KR100973156B1 - 고친화성 분자 이미징 프로브를 스크리닝하기 위한 인 시츄클릭 화학 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기의 a) 내지 h) 단계를 포함하는 후보 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법을 제공한다: a) 후보 화합물의 제1 라이브러리를 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계; b) 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 제1 라이브러리로부터 제1 구성원을 확인하는 단계; c) 제1 결합자리에 대해 친화도를 보이는 제1 라이브러리로부터 확인된 제1 구성원을 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계; d) 후보 화합물의 제2 라이브러리와, 제1 구성원 및 표적 생체거대분자를 접촉시키는 단계; e) 후보 이미징 프로브를 형성하기 위하여, 생체거대분자 유발성 클릭 화학 반응을 통해서, 상보적인 제1 작용기와 제2 작용기를 반응시키는 단계; f) 후보 이미징 프로브를 분리하고 확인하는 단계; g) 화학 합성에 의해 후보 이미징 프로브를 제조하는 단계; 및 h) 이미징에 적용하기 위해서, 후보 이미징 프로브를 이미징 프로브로 전환시키는 단계.

클릭 화학, 이미징 프로브, 생체거대분자, 방사성 동위원소

Description

고친화성 분자 이미징 프로브를 스크리닝하기 위한 인 시츄 클릭 화학 방법{IN SITU CLICK CHEMISTRY METHOD FOR SCREENING HIGH AFFINITY MOLECULAR IMAGING PROBES}

본 발명은 고친화성 분자 이미징 프로브, 특히 PET 이미징 프로브를 제조하기 위한 인 시츄(in situ) 클릭 화학 방법의 용도에 관한 것이다.

양전자방출 단층촬영술(Positron Emission Tomography, PET)은 질병의 검출에 점점 더 사용이 증가되고 있는 분자 이미징 기술이다. PET 이미징 시스템은 환자의 조직내에서 양전자-방출 동위원소의 분포에 기초되는 이미지를 만든다. 동위원소는 신체 내에서 용이하게 대사되거나 편재되거나(예를 들어, 글루코오스) 또는 신체내 수용체 자리에 화학적으로 결합하는 분자에 화학적으로 결합되는, F-18, C-11, N-13, 또는 0-15과 같은 양전자 방출 동위원소를 포함하는 프로브 분자의 주사에 의해 전형적으로 환자에 투여된다. 일부 경우에, 방사성 동위원소는 이온 용액으로서 또는 흡입에 의해 환자에게 투여된다. 가장 널리 사용되는 양성자 방출성 표지된 PET 분자 이미징 프로브는 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로-D-글루코오스 ([¹⁸F]FDG)이다.

글루코오스 유사체 [¹⁸F]FDG를 사용하는 PET 스캐닝은, 주로 글루코오스 수송자를 표적화하며, 암의 초기 검출, 단계화 및 재단계화를 위한 정확한 임상적 도구이다. 글루코오스 이용면에서의 초기 변화는, 결과 예측과 관련되는 것이 증명되었기 때문에, PET-FDG 이미징은 암 화학치료 및 화학방사선치료를 모니터링 하는데 그 사용이 증가되고 있다. 종양 세포의 특징은 해당작용 속도가 가속화되는 것인데, 이는 급속도로 증식하는 종양 조직에서 대사작용이 많이 요구되기 때문이다. 글루코오스와 같이, FDG는 글루코오스 수송자를 통해 암 세포에 의해 흡수되며, 헥소키나아제에 의해 FDG-6 포스페이트로 인산화된다. FDG-6 포스페이트는 해당과정 내에서 더 진행될 수 없고, 이것이 띤 전하 때문에 세포 밖으로 나올 수 없기 때문에, 고속의 해당작용이 존재하는 세포가 검출되게 되는 것이다.

비록 많은 문헌에서 유용하다고 했을지라도, 암을 모니터링 하는 것에 대해서 FDG-PET 이미징의 한계점은 여전히 존재한다. 염증성 조직내에서 축적되는 것은 FDG-PET의 감도를 제한한다. 반대로, 비특이적 FDG 흡수는 또한 종양 반응 예측에 대한 PET의 감도를 제한한다. 치료 유발성 세포 스트레스 반응은 방사선치료 및 화학치료적 약물에 의해 치료되는 종양 세포주내에서 FDG-흡수가 일시적으로 증가되는 것의 원인이 되는 것으로 증명된 바 있다. 추가로, 생리적으로 높은 정상의 바탕(background) 활성(즉, 뇌에서)은 신체의 일정 영역에서 암과 관련된 FDG-흡수의 양을 정량할 수 없게 할 수 있다.

이러한 한계점 때문에, 암 조직 내 다른 효소매개성 변화를 표적화하기 위한 다른 PET 이미징 트래이서, 예컨대 도파민 합성을 위한 6-[F-18]플루오로-L-DOPA, DNA 복제를 위한 3'-[F-18]플루오로-3'-데옥시티미딘(FLT), 및 콜린 키나아제를 위한 [C-11](메틸)콜린과 초고-특이적 활성 수용체-리간드 결합(예를 들어, 16α[F-18]플루오로에스트라디올) 및 잠재적인 유전자 발현(예를 들어, [F-18]플루오로-갠시클로비어)이 개발되었다. 분자적으로 표적화된 약제는 암에서 비침입성 PET 이미징에 대한 큰 잠재적 가치가 있는 것으로 증명되었다.

이러한 연구들은 암의 특이적인 대사 표적에 대해서 비침입성 PET 이미징이 큰 가치가 있음을 증명하였다. PET 이미징을 환자 관리에 도입하는 것은 명백하게 임상적으로 가치가 있음에도 불구하고, 그 한계점은 여전히 존재한다. 일부 경우에는, 현재의 이미징 프로브는 특이성을 결여하거나, 바탕 특징 상에 부적절한 신호(signal)를 가진다. 뿐만 아니라, 치료적 개입을 위해서 시험된 신규 생물학적 표적은 이의 치료적 잠재력을 평가하기 위하여 새로운 이미징 프로브를 요할 것이다.

암 약물 개발을 지원하고, 정확하게 질병을 진단하고 치료를 모니터링하기 위한 수단을 의료관계자에게 제공하기 위해서, 암 표적에 매우 높은 친화도를 보이고, 암 표적에 특이적인 추가적인 생물학적 표지가 필요한 실정이다. 이러한 이미징 프로브는 PET 스캐너의 외견상의 공간 해상도를 현저히 개선시킬 수 있어서, 더 크기가 작은 종양도 검출될 수 있게 하고, 환자에게 나노몰의 양으로 주사될 수 있도록 할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 암 및 기타 질병과 관련된 생체거대분자를 표적화하는 고친화성 PET 프로브를 확인하기 위한, 인 시츄 클릭 화학 접근법에 근거한 기술 기반을 제공한다(Mocharla, V. P.; Colasson, B.; Lee, L. V.; Roeper, S.; Sharpless, K. B.; Wong, C-H.; Kolb, H. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 116-120). 생물학적 표적을 위한 고친화성 리간드는, 생물학적 표적이 결합 포켓의 테두리내에 있는 2개의 반응성 단편의 조립을 주도함으로써, 인 시츄 클릭 화학을 통해 만들어진다. 표적에서 생성된 리간드를 방사성 표지하면, 종양 위치의 진단 및 확인을 허용할 수 있고, 치료의 목적으로 종양 유형에 대한 메카니즘 정보를 제공할 수 있는, 후보 PET 이미징 프로브가 제공된다. 스크리닝 방법에서 사용되는 한 쌍의 단편 중 적어도 하나는, 방사성 핵종(예를 들면, F-18)이 후에 도입되는 것을 용이하게 하기 위하여, 디자인의 일부로서 분자 이미징 프로브에 사용하기에 적합한 핵종내에 방사성 동위원소를 포함하는 원소(또는 화학 원소)의 비방사성 동위원소(예를 들면, F-19)를 전달한다.

