JP2023524815A - 標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法ならびにそのキット - Google Patents
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Abstract
生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法であって、生体試料を架橋剤で処理することを含み、この処理が、標的タンパク質を検出する一次抗体とともに生体試料をインキュベートした後であり、かつｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する前である、方法。
Description
〔技術分野〕
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０２１，６３２号の優先権及び利益を主張し、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０２１，６３２号の優先権及び利益を主張し、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２．分野
本開示の実施形態は、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法を含む。標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法、ならびに上記方法を実施するためのキットもまた提供される。
本開示の実施形態は、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法を含む。標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法、ならびに上記方法を実施するためのキットもまた提供される。
〔背景技術〕
３．背景技術
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞及び組織背景を保存しつつ、細胞または組織切片内で特定の配列を検出する、及び位置を特定するために、広く使用される分子生物学的技法である。したがって、ＩＳＨは、細胞及び組織内での遺伝子発現の空間的時間的視覚化、ならびに定量化を可能にし、これは研究及び診断において有用な適用を有する。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（１）：１－１３（２０１４）、Ｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ ９（６）：ｅ１３２５（２０１７）、Ｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２（２）：１０９－１１９（２００２）参照。
３．背景技術
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞及び組織背景を保存しつつ、細胞または組織切片内で特定の配列を検出する、及び位置を特定するために、広く使用される分子生物学的技法である。したがって、ＩＳＨは、細胞及び組織内での遺伝子発現の空間的時間的視覚化、ならびに定量化を可能にし、これは研究及び診断において有用な適用を有する。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（１）：１－１３（２０１４）、Ｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ ９（６）：ｅ１３２５（２０１７）、Ｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２（２）：１０９－１１９（２００２）参照。
免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）もまた、同様に空間分解能及び細胞学的背景を維持しながら、組織切片及び細胞内の特定のタンパク質を検出する、及び位置を特定するために使用される、強力な技法である。ＩＳＨと同様に、ＩＨＣ及びＩＣＣは、研究及び診断において、幅広くかつ補完的な適用を有する。Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５９（１１）：１３－３２（２０１１）参照。例えば、両方の手法によって、研究者は細胞の同一性及び状態に関する洞察を提供される。
組織または細胞内での複雑な細胞間相互作用の完全な特性評価には、マルチオミクス戦略が必要である。例えば、トランスクリプトミクス及びプロテオミクスに関する情報の検出及び分析は、複合組織を調査する際、及び細胞型に特異的な遺伝子発現を明らかにする際に（Ｖａｎｌａｎｄｅｗｉｊｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５４（７６９３）：４７５－４８２（２０１８）、Ｓｔｅｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ １４（１）：２２－２９（２０１４）参照）、分泌されたタンパク質の、細胞の発生源を特定する際に（Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９（７）：１３２２－１３３３（２０１７）参照）、ならびに様々な細胞型及びそれらの相互作用の空間構成を視覚化する際に有益である。細胞及び組織を完全かつ正確に特性決定するためには、核酸及びタンパク質を、同じ組織試料中で、空間的に識別できる方法で同時に検出する必要がある。
二重検出の極めて重大な役割にもかかわらず、二重検出には、同じ試料中で核酸及びタンパク質に関する高品質なシグナルを得ることに問題がある。したがって、両方のシグナルを検出できる新規方法、例えば１つの試料中で、互いに干渉することなくＩＳＨ及びＩＨＣ／ＩＣＣを同時に実行する方法に対する、大きな需要が存在する。本開示は、これら及びその他の必要性に対処する。
４．発明の概要
一態様では、本明細書において、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、を含む方法が提供される。
一態様では、本明細書において、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料を架橋剤で処理した後、かつｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する前に、生体試料をプロテアーゼで処理することをさらに含む。その他の実施形態では、本方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出した後に、二次抗体またはその他の標識方法とともに生体試料をインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。その他の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。さらに他の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。さらに他の実施形態では、生体試料は、培養細胞またはエクソソーム含有試料である。
いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の架橋剤は固定液である。特定の実施形態では、固定液は中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）である。一実施形態では、中性緩衝ホルマリンは、１０％中性緩衝ホルマリンである。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間続く。いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４℃で約２時間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、４℃で約１６～約１８時間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で約６０分間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約６０分間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約６０分間実施する。
別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）生体試料をプロテアーゼで処理することと、（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、（ｖ）二次抗体またはその他の標識方法とともに生体試料をインキュベートすることによって標的タンパク質を検出することと、を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する工程は、（ｉ）標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を提供することと、（ｉｉ）１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできるシグナル生成複合体を提供することであって、特定の実施形態において、シグナル生成複合体が、１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、提供することと、（ｉｉｉ）標的核酸を、１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズすることと、（ｉｖ）シグナル生成複合体を１つ以上の標的プローブ（複数可）に捕捉し、それによってシグナル生成複合体を標的核酸に捕捉することと、を含む。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のそれぞれは、標的（Ｔ）セクション及び標識（Ｌ）セクションを含む。特定の実施形態では、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列である。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは、標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは、生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
いくつかの実施形態では、本方法は、標的タンパク質を検出するための二次抗体に結合できる、免疫組織化学的標識を提供することをさらに含む。その他の実施形態では、二次抗体は予め標識化されている。
いくつかの実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。その他の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。さらに他の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。さらに他の実施形態では、生体試料は、培養細胞またはエクソソーム含有試料である。
いくつかの実施形態では、架橋剤は固定液である。特定の実施形態では、固定液は中性緩衝ホルマリンである。一実施形態では、中性緩衝ホルマリンは、１０％中性緩衝ホルマリンである。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間続く。いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４℃で約２時間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４℃で約１６～約１８時間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で約１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、室温で約６０分間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約４０℃で約６０分間実施する。
いくつかの実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約１５分間実施する。その他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約３０分間実施する。さらに他の実施形態では、生体試料を架橋剤で処理する工程は、約６０℃で約６０分間実施する。
いくつかの実施形態では、本方法は、複合組織中の空間構成をマッピングするために使用される。特定の実施形態では、複合組織は、腫瘍組織である。その他の実施形態では、本方法は、疾患のあるモデルからの生体試料において、変性した遺伝子発現を検出するために使用される。さらに他の実施形態では、本方法は、新規抗体を検証するために使用される。
別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、（ｉ）架橋剤と、（ｉｉ）標的タンパク質を検出する一次抗体とともに生体試料をインキュベートした後に、架橋剤が使用されることを示す取扱い説明書と、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットはプロテアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸を検出するための薬剤及び／または標的タンパク質を検出するための薬剤をさらに含む。
また別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、（ｉ）架橋剤と、（ｉｉ）プロテアーゼと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットは、架橋剤がプロテアーゼの前に使用され、かつ架橋剤が標的タンパク質を検出する一次抗体の後に使用されることを示す取扱い説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸を検出するための薬剤及び／または標的タンパク質を検出するための薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、生体試料を架橋剤で、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間、処理することをさらに示す。いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。
いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、約４℃で約２時間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。その他の実施形態では、取扱い説明書は、約４℃で約１６～約１８時間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。
いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、室温で約１５分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。その他の実施形態では、取扱い説明書は、室温で約３０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。さらに他の実施形態では、取扱い説明書は、室温で約６０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。
いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、約４０℃で約１５分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。その他の実施形態では、取扱い説明書は、約４０℃で約３０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。さらに他の実施形態では、取扱い説明書は、約４０℃で約６０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。
いくつかの実施形態では、取扱い説明書は、約６０℃で約１５分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。その他の実施形態では、取扱い説明書は、約６０℃で約３０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。さらに他の実施形態では、取扱い説明書は、約６０℃で約６０分間、生体試料を架橋剤で処理することをさらに示す。
いくつかの実施形態では、標的核酸を検出するための薬剤は、標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）と、１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできるシグナル生成複合体と、を含み、特定の実施形態において、上記シグナル生成複合体は、１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のそれぞれは、標的（Ｔ）セクション及び標識（Ｌ）セクションを含む。特定の実施形態では、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列である。特定の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは、標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは、生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
いくつかの実施形態では、本キットは、生体試料を得るためのツールをさらに含む。特定の実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。特定の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は、培養細胞またはエクソソーム含有試料である。
いくつかの実施形態では、本キットは、複合組織中の空間構成をマッピングするために使用される。特定の実施形態では、複合組織は、腫瘍組織である。その他の実施形態では、本キットは、疾患のあるモデルからの生体試料において、変性した遺伝子発現を検出するために使用される。さらに他の実施形態では、本キットは、新規抗体を検証するために使用される。
別の態様では、本明細書において、上記方法によって調製した生体試料が提供される。
５．図面の簡単な説明
〔図１Ａ〕逐次的ＩＳＨ／ＩＨＣ及びＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの概略図を示す。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローの工程を示す図である。
〔図１Ａ〕逐次的ＩＳＨ／ＩＨＣ及びＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの概略図を示す。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローの工程を示す図である。
〔図１Ｂ〕逐次的ＩＳＨ／ＩＨＣ及びＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの概略図を示す。ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの工程を示す図である。
〔図２〕ＣＤ２０のＩＨＣシグナルが、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドベース試薬のストレスから、架橋によって保護されたことを示す。Ａは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色した、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ヒト扁桃組織切片を示す図である。Ｂは、室温で３０分間、ハイブリダイゼーションバッファーへ曝露した後に、ＩＨＣシグナルが減退した切片を示す図である。Ｃは、ハイブリダイゼーションバッファーへの曝露にもかかわらず、一次抗体後の架橋によってＩＨＣシグナルが保護されたことを示す図である。
〔図３〕ＣＤ２０のＩＨＣシグナルのプロテアーゼ処理に対する抵抗性が、架橋によって保護されたことを示す。Ａは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色し、ＣＤ２０タンパク質を検出したヒト扁桃組織切片を示す図である。Ｂは、４０℃で１５分間、プロテアーゼ酵素への曝露後に減退したＩＨＣシグナルを示す図である。Ｃは、プロテアーゼ酵素への曝露にもかかわらず、一次抗体後の架橋によって保護されたＩＨＣシグナルを示す図である。
〔図４〕ＣＤ８のＩＨＣシグナルが、ハイブリダイゼーションバッファーまたはプロテアーゼ処理の前の架橋によって増強されたことを示す。Ａは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色し、ＣＤ８を検出したヒト扁桃組織切片を示す図である。Ｂは、室温で３０分間、ハイブリダイゼーションバッファーへ曝露した後に減退したＩＨＣシグナルを示す図である。Ｃは、ハイブリダイゼーションバッファーへの曝露にもかかわらず、一次抗体後の架橋によって増強されたＩＨＣシグナルを示す図である。Ｄは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色し、ＣＤ８を検出したヒト扁桃切片を示す図である。Ｅは、４０℃で１５分間、プロテアーゼ酵素へ曝露した後に減退したＩＨＣシグナルを示す図である。Ｆは、プロテアーゼ酵素への曝露にもかかわらず、一次抗体後の架橋によって増強されたＩＨＣシグナルを示す図である。
〔図５〕ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローによって、ヒトペプチジルプロリル異性化酵素Ｂ（Ｈｓ－ＰＰＩＢ）ＩＳＨ染色を用いて、ＣＤ８タンパク質の共検出が可能となったことを示す。Ａは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ＣＤ８に対するＩＨＣ染色を行ったＦＦＰＥヒト頭頸部癌試料の切片を示す図である。Ｂは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄキットを用いたＨｓ－ＰＰＩＢのＩＳＨ染色を示す図である。Ｃは、ＩＳＨ及びＩＨＣが逐次的に実施された従来の手順後のＩＳＨ及びＩＨＣシグナルを示す図である。Ｄは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフロー後の増強されたＩＳＨ及びＩＨＣシグナルを示す図である。
〔図６〕ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローにおいて、架橋がＩＨＣシグナル改善への鍵であることを示す。Ａは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、続いてＧｒｅｅｎ色素原を用いて、ＣＤ２０に対するＩＨＣ染色を行ったＦＦＰＥヒト扁桃組織の切片を示す図である。Ｂは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄキットを用いて、Ｈｓ－ＰＰＩＢのＩＳＨ染色を行ったＦＦＰＥヒト扁桃組織の切片を示す図である。Ｃは、ＩＨＣ染色の前に、４０℃でプロテアーゼを用いた１５分間のインキュベートを含むＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）前処理を行い、その結果ＩＨＣシグナルの低減がもたらされたＦＦＰＥヒト扁桃組織の切片を示す図である。Ｄは、架橋工程を伴わずにＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを行ったＦＦＰＥヒト扁桃組織の切片を示す図である。Ｅは、架橋工程を伴うＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを行ったＦＦＰＥヒト扁桃組織の切片を示す図である。
〔図７〕室温での架橋が、１５～６０分間実施するときに有効であったことを示す。Ａは、それぞれＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄ及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用して、Ｈｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｂは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、室温で１５分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｃは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、室温で３０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｄは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、室温で６０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。
