CN105247077A - 通过原位杂交区分瞬时高危型hpv感染和持续高危型hpv感染 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将宫颈组织或细胞学样品分类的方法，即通过使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测HPV？DNA和HPV？RNA；检测HPV核酸的存在；和基于HPV核酸表达将宫颈组织样品分类。

Description

通过原位杂交区分瞬时高危型HPV感染和持续高危型HPV感染

本申请要求2013年3月28日申请的美国临时申请序列号61/806,360的优先权的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文作为参考。

发明背景

本发明总的来讲涉及原位杂交测定(insituhybridizationassays)和宫颈样品分析，更准确地讲涉及用于测试人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染的测定及宫颈组织样品的分析。

高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染引起基本上所有宫颈癌和一部分头颈部癌(ZurHausen,Virology384:260–265(2009))。然而，仅有HPV感染对于致癌性转化是不够的；80-90％的感染是瞬时的并且被免疫系统自我清除。目前的HPV检验方法如Hybrid2(DigeneCorporation；Gaithersburg,MD)和GP5+/6+PCR虽然具有极好的分析灵敏度但是无法将瞬时HPV感染与持续HPV感染区分开，而仅仅报告HPV阳性(Kroupis和Vourlidis,Clin.Chem.Lab.Med.49:1783-1799(2011))。结果，这些检验对于高级别上皮内瘤变(CIN2+)的临床特异性差(40-50％)，从而对许多妇女造成不必要的随访程序(Kinney等人,Am.J.Clin.Pathol.134:193–199(2010))。因此，对于既有分析灵敏度又有临床特异性的HPV测定法有未满足的需求。

因此，基于HPV核酸的存在来准确地评价宫颈组织样品并将其分类的方法存在需求。本发明满足了这一需求并且也提供了相关优势。

发明概述

本发明涉及将宫颈组织或细胞学样品分类的方法，即通过使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和基于HPV核酸表达将宫颈组织样品分类。

附图简述

图1显示培养的Caski细胞的福尔马林固定石蜡包埋蜡块(formalin-fixedparaffin-embeddedblock)的系列切片。Caski细胞对于编码遍在蛋白(ubiquitin)的UBC(内源RNA对照)(左栏)、针对HPV16E6/E7mRNA的反义探针(中栏)和针对HPV16E6/E7DNA的有义探针(右栏)染色。上面一排，标准条件(无DNase)。下面一排，切片用DNase预处理后与HPV探针杂交。染色信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图2显示在正常宫颈和不同组织学级别的HPV相关宫颈病变中的HPVE6/E7染色图案(patterns)。使用针对18种亚型(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82)的一组探针，将宫颈活检样品对于高危型HPVE6/E7染色。正常宫颈对于高危型HPV呈完全阴性。注意到CIN1在宫颈上皮层的上1/3中具有强染色，但是其染色图案与CIN3的不相同，在整个上皮，信号似乎为细棕褐色颗粒。一些CIN2表现出如图所示的中间图案。染色信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图3显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。染色信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图4显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。上面一排，20x透镜；下面一排，40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图5显示与图3中用RNase消化预处理后用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的病变相同的CIN2病变。上面一排，20x透镜；下面一排40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图6显示与图3中用DNase预处理后用有义HPV探针染色的病变相同的CIN2病变。左，20x透镜；右，40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)。细胞核用苏木精染色(蓝色)。

图7显示宫颈上皮各层的示意图。

发明详述

本发明涉及将宫颈组织样品的状态根据人乳头瘤病毒(HPV)分类的测定和方法。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染引起基本上所有宫颈癌。本文公开的方法可以将宫颈组织样品归类或分类为含有低级别病变或高级别病变的样品的可能性，低级别病变最有可能被自我清除，高级别病变(被认为癌前期的)具有增加的进展到癌状态的可能性。本发明的方法可以单独使用或者与已知的组织学筛查方法(例如来自Pap涂片)联合使用，以将宫颈组织样品归类或分类。本发明的方法允许在给个体是否指示无治疗或是否应该实施治疗方案中作出决定。本发明的方法基于将瞬时高危型HPV感染与持续高危型HPV感染区分开，瞬时高危型HPV感染更有可能自发清除，持续高危型HPV感染具有增加的进展到癌状态的可能性。

如本文所用的，术语“核酸”或者术语“多核苷酸”是指核苷酸单体单元的多聚体，正如本领域技术人员众所周知的。示例性的核酸包括例如DNA和RNA，包括mRNA、siRNA、hnRNA、基因组DNA、cDNA或其它熟知的核酸形式。核酸或多核苷酸可以含有天然存在的核苷酸，包括熟知的天然存在的核苷酸修饰，以及非天然存在的核苷酸(如通过化学合成制备的核苷酸)。这样的修饰包括但不限于肽核酸(PNAs)，即修饰的寡核苷酸，例如，包含对于生物学RNA或DNA不是典型的核苷酸的寡核苷酸，诸如2'-O-甲基化寡核苷酸等。多核苷酸的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然或非天然的，还可以是未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键合、甲基膦酸酯键合、硼烷磷酸酯键合(boranophosphatelinkages)等连接。多核苷酸可以另外包含非核苷酸元件，诸如标记、猝灭剂(quenchers)、封闭基团等，正如本文所公开的。多核苷酸可以是单链的或双链的。

如本文所公开的，术语“HPV核酸”当在提及样品中使用时是指HPVDNA或RNA(特别是mRNA)，或HPVDNA和HPVRNA(如HPVmRNA)的组合。

如本文所用的，“核酸靶(nucleicacidtarget)”或“靶核酸(targetnucleicacid)”是指计划被检测的核酸或其区域。本领域技术人员能够容易地确定期望通过本发明的方法检测的靶核酸。如本文所描述的，本发明涉及检测HPV核酸、特别是高危型HPV的方法，如本文所公开的。因此，HPV核酸、特别是高危型HPV核酸是在本发明的方法中特别感兴趣的靶核酸，如本文所公开的。

如本文所用的，“标记(label)”是有利于检测分子的部分。在本发明正文中的普通标记包括荧光标记、发光标记、光散射标记和/或比色标记。合适的标记包括酶及荧光部分和显色部分，以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。在本发明的一个特定的实施方式中，标记是酶。示例性的酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各种蛋白酶。其它标记包括但不限于荧光团、二硝基苯(DNP)等。标记为本领域技术人员所熟知，如描述于例如Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)，和美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。许多标记是商业上可获得的并且可以用于本发明的方法和测定中，包括可检测酶/底物组合(Pierce,RockfordIL；SantaCruzBiotechnology,DallasTX；Invitrogen,CarlsbadCA)。在本发明的一个特定的实施方式中，酶可以利用显色或发荧光底物以产生可检测信号，如本文所描述的。本文中描述了示例性的标记。

如本文所用的，“原位杂交(insituhybridization)”或“ISH”是指一种杂交类型，其利用直接或间接标记的互补DNA或RNA链(如探针)与样品(特别是组织的一部分或切片)中的特异性核酸(如DNA或RNA)结合并将其定位(原位)。探针类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)(miRNA)和/或合成寡核苷酸。术语“荧光原位杂交”或“FISH”是指利用荧光标记的一种ISH类型。术语“显色原位杂交”或“CISH”是指具有显色标记的一种ISH类型。ISH、FISH和CISH方法为本领域技术人员所熟知(参见例如，Stoler,ClinicsinLaboratoryMedicine10(1):215-236(1990)；Insituhybridization.Apracticalapproach,Wilkinson编著,IRLPress,Oxford(1992)；Schwarzacher和Heslop-Harrison,Practicalinsituhybridization,BIOSScientificPublishersLtd,Oxford(2000))。

如本文所公开的，使用反义E6/E7探针，任选地在平行测定中辅助使用相应的有义探针，能够同时检测来自HPV感染细胞的病毒DNA和RNA信号，使得可以将瞬时HPV感染和持续HPV感染区分开。这种区别特征能够具有重要的临床应用，因为它能够允许通过HPV感染的状态将宫颈病变分类成三个阶段-瞬时状态(transientstate)(CIN1样图案)、过渡状态(transitionstate)(杂种图案)和持续状态(persistentstate)(CIN3样图案)–这和唯一的形态学标准相反。

本发明的方法可以用于使用宫颈活检样品来评估疾病状态和进展的风险。CIN1和CIN3信号图案和杂种图案代表与HPV感染相关的疾病进展的三个不同阶段。CIN1图案似乎指示瞬时HPV感染，而CIN3图案似乎指示持续感染的建立。杂种图案似乎指示当病毒开始在基底层中建立持续性时的过渡状态。因此，杂种和CIN3图案似乎指示高危型病变，而CIN1图案指示低危型病变，该低危型病变很可能自我清除。

通过HPVDNA/RNA染色图案将宫颈病变分类具有优于传统组织学CIN分级别的优点。例如，CIN2的存在已被认为与真实疾病状态相反的诊断歧义(diagnosticambiguity)(Galgano等人,Am.J.Surg.Pathol.34:1077–1087(2010))，因此导致治疗困境(treatmentdilemma)或过度治疗。相比之下，本文公开的实验中观察到的杂种图案可以为治疗决定做出提供更多的信息，因为它可指示病毒持续性的开始并因此应当像持续状态一样进行治疗。HPVDNA/RNA染色图案也可以允许将一些CIN1病变再分类为高危型病变，允许更早治疗和改善的结果，同时对具有真正低危型CIN1病变的患者不做积极随访(aggressivefollowup)和/或治疗程序。同样，组织学上的CIN2和CIN3病变也可以通过HPV感染的状态再归类并且根据病毒持续性的状态进行治疗。另外，HPVE6/E7RNA的不同水平或HPVE6/E7mRNA和DNA的相对量可以与发生高级别CIN病变和宫颈浸润癌(invasivecervicalcancer)的不同风险水平相关(预后)，再次允许更人性化管理。

采用细胞学样品评估疾病状态和进展的风险也可以使用本发明的方法。与宫颈活检样品的情形类似，通过反义或有义探针在细胞中强烈扩散染色的细胞核能指示瞬时感染的细胞，而使用反义探针，细胞质染色的存在能指示持续感染的细胞，例如，通过病毒整合到宿主基因组。再者，HPV感染的细胞的这两种类型及其绝对或相对细胞数和/或HPVE6/E7mRNA和DNA的相对水平的识别可以用于指示低级别或高级别病变的存在或预测疾病进展的风险(预后)。

已知某些HPV亚型与增加的发生宫颈癌的可能性相关，而其它HPV亚型与发生宫颈癌的低风险相关(参见例如，Burd,Clin.Microbio.Rev.16:1-17(2003))。在被诊断患有宫颈病变的患者中，确定一种或多种高危型HPV(HR-HPV)的E6/E7mRNA的存在可以用于确定宫颈病变是良性的还是与CIN有关(参见WO2012/103414；美国公布20120214152，所述文献通过引用并入本文作为参考)。如本文所用的，18种亚型的以下HPV亚组被认为是高危HPV亚型。这些高危HPV亚型包括但不限于HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82，并且该组在本文中也称为18种的HPV亚组。如有需要，十五种HPV亚型包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73的一个组在本文中也称为15种的亚组，也可以用于宫颈病变的测试。在18种的HPV亚组中的各HPV亚型，或者18种亚型中的一种或多种的组合，被认为是高危HPV亚型以在本文公开的方法中进行分析。高危HPV亚型的另一个组可以是包括HPV-16和18的一组。高危HPV亚型的又一个组可以是包括HPV-16、18、31、33、45、52和58的一组。应当理解，选自HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82的高危HPV亚型中的任何一种或多种可以用作核酸靶以检测高危型HPV，例如，在本发明的方法中作为针对HPV高危HPV亚型中的任何一种或多种的E6和/或E7区域的探针。因此，在本发明的一个实施方式中，探针包含靶探针组，其与选自16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82的HPV亚型中的一种或多种(包括多达所有的HPV亚型)的E6和/或E7区域互补。在另一个实施方式中，探针包含探针组，其与HPV亚型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73中的一种或多种(包括多达所有的HPV亚型)的E6和/或E7区域互补。在又一个实施方式中，探针包含探针组，其与HPV亚型16、18、31、33、45、52和58中的一种或多种(包括多达所有的HPV亚型)的E6和/或E7区域互补。在另一个实施方式中，探针包含探针组，其与HPV亚型16和/或18的E6和/或E7区域互补。

众多HPV亚型的序列是本领域已知的并且可以容易地由本领域技术人员鉴定。HPV亚型序列的示例性来源可以例如在国家生物技术信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)(ncbi.nlm.nih.gov)上找到。示例性的HPV亚型序列可以例如在NCBIGenBank数据库中找到并且包括但不限于以下的代表性基因组序列：HPV-16(NC_001526.2；GI:310698439)；HPV-18(AY262282.1；GI:30172004)，HPV-26(NC_001583.1；GI:9627305)，HPV-31(J04353.1；GI:333048)，HPV-33(M12732.1；GI:333049)，HPV-35(M74117.1；GI:333050)，HPV-39(KC470248.1；GI:537802154)，HPV-45(KC470260.1；GI:537802294)，HPV-51(M62877.1；GI:333087；Lungu等人,J.Virol.65:4216–4225(1991))，HPV-52(37751.1；GI:337238732)，HPV-53(NC_001593.1；GI:9627377)，HPV-56(EF177181.1；GI:138374823)，HPV-58(D90400.1；GI:222386)，HPV-59(X77858.1；GI:557236)，HPV-66(U31794.1；GI:1020290)，HPV-68(KC470283.1；GI:537802536)，HPV-73(X94165.1；GI:1491692)和HPV-82(AB027021.1；GI:6970427)。各种高危HPV亚型的其它代表性序列在NCBIGenBank数据库也可获得。