일 양태에서, 본 발명은 탄산무수화효소-II(CA-II)에 대한 새로운 부류의 분자 이미징 프로브를 확인한다. 생리학적으로 CA-II는 탄산무수화효소 패밀리 중 공지되어 있는 14개의 동질효소(isozyme) 중 하나이며, 거의 대부분의 신체내 장기 및 조직에서 발현된다. 이산화탄소에서 중탄산 이온으로 가역적으로 수화되는 것을 촉매하는 이 효소의 능력이 중요한 것임은 두말할 나위 없다. 이러한 생물학적으로 중요한 기능은 조직 간에 HCO₃ ^-/CO₂를 수송하는 것, pH 조절, 뼈 재흡수 및 각종 상 피에서의 전해물 분비를 포함하는 과정에서 CA-II가 중요한 역할을 하게 한다. CA 패밀리에는 다른 것도 있는데, 구체적으로는 동질효소 CA-IX 및 CA-XII로서, 이들은 암 세포에서 과다발현되는 것으로 보고되어 있다. 신규 CA-IX 및 CA-XII 이미징제의 확인에 이러한 스크리닝 기술을 추가로 적용하면, CA-IX 및 CA-XII를 발현하는 종양을 성공적으로 이미징화할 수 있으므로, 종국적으로 신규의 치료제 및 신규의 치료방법의 확인을 유도할 수 있을 것이다.

또다른 양태에서, 신규의 트리아졸 함유 사이클로옥시게나아제-2(COX-2) 방사성리간드의 확인에 스크리닝 기반을 적용할 수도 있는데, 이 리간드는 인 비보(in vivo)에서 COX-2 발현을 이미징화하기 위해 사용될 수 있는 것이다. COX-2는 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘이 생성되는 것을 촉매하는 COX 패밀리에 속하는 유발성 구성원이며, 염증성 조직에서 매우 많이 발현된다. COX-2를 발견했을 당시에는, 새로운 부류의 COX-2 특이적 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDS)이 COX-2 매개성 염증관련 질병, 가장 흔하기로는 류마티스성 관절염에 대한 치료를 제공하였다. COX-2 특이적 억제제가 COX-2를 선택적으로 표적화하지만 COX-1은 표적화하지 않기 때문에, 위출혈과 같은 기존의 NSAID 관련 치료에 수반되는 흔한 부작용이 없다. 새로운 COX-2 치료는 COX-1 억제 부작용을 수반하지는 않지만, COX-2 기반 치료는 로페콕십(Rofecoxib) (Vioxx^®)의 치료적 사용과 관련된 혈관계의 문제라고 일컬어지는 것 때문에 더 많은 주목을 받았다. 인 비보 이미징의 견지에서, 이유가 밝혀지지 않은 부작용을 갖는 화합물, 예컨대 COX-2 억제제의 약력학을 모니터링하 면, 보다 안전한 치료제를 개발할 수 있도록 하는 통찰력을 제공하여 개발 방향을 제시할 것이다.

또다른 양태에서, 스크리닝 방법은 효소, 수용체, DNA, RNA 및 항체와 같은 각종 생체거대분자로부터 유래한 분자 이미징 프로브를 확인하기 위해 사용된다. 이는, 이러한 생체거대분자가 인 비보에서 과다발현되거나 과다활성화될 때, 이들이 분자 이미징 프로브에 결합하는 것을 통해 검출된다. 예를 들면, 탄산무수화효소-II가 높은 수준으로 발현되는 조직(예를 들면, 적혈구 세포)을 인 비보 영상화하는 것은, 이러한 스크리닝 방법에 의해 확인되는 고친화성 CA-II 방사성리간드를 투여함으로써 달성할 수 있다. 또다른 양태에서, 스크리닝 기술은 상징적인 거대분자를 매우 많이 발현하는 종양을 확인하기 위해 적용할 수도 있다. 예를 들면, 암 영상화 영역에서는, 키나아제 패밀리의 종양발생 단백질에 특이적으로 표적화되는 방사성리간드가 특정한 종양 표현형의 검출을 유도할 수 있다. 특히 바람직한 표적 키나아제는 PI-3-키나아제/AKT 신호전달 경로 (PI-3-키나아제: 포스포이노시톨 3-키나아제; Akt: 프로테인 키나아제 B)에 속하는 것으로서, 이들은 암 세포 생존에 관련된 것이다. 예를 들면, 키나아제 Akt는 세포가 암으로 전환되는데 있어서 핵심 노드이며, 이에 따라 세포에 침입하는 이미징 프로브를 개발하는데 있어 핵심 표적이 되게 하고 고특이성 및 고친화성을 가지고 활성화된 Akt를 찾도록 해 준다.

일 양태에서, 스크리닝 방법은 효소의 결합자리에 대한 친화도를 보일 수 있는 다수개의 분자를 확인하는 것과, 이의 핵종내 적어도 하나의 방사성 동위원소(예를 들면, F-18)를 포함하는 하나의 원소의 비방사성 동위원소(예를 들면, F-19) 를 상기 분자에 공유결합적으로 부착시키는 것을 포함한다. 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 작용기, 예컨대 아지드기나 알킨기 또한, 선택적으로는 링커나 링커들을 통해 분자에 부착시킬 수 있다. 만들어진 다수개의 분자의 개개의 구성원을, 표적 분자와, 효소의 기질 결합자리에 대한 친화도를 보일 수 있는 화합물의 다수개 또는 라이브러리의 개개의 구성원과 혼합한다. 기질 결합 라이브러리의 구성원은 상보적인 클릭 단편 분자의 라이브러리의 작용기와 함께 사용할 수 있는 클릭 화학 작용기를 포함하도록 화학적 변형된다. 일 양태에서, 표적 키나아제 중 2개의 표적화된 결합자리에 대한 친화도를 보이는, 각 라이브러리로부터의 하나를 포함하는 한 쌍의 화합물을, 인 시츄에서 클릭 화학 작용기를 통해 공유결합시킬 것이다. 이러한 리간드는 선택이온검출질량분석기(SIM/MS)와 같은 공지된 방법에 의해 확인된다. 이러한 화합물을 화학적으로 합성한 후에는, 이들의 결합 상수를 결정하기 위하여 통상적인 생물학적 분석 기술을 사용하여 분석한다. 충분히 높은 결합 친화도(전형적으로는 100 nM 이하, 1 fM 이상의 IC₅₀ 값을 갖는 것)을 갖는 리간드들은 히트(hit) 화합물로 간주되고 분자 이미징 프로브가 될 수 있는 후보로 간주된다. 하지만 초기의 스크리닝에서 화합물이 충분한 결합 친화도를 갖지 않는 것으로 밝혀진 경우에는, 최적의 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 스크리닝을 다시 시작하고 과정들을 계속하여 반복한다. 그 다음으로 히트 화합물을 표준 방사선화학 기술을 통해 분자 이미징 프로브로 전환한다.

본 발명은 하기의 도면을 참조하여 개괄적으로 설명하고자 하며, 하기의 도면은 본 발명의 범위를 정하는데 필수적인 것이 아님을 염두에 둔 하에서,

도 1은 인 시츄 클릭 화학 방법의 개요도이고,

도 2는 키나아제 템플레이트(template)를 사용하여 리간드를 스크리닝하기 위한 본 발명의 인 시츄 클릭 화학 방법의 양태의 개요도이며,

도 3a는 Akt 내부에서 형성될 수 있는 리간드의 두가지 경로를 도시한 것이고,

도 3b는 리보오스 잔기 및 아르지닌 잔기 간의 가까운 거리(경로 A)를 드러내고, ATP의 포스페이트 및 세린 잔기 간의 가까운 거리(경로 B)를 드러내는 Akt의 X선 결정 구조이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명은, 많은 다른 형태로 구체화될 수도 있고, 본원에서 설명되는 양태로 한정되어 해석되어서는 안되며; 오히려, 이들 양태는 본 명세서를 충분하고 완전하도록 할 것이며, 당업자에게 본 발명의 범위를 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.

I. 정의

본원에 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥에서 다른 것으로 명확하게 언급되지 않는다면 복수형태를 포함한다.