〔図８〕加熱した温度での架橋によって、ＩＨＣシグナルが保存されたことを示す。Ａは、Ｈｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｂは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、４０℃で１５分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｃは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、４０℃で３０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｄは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、４０℃で６０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｅは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、６０℃で１５分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｆは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、６０℃で３０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｇは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、６０℃で６０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。
〔図９〕４℃での架橋によって、ＩＨＣシグナルが保存されたことを示す。Ａは、Ｈｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｂは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、室温で３０分間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｃは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、４℃で２時間架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。Ｄは、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いて、４℃で一晩架橋を行ったＦＦＰＥヒト胃癌組織の切片を示す図である。
〔図１０Ａ〕本開示の一実施形態による、バックグラウンドシグナルを低下させるための画像処理方法の代表的ワークフロー図を示し、処理中の画像に関して記載している。
〔図１０Ｂ〕本開示の一実施形態による、バックグラウンドシグナルを低下させるための画像処理方法の代表的ワークフロー図を示し、この方法の一般的な工程に関して記載している。
６．発明を実施するための形態
本開示は、一部には、実験手順の再編成、及び試料中のタンパク質を架橋させる工程の追加によって、干渉を最小限にとどめて、ＩＳＨ及びＩＨＣを有効に同時に実施できるという驚くべき発見に基づいている。いくつかの実施形態では、ＩＨＣ及びＩＳＨシグナルを保存及び改善するために、一次抗体と、二次抗体とのインキュベートは分離される。さらに、一次抗体を伴うインキュベートの後には架橋の工程が続き（図１Ｂ参照）、それによって一次抗体の抗原への結合を、分解（例えばプロテアーゼ処理による）から、またはＩＳＨで一般に使用されるハイブリダイゼーションバッファー及び高温のインキュベートによるその他の干渉（図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃ及び図４Ａ～図４Ｆ参照）から保護している。この手法が、核酸及びタンパク質の増強された同時検出につながる。
本開示は、一部には、実験手順の再編成、及び試料中のタンパク質を架橋させる工程の追加によって、干渉を最小限にとどめて、ＩＳＨ及びＩＨＣを有効に同時に実施できるという驚くべき発見に基づいている。いくつかの実施形態では、ＩＨＣ及びＩＳＨシグナルを保存及び改善するために、一次抗体と、二次抗体とのインキュベートは分離される。さらに、一次抗体を伴うインキュベートの後には架橋の工程が続き（図１Ｂ参照）、それによって一次抗体の抗原への結合を、分解（例えばプロテアーゼ処理による）から、またはＩＳＨで一般に使用されるハイブリダイゼーションバッファー及び高温のインキュベートによるその他の干渉（図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃ及び図４Ａ～図４Ｆ参照）から保護している。この手法が、核酸及びタンパク質の増強された同時検出につながる。
６．１ 定義
本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」は、供給源である試料の形態の保存を伴う、特定の標的核酸の位置を特定する、及び視覚化するための技法を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」は、供給源である試料の形態の保存を伴う、特定の標的核酸の位置を特定する、及び視覚化するための技法を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫組織化学」または「ＩＨＣ」は、一般に、供給源である試料（例えば、組織試料）の形態の保存を伴う、供給源である試料中での、抗体を利用した対象のタンパク質を検出するための技法を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「免疫細胞化学」または「ＩＣＣ」は、一般に、供給源である試料（例えば、接着性または懸濁液中の組織培養細胞株などの、分離または培養したままの細胞）の形態の保存を伴う、供給源である試料中での、抗体を利用した対象のタンパク質を検出するための技法を意味する。免疫蛍光（ＩＦ）は蛍光標識を意味し、したがってＩＨＣ及びＩＣＣという用語にも包含される。ＩＣＣ、ＩＨＣ及びＩＦアッセイは、本開示の画像化処理方法とともに使用でき、本明細書においてさらに記載されるように、試料中での対象の標的の定量的及び／または定性的アセスメントを容易にする。ＩＣＣ、ＩＨＣ及びＩＦアッセイはまた、対象の標的を検出するための統合化共検出工程の一部として、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとともに実施でき、この共検出工程はさらに、本開示の画像化処理方法の実行を含むことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「同時に」または「同時」は、異なる試料上ではなく、同じ生体試料上で実施される異なるアッセイからシグナルを得る工程を意味する。したがって、異なるアッセイからの、データ取得またはシグナル検出の厳密なタイミングに、必ずしも限定されない。１つのアッセイの読み取りが、もう一方のアッセイの読み取りに続く場合もある。
本明細書で使用されるとき、用語「架橋」は、２つ以上の分子を共に結合する工程を意味する。「架橋剤」または同等物は、それら自身を、タンパク質及び他の分子中に見いだされる官能基に結合させる、２つ以上の化学的反応性末端を含有する薬剤を意味する。具体的には、架橋剤がホルムアルデヒドまたは同等物である場合、アミノ酸または核酸塩基上の求核基がホルムアルデヒドとの共有結合を形成し、これは、多くの場合、別の分子上の別の官能基を伴う第２の工程において安定化され、メチレン架橋の形成につながる。架橋剤が酸化剤である場合、酸化剤はタンパク質及びその他の生体分子の側鎖と反応することができ、組織構造を安定化させる架橋の形成が可能となる。
本明細書で使用されるとき、用語「一次抗体」は、対象の抗原に直接結合する抗体を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「二次抗体」は、検出標識にコンジュゲートした抗体を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二次抗体は、一次抗体に直接結合する。その他の実施形態では、本明細書で提供される二次抗体は、例えば一次抗体を認識する別の抗体に結合することにより、一次抗体に間接的に結合する。
本明細書で使用される場合、用語「固定」または「固定すること」は、ＩＳＨ工程において生体試料を固定することに関するとき、例えば、自己分解または腐敗による崩壊から生体試料を守る手順を意味する。固定は、あらゆる進行中の生化学反応を停止させ、処理した組織の力学的強度または安定性も向上させ得る。
本明細書で使用される場合、用語「１つ以上」とは、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、または特定の用途のために所望の場合、より大きな数を意味する。
本明細書で使用される用語「検出する」とは、通常、任意の形態の測定を意味し、ある成分が存在するかどうかの決定を含む。この用語には、定量的及び／または定性的決定が含まれる。
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）で構成される任意の長さの高分子、または２つの天然に存在する核酸が配列特異的にハイブリダイズするのと同様に、天然に存在する核酸と配列特異的にハイブリダイズすることができる、合成的に生成される化合物、例えば、ワトソン・クリック塩基対相互作用に関与し得る化合物を指す目的で同義的に使用される。用語「複数の塩基」（または「塩基」）は、ポリヌクレオチド配列との関係で本明細書で使用される場合、「複数のヌクレオチド」（または「ヌクレオチド」）、すなわち、ポリヌクレオチドのモノマーサブユニットと同義である。用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基を含有する部分のみならず、修飾された他の複素環式塩基を含有する部分も包含することが意図される。このような修飾には、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖を含有する部分のみならず、他の糖を含有する部分も包含する。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられているか、エーテルまたはアミンなどに官能化されている。「類似体」は、模倣体、誘導体である、類似の構造を有する、または他の同様の用語として文献で認識されている構造的特徴を有する分子を指し、例えば、非天然ヌクレオチドが組み込まれたポリヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体（２’－修飾ヌクレオシドなど）、ペプチド核酸、オリゴマーヌクレオシドホスホネート及び置換基（保護基または連結部分など）が付加されている任意のポリヌクレオチドを含む。
「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドの配列に基づく、ポリヌクレオチド間の特異的な結合を指す。本明細書で使用される場合、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、互いに結合し合う場合、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、所定のレベルまたは検出可能なレベルのシグナルを生成する場合、相補的である。ポリヌクレオチドの部分は、従来の塩基対形成規則（例えば、ＡはＴ（またはＵ）と対になり、ＧはＣと対になる）に従う場合、互いに相補的であるが、ミスマッチ、挿入または欠失された配列の小さな領域（例えば、約３塩基未満）が存在してもよい。
本明細書で使用される用語「試料」は、対象の１種以上の成分を含有する物質または物質の混合物に関するものである。用語「試料」は、「生体試料」を包含し、生体試料は、生物学的対象から得られた試料、例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで得た、到達した、もしくは採取した生物組織または流体由来の試料などを意味する。生体試料として同じく、前がん細胞、がん細胞、前がん組織、またはがん組織を含有する生物学的対象の領域由来の試料を含む。このような試料は、哺乳動物から分離した器官、組織、細胞及びエクソソームであることができるが、これらに限定されない。例示的な生体試料としては、細胞溶解液、細胞、細胞培養物、細胞株、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、オルガノイド、生体液、血液試料、尿試料、皮膚試料などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生体試料としては、全血、部分精製血液、ＰＢＭＣ、組織生検体などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、特定の標的のｍＲＮＡ配列に向けられた捕捉物質を指す。したがって、プローブのセットの各プローブは、それぞれの標的ｍＲＮＡ配列を有する。いくつかの実施形態では、プローブは個別に使用できる。その他の実施形態では、プローブは、プローブのセットで使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるプローブは、「核酸プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」であり、これらは相補的配列を有する標的核酸、例えば本明細書において提供されるｍＲＮＡバイオマーカーと、通常、水素結合の形成による相補的塩基対形成を通じて結合できる核酸を指す。本明細書で使用される場合、プローブは、天然塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または修飾塩基（７－デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。加えて、プローブ内の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。プローブは、タグ、例えば発色団、発光団（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、または色素体で、直接または間接的に標識されることができる。プローブの有無についてアッセイすることによって、対象の標的ｍＲＮＡバイオマーカーの有無を検出することができる。
本開示及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。
実施形態が、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに本明細書に記載される場合、それ以外の、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という観点から記載された、類似の実施形態もまた提供されると理解される。また、実施形態が「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現とともに本明細書に記載される場合、それ以外の、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という観点から記載された、類似の実施形態もまた提供されると理解される。
「ＡとＢの間（ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ ａｎｄ Ｂ）」または「Ａ－Ｂ間（ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ－Ｂ）」などの表現において用いられる用語「の間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、Ａ及びＢを包含する範囲を示す。
本明細書における「Ａ及び／またはＢ」のような表現において用いられるような用語「及び／または」は、Ａ及びＢ、ＡまたはＢ、Ａのみ、ならびにＢのみ、を含むと意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような表現において用いられるような用語「及び／または」は、次の各具体例：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａのみ；Ｂのみ；ならびにＣのみ、を包含すると意図される。
６．２ ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出
一態様では、本明細書において、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、を含む方法が提供される。
一態様では、本明細書において、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料を架橋剤で処理した後、かつｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する前に、生体試料をプロテアーゼで処理することをさらに含む。その他の実施形態では、本方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出した後に、二次抗体またはその他の標識方法とともに生体試料をインキュベートすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書にて提供される本調製方法は、以下の工程、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、生体試料を架橋剤で処理することと、生体試料をプロテアーゼで処理することと、標的核酸をＩＳＨによって検出することと、生体試料を二次抗体またはその他の標識方法とともにインキュベートすることと、を逐次的に実施することを含む。いくつかの実施形態では、追加の工程が含まれてもよい。
ＩＳＨは、固定した組織及び細胞内で特定の標的核酸の位置を特定するための強力な技法であり、それによって例えば、遺伝子発現及び遺伝子座について時間的及び空間的情報を得る。標識化プローブは、試料内で標的核酸配列にハイブリダイズする。続いて、この標識化プローブは検出されることができる。ＩＳＨは、全細胞調製物、パラフィン包埋組織、凍結組織または浮遊切片を調製することを含む。調製するものがパラフィン包埋組織である場合、ＩＳＨの次の工程は脱パラフィンであり、この工程はパラフィンを除去し、試料を再水和するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＩＳＨ工程は、ブロッキング工程を含み、その工程で特定のブロッキング剤（複数可）を適用して細胞の特定の内因性成分をブロックし、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させる。例えば、後工程で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を検出酵素として使用する場合、過酸化水素がブロッキング剤である。過酸化水素を添加して、試料中の内因性ＨＲＰ活性を不活性化し、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させる。特定の実施形態では、このブロッキング工程は、脱パラフィン直後の、前処理の第１の工程として追加される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＩＳＨ工程は、エピトープ抗原賦活化工程を含み、特定のエピトープ抗原賦活化バッファー（複数可）を添加して、標的核酸を露出させることができる。いくつかの実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を約５０℃～約１００℃に加熱することを含む。一実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を約８８℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、プロテアーゼ工程を含む。界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫを、固定した細胞の透過性を高めるのに使用することができる。通常、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＳＤＳを用いる界面活性剤処理は、脂質を抽出して細胞膜を透過させるために、頻繁に使用される。プロテイナーゼＫは、広範囲のｐＨにわたって活性であり、容易に不活性化されない、非特異的プロテアーゼである。プロテイナーゼＫは、標的核酸を取り囲むタンパク質を消化するのに用いられる。処理の最適濃度及び最適継続時間は、当該技術分野において周知のように、実験において決定できる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、生体試料を脱水することを含む。特定の実施形態では、脱水は、例えば７０％、９５％、及び１００％エタノールの順序でエタノールの濃度を上昇させて行う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、生体試料をハイブリダイゼーションバッファーとともにインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションバッファーはホルムアミドベースである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、生体試料をハイブリダイゼーションプローブ（複数可）とともにインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、ハイブリダイゼーションプローブ（複数可）を増幅及び検出することを含む。
ＩＳＨのように、時間的及び空間的情報が保存され得るという点で、ＩＨＣは広く使われている別の技法であるが、これは標的タンパク質を検出するためのものである点が異なる。抗原抗体結合の特異性という利点を利用して、ＩＨＣは、細胞内及びそれらの適切な組織学的背景内において、特定の標的タンパク質の高く識別可能な分配及び局在を視覚化及び文書化することを可能にする。ＩＨＣは、全細胞調製物、パラフィン包埋組織、凍結組織または浮遊切片を調製することを含む。調製するものがパラフィン包埋組織である場合、ＩＨＣの次の工程は脱パラフィンであり、この工程はパラフィンを除去するためのものである。組織の調製及び保存工程の間に、架橋剤、例えばホルマリンが使用される場合、ホルマリン固定がエピトープをマスキングし、免疫活性の低減をもたらす可能性がある（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ７１：２２４－２３０（１９９６）参照）。ホルマリン固定は、固定時間を延ばすと、ホルムアルデヒド基が平衡点までタンパク質に継続して結合する結果となる、時間依存的工程である（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３３：８４５－８５３（１９８５）参照）。研究によって、ホルマリン固定、特に長時間にわたるホルマリン固定の場合、抗原性の低減がもたらされることが示されており（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ ａｎｄ Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３４：１０９５－１１００（１９８６）参照）、これによって診断用ＩＨＣでのホルマリン固定組織の使用が制限されている（Ｒａｍｏｓ－Ｖａｒａ，Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４２：４０５－４２６（２００５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７（８）：７５３－７６１（２００９）参照）。
ＩＳＨなどを用いた標的核酸、及びＩＨＣなどを用いた標的タンパク質の同時検出の利益は非常に大きい。例えば、同時検出は分析の処理能力を高め、それらの個々の構成成分の調査に関連する時間及び費用の負担を軽くする。さらに、同じ試料で検出を組み合わせることによって、研究者は、別々の切片での染色からは得られない情報、例えば分泌されたタンパク質及びその起源である細胞（複数可）を視覚化することや、異なる細胞型の相互作用などの情報を得られる。上記両方の技法の工程は類似しているようであるが、２つの技法を１つの試料中で組み合わせるには問題がある。
理論的には、ＩＳＨとＩＨＣとを組み合わせるための明白な選択肢は、最初にＩＨＣを実行し、続いてＩＳＨを実行することである（例えばＫｏｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５９（４）：２０９－２２１（２０１８）参照）。免疫蛍光とＲＮＡ ＦＩＳＨとの組み合わせに成功した報告があるものの、これらはシグナルの強度、染色パターン及び試薬適合性の観点から不十分であったため、実験の人為的結果及び失敗をもたらした。さらに、過去に実施されたＩＨＣはＲＮａｓｅフリーである必要があった可能性があるが、これは、細心の注意を払わない限り、ＲＮａｓｅが多くの標準的な実験室用試薬を汚染するため、より大規模または幅広い適用のためには実用的ではない。
