CN109554505B - 一组检测hpv高危型和中危型核酸的探针及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

一组检测hpv高危型和中危型核酸的探针及其检测试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针，如SEQ ID NO:1‑28所示序列中的至少一条。为放大荧光信号，本发明的探针组还可包含桥连探针。本发明还公开了探针在检测HPV高危型和中危型核酸中的应用和检测试剂盒。试剂盒中的预杂交液由Tris、Tween‑20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween‑20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；洗涤液由Tris、Tween‑20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成。本发明的探针在检测多重基因型别时可减少探针的数量，实现同时检测HPV高危型和中危型中的任意一种或多种基因型别，且具较高的灵敏性。

Description

一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针及其检测试剂盒和 应用
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针及其检测试剂盒和应用。
背景技术
HPV感染是宫颈癌发病的主要原因，但并不是所有HPV感染都能诱发宫颈癌病变，只有在感染高危型HPV，且一直处于活跃状态的HPV，才能有机会诱发宫颈癌的病变。所以检测活跃期、高危型的HPV具有较大的临床意义。
FISH-Flow是将荧光原位杂交和流式细胞相结合的一种技术，可同时检测细胞基因和蛋白的表达。相比实时荧光定量PCR，不需对细胞进行核酸提取，减少人员操作造成的误差。
探针是FISH-Flow检测的重要工具，根据碱基互补配对原则，合成长约20nt与之相互补的寡核苷酸序列作为探针。
现有的针对高危型HPV探针的设计，基本上是在相同区域设计通用探针，如果通用探针不能覆盖全部基因型别时，则对单个基因型别单独设计探针。根据WHO国际癌症研究机构，HPV需检测13种高风险基因型别(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和5种中风险基因型别(HPV26、53、66、73、82)。经序列比对结果，18种基因型别的重叠区域较少，这可能需要设计数十条或上百条的探针，易造成因探针之间相结合而失去探针的作用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针。该探针组能实现同时检测HPV13种高风险基因型别HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和5种中风险基因型别HPV26、53、66、73、82中的任意基因型别。
本发明的第一个目的是提供了一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针，其探针如SEQ ID NO:1-28所示序列中的至少一条。SEQ ID NO:1-28所示序列具体如下：
HPV-1:5’-ACGTGTTCTTGATGATCTGC-3’
HPV-2:5’-TAGAGATCAGTTGTCTCTGG-3’
HPV-3:5’-TGTAGAGTCACACTTRCAACA-3’
HPV-4:5’-TGTGTGCTTTGTACGCACAA-3’
HPV-5:5’-GGTCTTCCAAAGTACGAATG-3’
HPV-6:5’-ATTCCTAGTGTGCCCATTAA-3’
HPV-7:5’-TGTCGCTTAATTGCTCRTGAC-3’
HPV-8:5’-CCTCCCACACCACGGACACACAAAGGACAGTGGGAGG-3’
HPV-9:5’-GGACACAGCGCCCTGTCCAACGAC-3’
HPV-10:5’-TAGATGTTTGTCTCCAGTCCGACACCCACGACACTGTCG-3’
HPV-11:5’-TCTTGCAATGTTGCCTTAGGTTTTTGCATTCAACGCATTTCAATTC-3’
HPV-12:5’-CTTTGCTTTTTGTCCAAATGTCACATAACTGTTTTTTAGTTA-3’
HPV-13:5’-TCCTCTGGGTCCTGAAACATTGCAGT-3’
HPV-14:5’-TCCAACGCCTGACACAAATCTGGTARCTTTCTGGGTCGC-3’
HPV-15:5’-TGYTGTTCTAATGTTTCTCCATACAGTGAATA-3’
HPV-16:5’-AGGTCTYTGACAGGTAATACACCTAATTAATA-3’
HPV-17:5’-ACAAGACATACATCGMCCGGTCCAACGACC-3’
HPV-18:5’-GTATTGTAATGGGCTCTGTCCG-3’
HPV-19:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTCTGACATCTATGACACCTTATTAAC-3’
HPV-20:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTGCTGGTCACGCATATTATCTAC-3’
HPV-21:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTACACTATTCKTAAATCTGTAAATAGAAAG-3’
HPV-22:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCAGTAACTGTTGCTTGCAATATACACAGGT-3’
HPV-23:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATTTGGGTCACAGGTCGGGGTCTC-3’
HPV-24:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCACAGCTGGGGCACACAACAC-3’
HPV-25:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCTGTGGCCGCTTGTGCTTGTCCA-3’
HPV-26:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCACCGTGTACAGCGCCCTGTCCA-3’
HPV-27:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTAGATTACACTTGGGTTTCTCTACGT-3’