"알킬"은 길이에서 전형적으로 약 1 내지 20개 원자의 범위에 있는, 탄화수소 사슬을 언급한다. 이러한 탄화수소 사슬은, 비록 전형적으로 직쇄가 바람직하다고 할지라도, 분지쇄 또는 직쇄일 수도 있다. 대표적인 알킬기는 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸, 등을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "알킬"은 3개 이상의 탄소 원자가 언급될 때 사이클로알킬을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은 "고정 자리"는 제1 결합자리와 동의어이다.

"아릴"은 하나 이상의 방향족 환, 각각의 5 내지 6개의 중심 탄소 원자를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합될 수도 있는 또는 비페닐에서와 같이 융합되지 않을 수도 있는 다중 아릴 환을 포함한다. 아릴 환은 또한 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로고리 환으로 융합 또는 융합되지 않을 수도 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, "아릴"은 헤테로아릴을 포함한다.

"생물학적 표적"은 암(예를 들어, 백혈병, 림프종, 뇌종양, 유방암, 폐암, 전립선암, 위암과 피부암, 방광암, 뼈암, 자궁경부암, 대장암, 식도암, 안암, 담도암, 간암, 신장암, 후두암, 구강암, 난소암, 췌장암, 음경종암, 선상피종양, 직장암, 소장암, 육종, 고환암, 요도암, 자궁암, 질암), 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 순환기질환, 호흡기질환, 소화기질환, 감염질환, 염증성질환, 자가면역 질환 등을 포함하는 어떤 다양한 질병 및 질환과 관련되는 생물학적 경로에 포함되는 어떤 생물학적 분자일 수도 있다. 대표적인 생물학적 경로는, 예를 들어, 세포 순환 조절(예를 들어, 세포의 증식 및 아포토시스), 혈관신생, 신호 전달 경로, 종양 억제자 대사경로, 감염(COX-2), 종양유전자, 및 성장인자 수용체를 포함한다. 생물학적 표적은 또한 "표적 생체거대분자" 또는 "생체거대분자"로서 언급될 수도 있다. 생물학적 표적은 효소 수용체, 리간드-개폐 이온 채널, G-단백질-결합 수용체, 및 전사 인자와 같은 수용체일 수 있다. 생물학적인 표적은 바람직하게는 효소, 막 수송 단백질, 호르몬, 및 항체와 같은, 단백질 또는 단백질 복합체이다. 한 가지 특히 바람직한 양태에서, 단백질 생물학적 표적은 탄산무수화효소-II와 같은 효소 및 탄산무수화효소 IX 및 XII와 같은 관련된 동질효소이다.

본원에 사용되는 바와 같은 "상보적 작용기"는 새로운 공유 결합을 형성하기 위해 고 특이적으로(즉, 기가 한 가지에 대해 선택적이고 이들의 반응은 예측가능한 형태로 잘 정의된 생성물을 제공한다) 다른 것과 반응하는 화학적인 반응기를 의미한다.

"사이클로알킬"은 가교, 융합, 또는 스피로 사이클릭 화합물을 포함하는, 바람직하게는 3 내지 약 12개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 3 내지 약 8개로 구성되는, 포화 또는 불포화 고리형 탄화수소 사슬을 언급한다.

"헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S, 또는 이들의 조합을 함유하는 아릴기이다. 헤테로아릴 환은 또한 하나 이상의 고리형 탄화수소, 헤테로고리, 아릴, 또는 헤테로알릴 환으로 융합될 수도 있다.

"헤테로사이클" 또는 "헤테로고리"는 불포화 또는 방향족 특성을 갖거나 갖지않는, 하나 이상의 5-12개의 원자, 바람직하게는 5-7개의 원자를 의미하며 탄소원자가 아닌 적어도 하나의 환을 가진다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다.

본원에 사용되고 또한 당업계에서 공지되어 있는 바와 같이 정의되는 "키나아제"는, 아데노신 트리포스페이트(ATP)로부터의 포스페이트를 치환체 분자로 전달하는 효소이다. 키나아제는 인산화에서 보조인자인, ATP에 대한 결합자리와, 전형적으로 다른 단백질인, 치환체 분자에 대한 적어도 하나의 결합자리를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은 "이탈기"는 예를 들어, 아민, 티올 또는 알콜 친핵체 또는 그것의 염과 같은 친핵체에 의해 용이하게 치환되는 기를 의미한다. 이러한 이탈기는 공지되어 있으며, 예를 들어, 카르복실산염, N-하이드록시숙신이미드, N-하이드록시벤조트리아졸, 할로겐화물, 트리플레이트, 토실레이트, -OR 및 -SR 등을 포함한다.

"리간드"는, 바람직하게는 약 800 Da.보다 적은, 더 바람직하게는 약 600 Da.보다 적은 분자량을 가지며, 단백질과 같은 생물학적 표적 분자에서 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 제1의 기, 그리고 동일한 생물학적 표적 분자에서 제2 결합자리에 대한 친화도를 보이는 제2의 기를 포함한다. 두 개의 결합자리는 표적 분자 상의 동일한 결합 포켓 내에서도 별개의 영역일 수 있다. 리간드는 바람직하게는 생물학적 표적 분자에 대해 나노몰의 결합 친화도를 보인다. 본원에 개시되는 바와 같은 어떤 측면에서, 리간드는 "기질"로 호환하여 사용된다. 리간드는 본원에서 정의되는 바와 같은 "분자적 구조"를 포함할 수도 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 "링커"는 1 내지 10개의 원자를 포함하는 사슬을 언급하며, C, -NR-, O, S, -S(O)-, -S(O)₂-, CO, -C(NR)-등과 같은 원자 또는 기를 포함할 수도 있고, 여기서 R은 H이거나 또는 각각이 치환 또는 비치환된, (C_{1 -10})알킬, (C_{3 -8})사이클로알킬, 아릴(C_1-5)알킬, 헤테로아릴(C_1-5)알킬, 아미노, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록시, (C_{1 -10})알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시로 구성되는 군 중에서 선택된다. 링커 사슬은 또한 다고리 및 헤테로방향족 환을 포함하는, 포화, 불포화 부분 또는 방향족 환을 포함할 수도 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 "금속 킬레이트기"는, 당업계에서 정의되는 바와 같고, 예를 들어, 금속이온을 선택적으로 부착되거나 또는 결합하고, 복합체를 형성하는 분자, 단편 또는 작용기를 포함할 수도 있다. 어떤 유기 화합물은 유기 화합물의 두 개 이상의 원자를 통해 금속과 배위 결합을 형성할 수도 있다. 이러한 분자의 예는 DOTA, EDTA, 및 포르핀을 포함한다.

"분자적 구조"는 클릭 작용기에 부착되는, 선택적으로는 이탈기 및/또는 방사성 동위원소에 부착되는 분자 또는 분자의 부분 또는 단편을 언급하며, 또는 특정 변화에서, 분자는 클릭 작용기에 부착되는 링커에 부착될 수도 있다. 이러한 분자적 구조의 비배타적 예는, 예를 들어, 치환 또는 비치환 메틸렌, 선형 또는 분지형인 알킬기(C₁-C₁₀)를 포함하며, 각각 선택적으로 O, N 및 S, 아릴 및 각각 비치환 또는 치환인 헤테로아릴기, 생체거대분자, 뉴클레오시드 및 이들의 유사체 또는 유도체, 펩티드 모방체, 탄수화물 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로원자를 포함한다.

"다좌 금속 킬레이트기"는 금속을 동시에 배위(즉, 킬레이트)할 수 있는 두 개 이상의 주게 원자를 가지는 화학적 기를 의미한다. 따라서, 다좌기는 두 개 이상의 주게 원자를 가지며 배위구체에서 두 개 이상의 자리를 점유한다.

용어 "환자" 및 "대상"은 특히 모든 포유동물을 포함하는, 어떤 인간 또는 동물 대상을 언급한다.