あるいは、同じ組織切片上での標的タンパク質及び標的核酸の同時検出は、最初にＩＳＨを実施してｍＲＮＡの完全性を保存し、続いて直ちにＩＨＣを行うことによって達成されてもよい（例えば、Ｓｔｅｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ ２０，１３６６－１３７３．（２０１４）、Ｇｒａｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（３）：ｅ０１２０１２０（２０１５）参照）。ただし、プロトコルに関していくつかの不利益がある。まず第１に、この手法は、全ての対象の抗体に適合性があるわけではない場合が多い。第２に、後に実施されるＩＨＣシグナルは、この手法の早い段階の工程によって頻繁に失われる、または大きく減退する。１つの原因は、ＩＳＨの初めに用いられる苛酷な試薬及び条件であり、これらによって同じ組織切片上での後続の下流のアッセイにおける材料が不十分な品質となる。例えば、ＩＳＨ前処理では、試薬の浸透を助け、標的に接近しやすくするためにプロテアーゼを使用する。このプロテアーゼ工程は、場合によってはエピトープに損傷を与える可能性があり、それによって抗体抗原結合が損なわれ、結果的にＩＨＣシグナルが低下する。加えて、ＩＳＨで一般に使用されるホルムアミドベースのバッファー及び高温でのインキュベートは、非共有結合的な抗体抗原結合を損なう可能性があり、それによってＩＨＣシグナルが低下する。
本明細書において提供される方法は、従来のプロトコルを変更することによって、例えば抗原抗体結合を安定させることによって上記課題を克服する。この安定化は、例えばＩＳＨ検出の前に、最初に試料を一次抗体とともにインキュベートすること、及び１０％ＮＢＦで試料を固定することによって達成され、その後、残りのＩＨＣ染色が続く。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、一次抗体の結合後に、試料を架橋することを含み、架橋の後に、プロテアーゼ処理及びＩＳＨが続き、その後に残りのＩＨＣ染色工程が続く。この方法は、ハイブリダイゼーションバッファー依存的増幅を伴う後続の工程を通じて、エピトープをプロテアーゼ活性から保護すること、及び抗原抗体結合を安定させることの両方の能力を有する。この方法は、タンパク質及び核酸の共検出における高い柔軟性を提供し、核酸の高く識別可能な検出を維持し、以前は従来の共検出への適合性がなかった抗体のＩＨＣシグナルを安定させる。
下記セクション７．２及び７．３にて例示したように、本明細書で提供される方法は、ＩＳＨ及びＩＨＣの従来の共検出には適合性がないとみなされた抗体、例えばＣＤ２０の検出を可能にする。従来、標的核酸からのシグナルを保存するためにＩＳＨが最初に実施される場合、ＩＨＣシグナルは損なわれる可能性がある。例えば、同じ試料をＩＳＨ手順、例えばプロテアーゼ処理などによって処理すると、エピトープが負の影響を受ける可能性がある。それゆえ、問題があり得るＩＳＨ手順の前に試料を抗体とともにインキュベートすることは有益である。さらに、図６Ｃ～図６Ｅに図示したとおり、ＩＳＨ及びＩＨＣ統合のために、一次抗体のインキュベート後に架橋の工程が追加される。架橋によって抗原抗体結合を改善し、以前はＩＳＨ条件には適合性がなかったタンパク質エピトープの検出及び可視化が可能となった。加えて、本明細書で提供される架橋工程は、プロテアーゼ処理及びハイブリダイゼーションバッファーのインキュベートから試料中の抗体抗原結合を保護することによって、ＩＨＣシグナルを改善することが示されている（図３Ａ～図３Ｃ及び図４Ａ～図４Ｃ参照）。
さらに、本明細書で提供される方法は、いくつかの対象の抗体について、さらなる後押しとなる効果を示した。例えば、ハイブリダイゼーションバッファーのインキュベート及び／またはプロテアーゼ処理の前の架橋によって、従来のＩＳＨ－ＩＨＣプロトコルと比較した場合だけでなく、標準的なＩＨＣプロトコル単独と比較した場合も、ＣＤ８抗体のＩＨＣシグナルが改善した（図４Ａ～図４Ｆ及び図５Ａ～図５Ｄ参照）。ＩＨＣ検出における同様の後押し効果が、さらなる抗体にも当てはまる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を単独で検出する取り組みとして、ＩＨＣシグナルを増強するために、同様の手順、例えば一次抗体インキュベート後の追加の架橋工程を用いてもよい。その他の実施形態では、標的タンパク質を単独で検出する取り組みとして、ＩＨＣシグナルを増強するためにプロテアーゼ処理を用いてもよい。その他の実施形態では、標的タンパク質を単独で検出する取り組みとして、ＩＨＣシグナルを増強するために、例えば一次抗体インキュベート後の追加の架橋工程、及びＩＳＨの部分的なまたは全ての手順を模倣する実験的工程などの手順を用いてもよい。
ＩＳＨプローブ（複数可）を用いたハイブリダイゼーションの前に、いくつかの前処理の手順が必要となり得る。例えば、特定のブロッキング剤（複数可）が適用されるとき、ＩＳＨブロッキングは、細胞の特定の内因性成分をブロックし、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させるためのものである。例えば、後の工程で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を検出酵素として使用する場合、過酸化水素がブロッキング剤である。過酸化水素を添加して、試料中の内因性ＨＲＰ活性を不活性化し、それによってアッセイのバックグラウンドを低減させる。特定の実施形態では、このＩＳＨブロッキングは、脱パラフィン直後の、前処理の第１の工程として追加される。いくつかの実施形態では、前処理工程は標的の抗原賦活化工程を含み、特定の標的抗原賦活化バッファー（複数可）を添加して、標的核酸を露出させることができる。いくつかの実施形態では、エピトープ抗原賦活化工程は、試料を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、標的の抗原賦活化工程は、試料を約５０℃～約１００℃に加熱することを含む。一実施形態では、標的の抗原賦活化工程は、試料を約８８℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、前処理工程はプロテアーゼ処理を含み、これは標的核酸を取り囲むタンパク質を消化するために使用される。処理の最適濃度及び最適継続時間は、当該技術分野において周知のように、実験的に決定できる。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はトリプシンを用いて実施する。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はプロテイナーゼＫを用いて実施する。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はペプシンを用いて実施する。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はプロナーゼを用いて実施する。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はエンドプロテイナーゼＡｓｐＮを用いて実施する。特定の実施形態では、プロテアーゼ処理はエンドプロテイナーゼＧｌｕＣを用いて実施する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するための方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にプロテアーゼ処理、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にＩＳＨブロッキング、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的の抗原賦活化、次に生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的の抗原賦活化、次に生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的の抗原賦活化、次に生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にプロテアーゼ処理、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的の抗原賦活化、次に生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にＩＳＨブロッキング、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的の抗原賦活化、次に生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的の抗原賦活化、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的の抗原賦活化、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的の抗原賦活化、次にプロテアーゼ処理、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的の抗原賦活化、次にＩＳＨブロッキング、次にプロテアーゼ処理、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を一次抗体とともにインキュベートすること、続いて生体試料の架橋剤による第１の処理、次に標的の抗原賦活化、次にＩＳＨブロッキング、次に標的核酸のＩＳＨによる検出、そしてＩＨＣの残りの工程を、直前の段落にて記載されるように含む。その他の実施形態では、本明細書で提供される方法は３種以上の抗体の利用を含み、二次抗体またはその他の後続の抗体は一次抗体後に適用され、二次抗体またはその他の検出方法はＩＳＨ後に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で処理することを含む。特定の実施形態では、架橋剤は固定液である。特定の実施形態では、架橋剤はホルムアルデヒドである。特定の実施形態では、架橋剤はグルタルアルデヒドである。特定の実施形態では、架橋剤はアクロレインである。特定の実施形態では、架橋剤は四酸化オスミウムである。特定の実施形態では、架橋剤は過マンガン酸塩固定液の一種である。一実施形態では、架橋剤は過マンガン酸カリウムである。特定の実施形態では、架橋剤は二クロム酸塩固定液の一種である。一実施形態では、架橋剤は二クロム酸カリウムである。特定の実施形態では、架橋剤はクロム酸である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、架橋性固定液の混合物である架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、四酸化オスミウム、過マンガン酸塩固定液、二クロム酸塩固定液、及びクロム酸の一覧から選択される、２種以上の固定液の混合溶液である。一実施形態では、架橋剤は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物である。一実施形態では、架橋剤は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡである。一実施形態では、架橋剤は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）である。一実施形態では、架橋剤は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマールカルシウムである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール生理食塩水液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液である、Ｈｅｌｌｙ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液であるＨｏｌｌａｎｄｅ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液である、アルコールホルマリンである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールである。一実施形態では、架橋剤は固定液の混合物であり、混合物の少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。一実施形態では、架橋剤は、同時に使用されないが別々に、または逐次的に使用される固定液であり、少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２種以上の架橋剤で生体試料を処理することを含み、これらは同時に適用されないが別々に、または逐次的に適用され、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、四酸化オスミウム、過マンガン酸塩固定液、二クロム酸塩固定液及びクロム酸の一覧から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約０℃～約１００℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃～約９０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃～約８０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃～約７０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃～約６０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約０℃～約１００℃の温度において、生体試料を約１％～約２０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃～約９０℃の温度において、生体試料を約１％～約２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃～約８０℃の温度において、生体試料を約１％～約２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃～約７０℃の温度において、生体試料を約１％～約２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃～約６０℃の温度において、生体試料を約１％～約２０％のＮＢＦで処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約０℃～約１００℃の温度において、生体試料を約１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃～約９０℃の温度において、生体試料を約１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃～約８０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃～約７０℃の温度において、生体試料を約１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃～約６０℃の温度において、生体試料を約１０％のＮＢＦで処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１１℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１２℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１３℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１４℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１６℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１７℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１８℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１９℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２１℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２２℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２３℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２４℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２６℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２７℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２８℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２９℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９０℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９５℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１００℃の温度において、生体試料を架橋剤で処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１１℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１２℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１３℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１４℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１６℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１７℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１８℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１９℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２１℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２２℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２３℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２４℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２６℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２７℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２８℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２９℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９０℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９５℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１００℃の温度において、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６℃の温度において生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１１℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１２℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１３℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１４℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１６℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１７℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１８℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１９℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２１℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２２℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２３℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２４℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２６℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２７℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２８℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２９℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９０℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９５℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１００℃の温度において、生体試料を１０％のＮＢＦで処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．１時間～約４８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．１時間～約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．１時間～約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．２時間～約２２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．２５時間～約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．２５時間～約１８時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．１時間～約４８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．１時間～約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．１時間～約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．２時間～約２２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．２５時間～約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．２５時間～約１８時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．１時間～約４８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．１時間～約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．１時間～約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．２時間～約２２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．２５時間～約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．２５時間～約１８時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．２５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約０．７５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約３時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約７時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約９時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約１８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、約４８時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．