CN115702349A - 用于同时检测靶核酸和蛋白质的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种同时检测生物样本中的靶核酸和靶蛋白的方法，所述方法包括在将所述生物样本与检测所述靶蛋白的一抗一起温育之后并且在通过原位杂交检测所述靶核酸之前，用交联剂处理所述生物样本。

Description

用于同时检测靶核酸和蛋白质的方法及其试剂盒

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月7日提交的美国临时专利申请第63/021,632号的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用方式以其整体并入本文并用于所有目的。

2.技术领域

本公开的实施方案包括用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法。还提供了用于同时检测靶核酸和靶蛋白的方法，以及用于实施该方法的试剂盒。

3.背景技术

原位杂交(ISH)是广泛用于在保留细胞和组织背景的同时检测和定位细胞或组织切片内的特定序列的分子生物学技术。因此，ISH能够实现细胞和组织内基因表达的时空可视化以及量化，这在研究和诊断中具有有用的应用。参见Hu等人,Biomarker Research 2(1):1-13(2014)；Ratan等人,Cureus 9(6)：e1325(2017)；Weier等人,Expert Review ofMolecular Diagnostics 2(2):109-119(2002)。

免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)也是用于在类似地保持空间分辨率和细胞学背景的同时检测和定位组织切片和细胞内的特定蛋白质的强大技术。与ISH类似，IHC和ICC在研究和诊断方面也具有广泛且互补的应用。参见Shi等人,Journal ofHistochemistry&Cytochemistry 59(11):13-32(2011)。例如，这两种方法都为研究人员提供了有关细胞身份和状态的见解。

组织或细胞内复杂细胞相互作用的完整表征需要多组学策略。例如，检测和分析转录组和蛋白质组信息在检测复杂组织和揭示细胞类型特异性基因表达(参见Vanlandewijck等人,Nature 554(7693):475-482(2018)；Stempl等人,Journal ofMolecular Diagnostics 14(1):22-29(2014))、鉴定所分泌蛋白的细胞来源(参见Liou等人,Cell Reports 19(7):1322-1333(2017))以及可视化各种细胞类型的空间组织及其相互作用方面提供了有用的信息。为了全面准确地表征细胞和组织，需要以空间分辨的方式同时检测同一组织样本中的核酸和蛋白质。

尽管双重检测具有关键作用，但获得同一样本中核酸和蛋白质的高质量信号一直存在问题。因此，显著需要可以检测这两种信号，例如，在一个样本中同时执行ISH和IHC/ICC而彼此互不干扰的新方法。本公开解决了这些以及其他需求。

4.发明内容

在一个方面，本文提供了用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法，其包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；(iii)在(ii)之后通过原位杂交检测靶核酸。

在一些实施方案中，所述方法还包括在用交联剂处理生物样本之后并且在通过原位杂交检测靶核酸之前用蛋白酶处理生物样本。在其他实施方案中，所述方法还包括在通过原位杂交检测靶核酸后，将生物样本与二抗或其他标记方法一起温育。在一些实施方案中，所述靶核酸是RNA或DNA。

在一些实施方案中，所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。在其他实施方案中，所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。在又其他实施方案中，所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。在另外的又其他实施方案中，所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的交联剂是固定剂。在具体实施方案中，所述固定剂是中性缓冲福尔马林(NBF)。在一个实施方案中，所述中性缓冲福尔马林是10％中性缓冲福尔马林。

例如，用交联剂处理生物样本的步骤持续约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约4℃、室温、约40℃或约60℃下执行。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约4℃下执行约2小时。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在4℃下执行约16至约18小时。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行约60分钟。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约60分钟。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约60分钟。

在另一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的方法，其包括：(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)用交联剂处理生物样本；(iii)用蛋白酶处理生物样本；(iv)通过原位杂交检测靶核酸；以及(v)通过将生物样本与二抗或其他标记方法一起温育来检测靶蛋白。

在一些实施方案中，所述靶核酸是RNA或DNA。

在一些实施方案中，通过原位杂交检测靶核酸的步骤包括：(i)提供一种或多种能够与所述靶核酸杂交的靶探针；(ii)提供能够与所述一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，在某些实施方案中，所述产生信号的复合物包含能够与所述一种或多种靶探针和标记探针杂交的核酸组分；(iii)将所述靶核酸与所述一种或多种靶探针杂交；以及(iv)将所述产生信号的复合物捕获到所述一种或多种靶探针，从而将所述产生信号的复合物捕获到所述靶核酸。在具体实施方案中，所述一种或多种靶探针中的每一种靶探针都包含靶(T)区段和标记(L)区段。在某些实施方案中，所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与产生信号的复合物的核酸组分上的区段互补的核酸序列。在某些实施方案中，所述一种或多种靶探针的T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的L区段与产生信号的复合物的核酸组分的非重叠区互补。

在一些实施方案中，所述方法还包括提供能够与二抗结合的免疫组织化学标记以用于检测靶蛋白。在其他实施方案中，所述二抗是预先标记的。

在一些实施方案中，所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。在其他实施方案中，所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。在又其他实施方案中，所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。在另外的又其他实施方案中，所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

在一些实施方案中，所述交联剂是固定剂。在具体实施方案中，所述固定剂是中性缓冲福尔马林。在一个实施方案中，所述中性缓冲福尔马林是10％中性缓冲福尔马林。

例如，用交联剂处理生物样本的步骤持续约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约4℃、室温、约40℃或约60℃下执行。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约4℃下执行约2小时。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约4℃下执行约16至约18小时。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在室温下执行约60分钟。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约40℃下执行约60分钟。

在一些实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约15分钟。在其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约30分钟。在又其他实施方案中，用交联剂处理生物样本的步骤在约60℃下执行约60分钟。

在一些实施方案中，所述方法用于测绘复杂组织中的空间组织。在某些实施方案中，所述复杂组织是肿瘤组织。在其他实施方案中，所述方法用于检测来自患病模型的生物样本中改变的基因表达。在又其他实施方案中，所述方法用于验证新抗体。

在另一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)交联剂；和(ii)说明书，其指示交联剂是在将生物样本与检测靶蛋白的一抗一起温育后使用的。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含蛋白酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测靶核酸的剂和/或用于检测靶蛋白的剂。

在又一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)交联剂；和(ii)蛋白酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括指示交联剂是在蛋白酶之前使用并且交联剂是在检测靶蛋白的一抗之后使用的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测靶核酸的剂和/或用于检测靶蛋白的剂。在一些实施方案中，所述靶核酸是RNA或DNA。

在一些实施方案中，所述说明书还指示用交联剂处理生物样本约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。在一些实施方案中，所述说明书还指示在约4℃、室温、约40℃或约60℃下用交联剂处理生物样本。

在一些实施方案中，所述说明书还指示在约4℃下用交联剂处理生物样本约2小时。在其他实施方案中，所述说明书还指示在约4℃下用交联剂处理生物样本约16至约18小时。

在一些实施方案中，所述说明书还指示在室温下用交联剂处理生物样本约15分钟。在其他实施方案中，所述说明书还指示在室温下用交联剂处理生物样本约30分钟。在又其他实施方案中，所述说明书还指示在室温下用交联剂处理生物样本约60分钟。

在一些实施方案中，所述说明书还指示在约40℃下用交联剂处理生物样本约15分钟。在其他实施方案中，所述说明书还指示在约40℃下用交联剂处理生物样本约30分钟。在又其他实施方案中，所述说明书还指示在约40℃下用交联剂处理生物样本约60分钟。

在一些实施方案中，所述说明书还指示在约60℃下用交联剂处理生物样本约15分钟。在其他实施方案中，所述说明书还指示在约60℃下用交联剂处理生物样本约30分钟。在又其他实施方案中，所述说明书还指示在约60℃下用交联剂处理生物样本约60分钟。

在一些实施方案中，用于检测靶核酸的剂包括一种或多种能够与靶核酸杂交的靶探针；以及能够与所述一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，在某些实施方案中，所述产生信号的复合物包含能够与所述一种或多种靶探针杂交的核酸组分和标记探针。在具体实施方案中，所述一种或多种靶探针中的每一种靶探针都包含靶(T)区段和标记(L)区段。在某些实施方案中，所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与产生信号的复合物的核酸组分上的区段互补的核酸序列。在某些实施方案中，所述一种或多种靶探针的T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的L区段与产生信号的复合物的核酸组分的非重叠区互补。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于获得生物样本的工具。在具体实施方案中，所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。在具体实施方案中，所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。在具体实施方案中，所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。在具体实施方案中，所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

在一些实施方案中，所述试剂盒用于测绘复杂组织中的空间组织。在具体实施方案中，所述复杂组织是肿瘤组织。在其他实施方案中，所述试剂盒用于检测来自患病模型的生物样本中改变的基因表达。在又其他实施方案中，所述试剂盒用于验证新抗体。

在另一方面，本文提供了根据上述方法制备的生物样本。

5.附图说明

图1A至图1B示出顺序和ISH/IHC集成式联合检测工作流程的示意图。图1A例示了顺序ISH-IHC工作流程中的步骤。图1B例示了ISH/IHC集成式联合检测工作流程中的步骤。

图2A至图2C显示交联保护了CD20 IHC信号免受杂交缓冲液中基于甲酰胺的试剂的压力。图2A示出经受用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的IHC染色的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)人扁桃体组织切片。图2B显示在室温下暴露于杂交缓冲液30分钟后切片的IHC信号减弱。图2C显示在存在一抗后交联(post-primary crosslinking)的情况下尽管暴露于杂交缓冲液但IHC信号得到挽救。

图3A至图3C显示交联保护了CD20 IHC信号对蛋白酶处理的抵抗。图3A示出经受使用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的用于检测CD20蛋白的IHC染色的人扁桃体组织切片。图3B显示在40℃下暴露于蛋白酶15分钟后IHC信号减弱。图3C显示在存在一抗后交联的情况下尽管暴露于蛋白酶但IHC信号得到挽救。

图4A至图4F显示杂交缓冲液或蛋白酶处理之前的交联增强了CD8 IHC信号。图4A示出经受使用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的用于检测CD8的IHC染色的人扁桃体组织切片。图4B显示在室温下暴露于杂交缓冲液30分钟后IHC信号减弱。图4C显示在存在一抗后交联的情况下尽管暴露于杂交缓冲液但IHC信号得到增强。图4D示出经受使用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的用于检测CD8的IHC染色的人扁桃体组织切片。图4E显示在40℃下暴露于蛋白酶15分钟后IHC信号减弱。图4F显示在存在一抗后交联的情况下尽管暴露于蛋白酶但IHC信号得到增强。

图5A至图5D显示ISH/IHC集成式联合检测工作流程实现了CD8蛋白与人肽基脯氨酰异构酶B(Hs-PPIB)ISH染色的联合检测。图5A示出用Leica Bond Polymer RefineDetection试剂盒进行针对CD8的IHC染色的FFPE人头颈癌样本切片。图5B示出使用

2.5LS Red试剂盒进行的Hs-PPIB ISH染色。图5C示出在顺序进行ISH和IHC的常规程序之后的ISH和IHC信号。图5D示出ISH/IHC集成式联合检测工作流程后的增强的ISH和IHC信号。

图6A至图6E显示交联是ISH/IHC集成式联合检测工作流程中IHC信号改善的关键。图6A示出经受用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒并随后用绿色色原进行针对CD20的IHC染色的FFPE人扁桃体组织切片。图6B示出经受用