在NCIBGenBank数据库可获得的此类基因组序列包括例如指明E6基因和E7基因的位置的注释。因此，本领域技术人员能够使用本领域技术人员熟知的常规方法容易地确定和鉴别合适的序列以用作E6和E7编码区的有义或反义探针(也参见Burd等人，参见上文，2003,关于HPV基因组组构和编码基因的描述)。这样的适当区域的选择和与靶核酸、特别是与靶核酸特异性和选择性结合的寡核苷酸或探针结合的特异性和选择性试剂的设计都是本领域技术人员众所周知的(参见Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001)；Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)。使用适当选择靶核酸的区域以及结合剂(如寡核苷酸或探针)的适当长度可以实现期望的特异性，并且这样的选择方法为本领域技术人员所熟知。因此，本领域技术人员将容易地理解并且能够容易地确定适当的试剂，如寡核苷酸或探针，其可以用于靶向一种特定靶核酸优于另一种靶核酸。

在本发明的一个实施方式中，用原位杂交(ISH)测定来检测来源于女性个体子宫颈的组织切片或细胞学样品中的一种或多种高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA和/或DNA的存在。组织样品得自个体，例如，使用检查程序(如阴道镜检查)；或者可以得自宫颈组织活检。细胞学样品可以使用常规检查程序如Pap涂片或类似技术从子宫颈获取。任选地，样品可以使用众所周知的组织学方法先前已经分类和/或先前已经鉴别为HPV阳性。可以将样品在福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)切片中捕获，施用到固体表面(如载玻片)或在溶液中(如在细胞学涂片中)悬浮，并且任选地施用到固体支持物(如载玻片)上。当使用FFPE组织切片时，组织可任选地用组织预处理剂处理，如在柠檬酸盐缓冲液中加热，然后用蛋白酶消化，或者用其它熟知的方法加工FFPE用于ISH测定。在一个特定的实施方式中，组织或细胞学样品例如用加热和/或缓冲剂预处理，以促进与DNA杂交。准备好样品后，进行ISH测定以检测样品中的高危HPV亚型。

在本发明的方法中使用的ISHHPV测定中，一般而言，设计多个靶探针组以在高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA或DNA的区域里面与多种靶核酸杂交。应当理解，在使用本发明的方法评价宫颈样品中HPV核酸的存在时使用术语“靶探针”可以指单一探针或可以包括针对一种或多种高危HPV亚型的多个靶探针组。在一个特定的实施方式中，多种靶核酸可以包括18种的HPV亚组。在另一个实施方式中，多种靶核酸可以包括15种的HPV亚组。在又一个实施方式中，靶核酸可以是仅HPV-16。把各靶探针组设计为识别一种HPV亚型，并且靶探针组可以单独地使用或在一个池子(pool)中使用，这取决于HPV亚型是打算单独地检测还是作为一个组一起(无差别地)检测。在一个特定的实施方式中，各靶探针组可以含有适合于通过检测该组中所有靶探针的通用信号放大系统检测的完全相同的识别序列，如本文所描述的。如本文所用的这样一种通用放大系统一般是放大系统，其中使用同一标记来检测靶探针组中的所有高危HPV亚型。

在传统上，宫颈组织样本，举例来说，如在Pap涂片或宫颈组织活检中，分别基于细胞学或组织学进行分级别。宫颈组织样本由将样本根据其形态学分级别的临床医师来观察。宫颈组织样本的这种组织学分级别方法为本领域所熟知(参见例如，CecilTextbookofMedicine,Bennett和Plum编著,第20版,WBSaunders,Philadelphia(1996)；ColposcopyandTreatmentofCervicalIntraepithelialNeoplasia:ABeginner’sManual(宫颈上皮内瘤变的阴道镜检查和治疗：初学者手册),Sellors和Sankaranarayanan编著,InternationalAgencyforResearchonCancer,Lyon,France(2003)；Kalaf和Cooper,J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown和Trimble,BestPract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人,Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012))。显示在宫颈样品分级别中使用的各种术语的表格示于表1。

表1.宫颈细胞分级别目录(Sellors和Sankaranarayanan，同上，2003)

CIN：宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia)；LSIL：低级别鳞状上皮内病变(Low-gradesquamousintraepitheliallesion)；HSIL：高级别鳞状上皮内病变(High-gradesquamousintraepitheliallesion)；ASCUS：不能明确意义的不典型鳞状细胞(Atypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance)；AGUS：不能明确意义的不典型颗粒状细胞(Atypicalglandularcellsofundeterminedsignificance)。

在历史上，已用三级别系统CIN1、CIN2和CIN3和两级别系统LSIL和HSIL来将宫颈组织样品基于除正常组织以外的细胞或组织的组织学进行分类(参见表1)。当用CIN级别或其它组织学标准来将宫颈组织样品分级别时，诊断的可靠性可能是有问题的，因为CIN的组织学诊断依赖于细胞发现和形态学的主观解释。诊断准确性和再现性差可能很复杂并且造成患者忧虑。CIN级别在活检上的不正确分类能导致患者的不适当随访或治疗。临床医师冒着过度治疗良性病变或错误处理癌前期病变的风险。本发明提供基于HPV高危亚型核酸的存在和HPV感染状态的确定，辅助评估和诊断宫颈组织样本的方法。

目前，Pap(Papanicolaou)涂片或在宫颈癌筛查期间获得的液基细胞学材料(例如，ThinPrep；Hologic；BedfordMA)受到与基于组织学的宫颈活检处理相同的限制。基于细胞学，宫颈细胞的形态学一般不能用于得出是否该原因可能与HPV感染有关的结论。另外，良性HPV感染所致的形态学变化不能将恶性和癌前期HPV病变区分开。本文公开的方法的一个优点是它可以测试在分子水平上宫颈病变的性质，并因此确定是否宫颈病变很可能与瞬时、持续或过渡HPV感染有关，如本文所公开的。

本文公开的本发明的方法可以用于确定宫颈组织样品(包括诊断患有宫颈病变的患者)中的一种或多种高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA和/或DNA的表达，和任选地，E6和/或E7mRNA和/或DNA的水平的空间图案，以评价HPV感染的状态和朝完全恶性肿瘤的潜在进展，从而帮助此类患者的处理和随访治疗。目前，尚没有良好的方法来帮助处理患有低级别宫颈病变的患者，尽管这样的病变可能会进展或退变。目前可获得的方法一般测试基于组织学分级别朝恶变进展或退变的可能性，组织学分级别将上皮内宫颈瘤样病变分类为CIN1、CIN2、CIN3和浸润癌(Schiffman等人,Lancet370:890-907(2007))。CIN2或更坏(CIN2+)的分类被认为是介入性外科手术的阈值。然而，仅根据组织学的CIN2诊断是高度易变的并且不准确，从而导致不是治疗不足就是过度治疗(Stoler和Schiffman,J.Am.Med.Assoc.285:1500-1505(2001))。对从那些将具有退变的妇女中预测哪些妇女将会进展到较高级别病变无能为力导致给所有妇女相同的高强度随访和测试，这浪费了财政和医疗资源，同时也降低了患者的工作生产力。

本文公开的本发明的基于HPVE6/E7核酸的方法能更好地定义宫颈病变的HPV感染状态和致癌活性，并且更好地反映出疾病进展或退变(Ho等人,Int.J.Cancer127,622-632(2010))。因此，本发明的一个实施方式是使用ISH测定来检测高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA和/或DNA的空间图案和水平。这样的亚型的一个组是18种的HPV亚组，如本文所公开的。这样的亚型的另一个组是15种的HPV亚组，如本文所公开的。仅HPV-16也可用作高危HPV亚型。通过确定患者的宫颈样品(包括含有预先确定的病变(如CIN级别)的样品)的HPV感染状态，本发明提供基于在宫颈组织样品或病变中任何HPV感染状态的性质，对患者更有见识拣别分类的基础。这为临床医师提供了关于疾病进展风险的更多信息，并且鉴于可能的多次办公室访视和/或重复的细胞学和阴道镜检查，可以用于更有效地处理个体患者。通过更好地评价疾病进展的阶段和病毒持续性和潜在癌症发生的风险，本文公开的提供ISHHPV核酸测定的方法能够因此提供最佳疾病处理的客观信息。例如，基于疾病进展的阶段和癌症发生的风险的评估，人们可以选择对患者最佳的治疗选项。人们还可以最优化用于患者的重复试验的频率。

如本文所公开的，本发明涉及使用原位杂交(ISH)测定，基于高危HPV亚型的灵敏检测将宫颈组织样品分类、归类和/或分层的方法(参见实施例I和II)。该测定基于同时检测相同样品中的HPVDNA和mRNA的能力，从而提供关于宫颈组织样品的HPV感染状态的信息。如本文所公开的，关于HPV感染状态的信息可以用于补充宫颈样品的组织学分析以提供比组织学分析或先前仅HPV测试更有效的诊断。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，以确认宫颈组织样品的组织学分析，或将先前已通过组织学和/或HPV的存在分类的宫颈组织样品再分类。

在一个实施方式中，本发明提供将宫颈组织样品分类的方法。该方法可以包括使用反义E6和/或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6和/或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和将宫颈组织样品分类，其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态，其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续状态，或其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。

本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类。如本文所公开的，预期在宫颈样品的高级别CIN病变(CIN2+)中，高危HPV亚型将表现出E6/E7mRNA表达的上调。出人意外地发现在先前分类为CIN1的低级别宫颈病变中检测到HPV核酸(参见实施例II)。在宫颈病变的所有三个种类—CIN1、CIN2和CIN3中检测到HPV核酸。然而，CIN病变的每一个种类中HPV核酸的检测图案对于每一个种类是有区别的(参见实施例II)。进一步揭示，针对高危HPV亚型的E6和/或E7区域的反义探针能够同时检测HPVDNA和HPVmRNA，而HPVDNA和mRNA的同时检测使得可以基于宫颈样品的细胞的HPV感染状态将宫颈组织样品进一步分类。

具体地说且如本文所公开的，已确定先前分类为CIN1的宫颈组织样品表现出HPV核酸的扩散核染色，但是仅在宫颈样品的上皮的浅表层中。已证明CIN1样品中存在的HPV核酸是HPVDNA。先前分类为CIN3的宫颈组织样品也表现出截然不同的HPV核酸染色图案。在CIN3病变中，宫颈样品表现出在整个上皮，最明显的是在宫颈上皮的中间层和基底层中，在细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色。先前分类为CIN2的宫颈组织样品还具有另一种染色图案，这似乎是介于CIN1和CIN3宫颈病变图案之间的杂种图案。特别是在CIN2病变中，宫颈样品表现出在宫颈上皮的浅表层中的HPV核酸的扩散核染色以及宫颈上皮的中间层的细胞的细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色。HPV核酸的扩散核染色具有与CIN1病变类似的外观，而细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色具有与CIN3病变类似的外观。因此，宫颈组织样品中的HPV核酸染色图案可以用于将宫颈样品分类为低级别的CIN1样病变或分类为高级别的CIN2样或CIN3样病变。如本文所描述的和本领域已知的，CIN2病变一般被分类为高级别病变。

进一步如本文所公开的，扩散核染色vs颗粒细胞质和核染色的截然不同的HPV核酸染色图案经测定与DNAvsmRNA表达相关。具体地说，发现用HPV反义探针观察到的扩散核染色图案也用HPV有义探针观察到(参见实施例II)。如本文所公开的，有义探针能与DNA杂交但不与mRNA杂交。这一观察结果使用RNase和DNase得到证实，RNase不降低扩散核染色的信号，而DNase降低该信号。因此，可以确定在CIN1和CIN2病变中观察到的HPV核酸的扩散核染色相当于HPVDNA。

仅在CIN1病变的浅表层中的相当于HPVDNA的扩散核染色的观察结果很可能是在病毒生活周期的繁殖期中产生的病毒DNA，这在HPV基因组扩增之后，但在病毒衣壳从宿主细胞释放之前。虽然该测定将每个拷贝的靶核酸染色成信号"斑点(dot)"，因为HPV基因组扩增典型地产生非常大量的HPVDNA拷贝，所以每个拷贝的斑点染色(dottedstain)彼此重叠产生扩散染色图案。已知CIN1病变频繁地自发清除HPV感染。因此，CIN1病变的HPV感染状态是瞬时的。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类相当于瞬时HPV感染状态的瞬时状态。

另外如本文所公开的，发现细胞核和细胞质中的颗粒染色相当于HPVmRNA。这是基于颗粒状细胞核和细胞质染色图案用反义探针见到但用有义探针见不到的观察结果。这一观察结果用RNase处理得到确认，RNase处理显著减少颗粒染色(参见实施例II)。在CIN3病变中在整个上皮层(最明显在中间层和/或基底层中)的细胞的细胞质和/或细胞核中的颗粒状HPV核酸染色的观察结果与在活跃E6和/或E7mRNA表达中反映出的持续HPV感染的建立相关。HPVmRNA的颗粒状细胞质和细胞核染色很可能反映出在CIN3病变中持续HPV感染的建立。因此，CIN3病变的HPV感染状态是持续的。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类为相当于持续HPV感染状态的持续状态。