２５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約０．７５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約３時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約７時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約９時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約１８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～２０％のＮＢＦで、約４８時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．２５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約０．７５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約３時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約５時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約７時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約９時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１１時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１２時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約１８時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約２０時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約２４時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約３６時間処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１０％のＮＢＦで、約４８時間処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において１０時間を超えて処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において５時間を超えて処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において１時間を超えて処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約６時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約７時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約８時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約９時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約１０時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約１１時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４℃の温度において約１２時間処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約６時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約３時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約１時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．５時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．１時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．１５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．２時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．２５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．３時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．３５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．４時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．４５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．５５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．６時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．６５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．７時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．７５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．８時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．８５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約０．９時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約１時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約１．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約２時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約２．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約３時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約３．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、室温において約４時間処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約６時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約３時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約１時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約０．５時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約０．１時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約０．２５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約０．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約０．７５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、４０℃の温度において約１時間処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約６時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約３時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約１時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約０．５時間未満処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約０．１時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約０．２５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約０．５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約０．７５時間処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、６０℃の温度において約１時間処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約６で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約６．５で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約７で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約７．５で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約８で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約８．５で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を架橋剤で、ｐＨ約９で処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％未満の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を５０％を超える有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１％～５０％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を２％～４０％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を３％～３０％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を４％～２０％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を約４％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を１２％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を２４％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を３７％の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、１％～５０％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、２％～４０％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、３％～３０％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、４％～２０％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、約４％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、１２％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、２４％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、３７％でのホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する架橋剤で処理することを含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％未満のホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は室温である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約７及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約８及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は６０℃である。一実施形態では、架橋は約０．５時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間未満続く。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料を、ｐＨ約６及び１２％を超えるホルムアルデヒドまたは同等物の有効濃度を有する等張緩衝液中の架橋剤で処理することを含み、ここで温度は４℃である。一実施形態では、架橋は約１時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１２時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約１８時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約２４時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３０時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約３６時間を超えて続く。一実施形態では、架橋は約４８時間を超えて続く。
本明細書で提供される方法は、標的核酸を検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。その他の実施形態では、標的核酸はＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にハイブリダイゼーションベースの方法によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、ＩＳＨによって標的ＲＮＡを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡを分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（３）：３０３－３０８（１９９６）参照）によって検出することを含む。一実施形態では、この方法は、強制インターカレーション（ｆｏｒｃｅｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）（ＦＩＴ）プローブ（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．６（１）：６９－７７（２００５）参照）によって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にアプタマーベースの方法によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、アプタマー「Ｓｐｉｎａｃｈ」（Ｐａｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０４２）：６４２－６４６（２０１１）参照）によって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に粒子関連ハイブリダイゼーションベースのプローブによって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、金ナノ粒子量子ドットプローブによって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡ中に視覚化可能な部分を直接組み込むこと（Ｊａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１０５（４１）：１５７７９－１５７８４（２００８）参照）によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）の蛍光タンパク質融合バージョン（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４３（６１６９）：４２２－４２４（２０１４）参照）によって、標的ＲＮＡを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、Ｐｕｍｉｌｉｏベースの方法（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１４（２）：２００－２０４（２０１３）参照）によって、標的ＲＮＡを検出することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＤＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にハイブリダイゼーションベースの方法によって標的ＤＮＡを検出することと、を含む。いくつかの特定の実施形態では、この方法は、発色（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）ＩＳＨによって標的ＤＮＡを検出することを含む。その他の特定の実施形態では、この方法は、蛍光ＩＳＨによって標的ＤＮＡを検出することを含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するため方法は、様々な起源の生体試料を含む。一実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。一実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。一実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。一実施形態では、生体試料は培養細胞である。別の実施形態では、生体試料はエクソソーム含有試料である。
組織検体としては、例えば、組織生検試料が挙げられる。血液試料としては、例えば、診断目的で採取した血液試料が挙げられる。血液試料の場合、血液塗抹標本におけるように、血液を直接解析でき、あるいは、血液を処理して、例えば、赤血球細胞の溶解、ＰＢＭＣまたは白血球の単離、標的細胞の単離などを行って、本開示の方法によって解析される試料中の細胞が、血液試料中に存在するように、または血液試料から抽出されるようにできる。同様に、組織検体の処理を行うことができ、例えば、組織検体を細かく切断し、物理的または酵素的に処理して、組織を破壊して、個々の細胞または細胞クラスターの状態にすることができる。加えて、望ましい場合には、細胞学的試料を処理して、細胞を単離するか、または細胞クラスターを破壊することができる。したがって、当該技術分野において周知の方法を用いて、組織、血液及び細胞学的試料を入手及び処理することができる。本開示の方法は、病態を示すバイオマーカーである核酸標的の有無に基づき、病的細胞の有無を確認する診断用途で用いることができる。
本明細書で提供される方法を用いて標的核酸及び標的タンパク質を検出する際には、いずれかの数の好適な試料タイプを使用できることが、当業者には理解される。本明細書で提供される方法で用いる試料は概して、生体試料または組織試料である。このような試料は、生体対象から得ることができ、個体または何らかの他の生体物質源（生検体、剖検体または鑑定物質など）から採取される生体組織または体液由来の試料を含む。生体試料には、前がん細胞、がん細胞、前がん組織もしくはがん組織を含むか、またはその細胞もしくは組織を含む疑いのある、生体対象の領域から得た試料、例えば組織生検体（細針吸引物、血液試料または細胞学的検体が挙げられる）も含まれる。このような試料は、哺乳動物のような生物から単離した器官、組織、組織断片、細胞及び／またはエクソソームであることができるが、これらに限定されない。例示的な生体試料としては、細胞、初代細胞培養物、細胞株、組織、器官、オルガノイド、生体液などの細胞培養物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の生体試料としては、皮膚試料、組織生検体（細針吸引物を含む）、細胞学的試料、便、体液（血液及び／または血清の試料、唾液、精液を含む）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような試料は、医学または獣医学における診断目的で用いることができる。
本明細書で提供される方法による解析用の細胞学的試料を採取することは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｄｅｙ，“Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２１－１３２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０１８）、“Ｎｏｎ－Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｄｏｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＡＳＣ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｂｏａｒｄ Ｍａｒｃｈ ２，２００４参照）。
例えば、子宮頸部組織の解析用に、試料（組織生検体及び細胞学的試料を含む）を処理する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｐｌｕｍ，ｅｄｓ．，２０ｔｈ ｅｄ．，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）、Ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａ Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｌｌｏｒｓ ａｎｄ Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ（２００３）、Ｋａｌａｆ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：４４９－４５５（２００７）、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ． Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎａｅｃｏｌ．２６：２３３－２４２（２０１２）、Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２０：１４６５－１４７１（２０１２）、Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＴＯＣ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＡＳＣ）Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，２０００参照）。
特定の実施形態では、試料は、組織検体である、または組織検体に由来するものである。いくつかの実施形態では、組織検体はＦＦＰＥである。いくつかの実施形態では、組織検体は新鮮凍結である。いくつかの実施形態では、組織検体は、固定液とともに調製される。いくつかの実施形態では、組織検体は、架橋性固定液とともに調製される。その他の特定の実施形態では、試料は、血液試料である、または血液試料に由来するものである。さらに別の特定の実施形態では、試料は、細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来するものである。
６．３ 標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出する方法
別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）生体試料をプロテアーゼで処理することと、（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、（ｖ）二次抗体またはその他の標識方法とともに生体試料をインキュベートすることによって標的タンパク質を検出することと、を含む方法が提供される。
別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法であって、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）生体試料をプロテアーゼで処理することと、（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出することと、（ｖ）二次抗体またはその他の標識方法とともに生体試料をインキュベートすることによって標的タンパク質を検出することと、を含む方法が提供される。