2.5LS Red试剂盒进行的针对Hs-PPIB的ISH染色的FFPE人扁桃体组织切片。图6C示出经受

预处理(包括IHC染色之前在40℃下与蛋白酶一起温育15分钟，这导致IHC信号降低)的FFPE人扁桃体组织切片。图6D示出经受不具有交联步骤的ISH/IHC集成式联合检测流程的FFPE人扁桃体组织切片。图6E示出经受具有交联步骤的ISH/IHC集成式联合检测流程的FFPE人扁桃体组织切片。

图7A至图7D显示室温下的交联在被执行介于15至60分钟的时间时是有效的。图7A示出经受分别使用

2.5LS Red和Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及紧接着的用于检测CD8的IHC染色的FFPE人胃癌组织切片。图7B示出经受室温下15分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图7C示出经受室温下30分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图7D示出经受室温下60分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。

图8A至图8G示出热交联保留的IHC信号。图8A示出经受用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及紧接着的用于检测CD8的IHC染色的FFPE人胃癌组织切片。图8B示出经受40℃下15分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图8C示出经受40℃下30分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图8D示出经受40℃下60分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图8E示出经受60℃下15分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图8F示出经受60℃下30分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图8G示出经受60℃下60分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。

图9A至图9D示出4℃交联保留的IHC信号。图9A示出经受用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及紧接着的用于检测CD8的IHC染色的FFPE人胃癌组织切片。图9B示出经受室温下30分钟交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图9C示出经过4℃下2小时交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。图9D示出经受4℃下过夜交联与ISH/IHC集成式联合检测工作流程的FFPE人胃癌组织切片。

图10A至图10B示出根据本发明的一个实施方案的参考正在加工的图像(图10A)描述的用于减少背景信号的图像加工方法和该方法的一般步骤(图10B)的代表性流程图。

6.具体实施方式

本公开部分基于令人惊讶的发现，即通过重新安排实验程序和增加使样本中蛋白质交联的步骤，ISH和IHC可以在干扰最小的情况下有效地同时执行。在一些实施方案中，为了保留和改善IHC和ISH信号，一抗和二抗的温育是分开的。此外，在与一抗一起温育之后接着执行交联步骤(参见图1B)，从而保护一抗与其抗原的结合免受降解(例如，由蛋白酶处理所引起的降解)或免受ISH中常用的杂交缓冲液和高温温育引起的其他干扰(参见图2A至图2C、图3A至图3C和图4A至图4F)。这种方法导致同时增强对核酸和蛋白质的检测。

6.1定义

如本文所用，术语“原位杂交”或“ISH”是指通过保留源样本的形态定位和可视化特定靶核酸的技术。

如本文所用，术语“免疫组织化学”或“IHC”通常是指在保留源样本(例如，组织样本)的形态的情况下利用抗体检测源样本中感兴趣的蛋白质的技术。如本文所用，术语“免疫细胞化学”或“ICC”通常是指在保留源样本(例如，分离或培养的完整细胞，包括组织培养细胞系，无论是贴壁的或在悬浮的)的情况下利用抗体检测源样本中感兴趣的蛋白质的技术。免疫荧光(IF)是指荧光标记，因此它也涵盖在术语IHC和ICC中。ICC、IHC和IF测定可以与如本文进一步描述的本公开的成像加工方法(包括促进样本中感兴趣的靶标的定量和/或定性评估)结合使用。ICC、IHC和IF测定还可以与作为用于检测感兴趣的靶标的集成式共同检测过程的一部分的原位杂交结合执行，所述集成式共同检测过程还可以包括执行本公开的成像加工方法。

如本文所用，术语“同时(地)”或“同时(的)”是指从对相同生物样本而不是对不同样本执行的不同测定获得信号的过程。因此，它不一定限制来自不同测定的数据采集或信号检测的确切时间。一个测定读出可以在另一个测定读出之后。

如本文所用，术语“交联”是指使两个或更多个分子结合在一起的过程。“交联剂”或等同物是指含有两个或更多个化学反应末端的剂，所述末端将它们自身附接到蛋白质和其他分子中存在的官能团。具体而言，如果交联剂是甲醛或其等同物，则氨基酸或核酸碱基上的亲核基团与甲醛形成共价键，导致亚甲基桥的形成，所述共价键在涉及另一个官能团(通常在另一个分子上)的第二步中是稳定的。如果交联剂是氧化剂，则它可以与蛋白质和其他生物分子的侧链发生反应，从而允许形成使组织结构稳定化的交联。

如本文所用，术语“一抗”是指直接结合靶抗原的抗体。如本文所用，术语“二抗”是指与检测标记缀合的抗体。在一些实施方案中，本文提供的二抗直接与一抗结合。在其他实施方案中，本文提供的二抗与一抗(例如，通过与识别一抗的另一种抗体结合)间接结合。

如本文所用，术语“固定(fixation)”或“固定(fixing)”在针对ISH过程中的固定生物样本被提及时，是指保留生物样本以防因例如自溶或腐败而腐解的程序。它终止任何正在进行的生化反应，并且还可以增加经处理的组织的机械强度或稳定性。

如本文所用，术语“一个或多个”是指例如，1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个，或更多数量(如果特定用途需要)。

如本文所用的术语“检测”通常指任何形式的测量，并且包括确定元素是否存在。该术语包括定量和/或定性确定。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地用于描述由核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的任何长度的聚合物或合成产生的化合物，该任何长度的聚合物或合成产生的化合物可以以类似于两种天然存在的核酸类似的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。如本文所用，在多核苷酸序列的背景下，术语“多个碱基”(或“碱基”)与“多个核苷酸”(或“核苷酸”)，即多核苷酸的单体亚基同义。术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有其他已被修饰的杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅含有常规核糖和脱氧核糖，还含有其他糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸还包括位于所述糖部分上的修饰，例如，其中羟基中的一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，或被官能化为醚、胺等。“类似物”是指具有在文献中被认为是模拟物、衍生物、具有类似结构或其他类似术语的结构特征的分子，并且包括例如掺入有非天然核苷酸的多核苷酸、核苷酸模拟物(诸如2'-修饰的核苷)、肽核酸、寡聚核苷膦酸盐(酯)和任何添加了取代基(诸如保护基或连接部分)的多核苷酸。

术语“互补(的)”是指基于多核苷酸序列的多核苷酸之间的特异性结合。如本文所用，如果第一多核苷酸和第二多核苷酸在严格条件下的杂交测定中彼此结合，例如，如果它们在杂交测定中产生给定或可检测水平的信号，则它们是互补的。如果多核苷酸的各部分遵循常规碱基配对规则，例如，A与T(或U)配对以及G与C配对，则它们是彼此互补的，但可能存在具有错配、插入或缺失序列的小区域(例如，少于约3个碱基)。

如本文所用的术语“样本”涉及含有一种或多种感兴趣组分的材料或材料混合物。术语“样本”包括“生物样本”，该生物样本是指从生物受试者获得的样本，包括体内或原位获得、到达或采集的生物组织或流体来源的样本。生物样本还包括来自生物受试者的含有癌前或癌细胞或组织的区域的样本。此类样本可以是但不限于从哺乳动物分离的器官、组织、细胞和外泌体。示例性生物样本包括但不限于细胞裂解物、细胞、细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、类器官、生物流体、血液样本、尿液样本、皮肤样本等。优选的生物样本包括但不限于全血、部分纯化的血液、PBMC、组织活检物等。

如本文所用的术语“探针”是指针对特定靶mRNA序列的捕获剂。因此，探针组的每个探针具有各自的靶mRNA序列。在一些实施方案中，探针可以单独使用。在其他实施方案中，探针可以在探针组之间使用。在一些实施方案中，本文提供的探针是“核酸探针”或“寡核苷酸探针”，该核酸探针或寡核苷酸探针是指能够通常通过互补碱基配对通过形成氢键结合至具有互补序列的靶核酸(诸如本文提供的mRNA生物标志物)的核酸。如本文所用，探针可包括天然碱基(例如，A、G、C或T)或经修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，探针中的碱基可以通过除磷酸二酯键以外的连键连接，只要它不干扰杂交即可。探针可以直接或间接地用标签(例如发色团、发光团或色原)标记。通过测定探针的存在或不存在，人们可以检测感兴趣的靶mRNA生物标志物的存在或不存在。

如本公开和权利要求书中所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数形式。

应该理解，每当在本文用术语“包含”来描述实施方案时，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方案。还应该理解，每当在本文用短语“基本上由……组成”来描述实施方案时，还提供了以“由……组成”描述的其它方面类似的实施方案。

如此类术语“介于A和B之间”或“介于A-B之间”中所用，术语“介于……之间”是指包括A和B两者在内的范围。

如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用，术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。类似地，如诸如“A、B和/或C”的短语中所用，术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

6.2 ISH/IHC集成式联合检测

在一个方面，本文提供了用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法，其包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；(iii)在(ii)之后通过原位杂交检测靶核酸。

在一些实施方案中，所述方法还包括在用交联剂处理生物样本之后并且在通过原位杂交检测靶核酸之前用蛋白酶处理生物样本。在其他实施方案中，所述方法还包括在通过原位杂交检测靶核酸后，将生物样本与二抗或其他标记方法一起温育。

在一些实施方案中，本文提供的制备方法包括依次执行以下步骤：将生物样本与一抗一起温育；用交联剂处理生物样本；用蛋白酶处理生物样本；通过ISH检测靶核酸；以及将生物样本与二抗或其他标记方法一起温育。在一些实施方案中，可以包括另外的操作。

ISH是用于定位经固定的组织和细胞内特定靶核酸，从而例如获得有关基因表达和基因位点的时间和空间信息的强大技术。经标记的探针与样本中的靶核酸序列杂交。然后可以检测该经标记的探针。ISH包括制备全细胞制品、石蜡包埋组织、冷冻组织或浮动切片。如果制备的是石蜡包埋组织，则ISH的下一步是脱蜡，即去除石蜡，并对样本进行再水化。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括阻断步骤，其中某一种或多种阻断剂被施加用于阻断细胞的某些内源性组分，从而降低测定背景。例如，当辣根过氧化物酶(HRP)在后面的步骤中被用作检测酶时，过氧化氢是阻断剂。添加过氧化氢以灭活样本中的内源性HRP活性，从而降低测定背景。在具体实施方案中，这个阻断步骤被添加作为在脱蜡后立即进行的预处理的第一步骤。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括表位修复步骤，其中某一种或多种表位修复缓冲剂可被添加以对所述靶核酸进行去掩蔽(unmask)。在一些实施方案中，所述表位修复步骤包括加热所述样本。在一些实施方案中，所述表位修复步骤包括加热所述样本至约50℃至约100℃。在一个实施方案中，所述表位修复步骤包括将所述样本加热至约88℃。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括蛋白酶步骤。去污剂(例如，Triton X-100或SDS)和蛋白酶K可以用于增加经固定的细胞的通透性。通常使用Triton X-100或SDS进行的去污剂处理经常被用于通过提取脂质来渗透膜。蛋白酶K是非特异性蛋白酶，其在宽pH值范围内具有活性且不易被灭活。它被用于消化所述靶核酸周围的蛋白质。治疗的最佳浓度和持续时间可以如本领域公知的那样通过实验确定。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括使生物样本脱水。在某些实施方案中，所述脱水是用浓度不断增加的乙醇(诸如以70％、95％和100％乙醇的顺序)进行的。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括将生物样本与杂交缓冲液一起温育。在某些实施方案中，所述杂交缓冲液是基于甲酰胺的。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括将生物样本与一种或多种杂交探针一起温育。在一些实施方案中，本文提供的ISH包括扩增和检测一种或多种杂交探针。