HPV-28:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTATGGTTTTCTGCATTTTCCGCACCT-3’
优选的，所述探针的两端均用FAM标记。
所述如SEQ ID NO:19-28所示序列的探针为桥连探针，除了起到检测的作用外还能起到信号放大的作用。具体来说，以上HPV19、20、21、22、23、24、25、26、27、28均属于桥连探针，CTGGTCGGCTGGTCGG与CCGACCAGCCGACCAG为接头；当在检测某种基因型别时，混合探针中不能和靶基因直接结合的多余探针，可通过桥连探针，使能结合上靶基因的探针荧光信号放大，增加其探针的敏感性。
本发明的第二个目的是提供了上述探针在检测HPV高危型和中危型核酸中的应用。
本发明的第三个目的是提供了一种检测HPV高危型和中危型核酸的试剂盒，所述试剂盒含有链霉亲和素标记的微球、预杂交液、杂交液、洗涤液和上述探针。这种试剂盒是在分子水平检测的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供了一种检测HPV高危型和中危型核酸的试剂盒，所述试剂盒含有体积百分比浓度为4％的多聚甲醛的固定液、体积百分比浓度为1％的TritonX-100的通透液、预杂交液、杂交液、洗涤液和序列如SEQ ID NO:1-28所示的探针，上述探针是双FAM标记的探针。这种试剂盒是在细胞水平检测的试剂盒。
优选的，上述两种试剂盒中的预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的PH值为8.5-9.2。
优选的，上述两种试剂盒中的述杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述杂交液的PH值为8.5-9.2。
优选的，上述两种试剂盒中的述洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的PH值为8.5-9.2。
本发明的探针针对HPV高危型和中危型核酸设计的探针，其中包含桥连探针。在检测某一基因型别时，不能与靶基因直接结合的探针可通过桥连探针与靶基因相结合的探针结合，使之荧光信号放大。利用这种设计的探针，在检测多重基因型别时可减少探针设计的数量，实现同时检测HPV13种高危型和5种中危型中的任意一种或多种基因型别，且具有较高的检测灵敏性。
附图说明
图1为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的阴性对照流式柱状图；
图2为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV16基因型别流式柱状图；
图3为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV18基因型别流式柱状图；
图4为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV26基因型别流式柱状图；
图5为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV31基因型别流式柱状图；
图6为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV33基因型别流式柱状图；
图7为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别的阴性对照的流式细胞柱状图；
图8为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别的阴性对照的流式细胞柱状图；
图9为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV16型的流式细胞柱状图；
图10为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV16型的流式细胞柱状图；
图11为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV18型的流式细胞柱状图；
图12为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV18型的流式细胞柱状图；
图13为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV33型的流式细胞柱状图；
图14为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV33型的流式细胞柱状图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域中常规实验方法进行。
实施例1本发明的一种检测HPV高危型和中危型核酸分子水平检测的试剂盒的一个优选实施例
本实施例的试剂盒含有HPV双FAM标记的探针、链霉亲和素标记的微球、预杂交液、杂交液、洗涤液和探针。
其中，探针为检测HPV高危型和中危型核酸的探针，其探针如SEQ ID NO:1-28所示序列中的至少一条。SEQ ID NO:1-28所示序列具体如下：
HPV-1:5’-ACGTGTTCTTGATGATCTGC-3’
HPV-2:5’-TAGAGATCAGTTGTCTCTGG-3’
HPV-3:5’-TGTAGAGTCACACTTRCAACA-3’
HPV-4:5’-TGTGTGCTTTGTACGCACAA-3’
HPV-5:5’-GGTCTTCCAAAGTACGAATG-3’
HPV-6:5’-ATTCCTAGTGTGCCCATTAA-3’
HPV-7:5’-TGTCGCTTAATTGCTCRTGAC-3’
HPV-8:5’-CCTCCCACACCACGGACACACAAAGGACAGTGGGAGG-3’
HPV-9:5’-GGACACAGCGCCCTGTCCAACGAC-3’
HPV-10:5’-TAGATGTTTGTCTCCAGTCCGACACCCACGACACTGTCG-3’
HPV-11:5’-TCTTGCAATGTTGCCTTAGGTTTTTGCATTCAACGCATTTCAATTC-3’
HPV-12:5’-CTTTGCTTTTTGTCCAAATGTCACATAACTGTTTTTTAGTTA-3’
HPV-13:5’-TCCTCTGGGTCCTGAAACATTGCAGT-3’
HPV-14:5’-TCCAACGCCTGACACAAATCTGGTARCTTTCTGGGTCGC-3’
HPV-15:5’-TGYTGTTCTAATGTTTCTCCATACAGTGAATA-3’
HPV-16:5’-AGGTCTYTGACAGGTAATACACCTAATTAATA-3’
HPV-17:5’-ACAAGACATACATCGMCCGGTCCAACGACC-3’
HPV-18:5’-GTATTGTAATGGGCTCTGTCCG-3’