上記セクション６．２での記載の他に、ＩＳＨは、標的核酸を１種以上の標的プローブ（複数可）とハイブリダイズさせることを含む。核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出方法は、当業者には周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）参照）。本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」とは、直接または間接的に標識した相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖（プローブなど）を用いて、試料、具体的には、組織または細胞の一部または切片（ｉｎ ｓｉｔｕ）における所定の核酸に結合して、その核酸の位置を特定するタイプのハイブリダイゼーションを指す。このプローブの種類は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖補完的ＲＮＡ（ｓｓｃＲＮＡ）、及び／または合成オリゴヌクレオチドであることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＩＳＨは、上記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を少なくとも１セット提供することと、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、上記シグナル生成複合体が、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、提供することと、上記標的核酸を、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズすることと、シグナル生成複合体を上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットに捕捉し、それによってシグナル生成複合体を上記標的核酸に捕捉することと、を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、単一のプローブを含む。その他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、２つのプローブを含む。さらにその他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）の各セットは、３つ以上のプローブを含む。
いくつかの実施形態では、標的プローブの各セットが、単一の標的プローブを含む場合、単一の標的プローブが標的核酸に結合するときに、シグナル生成複合体が形成される。その他の実施形態では、標的プローブの各セットが２つの標的プローブを含む場合、標的プローブ対の両方のメンバーが標的核酸に結合するときに、シグナル生成複合体が形成される。
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で使用されるＩＳＨはＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）であり、例えば米国特許第７，７０９，１９８号、同第８，６０４，１８２号、及び同第８，９５１，７２６号により詳細に記載されている。具体的には、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）に関しては、特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、分枝状のＤＮＡ様シグナル生成複合体と組み合わせて用いて、標準的な明視野顕微鏡の下、単分子の感度で、１キロベースほどの小ささのＲＮＡを確実に検出することが記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７（１０）：２２０１－２２０８（２０１６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１４（１）：２２－２９（２０１２））。
いくつかの実施形態では、各標的プローブは標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１セットを使用して、標的核酸を検出する。その他の実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）３セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）４セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）５セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）６セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）７セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）８セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）９セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１０セットを使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）１６セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）２１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的プローブ（複数可）３１セット以上を使用して、標的核酸を検出する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数の核酸標的を検出するためのものである。いくつかの実施形態では、複数の核酸標的は全て、１００未満のヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、核酸標的の一部は１００未満のヌクレオチドを含み、一方でその他の標的は１００を超えるヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、複数の核酸標的の一部は、１０００を超えるヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「標的プローブ」は、標的核酸にハイブリダイゼーションして、標識プローブまたはシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の成分をその標的核酸に捕捉または結合させることができるポリヌクレオチドである。標的プローブは、標識プローブに直接ハイブリダイゼーションできるか、または標識プローブに逐次にハイブリダイゼーションする１つ以上の核酸にハイブリダイゼーションでき、例えば、標的プローブは、ＳＧＣにおける増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標的プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列と相補的である第１のポリヌクレオチド配列と、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、またはプレ－プレ増幅剤などのポリヌクレオチド配列と相補的である第２のポリヌクレオチド配列とを含む。標的プローブは概して１本鎖であり、上記の相補的配列が、対応する標的核酸、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤とハイブリダイゼーションするのに利用可能なようになっている。いくつかの実施形態では、標的プローブは、対として供給される。
本明細書で使用される場合、「標識プローブ」という用語は、標的分子に直接または間接的に、概ね間接的に結合して、標的を検出可能にする物体を指す。標識プローブ（または「ＬＰ」）は、直接または間接的に検出可能なシグナルを供給する標識を１つ以上含む、典型的には１本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである核酸結合部分を含む。その標識が、そのポリヌクレオチドに共有結合していることもできるし、またはそのポリヌクレオチドが、その標識に結合するように構成されていることもできる。例えば、ビオチン化ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジン結合標識と結合できる。標識プローブは例えば、標的核酸に直接ハイブリダイゼーションできる。概して、標識プローブは、標的核酸に逐次にハイブリダイゼーションしている核酸、または標的核酸にハイブリダイゼーションしている１つ以上の他の核酸にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標識プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列、特に、標的核酸の一部分と相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、標識プローブは、ＳＧＣにおける増幅剤、プレ増幅剤、またはプレ－プレ増幅剤のポリヌクレオチド配列と相補的であるポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＧＣは、このような増幅剤、プレ増幅剤、及び／またはプレ－プレ増幅剤に関して、追加の説明を含む。
本明細書で使用される場合、「増幅剤」は、複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、増幅剤は、複数の同一の標識プローブにハイブリダイゼーションする。増幅剤は、標的核酸、標的プローブ対の少なくとも１つの標的プローブ、標的プローブ対の両方の標的プローブ、または標的プローブに結合した核酸（増幅剤、プレ増幅剤もしくはプレ－プレ増幅剤など）にハイブリダイゼーションすることもできる。例えば、増幅剤は、少なくとも１つの標的プローブ及び複数の標識プローブ、またはプレ増幅剤及び複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる。増幅剤は例えば、直鎖状、フォーク状、櫛状または分岐状の核酸であることができる。全てのポリヌクレオチドについて本明細書で記載されているように、増幅剤は、修飾ヌクレオチド及び／または非標準的なヌクレオチド間結合、ならびに標準的なデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／またはホスホジエステル結合を含むことができる。好適な増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，１２４，２４６号、同第５，７１０，２６４号、同第５，８４９，４８１号、及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。
本明細書で使用される場合、「プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上の増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数の増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，６８１，６９７号及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号及び同第２０１７／０１０１６７２号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。
本明細書で使用される場合、「プレ－プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上のプレ増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ－プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数のプレ増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ－プレ増幅剤は例えば、２０１７／０１０１６７２に記載されており、これは、参照により援用される。
標識は典型的には、ＩＳＨで、標的核酸を検出するために使用される。本明細書で使用される場合、「標識」とは、分子の検出を容易にする部分である。一般的な標識には、蛍光標識、発光標識、光散乱標識及び／または比色標識が含まれる。好適な標識としては、酵素、ならびに蛍光部分及び発色部分、また放射性核種、基質、補因子、阻害剤、化学発光部分、磁性粒子、希土類金属、金属同位体などが挙げられる。特定の実施形態では、標識は、酵素である。例示的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼなど、ならびに各種プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の標識としては、フルオロフォア及びジニトロフェニル（ＤＮＰ）などが挙げられるが、これらに限定されない。標識は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号に記載されているように、当業者には周知である。検出可能な酵素／基質の組み合わせ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を含め、多くの標識が市販されており、本開示の方法及びアッセイで使用できる。本開示の特定の実施形態では、酵素は、発色基質または蛍光基質を利用して、本明細書に記載されているように、検出可能なシグナルを生成できる。例示的な標識は、本明細書に記載されている。
酵素活性標識または非酵素標識が、それぞれ検出できるものである限りは、いずれの数の酵素標識または非酵素標識も使用できる。本酵素は、それによって検出可能なシグナルを生成し、そのシグナルを利用して、標的核酸を検出できる。特に有用である検出可能なシグナルは、発色シグナルまたは蛍光シグナルである。したがって、標識として用いるのに特に有用な酵素には、発色基質または蛍光基質が利用可能である酵素が含まれる。このような発色基質または蛍光基質を酵素反応によって容易に検出可能な発色生成物または蛍光生成物に変換し、この生成物は、顕微鏡法または分光法を用いて、容易に検出及び／または定量できる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）参照）。周知の発色基質または蛍光基質を有する他の酵素には、様々なペプチダーゼが含まれ、その発色ペプチド基質または蛍光ペプチド基質を用いて、タンパク質切断反応を検出できる。発色基質及び蛍光基質の利用は、細菌の診断でも周知であり、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、及びリパーゼなどの利用が挙げられるが、これらに限らず（Ｍａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．５５：３３５－３４８（１９９１））、既知の発色基質または蛍光基質を有するこのような酵素は、本明細書で提供される方法で用いるのに容易に適合させることができる。
検出可能なシグナルを生成させるための様々な発色基質または蛍光基質は、当業者に周知であり、市販されている。検出可能なシグナルを生成させるのに利用できる例示的な基質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、クロロナフトール（４－ＣＮ）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルカリホスファターゼに対する５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－リン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）及びｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、β－ガラクトシダーゼに対する１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、ならびにβ－グルコシダーゼに対する２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な蛍光基質としては、アルカリホスファターゼに対する４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルリン酸、ホスファターゼに対する４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（シクロヘキシルアンモニウム）及び４－メチルウンベリフェリルリン酸、西洋ワサビペルオキシダーゼに対するＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕｉｎｔｏｌｅｔ、β－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）及びナフトフルオレセインジ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、β－グルコシダーゼに対する３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ならびにα－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なシグナルを生成させる例示的な酵素及び基質は例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にも記載されている。発色基質または蛍光基質を含む様々な検出可能な酵素基質は、周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｃａｒｅ）。概して、基質は、標的核酸の部位で沈着する沈殿物を形成する生成物に変換される。その他の例示的な基質としては、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｂｉｏｃａｒｅ製のＶｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ及びＦｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ；ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
検出可能な標識として適する例示的な希土類金属及び金属同位体としては、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、及び１７６Ｙｂのようなランタニド（ＩＩＩ）同位体が挙げられるが、これらに限定されない。金属同位体は、例えば、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）（例えば、ＦｌｕｉｄｉｇｍのＨｅｌｉｏｓ及びＨｙｐｅｒｉｏｎシステム、ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて検出できる。
ビオチン－アビジン（またはビオチン－ストレプトアビジン）は、それらの２つの分子の相互の親和性が非常に高いとともに、１つのアビジン／ストレプトアビジン分子が４つのビオチン分子と結合できるという知見に基づく、周知のシグナル増幅システムである。抗体は、免疫組織化学法及びＩＳＨでのシグナル増幅に広く用いられている。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）は、ペルオキシダーゼ活性によって、多数のハプテン化チラミド分子が沈着することに基づいている。チラミンは、フェノール化合物である。固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、少量の過酸化水素の存在下で、標識基質を、極めて反応性の高い短命な中間体に変換する。続いて、活性化した基質分子は、ペルオキシダーゼ結合部位またはペルオキシダーゼ結合部位の近くで、電子の豊富なタンパク質部分（チロシンなど）と非常に速やかに反応して、その部分に共有結合する。この方法で、チラミドにコンジュゲートした多くのハプテン分子をハイブリダイゼーション部位で、ｉｎ ｓｉｔｕに導入できる。その後、沈着したチラミド－ハプテン分子を直接または間接的に可視化できる。このような検出システムは例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にさらに詳細に記載されている。
本明細書に記載されている実施形態では、酵素を利用して、適切な発色基質または蛍光基質を用いる検出可能なシグナルを生成できる。あるいは、標識プローブは、その標識プローブの核酸部分に直接結合された検出可能な標識を有することができることが理解される。例示的な検出可能な標識は、当業者に周知であり、発色標識または蛍光標識が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）参照）。例示的な、標識として有用なフルオロフォアとしては、ローダミン誘導体、例えばテトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１）、ローダミン１１０、及びそれらの誘導体、例えばテトラメチルローダミン－５－（または６）、リサミンローダミンＢなど；７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）；フルオレセイン及びその誘導体；ナフタレン、例えばダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）；クマリン誘導体、例えば７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）など；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標））及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ピレン及びスルホン化ピレン、例えばＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）及びその誘導体、例えば８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸など；ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（３，６－ジスルホネート－４－アミノ－ナフタルイミド）及びその誘導体；ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、ＡＴＴＯ ３９０、ＤｙＬｉｇｈｔ ３９５ＸＬ、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０、Ｃｙａｎ ５００ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＨ，Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発色団としては、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、芳香族ニトロ化合物（ニトロフェニルなど）、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示されているように、本明細書で提供される方法は、複数の標的核酸の同時検出に利用できる。フルオロフォアを標識として用いる場合には、複数の標的核酸の検出に用いるフルオロフォアは、標的核酸の同時検出の場合に、各フルオロフォアが識別可能であるとともに、フルオロフォアを蛍光顕微鏡で同時に検出できるように選択する。このようなフルオロフォアは、標的核酸の別個の標識を同時に検出できるように、発光線のスペクトルが分離されるように選択する。本開示の方法で用いるのに適する識別可能なフルオロフォアを選択する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，”１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）参照）。
顕微鏡、サイトメトリー（例えば、マスサイトメトリー、飛行時間法によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、フローサイトメトリー）または分光法のような周知の方法を用いて、それぞれの標的核酸と関連する検出可能な発色シグナル、蛍光シグナルまたは金属シグナルを可視化できる。概して、同じ試料中の核酸標的の検出に、１種類の計器を使用できるように、同じアッセイで、それぞれ異なる標識を使用する場合には、特定のアッセイに合わせて、発色基質もしくは蛍光基質、または発色標識もしくは蛍光標識、あるいは希土類金属同位体のいずれかを使用する。