与时间和空间信息可被保留的ISH一样，IHC是另一种广泛使用的技术，但用于检测靶蛋白。利用抗原-抗体结合的特异性，IHC可以可视化和记录细胞内及其适当适当的组织学背景中特定靶蛋白的高分辨率分布和定位。IHC包括制备全细胞制品、石蜡包埋组织、冷冻组织或浮动切片。如果制备的是石蜡包埋组织，IHC的下一步是脱蜡，即去除石蜡。在组织制备和保留过程中，如果使用交联剂，诸如福尔马林，则福尔马林固定液可能会掩蔽表位并导致免疫反应性降低(参见Arnold等人，Biotech Histochem 71:224–230(1996))。福尔马林固定是时间依赖性过程，其中增加的固定时间导致甲醛基团继续与蛋白质结合至平衡点(参见Fox等人，J Histochem Cytochem33:845–853(1985年))。研究表明，福尔马林固定，尤其是长时间固定，导致抗原性降低(参见Battifora和Kopinski，JHistochemCytochem34:1095–1100(1986))，这限制了经福尔马林固定的组织在诊断性IHC中的使用(参见Ramos-Vara，Vet Pathol42:405–426(2005),Webster等人，JHistochemCytochem.57(8):753–761(2009))。

同时用诸如ISH检测靶核酸和用诸如IHC检测靶蛋白的益处是巨大的。例如，它增加了分析的处理量并减少了与调查这些单个组件相关的时间和成本负担。此外，同一样本中的联合检测为研究人员提供了无法通过对单独切片染色获得的信息，诸如，可视化分泌的蛋白质及其一种或多种细胞的起源以及不同细胞类型的相互作用。尽管上述两种技术中的步骤似乎是相似的，但在一个样本中联合这两种技术是有问题的。

理论上，联合ISH和IHC的明显选择是首先执行IHC，然后执行ISH(参见，例如，Kochan等人，BioTechniques，59(4):209-221(2018))。尽管有报告称将免疫荧光和RNAFISH成功联合，但在信号强度、染色模式和试剂兼容性方面还不够，从而导致伪影和实验失败。此外，之前执行的IHC可能需要不含RNase，这对于更大规模或广泛的应用是不切实际的，因为除非非常小心，否则RNase会污染许多标准实验室试剂。

可替代地，可以通过首先执行ISH以保留mRNA完整性，然后立即执行IHC，从而实现在同一组织切片上同时检测靶蛋白和靶核酸(参见，例如，Stempl等人，Molecular Vision20,1366-1373.(2014)；Grabinski等人，PLoS ONE 10(3):e0120120(2015))。但是，该策略有几个缺点。首先，这种方法通常与所有感兴趣的抗体不兼容。其次，稍后执行的IHC信号经常丢失或随着这种方法的早期步骤而大大减弱。罪魁祸首之一是最初用于ISH的苛刻试剂和条件，导致材料质量不足以在同一组织切片上进行后续下游分析。例如，ISH预处理使用蛋白酶来帮助试剂渗透和靶标可及性。该蛋白酶步骤可能会破坏表位，从而破坏抗体-抗原结合，从而降低IHC信号。此外，ISH中常用的基于甲酰胺的缓冲液和高温温育可以破坏非共价抗体-抗原结合，从而降低IHC信号。

本文提供的方法通过例如使抗原-抗体结合稳定化来修改常规策略来克服上述挑战。所述稳定化是通过例如先将样本与一抗一起温育，然后在ISH检测之前用10％NBF固定样本，然后进行剩余的IHC染色而实现。

在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括在一抗结合后使样本交联，交联之后进行蛋白酶处理和ISH，然后执行剩余的IHC染色步骤。该方法具有保护表位免受蛋白酶活性影响以及通过涉及杂交缓冲液依赖性扩增的后续步骤使抗原-抗体结合稳定化的能力。该方法在联合检测蛋白质和核酸方面提供更大的灵活性，保持核酸的高分辨率检测，并使以前与传统联合检测不兼容的抗体的IHC信号稳定化。

如下文第7.2节和第7.3节所示，本文提供的方法能够检测被认为与ISH和IHC的常规联合检测不兼容的抗体(诸如CD20)。通常，如果首先执行ISH以保留来自靶核酸的信号，则IHC信号可能受到损害。例如，同一样本已通过ISH程序(诸如蛋白酶处理等处理)来进行加工，表位可能受到不良影响。因此，在潜在有问题的ISH程序之前将样本与抗体一起温育是有益的。此外，如图6C至图6E中所示，针对ISH和IHC集成增加了在温育一抗之后的交联步骤。交联改善了抗原-抗体结合，并允许检测和可视化先前与ISH条件不兼容的蛋白质表位。此外，本文提供的交联步骤被证明能通过保护样本中的抗体-抗原结合免受蛋白酶处理和杂交缓冲液温育的影响来改善IHC信号(参见图3A至图3C和图4A至图3C)。

此外，本文提供的方法展现出了对一些感兴趣的抗体的进一步增强作用。例如，杂交缓冲液温育和/或蛋白酶处理之前的交联使CD8抗体的IHC信号不仅与传统的ISH-IHC策略相比得到改善，而且与单独的标准IHC策略相比得到改善，(参见图4A至图4F和图5A至图5D)。IHC检测的类似提升适用于另外的抗体。在一些实施方案中，为了单独检测靶蛋白，可以采用类似的程序诸如在温育一抗之后的额外交联步骤来增强IHC信号。在其他实施方案中，为了单独检测靶蛋白，可以采用蛋白酶处理来增强IHC信号。在其他实施方案中，为了单独检测靶蛋白，可以采用诸如温育一抗之后的额外交联步骤和模拟部分或全部ISH程序的实验步骤以增强IHC信号。

在与一种或多种ISH探针杂交之前，可能需要几个预处理程序。例如，ISH阻断是当应用某一种或多种阻断剂来阻断细胞的某些内源性组分时，从而降低测定背景。例如，当辣根过氧化物酶(HRP)在后面的步骤中被用作检测酶时，过氧化氢是阻断剂。添加过氧化氢以灭活样本中的内源性HRP活性，从而降低测定背景。在具体实施方案中，这个ISH阻断被添加作为在脱蜡后立即进行的预处理的第一步骤。在一些实施方案中，所述预处理步骤包括靶标修复步骤，其中某一种或多种靶标修复缓冲剂可被添加以对所述靶核酸进行去掩蔽(unmask)。在一些实施方案中，所述表位修复步骤包括加热所述样本。在一些实施方案中，所述靶标修复步骤包括加热所述样本至50℃至100℃。在一个实施方案中，所述靶标修复步骤包括将所述样本加热至约88℃。在一些实施方案中，所述预处理步骤包括蛋白酶处理，其用于消化围绕靶核酸的蛋白质。治疗的最佳浓度和持续时间可以如本领域公知的那样通过实验确定。在某些实施方案中，用胰蛋白酶执行蛋白酶处理。在某些实施方案中，所述蛋白酶处理是用蛋白酶K执行的。在某些实施方案中，所述蛋白酶处理是用胃蛋白酶执行的。在某些实施方案中，所述蛋白酶处理是用链霉蛋白酶执行的。在某些实施方案中，所述蛋白酶处理是用蛋白内切酶AspN执行的。在某些实施方案中，所述蛋白酶处理是用蛋白内切酶GluC执行的。

在一些实施方案中，本文提供的用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法包括将生物样本与一抗一起温育，接着首先用交联剂处理生物样本；接下来通过ISH检测靶核酸；以及然后执行IHC的剩余步骤。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行蛋白酶处理，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行ISH阻断，接下来进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括靶标修复，接下来将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括靶标修复，接下来将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，随后进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括靶标修复，接下来将生物样本与一抗一起温育，以及随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行蛋白酶处理，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括靶标修复，接下来将生物样本与一抗一起温育，以及随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行ISH阻断，接下来进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括靶标修复，接下来将生物样本与一抗一起温育，以及随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行靶标修复，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，然后进行靶标修复，接下来进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行靶标修复，接下来进行蛋白酶处理，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行靶标修复，接下来进行ISH阻断，接下来进行蛋白酶处理，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括将生物样本与一抗一起温育，随后首先用交联剂处理生物样本，接下来进行靶标修复，接下来进行ISH阻断，接下来通过ISH检测靶核酸，以及然后执行IHC的剩余步骤，如紧接在前面的段落中所述。在其他实施方案中，本文提供的方法包括使用多于两种抗体，二抗或其他后续抗体是在一抗之后应用，并且二抗或其他检测方法是在ISH之后应用。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，所述交联剂是固定剂。在具体实施方案中，所述交联剂是甲醛。在具体实施方案中，所述交联剂是戊二醛。在具体实施方案中，所述交联剂是丙烯醛。在具体实施方案中，所述交联剂是四氧化锇。在具体实施方案中，所述交联剂是一种高锰酸盐固定剂。在一个实施方案中，所述交联剂是高锰酸钾。在具体实施方案中，所述交联剂是一类重铬酸盐固定剂。在一个实施方案中，所述交联剂是重铬酸钾。在具体实施方案中，所述交联剂是铬酸。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本，所述交联剂是交联固定剂的混合物。在一些实施方案中，所述交联剂是两种或更多种选自甲醛、戊二醛、丙烯醛、四氧化锇、高锰酸盐固定剂、重铬酸盐固定剂和铬酸列表的固定剂的混合物溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Bouin固定剂，其为苦味酸、甲醛和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛和戊二醛的混合物。在一个实施方案中，所述交联剂是FAA，其为乙醇、乙酸和甲醛的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)，其为多聚甲醛、L-赖氨酸和INaO4的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛钙，其为甲醛和氯化钙的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛盐水，其为甲醛和氯化钠的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是福尔马林锌，其为甲醛和硫酸锌的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Helly固定剂，其为甲醛、重铬酸钾、硫酸钠和氯化汞的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Hollande固定剂，其为甲醛、乙酸铜、苦味酸和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Gendre溶液，其为甲醛、乙醇、苦味酸和冰乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是醇福尔马林，其为甲醛、乙醇和乙酸钙的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛乙酸醇，其为甲醛、冰乙酸和乙醇的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是固定剂的混合物，其中所述混合物中的至少一种固定剂是甲醛或戊二醛。在一个实施方案中，所述交联剂是并非同时而是分开或连续使用的固定剂，其中至少一种固定剂是甲醛或戊二醛。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用两种或更多种交联剂处理生物样本，所述交联剂是并非同时而是分开或连续施用，并且选自甲醛、戊二醛、丙烯醛、四氧化锇、高锰酸盐固定剂、重铬酸盐固定剂和铬酸的列表。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约0℃至约100℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃至约90℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃至约80℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃至约70℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃至约60℃的温度下用交联剂处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约0℃至约100℃的温度下用约1％至约20％中性缓冲福尔马林(NBF)处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃至约90℃的温度下用约1％至约20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃至约80℃的温度下用约1％至约20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃至约70℃的温度下用约1％至约20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃至约60℃的温度下用约1％至约20％NBF处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约0℃至约100℃的温度下用约10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃至约90℃的温度下用约10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃至约80℃的温度下用约10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃至约70℃的温度下用约10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃至约60℃的温度下用约10％NBF处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约5℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约6℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约7℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约8℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约9℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约10℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约11℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约12℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约13℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约14℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约15℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约16℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约17℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约18℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约19℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约20℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约21℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约22℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约23℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约24℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约25℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约26℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约27℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约28℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约29℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约30℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约35℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约40℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约45℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约50℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约55℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约60℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约65℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约70℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约75℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约80℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约85℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约90℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约95℃的温度下用交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约100℃的温度下用交联剂处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约5℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约6℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约7℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约8℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约9℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约10℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约11℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约12℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约13℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约14℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约15℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约16℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约17℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约18℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约19℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约20℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约21℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约22℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约23℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约24℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约25℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约26℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约27℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约28℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约29℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约30℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约35℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约40℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约45℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约50℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约55℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约60℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约65℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约70℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约75℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约80℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约85℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约90℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约95℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约100℃的温度下用1％至20％NBF处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约5℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约6℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约7℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约8℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约9℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约10℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约11℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约12℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约13℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约14℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约15℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约16℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约17℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约18℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约19℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约20℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约21℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约22℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约23℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约24℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约25℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约26℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约27℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约28℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约29℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约30℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约35℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约40℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约45℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约50℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约55℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约60℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约65℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约70℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约75℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约80℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约85℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约90℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约95℃的温度下用10％NBF处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约100℃的温度下用10％NBF用10％NBF处理生物样本。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.1小时至约48小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.1小时至约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.1小时至约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.2小时至约22小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.25小时至约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.25小时至约18小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.1小时至约48小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.1小时至约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.1小时至约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.2小时至约22小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.25小时至约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.25小时至约18小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.1小时至约48小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.1小时至约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.1小时至约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.2小时至约22小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.25小时至约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.25小时至约18小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约2小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约4小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约7小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约8小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约9小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约10小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约11小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约12小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约14小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约18小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用交联剂处理生物样本约48小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约2小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约4小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约7小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约8小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约9小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约10小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约11小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约12小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约14小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约18小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理生物样本约48小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约2小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约4小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约7小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约8小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约9小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约10小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约11小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约12小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约14小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约18小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理生物样本约48小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本超过10小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本超过5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本超过1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约7小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约8小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约9小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约10小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约11小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本约12小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本少于约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本少于约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本少于约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本少于约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.15小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.2小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.35小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.4小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.45小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.55小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.65小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.7小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.8小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.85小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约0.9小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约1.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约2小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约2.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约3.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用交联剂处理生物样本约4小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用交联剂处理生物样本约1小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约6小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约3小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本少于约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.1小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.25小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.5小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本约0.75小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用交联剂处理生物样本约1小时。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为6的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为6.5的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为7的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为7.5的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为8的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为8.5的交联剂处理生物样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用pH约为9的交联剂处理生物样本。