용어 "고리형 협동반응"은 협동하는 고리 전이 상태에서 만들어지거나 깨지는 반응을 언급한다. 협동반응은 반응의 과정 동안 어떤 중간체도 함유하지 않는 것이다. 전형적으로, 반응물 자체가 전하를 띠지 않는 한, 즉, 카보늄 이온 또는 카보 음이온이 아닌 한, 반응 속도에 대해 상대적으로 작은 용매 효과가 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "방사화학물질"은 공유결합적으로 부착된 방사성 동위원소, 어떤 무기 방사성 이온 용액(예를 들어, Na[¹⁸F]F 이온 용액), 또는 어떤 방사성 기체(예를 들어, [¹¹C]CO₂)를 포함하는 어떤 유기, 무기 또는 유기 금속 화합물을 포함하도록 의도되고, 특히 조직 이미징 용도로 환자에 투여되도록 의도되고, 또한 방사성의약품, 방사성트래이서, 또는 방사성리간드로서 당업계에서 언급되는 방사성 분자 이미징 프로브를 포함하는 용어이다. 본 발명이 PET 이미징 시스템에서 사용을 위한 양전자-방출 분자 이미징 프로브의 합성에 관한 것일지라도, 본 발명은 단일광자방출단층촬영술(single photon emission computed tomography (SPECT))과 같은, 다른 이미징 시스템에서 유용한 방사 화학을 포함하는, 방사성핵종을 포함하는 임의의 방사성 화합물의 합성에 용이하게 변형될 수도 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "방사성 동위원소"는 방사성 붕괴(즉, 양전자를 방출)를 보이는 동위원소 및, 방사성 동위원소를 포함하는 방사성표지제(예를 들어, 탄소-11을 함유하는 [¹¹C]메탄, [¹¹C]일산화탄소, [¹¹C]이산화탄소, [¹¹C]포스겐, [¹¹C]우레아, [¹¹C]시아노겐 브로마이드와 다양한 산 염화물, 카르복실산, 알콜, 알데하이드, 및 케톤)를 언급한다. 이러한 동위원소는 또한 방사성동위원소 또한 방사성핵종로서 당업계에서 언급된다. 방사성동위원소는 흔히 사용되는 다양한 원소명 또는 원소기호와 이의 질량수를 병기하여 본원에서 명명된다(예를 들어, ¹⁸F, F-18, 또는 플루오르-18). 대표적인 방사성 동위원소는 I-124, F-18 플루오르, C-11, N-13, 및 O-15를 포함하며, 각각, 4.2일, 110분, 20분, 10분, 및 2분의 반감기를 가진다. 방사성 동위원소는 바람직하게는 극성 비양자성 용매와 같은, 유기 용매에 용해된다. 바람직하게는, 본 방법에 사용되는 방사성 동위원소는 F-18, C-11, I-123, I-124, I-127, I-131, Br-76, Cu-64, Tc-99m, Y-90, Ga-67, Cr-51, Ir-192, Mo-99, Sm-153 및 Tl-201을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 방사성 동위원소는 하기를 포함한다: As-72, As-74, Br-75, Co-55, Cu-61, Cu-67, Ga-68, Ge-68, I-125, I-132, In-111, Mn-52, Pb-203 및 Ru-97.

광학 이미징제는 파장 방출이 400nm 이상 1200nm 이하인 분자를 언급한다. 광학 이미징제의 예는 Alex Fluor, BODIPY, 나일 블루, COB, 로다민, 오레곤 그린, 플루오레세인 및 아크리딘이 있다.

용어 "반응성 전구체"는 소분자, 천연 생성물, 또는 생체분자(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)와 같은, 아지드 또는 알키닐기의 첨가에 의해 화학적으로 변형될 수 있는 어떤 다양한 분자와 관련되어 있다. 두 개의 전구체 분자로부터 리간드가 형성되기 위해서는, 전구체 분자중 하나는 그것의 핵종내에 방사성 동위원소를 가지는 하나의 원소의 비방사성 동위원소를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 어떤 측면에서, 용어 "리간드"는 생체거대분자에 결합하는 전구체, 화합물 및 이미징 프로브를 언급할 수도 있다. 리간드의 두 개의 전구체는 바람직하게는 효소와 같은 생물학적 표적 분자 상의 별개의 결합자리(또는 동일한 결합자리나 포켓 중의 별개의 섹션)에 대해 친화도를 보인다. 생체거대분자 상의 활성 자리에 대한 결합 친화도를 가지는 반응성 전구체는 때때로 본원에서 "고정 분자"로서 언급된다. 키나아제의 기질 결합자리에 대한 결합 친화도를 가지는 반응성 전구체는 때때로 본원에서 "기질 모방체"로서 언급된다. 용어 "반응성 전구체"는 또한 후보 화합물의 라이브러리를 포함하는 후보 화합물을 제조하는데 사용되는 전구체 또는 화합물을 언급할 수도 있다.

리간드 방사화학 양태를 가지는 본 방법의 특정 측면에서, 전구체 분자 중 하나는 또한 전구체에 방사성동위원소를 공유결합적으로 부착하기 위하여 친핵성 치환에 의해 용이하게 치환될 수 있는 이탈기를 포함할 수도 있다. 대표적인 반응성 전구체는 기존의 PET 프로브 분자, EGF, 암 마커(예를 들어, 유방암에 대한 p185HER2, 난소암, 폐암, 유방암, 췌장암, 및 위장관암에 대한 CEA, 및 전립선암에 대한 PSCA), 성장인자 수용체(예를 들어, EGFR 및 VEGFR), 자가면역질환과 관련되는 글리코단백질(예를 들어, HC gp-39), 종양 또는 염증 특이적 글리코단백질 수용체(예를 들어, 셀렉틴), 인테그린 특이적 항체, 바이러스-관련 항체(예를 들어, HSV 글리코단백질 D, EV gp), 및 기관 특이적 유전자 생성물에 대해 구조적 유사도를 갖는 소분자를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "치환된" 또는 "치환체"는 -C_{1 - 5}알킬, C_{2 - 5}알케닐, 할로겐화물(염소, 플루오르, 브롬, 요오드 원자), -CF₃, 니트로, 아미노, 옥소, -OH, 카르복실, -COOC_{1 - 5}알킬, -OC_{1 - 5}알킬, -CONHC_{1 - 5}알킬, -NHCOC_{1 - 5}알킬, -OSOC_{1 - 5}알킬, -SOOC_{1 - 5}알킬, -SOONHC_{1 - 5}알킬, -NHSO₂C_{1 - 5}알킬, 아릴, 헤테로아릴 등과 같은 기에 의해 치환되고(치환체), 각각 추가적으로 치환될 수도 있는, 하나 이상의 수소 원자를 포함하는 화합물 또는 작용기를 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같은 "기질 모방체"는 이들의 3차원 구조, 전하분포 및 수소결합 주게 또는 받게 경향 측면에서 효소 기질을 모방하여, 효소 활성 자리에 의해 인식될 수 있는 화합물을 의미한다.

II . 인 시츄 클릭 화학 방법

분자 이미징 프로브를 제조하는 기존의 방법은 단단히 결합하는 분자를 확인하는 것으로부터 시작한다. 이러한 분자는 대규모 스크리닝 또는 SAR 개발에 의해 이미 확인되었을 수 있다. 이어서 이러한 화합물을 방사성 표지의 가망성 측면 뿐만 아니라, 분자 자체가 선호하는 표지 자리 측면에서 평가한다. 일단 방사성표지할 위치가 결정이 되면, PET 이미징에 사용한 경우라면, 18F-플루오르화물로 표지함으로써 이미징제로 전환하고, 마우스와 같은 적당한 살아있는 개체에 주사한 다음, PET 스캐너로 이미징화하여 트래이서의 생체내분포, 약물동력학 및 약력학 성질, 대사 및 배출 경로를 측정하게 된다. 오리지널 분자에서 비방사성 동위원소로서는 존재하지 않는 분자에 방사성 원소가 도입된 경우에는, 표지된 화합물이 모(parent) 화합물과는 매우 다르게 행동할 수 있을 가능성이 존재한다. 예를 들어, 수소 원자 대신에 18F-플루오르화물을 도입하면, 표적에 대한 이미징 프로브의 결합 친화도를 약화시킬 수 있다. 이러한 약화는 인 비보에서 편재되는 것을 방해할 수 있어서, 중국에 적절한 PET 이미지의 형성을 방해할 수 있다.