本明細書で開示されているように、標識は、標識が任意に切断可能となるように設計できる。本明細書で使用される場合、切断可能な標識とは、例えば、標的核酸を標識及び検出する２回目以降のラウンドで、同じ標識を使用するために、標識を除去できるように、標識プローブに結合またはコンジュゲートされている標識を指す。概して、標識は、切断可能である化学リンカーによって、標識プローブにコンジュゲートされている。標識が切断可能となるように、標識を標識プローブにコンジュゲートする方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（３）：４８４－４８９（１９９８）参照）。オリゴヌクレオチドを標識する具体的システムの１つは、ＦａｓｔＴａｇ（商標）システムである（上記のＤａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）。様々な切断可能な部分をリンカーに含めて、標識を標識プローブから切断されるようにできる。このような切断可能な部分は、化学的、光化学的または酵素的に切断できる基を含む。切断可能な化学リンカーは、還元によって切断できるジスルフィド、過ヨウ素酸塩によって切断できるグリコールまたはジオール、亜ジチオン酸塩によって切断できるジアゾ結合、ヒドロキシルアミンによって切断できるエステル、塩基によって切断できるスルホンなどのような切断可能な化学的部分を含むことができる（上記のＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６参照）。特に有用である切断可能なリンカーの１つは、ジスルフィド結合を還元することによって切断できるジスルフィド結合を含むリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、酵素によって切断するための部位を含むことができる。例えば、リンカーは、タンパク質切断部位を含むことができる。概して、このような切断部位は、配列特異的なプロテアーゼに対するものである。このようなプロテアーゼとしては、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（切断部位：ＬＥＶＬＦＱ／ＧＰ）、エンテロキナーゼ（切断部位：ＤＤＤＤＫ／）、第Ｘａ因子（切断部位：ＩＥＧＲ／）、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（切断部位：ＥＮＬＹＦＱ／Ｇ）及びトロンビン（切断部位：ＬＶＰＲ／ＧＳ）が挙げられる（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ参照）が、これらに限定されない。別の切断可能な部分は例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）によって切断できるウラシル－ＤＮＡ（ウラシルを含むＤＮＡ）であることができる（例えば、Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８２（３）：４１０－４０４（２００８）参照）。
切断可能な標識は、その標識を切断し、その標識を標識プローブから解離する目的で、化学的な薬剤のような薬剤または光を適用することによって除去することができる。上で論じたように、化学的な切断に有用な切断剤としては、還元剤、過ヨウ素酸、亜ジチオン酸塩、ヒドロキシルアミン、及び塩基などが挙げられるが、これらに限定されない（上記のＨｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６参照）。ジスルフィド結合を含むリンカーを切断するのに有用な方法の１つは、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を利用することである（Ｍｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３：１１０４６－１１０５１（２０１６）参照）。一実施形態では、標識を標識プローブから切断する薬剤として、ＴＣＥＰを使用する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標識化一次抗体の使用を含み、それによってその他のＩＨＣ工程を実施する必要性を排除する。特定の実施形態では、一次抗体は発色標識で標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は蛍光標識で標識化される。特定の実施形態では、一次抗体はポリヌクレオチド（複数可）で標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は、ＮＨＳ（スクシンイミジル）エステル法によって標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は、イソチオシアネート法によって標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は、カルボジイミド法によって標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は、２タグ法（触媒及び基質）によって標識化される。特定の実施形態では、一次抗体は、過ヨウ素酸法によって標識化される。
蛍光ベースの検出とともに使用するために、一次抗体後の架橋を、ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）シグナル増幅システム（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ８：１９９８（２０１７）参照）と組み合わせて、または同様のプロトコルを用いるその他の核酸検出方法と組み合わせて採用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にハイブリダイゼーションベースの方法によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、ＩＳＨによって標的ＲＮＡを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡを分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（３）：３０３－３０８（１９９６）参照）によって検出することを含む。一実施形態では、この方法は、強制インターカレーション（ｆｏｒｃｅｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）（ＦＩＴ）プローブ（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．６（１）：６９－７７（２００５）参照）によって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にアプタマーベースの方法によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、アプタマー「Ｓｐｉｎａｃｈ」（Ｐａｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０４２）：６４２－６４６（２０１１）参照）によって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に粒子関連ハイブリダイゼーションベースのプローブによって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、金ナノ粒子量子ドットプローブによって標的ＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡ中に視覚化可能な部分を直接組み込むこと（Ｊａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１０５（４１）：１５７７９－１５７８４（２００８）参照）によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＲＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質によって標的ＲＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）の蛍光タンパク質融合バージョン（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４３（６１６９）：４２２－４２４（２０１４）参照）によって、標的ＲＮＡを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、Ｐｕｍｉｌｉｏベースの方法（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１４（２）：２００－２０４（２０１３）参照）によって、標的ＲＮＡを検出することを含む。
ＤＮＡ検出には、抗原抗体結合を損なう可能性がある同様のプロテアーゼ及びハイブリダイゼーション条件が用いられ得るため、本明細書に記載の架橋の手法によって、タンパク質ＤＮＡ共検出もまた可能となる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的ＤＮＡ及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製するためのものであり、（ｉ）生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、（ｉｉ）（ｉ）後に生体試料を架橋剤で処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）後にハイブリダイゼーションベースの方法によって標的ＤＮＡを検出することと、を含む。一実施形態では、この方法は、発色ＩＳＨによって標的ＤＮＡを検出することを含む。一実施形態では、この方法は、蛍光ＩＳＨによって標的ＤＮＡを検出することを含む。
本明細書で提供される方法は、有益な研究ツールであり、加えて診断用ツールでもある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、複合組織中の空間構成をマッピングするために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞型及び新規の細胞型を識別するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞状態を識別するために使用される。その他の特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍微小環境において細胞型及び新規の細胞型を識別するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍微小環境において細胞状態を識別するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、疾患のある細胞及び組織において変性した遺伝子発現を検出するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、特定の細胞型において変性した遺伝子発現の位置を特定する、及び腫瘍内不均一性を理解するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍免疫細胞の相互作用を研究するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、がんの診断及び予後のためのバイオマーカーを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、がん治療用の治療標的を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、新規抗体の検証を容易にするために使用される。
６．４ 標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するキット
また別の態様では、本明細書において、上記のセクション６．２及び６．３に記載される各種方法を実行するためのキットが提供される。
また別の態様では、本明細書において、上記のセクション６．２及び６．３に記載される各種方法を実行するためのキットが提供される。
別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、（ｉ）架橋剤と、（ｉｉ）標的タンパク質を検出する一次抗体とともに生体試料をインキュベートした後に、架橋剤が使用されることを示す取扱い説明書と、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットはプロテアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸を検出するための薬剤及び／または標的タンパク質を検出するための薬剤をさらに含む。
また別の態様では、本明細書において、生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、（ｉ）架橋剤と、（ｉｉ）プロテアーゼと、を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットは、架橋剤がプロテアーゼの前に使用され、かつ架橋剤が標的タンパク質を検出する一次抗体の後に使用されることを示す取扱い説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸を検出するための薬剤及び／または標的タンパク質を検出するための薬剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キット中の架橋剤は固定液である。特定の実施形態では、キット中の架橋剤はホルムアルデヒドである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤はグルタルアルデヒドである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤はアクロレインである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤は四酸化オスミウムである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤は過マンガン酸塩固定液の一種である。一実施形態では、キット中の架橋剤は過マンガン酸カリウムである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤は二クロム酸塩固定液の一種である。一実施形態では、キット中の架橋剤は二クロム酸カリウムである。特定の実施形態では、キット中の架橋剤はクロム酸である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、架橋性固定液の混合物である架橋剤を含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、四酸化オスミウム、過マンガン酸塩固定液、二クロム酸塩固定液、及びクロム酸の一覧から選択される、２種以上の固定液の混合溶液である。一実施形態では、架橋剤は、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液であるＢｏｕｉｎ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドの混合物である。一実施形態では、架橋剤は、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液であるＦＡＡである。一実施形態では、架橋剤は、パラホルムアルデヒド、Ｌリジン、及びＩＮａＯ４の溶液である、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）である。一実施形態では、架橋剤は、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液であるホルマールカルシウムである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液であるホルマール生理食塩水液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である、亜鉛ホルマリンである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化水銀の溶液である、Ｈｅｌｌｙ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液であるＨｏｌｌａｎｄｅ固定液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である、Ｇｅｎｄｒｅ溶液である。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液である、アルコールホルマリンである。一実施形態では、架橋剤は、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液であるホルモール酢酸アルコールである。一実施形態では、架橋剤は固定液の混合物であり、混合物の少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。一実施形態では、架橋剤は、同時に使用されないが別々に、または逐次的に使用される固定液であり、少なくとも１種の固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、２種以上の架橋剤を含み、これらは同時に適用されないが別々に、または逐次的に適用され、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、四酸化オスミウム、過マンガン酸塩固定液、二クロム酸塩固定液及びクロム酸の一覧から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約０℃～約１００℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１℃～約９０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２℃～約８０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約３℃～約７０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約４℃～約６０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約３℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約４℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約６℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約７℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約８℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約９℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１１℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１２℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１３℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１４℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１６℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１７℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１８℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１９℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２１℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２２℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２３℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２４℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２６℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２７℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２８℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約２９℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約３０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約３５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約４０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約４５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約５０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約５５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約６０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約６５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約７０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約７５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約８０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約８５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約９０℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約９５℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生体試料を架橋剤で、約１００℃の温度で処理することを示す取扱い説明書を含む。
いくつかの実施形態では、本キットは、対象から生体試料を得るためのツールをさらに含む。特定の実施形態では、生体試料は組織検体である、または組織検体に由来する。特定の実施形態では、生体試料は血液試料である、または血液試料に由来する。特定の実施形態では、生体試料は細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるキットは、例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、同第８，６０４，１８２号、及び同第８，９５１，７２６号により詳細に記載されるような、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）を実行するための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）の少なくとも１セットと、上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできるシグナル生成複合体とを含み、上記シグナル生成複合体は、標識プローブ、及び上記１つ以上の標的プローブ（複数可）のセットにハイブリダイズできる核酸成分を含む。
いくつかの実施形態では、標的プローブ（複数可）は、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、Ｔセクションは標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、Ｌセクションはシグナル生成複合体の核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＴセクションは標的核酸の非重複領域に相補的であり、１つ以上の標的プローブ（複数可）のＬセクションは生成複合体の核酸成分の非重複領域に相補的である。
いくつかの実施形態では、本キットは、上記のセクション６．３に記載されるようなシグナル生成複合体をさらに含み、この複合体は標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、及び／またはプレ－プレ増幅剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、本キットは、ハイブリダイゼーションの準備のために試料を処理する固定剤及び薬剤、ならびに試料を洗浄するための薬剤など、ＩＳＨを実行するためのその他の薬剤または材料をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本キットは、ブロッキングバッファー、二次抗体、ＩＨＣ標識、試料を洗浄するための薬剤などをはじめとする、ＩＨＣを実施するための他の薬剤または材料をさらに含む。