在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度低于1％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度超过50％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为1％至50％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为2％至40％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为3％至30％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为4％至20％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为约4％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为12％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为24％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用有效浓度为37％的交联剂处理生物样本。

在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为1％至50％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为2％至40％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为3％至30％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为4％至20％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为约4％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为12％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为24％的交联剂处理生物样本。在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括用甲醛或等效物有效浓度为37％的交联剂处理生物样本。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度低于12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为室温。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为40℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为7且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为8且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为60℃。在一个实施方案中，所述交联持续少于约0.5小时。在一个实施方案中，所述交联持续少于约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括用在pH约为6且甲醛或等效物有效浓度超过12％的等渗缓冲液中的交联剂处理生物样本，并且其中所述温度为4℃。在一个实施方案中，所述交联持续超过约1小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约6小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约12小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约18小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约24小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约30小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约36小时。在一个实施方案中，所述交联持续超过约48小时。

本文提供的方法包括检测靶核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是DNA。在一些实施方案中，所述靶核酸是RNA。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于杂交的方法检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过ISH检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过分子信标检测靶RNA(参见Tyagi等人，Nat Biotechnol.4(3):303–308(1996年))。在一个实施方案中，所述方法包括通过强制插入(FIT)探针检测靶RNA(参见

等人，Chembiochem.6(1):69–77(2005))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于适体的方法检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过适体“菠菜(Spinach)”检测靶RNA(参见Paige等人，Science,333(6042):642–646(2011))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于粒子相关杂交的探针检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过金纳米粒子-量子点探针检测靶RNA。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)通过将可视化部分直接整合到靶RNA中来检测靶RNA(参见Jao等人，Proc Natl Acad Sci.105(41):15779–15784(2008))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)通过RNA结合蛋白检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过噬菌体MS2外壳蛋白(MCP)的荧光蛋白融合型式检测靶RNA(参见Park等人，Science.343(6169):422-424(2014))。在一个实施方案中，所述方法包括通过基于Pumilio的方法检测靶RNA(参见Kellermann等人，Chembiochem.14(2):200–204(2013))。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶DNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于杂交的方法检测靶DNA。在一些具体实施方案中，所述方法包括通过发色ISH检测靶DNA。在其他具体实施方案中，所述方法包括通过荧光ISH检测靶DNA。

在一些实施方案中，用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法包括各种来源的生物样本。在一个实施方案中，所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。在一个实施方案中，所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。在一个实施方案中，所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。在一个实施方案中，所述生物样本是培养的细胞。在另一个实施方案中，所述生物样本是含外泌体的样本。

组织标本包括例如组织活检样本。血液样本包括例如为诊断目的而采集的血液样本。在血液样本的情况下，所述血液可以诸如在血液涂片中被直接分析，或者可以对所述血液进行加工，例如裂解红血细胞、分离PBMC或白细胞、分离靶细胞等，以使得通过本公开方法分析的样本中的细胞是在血液样本中或来源于血液样本。类似地，可加工组织标本，例如，切碎并物理或酶促地处理组织标本以将组织破碎成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要，可加工细胞学样本以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可以使用本领域熟知的方法获得和加工组织、血液和细胞学样本。本公开的方法可被用于诊断应用以基于作为指示病理的生物标记的核酸靶的存在或不存在来鉴定病理细胞的存在或不存在。

本领域技术人员应理解，许多合适的样本类型中的任一种样本类型都可被用于使用本文提供的方法检测靶核酸和靶蛋白。用于本文提供的方法的样本通常是生物样本或组织样本。这样的样本可以从生物受试者获得，包括生物组织或流体起源的样本，其收集自个体或生物材料的一些其他来源(诸如活检、尸检或法医材料)。生物样本还包括来自生物受试者的含有或疑似含有癌前或癌细胞或组织的区域的样本，例如组织活检物(包括细针抽吸物)、血液样本或细胞学标本。此类样本可以是，但不限于，从生物体如哺乳动物分离的器官、组织、组织级分、细胞和/或外泌体。示例性生物样本包括但不限于细胞培养物，包括细胞、原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、类器官、生物流体等。另外的生物样本包括但不限于皮肤样本、组织活检物(包括细针抽吸物)、细胞学样本、粪便、体液(包括血液和/或血清样本)、唾液、精液等。此类样本可用于医学或兽医诊断目的。

用于通过本文提供的方法进行分析的细胞学样本的采集是本领域众所周知的(参见，例如，Dey,“Cytology Sample Procurement,Fi xation and Processing，见Basic andAdvanced Laboratory Technique s in Histopathology and Cytology第121-132页,Springer,Singapor e(2018)”；美国细胞病理学学会(American Society ofCytopathology)的“Non-Gynecological Cytology Practice Guideline”(ASC执行委员会2004年3月2日采用))。

例如，用于加工用于宫颈组织分析的样本(包括组织活检物和细胞学样本)的方法是本领域熟知的(参见，例如，Cecil Textbook of Me dicine,Bennett和Plum编著,第20版,WB Saunders,Philadelphia(1996)；Colposcopy and Treatment of CervicalIntraepithelial Neoplasi a:A Beginner’s Manual,Sellors和Sankaranarayanan编著,Internatio nal Agency for Research on Cancer,Lyon,France(2003)；Kalaf和Cooper,J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown和Trimble,Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人,Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012)；CervicalCytology PracticeGuidelines TOC(美国细胞病理学学会(ASC)执行委员会2000年11月10日批准))。

在特定实施方案中，所述样本是组织标本或源自组织标本。在一些实施方案中，所述组织标本是FFPE。在一些实施方案中，所述组织标本是新鲜冷冻的。在一些实施方案中，所述组织标本是用固定剂制备的。在一些实施方案中，所述组织标本是用交联固定剂制备的。在本发明的其他特定实施方案中，所述样本是血液样本或来源于血液样本。在另其他特定实施方案中，所述样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。

6.3同时检测靶核酸和靶蛋白的方法

在另一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的方法，其包括：(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)用交联剂处理生物样本；(iii)用蛋白酶处理生物样本；(iv)通过原位杂交检测靶核酸；以及(v)通过将生物样本与二抗或其他标记方法一起温育来检测靶蛋白。

除了上面第6.2节中的描述之外，所述ISH还包括将靶核酸与一种或多种靶探针杂交。用于原位检测核酸的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，US 2008/0038725；US2009/0081688；Hicks等人,J.Mol.Histol.35:595-601(2004))。如本文所用，“原位杂交”或“ISH”是一类这样的杂交，该杂交使用直接或间接标记的互补DNA或RNA链(诸如探针)来(原位)结合至并定位样本(特别是组织或细胞的部分或切片)中的特定核酸。探针类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)和/或合成的寡核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供的ISH包括提供至少一组一种或多种能够与所述靶核酸杂交的靶探针；提供能够与所述组的一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，所述产生信号的复合物包含能够与所述组的一种或多种靶探针和标记探针杂交的核酸组分；将所述靶核酸与所述组的一种或多种靶探针杂交；以及将所述产生信号的复合物捕获到所述组的一种或多种靶探针，从而将所述产生信号的复合物捕获到所述靶核酸。

在一些实施方案中，每组一种或多种靶探针包含单个探针。在其他实施方案中，每组一种或多种靶探针包含两个探针。在一些实施方案中，每组一种或多种靶探针包含多于两个探针。

在一些实施方案中，当每组靶探针包含单个靶探针时，产生信号的复合物在所述单个靶探针结合至靶核酸时形成。在其他实施方案中，当每组靶探针包含两种靶探针时，产生信号的复合物在靶探针对的两个成员都结合至靶核酸时形成。

在一些具体实施方案中，本文使用的ISH是

其更详细地描述于例如美国专利第7,709,198号、第8,604,182号和第8,951,726号中。具体来说，

描述了使用特殊设计的寡核苷酸探针与支化的DNA样产生信号的复合物的组合来在标准明场显微镜下以单分子灵敏度可靠地检测小至1千碱基的RNA(Anderson等人),J.Cell.Biochem.117(10):2201–2208(2016)；Wang等人,J.Mol.Diagn.14(1):22-29(2012))。

在一些实施方案中，每种靶探针包含靶(T)区段和标记(L)区段，其中所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与所述产生信号的复合物的核酸组分上的区段互补的核酸序列，并且其中所述一种或多种靶探针的T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的L区段与所述产生信号的复合物的核酸组分的非重叠区互补。

在一些实施方案中，一组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在其他实施方案中，两组或更多组一种或多种靶探被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，两组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，三组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，四组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，五组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，六组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，七组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，八组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，九组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，十组一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，多于10组的一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，多于15组的一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，多于20组的一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。在一些实施方案中，多于30组的一种或多种靶探针被用于检测靶核酸。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述多个核酸靶标全部包含小于100个核苷酸。在其他实施方案中，所述核酸靶标中的一些核酸靶标包含小于100个核苷酸，而其他靶标包含大于100个核苷酸。在其他实施方案中，所述多个核酸靶标中一些包含多于1000个核苷酸。