분자 이미징 프로브를 확인하기 위한 대안적인 접근법은 비방사성 동위원소 함유 리간드의 라이브러리를 만들어 각각의 리간드를 인 비트로(in vitro)에서의 잠재적인 활성에 대해 스크리닝하는 것이다. 일단 히트가 발견되면, 이 분자를 방사성 유사체로 전환하여 인 비보에서 이미징화한다. 이러한 모 화합물의 방사성 유사체는 모 화합물과 동일한 생화학적 특징을 가질 것으로 예상되는데, 왜냐하면 방사성 동위원소가 입체구조 및 전하 면에서 유사하기 때문이다. 이러한 방법의 결점은, 가능성 있는 수많은 화합물을 만들어야 하고, 확인해야 하며, 정제해야 하며, 각각 그 활성에 대해 스크리닝해야 한다는 점이다. 이 방법은 시간, 경비 및 노력을 많이 들게 한다. 세번째 방법은, 클릭 화학을 사용하는 것을 통해, 바람직한 잠재적인 분자 이미징 프로브를 조립하기 위한 반응 용기로서 생물학적 표적을 사용하는 방법인데, 이 방법은, 전술한 두가지 방법에 비해 뚜렷한 장점을 보인다.

클릭 화학은, 이들의 생물학적 표적에 대해 매우 고친화도를 보이며, 시그널 대 바탕 비율이 훌륭한 "고성능" 분자 이미징에 대한 단계를 제공하는, 소분자 PET 이미징 트래이서를 디자인하기 위한 기회를 제공한다. 클릭 화학은 오로지 가장 실용적이고 신뢰성있는 화학적 변환만을 활용하는 화학적 합성에 대한 모듈 접근법이다. 이 기술은 표적의 결합 포켓 안에서 비가역적으로 빌딩 블록(building block) 반응물을 조립함으로써 고친화성 억제제를 제조한다. 이러한 인 시츄 클릭 화학의 개괄적인 접근법은 도 1에 제시하였다. 클릭 화학 기술은 예를 들면 전체가 본원에 참고로써 포함되는, 하기의 참고 문헌에서 기술된다:

● Kolb, H. C; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angewandte Chemie , International Edition 2001, 40, 2004-2021.

● Kolb, H. C; Sharpless, K. B. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128-1137.

● Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angewandte Chemie , International Edition 2002, 41, 2596-2599.

● Tornoe, C. W.; Christensen, C; Meldal, M. Journal of Organic Chemistry 2002, 67, 3057-3064.

● Wang, Q.; Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Finn, M. G. Journal of the American Chemical Society 2003, 125, 3192-3193.

● Lee, L. V.; Mitchell, M. L.; Huang, S.-J.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Wong, C-H. Journal of the American Chemical Society 2003, 125, 9588- 9589.

● Lewis, W. G.; Green, L. G.; Grynszpan, F.; Radic, Z.; Carlier, P. R.; Taylor, P.; Finn, M. G.; Barry, K. Angew . Chem ., Int . Ed. 2002, 41, 1053- 1057.

● Manetsch, R.; Krasinski, A.; Radic, Z.; Raushel, J.; Taylor, P.; Sharpless, K. B.; Kolb, H. C. Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 12809-12818.

● Mocharla, V. P.; Colasson, B.; Lee, L. V.; Roeper, S.; Sharpless, K. B.; Wong, C-H.; Kolb, H. C Angew . Chem . Int . Ed . 2005, 44, 116-120.

● M. Whiting, J. Muldoon, Y.-C. Lin, S. M. Silverman, W. Lindstrom, A. J. Olson, H. C KoIb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, J. H. Elder, V. V. Fokin, Angew. Chem . 2006, 118, 1463-1467; Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 2006, 45, 1435-1439.

상기 참고문헌에 기술된 것과 같은 다른 클릭 화학 작용기가 활용될 수 있지만, 고리화첨가반응을 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 아지드기와 알키닐기를 반응시키는 것이 바람직하다. 말단의 알킨과 같은 알킨 및 아지드는 1,3-이극성 고리화첨가반응을 겪게되어 1,4-2치환된 1,2,3-트리아졸을 형성한다. 그렇지 않으면, 아지드 및 알키닐 반응물을 사용하면 1,5-2치환된 1,2,3-트리아졸이 형성될 수도 있다(Krasinski, A., Fokin, V. V. & Barry, K. Organic Letters 2004, 1237- 1240). 헤테로 딜스-알더(Diels-Alder) 반응 또는 1,3-이극성 고리화첨가반응을 사용할 수도 있다(참고: Huisgen 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry (Vol. 1) (Padwa, A., ed.), pp. 1- 176, Wiley; Jorgensen Angew. Chem . Int . Ed . Engl 2000, 39, 3558-3588; Tietze, L.F. and Kettschau, G. Top . Curr . Chem . 1997, 189, 1-120). 이러한 반응들은 그들의 결합 포켓내에서 인 시츄로 생물학적 표적 분자에 의해 촉매화된다. 생물학적 표적으로 촉매되는 반응과는 반대로, 각 자리에 대한 결합기를 전달하는 아지드 및 아세틸렌 또는 알키닐 반응성 전구체 간의 1,3-이극성 고리화첨가반응 열반응은 실온에서 매우 느려서, 반응물이 바이오-오르토고날(bio-orthogonal)(즉, 생물학적 분자와는 반응하지 않아서 생리학적 조건 하에서는 매우 불활성임을 말한다)이므로, 억제 화합물이 인 시츄에서 생성되어야 할 요구를 암시한다. 이러한 촉매되지 않는 반응을 최소화하면, 스크리닝 방법에서 거짓 양성반응(false positive)을 유도하는 비-주형 표적 리간드가 원치않게 형성되고 확인하는 것을 예방하게 한다.

일 구체적인 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 인 시츄 클릭 화학 방법은 디자인의 일부로서 PET 표지를 전달하는 나노몰 이하의 능력을 갖는 신규 리간드를 발생시킨다. 리간드 발견 단계 동안에, 비방사성 또는 "콜드" 동위원소(예를 들면, F-19)를 PET 방사성핵종에 대한 플레이스-홀더(place-holder)로서 사용한다. 고친화성 리간드가 발견되면, F-19를 F-18로 교체한다. 이러한 표적 안내 전략은, 효소에 선택적으로 결합하여, 서로 결합 포켓의 테두리내에서 비가역적으로 연결되는 "1가(monovalent)" 빌딩 블록 반응물로부터 성능이 좋은 리간드 억제제를 발생시키기 위한 주형으로서 효소 자체를 활용한다. 이러한 접근법은 수천가지의 라이브러리 화합물의 합성, 정제, 및 스크리닝을 요구하는 것이 아닌, 비교적 소수의 반응물(이는 수천가지의 방식으로 조합될 수 있는 것이다)로부터 자신의 억제제를 조립하기 위해 생물학적 표적을 활용하기 때문에, 기존의 조합 화학에 비해 훨씬 더 좋은 효율을 보장한다. 효소로 생성시킨 히트의 추후단계 시험은 표적에 대한 결합 친화도 및 특이성을 정하는 것이다. 특정한 양태에서, 생체거대분자와 중복반응하는 2가 분자, 예컨대 단백질과 같은 생성물 히트는 매우 성능이 좋다. 이러한 생성된 2가 분자는 보조인자 결합자리에 결합하여 기질 포켓에 도달한다. 주로 엔트로피 때문에(3차원 회전 및 옮김 자유도 손실을 피하기 위해서) 리간드 억제제는 개개의 성분보다 그들의 생물학적 표적에 더욱 높은 친화도를 보인다. 따라서, 개개의 결합 포켓에 중간 정도의 마이크로몰 친화도를 가지는 단편이라고 해도, 서로 커플링된 경우 생물학적 표적과의 최적의 결합 상호작용을 허용하는 나노몰 억제제를 생성시킬 수 있다. 따라서, 효소에 대한 빌딩 블록 반응물 및 전구체의 결합 친화도는 나노몰 범위로 요구되지 않는다. 마이크로몰 단위의 친화도만으로도 클릭 화학 반응이 일어나게 하기에 충분하다.