本キットは、本キットの構成成分を収容する物理構造を意味する「梱包材料」をさらに含んでもよい。梱包材料は、構成成分を無菌的に維持することができ、そのような目的のために通常用いられる材料で製造することができる（例えば紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、管など）。
本明細書において提供されるキットは、ラベルまたは挿入紙を含むことができる。ラベルまたは挿入紙は、キット構成成分が使用される目的となり得る状態、障害、疾患、または症状についての情報を含む。ラベルまたは挿入紙は、臨床医または対象が、方法、治療プロトコル、または治療レジメンにおいて、キット構成成分のうちの１つ以上を使用するための取扱い説明書を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、複合組織中の空間構成をマッピングするために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、細胞型及び新規の細胞型を識別するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、細胞状態を識別するために使用される。その他の特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、腫瘍微小環境において細胞型及び新規の細胞型を識別するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、腫瘍微小環境において細胞状態を識別するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、疾患のある細胞及び組織において変性した遺伝子発現を検出するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、特定の細胞型において変性した遺伝子発現の位置を特定する、及び腫瘍内不均一性を理解するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、腫瘍免疫細胞の相互作用を研究するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、がんの診断及び予後のためのバイオマーカーを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、がん治療用の治療標的を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、新規抗体の検証を容易にするために使用される。
７．実施例
以下は、研究に用いられる各種方法及び材料の記載であり、本開示をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示され、本発明者が自身の開示とみなすものの範囲を限定することを意図しておらず、また下記の実験が実施されたものであり、実施され得る実験の全てであると示すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記載は、必ずしも実行されたというわけではなく、むしろ、これらの記載を実行して、本開示の教示に関連するデータなどを作成することができると理解すべきである。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及びばらつきが考慮されるべきである。
以下は、研究に用いられる各種方法及び材料の記載であり、本開示をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示され、本発明者が自身の開示とみなすものの範囲を限定することを意図しておらず、また下記の実験が実施されたものであり、実施され得る実験の全てであると示すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記載は、必ずしも実行されたというわけではなく、むしろ、これらの記載を実行して、本開示の教示に関連するデータなどを作成することができると理解すべきである。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及びばらつきが考慮されるべきである。
７．１ ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフロー
図１Ａ及び図１Ｂは、逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフロー及び統合化二重ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローの工程を図示している。元々の逐次的二重ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローは、標準的なＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）の前処理から開始し、ＩＨＣ染色を開始する前にＩＳＨ染色を完了する（図１Ａ参照）。これに対して、統合化ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出ワークフローは、標的の抗原賦活化までの前処理のみで開始する。次に、ＩＨＣ一次抗体を、組織／細胞中の抗原に結合し、架橋させ、続いてプロテアーゼ処理及びＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）染色を行う。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）染色が完了したら、二次抗体に曝露する、及び染色することでＩＨＣ検出を再開する（図１Ｂ参照）。理論的には、ＩＨＣ用に直接標識化された一次抗体を用いることで、二次抗体への曝露の必要性を取り除き、この統合化ワークフローが短縮される可能性がある。
図１Ａ及び図１Ｂは、逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフロー及び統合化二重ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローの工程を図示している。元々の逐次的二重ＩＳＨ－ＩＨＣワークフローは、標準的なＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）の前処理から開始し、ＩＨＣ染色を開始する前にＩＳＨ染色を完了する（図１Ａ参照）。これに対して、統合化ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出ワークフローは、標的の抗原賦活化までの前処理のみで開始する。次に、ＩＨＣ一次抗体を、組織／細胞中の抗原に結合し、架橋させ、続いてプロテアーゼ処理及びＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）染色を行う。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）染色が完了したら、二次抗体に曝露する、及び染色することでＩＨＣ検出を再開する（図１Ｂ参照）。理論的には、ＩＨＣ用に直接標識化された一次抗体を用いることで、二次抗体への曝露の必要性を取り除き、この統合化ワークフローが短縮される可能性がある。
７．２ 一次抗体後の架橋による、ハイブリダイゼーションバッファーへの曝露またはプロテアーゼ処理後のＩＨＣシグナルの保存または改善
ＣＤ２０のＩＨＣシグナルは、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドベース試薬のストレスから、架橋によって保護された。図２Ａ～図２Ｃは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色した、ＦＦＰＥヒト扁桃組織切片を示す。基準として、ＩＳＨからのいかなる干渉もないＣＤ２０検出用のＩＨＣでは、明確なシグナルを示した（図２Ａ参照）。切片をＣＤ２０抗体とともにインキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーに室温で３０分間曝露し、続いて残りのＩＨＣ染色を行った。ハイブリダイゼーションバッファーへの曝露によって、ＣＤ２０のＩＨＣシグナルが著しく減退した（図２Ｂ参照）。組織を市販の１０％ＮＢＦとともに室温で３０分間インキュベートすることによって一次抗体後の架橋を達成し、これはハイブリダイゼーションバッファーの影響に対するＩＨＣの抵抗性を向上させた（図２Ｃ参照）。
ＣＤ２０のＩＨＣシグナルは、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドベース試薬のストレスから、架橋によって保護された。図２Ａ～図２Ｃは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いてＩＨＣ染色した、ＦＦＰＥヒト扁桃組織切片を示す。基準として、ＩＳＨからのいかなる干渉もないＣＤ２０検出用のＩＨＣでは、明確なシグナルを示した（図２Ａ参照）。切片をＣＤ２０抗体とともにインキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーに室温で３０分間曝露し、続いて残りのＩＨＣ染色を行った。ハイブリダイゼーションバッファーへの曝露によって、ＣＤ２０のＩＨＣシグナルが著しく減退した（図２Ｂ参照）。組織を市販の１０％ＮＢＦとともに室温で３０分間インキュベートすることによって一次抗体後の架橋を達成し、これはハイブリダイゼーションバッファーの影響に対するＩＨＣの抵抗性を向上させた（図２Ｃ参照）。
同様に、架橋はＣＤ２０のＩＨＣシグナルのプロテアーゼ処理への抵抗性も向上させた。Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ヒト扁桃切片をＩＨＣで染色してＣＤ２０タンパク質を検出し、染色によって明確なシグナルを得た（図３Ａ参照）。一次抗体とともにインキュベートし、その後、スライドを４０℃で１５分間、プロテアーゼ処理に曝露し、これによってＩＨＣシグナルの顕著な低減が得られた（図３Ｂ参照）。一次抗体のインキュベート後かつプロテアーゼ処理の前に、室温で３０分間１０％ＮＢＦによって組織を架橋させることによって、ＩＨＣシグナルへのプロテアーゼの影響が改善された（図３Ｃ参照）。
対象の他のいくつかの抗体についても、一次抗体後の架橋によって、ＩＨＣシグナルが保護されたばかりでなく、増強もされた。一例はＣＤ８抗体であった。Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ヒト扁桃切片をＩＨＣで染色してＣＤ８を検出した（図４Ａ及び図４Ｄ参照）。組織をＣＤ８抗体とともにインキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーに室温で３０分間（図４Ｂ参照）、またはプロテアーゼ処理に４０℃で１５分間（図４Ｅ参照）のいずれかに曝露し、これによってＩＨＣシグナルの顕著な低減が得られた。一次抗体のインキュベート後、かつハイブリダイゼーションバッファーのインキュベート（図４Ｃ参照）または、プロテアーゼ処理（図４Ｆ参照）のいずれかの前に、室温で３０分間１０％ＮＢＦによって組織を架橋させることによって、標準的なＩＨＣプロトコル（それぞれ図４Ａ及び図４Ｄ参照）と比較して、ＣＤ８のＩＨＣシグナルが改善された。
７．３ ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローによって成功のうちに得られた強いＩＳＨ及びＩＨＣシグナル
ＩＨＣまたはＩＳＨ単独での基準として、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ＦＦＰＥヒト頭頸部癌切片にＣＤ８に対するＩＨＣ染色を行い、ＩＨＣシグナルの検出を可視化した（図５Ａ参照）。それとは別に、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄキットを用いて、ヒトペプチジルプロリル異性化酵素Ｂ（Ｈｓ－ＰＰＩＢ）のＩＳＨ染色を単独で実施し、ＩＳＨシグナルもまた検出した（図５Ｂ参照）。しかし、切片にＨｓ－ＰＰＩＢのＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ ＲｅｄのＩＳＨ検出を行い、その直後にＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いたＣＤ８のＩＨＣ染色を行う逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフロー（図１Ａ参照）を用いると、ＩＨＣシグナルは大きく低減した（図５Ｃ参照）。これに対して、統合化共検出ワークフロー（図１Ｂ参照）を用いる場合、上述のように、一次抗体への曝露の後に組織を架橋した。続いて、組織を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄアッセイを用いて、Ｈｓ－ＰＰＩＢについて染色し、その後に残りのＩＨＣ染色工程を行った。したがって、統合化ＩＳＨ／ＩＨＣワークフローは抗原抗体結合の保存を助け、ＣＤ８の場合には、ＩＨＣシグナルを改善した（図５Ｄ参照）。
ＩＨＣまたはＩＳＨ単独での基準として、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ＦＦＰＥヒト頭頸部癌切片にＣＤ８に対するＩＨＣ染色を行い、ＩＨＣシグナルの検出を可視化した（図５Ａ参照）。それとは別に、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄキットを用いて、ヒトペプチジルプロリル異性化酵素Ｂ（Ｈｓ－ＰＰＩＢ）のＩＳＨ染色を単独で実施し、ＩＳＨシグナルもまた検出した（図５Ｂ参照）。しかし、切片にＨｓ－ＰＰＩＢのＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ ＲｅｄのＩＳＨ検出を行い、その直後にＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いたＣＤ８のＩＨＣ染色を行う逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣワークフロー（図１Ａ参照）を用いると、ＩＨＣシグナルは大きく低減した（図５Ｃ参照）。これに対して、統合化共検出ワークフロー（図１Ｂ参照）を用いる場合、上述のように、一次抗体への曝露の後に組織を架橋した。続いて、組織を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄアッセイを用いて、Ｈｓ－ＰＰＩＢについて染色し、その後に残りのＩＨＣ染色工程を行った。したがって、統合化ＩＳＨ／ＩＨＣワークフローは抗原抗体結合の保存を助け、ＣＤ８の場合には、ＩＨＣシグナルを改善した（図５Ｄ参照）。
逐次的ＩＳＨ／ＩＨＣと統合化共検出ワークフローとの間には、１つを超える違いが存在する。どの違い（複数可）が、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを用いる場合のより良好なＩＳＨ及びＩＨＣシグナルの原因であるかをさらに特定するために、別の実験セットを実施した。ＦＦＰＥヒト扁桃組織切片に、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ＣＤ２０に対するＩＨＣ染色を行い、続いてＧｒｅｅｎ色素原を用いて染色を行い、ＣＤ２０タンパク質を検出した（図６Ａ参照）、またはＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄキットを用いて、Ｈｓ－ＰＰＩＢについてのＩＳＨ染色を行い、ＲＮＡを検出した（図６Ｂ参照）。あるいはＩＨＣ染色の前に、切片に、４０℃でのプロテアーゼを用いた１５分間のインキュベートを含む、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）前処理を実施し、ＩＨＣシグナルの低減が得られた（図６Ｃ参照）。ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフロー（図１Ｂ参照）を用いる場合、一次抗体への曝露の後に、上述のように組織を架橋した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄアッセイを用いて、Ｈｓ－ＰＰＩＢに対するＩＳＨ染色を実施し、その後に残りのＩＨＣ染色工程（二次抗体、発色性検出及び対比染色）を実施した。統合化ＩＳＨ／ＩＨＣワークフローでの架橋は抗原抗体結合の保存を助け、ＩＨＣシグナルを改善した（図６Ｅ参照）。これに対して、追加の架橋工程を伴わないＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを実行すると、ＣＤ２０のＩＨＣシグナルの一様な喪失がもたらされ、一次抗体後の架橋の重要性を強調している（図６Ｄ参照）。
７．４ ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローにおける架橋のための、温度及び処理持続時間のパラメータ
架橋工程がＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの鍵となる工程であることを考慮して、より多くの実験を実施し、温度及び持続時間の異なる組み合わせについての実現可能性を試験した。第１に、室温での架橋は、１５～６０分間で有効であると示された。ＦＦＰＥヒト胃癌組織に、それぞれＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄ及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用して、Ｈｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行った。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出ワークフローを用いると、Ｈｓ－ＰＰＩＢのＩＳＨ染色は成功したが、一方で検出されたＣＤ８のＩＨＣシグナルは最小限である可能性があった（図７Ａ参照）。ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを使用すると、室温での、１５分間（図７Ｂ参照）、３０分間（図７Ｃ参照）、及び６０分間（図７Ｄ参照）の架橋によって、ＣＤ８のＩＨＣ検出の成功がもたらされた。
架橋工程がＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローの鍵となる工程であることを考慮して、より多くの実験を実施し、温度及び持続時間の異なる組み合わせについての実現可能性を試験した。第１に、室温での架橋は、１５～６０分間で有効であると示された。ＦＦＰＥヒト胃癌組織に、それぞれＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄ及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用して、Ｈｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行った。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出ワークフローを用いると、Ｈｓ－ＰＰＩＢのＩＳＨ染色は成功したが、一方で検出されたＣＤ８のＩＨＣシグナルは最小限である可能性があった（図７Ａ参照）。ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフローを使用すると、室温での、１５分間（図７Ｂ参照）、３０分間（図７Ｃ参照）、及び６０分間（図７Ｄ参照）の架橋によって、ＣＤ８のＩＨＣ検出の成功がもたらされた。
第２に、加熱した温度での架橋もまた、１５～６０分間で有効であると示された。ＦＦＰＥヒト胃癌組織に、上述のようにＨｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行った。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出では、低いＣＤ８のＩＨＣ検出という結果になった（図８Ａ参照）。これに対して、ＩＳＨ／ＩＨＣ統合化共検出ワークフロー内の、４０℃における１５分間（図８Ｂ参照）、３０分間（図８Ｃ参照）、または６０分間（図８Ｄ参照）のいずれかの架橋によって、ＣＤ８のＩＨＣ検出の改善が可能となった。６０℃における１５分間（図８Ｅ参照）、３０分間（図８Ｆ参照）、または６０分間（図８Ｇ参照）のいずれかの架橋もまた、逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出と比較してＩＨＣシグナルを保存したが、低いインキュベート温度（例えば、図８Ｂ、図８Ｃ及び図８Ｄ参照）よりも程度は小さかった。
第３に、４℃における架橋もまた、２時間または一晩実行したとき、有効であると示された。ＦＦＰＥヒト胃癌組織に、上述のようにＨｓ－ＰＰＩＢ検出のためのＩＳＨ染色、その直後にＣＤ８のＩＨＣ検出を行った。すでに観察されたように、逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出は、ＣＤ８のＩＨＣシグナルに負の影響を与えた（図９Ａ参照）。統合化共検出ワークフローを変更して、手作業での組織の前処理、抗体インキュベート及び架橋の実行によって、室温未満での架橋インキュベートを可能とした。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＩＳＨ染色及び残りのＩＨＣ染色を含む後続の全ての工程を、それぞれＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄ及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用して、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ上で自動化した。逐次的ＩＳＨ－ＩＨＣ共検出（図９Ａ参照）及び室温における３０分間の架橋（図９Ｂ参照）と比較して、４℃における２時間の架橋（図９Ｃ参照）及び４℃における一晩の架橋（図９Ｄ参照）では、ＣＤ８のＩＨＣ検出の成功が可能となった。
７．５ 画像処理
本開示の実施形態は、標的の検出を増強するための方法１００もまた含む。いくつかの実施形態では、方法１００は画像処理方法を含む。方法１００は工程のフローチャートとして図１０Ｂに示され、一方で図１０Ａは、複数の画像、及び画像を修正するために方法１００で使用される対応する因子を示す。図示した実施形態では、方法１００は、少なくとも部分的には、記憶装置上（すなわち、非一時的なコンピュータ可読媒体）に保存された対応する命令を有するコンピュータを用いて実施する。方法１００からの最終的な画像、及びいくつかの実施形態では、中間の画像は、記憶装置内に保存される。いくつかの実施形態では、記憶装置はネットワークによってアクセス可能である。いくつかの実施形態では、ユーザーの入力または命令は、ネットワークを介して受信可能、またはアクセス可能である。
本開示の実施形態は、標的の検出を増強するための方法１００もまた含む。いくつかの実施形態では、方法１００は画像処理方法を含む。方法１００は工程のフローチャートとして図１０Ｂに示され、一方で図１０Ａは、複数の画像、及び画像を修正するために方法１００で使用される対応する因子を示す。図示した実施形態では、方法１００は、少なくとも部分的には、記憶装置上（すなわち、非一時的なコンピュータ可読媒体）に保存された対応する命令を有するコンピュータを用いて実施する。方法１００からの最終的な画像、及びいくつかの実施形態では、中間の画像は、記憶装置内に保存される。いくつかの実施形態では、記憶装置はネットワークによってアクセス可能である。いくつかの実施形態では、ユーザーの入力または命令は、ネットワークを介して受信可能、またはアクセス可能である。
方法１００は、標的シグナルを有する試料を撮像してプローブ画像を作成すること（工程１０４）、及び標的シグナルを伴わない試料を撮像してバックグラウンド画像（すなわち「ブランク画像」）を作成すること（工程１０８）を含む。いくつかの実施形態では、撮像には、ネットワークを介してコンピュータに接続された蛍光顕微鏡を利用する。いくつかの実施形態では、標的シグナルは、試料に、蛍光性のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ及び／または免疫蛍光アッセイを行うことで得られる。いくつかの実施形態では、標的シグナルのないバックグラウンド画像は、試料から標的シグナルを取り除くことによって（すなわち、開裂処理によって）得られる。その他の実施形態では、標的シグナルのないバックグラウンド画像は、アッセイが行われる前に得られる。換言すれば、いくつかの実施形態では、工程１０４は工程１０８の前に起こり、その他の実施形態では、工程１０４は工程１０８の後に起こる。いくつかの実施形態では、標的シグナルは、標的核酸に結合した蛍光標識を含む。その他の実施形態では、標的シグナルは、標的ペプチドまたは標的ポリペプチドに結合した蛍光標識を含む。
引き続き図１０Ｂを参照すると、方法１００は、プローブ画像及びバックグラウンド画像を登録する工程１１２を含む。プローブ画像とバックグラウンド画像との間の起こり得るバックグラウンド蛍光の差異は、画像獲得の異なるラウンド間で試料全体を動かすために発生する、空間的なパターンのずれを生む。このような差異を取り除くために、画像登録技術（例えば位相相関）を利用する。ロバストな画像登録（例えば、工程１１２）では、画像特徴の検出及びマッチングを利用して、あらゆる全体的な試料の移動（すなわち平行移動及び回転）を補正した。