如本文所用，“靶探针”是能够与靶核酸杂交并且将标记探针或产生信号的复合物(SGC)组分捕获或结合至该靶核酸的多核苷酸。靶探针可与标记探针直接杂交，或者靶探针可与一个或多个核酸杂交，所述核酸继而与标记探针杂交；例如，靶探针可与SGC中的扩增子、前置扩增子(pre-amplifier)或前置前置扩增子(pre-pre-amplifier)杂交。因此，靶探针包括与靶核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。靶探针通常是单链的，使得互补序列可用于与相应的靶核酸、标记探针、扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子杂交。在一些实施方案中，所述靶探针是作为对提供的。

如本文所用，术语“标记探针”是指直接或间接，通常间接地结合至靶分子并且使得该靶能够被检测的实体。标记探针(或“LP”)含有核酸结合部分，该核酸结合部分通常为包含一个或多个直接或间接提供可检测信号的标记的单链多核苷酸或寡核苷酸。该标记可以与该多核苷酸共价附接，或者多该核苷酸可以被构造成与该标记结合。例如，生物素化的多核苷酸可以结合与链霉亲和素相关的标记。标记探针可例如与靶核酸直接杂交。通常，标记探针可与核酸杂交，该核酸继而与靶核酸杂交或者与一种或多种与靶核酸杂交的其他核酸杂交。因此，标记探针可包含与靶核酸的多核苷酸序列，特别是一部分互补的多核苷酸序列。替代地，所述标记探针可包含至少一个与SGC中扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的SGC包括另外的著释，诸如扩增子、前置扩增子和/或前置前置扩增子。

如本文所用，“扩增子”是能够与多个标记探针杂交的分子，通常为多核苷酸。通常，扩增子与多个同一的标记探针杂交。扩增子还可与靶核酸杂交，与一对靶探针中的至少一种靶探针杂交，与一对靶探针中的两种靶探针都杂交，或与结合靶探针的核酸，如扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子杂交。例如，扩增子可与至少一种靶探针以及与多个标记探针杂交，或者与前置扩增子和多个标记探针杂交。扩增子可以是例如线性、叉状、梳状或分支的核酸。如本文对所有多核苷酸所述，扩增子可包括经修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间连键以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。例如，美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198以及美国公开案2008/0038725和2009/0081688中描述了合适的扩增子，所述专利中的每一篇均以引用的方式并入。

如本文所用，“前置扩增子”是充当介于一个或多种靶探针与一个或多个扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置扩增子同时与一个或多种靶探针以及与多个扩增子杂交。示例性前置扩增子例如描述在美国专利第5,635,352号、第5,681,697号和第7,709,198号以及美国公布2008/0038725、2009/0081688和2017/0101672中，其各自以引用的方式并入。

如本文所用，“前置前置扩增子”是充当介于一个或多种靶探针与一个或多个前置扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置前置扩增子同时与一个或多种靶探针以及与多个前置扩增子杂交。示例性前置前置扩增子例如描述在2017/0101672中，其通过引用并入本文。

标记通常在ISH中被用于检测靶核酸。如本文所用，“标记”是使分子容易被检测的部分。常见标记包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶、荧光和发色部分，以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒、稀土金属、金属同位素等。在特定实施方案中，所述标记是酶。示例性酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及各种蛋白酶。其他标记包括但不限于荧光团、二硝基苯基(DNP)等。标记是本领域技术人员熟知的，例如描述于Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)，以及美国专利第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；和第4,366,241号中。许多标记是可商购的并且可被用于本公开的方法和测定中，包括可检测的酶/底物组合(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,DallasTX；Life Technologies,Carlsbad CA)。在本公开的特定实施方案中，所述酶可利用发色或荧光底物来产生可检测信号，如本文所述。本文描述了示例性标记。

可以使用许多酶或非酶标记中的任何一种酶或非酶标记，只要酶活性或非酶标记可以分别被检测到即可。酶由此产生可检测信号，其可用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是发色或荧光信号。因此，用作标记的特别有用的酶包括可获得发色或荧光底物的酶。这样的发色或荧光底物可以通过酶促反应转化为容易检测的发色或荧光产物，该发色或荧光产物可以使用显微镜或光谱法容易地检测和/或定量。此类酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。其他具有众所周知的发色或荧光底物的酶包括其中发色或荧光肽底物可被用于检测蛋白水解裂解反应的各种肽酶。发色和荧光底物的使用在细菌诊断学中也是熟知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等(Manafi等人,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，并且此类具有已知发色或荧光底物的酶可容易地被调适用于本文提供的方法。

用于产生可检测信号的各种发色或荧光底物为本领域技术人员所熟知并且可商购获得。可被用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(BC IP)、氮蓝四唑(NBT)、固红(固红TR/AS-MX)和对硝基苯基磷酸酯(PNPP)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷等。示例性荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基磷酸酯；用于磷酸酶的4-甲基伞形基磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸酯双(环己基铵)和4-甲基伞形基磷酸酯；用于辣根过氧化物酶的QuantaBlu^TM和Quintolet；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰基伞形基β-D-吡喃葡糖苷和4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷；和用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷。用于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公布2012/0100540中。各种可检测的酶底物(包括发色或荧光底物)是熟知的且可商购的(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；Invitrogen,Carlsbad CA；42Life Science；Biocare)。通常，将底物转化为形成沉淀的产物，沉淀沉积在靶核酸的位点。其他示例性底物包括但不限于HRP-Green(42LifeScience)、Betazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran紫、Vina绿、Deep SpaceBlack^TM、Warp Red^TM、Vulcan固红和来自Biocare的Ferangi蓝(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。

适合作为可检测标记的示例性稀土金属和金属同位素包括但不限于镧系元素(III)同位素，诸如¹⁴¹Pr、¹⁴²Nd、¹⁴³Nd、¹⁴⁴Nd、¹⁴⁵Nd、¹⁴⁶Nd、¹⁴⁷Sm、¹⁴⁸Nd、¹⁴⁹Sm、¹⁵⁰Nd、¹⁵¹Eu、¹⁵²Sm、¹⁵³Eu、¹⁵⁴Sm、¹⁵⁵Gd、¹⁵⁶Gd、¹⁵⁸Gd、¹⁵⁹Tb、¹⁶⁰Gd、¹⁶¹Dy、¹⁶²Dy、¹⁶³Dy、¹⁶⁴Dy、¹⁶⁵Ho、¹⁶⁶Er、¹⁶⁷Er、¹⁶⁸Er、¹⁶⁹Tm、¹⁷⁰Er、¹⁷¹Yb、¹⁷²Yb、¹⁷³Yb、¹⁷⁴Yb、¹⁷⁵Lu和¹⁷⁶Yb。金属同位素可以例如使用飞行时间质谱法(TOF-MS)(例如，Fluidigm Helios和Hyperion systems,fluidigm.com/systems；SouthSan Francisco,CA)检测。

生物素-亲和素(或生物素-链霉亲和素)是熟知的信号放大系统，这基于以下事实：该两个分子彼此具有特别高的亲和力并且一个亲和素/链霉亲和素分子可结合四个生物素分子。抗体被广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放大。酪酰胺信号放大(TSA)是基于因过氧化物酶活性导致大量半抗原化的酪酰胺分子沉积。酪胺是酚类化合物。在少量过氧化氢存在下，固定的辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化成短寿命、极具反应性的中间体。然后活化的底物分子在过氧化物酶结合位点处或附近与蛋白质的富电子部分(如酪氨酸)非常迅速地反应并共价结合。这样，可以在杂交位点原位引入许多与酪酰胺缀合的半抗原分子。随后，可以直接或间接使沉积的酪酰胺-半抗原分子可视化。例如美国公布2012/0100540中更详细地描述了此种检测系统。

本文所述的实施方案可以利用酶来使用合适的发色或荧光底物产生可检测信号。可以理解，替代地，标记探针可以具有直接偶联到标记探针的核酸部分的可检测标记。示例性可检测标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于发色或荧光标记(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺基罗丹明B、德克萨斯红(磺基罗丹明101)、罗丹明110以及它们的衍生物，诸如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘，诸如丹磺酰(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，诸如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa荧光染料(Molecular Probes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPY^TM)及其衍生物(Molecular Probes；Eugene,OR)；芘和磺化芘，诸如Cascade Blue^TM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基恶唑衍生物和达巴氧基衍生物(Molecular Probes)；荧光黄(3,6-二磺酸根-4-氨基-萘二酰亚胺)及其衍生物；CyDye^TM荧光染料(Amersham/GEHealthcare Life Sciences；Piscataway NJ)；ATTO 390、DyLight 395XL、ATTO 425、ATTO465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO542、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Thio12、ATTORho101、ATTO 590、ATTO 594、ATTO Rho13、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、Cyan 500NHS-酯(ATTO-TECH,Siegen,德国)等。示例性发色团包括但不限于酚酞、孔雀石绿、硝基芳族化合物如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。

如本文所公开的，本文提供的方法可被用于多个靶核酸的并行检测。在使用荧光团作为标记的情况下，选择用于检测多个靶核酸的荧光团，以使得每种荧光团是可区分的，并且在并行检测靶核酸的情况下可以在荧光显微镜中被并行地检测。选择此类荧光团以使它们的发射光谱分离，以使得可以并行检测靶核酸的不同标记。选择用于本公开方法的合适的可区分荧光团的方法是本领域熟知的(参见例如John son和Spence,“MolecularProbes Handbook,a Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies”,第11版,Life Technologies(2010))。

可以利用熟知的方法如显微法、细胞计数法(例如，质量细胞计数法，根据飞行时间的细胞计数法(CyTOF)，流式细胞计数法)或光谱法来使与相应靶核酸相关的发色、荧光或金属可检测信号可视化。通常，如果在同一测定中使用不同的标记，则将会将发色底物或荧光底物，或发色或荧光标记，或稀土金属同位素用于特定测定，以使得可以使用单一类型的仪器来检测同一样本中的核酸靶。

如本文所公开的，所述标记可以被设计成使得所述标记是任选可切割的。如本文所用，可切割标记是指这样的标记，该标记与标记探针附接或缀合，从而使得该标记可以被去除，例如，以便在随后一轮的靶核酸标记和检测中使用相同的标记。通常，所述标记通过可切割的化学接头与标记探针缀合。将标记与标记探针缀合以使所述标记可切割的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques,AcademicPress,San Diego(1996)；Daniel等人,BioTechniques 24(3):484-489(1998年))。一种特定的标记寡核苷酸的系统是FastTag^TM系统(Daniel等人，同上，1998；VectorLaboratories,Burlingame CA)。接头中可包含各种可切割部分，以使得该标记可从该标记探针上被切割。此类可切割部分包括可以被化学、光化学或酶促切割的基团。可切割的化学接头可以包括可切割的化学部分，诸如可通过还原被切割的二硫化物、可通过高碘酸盐被切割的二醇或二元醇、可被连二亚硫酸盐切割的重氮键、可被羟胺切割的酯、可被碱切割的砜等(参见Hermanson，同上，1996)。一种特别有用的可切割接头是含有二硫键的接头，该接头可以通过还原该二硫键来切割。在其他实施方案中，所述接头可以包括用于被酶切割的位点。例如，所述接头可以含有蛋白水解切割位点。通常，此种切割位点是供序列特异性蛋白酶所用的。此类蛋白酶包括但不限于人鼻病毒3C蛋白酶(切割位点LEVLFQ/GP)、肠激酶(切割位点DDDDK/)、因子Xa(切割位点IEGR/)、烟草蚀纹病毒蛋白酶(切割位点ENLYFQ/G)和凝血酶(切割位点LVPR/GS)(参见，例如，Oxford Genetics,Oxford,UK)。另一个可切割的部分可以是，例如，尿嘧啶-DNA(含有尿嘧啶的DNA)，该尿嘧啶-DNA可以被尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)切割(参见，例如，Sidorenko等人，FEBS Lett.582(3):410–404(2008年))。