HPV-19:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTCTGACATCTATGACACCTTATTAAC-3’
HPV-20:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTGCTGGTCACGCATATTATCTAC-3’
HPV-21:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTACACTATTCKTAAATCTGTAAATAGAAAG-3’
HPV-22:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCAGTAACTGTTGCTTGCAATATACACAGGT-3’
HPV-23:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATTTGGGTCACAGGTCGGGGTCTC-3’
HPV-24:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCACAGCTGGGGCACACAACAC-3’
HPV-25:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCTGTGGCCGCTTGTGCTTGTCCA-3’
HPV-26:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCACCGTGTACAGCGCCCTGTCCA-3’
HPV-27:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTAGATTACACTTGGGTTTCTCTACGT-3’
HPV-28:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTATGGTTTTCTGCATTTTCCGCACCT-3’
所述探针的两端均用FAM标记。如SEQ ID NO:19-28所示序列的探针为桥连探针，除了起到检测的作用外还能起到信号放大的作用。具体来说，以上HPV19、20、21、22、23、24、25、26、27、28均属于桥连探针，CTGGTCGGCTGGTCGG与CCGACCAGCCGACCAG为接头；当在检测某种基因型别时，混合探针中不能和靶基因直接结合的多余探针，可通过桥连探针，使能结合上靶基因的探针荧光信号放大，增加其探针的敏感性。
在本实施例中，试剂盒里的探针为HPV-27探针。
试剂盒中的预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，17.53克NaCl，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20,和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的预杂交液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、预杂交液的PH值为8.5。
试剂盒中的杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述杂交液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量20克硫酸葡聚糖、0.48克的Tris、0.2克的BSA、0.08克的MgCl2·6H2O、1.75克的NaCl用50ml纯净水溶解，再加入0.2ml的Tween-20和10ml的甲酰胺，最后补充纯净水到100ml。用乙酸调节PH值到8.5。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％、Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、荧光原位杂交缓冲液的PH值范围可以为8.5-9.2。
试剂盒中的洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、洗涤液的PH值调整范围可以为8.5-9.2。
实施例2本发明的一种检测HPV高危型和中危型核酸细胞水平检测的试剂盒的一个优选实施例
本实施例的试剂盒含有HPV双FAM标记的探针、体积百分比浓度为4％的多聚甲醛的固定液、体积百分比浓度为1％的TritonX-100的通透液、预杂交液、杂交液、洗涤液和探针。
其中，探针为检测HPV高危型和中危型核酸的探针，其探针如SEQ ID NO:1-28所示序列。SEQ ID NO:1-28所示序列具体如下：
HPV-1:5’-ACGTGTTCTTGATGATCTGC-3’
HPV-2:5’-TAGAGATCAGTTGTCTCTGG-3’
HPV-3:5’-TGTAGAGTCACACTTRCAACA-3’
HPV-4:5’-TGTGTGCTTTGTACGCACAA-3’
HPV-5:5’-GGTCTTCCAAAGTACGAATG-3’
HPV-6:5’-ATTCCTAGTGTGCCCATTAA-3’
HPV-7:5’-TGTCGCTTAATTGCTCRTGAC-3’
HPV-8:5’-CCTCCCACACCACGGACACACAAAGGACAGTGGGAGG-3’
HPV-9:5’-GGACACAGCGCCCTGTCCAACGAC-3’
HPV-10:5’-TAGATGTTTGTCTCCAGTCCGACACCCACGACACTGTCG-3’
HPV-11:5’-TCTTGCAATGTTGCCTTAGGTTTTTGCATTCAACGCATTTCAATTC-3’
HPV-12:5’-CTTTGCTTTTTGTCCAAATGTCACATAACTGTTTTTTAGTTA-3’
HPV-13:5’-TCCTCTGGGTCCTGAAACATTGCAGT-3’
HPV-14:5’-TCCAACGCCTGACACAAATCTGGTARCTTTCTGGGTCGC-3’
HPV-15:5’-TGYTGTTCTAATGTTTCTCCATACAGTGAATA-3’
HPV-16:5’-AGGTCTYTGACAGGTAATACACCTAATTAATA-3’
HPV-17:5’-ACAAGACATACATCGMCCGGTCCAACGACC-3’
HPV-18:5’-GTATTGTAATGGGCTCTGTCCG-3’
HPV-19:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTCTGACATCTATGACACCTTATTAAC-3’
HPV-20:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTTGCTGGTCACGCATATTATCTAC-3’
HPV-21:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTACACTATTCKTAAATCTGTAAATAGAAAG-3’