인 시츄 클릭 화학은 분자 프로브 발견에 대한 새로운 매력적인 접근법을 제공하는데, 이는 기존의 방식을 통해 힘들게 제조된 최종 화합물의 스크리닝을 꼭 거치지 않아도, 효소로 하여금 자신의 억제 분자를 조립하기 위해 결합자리에 들어맞는 빌딩 블록 반응물을 선택하여 조합할 수 있도록 하기 때문이다. 예를 들면, 단 200개의 빌딩 블록 반응물(100 모노-아지드 및 100 모노-아세틸렌)이 있는 경우에, 이러한 화합물을 실제로 만들지 않아도 20,000개(100 x 100 x 2; '2'는 가능한 신(syn )- 또는 안티(anti )-트리아졸 형성 가능성에 대한 인자이다)의 가능한 조합을 신속하게 스캐닝할 수 있다. 이 숫자는 다이- 또는 트라이-아지드 또는 -아세틸렌을 포함하는 경우, 동일한 빌딩 블록 반응물 수를 사용해도 더 커질 수 있어서, 효소에게 동시에 적당한 빌딩 블록 반응물 및 작용기를 선택할 수 있는 더욱 큰 유연성을 부여한다. 스크리닝 방법은 LC/MS에 의해 소정의 시험 혼합물 중에 생성물이 형성되었는지 아닌지를 결정하는데 있어 가장 단순한 방법이다. 효소에 의해 형성된 화합물은 상호작용이 여러자리에서 일어날 수 있는 성질 때문에 훌륭하고 선택적인 결합제가 될 수 있다.

리간드 개발 또는 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법은 두 단계로 발생할 수 있다. 특정한 양태에서는, 발견 단계에서 각 화합물은 '콜드' F-19 원자를 전달하여, 효소에 대한 화합물의 결합 친화도를 뚜렷하게 변화시키지 않으면서 '핫' F-18이 나중에 도입될 수 있도록 준비한다. 전구체는, 낮은 마이크로몰 또는 더욱 높은 친화도를 가지고 표적의 결합 포켓에 접착하고, 바이오-오르토고날 작용기(아지드 및 아세틸렌)을 전달하는 화합물이다. 본 방법의 일 양태에서, 각 분자는 F-18 방사성핵종에 의해 나중에 치환될 하나의 플루오르 원자를 전달한다. 특정한 양태에서는, 기질 모방체 또는 링커 모듈보다는 고정 분자에 플루오르 원자를 도입하는 것이 바람직한데, 이렇게 하는 것이 합성에 드는 노력을 최소화할 것이기 때문이며, 더욱 플루오르 함량이 낮은 화합물이 만들어져야 할 필요가 있는 측면에서, 잠재적인 고정 분자의 총수가 기질/링커 잔기의 수보다 훨씬 작기 때문이다.

일 양태에서, 스크리닝 방법은 표적 효소의 결합자리에 대한 친화도를 보이는 다수개의 분자를 확인하는 단계와, 이의 핵종내에 적어도 하나의 방사성 동위원소(예를 들면, F-19 또는 I-127)를 포함하는 하나의 원소의 비방사성 동위원소를 상기 분자에 공유결합적으로 부착하는 단계를 포함한다. 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 작용기, 예컨대 아지드 또는 알키닐기는 또한 분자에, 선택적으로는 링커를 통해 부착될 수 있다. 그 다음에 생성되는 여러개 분자 중 각각의 구성원을 표적 분자와, 효소의 기질 결합자리에 대한 친화도를 보일 수 있는 여러개 화합물 또는 화합물의 라이브러리의 각각의 구성원과 혼합한다. 기질 결합 라이브러리의 구성원은 보조인자 결합 분자의 라이브러리의 작용기와 함께 사용할 수 있는 클릭 화학 작용기를 포함하도록 화학적 변형된 것이다. 그러므로, 효소의 결합자리에 대한 친화도를 보이는, 각 라이브러리에서 하나씩 유래한 한 쌍의 화합물은 인 시츄에서 클릭 화학 작용기를 통해 공유결합될 것이다. 스크리닝 방법에서는 다중-웰 마이크로적정 플레이트와 같은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 스크리닝 장치를 활용할 수 있다.

스크리닝 방법의 순차적인 자동화 데이터 분석을 위해 질량분석기를 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 대표적인 질량분석기에는 아질런트 MSD 1100 SL 시스템(Agilent MSD 1100 SL system), 선형 이온 트랩 시스템(linear ion trap systems) (ThermoFinnigan LTQ), 쿼드루폴 이온 트랩(quadrupole ion trap)(LCQ), 또는 쿼드루폴 타임-오브-플라이트(quadrupole time-of-flight)(Waters or Applied systems으로부터의 QTOF)이 포함된다. 이러한 분석기 각각은 LC-MS 실험을 위한 효과적인 HPLC 인터페이스를 가진다.

일 양태에서, 고정 분자일 수 있는 출발 전구체 단편은, 공지된 약물 및/또는 기질에 근거하여 소수의 표적화된 화합물 라이브러리(예를 들면, 100개 이하의 화합물)를 디자인함으로써 발견할 수 있다. 이러한 라이브러리는 기존의 결합 분석방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 고정 분자는 효소 표적과, 상보적인 클릭 화학 반응물 또는 전구체(예를 들면, 고정 분자가 아지드인 경우 아세틸렌)의 소수 라이브러리와 함께 인큐베이팅할 수 있다. 각각의 반응 혼합물은 효소에 의해 형성되는 생성물을 확인하기 위하여 LC/MS로 분석할 수 있다. 효소에 의해 결과적으로 화합물이 형성된다는 것을 증명하기 위해, 경쟁적 실험을 통해 히트 검증을 수행하고, 결합 분석방법은 효소에 의해 생성된 히트의 결합 친화도를 정할 수 있다.

일 양태에서, 고정 분자는 효소 내부의 리간드 화합물로 나중에 전환되기 위한 바이오-오르토고날 작용기(예를 들면, -N₃, -C≡CR, 여기에서 R=H, 알킬, 아릴 등이다)를 전달한다. 바람직하게는 R은 수소이다. 뿐만 아니라, 각 후보 고정 분자는, 해당하는 방사성핵종으로 '콜드'[F-19]를 치환함으로써 후에 [F-18]표지하기 위해서, 친핵 치환 화학에 의해 쉽게 도입될 수 있는 하나의 플루오르 원자를 전달한다. 이렇게 변화시키면, 결합 친화도에 대해 최소한의 영향을 미침으로써, PET 프로브 개발을 더욱 예측가능하게 만들 것이다.

두개의 반응기 또는 전구체 간의 링커의 성질과 길이는 화합물에게 최적의 결합 친화도를 제공하도록 선택할 수 있다. 그러므로, 여러가지 유형의 링커가 상기 기술한 바와 같은 기질 모방체에 부착될 수 있다. 이러한 부착은 탄소-헤테로원자 결합 형성 반응을 통해 쉽게 수행할 수 있는데, 상기 반응에는 직접적으로(트리아졸 형성) 또는 간접적으로(아지드 환원, 그에 이어지는 생성물 아민의 아실화 또는 설포닐화) 아지드기가 관여한다. 기질 모방체의 라이브러리는 바람직하게는 가능한 반응의 조합수를 증가시키기 위해서 다이-아지드 및 다이-아세틸렌을 포함한다.