可切割标记可通过施加诸如化学剂的剂或光来切割该标记并使该标记从标记探针上释放而去除。如上所讨论，用于化学切割的有用切割剂包括但不限于还原剂、高碘酸盐、连二亚硫酸盐、羟胺、碱等(参见Hermanson，同上，1996)。一种用于切割含有二硫键的接头的有用方法是使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(参见Moffitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA113:11046-11051(2016))。在一个实施方案中，TCEP被用作用于从标记探针切割标记的剂。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用标记的一抗，从而消除执行其他IHC步骤的需要。在具体实施方案中，所述一抗是用发色标记标记的。在具体实施方案中，所述一抗是用荧光标记标记的。在具体实施方案中，所述一抗是用一种或多种多核苷酸标记的。在具体实施方案中，所述一抗是通过NHS(琥珀酰亚胺)酯方法标记的。在具体实施方案中，所述一抗是通过异硫氰酸酯方法标记的。在具体实施方案中，所述一抗是通过碳二亚胺方法标记的。在具体实施方案中，所述一抗是通过双标签方法(催化剂及其底物)标记的。在具体实施方案中，所述一抗是通过高碘酸盐方法标记的。

一抗后的交联(post-primary-antibody crosslinking)可以适合于与基于荧光的检测一起使用，与BaseScope^TM信号放大系统(参见Baker等人，Nature Communication 8:1998(2017))相联合，或与使用类似方案的其他核酸检测方法相联合。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于杂交的方法检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过ISH检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过分子信标检测靶RNA(参见Tyagi等人，Nat Biotechnol.4(3):303–308(1996年))。在一个实施方案中，所述方法包括通过强制插入(FIT)探针检测靶RNA(参见

等人，Chembiochem.6(1):69–77(2005))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于适体的方法检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过适体“菠菜”检测靶RNA(参见Paige等人，Science,333(6042):642–646(2011))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于粒子相关杂交的探针检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过金纳米粒子-量子点探针检测靶RNA。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；(iii)通过将可视化部分直接整合到靶RNA中来检测靶RNA(参见Jao等人，Proc Natl Acad Sci.105(41):15779–15784(2008))。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶RNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)通过RNA结合蛋白检测靶RNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过噬菌体MS2外壳蛋白(MCP)的荧光蛋白融合型式检测靶RNA(参见Park等人，Science.343(6169):422-424(2014))。在一个实施方案中，所述方法包括通过基于Pumilio的方法检测靶RNA(参见Kellermann等人，Chembiochem.14(2):200–204(2013))

由于DNA检测可能采用可破坏抗原-抗体结合的类似蛋白酶和杂交条件，因此此处描述的交联方法也可以实现蛋白质-DNA的联合检测。在一些实施方案中，本文提供的方法用于制备用于同时检测靶DNA和靶蛋白的生物样本，包括(i)将生物样本与一抗一起温育；(ii)在(i)之后用交联剂处理生物样本；以及(iii)在(ii)之后通过基于杂交的方法检测靶DNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过发色ISH检测靶DNA。在一个实施方案中，所述方法包括通过荧光ISH检测靶DNA。

本文提供的方法是有价值的研究工具以及诊断工具。在一些实施方案中，本文提供的方法用于测绘复杂组织中的空间组织。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于鉴定细胞类型和新细胞类型。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于鉴定细胞状态。在其他具体实施方案中，本文提供的方法用于鉴定肿瘤微环境中的细胞类型和新细胞类型。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于鉴定肿瘤微环境中的细胞状态。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测患病细胞和组织中改变的基因表达。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于定位特定细胞类型中改变的基因表达以及了解肿瘤异质性。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于研究肿瘤-免疫细胞相互作用。在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测用于癌症诊断和预后的生物标志物。在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测用于癌症治疗的治疗靶标。在一些实施方案中，本文提供的方法用于促进新抗体的验证。

6.4用于同时检测靶核酸和靶蛋白的试剂盒

在又一方面，本文提供了用于执行以上第6.2节和第6.3节中所述的各种方法的试剂盒。

在另一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)交联剂；和(ii)说明书，其指示交联剂是在将生物样本与检测靶蛋白的一抗一起温育后使用的。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含蛋白酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测靶核酸的剂和/或用于检测靶蛋白的剂。

在又一方面，本文提供了用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)交联剂；和(ii)蛋白酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括指示交联剂是在蛋白酶之前使用并且交联剂是在检测靶蛋白的一抗之后使用的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测靶核酸的剂和/或用于检测靶蛋白的剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是固定剂。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是甲醛。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是戊二醛。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是丙烯醛。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是四氧化锇。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是一类高锰酸盐固定剂。在一个实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是高锰酸钾。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是一类重铬酸盐固定剂。在一个实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是重铬酸钾。在具体实施方案中，所述试剂盒中的交联剂是铬酸。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括交联剂，其为交联固定剂的混合物。在一些实施方案中，所述交联剂是两种或更多种选自甲醛、戊二醛、丙烯醛、四氧化锇、高锰酸盐固定剂、重铬酸盐固定剂和铬酸列表的固定剂的混合物溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Bouin固定剂，其为苦味酸、甲醛和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛和戊二醛的混合物。在一个实施方案中，所述交联剂是FAA，其为乙醇、乙酸和甲醛的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)，其为多聚甲醛、L-赖氨酸和INaO4的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛钙，其为甲醛和氯化钙的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛盐水，其为甲醛和氯化钠的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是福尔马林锌，其为甲醛和硫酸锌的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Helly固定剂，其为甲醛、重铬酸钾、硫酸钠和氯化汞的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Hollande固定剂，其为甲醛、乙酸铜、苦味酸和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是Gendre溶液，其为甲醛、乙醇、苦味酸和冰乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是醇福尔马林，其为甲醛、乙醇和乙酸钙的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是甲醛乙酸醇，其为甲醛、冰乙酸和乙醇的溶液。在一个实施方案中，所述交联剂是固定剂的混合物，其中所述混合物中的至少一种固定剂是甲醛或戊二醛。在一个实施方案中，所述交联剂是并非同时而是分开或连续使用的固定剂，其中至少一种固定剂是甲醛或戊二醛。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括含有两种或更多种剂的交联剂，所述两种或更多种剂是并非同时而是分开或连续施加，并且选自甲醛、戊二醛、丙烯醛、四氧化锇、高锰酸盐固定剂、重铬酸盐固定剂和铬酸的列表。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约0℃至约100℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约1℃至约90℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约2℃至约80℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约3℃至约70℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约4℃至约60℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约1℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约2℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约3℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约4℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约5℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约6℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约7℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约8℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约9℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约10℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约11℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约12℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约13℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约14℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约15℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约16℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约17℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约18℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约19℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约20℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约21℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约22℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约23℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约24℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约25℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约26℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约27℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约28℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约29℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约30℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约35℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约40℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约45℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约50℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约55℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约60℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约65℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约70℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约75℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约80℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约85℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约90℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约95℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括指示在约100℃的温度下用交联剂处理生物样本的说明书。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于从受试者获得生物样本的工具。在某些实施方案中，所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。在某些实施方案中，所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。在某些实施方案中，所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。

在具体实施方案中，本文提供的试剂盒包括用于执行

的剂，如例如美国专利第7,709,198号、第8,604,182号和第8,951,726号中更详细描述的。在一些实施方案中，所述试剂盒包括至少一组一种或多种能够与靶核酸杂交的靶探针；能够与所述组的一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，其中所述产生信号的复合物包含标记探针和能够与所述组的一种或多种靶探针杂交的核酸组分。

在一些实施方案中，所述一种或多种靶探针包含靶(T)区段和标记(L)区段，其中所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与所述产生信号的复合物的核酸组分上的区段互补的核酸序列，并且其中所述一种或多种靶探针的T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的L区段与所述产生信号的复合物的核酸组分的非重叠区互补。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括如上文第6.3节所述的产生信号的复合物，该复合物可包含标记探针、扩增子、前置扩增子和/或前置前置扩增子。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于执行ISH的其他剂或材料，包括固定剂和用于处理用于制作杂交的样本的剂、用于洗涤样本的剂，等等。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于执行IHC的其他试剂或材料，包括阻断缓冲液、二抗、IHC标记、用于洗涤样本的剂，等等。

所述试剂盒还可以包括“包装材料”，所述包装材料是指容纳试剂盒的组件的物理结构。所述包装材料可以维持所述组件的无菌性，并且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、瓦楞纤维(corrugated fiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。

本文提供的试剂盒可包括标签或插页。标签或插页包括关于所述试剂盒组件可用于的病状、病症、疾病或症状的信息。标签或插页可包括针对临床医生或受试者在方法、治疗策略(protocol)或治疗方案中使用试剂盒组件中的一种或多种试剂盒组件的说明书。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于测绘复杂组织中的空间组织。在一些具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于鉴定细胞类型和新细胞类型。在一些具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于鉴定细胞状态。在其他具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于鉴定肿瘤微环境中的细胞类型和新细胞类型。在一些具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于鉴定肿瘤微环境中的细胞状态。

在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于检测患病细胞和组织中改变的基因表达。在一些具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于定位特定细胞类型中改变的基因表达以及了解肿瘤异质性。在一些具体实施方案中，本文提供的试剂盒用于研究肿瘤-免疫细胞相互作用。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于检测用于癌症诊断和预后的生物标志物。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于检测用于癌症治疗的治疗靶标。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于促进新抗体的验证。

7.实施例

以下是研究中使用的各种方法和材料的描述，并且是为了为本领域普通技术人员提供如何执行和使用本公开的完整公开和描述而提出的，并且不意图限制发明人所认为的本发明范围，也不意图表示以下实验被执行并且是可被执行的全部实验。应当理解，以现在式时态编写的示例性描述未必执行，而是该描述可以被执行来生成与本公开的教导相关联的数据等。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、百分比等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。

7.1 ISH/IHC集成式联合检测工作流程

图1A和图1B例示了顺序ISH-IHC工作流程和集成式双ISH-IHC工作流程的步骤。最初的顺序双ISH-IHC工作流程从标准

预处理开始，并在开始IHC染色之前完成ISH染色(参见图1A)。相比之下，集成式ISH-IHC联合检测工作流程仅从预处理开始直到靶标修复。然后，IHC一抗与其在组织/细胞中的抗原结合并交联，然后进行蛋白酶处理和

染色。一旦

染色完成，IHC检测就从暴露于二抗和染色重新开始(参见图1B)。理论上，使用直接标记的一抗进行IHC可以通过消除暴露于二抗的需要来缩短这一集成式工作流程。

7.2一抗后交联保留或改善了暴露于杂交缓冲液或蛋白酶处理中之后的IHC信号

交联保护了CD20 IHC信号免受杂交缓冲液中基于甲酰胺的试剂的压力。图2A至图2C示出经受用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的IHC染色的FFPE人扁桃体组织切片。作为基线，没有受到来自ISH的任何干扰的用于CD20检测的IHC显示出清晰的信号(参见图2A)。在切片与CD20抗体一起温育后，将切片在室温下暴露于杂交缓冲液30分钟，然后进行剩余的IHC染色。暴露于杂交缓冲液显著减弱了CD20 IHC信号(参见图2B)。通过将组织在室温下与可商购获得的10％NBF一起温育30分钟来实现一抗后交联，它提高了IHC对杂交缓冲液的影响的抵抗(参见图2C)。