进一步如本文所公开的，在CIN2病变中观察到杂种HPV核酸染色图案。如本文所描述的，CIN2中的扩散核染色，类似于在CIN1中观察到的染色图案，经测定是HPVDNA(参见实施例II)。在CIN2病变中在细胞质和细胞核中的颗粒染色图案相当于HPVmRNA表达，类似于CIN3病变中观察到的图案(参见实施例II)。CIN2病变中杂种染色图案的观察结果很可能与过渡HPV感染状态相关，其中HPV感染从能够自我清除的瞬时感染过渡到如在CIN3病变中反映出的持续HPV感染。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类为相当于过渡HPV感染状态的过渡状态，过渡HPV感染状态具有增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。这是特别有用的，因为CIN2病变仅通过组织学进行分类是最困难的。通过基于HPV感染状态鉴别和分类CIN2病变，本发明的方法可以用于基于宫颈样品表现出过渡HPV感染状态的可能性客观地鉴别宫颈样品并将其分层，过渡HPV感染状态具有增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。因此，本发明的方法对于基于高危HPV亚型的E6和/或E7的活跃转录(mRNA的存在)的检测将CIN2病变分层为是更像CIN1状态(即，表现出CIN2病变的组织学但有瞬时HPV感染状态的HPV核酸染色图案)的宫颈样品，还是更有可能进展到CIN3病变的持续状态的CIN2病变的宫颈样品特别有用。

如本文所公开的，本发明的方法涉及基于宫颈细胞的HPV感染状态将宫颈样品分类。基于宫颈细胞的感染状态，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检测仅仅在宫颈组织样品的上皮的浅表层中的HPVDNA，其指示低级别病变。如本文所描述的，仅在宫颈组织样品的上皮的浅表层中检测到丰富HPVDNA与瞬时HPV感染状态和CIN1病变相关。这样的瞬时HPV感染状态或CIN1样病变被认为是低级别病变，如本文所公开的。

在另一个实施方式中，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检测宫颈组织样品的上皮的浅表层、中间层和/或基底层中，特别是中间层和/或基底层中的HPVRNA，其指示高级别病变。如本文所公开的，在宫颈上皮的各层中均检测到HPVRNA(mRNA)与持续HPV感染状态和CIN3病变相关。这样的持续HPV感染和CIN3样病变被认为是高级别病变，如本文所公开的。

在又一个实施方式中，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检测宫颈组织样品的上皮的基底层或中间层中的HPVRNA和宫颈组织样品的上皮的浅表层中的HPVDNA，其指示高级别病变。如本文所公开的，在宫颈组织样品的上皮的中间层中检测到HPVRNA和在宫颈组织样品的上皮的浅表层中检测到HPVDNA与过渡HPV感染状态和CIN2病变相关。尽管这样的过渡HPV感染状态能被认为是处于CIN1和CIN3之间的中间状态(杂种状态)，但是本领域已知CIN2病变具有增加的过渡到CIN3级别的可能性并且常规被指派为高级别病变(参见表1和参考文献如Sellors和Sankaranarayanan，同上，2003；Kalaf和Cooper，同上，2007；Brown和Trimble，同上，2012；Waxman等人，同上，2012)。因此，即使在宫颈组织样品的上皮的中间层中检测到HPVRNA和在宫颈组织样品的上皮的浅表层中检测到HPVDNA与过渡HPV感染状态相关，但是这种杂种或中间状态仍然被认为是高级别病变，其与CIN2病变的已知状态和与活跃HPVE6/E7mRNA表达的存在相一致。

如本文所公开的，HPVRNA(mRNA)在CIN2和CIN3病变中被检出，指示这些病变活跃地转录E6和/或E7mRNA。相反，仅HPVDNA或占优势地的是DNA在CIN1病变中被检出。因此，在宫颈组织样品中HPVRNA的存在与CIN2和CIN3病变相关，它们二者均被归类为高级别病变。因此，本发明的方法可以用于基于HPVRNA(mRNA)的检测将宫颈组织样品分类或归类为指示高级别病变。

如本文所公开的，本发明的方法有利地允许同时检测HPVDNA和HPVRNA。用于检测宫颈样品中的HPV的先前方法没有涉及使用相同检测方法同时检测相同样品中的HPVDNA和HPVRNA。如果HPVDNA和HPVRNA在相同样品中被检出，一般采用不同检测方法来最优化DNA或RNA的检测。这一般被认为是重要的，因为甚至低拷贝数HPVDNA的检测能够与了解宫颈组织样品病变的病理学有关。本发明的方法可以有利地用于以高灵敏度同时检测HPVDNA和HPVRNA，从而如本文所公开的允许将宫颈组织样品归类，并且也增加了HPV检测的灵敏度。因此，本发明的一个实施方式包括同时检测HPVDNA和HPVRNA二者的能力，当它们二者同时存在于宫颈组织样品中时。因此，检测HPV核酸的存在可以包括检测HPVDNA和HPVRNA。在一个特定的实施方式中，反义E6和/或E7探针能检测探针组中的高危型HPV，选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。

进一步如本文所公开的，本发明的能同时检测HPVDNA和HPVRNA二者的方法可以包括样品在进行原位杂交测定之前的预处理步骤以使双链DNA变性。这个步骤可以用于增加或最优化HPVDNA的检测，即通过产生至少部分变性的单链段DNA，其能与HPV靶探针更有效地杂交。用于处理宫颈细胞学样品使HPVDNA至少部分变性的方法为本领域所熟知，如本文所公开的。应当理解，这样的方法能导致样品中存在的实质上所有的DNA的变性或者使样品存在的DNA部分变性，以便增加靶探针与HPVDNA结合的效率。本领域技术人员能够容易地确定样品中DNA的至少部分变性至实质上完全变性足以提供HPVDNA检测的适当条件。

如本文所描述的，本发明的方法利用反义探针同时检测HPVDNA和HPVRNA，如果存在的话。本发明的方法能任选地包括使用有义探针使平行样品杂交以鉴别和/或确认HPVDNA的检测(参见实施例I和II)。因此，利用有义探针的平行测定能任选地用在本发明的方法中。在这样的情况下，有义探针将一般是针对与在反义探针中使用的HPV亚型或HPV亚型池相同的一组靶探针。本发明的方法能任选地进一步包括将样品与DNase和/或RNase一起孵育以确认被测HPV核酸是HPVDNA还是HPVRNA的测定，如有需要。此外，应当理解，HPVDNA和/或RNA的水平可以使用众所周知的测定条件进行定量，以定量测定原位杂交测定中的被测信号。因此，本发明的方法能利用HPVDNA和/或RNA表达图案，组织样品中HPVDNA或RNA表达的空间取向，或HPVDNA和/或RNA表达的水平，或它们的组合，来确定关于宫颈样品的HPV感染状态的有关信息。

如本文所公开的，本发明的方法提供基于HPVDNA和/或mRNA(如果存在的话)的检测将宫颈组织样品分类的能力，并且另外还利用HPVDNA和/或mRNA的空间表达图案以将宫颈组织样品进一步分类。HPVDNA和/或mRNA表达图案已在宫颈上皮不同层中观察到，这取决于宫颈病变的CIN种类，特别是在宫颈组织的上皮的浅表层、中间层和/或基底层中的表达，例如，在上皮的中间层和/或基底层中的表达。本领域技术人员将容易地理解基于宫颈组织的熟知解剖学和组织学，宫颈组织上皮各层的含义。

举例说明，图7显示正常宫颈上皮已知结构的示意图。浅表层由几层不大贴壁的细胞组成，一般比中间层的更宽和更薄。中间层，也称为中央带或副基底带，由成熟鳞状细胞组成，它具有比基底层的更丰富的细胞质。有的时候，中间层进一步分层为副基底层和更成熟鳞状上皮细胞。如本文所用的，术语“中间层”包括副基底层和更成熟鳞状上皮细胞，即在基底层和浅表层之间的层。基底层，也称为基底带，是单层柱状细胞，其主要功能是上皮再生。图7意欲说明宫颈组织的上皮的浅表层、中间层和基底层的一般位置，并且本领域技术人员、特别是临床医师或病理学家将容易地理解如本文所用的宫颈组织的上皮的浅表层、中间层和基底层的含义。

如本文所描述的，本发明的方法可以用于确定关于宫颈组织样品的HPV感染状态的有帮助的信息，并且基于高危型HPVDNA和/或mRNA的表达图案的空间取向进行分类，特别是如宫颈上皮的特定各层所确定。本发明的方法也可以用于将宫颈细胞学样品分类，甚至在不存在HPVDNA和/或mRNA的表达图案的空间信息的情况下。如本文所公开的，用Caski细胞作为一种模型以表征在不存在组织结构(如组织活检)的情况下，HPVDNA和mRNA在个体细胞中的表达。Caski细胞是已知携带HPV16的宫颈细胞系。如本文所公开的，可以用HPV-16有义和反义探针来检测个体细胞中的HPVDNA和mRNA。个体细胞中HPVDNA和mRNA的检测指示本发明的方法能够容易地应用于细胞学样品如由宫颈细胞刮擦所获得的宫颈细胞，例如，如用Pap涂片所获得的。

在一个另外的实施方式中，本发明提供将宫颈细胞学样品分类的方法。该样品可以在常规宫颈检查程序如Pap涂片或类似技术中获得。所采集的宫颈细胞可以直接在采集地点涂抹在显微镜载玻片上，或者作为在防腐保存缓冲液(即，液体Pap)的悬浮细胞收集，并且后者使用本领域已知的方法沉积在载玻片上。该方法可以包括使用反义E6和/或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6和/或E7探针能同时检测HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和将宫颈细胞学样品分类，其中仅在宫颈细胞样品中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态，其中在宫颈细胞学样品中在细胞质和细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续状态，或其中在宫颈细胞学样品的细胞质和细胞核中HPV核酸的扩散核染色和HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。

与使用宫颈组织样品的方法类似，将宫颈细胞学样品分类的方法可以用于确定相当于瞬时HPV感染状态的瞬时状态。如本文所公开的，CIN1病变的细胞表现出仅HPVDNA的染色。因此，表现出仅HPVDNA的染色和特别是扩散核染色的宫颈细胞学样品(如含有宫颈细胞的宫颈细胞刮擦物)被认为相当于瞬时HPV感染和低级别病变(CIN1样病变)。

在将宫颈细胞学样品分类的方法的另一个实施方式中，HPVmRNA表达的检测指示高级别病变。在观察到颗粒状细胞核和细胞质HPV核酸染色的情况下，这样的样品被认为代表HPVmRNA的表达且相当于高级别病变。在这样的样品中，在代表性细胞学样本中的细胞表现出细胞核和细胞质mRNA表达的情况下，该样品被认为与高级别CIN3样病变相关。在代表性细胞学样本中的细胞表现出细胞核和细胞质mRNA表达的情况下，样品被认为相当于持续HPV感染状态的持续状态。

在将宫颈细胞学样品分类的方法的又一个实施方式中，在相同细胞学样品里面细胞中的颗粒状细胞核和细胞质HPV核酸染色和扩散核染色二者的检测相当于过渡状态，类似于通过宫颈组织分析观察到的CIN2状态，相当于HPV感染状态，其具有增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。在本发明的方法中，在宫颈细胞学样品中观察到的HPVRNA的检测指示高级别病变。与宫颈组织样品分析类似，HPVE6和/或E7mRNA的表达是HPVE6和/或E7活跃转录的指标并且相当于高级别病变。在宫颈细胞学样品中HPVRNA和HPVDNA的检测也指示高级别病变。除了HPVmRNA和活跃转录的检测以外，也含有HPVDNA的代表性细胞学样本中的细胞的检测能相当于CIN2样病变。

应当理解，本文中涉及宫颈组织样品的描述可以类似地应用于宫颈细胞学样品，如适当的时候。因此，在将宫颈细胞学样品分类的方法中，检测HPV核酸的存在可以包括检测HPVDNA和HPVRNA。另外，在将宫颈细胞学样品分类的方法中，可将该样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性，如本文所描述的。

在另一个实施方式中，本发明提供将宫颈细胞学样品分类的方法。该方法可以包括使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和将宫颈细胞学样品分类，其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬时HPV感染状态，或其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该细胞中的持续HPV感染状态。在这样的本发明的方法中，在宫颈细胞学样品的众多细胞中，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中的HPV核酸的仅扩散核染色的存在，指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。在另一个实施方式中，在宫颈细胞学样品的众多细胞，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中，在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在，指示该样品相当于持续HPV感染状态。在又一个实施方式中，在宫颈细胞学样品的众多细胞，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中，在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的扩散核染色和HPV核酸的颗粒染色的存在，指示该样品相当于过渡HPV感染状态。在另一个实施方式中，在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在，指示过渡到持续HPV感染状态的可能性。在本发明的方法的另一个实施方式中，相对于具有HPV核酸的扩散核染色的细胞，在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的细胞的增速比、相对比或更大数目的存在指示增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。

在本发明的方法中，HPV核酸的存在可以包括检测HPVDNA和HPVRNA。在本发明的方法的另一个实施方式中，反义E6和/或E7探针能检测高危型HPV，选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。在本发明的方法的又一个实施方式中，将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