본 발명의 여러측면 :

일 양태에서, 본 발명은 하기의 a) 내지 h) 단계를 포함하는 후보 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법을 제공한다:

a) 후보 화합물의 제1 라이브러리를 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계로서, 화합물의 제1 라이브러리의 각 화합물은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 제1 작용기를 포함하는 것이고, 각각의 화합물은 제1 결합자리와 제2 결합자리를 포함하는 표적 생체거대분자의 제1 결합자리에 대해서 선택적으로 친화도를 보이는 것이다;

b) 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 제1 구성원을 확인하는 단계;

c) 제1 결합자리에 대해 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 확인된 제1 구성원을 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계;

d) 후보 화합물의 제2 라이브러리와, 제1 구성원 및 표적 생체거대분자를 접촉시키는 단계로서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 제2 결합자리에 대해 선택적으로 친화도를 보이며, 후보 화합물의 제2 라이브러리의 각각의 화합물은 제1 작용기와의 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 상보적인 제2 작용기를 포함하고, 여기에서 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 독립적으로, 각각이 선택적으로는 링커를 통해 부착된, i) 적어도 하나의 방사성 동위원소를 포함하는 화학 원소의 비방사성 동위원소 및/또는 ii) 이탈기 및/또는 iii) 금속 킬레이트기, 및/또는 iv) 형광기를 포함하는 것이다;

e) 후보 이미징 프로브를 형성하기 위하여, 생체거대분자 유발성 클릭 화학 반응을 통해서, 상보적인 제1 작용기와 제2 작용기를 반응시키는 단계;

f) 후보 이미징 프로브를 분리하고 확인하는 단계;

g) 화학 합성에 의해 후보 이미징 프로브를 제조하는 단계; 및

h) 이미징에 적용하기 위해서, 원소의 비방사성 동위원소를 방사성 동위원소로 전환시킴으로써, 또는 이탈기를 방사성 반응물로 치환시킴으로써, 또는 방사성 금속과 복합체를 형성하도록 함으로써, 후보 이미징 프로브를 이미징 프로브로 전환시키는 단계. 상기 방법의 일 변형에서, 생체거대분자는 효소, 수용체, DNA, RNA, 이온 채널 및 항체로 구성되는 군 중에서 선택된다. 다른 변형에서, 표적 생체거대분자는 질병 단계에서 과다발현된 단백질, 예컨대 알츠하이머병 환자의 뇌조직에 있는 베타-아밀로이드이다.

상기의 방법의 다른 측면에서, 제2 결합자리는 제1 결합자리의 일부를 구성한다. 방법의 일 변형에서, 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 금속 킬레이트기 및/또는 형광단을 포함한다. 구체적인 양태에서, 클릭 화학 반응은 고리형 협동반응이다. 상기의 방법중 다른 변형에서는, 고리형 협동반응은 고리화첨가반응이다. 또다른 변형에서, 고리화첨가반응은 딜스-알더 반응 또는 1,3-이극성 고리화첨가반응으로 구성되는 군 중에서 선택된다. 바람직하게는 본원 중의 특정 방법에서는, 고리화첨가반응은 1,3-이극성 고리화첨가반응이다.

상기 방법의 또다른 측면에서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드 및 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성한다. 일 변형에서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 알킨이거나, 또는 제1 작용기는 알킨이고 제2 작용기가 아지드이다. 다른 변형에서, 알킨은 말단의 알킨이다. 상기 방법의 특정한 변형에서, a) 내지 f)의 단계는 최적의 결합, 생체내분포, 대사 및 약물동력학 성질을 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 및/또는 제2 라이브러리를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행되는 것이다.

특정한 측면에서, 확인된 이미징 프로브는 표적화된 생체거대분자에 대한 높은 결합 친화도와 특이성을 보인다. 바람직하게는 결합 친화도는 나노몰 또는 그보다 더 높은 친화도를 의미하며, 확인된 이미징 프로브는 최적의 생체내분포, 대사, 약물동력학 및 제거 성질을 보인다.

상기 방법의 변형에서, 이탈기는 표지된 유도체를 형성하기 위해 교환 반응, 친핵 치환 반응 또는 친전자 치환 반응에 의해 전환될 수 있다. 상기 방법의 또다른 변형에서, 확인된 후보 이미징 프로브는 방사성 동위원소로 표지되며, 생성물 방사성 이미징 프로브는 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성되는 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 하기의 a) 내지 h)의 단계를 포함하는 후보 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법을 제공한다:

a) 후보 화합물의 제1 라이브러리를 표적 효소와 접촉시키는 단계로서, 화합물의 제1 라이브러리의 각 화합물은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 제 1 작용기를 포함하는 것이고, 각 화합물은 제1 결합자리와 제2 결합자리를 포함하는 표적 효소의 제1 결합자리에 대해서 선택적으로 친화도를 보이는 것이다;

b) 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 제1 구성원을 확인하는 단계;

c) 제1 결합자리에 대해 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 확인된 제1 구성원을 표적 효소와 접촉시키는 단계;

d) 후보 화합물의 제2 라이브러리와, 제1 구성원 및 표적 효소를 접촉시키는 단계로서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 제2 결합자리에 대해 선택적으로 친화도를 보이며, 후보 화합물의 제2 라이브러리의 각 화합물은 제1 작용기와의 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 상보적인 제2 작용기를 포함하고, 여기에서 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 독립적으로, 각각이 선택적으로는 링커를 통해 부착되는, i) 적어도 하나의 방사성 동위원소를 포함하는 화학 원소의 비방사성 동위원소 및/또는 ii) 이탈기 및/또는 iii) 금속 킬레이트기, 및/또는 iv) 형광기를 포함하는 것이다;

e) 후보 이미징 프로브를 형성하기 위하여, 클릭 화학 반응을 통해서, 상보적인 제1 작용기와 제2 작용기를 반응시키는 단계;

f) 후보 이미징 프로브를 분리하고 확인하는 단계;

g) 화학 합성에 의해 후보 이미징 프로브를 제조하는 단계; 및

h) 이미징에 적용하기 위해서, 원소의 비방사성 동위원소를 방사성 동위원소로 전환시킴으로써, 또는 이탈기를 방사성 반응물로 치환시킴으로써, 후보 이미징 프로브를 이미징 프로브로 전환시키는 단계.

상기 방법의 일 측면에서, 특정 생체거대분자에 대한 제1 결합자리는 보조 인자 결합자리이고, 제2 결합자리는 기질 결합자리이다.

상기 방법의 일 변형에서, 표적 효소는 COX-2, AKT, P13K, 또는 CA-9/CA-12와 같이, 질병 단계에서 과다발현되거나 과다활성화된 것으로 구성된 군 중에서 선택된다. 또다른 변형에서, 표적 생체거대분자는 질병 단계에서 과다발현된 단백질로서, 여기에는 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에 있는 베타-아밀로이드가 포함된다. 또다른 변형에서, 제2 결합자리는 제1 결합자리의 일부를 구성한다. 상기 방법의 특정 측면에서, 제2 결합자리는 제1 결합자리의 일부 또는 일 섹션을 구성하고, 제2 후보 화합물의 결합은 제1 결합자리를 캡핑함으로써 결합자리에 결합한다. 상기 방법의 또다른 변형에서, 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 금속 킬레이트기 및/또는 형광단을 포함한다. 또다른 변형에서, 클릭 화학 반응은 고리형 협동반응이다. 바람직하게는, 특정한 변형에서, 고리형 협동반응은 고리화첨가반응이다. 또다른 변형에서, 고리화첨가반응은 딜스-알더 반응 또는 1,3-이극성 고리화첨가반응으로 구성된 군 중에서 선택된다. 바람직하게는, 상기의 방법의 특정한 변형에서, 고리화첨가반응은 1,3-이극성 고리화첨가반응이다. 또다른 변형에서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드 및 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성한다.

상기 방법의 특정한 변형에서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 말단의 알킨이거나, 제1 작용기는 말단의 알킨이고 제2 작용기는 아지드이다. 상기 방법의 다른 변형에서, a) 내지 f)의 단계는 최적의 결합 친화도를 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 및/또는 제2 라이브러리를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행된다. 또다른 변형에서, 이탈기는 교환 반응, 친핵 치환 반응 또는 친전자 치환 반응에 의해 표지된 유도체를 형성하도록 개조될 수 있다. 상기 방법의 일 측면에서, 확인된 후보 이미징 프로브는 방사성 동위원소로 표지되며, 생성물 방사성 이미징 프로브는 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성되는 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용된다. 상기 방법의 일 변형에서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드와 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성한다. 또다른 변형에서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 알킨이거나, 제1 작용기는 알킨이고 제2 작용기는 아지드이다. 상기 방법의 특정한 측면에서, 클릭 반응에 사용된 알킨은 말단의 알킨이다.

상기 방법의 특정한 변형에서, a) 내지 f)의 단계는, 최적의 결합, 생체내분포, 대사 및 약물동력학 성질을 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 및/또는 제2 라이브러리를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행된다.