同样，交联也提高了CD20 IHC信号对蛋白酶处理的抵抗。使用Leica BondPolymer Refine Detection试剂盒对人扁桃体切片进行IHC染色以检测CD20蛋白，该染色产生清晰的信号(参见图3A)。在与一抗一起温育后，将载玻片在40℃下暴露于蛋白酶处理15分钟，从而导致IHC信号显著降低(参见图3B)。在一抗一起温育之后并在蛋白酶处理之前，在室温下用10％NBF交联组织30分钟改善了蛋白酶对IHC信号的影响(参见图3C)。

对于一些其他感兴趣的抗体，一抗后交联不仅可以保护IHC信号，还可以增强IHC信号。一个实例是CD8抗体。使用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒对人扁桃体切片进行IHC染色以检测CD8(参见图4A和图4D)。与CD8抗体一起温育后，将组织在室温下暴露于杂交缓冲液30分钟(参见图4B)，或在40℃下用蛋白酶处理15分钟(参见图4E)，导致显著的IHC信号减弱。在温育一抗之后并且在温育杂交缓冲液(参见图4C)或蛋白酶处理(参见图4F)之前在室温下用10％NBF交联组织30分钟使CD8 IHC信号在与标准IHC策略相比时得到了改善(分别参见图4A和图4D)。

7.3 ISH/IHC集成式联合检测工作流程成功地产生强ISH和IHC信号

作为单独IHC或ISH的基线，用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒对FFPE人头颈癌切片进行针对CD8的IHC染色，IHC检测信号是可见的(参见图5A)。另外地，还单独使用

2.5LS Red试剂盒进行了人肽基脯氨酰异构酶B(Hs-PPIB)ISH染色，并且还检测了ISH信号(见图5B)。然而，使用顺序ISH-IHC工作流程(参见图1A)(其中切片经受Hs-PPIB

2.5LS Red ISH检测，随后立即经受使用Leica Bond PolymerRefine Detection试剂盒进行的CD8 IHC染色)时，IHC信号显著降低(参见图5C)。相比之下，使用集成式联合检测工作流程(参见图1B)时，如上所述在暴露于一抗后，对组织进行交联。然后用

2.5LS Red测定对组织进行Hs-PPIB染色，随后执行剩余的IHC染色步骤。因此，集成式ISH/IHC工作流程有助于保留抗原-抗体结合，并且在CD8的情况下，改善了IHC信号(参见图5D)。

顺序和ISH/IHC集成式联合检测工作流程之间存在超过一项差异。为了进一步具体说明采用ISH/IHC集成式联合检测工作流程时哪一项或多项差异造成更好的ISH和IHC信号，进行了另一组实验。先用Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒并随后用绿色色原对FFPE人扁桃体组织切片进行针对CD20的IHC染色，结果是CD20蛋白检测(参见图6A)；或用

2.5LS Red试剂盒对FFPE人扁桃体组织切片进行针对Hs-PPIB的ISH染色，结果是RNA检测(参见图6B)。可替代地，对切片进行

预处理，该预处理包括在IHC染色之前在40℃下与蛋白酶一起温育15分钟，这导致IHC信号降低(参见图6C)。使用ISH/IHC集成式联合检测工作流程(参见图1B)时，如上所述在暴露于一抗后，对组织进行交联。使用

2.5LS Red测定进行针对Hs-PPIB的ISH染色，随后执行剩余的IHC染色步骤(二抗、发色检测和复染)。集成式ISH/IHC工作流程内的交联有助于保留抗原-抗体结合并改善IHC信号(参见图6E)。相比之下，执行没有另外的交联步骤的ISH/IHC集成式联合检测工作流程导致CD20 IHC信号均匀损失，从而突出了一抗后交联的重要性(参见图6D)。

7.4 ISH/IHC集成式联合检测工作流程中交联的温度和处理持续时间的参数

鉴于交联步骤是ISH/IHC集成式联合检测工作流程的关键步骤，因此进行了更多实验以测试不同温度和持续时间组合的可行性。首先，室温下交联被证明在15至60分钟之间是有效的。FFPE人胃癌组织经受分别使用

2.5LS Red和Leica BondPolymer Refine Detection试剂盒进行的用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及紧接着的用于检测CD8的IHC染色。使用顺序ISH-IHC联合检测工作流程时，Hs-PPIB ISH染色是成功的，同时最小的CD8 IHC信号都可以被检测到(参见图7A)。使用ISH/IHC集成式联合检测工作流程时，在室温下交联15分钟(参见图7B)、30分钟(参见图7C)和60分钟(参见图7D)导致CD8的成功IHC检测。

其次，在加热温度下的交联也被证明在15至60分钟之间是有效的。FFPE人胃癌组织经受用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及随后紧接着的用于检测CD8的IHC染色，如上所述。顺序ISH-IHC联合检测导致低CD8 IHC检测(参见图8A)。相比之下，在ISH/IHC集成式联合检测工作流程中在40℃下交联15分钟(参见图8B)、30分钟(参见图8C)或60分钟(参见图8D)使得CD8 IHC检测得到改善。与顺序ISH-IHC联合检测相比，在60℃下交联15分钟(参见图8E)、30分钟(参见图8F)或60分钟(参见图8G)也保留了IHC信号，但保留的程度低于较低的温育温度(参见，例如，图8B、图8C和图8D)。

第三，4℃下的交联在被执行2小时或过夜时也被证明是有效的。FFPE人胃癌组织经受用于检测Hs-PPIB的ISH染色以及随后紧接着的用于检测CD8的IHC染色，如上所述。如前所述，顺序ISH-IHC联合检测对CD8 IHC信号产生负面影响(参见图9A)。对集成式联合检测工作流程进行了修改，以使其允许在低于室温下进行交联温育，并手动执行组织预处理、抗体温育和交联。所有后续步骤均在Leica Bond Rx上自动进行，该步骤包括分别使用

2.5LS Red和Leica Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行的

ISH染色和剩余的IHC染色。与顺序ISH-IHC共检测(参见图9A)和室温交联30分钟(参见图9B)相比，4℃交联2小时(参见图9C)和4℃交联过夜(参见图9D)使得能够成功地对CD8进行IHC检测。

7.5图像加工

本公开的实施方案还包括用于增强靶标检测的方法100。在一些实施方案中，所述方法100包括图像加工方法。方法100在图10B中被例示为步骤流程图，而图10A例示了多个图像和方法100中用于修改图像的相应因素。在所例示的实施方案中，所述方法100至少部分地用具有存储在存储器(即，非暂时性计算机可读介质)上的相应指令的计算机来实现。来自方法100的最终图像以及在一些实施方案中的中间图像被存储在存储器中。在一些实施方案中，所述存储器可通过网络访问。在一些实施方案中，用户输入或指令可通过网络接收或访问。

所述方法100包括对具有靶信号的样本进行成像(步骤104)以创建探针图像，以及对没有靶信号的样本进行成像(步骤108)以创建背景图像(即，“空白图像”)。在一些实施方案中，所述成像使用通过网络耦合到计算机的荧光显微镜。在一些实施方案中，所述靶信号是通过对样本进行荧光原位杂交测定和/或免疫荧光测定获得的。在一些实施方案中，没有靶信号的背景图像是通过从样本中去除靶信号(即，通过切割过程)获得的。在其他实施方案中，没有靶信号的背景图像是在执行测定之前获得的。换言之，在一些实施方案中，步骤104发生在步骤108之前，而在其他实施方案中，步骤104发生在步骤108之后。在一些实施方案中，所述靶信号包括与靶核酸结合的荧光标记。在其他实施方案中，所述靶信号包括与靶肽或多肽结合的荧光标记。

继续参考图10B，所述方法100包括将探针图像和背景图像配准的步骤112。探针图像和背景图像之间潜在的背景荧光差异会产生空间模式不匹配，这是由于不同轮次图像采集之间整个样本移动而发生的。为了消除此类差异，使用了图像配准技术(例如，相位相关)。稳健的图像配准(例如，步骤112)利用图像特征的检测和匹配来补偿任何全局样本移动(即，平移和旋转)。

所述方法100进一步包括修改背景图像(步骤136)以基于至少一个图像度量来创建经调整的背景图像(例如，经变换的、经强度调整的空白图像)。如本文进一步解释的，所述至少一个图像度量是比率因子(步骤116、120、124)、倍增因子(步骤128)、局部最大值变换(步骤132)和任何其他合适的度量。在一些实施方案中，所述方法100包括单个图像度量。在其他实施方案中，所述方法100包括图像度量的组合。

继续参考图10B，所述方法100进一步包括从探针图像中扣减去经调整的背景图像(步骤140)以创建包括增强的靶信号的最终图像。换言之，在扣减步骤(步骤140)中使用经修改(即，变换、调整、缩放等)的空白图像，而不是原始空白图像。在一些实施方案中，所述增强的靶信号包括增强的对比度。在一些实施方案中，所述方法100包括在显示器(例如，计算机显示器)上显示最终图像(步骤144)。最终图像可以被保存到存储器中并且可以被用户例如通过网络访问。因此，所述方法100在具有组织自发荧光的背景存在的情况下提供改善的信号检测。

在一些实施方案中，所述图像度量是考虑空白图像和探针图像之间背景强度差异的比率因子。强度差异可能会在图像采集设置不同时发生或者可能会因荧光团激发期间的光漂白而发生。为了补偿背景强度差异，所述方法100包括步骤116、120和124以确定将探针图像的总体背景强度与空白图像进行比较的比率因子。首先，估计探针的像素位置(步骤116)。使用例如White Top Hat算法(Gonzalez&Woods,2008,Digital Image Processing)、带通滤波(Shenoi,2006,Introduction to Digital Signal Processing and FilterDesign)或合适的方法的任何组合估计探针图像中的探针位置。在确定探针图像中靶信号的估计位置之后(步骤116)，位于估计探针位置处的像素被排除在探针图像和空白图像之外(步骤120)，从而产生仅背景像素的图像(即，仅背景图像)。换言之，步骤120包括从探针图像中去除估计位置以创建第一仅背景图像，以及从空白图像(背景图像)中去除估计位置以创建第二仅背景图像。

在从这两个图像中去除估计探针位置(步骤120)之后，所述方法100包括用于确定比率因子的步骤124。换言之，对排除探针的空白图像和排除探针的探针图像两者的统计量度进行评估并将其整合到比率因子中。如本文进一步解释的，比率因子在一些实施方案中被用来修改背景图像以创建经调整的背景图像(步骤136)。换言之，修改背景图像以创建经调整的背景图像可以包括在一些实施方案中按比率因子缩放背景图像。

在一些实施方案中，所述至少一个图像度量是第一仅背景图像和第二仅背景图像的比率因子。例如，在一些实施方案中，所述比率因子是第一强度与第二强度之比，其中所述第一强度由第一仅背景图像确定，并且所述第二强度由第二仅背景图像确定。在一些实施方案中，所述比率因子中使用的第一强度和第二强度是统计度量，诸如图像中的任何部分(包括所有)强度值的统计平均值、中值或两者的组合。

在一些实施方案中，所述第一强度是第一仅背景图像中多个像素强度值的平均值，并且所述第二强度是第二仅背景图像中的多个像素强度值的平均值。在一些实施方案中，所述平均值是该图像中所有像素强度值的平均值。在其他实施方案中，所述第一强度是第一仅背景图像中的多个像素强度值的中值，并且所述第二强度是第二仅背景图像中的多个像素强度值的中值。在一些实施方案中，所述中值是该图像中所有像素强度值的中值。在另一个实施方案中，所述第一强度是第一仅背景图像中所有像素强度值的中心约80％的平均值(即，不包括约顶部10％和约底部10％)，所述第二强度是第二仅背景图像中所有像素强度值的中心约80％的平均值。