HPV-22:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCAGTAACTGTTGCTTGCAATATACACAGGT-3’
HPV-23:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATTTGGGTCACAGGTCGGGGTCTC-3’
HPV-24:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATCACAGCTGGGGCACACAACAC-3’
HPV-25:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCTGTGGCCGCTTGTGCTTGTCCA-3’
HPV-26:5’-CCGACCAGCCGACCAGTATAGCACCGTGTACAGCGCCCTGTCCA-3’
HPV-27:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTAGATTACACTTGGGTTTCTCTACGT-3’
HPV-28:5’-CTGGTCGGCTGGTCGGTTATGGTTTTCTGCATTTTCCGCACCT-3’
所述探针的两端均用FAM标记。如SEQ ID NO:19-28所示序列的探针为桥连探针，除了起到检测的作用外还能起到信号放大的作用。具体来说，以上HPV19、20、21、22、23、24、25、26、27、28均属于桥连探针，CTGGTCGGCTGGTCGG与CCGACCAGCCGACCAG为接头；当在检测某种基因型别时，混合探针中不能和靶基因直接结合的多余探针，可通过桥连探针，使能结合上靶基因的探针荧光信号放大，增加其探针的敏感性。
试剂盒中的预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，17.53克NaCl，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20,和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的预杂交液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、预杂交液的PH值为8.5。
试剂盒中的杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述杂交液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量20克硫酸葡聚糖、0.48克的Tris、0.2克的BSA、0.08克的MgCl2·6H2O、1.75克的NaCl用50ml纯净水溶解，再加入0.2ml的Tween-20和10ml的甲酰胺，最后补充纯净水到100ml。用乙酸调节PH值到8.5。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％、Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、荧光原位杂交缓冲液的PH值范围可以为8.5-9.2。
试剂盒中的洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；所述Tris的摩尔浓度为40mM；所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的PH值为8.5-9.2。配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、洗涤液的PH值调整范围可以为8.5-9.2。
实施例3：用实施例1中的试剂盒检测高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68和中危型HPV26、82基因型别的一个优选实施例
实施例1中的试剂盒中的探针为HPV-27探针，本实施例用实施例2中的试剂盒检测高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68和中危型HPV26、82基因型别。具体实验方法如下：
体外分别转录含生物素标记的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68、26、82mRNA。纯化后，取100ng mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球。阴性对照用1μl纯水加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球。各组加入5μl浓度为0.5μM的HPV-27探针，再用预杂交液补足至10μl，混匀。再加入10μl杂交液。混匀后，置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min；然后自然降温至37℃，此步骤也可以降温到37℃以下；加入洗涤液洗除未结合的探针，用流式细胞仪检测。
实验结果图如图1-6所示，图1为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的阴性对照流式柱状图；图2为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV16基因型别流式柱状图；图3为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV18基因型别流式柱状图；图4为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV26基因型别流式柱状图；图5为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV31基因型别流式柱状图；图6为用HPV-27探针检测HPV高危型和中危型实验中的检测HPV33基因型别流式柱状图。数据结果如表1所示，表1为HPV-27探针的试剂盒检测高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68和中危型HPV26、82基因型别的实验数据结果。
表1
基因型别 M2％Parent
NC 1.02％
HPV16 98.51％
HPV18 98.25％
HPV26 96.45％
HPV31 91.42％
HPV33 95.99％
HPV35 94.47％
HPV39 98.40％
HPV45 99.34％
HPV51 97.92％
HPV52 92.39％
HPV58 82.16％
HPV59 89.85％
HPV68 24.25％
HPV82 96.10％