如本文所用的，宫颈组织样品被认为涉及从个体如通过组织活检获得的组织样品。在组织样品的情况下，将组织样品的解剖物保存到一定程度用于测定，例如，通过使用如本领域技术人员所了解的福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)组织样品、组织薄切片等以保存组织样品里面某些细胞的相对取向。如本文所用的，宫颈细胞学样品是指在组织中细胞的取向不一定被保存的情况下的细胞学样品。宫颈组织的这类细胞学样品可以例如使用Pap涂片或用于从个体获得代表性宫颈细胞所使用的类似技术来获得。可选地，这样的细胞学样品可以得自组织活检，其中将来自组织的细胞分散在组织中，使用众所周知的方法如通过将组织样品捣碎或使用机械破碎或酶促消化(如用蛋白酶)等其它方法(参见例如，Freshney,CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,第4版,Wiley-Liss,NewYork(2000))。在这样的情况下，细胞在组织样品中的相对取向在细胞学样品中不被保存。本领域技术人员将容易地理解组织样品和细胞学样品的含义，如本文所公开的。

如本文所描述的，本发明的方法可以用于基于HPVDNA和/或mRNA、特别是高危HPV亚型的E6和/或E7的检测将宫颈组织或细胞学样品分类。该方法可以应用在先前尚未通过组织学分析并且被指派为仅基于HPV感染状态的种类的宫颈组织或细胞学样品上。可选地，本发明的方法可以用在组织学分析所使用的样品上以提供低级别或高级别病变的确诊，如本文所公开的。此外，本发明的方法可以用在先前已通过传统组织学分析分类的样品(或组织活检样品或细胞学样品)上。在基于本文公开的分析，HPV感染状态相当于先前确定的级别如低级别或高级别病变或CIN1、CIN2或CIN3种类的情况下，本发明的方法可以用作组织学分类的确认测定。如果由本发明的方法所确定的HPV感染状态不同于先前确定的组织学分析，那么本发明的方法可以用于将先前分类的宫颈组织或细胞学样品进行再分类或再归类。因此，本发明的方法可以作为分析宫颈组织或细胞学样品的方法单独使用或者与传统组织学分析联合使用以将通过组织学确定的级别进行确认或再分类。

另外，本发明的方法也可以用于评估疾病状态或进展到疾病状态的可能性(即，预后)。如本文所公开的，本发明的方法可以用于将宫颈组织或细胞学样品分类为表现出瞬时HPV感染状态并因此像宫颈感染更有可能退变和自发清除的种类。另外，本发明的方法可以用于将宫颈组织或细胞学样品分类为表现出持续高危型HPV感染状态并因此被认为更有可能进展到癌状态的种类。因此，本发明的方法可以用于确定进展到瘤变状态的风险。进一步，本发明的方法可以用于将宫颈组织或细胞学样品分类为表现出过渡HPV感染状态的种类。这样的状态是更有可能进展到更高级别如CIN3的状态。这样的方法对于将CIN2病变分类为更有可能退变至CIN1级别和自发清除的病变或更有可能进展到CIN3级别(具有增加的进展到癌阶段的可能性)的病变，从而提供改善的治疗或非治疗方案。

在另一个实施方式中，本发明提供基于宫颈组织样品的分析确定患者结果的预后的方法。该方法可以包括使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和将宫颈组织样品分类，其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时HPV感染状态，其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续HPV感染状态，或其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡HPV感染状态。

在这样的本发明的方法的一个特定的实施方式中，瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可能性。在另一个实施方式中，持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。在再一个实施方式中，过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感染状态的可能性。在另一个实施方式中，过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。在又一个实施方式中，检测HPV核酸的存在包括检测HPVDNA和HPVRNA。在再一个实施方式中，在本发明的方法中使用的探针组中的高危型HPV选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种，例如，反义E6和/或E7探针能检测高危型HPV，选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。在本发明的方法的另一个实施方式中，可将该样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

在又一个实施方式中，本发明提供基于宫颈细胞学样品的分析确定患者结果的预后的方法。这样的方法可以包括使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；检测HPV核酸的存在；和将宫颈细胞学样品分类，其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬时HPV感染状态，或其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该细胞中的持续HPV感染状态。

在这样的本发明的方法的一个特定的实施方式中，在宫颈细胞学样品的众多细胞中，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中HPV核酸的仅扩散核染色的存在，指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。在本发明的方法的另一个实施方式中，在宫颈细胞学样品的众多细胞中，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在，指示该样品相当于持续HPV感染状态。在又一个实施方式中，在宫颈细胞学样品的众多细胞中，例如，样品中的HPV阳性细胞如所有或实质上所有的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的扩散核染色和HPV核酸的颗粒染色的存在，指示该样品相当于过渡HPV感染状态。在另一个实施方式中，在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在指示过渡到持续HPV感染状态的可能性。在再一个实施方式中，相对于具有HPV核酸的扩散核染色的细胞，在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的细胞的增速比、相对比或更大数目的存在指示增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。

在本发明的方法的又一个实施方式中，瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可能性。在另一个实施方式中，持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。在再一个实施方式中，过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感染状态的可能性。在另一个实施方式中，过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。在本发明的方法的又一个实施方式中，检测HPV核酸的存在可以包括检测HPVDNA和HPVRNA。在本发明的方法的再一个实施方式中，该探针中的高危型HPV选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种，例如，反义E6和/或E7探针能检测高危型HPV，选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。在另一个实施方式中，可将该样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

正如本领域众所周知的，在杂交测定中可以任选地包括适当的阴性对照，如本文所公开的。例如，可以使用至少一种阴性对照探针组进行杂交测定。用于原位杂交测定中的阴性对照的用途和设计为本领域技术人员所熟知。特别有用的阴性对照包括在被表征的靶探针组中不与特定HPV亚型杂交的那些。这样的阴性对照可以因此基于与已知在宫颈细胞中不被表达的序列杂交的探针，例如，对其它细胞类型的组织特异性探针。特别有用的阴性对照将是针对完全不同的生物体、特别是非哺乳动物生物体和更特别是非真核生物如细菌而设计的探针。本领域技术人员将容易地知道如何选择适合于原位杂交测定的适宜阴性对照。

如本文所公开的，本发明的进行基于原位杂交的测定的一种方法包括使用测定。原位杂交测定在商业上可获自AdvancedCellDiagnostics,Inc.(HaywardCA)。测定先前例如在美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688和WO2007/001986和WO2007/002006中已有描述。下面更详细描述了各种实施方式中的测定。应当理解，本发明的测定法可以用商业上可获得的原位杂交测定包括或如本文所描述的测定的变体进行。称作的RNAISH技术平台具有单分子敏感性，能够多重检测，并且与福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)组织相容(参见例如，Masand等人,5:108–116(2011)；Ukpo等人,Am.J.Surg.Pathol.35:1343(2011)；Wang等人,J.Mol.Diagnostics14:22–29(2012))。在检测HPV中的应用也有描述(参见WO2012/103414和美国公布20120214152)。在本文中描述了测定的概要和更多细节。

如本文所用的，术语“标记探针(labelprobe)”是指与靶分子直接或间接结合的实体，并且允许靶标被检测。标记探针(或“LP”)含有核酸结合部分，典型地为单链多核苷酸或寡核苷酸，包含直接或间接提供可检测信号的一种或多种标记。标记可以与多核苷酸共价连接，或者多核苷酸可以经构型以与标记结合。例如，生物素化多核苷酸可以结合链霉抗生物素蛋白缔合的标记。标记探针可以例如直接与靶核酸如高危HPV亚型杂交，或者它可以与核酸杂交，进而与靶核酸或与与靶核酸杂交的一种或多种其它核酸杂交。因此，标记探针可以包含与多核苷酸序列、特别是靶核酸的一部分互补的多核苷酸序列。可选地，标记探针可以包含与放大子、辅放大子、中间复合物等中的多核苷酸序列互补的至少一个多核苷酸序列，如本文所描述的。如本文所用的，包含酶标记或非酶标记的标记探针是指包含核酸结合部分如与核酸结合部分偶联的寡核苷酸和酶或非酶标记的标记探针。如本文所公开的，酶标记或非酶标记与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲和力结合相互作用如生物素/抗生物素蛋白或其它类似高亲和力结合分子。

如本文所用的，“靶探针(targetprobe)”是能够与靶核酸杂交并且捕获或结合针对该靶核酸的标记探针或中间复合物分子的多核苷酸。靶探针可以直接与标记探针杂交，或者它可以与进而与标记探针杂交的一种或多种核酸杂交；例如，靶探针可以与中间复合物中的放大子或辅放大子杂交。因此，靶探针包括与靶核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、放大子、辅放大子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。靶探针一般是单链的，使得互补序列可以用来与相应的靶核酸、标记探针、放大子或辅放大子杂交。

如本文所用的，“反义探针(antisenseprobe)”是指与mRNA互补的多核苷酸或寡核苷酸。因此，反义探针可以与mRNA杂交。这样的反义探针也可以与DNA链杂交，该DNA链具有与mRNA相应的序列，也称为编码链。反义探针取向在本领域也被认为相当于非编码链。如本文所用的，“有义探针(senseprobe)”是指具有与DNA的有义链或编码链或mRNA相同的序列的多核苷酸或寡核苷酸。因此，有义探针可以与DNA的互补非编码链杂交，但是不能与mRNA杂交。因此，如本文所用的，反义探针可以与DNA和mRNA二者上的互补链杂交，而有义探针仅仅与DNA上的互补链杂交。

如本文所用的，“放大子(amplifier)”是能够与多个标记探针杂交的一种分子，典型地为多核苷酸。典型地，放大子与多个完全相同的标记探针杂交。放大子也可以与靶核酸、至少一种靶探针或与靶探针如辅放大子结合的核酸杂交。例如，放大子可以与至少一种靶探针和与多个标记探针，或与辅放大子和多个标记探针杂交。放大子可以是例如线性、分叉的、梳子样或支链核酸。如本文所描述的对于所有多核苷酸，放大子可以包括修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间键合以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。合适的放大子描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198及美国公布2008/0038725和2009/0081688。

如本文所用的，“辅放大子(preamplifier)”是用作在一个或多个靶探针和一个或多个放大子之间的中间体的一种分子、典型地为多核苷酸。典型地，辅放大子同时与一个或多个靶探针和与多个放大子杂交。示例性的辅放大子描述于例如美国专利号5,635,352、5,681,697和7,709,198及美国公布2008/0038725和2009/0081688。

如本文所用的，“中间复合物(intermediarycomplex)”是一种这样的分子，并且可以是大型复杂分子，或多个分子的组装：其具有一种或多种组分(各自含有能够与靶核酸的片段特异性结合的片段)并且具有另一种组分或多种组分(各自含有能够与标记探针结合的一个或多个片段)。中间复合物可以包含例如标记探针、放大子和/或辅放大子。

在一个方面，标记探针直接与靶探针结合。在另一个方面，标记探针被捕获至间接例如通过辅放大子和/或放大子的结合的靶探针。放大子和辅放大子的用途可以在增加信号强度中是有利的，因为它们可以有利于大量标记探针与各核酸靶的结合。在一个实施方式中，一个靶探针与每一个标记探针、放大子或辅放大子杂交。在另一个实施方式中，两个或两个以上靶探针与标记探针、放大子或辅放大子杂交。

在其中利用两个或两个以上靶探针的多个实施方式中，靶探针可以与非重叠多核苷酸序列在它们各自的核酸靶中杂交。靶探针可以但不需要覆盖核酸靶的相邻区域。封闭探针，即与未被靶探针占据的核酸靶的区域杂交的多核苷酸能任选地包括在内并且与靶杂交。对于给定的核酸靶，相应的靶探针和封闭探针一般与核酸靶中的物理上区别的非重叠序列互补，这种非重叠序列可以是，但不一定是相邻的。鉴于靶探针和任选的封闭探针彼此相邻可以在一些实施方式中提高杂交强度、去除二级结构并且确保更一致和再现的信号。

本文公开的ISH方法对于核酸的多重检测，包括一种或一种以上、两种或两种以上、三种或三种以上或超过三种核酸靶(如三种或三种以上高危HPV亚型)的同时检测特别有用。因此，细胞能任选地包含或被怀疑包含第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种或甚至更多种，包括多达18种核酸靶(如高危HPV亚型)。例如，检测第三种核酸靶的方法包括：提供包含第三种标记的第三种标记探针，其中来自第三种标记的第三种信号可以与前两种信号可区别或不可区别，这依赖所收集的信息程度，提供至少两个第三种靶探针，使第三种靶探针与第三种核酸靶在细胞中杂交(当在细胞中存在第三种靶标时)，捕获第三种标记探针至第三种靶探针，并且检测来自第三种标记的第三种信号。相同原则可以应用于检测第四种、第五种、第六种、第七种……等等，包括多达所有18种高危HPV亚型，即通过使用可以包含能与18种高危HPV亚型中的每一种特异性杂交的探针的探针组或其亚组，如本文所公开的。如本文所公开的，HPV亚型可以用相同标记或有区别的标记进行检测，如有需要。

在检测细胞中的核酸靶时，在靶探针的杂交之前，将细胞任选固定并且透化。固定和透化细胞可以有利于保留细胞中的核酸靶并且允许靶探针、标记探针、放大子、辅放大子等进入细胞。将细胞任选洗涤以去除未被捕获至核酸靶之一的材料。细胞可以在各种步骤中的任何一个步骤之后洗涤，例如，在靶探针与核酸靶的杂交之后以去除未结合的靶探针，在辅放大子、放大子和/或标记探针与靶探针的杂交之后，等等。

