 방법.
  20. 제 13 항의 방법에 따라 제조된, 세포에 기초한 진단법을 이용하여 포괄적인 질병 상태를 검출하거나 또는 특이적인 질병을 식별하기 위한 패널.
  21. 제 1 항에 있어서,
    상기 질병 마커가 형태학적 생체마커, 유전학적 생체마커, 세포 주기 생체마커, 분자 생체마커 및 생화학적 생체마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  22. 제 3 항에 있어서,
    상기 상피세포계 암이 폐, 비뇨기, 소화관 또는 생식기로부터의 암인 패널.
  23. 제 3 항에 있어서,
    상기 고형 종양계 암이 육종, 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  24. 제 3 항에 있어서,
    상기 분비 종양계 암이 육종, 유방암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  25. 제 3 항에 있어서,
    상기 혈액계 암이 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  26. 제 18 항에 있어서,
    상기 체액이 혈액, 뇨, 척수액 및 림프로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제 18 항에 있어서,
    상기 상피세포에 기초한 기관 시스템이 호흡기, 비뇨기, 생식기 및 위장관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 18 항에 있어서,
    상기 최종 침 흡인이 기관 및 시스템의 고형 조직 유형으로부터 이루어지는 방법.
  29. 제 18 항에 있어서,
    상기 생검이 기관 및 시스템의 고형 조직 유형으로부터 이루어지는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    상기 기관 및 시스템이 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 21 항에 있어서,
    상기 조직학적 생체마커가 DNA 배수성, MAC 및 전암성 병소로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  32. 제 21 항에 있어서,
    상기 유전학적 생체마커가 DNA 부가물, DNA 변이 및 세포자멸사 지수로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  33. 제 21 항에 있어서,
    상기 세포 주기 생체마커가 세포 증식 마커, 분화 마커, 조절 분자 및 세포자멸사 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  34. 제 21 항에 있어서,
    상기 분자 생체마커 또는 생화학적 생체마커가 종양 유전자, 종양 억제 유전자, 종양 항원, 성장 인자 및 수용체, 효소, 단백질, 프로스타글란딘 및 부착 분자로 이 루어진 군으로부터 선택되는 패널.
  35. 제 29 항에 있어서,
    상기 기관 및 시스템이 유방, 췌장, 간, 신장, 갑상선, 골수, 근육, 전립선 및 폐로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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