由图1-6和表1中的结果显示，HPV-27探针的试剂盒能有效地检测高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68和中危型HPV26、82基因型别。
实施例4：本发明中的HPV-21、22探针检测HPV16、HPV58基因型别的一个优选实施例
用实施例1中的试剂盒对HPV16、HPV58基因型别进行检测。体外转录含生物素标记的HPV16 mRNA、HPV58 mRNA。纯化后，取100ng mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，除空白对照外，分为平行的四组进行检测，具体操作如下：
第一组为：取100ng生物素标记的HPV16 mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，再加入5μl浓度为0.5μM的HPV-22探针；
第二组为：取100ng生物素标记的HPV16 mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，再加入5μl浓度为0.5μM的HPV-21和HPV-22探针；
第三组为：取100ng生物素标记的HPV58 mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，再加入5μl浓度为0.5μM的HPV-21探针；
第四组为：取100ng生物素标记的HPV58 mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，再加入5μl浓度为0.5μM的HPV-21和HPV-22探针。
以上平行的四组溶液中，再用预杂交液补足至10μl，混匀。再加入10μl杂交液。混匀后，置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min；然后自然降温至37℃，此步骤也可以降温到37℃以下；加入洗涤液洗除未结合的探针，用流式细胞仪检测。
其中，所述预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成。
杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；
洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；
检测结果如表2所示，表2为HPV-21、22探针检测HPV16、HPV58基因型别结果。
表2
样本 E1 Mean FITC-H 荧光增加倍数
NC 2104
HPV16-HPV-22探针 97862
HPV16-HPV-22/21探针 190850 2.0
HPV58-HPV-21探针 31551
HPV58-HPV-21/22探针 82975 2.6
由表2的结果可见，没有使用探针的，荧光信号为2104，使用了对应的探针HPV22检测HPV16，检测的荧光信号为97862，如果同时使用HPV21探针和HPV22探针来检测HPV16，则检测的荧光信号增强到190850，信号增强了2倍；检测HPV58型时，单独用HPV21来检测，则检测的荧光信号为31551，用HPV21探针和HPV22探针来检测HPV58，则检测的荧光信号为82975，信号增强了2.6倍。
由以上结果可见，使用桥连探针后，荧光信号可以放大2倍以上。
实施例5：本发明中的HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别的一个优选实施例
体外转录含生物素标记的HPV18种基因型别的mRNA。18种基因型别包括HPV13种高风险基因型别HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和5种中风险基因型别HPV26、53、66、73、82。纯化后，取100ng mRNA加入到预杂交液洗涤的链霉亲和素标记的微球，加入5μl浓度为0.5μM的HPV混合探针，用预杂交液补足至10μl，混匀。再加入10μl杂交液。混匀后，置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min；然后自然降温至37℃或37℃以下。加入洗涤液洗除未结合的探针。用流式细胞仪检测。
其中，所述预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，17.53克NaCl，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20,和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的预杂交液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、预杂交液的PH值为8.5。
杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；配制方法如下：称量20克硫酸葡聚糖、0.48克的Tris、0.2克的BSA、0.08克的MgCl2 .6H2O、1.75克的NaCl用50ml纯净水溶解，再加入0.2ml的Tween-20和10ml的甲酰胺，最后补充纯净水到100ml。用乙酸调节PH值到8.5。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％、Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、NaCl的摩尔浓度为0.3M、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、荧光原位杂交缓冲液的PH值范围可以为8.5-9.2。
洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克Tris，2克BSA，0.81克MgCl2·6H2O，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的Tween-20和100ml的甲酰胺，用乙酸调PH值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，Tris的摩尔浓度为40mM、Tween-20的体积百分比浓度为0.2％、BSA的质量体积百分比浓度为0.2％、MgCl2的摩尔浓度为4mM、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、洗涤液的PH值调整范围可以为8.5-9.2。
检测结果如表3所示，表3为本发明中的HPV混合探针检测18种高危型和中危型HPV基因型别的结果。检测的部分结果见图7、图9、图11、图13。图7为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别的阴性对照的流式细胞柱状图；图9为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV16型的流式细胞柱状图；图11为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV18型的流式细胞柱状图；图13为在本发明杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV33型的流式细胞柱状图。