各种捕获和杂交步骤可以同时或序贯进行，以基本上任何方便顺序。在一个特定的实施方式中，在同一时间完成对所有核酸靶的给定杂交步骤以对于测定来说提高效率并节约时间、试剂和成本。例如，可以将所有靶探针(第一种、第二种等)一次性加入到细胞中并且允许与它们的相应靶杂交，可以将细胞洗涤，放大子(第一种、第二种等)可以与相应的靶探针杂交，可以将细胞洗涤，标记探针(第一种、第二种等)可以与相应的放大子杂交，然后在标记检测之前可以将细胞再次洗涤。作为另一个实例，靶探针可以与靶杂交，可以将细胞洗涤，可以将放大子和标记探针一起加入并且杂交，然后在检测之前可以将细胞洗涤。在相应的靶探针与靶杂交之前，将双链核酸靶任选变性(例如，通过加热或其它方法)将是显而易见的。

在本发明的一个实施方式中，在进行原位杂交测定之前，将组织或细胞样品预处理，特别有利于与HPVDNA杂交。可将样品用缓冲液预处理和/或加热至使双链DNA至少部分变性以有利于靶探针与样品中存在的HPVDNA杂交。用于使双链DNA变性的条件为本领域所熟知(参见Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001)；Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999))。本领域众所周知的是，可以将温度和缓冲液条件变化以达到样品中双链DNA的至少部分变性所需要的条件。这样的条件包括但不限于加热样品，例如，在40℃-110℃之间加热样品，例如，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃或110℃，或在50℃-110℃、60℃-110℃、70℃-110℃、80℃-110℃、90℃-110℃、90℃-100℃、100℃-110℃或甚至更高温度的范围内加热样品，如有需要。本领域技术人员将容易地理解，用于将样品中的双链变性的特定温度的选择可以变化，这取决于用于变性步骤的缓冲液条件，包括但不限于盐和/或离液试剂(chaotropicagents)的存在，等等。例如，在化学变性试剂的存在下，一般可以使用较低孵育温度，正如本领域众所周知的。类似地，本领域技术人员可以改变进行预处理步骤以实施双链DNA的至少部分变性的时间长度。例如，预处理步骤可以进行约1分钟至约1小时，或更长时间，如有需要。具体地说，预处理步骤进行至少5分钟至60分钟，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分钟，如有需要。也可以使用更长的孵育时间，例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16小时，例如，过夜或更长时间，如有需要，特别是当使用较低温度时。在一个特定的实施方式中，预处理步骤在约100℃的温度下进行5-60分钟，特别是5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟，例如，5-55、5-50、5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、25-30、30-60、30-55、30-50、30-45、30-40、30-35、35-60、35-55、35-50、35-45、35-40、40-60、40-55、40-50、40-45、50-60、50-55、55-60分钟，等等，如有需要。

对于该方法的所有或大部分步骤，为了易于处理，可以将宫颈细胞学样品用作细胞悬液。一般而言，该方法也应用于固体组织样品(例如，组织活检样品或组织切片)中的宫颈细胞样品和/或固定在基底(例如，载玻片或其它表面)上的细胞学样品的细胞并且对于分析它们特别有用。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的ISH方法可以使用有区别的酶或非酶标记，允许可区别的可检测标记与特定靶核酸的缔合。例如，可以用可区别的标记来检测HPV靶探针组中的每一种HPV亚型。在另一个实施方式中，用不可区别的标记即相同的标记来检测所有HPV靶探针，从而检测样品中的HPV亚型中的任何一种。因为探针组含有高危HPV亚型，所以检测样品中的高危HPV亚型中的任何一种或多种对于与本发明的方法相关的分析来说是足够的。因此，一般而言，用相同标记探针来检测样品中存在的任何和所有HPV亚型。

可以使用多种酶或非酶标记中的任何一种，只要酶促活性或非酶标记可以分别被检出。酶由此产生可检测信号，其可以用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是显色或发荧光信号。因此，特别有用的用作标记的酶包括显色或发荧光底物可获得的那些。这样的显色或发荧光(fluorgenic)底物可以通过酶促反应转化成容易检测的显色或荧光产物，其可以使用显微镜术或光谱学容易地检测和/或定量。这样的酶为本领域技术人员所熟知，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996))。具有熟知的显色或发荧光(fluoregenic)底物的其它酶包括各种肽酶，其中显色或发荧光肽底物可以用于检测蛋白酶切割反应。显色和发荧光底物的应用在细菌诊断中也是众所周知的，包括但不限于α-和β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷-6-磷酸半乳糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等的应用(Manafi等人,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，并且这样的具有已知显色或发荧光底物的酶能够容易地改变以用在本发明的方法中。

各种产生可检测信号的显色或发荧光底物为本领域技术人员所熟知并且是在商业上可获得的。可以用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻-苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，对于辣根过氧化物酶；5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑翁盐(NBT)、坚牢红(FastRed)(FastRedTR/AS-MX)和磷酸对-硝基苯酯(PNPP)，对于碱性磷酸酶；1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷，对于β-半乳糖苷酶；2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷，对于β-葡萄糖苷酶；等等。示例性的发荧光底物包括但不限于4-(三氟甲基)伞形基(umbelliferyl)磷酸酯，对于碱性磷酸酶；4-甲基伞形基磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸酯双(环己铵)和4-甲基伞形基磷酸酯，对于磷酸酶；QuantaBlu^TM和QuantaRed^TM，对于辣根过氧化物酶；4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，对于β-半乳糖苷酶；3-乙酰基伞形基β-D-吡喃葡萄糖苷和4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷，对于β-葡萄糖苷酶；和4-甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷，对于α-半乳糖苷酶。用于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公布2012/0100540。各种可检测酶底物包括显色或发荧光底物是众所周知的并且是在商业上可获得的(Pierce,RockfordIL；SantaCruzBiotechnology,DallasTX；Invitrogen,CarlsbadCA；42LifeScience；Biocare)。一般而言，将底物转变成产物，产物形成沉淀物，沉淀物沉积在靶核酸的位点上。其它示例性的底物包括但不限于HRP-Green(42LifeScience)、BetazoidDAB、CardassianDAB、RomulinAEC、拜卓紫(BajoranPurple)、维娜绿(VinaGreen)、DeepSpaceBlack^TM、WarpRed^TM、VulcanFastRed和FerangiBlue(来自Biocare)(ConcordCA；biocare.net/products/detection/chromogens)。

生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉抗生物素蛋白)是众所周知的信号放大系统，基于这两个分子彼此具有超常的高亲和力并且一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子可以结合四个生物素分子的事实。抗体广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放大。酪酰胺信号放大(Tyramidesignalamplification,TSA)基于通过过氧化物酶活性使大量半抗原化酪酰胺分子沉积。酪胺是一种酚类化合物。在少量过氧化氢的存在下，固定化辣根过氧化物酶(HRP)将经标记的底物转变成短寿命的极具反应性的中间体。然后，被激活的底物分子与蛋白质的富电子部分(如酪氨酸)在过氧化物酶结合位点处或其附近非常快速地反应并且与其共价结合。以这种方式，可以在原位杂交位点引入与酪酰胺缀合的许多额外半抗原分子。随后，沉积的酪酰胺-半抗原分子可以直接地或间接地显现。这样的检测系统例如在美国公布2012/0100540中有更详细描述。

使用适当的显色或发荧光底物，本文描述的实施方式可以利用酶来产生可检测信号。应当理解，可选地，标记探针可具有直接与标记探针的核酸部分偶联的可检测标记。示例性的可检测标记为本领域技术人员所熟知，包括但不限于显色或荧光标记(参见Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如，四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺基罗丹明B、德克萨斯红(TexasRed)(磺基罗丹明101)、罗丹明110及其衍生物(如四甲基罗丹明-5-(或6))、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘，例如丹磺酰基(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexafluor染料(MolecularProbes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-茚(BODIPY^TM)及其衍生物(MolecularProbes；EugeneOreg.)；芘和磺酸化芘，例如CascadeBlue^TM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基噁唑衍生物和dapoxyl衍生物(MolecularProbes)；萤光黄(LuciferYellow)(3,6-二磺酸酯-4-氨基-萘酰亚胺)及其衍生物；CyDye^TM荧光染料(Amersham/GEHealthcareLifeSciences；PiscatawayNJ)等。示例性的生色团包括但不限于酚酞、孔雀绿、硝基芳族化合物(如硝基苯)、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。

可以用熟知的方法如显微镜术或光谱学来显现与相应靶核酸相关的显色或荧光可检测信号。一般而言，对于特殊测定将使用或显色底物或发荧光底物，或显色或荧光标记，如果在同一测定中使用不同标记的话，使得可以在相同样品中使用单一类型的仪器进行核酸靶的检测。

在一个实施方式中，标记探针直接与靶核酸分子杂交。如上所讨论的，在这样的实施方式中，标记探针本身包含核酸靶结合区(如互补寡核苷酸)，并且直接与靶核酸结合。可选地，使用中间复合物，标记探针可以间接与靶核酸结合(也参见WO2013/134442和WO2013/152295)。在一个这样的实施方式中，中间复合物可以是单个分子如单个核酸分子。例如，作为单个分子的中间复合物可以包含能够与靶核酸特异性和选择性连接或结合的区域。这类似于经设计连接或结合至靶核酸的标记探针，只是与核酸靶结合由中间分子介导。中间分子也可以包含能够与标记探针特异性和选择性结合的区域。在这样的情况下，标记探针和中间分子被设计成具有彼此互补的结合区(如寡核苷酸区)。这样的构型因而使酶标记通过中间分子与靶核酸特异性和选择性缔合。第二靶核酸可以通过第二中间复合物与相同标记或区别标记特异性和选择性缔合。第二中间复合物包含能够与靶核酸特异性和选择性结合的第一区域和能够与相同标记探针或第二标记探针特异性和选择性结合的第二区域。因此，标记探针可以通过第一和第二中间复合物与靶核酸分子结合。进一步，中间复合物可以包含包含与靶核酸互补的第一区域的分子并且包含与标记探针互补的至少一种第二区域的相同或不同分子。再进一步，中间复合物可以包含组装的多个分子，其中一种或多种组分各自包含与靶核酸互补的一个或多个区域，并且一种或多种其它组分各自包含与标记探针互补的一个或多个区域。以这种方式，中间复合物可以是放大结构，允许多个标记探针与靶核酸上的区域连接。一般而言，中间复合物包含一种或多种核酸分子以利用核酸相互作用的特异性和选择性结合能力。

如本文所描述的，可以使样品与相同或有区别的标记探针接触，如本文所公开的。标记探针通过靶核酸上的互补区和标记探针或中间复合物的杂交与靶核酸分子结合，如本文所讨论的。

如本文所描述的，在本发明的方法中使用的标记探针可以包含含有寡核苷酸的靶核酸结合区，寡核苷酸与靶核酸互补或与可以结合至靶核酸的中间复合物的组分互补。在标记探针的这种构型中，寡核苷酸部分与酶或非酶标记偶联。酶或非酶标记与标记探针中的寡核苷酸的偶联可以是共价的，使用众所周知的化学偶联方法(参见例如，Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996))。可选地，高亲和力相互作用(如生物素/抗生物素蛋白，其中生物素或抗生物素蛋白与寡核苷酸和标记探针中的酶或非酶标记偶联)，可以用于使酶或非酶标记与标记探针中的寡核苷酸偶联(参见美国公布2012/0100540)。应当理解，酶或非酶标记与标记探针中的寡核苷酸的偶联具有足够的亲和力，如通过相互作用(如生物素/抗生物素蛋白)，或为共价的，使得酶或非酶标记保留通过本发明的方法的各种反应和测定条件与寡核苷酸连接。

在又一个实施方式中，本发明的方法可以使用中间复合物，其中中间复合物包含多种分子而不是单一分子。这样的中间复合物对于放大可检测信号、提供靶核酸的更高灵敏度检测特别有用。这样的用于放大信号的方法描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198及美国公布2008/0038725和2009/0081688，以及WO2007/001986和WO2012/054795。

因此，在一个特定的实施方式中，中间复合物可以包含靶探针、放大子和辅放大子。另外，多个标记探针可以与一个或多个放大子杂交，多个放大子可以与辅放大子杂交，并且辅放大子可以与靶探针杂交。

在再一个实施方式中，可以使用构型，其中中间复合物包含靶探针、辅放大子和放大子。不使用单一靶探针使辅放大子与靶核酸结合，而是使用两个或两个以上靶探针使辅放大子与靶核酸结合。一般而言，这样的构型的优点可以使用两种靶探针来实现，即，使用一对靶探针使辅放大子与靶核酸结合。这样的构型及其用于增加灵敏度和减少背景的优点描述于例如美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688，及WO2007/001986、WO2007/002006、WO2013/134442和WO2013/152295。美国专利号7,709,198和美国公布2008/0038725和2009/0081688另外还描述了用于选择靶探针(包括靶探针对)的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等，如下文更详细讨论的。

本领域技术人员应该理解，许多合适样品中的任何一种都可以用于使用本发明的方法检测靶核酸。在本发明的方法中使用的样品将一般是生物学样品或组织样品。这样的样品可以得自生物学对象，包括从个体采集的生物学组织或体液来源的样品，或生物学材料的一些其它来源如活检样品。生物学样品也包括来自生物学对象的含有或怀疑含有宫颈病变、癌前期或癌细胞或组织的区域的样品，例如，组织活检、宫颈细胞涂片(Pap涂片)。这样的样品可以是但不限于从生物体如哺乳动物、特别是人分离的组织、组织碎片和/或细胞。在一个特定的实施方式中，组织切片是福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)。