在一些实施方案中，所述图像度量是用于说明空白图像和探针图像之间潜在局部强度差异的倍增因子。特别地，所例示实施方案中的方法100包括用于确定倍增因子的步骤128。在一些实施方案中，所述倍增因子在约1.0到约1.2的范围内。在其他实施方案中，所述倍增因子在约1.0到约1.1的范围内。如本文进一步解释的，所述倍增因子在一些实施方案中被用来修改背景图像以创建经调整的背景图像(步骤136)。换言之，修改背景图像以创建经调整的背景图像可以包括在一些实施方案中按倍增因子缩放背景图像。

在一些实施方案中，所述图像度量是局部最大值变换。特别地，所例示实施方案中的方法100包括用于利用局部最大值变换来变换空白图像的步骤132。即使在全局图像配准之后，也可能仍然存在局部背景图案不匹配，该不匹配例如是由不同焦平面的图像采集，或者样本没有牢固地附着在支撑材料(例如，载玻片)上并且在成像时间之间部分移动引起的。为了解决这个问题，利用变换来补偿局部不匹配。在所例示的实施方案中，对于空白图像中的每个像素(“感兴趣的像素”)，搜索感兴趣的像素周围的预定半径的邻域。搜索过程将找到最大强度的像素，并将这个最大强度分配给那个感兴趣的像素。对每个感兴趣的像素执行此搜索过程，在原始空白图像中搜索其邻域，以形成经变换的空白图像。如这里更详细地解释的，可以在后面的扣减步骤(即，步骤140)中使用经变换的空白图像而不是原始空白图像。在一些实施方案中，所述预定半径(“匹配距离”)是可调整的。

在一些实施方案中，在局部最大值变换中使用的预定半径在大约0到大约5个像素的范围内。换言之，所述局部最大值变换包括大约0到5个像素范围内的搜索半径。例如，当没有明显的局部背景图案不匹配时，使用0像素的预定半径。在一些实施方案中，所述搜索区域被简化以通过使用从感兴趣的像素辐射的八条角度相等地间隔(即，相隔45度)的线(每条线具有单像素宽度)来减少计算时间。

在一些实施方案中，所述图像度量是块匹配变换。特别地，所述方法100在一些实施方案中包括用于利用块匹配变换来变换空白图像的步骤。在一些实施方案中，所述块匹配变换被用于代替局部最大值变换以解决局部不匹配的问题。在一些实施方案中，块(“感兴趣的块”)与预定的块大小(例如，3像素×3像素块)一起使用。将空白图像中的每个块与附近位置中(即，在预定块搜索大小内)的探针图像中相同大小的块进行比较。搜索确定与感兴趣的块最相似的临近块。利用相似性度量来衡量块的相似性，并将搜索到的具有最高相似性度量的临近块确定为靶块。然后，将感兴趣的块移动到靶块的相应位置。在一些实施方案中，所述相似性度量是平均绝对差、绝对差和、均方差或平方差和，其中所述差是被比较的两个块之间的像素强度差。因此，对每个感兴趣的块执行块匹配变换，在探针图像中搜索其对应的邻域并相应地移动其位置，以形成经变换的空白图像。在一些实施方案中，在后面的扣减步骤(即，步骤140)中使用经变换的空白图像而不是原始空白图像。

在一些实施方案中，所述预定块大小和预定块搜索大小是可调整的。在一些实施方案中，所述块匹配变换中使用的预定块大小在大约1个到大约10个像素的范围内。换言之，所述块匹配变换包括在大约1到10个像素范围内的块大小。在一些实施方案中，所述块匹配变换中使用的预定块搜索大小在大约1个到大约10个像素的范围内。换言之，所述块匹配变换包括在大约1个到10个像素范围内的块搜索半径。

在一些实施方案中，用于增强靶检测的方法包括本文所述的步骤以各种顺序的任何组合。在一些实施方案中，可以省略步骤。进一步地，步骤的顺序可以颠倒、改变或同时执行。

在至少一个实施方案中，所述方法100的基于电子的方面可以在可由具有一个或多个加工单元(诸如微处理器和/或应用程序专用集成电路(“ASIC”))的计算机执行的软件(例如，存储在非暂时性计算机可读介质上的软件)中实现。一些实施方案可以包括硬件、软件和电子组件或模块。因此，应当注意，可以利用多个基于硬件和软件的设备以及多个不同的结构组件来实现实施方案。

从上述内容将会理解，尽管为了说明目的在本文中描述了具体实施方案，但是可以在不偏离本文所提供的精神和范围的情况下可以进行各种修改。上文提及的所有参考文献都通过引用方式以其整体并入本文。

Claims (85)

1.一种用于制备用于同时检测靶核酸和靶蛋白的生物样本的方法，所述方法包括：

(i)将所述生物样本与一抗一起温育；

(ii)在(i)之后用交联剂处理所述生物样本；以及

(iii)在(ii)之后通过原位杂交检测所述靶核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括在用所述交联剂处理所述生物样本(ii)之后并且在通过原位杂交检测所述靶核酸(iii)之前用蛋白酶处理所述生物样本。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其还包括在通过原位杂交检测所述靶核酸(iii)之后将所述生物样本与二抗或其他标记方法一起温育。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。

5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是组织标本或者来源于组织标本。

7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。

8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。

9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述交联剂是固定剂。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述固定剂是中性缓冲福尔马林。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述中性缓冲福尔马林是10％中性缓冲福尔马林。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤持续约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。

14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃、室温、约40℃或约60℃下执行。

15.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃下执行约2小时。

16.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃下执行约16至约18小时。

17.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约15分钟。

18.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约30分钟。

19.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约60分钟。

20.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约15分钟。

21.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约30分钟。

22.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约60分钟。

23.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约15分钟。

24.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约30分钟。

25.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约60分钟。

26.一种用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的方法，所述方法包括：

(i)将所述生物样本与一抗一起温育；

(ii)用交联剂处理所述生物样本；

(iii)用蛋白酶处理所述生物样本；

(iv)通过原位杂交检测所述靶核酸；以及

(v)通过将所述生物样本与二抗或其他标记方法一起温育来检测所述靶蛋白。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。

29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中通过原位杂交检测所述靶核酸的步骤包括：

(i)提供一种或多种能够与所述靶核酸杂交的靶探针；

(ii)提供能够与所述一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，其中所述产生信号的复合物包含能够与所述一种或多种靶探针和标记探针杂交的核酸组分；

(iii)使所述靶核酸与所述一种或多种靶探针杂交；以及

(iv)将所述产生信号的复合物捕获到所述一种或多种靶探针，并且从而将所述产生信号的复合物捕获到所述靶核酸。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述一种或多种靶探针中的每一种靶探针均包含靶(T)区段和标记(L)区段，其中所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与所述产生信号的复合物的所述核酸组分上的区段互补的核酸序列，并且其中所述一种或多种靶探针的所述T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的所述L区段与所述产生信号的复合物的所述核酸组分的非重叠区互补。

31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括提供用于检测所述靶蛋白的能够与所述二抗结合的免疫组化标记；或其中所述二抗是经预标记的。

32.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述生物样本是组织标本或者来源于组织标本。

33.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。

34.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。

35.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

36.如权利要求26所述的方法，其中所述交联剂是固定剂。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述固定剂是中性缓冲福尔马林。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述中性缓冲福尔马林是10％中性缓冲福尔马林。

39.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤持续约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。

40.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃、室温、约40℃或约60℃下执行。

41.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃下执行约2小时。

42.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约4℃下执行约16至约18小时。

43.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约15分钟。

44.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约30分钟。

45.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在室温下执行约60分钟。

46.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约15分钟。

47.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约30分钟。

48.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约40℃下执行约60分钟。

49.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约15分钟。

50.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约30分钟。

51.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中用所述交联剂处理所述生物样本的步骤在约60℃下执行约60分钟。

52.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述方法用于测绘复杂组织中的空间组织，并且任选地，其中所述复杂组织是肿瘤组织。

53.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测来自患病模型的所述生物样本中改变的基因表达。

54.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述方法用于验证新抗体。

55.一种用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，其包括：

(i)交联剂；和

(ii)说明书，其指示所述交联剂是在将所述生物样本与检测所述靶蛋白的一抗一起温育之后使用。

56.如权利要求55所述的试剂盒，其还包括蛋白酶。

57.一种用于同时检测生物样本中靶核酸和靶蛋白的试剂盒，其包括：

(i)交联剂；和

(ii)蛋白酶。

58.如权利要求57所述的试剂盒，其还包括指示所述交联剂是在所述蛋白酶之前使用并且所述交联剂是在检测所述靶蛋白的一抗之后使用的说明书。

59.如权利要求55至58中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测所述靶核酸的剂和/或用于检测所述靶蛋白的剂。

60.如权利要求55至59中任一项所述的试剂盒，其中所述靶核酸是RNA。

61.如权利要求55至59中任一项所述的试剂盒，其中所述靶核酸是DNA。

62.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示用所述交联剂处理所述生物样本约15分钟、约30分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时。

63.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约4℃、室温、约40℃或约60℃下用所述交联剂处理所述生物样本。

64.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约4℃下用所述交联剂处理所述生物样本约2小时。

65.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约4℃下用所述交联剂处理所述生物样本约16至约18小时。

66.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在室温下用所述交联剂处理所述生物样本约15分钟。

67.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在室温下用所述交联剂处理所述生物样本约30分钟。

68.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在室温下用所述交联剂处理所述生物样本约60分钟。

69.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约40℃下用所述交联剂处理所述生物样本约15分钟。

70.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约40℃下用所述交联剂处理所述生物样本约30分钟。

71.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约40℃下用所述交联剂处理所述生物样本约60分钟。

72.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约60℃下用所述交联剂处理所述生物样本约15分钟。

73.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约60℃下用所述交联剂处理所述生物样本约30分钟。

74.如权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书还指示在约60℃下用所述交联剂处理所述生物样本约60分钟。

75.如权利要求59所述的试剂盒，其中所述用于检测所述靶核酸的剂包含一种或多种能够与所述靶核酸杂交的靶探针；以及能够与所述一种或多种靶探针杂交的产生信号的复合物，其中所述产生信号的复合物包含能够与所述一种或多种靶探针和标记探针杂交的核酸组分。

76.如权利要求75所述的试剂盒，其中所述一种或多种靶探针中的每一种靶探针均包含靶(T)区段和标记(L)区段，其中所述T区段是与所述靶核酸上的区段互补的核酸序列，并且所述L区段是与所述产生信号的复合物的所述核酸组分上的区段互补的核酸序列，并且其中所述一种或多种靶探针的所述T区段与所述靶核酸的非重叠区互补，并且所述一种或多种靶探针的所述L区段与所述产生信号的复合物的所述核酸组分的非重叠区互补。

77.如权利要求55至76中任一项所述的试剂盒，其还包括用于获得所述生物样本的工具。

78.如权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样本是组织标本或来源于组织标本。

79.如权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样本是血液样本或来源于血液样本。

80.如权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样本是细胞学样本或来源于细胞学样本。

81.如权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样本是培养的细胞或含外泌体的样本。

82.如权利要求55至81中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于测绘复杂组织中的空间组织，并且任选地其中所述复杂组织是肿瘤组织。

83.如权利要求55至81中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测来自患病模型的所述生物样本中改变的基因表达。

84.如权利要求55至81中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于验证新抗体。

85.一种根据权利要求1至25中任一项所述的方法制备的生物样本。

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