表3
Figure BDA0001923425940000121
Figure BDA0001923425940000131
由表3和图7、9、11、13的结果可见，对照空白组的检测荧光信号为2070，本发明设计的HPV探针组合针对HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82检测所得的荧光信号是对照组的63.39-971.98倍。该结果证明本发明设计的HPV探针组合能全部有效的检测出HPV高危型和中危型的18种基因型别。
同时，用传统杂交液检测的对照实验：取100ng mRNA加入到传统洗涤液洗涤的链霉亲和素标记的微球，加入5μl浓度为0.5μM的HPV混合探针，用传统洗涤液补足至10μl，混匀。再加入10μl传统杂交液。混匀后，置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min；然后自然降温至37℃以下。加入传统洗涤液洗除未结合的探针。其中，传统洗涤液：2×SSC(含0.3MNaCl、0.03M柠檬酸钠)、10％甲酰胺、0.2mg/mlBSA；传统杂交液：10％硫酸葡聚糖、2×SSC(含0.3MNaCl、0.03M柠檬酸钠)、10％甲酰胺、1mg/mltRNA、0.2mg/mlBSA。最后用流式细胞仪检测。检测结果见表4。检测的部分结果见图8、图10、图12和图14，其中，图8为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别的阴性对照的流式细胞柱状图；图10为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV16型的流式细胞柱状图；图12为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV18型的流式细胞柱状图；图14为在传统杂交体系中，HPV混合探针检测高危型和中危型HPV基因型别中的的HPV33型的流式细胞柱状图。
表4
Figure BDA0001923425940000132
Figure BDA0001923425940000141
对比表3、表4和图7-14的结果，可见本试剂盒提供的杂交体系比传统杂交体系的灵敏度更高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Figure BDA0001923425940000151
Figure BDA0001923425940000161
Figure BDA0001923425940000171
Figure BDA0001923425940000181
Figure RE-IDA0001968380780000011
Figure RE-IDA0001968380780000021
Figure RE-IDA0001968380780000031
Figure RE-IDA0001968380780000041

Claims (8)

1.一组检测HPV高危型和中危型核酸的探针，其特征在于，所述探针由SEQ ID NO:1-28所示序列组成。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针的两端均用FAM标记。
3.权利要求1或2所述的探针在制备检测HPV高危型和中危型核酸试剂盒中的应用。
4.一种检测HPV高危型和中危型核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有链霉亲和素标记的微球、预杂交液、杂交液、洗涤液和权利要求1或2所述的探针。
5.一种检测HPV高危型和中危型核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有体积百分比浓度为4％的多聚甲醛的固定液、体积百分比浓度为1％的Triton X-100的通透液、预杂交液、杂交液、洗涤液和权利要求1或2所述的探针。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述预杂交液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；
所述Tris的摩尔浓度为40mM；
所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；
所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；
所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；
所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；
所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；
所述预杂交液的PH值为8.5-9.2。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液由硫酸葡聚糖、Tris、Tween-20、BSA、MgCl2、NaCl和甲酰胺组成；
所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；
所述Tris的摩尔浓度为40mM；
所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；
所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；
所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；
所述NaCl的摩尔浓度为0.3M；
所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；
所述杂交液的PH值为8.5-9.2。
8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液由Tris、Tween-20、BSA、MgCl2和甲酰胺组成；
所述Tris的摩尔浓度为40mM；
所述Tween-20的体积百分比浓度为0.2％；
所述BSA的质量体积百分比浓度为0.2％；
所述MgCl2的摩尔浓度为4mM；
所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；
所述洗涤液的PH值为8.5-9.2。
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