样品或生物学样本可以通过用于处置生物学样品的多种常规方法中的任一种进行加工。例如，可以将细胞分离或加工例如作为组织薄切片或其它组织样本，包括固定细胞，例如用福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)组织、新鲜冷冻组织、白细胞等。用于加工宫颈样品的方法为本领域所熟知(参见Sellors和Sankaranarayanan，同上，2003)。用于加工组织或细胞样品进行原位杂交的方法为本领域技术人员所熟知(参见例如，Stoler,ClinicsinLaboratoryMedicine10(1):215-236(1990)；Insituhybridization.Apracticalapproach,Wilkinson编著,IRLPress,Oxford(1992)；Schwarzacher和Heslop-Harrison,Practicalinsituhybridization,BIOSScientificPublishersLtd,Oxford(2000)；)。用于加工样品进行宫颈组织包括组织活检和细胞学样品的分析的方法为本领域所熟知(参见例如，CecilTextbookofMedicine,Bennett和Plum编著,第20版,WBSaunders,Philadelphia(1996)；ColposcopyandTreatmentofCervicalIntraepithelialNeoplasia:ABeginner’sManual(宫颈上皮内瘤变的阴道镜检查和治疗：初学者手册),Sellors和Sankaranarayanan编著,InternationalAgencyforResearchonCancer,Lyon,France(2003)；Kalaf和Cooper,J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown和Trimble,BestPract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人,Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012)；CervicalCytologyPracticeGuidelinesTOC,ApprovedbytheAmericanSocietyofCytopathology(ASC)ExecutiveBoard,November10,2000))。

如本文所公开的，本发明的方法为检测相同样品中的多种靶核酸、特别是高危HPV亚型提供了一种方便测定方法。除了指导标记探针与酶或非酶标记的偶联以外，在另一个实施方式中，抗体可以用作中间物以标记靶核酸。用于同时检测两种DNA靶的方法(如双色显色ISH(CISH)测定)先前已有描述(US2011/033176)，其中将针对两个不同基因的探针与半抗原如地高辛(DIG)或二硝基苯(DNP)缀合。然后，使用与诸如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等不同酶缀合的抗DIG抗体和抗DNP抗体或其它合适的抗半抗原抗体来产生不同颜色的沉淀物。尽管该测定法允许两种靶标的显现，但是该显现使用一种抗体使酶与靶核酸结合来发生。这样的基于抗体的ISH测定能同样地适用于本发明的方法，如本文所公开的。

如本文所公开的，通过利用包含核酸的标记探针与靶核酸结合，通过使用适当的在计算机芯片上(insilico)寡核苷酸设计和通过选择和控制杂交条件，使用众所周知的方法，可以实现特异性和选择性的高水平。这样的系统可以对选择性和特异性进行最优化并且对核酸靶之间的非特异性结合最小化。

本发明另外还提供试剂盒，其包含进行本发明的方法的组分。在一个实施方式中，本发明提供用于检测如本文所公开的高危HPV亚型的试剂盒，包括针对HPV亚型的反义和有义探针。该试剂盒可以含有多种进行RNA原位杂交测定的试剂，包括经设计以与一种或多种HPV亚型杂交的至少一个探针组；和信号放大系统。一般而言，这样的试剂盒将在合适的容器中提供。任选地，该试剂盒可以还包含至少一个阴性对照探针组。在一个特定的实施方式中，该试剂盒含有多种用于进行如本文所公开的和先前描述的原位杂交测定如测定的试剂(美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688和WO2007/001986和WO2007/002006)。

这样的试剂盒除了包括以上描述的组分以外，还能够任选地包括例如标记探针、放大子、辅放大子、靶探针等。这样的组分可以设计为用于本文公开的构型中的任一种。本发明的试剂盒可以例如包含标记探针，标记探针包含相同标记或有区别的标记，如果标记包括酶、用于酶的合适的显色或发荧光底物，用于实现本发明的方法。该试剂盒可以含有非靶特异性组分，该组分可以用于检测任何期望靶核酸，用由试剂盒的用户分开设计的靶特异性结合组分，例如针对高危HPV亚型的探针，如本文所公开的。可选地，该试剂盒可以设计为含有包括一种或多种特定靶核酸如高危HPV亚型的结合剂的组分。该试剂盒可以另外包括使用试剂盒的组分以实现本发明的方法的说明书。

如本文所描述的，本发明的实施方式可以包括靶探针的用途。这样的构型及其用于增加灵敏度和减少背景的优点描述于例如美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688及WO2007/001986和WO2007/002006。美国专利号7,709,198和美国公布2008/0038725和2009/0081688另外还描述了用于选择靶探针(包括靶探针对)的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等。本领域技术人员能够基于7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688及WO2007/001986和WO2007/002006中的教导容易地鉴定合适的构型。在下面提供的描述中，基于本文中的公开内容和7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688及WO2007/001986和WO2007/002006中的教导，本领域技术人员将会理解如在这些参考文献中使用的和如下文所论述的术语“标记扩展子(labelextender)”可以与如本文所描述的术语“靶探针(targetprobe)”互换使用。

简而言之，实施方式的第一个大类包括检测两种或两种以上感兴趣核酸的方法。在该方法中，提供包含或怀疑包含感兴趣核酸的样品、m个标记扩展子(靶探针)的两个或两个以上子集(其中m为至少两个)和标记探针系统。m个标记扩展子的每一个子集能够与感兴趣核酸中的一个杂交。例如，感兴趣核酸可以是一种或多种高危HPV亚型。标记探针系统包含标记，且标记探针系统的组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交。每一个感兴趣核酸与m个标记扩展子的其相应子集杂交，并且标记探针系统与m个标记扩展子杂交。然后检测标记的存在与否。由于标记通过标记扩展子和标记探针系统的杂交与感兴趣核酸相关，所以标记的存在与否与感兴趣核酸的存在与否和因此在原始样品中相关联，标记探针系统能任选地包括辅放大子、放大多聚体(amplificationmultimer)和标记探针，其中辅放大子能够同时与m个标记扩展子中的至少两个和与多个放大多聚体杂交，和其中放大多聚体能够同时与辅放大子和与多个标记探针杂交。

如上所述，标记探针系统的组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交。典型地，与两个或两个以上标记扩展子杂交的标记探针系统的组分是放大多聚体或辅放大子。因此，在一个方面，标记探针系统包含放大多聚体或辅放大子，所述放大多聚体或辅放大子能够与至少两个标记扩展子杂交，并且标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和放大多聚体或辅放大子之间的复合物的解链温度T_m。杂交温度典型地为比Tm高约5℃或5℃以上，例如，比Tm高约7℃或7℃以上、约10℃或10℃以上、约12℃或12℃以上、约15℃或15℃以上、约17℃或17℃以上，或甚至约20℃或20℃以上。

每个标记扩展子典型地包含与相应感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1(在本文中也称为与靶核酸互补的T段)和与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2(在本文中也称为与标记探针系统互补的L段)。在实施方式的一个类别中，子集中的m个标记扩展子各自具有L-2的L-15'或者各自具有L-2的L-13'。L-2的长度可以变化。例如，序列L-2可以是长度20个核苷酸或少于20个核苷酸，例如，L-2可以是长度在9个和17个核苷酸之间或长度在12个和15个核苷酸之间或在13个和15个核苷酸之间。

实施方式的另一个大类提供使用标记扩展子构型检测一种或多种核酸的方法。在该方法中，提供包含或怀疑包含感兴趣核酸的样品、m个标记扩展子的一个或多个子集(其中m为至少两个)和标记探针系统。m个标记扩展子的每一个子集能够与感兴趣核酸中的一种杂交。标记探针系统包含标记，并且标记探针系统的组分(例如，辅放大子或放大多聚体)能够同时与子集中的m个标记扩展子中的至少两个杂交。每一个标记扩展子包含与相应感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1和与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，并且至少两个标记扩展子(例如，子集中的m个标记扩展子)各自具有L-2的L-15'或各自具有L-2的L-13'。

每一个感兴趣核酸与m个标记扩展子的其相应子集杂交，并且标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交。杂交温度可以大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm。由于标记通过标记扩展子和标记探针系统的杂交与感兴趣核酸相关，因此感兴趣核酸的存在与否可以被确定。

实施方式的又一大类提供在多重测定中捕获标记至第一感兴趣核酸的方法，其中两种或两种以上感兴趣核酸被检测。在该方法中，提供包含第一感兴趣核酸并且也包含或怀疑包含一种或多种其它感兴趣核酸的样品。也提供m个标记扩展子(其中m为至少两个)的第一子集和包含标记的标记探针系统。m个标记扩展子的第一子集能够与第一感兴趣核酸杂交，并且标记探针系统的组分能够同时与第一子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交。第一感兴趣核酸与m个标记扩展子的第一子集杂交，并且标记探针系统与m个标记扩展子杂交，从而捕获标记至第一感兴趣核酸。

实施方式的再一个大类提供捕获标记至感兴趣核酸的方法。在该方法中，提供m个标记扩展子，其中m为至少两个。m个标记扩展子能够与感兴趣核酸杂交。也提供包含标记的标记探针系统。标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的至少两个杂交。每一个标记扩展子包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1和与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，并且m个标记扩展子各自具有L-2的L-15'或其中m个标记扩展子各自具有L-2的L-13'。感兴趣核酸与m个标记扩展子杂交，并且标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交，从而捕获标记至感兴趣核酸。优选地，杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm。

“标记扩展子(labelextender)”或“LE”是能够与感兴趣核酸和与标记探针系统杂交的多核苷酸。这样的标记扩展子在本文中也称为靶探针。标记扩展子典型地具有与感兴趣核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列L-1和与标记探针系统的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列L-2(例如，L-2可以与放大多聚体、辅放大子、标记探针等的多核苷酸序列互补)。标记扩展子一般是单链的。

“标记探针系统(labelprobesystem)”包含统统包含标记和至少两个多核苷酸序列M-1的一个或多个多核苷酸，其各自能够与标记扩展子杂交。标记直接或间接地提供信号。多核苷酸序列M-1典型地与标记扩展子中的序列L-2互补。至少两个多核苷酸序列M-1任选地为完全相同的序列或不同序列。标记探针系统可以包括多个标记探针(例如，多个完全相同的标记探针)和放大多聚体；例如，它任选地也包括辅放大子等，或任选地包括仅标记探针。

“放大多聚体(amplificationmultimer)”是包含多个多核苷酸序列M-2、典型地(但不一定)是完全相同的多核苷酸序列M-2的多核苷酸。多核苷酸序列M-2与标记探针中的多核苷酸序列互补。放大多聚体也包括能够与标记扩展子或与核酸杂交的至少一个多核苷酸序列，该核酸与标记扩展子(例如，辅放大子)杂交。例如，放大多聚体任选地包括至少一个(且一般至少两个)多核苷酸序列M-1、任选完全相同的序列M-1；多核苷酸序列M-1典型地与标记扩展子的多核苷酸序列L-2互补。类似地，放大多聚体任选地包括与辅放大子中的多核苷酸序列互补的至少一个多核苷酸序列。放大多聚体可以为例如直链或支链核酸。如对所有多核苷酸注意到，放大多聚体可以包括修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间键合以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。合适的放大多聚体描述于例如美国专利号5,635,352、美国专利号5,124,246、美国专利号5,710,264、美国专利号5,849,481和美国专利号7,709,198。

信号放大始于LE与靶mRNA或DNA的结合。然后，放大多聚体典型地与LE杂交。放大多聚体一般具有与标记探针互补的序列的多个拷贝并且可以是支链核酸；例如，放大多聚体可以是支链、分叉的或梳子样核酸或直链核酸。标记(例如，酶或非酶标记)与每一个标记探针共价连接。

在前述实施方式中，放大多聚体和标记探针包含标记探针系统。在另一个实施方式中，标记探针系统也包含辅放大子，例如，如美国专利号5,635,352、美国专利号5,681,697和美国专利号7,709,198中所描述的，其进一步放大来自单一靶mRNA的信号。在再一个实例中，标记扩展子直接与标记探针杂交，并且不使用放大多聚体或辅放大子，所以来自单一靶mRNA或DNA分子的信号仅由与该mRNA或DNA杂交的区别标记扩展子的个数放大。

在其它方面，本发明提供可以用于同时检测两种或两种以上靶核酸的多重bDNA测定。类似地，本发明的一方面提供单一或多重bDNA测定，其降低了来自非特异性杂交事件的背景。

一般而言，在本发明的测定中，使用两个或两个以上标记扩展子来捕获标记探针系统的单一组分(例如，辅放大子或放大多聚体)。可以控制在单一LE和标记探针系统的组分之间的复合物(例如，辅放大子或放大多聚体)的测定温度和稳定性，使得单一LE与组分的结合不足以与LE所结合的核酸的组分稳定地相关，而两个或两个以上LE与组分的同时结合可捕获它到核酸。需要用于标记探针系统与感兴趣核酸相关的多个LE的这样的协同杂交导致高特异性和低背景，背景来自LE与其它非靶核酸的交叉杂交。

为了达到高特异性和高灵敏度的测定，它优选地具有低背景，例如由最小交叉杂交所致。在多重测定中，与单一测定相比，这样的低背景和最小交叉杂交通常实质上更难以达到，因为潜在非特异性相互作用的数目在多重测定中大大地增加，这是由于测定中使用的探针个数增加(例如，CEs和LE的更大数目)。需要用于标记探针系统捕获至靶核酸的多个同时LE-标记探针系统组分相互作用最小化非特异性捕获将发生的机会，甚至当一些非特异性CE-LE或LE-CP相互作用例如的确发生时。这种通过不希望交叉杂交事件的最小化在背景中的降低因此有利于感兴趣核酸的多重检测。