方法１００は、少なくとも１つの画像メトリクスを基準に、バックグラウンド画像を修正して、調整されたバックグラウンド画像（例えば、変換された、強度調整済みのブランク画像）を作成すること（工程１３６）をさらに含む。本明細書においてさらに説明されるように、少なくとも１つの画像メトリクスは、比率因子（工程１１６、工程１２０、工程１２４）、倍増率（工程１２８）、局所的最大値変換（工程１３２）、及び任意のその他の適切なメトリクスである。いくつかの実施形態では、方法１００は、単一の画像メトリクスを含む。その他の実施形態では、方法１００は、画像メトリクスの組み合わせを含む。
引き続き図１０Ｂを参照すると、方法１００は、プローブ画像から調整済みのバックグラウンド画像を取り去って、増強された標的シグナルを含む最終的な画像を作成すること（工程１４０）をさらに含む。換言すれば、修正された（すなわち、変換された、調整された、スケーリングされた、など）ブランク画像が、元のブランク画像の代わりに、取り去る工程（工程１４０）において使用される。いくつかの実施形態では、増強された標的シグナルはコントラスト強調を含む。いくつかの実施形態では、方法１００は、ディスプレイ（例えば、コンピュータディスプレイ）に、最終的な画像を表示すること（工程１４４）を含む。最終的な画像は記憶装置に保存され、例えばネットワーク上で、ユーザーがアクセス可能であってもよい。このように、方法１００は、組織自己蛍光を伴うバックグラウンドの存在下での、改善されたシグナル検出を提供する。
いくつかの実施形態では、画像メトリクスは、ブランク画像とプローブ画像との間の、バックグラウンドにおける強度差の原因である比率因子である。強度差は、画像獲得設定が異なるときに、またはフルオロフォア励起の間の光退色から起こり得る。バックグラウンドの強度差を補正するために、方法１００は、プローブ画像対ブランク画像の全体的なバックグラウンド強度を比較する比率因子を決定するための工程１１６、工程１２０及び工程１２４を含む。最初に、プローブの画素位置を推定する（工程１１６）。プローブ画像中のプローブ位置は、例えばＷｈｉｔｅ Ｔｏｐ Ｈａｔアルゴリズム（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＆ Ｗｏｏｄｓ，２００８，Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、バンドパスフィルタ（Ｓｈｅｎｏｉ，２００６，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ）、または好適な方法の任意の組み合わせを使用して推定する。プローブ画像中の標的シグナルの推定位置を決定した（工程１１６）後に、プローブ画像及びブランク画像から推定したプローブ位置における画素を除去し（工程１２０）、その結果、バックグラウンド画素のみの画像（すなわちバックグラウンドのみの画像）が得られる。換言すれば、工程１２０は、プローブ画像から推定位置を取り除いて第１のバックグラウンドのみの画像を作成すること、及びブランク画像（バックグラウンド画像）から推定位置を取り除いて第２のバックグラウンドのみの画像を作成することを含む。
両方の画像からの推定されたプローブ位置の除去（工程１２０）に続いて、方法１００は、比率因子を決定する工程１２４を含む。換言すれば、プローブ除去ブランク画像及びプローブ除去プローブ画像についての統計的メトリクスが評価され、比率因子に組み込まれる。本明細書においてさらに説明されるように、いくつかの実施形態では、バックグラウンド画像を修正して、調整されたバックグラウンド画像を作成する（工程１３６）ために、比率因子を利用する。換言すれば、バックグラウンド画像を修正して調整されたバックグラウンド画像を作成することは、いくつかの実施形態では、比率因子によってバックグラウンド画像をスケーリングすることを含むことができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画像メトリクスは、第１のバックグラウンドのみの画像及び第２のバックグラウンドのみの画像の比率因子である。例えば、いくつかの実施形態では、比率因子は第２の強度に対する第１の強度であり、第１の強度は第１のバックグラウンドのみの画像から決定され、第２の強度は第２のバックグラウンドのみの画像から決定される。いくつかの実施形態では、比率因子で使用される第１及び第２の強度は、画像における強度値の任意の部分（全体を含む）についての統計的メトリクス、例えば統計的平均値、中央値、または両者の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１の強度は、第１のバックグラウンドのみの画像における複数の画素強度値の平均値であり、第２の強度は、第２のバックグラウンドのみの画像における複数の画素強度値の平均値である。いくつかの実施形態では、平均値は、画像中の全ての画素強度値の平均値である。その他の実施形態では、第１の強度は、第１のバックグラウンドのみの画像における複数の画素強度値の中央値であり、第２の強度は、第２のバックグラウンドのみの画像における複数の画素強度値の中央値である。いくつかの実施形態では、中央値は、画像中の全ての画素強度値の中央値である。別の実施形態では、第１の強度は、第１のバックグラウンドのみの画像における、全ての画素強度値の中央の約８０％（すなわち、概算の上位１０％及び概算の下位１０％を除く）の平均値であり、第２の強度は、第２のバックグラウンドのみの画像における、全ての画素強度値の中央の約８０％の平均値である。
いくつかの実施形態では、画像メトリクスは、ブランク画像とプローブ画像との間の起こり得る局所的強度差の原因である倍増率である。特に、図示した実施形態における方法１００は、倍増率を決定するための工程１２８を含む。いくつかの実施形態では、倍増率は、約１．０～約１．２の範囲内である。その他の実施形態では、倍増率は、約１．０～約１．１の範囲内である。本明細書においてさらに説明されるように、いくつかの実施形態では、バックグラウンド画像を修正して、調整されたバックグラウンド画像を作成する（工程１３６）ために、倍増率を利用する。換言すれば、バックグラウンド画像を修正して調整されたバックグラウンド画像を作成することは、いくつかの実施形態では、倍増率によってバックグラウンド画像をスケーリングすることを含むことができる。
いくつかの実施形態では、画像メトリクスは、局所的最大値変換である。特に、図示した実施形態における方法１００は、局所的最大値変換を用いてブランク画像を変換する工程１３２を含む。全体画像の登録後であっても、例えば、異なる焦点面での画像獲得、または試料の支持材（例えば、スライドガラス）への付着不足、及び撮像セッション間の試料の部分的な移動から、局所的バックグラウンドパターンのずれが残っている可能性がある。この問題を解決するために、局所的なずれは、変換によって補正する。図示した実施形態では、ブランク画像の各画素（「注目画素」）について、注目画素を包囲する所定の半径の近傍がサーチされる。サーチ過程により最大強度の画素が見つかり、この最大強度は、その注目画素に指定される。このサーチ手順は各注目画素について実施し、元のブランク画像において各注目画素の近傍をサーチして、変換されたブランク画像を形成する。本明細書でより詳細に説明するように、変換されたブランク画像は、後の取り去る工程（すなわち工程１４０）において、元のブランク画像の代わりに使用できる。いくつかの実施形態では、所定の半径（「マッチ距離」）は調整可能である。
いくつかの実施形態では、局所的最大値変換で使用される所定の半径は、約０～約５画素の範囲内である。換言すると、局所的最大値変換は、約０～５画素の範囲内のサーチ半径を含む。例えば、顕著な局所的バックグラウンドパターンのずれがないときは、０画素の所定の半径を利用する。いくつかの実施形態では、サーチ領域は、計算時間を減らすために、角度をつけて等間隔に置いた８本の線（すなわち４５度間隔）で、それぞれ単一画素幅を有し、注目画素から放射状に伸びる線を使用して簡略化される。
いくつかの実施形態では、画像メトリクスは、ブロックマッチング変換である。特に、方法１００は、いくつかの実施形態において、ブロックマッチング変換を用いてブランク画像を変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、ブロックマッチング変換は、局所的なずれの問題を解決するために、局所的最大値変換の代わりに使用する。いくつかの実施形態では、ブロック（「注目ブロック」）は、所定のブロックサイズ（例えば、３画素×３画素ブロック）を用いて使用される。ブランク画像の各ブロックは、近い位置（すなわち、所定のブロックサーチサイズ内）でのプローブ画像の同じサイズのブロックと比較される。サーチにより、注目ブロックに最も類似する近傍のブロックが決定される。ブロックの類似性を測定する類似性メトリクスを利用して、サーチされた、最も高い類似性メトリクスを有する近傍のブロックが標的ブロックと決定される。次に、注目ブロックを標的ブロックの対応する位置に移動させる。いくつかの実施形態では、類似性メトリクスは、絶対値差の平均値、絶対値差の合計、二乗差の平均値、または二乗差の合計であり、差は、比較される２つのブロック間の画素強度差である。このように、ブロックマッチング変換は、各注目ブロックに対して実行され、プローブ画像中の対応する近傍をサーチし、それに応じてその位置を移動し、変換されたブランク画像を形成する。いくつかの実施形態では、この変換されたブランク画像は、後の取り去る工程（すなわち工程１４０）において、元のブランク画像の代わりに使用する。
いくつかの実施形態では、所定のブロックサイズ及び所定のブロックサーチサイズは調整可能である。いくつかの実施形態では、ブロックマッチング変換で使用される所定のブロックサイズは、約１～約１０画素の範囲内である。換言すると、ブロックマッチング変換は、約１～１０画素の範囲内のブロックサイズを含む。いくつかの実施形態では、ブロックマッチング変換で使用される所定のブロックサーチサイズは、約１～約１０画素の範囲内である。換言すると、ブロックマッチング変換は、約１～１０画素の範囲内のブロックサーチサイズを含む。
いくつかの実施形態では、標的の検出を増強するための方法は、本明細書に記載の工程の任意の組み合わせを、様々な順序で含む。いくつかの実施形態では、工程を省略してもよい。さらに、工程の順序は逆にしても、変更してもよく、または同時に実行してもよい。
少なくとも１つの実施形態では、方法１００の電子ベースの側面は、１種以上の処理ユニット、例えばマイクロプロセッサ及び／または特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）を備えるコンピュータによって実行可能なソフトウェアにおいて実施されてもよい（例えば、非一時的なコンピュータ可読媒体での保存）。いくつかの実施形態では、ハードウェア、ソフトウェア、及び電子部品またはモジュールが含有され得る。このように、複数のハードウェア及びソフトウェアベースの装置、ならびに複数の異なる構造的部品を、実施形態を実施するために利用できることに留意されたい。
前述から、具体的な実施形態を例示の目的で本明細書に記載してきたが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲を逸脱することなく、種々の変更がなされ得ることを理解されたい。上記に言及される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
Claims (85)
- 標的核酸及び標的タンパク質の同時検出用の生体試料を調製する方法であって、
（ｉ）前記生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、
（ｉｉ）（ｉ）後に前記生体試料を架橋剤で処理することと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）後に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記標的核酸を検出することと、を含む、前記方法。 - （ｉｉ）前記生体試料を前記架橋剤で処理した後、かつ（ｉｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記標的核酸を検出する前に、前記生体試料をプロテアーゼで処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- （ｉｉｉ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記標的核酸を検出した後に、二次抗体またはその他の標識方法とともに前記生体試料をインキュベートすることをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が、培養細胞またはエクソソーム含有試料である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）の前記架橋剤が固定液である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記固定液が中性緩衝ホルマリンである、請求項１０に記載の方法。
- 前記中性緩衝ホルマリンが１０％中性緩衝ホルマリンである、請求項１１に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間続く、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃で約２時間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃で約１６～約１８時間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約１５分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約３０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約６０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約１５分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約３０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約６０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約１５分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約３０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約６０分間実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するための方法であって、
（ｉ）前記生体試料を一次抗体とともにインキュベートすることと、
（ｉｉ）前記生体試料を架橋剤で処理することと、
（ｉｉｉ）前記生体試料をプロテアーゼで処理することと、
（ｉｖ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記標的核酸を検出することと、
（ｖ）二次抗体またはその他の標識方法とともに前記生体試料をインキュベートすることによって前記標的タンパク質を検出することと、を含む前記方法。 - 前記標的核酸がＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
- 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
- ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記標的核酸を検出する前記工程が、
（ｉ）前記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）を提供することと、
（ｉｉ）前記１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできる、シグナル生成複合体を提供することであって、前記シグナル生成複合体が、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、前記提供することと、
（ｉｉｉ）前記標的核酸を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズすることと、
（ｉｖ）前記シグナル生成複合体を前記１つ以上の標的プローブ（複数可）に捕捉し、それによって前記シグナル生成複合体を前記標的核酸に捕捉することと、を含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。 - 前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のそれぞれが、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、前記Ｔセクションは前記標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記Ｌセクションは前記シグナル生成複合体の前記核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｔセクションは前記標的核酸の非重複領域に相補的であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｌセクションは前記生成複合体の前記核酸成分の非重複領域に相補的である、請求項２９に記載の方法。
- 前記標的タンパク質を検出するための前記二次抗体に結合できる免疫組織化学的標識を提供することをさらに含む、または前記二次抗体が予め標識されている、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料が、培養細胞またはエクソソーム含有試料である、請求項２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記架橋剤が固定液である、請求項２６に記載の方法。
- 前記固定液が中性緩衝ホルマリンである、請求項３６に記載の方法。
- 前記中性緩衝ホルマリンが１０％中性緩衝ホルマリンである、請求項３７に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間続く、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃で約２時間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４℃で約１６～約１８時間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約１５分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約３０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、室温で約６０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約１５分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約３０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約４０℃で約６０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約１５分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約３０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体試料を前記架橋剤で処理する前記工程が、約６０℃で約６０分間実施される、請求項２６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が複合組織中の空間構成をマッピングするために使用され、所望により前記複合組織が腫瘍組織である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 疾患のあるモデルからの前記生体試料において、変性した遺伝子発現を検出するために使用される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 新規抗体を検証するために使用される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、
（ｉ）架橋剤と、
（ｉｉ）前記標的タンパク質を検出する一次抗体とともに前記生体試料をインキュベートした後に、前記架橋剤が使用されることを示す取扱い説明書と、を含む前記キット。 - プロテアーゼをさらに含む、請求項５５に記載のキット。
- 生体試料中の標的核酸及び標的タンパク質を同時に検出するためのキットであって、
（ｉ）架橋剤と、
（ｉｉ）プロテアーゼと、を含む前記キット。 - 前記架橋剤が前記プロテアーゼの前に使用され、かつ前記架橋剤が前記標的タンパク質を検出する一次抗体の後に使用されることを示す取扱い説明書をさらに含む、請求項５７に記載のキット。
- 前記標的核酸を検出するための薬剤及び／または前記標的タンパク質を検出するための薬剤をさらに含む、請求項５５～５８のいずれか１項に記載のキット。
- 前記標的核酸がＲＮＡである、請求項５５～５９のいずれか１項に記載のキット。
- 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項５５～５９のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約１５分、約３０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４℃、室温、約４０℃または約６０℃で処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４℃で約２時間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４℃で約１６～約１８時間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、室温で約１５分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、室温で約３０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、室温で約６０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４０℃で約１５分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４０℃で約３０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約４０℃で約６０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約６０℃で約１５分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約６０℃で約３０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記取扱い説明書が、前記生体試料を前記架橋剤で、約６０℃で約６０分間処理することをさらに示す、請求項５５～６１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記標的核酸を検出するための前記薬剤が、前記標的核酸にハイブリダイズできる１つ以上の標的プローブ（複数可）と、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできるシグナル生成複合体と、を含み、前記シグナル生成複合体が、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）にハイブリダイズできる核酸成分、及び標識プローブを含む、請求項５９に記載のキット。
- 前記１つ以上の標的プローブ（複数可）のそれぞれが、標的（Ｔ）セクションと標識（Ｌ）セクションとを備え、前記Ｔセクションは前記標的核酸上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記Ｌセクションは前記シグナル生成複合体の前記核酸成分上のセクションに相補的な核酸配列であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｔセクションは前記標的核酸の非重複領域に相補的であり、前記１つ以上の標的プローブ（複数可）の前記Ｌセクションは前記生成複合体の前記核酸成分の非重複領域に相補的である、請求項７５に記載のキット。
- 前記生体試料を得るためのツールをさらに含む、請求項５５～７６のいずれか１項に記載のキット。
- 前記生体試料が組織検体である、または組織検体に由来する、請求項７７に記載のキット。
- 前記生体試料が血液試料である、または血液試料に由来する、請求項７７に記載のキット。
- 前記生体試料が細胞学的試料である、または細胞学的試料に由来する、請求項７７に記載のキット。
- 前記生体試料が、培養細胞またはエクソソーム含有試料である、請求項７７に記載のキット。
- 前記キットが複合組織中の空間構成をマッピングするために使用され、所望により前記複合組織が腫瘍組織である、請求項５５～８１のいずれか１項に記載のキット。
- 疾患のあるモデルからの前記生体試料において、変性した遺伝子発現を検出するために使用される、請求項５５～８１のいずれか１項に記載のキット。
- 新規抗体を検証するために使用される、請求項５５～８１のいずれか１項に記載のキット。
- 請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法によって調製される、生体試料。
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