标记探针系统任选地包括放大多聚体和多个标记探针，其中放大多聚体能够与标记扩展子和与多个标记探针杂交。在另一个方面，标记探针系统包括辅放大子、多个放大多聚体和多个标记探针，其中辅放大子与标记扩展子杂交，并且放大多聚体与辅放大子和与多个标记探针杂交。作为另一个实例，标记探针系统可以包括仅标记探针，其直接与标记扩展子杂交。在实施方式的一个类别中，标记探针包含标记，例如，共价连接的标记。在其它的实施方式中，标记探针经构造以结合标记；例如，生物素化标记探针可以与链霉抗生物素蛋白相关标记结合，如本文所公开的。

每一个标记扩展子典型地包括与相应感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1和与标记探针系统的组分(例如，辅放大子或放大多聚体)中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2。显而易见的是，在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间重叠的数量(即，L-2和M-1的长度)影响在标记扩展子和组分之间的复合物的Tm，例如，如序列L-2和M-1的GC碱基含量。任选地，所有标记扩展子具有相同长度序列L-2和/或完全相同的多核苷酸序列L-2。可选地，不同标记扩展子可以具有不同长度和/或序列多核苷酸序列L-2。也是显而易见的，稳定捕获组分至感兴趣核酸所需要的标记扩展子的数目部分地取决于在标记扩展子和组分之间重叠的数量(即，L-2和M-1的长度)并且可以容易地由本领域技术人员来确定。

可以达到标记探针系统的组分被至少两个标记扩展子的稳定捕获，例如，在使外部核酸的捕获最小化的同时，例如，通过平衡与组分结合的标记扩展子的数目、在标记扩展子和组分之间重叠的数量(L-2和M-1的长度)和/或在使标记扩展子和组分杂交条件下的条件严格性。在标记扩展子和标记探针系统的组分之间的互补性的量、与组分结合的标记扩展子的数目和杂交的严格性的适当组合可以例如由本领域技术人员经实验确定。例如，可以选择标记扩展子的特定数目和杂交条件的特定集合，尽管在标记扩展子和组分之间的互补性的核苷酸的数目变化，直到标记扩展子与核酸的杂交捕获组分至核酸，与此同时单一标记扩展子的杂交没有有效地捕获组分。严格性可以例如通过控制甲酰胺浓度、离液盐浓度、盐浓度、pH、有机溶剂含量和/或杂交温度来控制。

注意到，任何核酸双链体的Tm可以使用本领域众所周知的技术直接测量。例如，对于双链体可以获得热变性曲线，其中点相当于Tm。显而易见的是，这样的变性曲线可以在基本上具有任何有关pH、盐浓度、溶剂含量等的条件下获得。

典型地，标记探针系统的组分(例如，放大多聚体或辅放大子)能够同时与子集中的m个标记扩展子中的两个杂交，尽管它任选地与标记扩展子中的三个、四个或四个以上杂交。在实施方式(例如，其中两个(或两个以上)标记扩展子与标记探针系统的组分结合的实施方式)的一个类别中，序列L-2为长度20个核苷酸或少于20个核苷酸。例如，L-2可以是长度在9个和17个核苷酸之间，例如，长度在12个和15个核苷酸之间、长度在13个和15个核苷酸之间或长度在13个和14个核苷酸之间。注意到，m为至少两个，并且可以为至少三个、至少五个、至少10个或更多个。m可以与标记扩展子的子集与子集(subsettosubset)相同或不同。

标记扩展子可以以多种方式中的任一种构造。例如，与标记探针系统的组分杂交的两个标记扩展子可以假定十字排列，其中一个标记扩展子具有L-2的L-15'，而另一个标记扩展子具有L-2的L-13'。其中两个标记扩展子的5'或3'末端与核酸杂交而另一末端与组分结合的构型，产生比标记扩展子的十字排列更强的组分与核酸的结合。因此，在实施方式的一个类别中，至少两个标记扩展子(例如，子集中的m个标记扩展子)各自具有L-2的L-15'或各自具有L-2的L-13'。例如，与感兴趣核酸杂交的L-1，可以是在每一个标记扩展子的5'末端，而与标记探针系统的组分杂交的L-2，是在每一个标记扩展子的3'末端(或反之亦然)。L-1和L-2任选地被另外的序列分隔开。在一个示例性的实施方式中，L-1位于标记扩展子的5'末端且为长度约20-30个核苷酸，并且L-2位于标记扩展子的3'末端且为长度约13-14个核苷酸，并且L-1和L-2被间隔序列(例如，5个T)分隔开。

如本文所公开的本发明的方法也可以用以下描述的另外的实施方式来进行。这样的方法的步骤可以包括例如提供包含细胞的样品，该细胞包含或怀疑包含一种或多种核酸靶，例如，包含宫颈组织或宫颈细胞的样品；为各核酸靶提供包含标记的标记探针系统；为各核酸靶提供包含两个或两个以上不同标记扩展子的标记扩展子系统，其中两个或两个以上标记扩展子中的每一个都包含与核酸靶上的片段互补的片段T和与标记探针系统的组分上的片段互补的片段L，和其中T段与核酸靶的非重叠区域互补，并且L段与标记探针系统的组分的非重叠区域互补；在该细胞中，使标记扩展子系统与核酸靶杂交，当在该细胞中存在时，从而提供两个或两个以上不同标记扩展子与核酸靶分子的单拷贝的杂交；在该细胞中和在细胞的非靶核酸的存在下，捕获标记探针系统至与核酸靶分子杂交的标记扩展子系统，从而捕获标记至核酸靶，其中通过至少两个不同标记扩展子与与标记扩展子互补的标记探针系统的组分的单个分子同时杂交而发生捕获；和检测来自标记的信号。

一个实施方式可以包括至少两个不同标记扩展子与与标记扩展子互补的标记探针系统的组分的单个分子在杂交温度下杂交，杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分(例如，标记探针、放大子或辅放大子)之间的复合物的解链温度Tm。在另一个实施方式中，至少两个不同标记扩展子与核酸靶上的相邻片段杂交。另外，两个或两个以上标记扩展子与核酸靶的单个分子杂交可以在杂交温度下进行，杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和核酸靶之间的复合物的解链温度Tm。另一个实施方式可以进一步包含提供能够与未被标记扩展子占据的核酸靶的区域杂交的一种或多种封闭探针。在又一个实施方式中，各杂交或捕获步骤对所有核酸靶来说在相同时间完成。在一个进一步实施方式中，一种或多种核酸靶可以包含参考核酸，和其中所述方法包括使一种或多种核酸靶的信号归一化至参考核酸的信号。再一个进一步实施方式可以包含使各核酸靶的信号强度与该细胞中存在的相应核酸靶的数量相联系的步骤。

在一个特定的实施方式中，每一个标记扩展子都是呈“Z”构型，其中Z构型包含在5’末端的标记扩展子的T段(与靶核酸结合)和在3’末端的标记扩展子的L段(与标记探针系统结合)，或在3’末端的标记扩展子的T段和在5’末端的标记扩展子的L段。在另一个实施方式中，标记探针系统包含(A)(i)包含一种或多种标记的标记探针，或(B)(i)一种或多种标记探针和(ii)能够与标记探针中的一种或多种杂交的放大子，或(C)(i)一种或多种标记探针，(ii)一个或多个放大子，和(iii)能够与放大子中的一个或多个杂交的辅放大子。在一个进一步实施方式中，捕获标记至核酸靶分子，即通过标记探针与与核酸靶分子杂交的至少两个不同标记扩展子的杂交。在再一个进一步实施方式中，捕获标记至核酸靶分子，即通过一种或多种标记探针与放大子分子的杂交，放大子分子与至少两个不同标记扩展子杂交，至少两个不同标记扩展子与核酸靶分子杂交。在再一个实施方式中，捕获标记至核酸靶分子，即通过一个或多个标记探针与一个或多个放大子的杂交，放大子与辅放大子分子杂交，辅放大子分子与至少两个不同标记扩展子杂交，至少两个不同标记扩展子与核酸靶分子杂交。在一个再进一步实施方式中，为各靶核酸提供多个标记探针系统，和其中两个或两个以上标记探针系统通过使用包含两个或两个以上不同标记扩展子的标记扩展子系统捕获至靶核酸，和其中标记扩展子系统中的每一个标记扩展子包含与核酸靶的非重叠区域互补的T段。在再一个实施方式中，三个或三个以上标记探针系统通过标记扩展子系统捕获至靶核酸。

本发明的方法可以另外包括如下描述的更多方面。例如，该方法可进一步包括检测一种或多种感兴趣核酸的方法，该方法包括：a)提供包含或怀疑包含一种或多种感兴趣核酸的样品；b)使用本文公开的方法标记该样品中存在的那些感兴趣核酸；c)提供m个标记扩展子(其中m为至少两个)的一个或多个子集，其中m个标记扩展子的每一个子集能够与感兴趣核酸中的一种杂交；d)提供包含标记的标记探针系统，其中标记探针系统的组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交，其中至少两个标记扩展子中的每一个包含与相应感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1并且包含与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，其中至少两个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或L-2的L-13'，和其中子集中的m个标记扩展子与相应感兴趣核酸中的非重叠序列互补；e)使捕获的任何感兴趣核酸与m个标记扩展子的其相应子集杂交；f)使标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm；和g)检测靶核酸上的标记的存在与否。

在一个特定的实施方式中，标记探针系统包含辅放大子、放大多聚体和标记探针；其中辅放大子能够同时与m个标记扩展子的至少两个和与多个放大多聚体杂交；其中放大多聚体能够同时与辅放大子和与多个标记探针杂交；和其中标记探针包含标记。在另一个实施方式中，一种或多种感兴趣核酸包含两种或两种以上不同感兴趣核酸，所述不同感兴趣核酸是不同核酸分子，和其中m个标记扩展子的一个或多个子集包含m个标记扩展子的两个或两个以上不同子集。在一个特定的实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体或辅放大子，所述放大多聚体或辅放大子能够与至少两个标记扩展子杂交。

在一个实施方式中，杂交温度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的Tm高约5℃或5℃以上。可选地，杂交温度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的Tm高约7℃或7℃以上、约10℃或10℃以上、约12℃或12℃以上、约15℃或15℃以上、约17℃或17℃以上或约20℃或20℃以上。在另一个实施方式中，多核苷酸序列L-2为长度20个核苷酸或少于20个核苷酸。可选地，L-2为长度在9个和17个核苷酸之间。可选地，L-2为长度在13个和15个核苷酸之间。

在另一个实施方式中，至少两个标记扩展子的每一个具有在其5'末端的L-1和在其3'末端的L-2。在又一个实施方式中，至少两个标记扩展子的每一个具有在其3'末端的L-1和在其5'末端的L-2。在又一个实施方式中，子集中的m个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或全都具有L-2的L-13'。在另一个实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体和标记探针；其中放大多聚体能够同时与m个标记扩展子的至少两个和与多个标记探针杂交；和其中标记探针包含标记。在另一个实施方式中，标记探针系统包含标记探针；其中标记探针能够同时与m个标记扩展子的至少两个杂交；和其中标记探针包含标记。在另一个实施方式中，标记探针系统的组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的两个杂交。

本发明的方法可进一步涵盖捕获标记至感兴趣核酸，即通过a)提供m个标记扩展子，其中m为至少两个，其中m个标记扩展子能够与感兴趣核酸中的非重叠序列杂交；b)提供包含标记的标记探针系统，其中标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的至少两个杂交，其中至少两个标记扩展子中的每一个包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1并且包含与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，和其中至少两个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或全都具有L-2的L-13'；c)使感兴趣核酸与m个标记扩展子杂交；和d)使标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm，从而捕获标记至感兴趣核酸。

在一个实施方式中，m个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或全都具有L-2的L-13'。在一个实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体或辅放大子，所述放大多聚体或辅放大子能够与m个标记扩展子的至少两个杂交。在一个实施方式中，标记探针系统包含辅放大子、放大多聚体和标记探针；其中辅放大子能够同时与m个标记扩展子中的至少两个和与多个放大多聚体杂交；其中放大多聚体能够同时与辅放大子和与多个标记探针杂交；和其中标记探针包含标记。在一个实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体和标记探针；其中放大多聚体能够同时与m个标记扩展子中的至少两个和与多个标记探针杂交；和其中标记探针包含标记。在一个实施方式中，标记探针系统包含标记探针；其中标记探针能够同时与m个标记扩展子中的至少两个杂交；和其中标记探针包含标记。在一个实施方式中，标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的两个杂交。在一个实施方式中，杂交温度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的Tm高约5℃或5℃以上。在一个实施方式中，杂交温度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的Tm高约7℃或7℃以上、约10℃或10℃以上、约12℃或12℃以上、约15℃或15℃以上、约17℃或17℃以上或约20℃或20℃以上。在一个实施方式中，多核苷酸序列L-2为长度20个核苷酸或少于20个核苷酸。在一个实施方式中，L-2为长度在9个和17个核苷酸之间。在一个实施方式中，L-2为长度在13个和15个核苷酸之间。在一个实施方式中，至少两个标记扩展子中的每一个都具有在其5'末端的L-1和在其3'末端的L-2。在一个实施方式中，至少两个标记扩展子中的每一个都具有在其3'末端的L-1和在其5'末端的L-2。

一个进一步实施方式可以包括检测一种或多种感兴趣核酸的方法，即通过a)提供包含一种或多种感兴趣核酸的样品；b)使用本文公开的方法标记感兴趣核酸；c)提供包含标记的标记探针系统；d)对于感兴趣核酸中的每一种，提供m个标记扩展子的子集，其中m为至少两个，其中m个标记扩展子的子集能够与该感兴趣核酸杂交，其中标记探针系统的组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交，其中至少两个标记扩展子中的每一个都包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1并且包含与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，和其中至少两个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或全都具有L-2的L-13'；e)使每一种感兴趣核酸与m个标记扩展子的其相应子集杂交；f)使标记探针系统与标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm，凭此，对于感兴趣核酸中的每一种，至少两个标记扩展子中的每一个的单拷贝同时与感兴趣核酸的单拷贝和与标记探针系统的组分的单拷贝杂交；和g)检测靶核酸上的标记的存在与否。

在再一个实施方式中，方法可以包括捕获标记至感兴趣核酸，即通过a)提供m个标记扩展子，其中m为至少两个，其中m个标记扩展子能够与感兴趣核酸杂交；b)提供包含标记的标记探针系统，其中标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的至少两个杂交，其中至少两个标记扩展子中的每一个包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1并且包含与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2，和其中至少两个标记扩展子全都具有L-2的L-15'或全都具有L-2的L-13'；c)使感兴趣核酸与m个标记扩展子杂交；和d)使标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm，凭此至少两个标记扩展子中的每一个的单拷贝同时与感兴趣核酸的单拷贝和与标记探针系统的组分的单拷贝杂交，从而捕获标记至感兴趣核酸。

应当理解，在本文提供的本发明的定义中也提供了不实质上影响本发明的各种实施方式的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而不是限制本发明。

实施例I

Caski细胞中的HPV检测

本实施例描述了Caski细胞中HPV核酸的检测。

基于技术(AdvancedCellDiagnostics)开发RNA原位杂交(ISH)测定以检测HR-HPV的E6和E7致癌基因的mRNA(Bishop等人,Am.J.Surg.Pathol.36:1874-1882(2012)；Schache等人,Br.J.Cancer108:1332-1339(2013)；Ukpo等人,Am.J.Surg.Pathol.35:1343-1350(2011)；Wang等人,J.Mol.Diagn.14:22–29(2012))。在该测定中，观察到常见的核染色核染色，这可能是源于HPV感染的细胞中的DNA。为了调查这件事情，使用靶向E6和E7基因的探针，在已知携带HPV16的宫颈癌细胞系Caski上进行了ISH测定。使用两种类型的探针：与E6和E7mRNA互补的标准反义探针和靶向相同区域但在与E6/E7mRNA相同意义中的有义探针(探针组在商业上可获自AdvancedCellDiagnostics)。换句话说，反义探针能与E6和E7mRNA和具有与mRNA相同的意义的DNA链杂交。因此，将有义探针设计为仅仅检测HPVDNA，而反义探针能既检测mRNA又检测DNA。此外，来自有义探针的信号应该是DNase敏感的，而来自反义探针的信号应该是部分敏感的：DNA信号应该由于DNase处理被消灭/削弱，但是mRNA来源的信号应该保留下来。这些预期结果在Caski细胞中观察到(图1)。

图1显示培养的Caski细胞的福尔马林固定石蜡包埋蜡块的系列切片。Caski细胞对于编码遍在蛋白的UBC(内源RNA对照)(左栏)、针对HPV16E6/E7mRNA的反义探针(中栏)和针对HPV16E6/E7DNA的有义探针(右栏)染色。上面一排显示标准条件(无DNase)。在下面一排，切片用DNase预处理后与HPV探针杂交。染色信号呈棕褐色(DAB)，细胞核用苏木精染色(蓝色)。

因此，本实验证明靶向HPVE6/E7mRNA测定的标准反义探针确实能够同时检测HPVDNA和mRNA。本实验也证明应用有义探针作为用于区别DNA-和RNA-来源的信号的方法的能力。

这些结果证明检测HPV核酸的探针可以用于同时检测细胞中的HPVDNA和mRNA。

实施例II

宫颈组织样品中的HPV检测

本实施例描述了宫颈组织样品中HPV核酸的检测。

已知高危型HPVE6/E7mRNA在高级别CIN病变(CIN2+)中被上调但在低级别病变(CIN1)中没有上调(Lie和Kristensen,ExpertRev.Mol.Diagn.8:405–415(2008))。基本上如实施例I中所描述的方法在宫颈组织样品上进行原位杂交测定。简而言之，通过100％二甲苯和乙醇洗涤将5微米厚度载玻片固定的切片脱石蜡。然后，组织用市售的缓冲液(AdvancedCellDiagnostics)进行系列处理：预处理1溶液(内源氢过氧化物酶用预处理1溶液在室温下封闭10分钟)；预处理2(100℃，在预处理2溶液中浸没15分钟)；和预处理3(蛋白酶消化，40℃达30分钟)；在每一个预处理步骤之后进行用水漂洗。然后，组织在HR18HPV杂交溶液中(无需盖玻片)在HybEZOven(AdvancedCellDiagnostics,Hayward,CA)中于40℃杂交2小时。在洗涤缓冲液步骤之后，通过以下的系列应用进行杂交后的探针的信号放大：Amp1(辅放大子步骤)、Amp2(信号增强子步骤)、Amp3(放大子步骤)、Amp4(标记探针步骤)、Amp5和Amp6(信号放大步骤)；在每一个Amp步骤之后进行洗涤缓冲液步骤。然后，HRP活性通过在环境温度下将3,3'-二氨基联苯胺(DAB)应用10分钟来证明。然后，切片用苏木精复染色，通过分等级的乙醇(50％、70％和100％)和二甲苯脱水，然后用CytosealXYL(ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA)封固。

图2显示正常宫颈和不同组织学级别的HPV相关宫颈病变中的HPVE6/E7染色图案。使用针对18种亚型(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82)的一组探针，将宫颈活检样品对于高危型HPVE6/E7染色。正常宫颈对于高危型HPV呈完全阴性。注意到CIN1在宫颈上皮层的上1/3中具有强染色，但是其染色图案与CIN3的不相同，在整个上皮，信号似乎为细棕褐色颗粒。一些CIN2表现出如图所示的中间图案。染色信号呈棕褐色(DAB)，并且细胞核用苏木精染色(蓝色)。

出乎意料的是，所检测的HPVE6/E7mRNA测定在CIN1和CIN2+病变中测得了强烈的信号(图2)。然而，CIN1、CIN2和CIN3病变中的信号图案明显不同。在CIN1中，在许多细胞中但仅在上皮的浅表层中存在扩散完全核染色，而在CIN3中，主要在累及多数上皮的细胞质中，染色似乎为细颗粒。在一些CIN2病变中，观察到杂种信号图案；在靠下方的上皮中，在浅表层和细胞质信号中有强烈完全核染色。在CIN1中，出乎意料的强染色预期是来自HPVDNA，这与在Caski细胞中观察的类似(图1)。扩散核信号可能代表在病毒生活周期的繁殖期中产生的病毒DNA，这在HPV基因组扩增之后，但在病毒衣壳从宿主细胞释放之前。因此，CIN1E6/E7染色图案似乎代表瞬时HPV感染，而CIN3E6/E7图案似乎代表持续HPV感染。

为了确定信号的性质，使用有义探针和DNase/RNase处理来确认CIN1和CIN2病变中的扩散核信号是来自与HPVDNA杂交的反义探针。在图3中，CIN2病变的系列切片用针对HR-HPV的有义或反义E6/E7探针染色。图3显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。染色信号呈棕褐色(DAB)，并且细胞核用苏木精染色(蓝色)。

常规反义探针检测到“杂种”信号图案，其中在浅表层中均具有强烈扩散核染色(图3，指向左边的箭头)和在细胞质和细胞核中均具有细颗粒染色(图3，指向右边的箭头)。然而，有义探针仅检测到上皮靠上方部位中的强烈核染色，这似乎与用反义探针在病变的相同区域中见到的惊人相似。这些数据提供了用反义探针见到的CIN1和CIN2病变中的扩散核染色可能来自HPVDNA的初步支持，也借助其通过有义探针的检测。

在一个独立的实验中，用DNase和RNase来进一步确认CIN2病变中所观察到的信号的DNA或RNA性质。图4显示用反义和有义探针的染色结果。图4显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。顶上图是20x透镜；靠下方的图是40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)，并且细胞核用苏木精染色(蓝色)。

在上皮的顶上浅表层中用两种探针观察到强烈扩散核染色(图4，指向左边的箭头)。反义探针也检测到基底层中的另外的细胞质染色，这可以在更高放大倍数(40X)下更清晰地见到(图4，指向右边的箭头)。

图5显示与图3中用RNase预处理，然后用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色相同的CIN2病变。顶上图是20x透镜；靠下方的图是40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)，并且细胞核用苏木精染色(蓝色)。用反义或有义探针，在上层中，用RNase预处理对强烈完全核染色无影响，但是使用反义探针，在基底层中，所观察到的较弱的细颗粒细胞质信号的确被消灭，因此证实了后者信号的RNA性质(图5)。

图6显示与图3中用DNase预处理，然后用有义HPV探针染色相同的CIN2病变。左图是20x透镜；右图是40X透镜。信号呈棕褐色(DAB)，并且细胞核用苏木精染色(蓝色)。用DNase预处理引起在上层中用有义探针所观察到的扩散染色细胞的数目显著减少(图6)。剩余的信号多半是由于不完全DNase消化。DNase处理实验与有义探针的应用合在一起证实了该病变上层中的强烈完全核信号是来自HPVDNA。

在ISH测定中通过有义探针所检测的信号图案与先前使用常规DNA原位杂交技术报道的信号图案相类似(DeMarchiTriglia等人,Gynecol.Oncol.112(1),114–118(2009)；Evans等人,Mod.Pathol.15:1339–1347(2002))。然而，用相同探针同时检测HPVDNA和RNA二者尚未见报道。

这些结果证明HPV核酸(DNA和mRNA二者)的检测可以在同一测定中同时被检测并且可以用于将宫颈组织样品分层和分类。

在本申请中，引用了多种不同的出版物。这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入本申请中作为参考以便更全面地描述本发明所属领域的现有状态。虽然本发明已经参照以上提供的实施例进行了描述，但是应当理解，在不偏离本发明的精神的情况下，可以作出各种修改。

Claims (37)

1.将宫颈组织样品分类的方法，包括：

(a)使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；

(b)检测HPV核酸的存在；和

(c)将该宫颈组织样品分类，

其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态，

其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续状态，或

其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。

2.权利要求1的方法，其中所述瞬时状态相当于瞬时HPV感染状态。

3.权利要求1的方法，其中所述持续状态相当于持续HPV感染状态。

4.权利要求1的方法，其中所述过渡状态相当于过渡HPV感染状态，其具有增加的过渡到持续HPV感染状态的可能性。

5.权利要求1的方法，其中仅在宫颈组织样品的上皮的浅表层中HPVDNA的检测指示低级别病变。

6.权利要求1的方法，其中在宫颈组织样品的上皮的中间层和基底层中HPVRNA的检测指示高级别病变。

7.权利要求1的方法，其中在宫颈组织样品的上皮的基底层或中间层中HPVRNA和在宫颈组织样品的上皮的浅表层中HPVDNA的检测指示高级别病变。

8.权利要求1的方法，其中HPVRNA的检测指示高级别病变。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPVDNA和HPVRNA。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

12.将宫颈细胞学样品分类的方法，包括：

(a)使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；

(b)检测HPV核酸的存在；和

(c)将该宫颈细胞学样品分类，

其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬时HPV感染状态，或

其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该细胞中的持续HPV感染状态。

13.权利要求12的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中HPV核酸的仅扩散核染色的存在指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。

14.权利要求12的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该样品相当于持续HPV感染状态。

15.权利要求12的方法，其中在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在指示过渡到持续HPV感染状态的可能性。

16.权利要求12-15中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPVDNA和HPVRNA。

17.权利要求12-16中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。

18.权利要求12-17中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

19.基于宫颈组织样品的分析确定患者结果的预后的方法，包括：

(a)使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；

(b)检测HPV核酸的存在；和

(c)将该宫颈组织样品分类，

其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时HPV感染状态，

其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续HPV感染状态，或

其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡HPV感染状态。

20.权利要求19的方法，其中瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可能性。

21.权利要求19的方法，其中持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。

22.权利要求19的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感染状态的可能性。

23.权利要求22的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。

24.权利要求19-23中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPVDNA和HPVRNA。

25.权利要求19-24中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。

26.权利要求19-25中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。

27.基于宫颈细胞学样品的分析确定患者结果的预后的方法，包括：

(a)使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA；

(b)检测HPV核酸的存在；和

(c)将该宫颈细胞学样品分类，

其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬时HPV感染状态，或

其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该细胞中的持续HPV感染状态。

28.权利要求27的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中HPV核酸的仅扩散核染色的存在指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。

29.权利要求27的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该样品相当于持续HPV感染状态。

30.权利要求27的方法，其中在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在指示过渡到持续HPV感染状态的可能性。

31.权利要求27的方法，其中瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可能性。

32.权利要求27的方法，其中持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。

33.权利要求27的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感染状态的可能性。

34.权利要求33的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能性。

35.权利要求27-34中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPVDNA和HPVRNA。

36.权利要求27-35中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多种。

37.权利要求27-36中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使双链DNA变性。