이러한 방법의 특정한 측면에서, 방법은 적어도 1회 반복하여 수행된다. 일 변형에서, 방법은 최적의 결합, 생체내분포, 약물동력학, 대사 및 제거 성질을 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 적어도 5회, 적어도 10회, 또는 적어도 20회 반복 수행된다. 본원에 기재된 방법에서, 최적의 결합 친화도는 나노몰 범위 또는 그 이상의 범위로서 정의된다. 최적의 생체내분포 및 약물동력학은 인 비보에서 표적화된 조직에 화합물이 도달하여, 충분한 기간 동안에 혈류내에 머물러서, 예컨대 18-F PET의 경우에는 수분에서 2시간 동안 머물러서, 인 비보에서 표적화된 생체분자에 화합물 또는 이미징 프로브가 결합하도록 허여하는 것을 의미한다. 최적의 대사는 기타의 원치 않는 조직을 표적화하는 비활성 생성물 또는 해로운 방사성 화합물 또는 이온을 형성하면서 화합물 또는 프로브가 대사되는 것이 아닌 것을 의미한다. 예로서, 화합물이 이의 방사성 18F를 손실한 경우, 원치 않는 강한 PET 신호가 뼈속에 발생한다. 최적의 제거 성질이란, 표적 조직에 도달하지 못하여 결합하지 않은 화합물 또는 프로브가 유기체로부터 신속하게 제거되어(18F의 경우에는 최대 2-3시간 안에), 매우 큰 신호 대 바탕 비율을 산출하는 것을 의미한다("신호"란 결합한 화합물로부터 방출되는, 예컨대 방사능과 같은 신호를 의미한다).

본 방법의 또다른 측면에서, 제1 결합자리는 기질 결합자리이고, 제2 결합자리는 보조인자 결합자리이거나, 제1 결합자리는 보조인자 결합자리이고, 제2 결합자리는 기질 결합자리이다.

상기 방법의 특정한 변형에서, 이탈기는 교환 반응, 친핵 치환 반응, 친전자 치환 반응을 통해, 또는 방사성 금속과 복합체를 형성하는 것을 통해 표지된 유도체를 형성하기 위하여 전환된다. 본 방법의 특정한 변형에서, 이탈기는 할로, 하이드록시, 아실옥시, 니트로 및 설포닐옥시(sulfonyloxy)기로 구성되는 군 중에서 선택된다. 이탈기의 구체적인 예에는 알카노일옥시(alkanoyloxy)(예를 들면, 아세트옥시(acetoxy), 프로피오닐옥시(propionyloxy) 등), 설포닐옥시(예를 들면, 메실옥시(mesyloxy), 토실옥시(tosyloxy) 등) 등이 포함된다.

방법의 특정한 변형에서, 확인된 리간드 화합물은 방사성 동위원소로 표지되고, 생성물 리간드 화합물은 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성된 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용된다. 상기 방법의 특정한 응용을 위해서는, 방사성 동위원소는 F-18, C-11, I-123, I-124, I-127, I-131, Br-86, Cu-64, Tc-99m, Y-90, Ga-67, Cr-51, Ir-192, Mo-99, Sm-153 및 Tl-201로 구성되는 군 중에서 선택된다. 방법의 변형에서, 후보 화합물이 효소 결합자리에 결합하는 것은 임의의 외부로부터 첨가된 촉매가 부재하는 가운데에서도 클릭 화학 반응을 촉진한다. 방법의 또다른 변형에서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다. 방법의 또다른 변형에서, 후보 화합물의 제1 라이브러리 및 후보 화합물의 제2 라이브러리 각각은 독립적으로 적어도 하나의 화합물, 적어도 5개의 화합물, 적어도 10개의 화합물 또는 그 이상의 화합물, 또는 적어도 25개의 화합물 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.

상기 방법의 또다른 측면에서, 후보 화합물의 제1 라이브러리 및/또는 후보 화합물의 제2 라이브러리는, 화합물과 제1 작용기 간의 링커 및/또는 화합물과 제2 작용기 간의 링커를 추가로 포함한다. 일 변형에서, 링커는 화합물과 작용기 간의 링커 사슬내에 1 내지 10개의 원자를 포함한다.

또다른 양태에서는, 후보 화합물의 제1 라이브러리는 화학식 1의 화합물을 포함하고, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 화학식 2의 화합물을 포함하는 것이 특징인, 상기에 기술된 것에 따른 방법이 제공된다:

상기 식에서, A 및 A'는 각각 독립적으로 치환된 또는 치환되지 않은 아릴 또는 헤테로아릴기, 펩티드가 아닌 기질 모방체, 펩티드성 기질 모방체 및 아르지닌기 모방체로 구성되는 군 중에서 선택된 기질 모방체이고; L 및 L'은 각각 독립적으로 1 내지 10개 원자를 링커 사슬내에 포함하고, 선택적으로는 O-3 치환체에 의해 치환된 결합 또는 링커기이며; X 및 X'은 각각 독립적으로 상보적인 클릭 화학 작용기이며; Z 및 Z'은 각각 독립적으로 -NH₂, 히드라지닐(hydrazinyl), 치환된 히드라지닐, 및 선택적으로는 치환된 우레아이고, 그렇지 않으면 부재하며; U 및 U'은 각각 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이며; V 및 V'은 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이며, W 및 W'은 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이다.

본원에서 언급된 바와 같은 개시 내용의 상기 측면들 각각은 모든 측면들, 양태들 및 변형들과 대표적인 예들을 포함하는 것으로서, 각종 측면들, 양태들 및 변형들이 호환가능하게 조합되거나 상이한 순서가 될 수 있도록, 응용가능한 곳에서는 호환되는 것으로 의도하고자 하는 것이다. 예를 들면, 링커가 부재하는 제1 작용기를 포함하는 특정한 제1 분자적 구조는, 링커가 부재하는 상보적인 작용기를 갖는 제2 분자적 구조와 1,3-이극성 고리화첨가반응을 겪을 수 있으며, 그렇지 않으면 링커가 존재하는 작용기를 포함하는 동일한 제1 분자적 구조는, 분자적 구조와 상보적인 작용기 간에 링커를 포함하는 상보적인 작용기를 포함하는 제2 분자적 구조와의 1,3-이극성 고리화첨가반응을 겪을 수도 있다. 이런식의 순서나 다른 순서 및 변형들도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 의도하고자 한다.

반응물 농도는 매우 중요한 파라미터인데, 왜냐하면 이는 효소 유발성 반응(즉, 희망하는 인 시츄 반응)뿐 아니라, 효소가 없는 바탕 반응의 속도 모두에 영향을 주기 때문이다. 실시할 수 있기 위해서는, 바탕 반응의 정도를 최소화하여, 효소에 기반을 둔 생성물 형성을 보다 쉽게 확인할 수 있도록, 반응물 농도를 낮게 유지하는 것이 바람직하다. 동시에 고정 분자의 농도는 가능한 효소의 최적의 활용을 위해 결합자리의 상당한 포화를 달성할 수 있도록 충분히 높아야 한다. 고정 분자 및 효소 농도는 활성 자리의 95% 포화, 또는 그보다 높은 포화를 달성하기 위하여 충분이 높은 것을 사용하는 것이 바람직하다. 마지막 반응 성분인 기질 모방체는 효소/고정 분자 복합체 및 기질 모방체 간의 2분자 반응이 바람직한 속도로 일 어나도록 하기 위하여 충분히 높은 농도에서 사용가능하여야 한다. 전형적으로는, 기질 모방체 농도는 적어도 400 μM일 것이다. 바탕 반응이 너무 빠른 것으로 드러나거나, 매우 소수의 인 시츄 히트가 발견되는 경우, 농도는 더 낮게 또는 더 높게 조정할 수 있다.

각각의 반응물/효소 조합은, 잠재적인 인 시츄 히트인 트리아졸 생성물을 확인하기 위해서 LC-질량분석기로 분석할 수 있다. 몇몇 시험을 수행하여 효소에 의해 형성된 것인지 아닌 지를 결정함으로써, 이러한 잠재적인 인 시츄 히트를 검증할 수 있는데, 즉 (a) 효소가 부재하는 BSA 대조군 실험은 거짓 양성반응을 확인할 수 있고; (b) 공지된 효소 억제제의 존재 중에 인 시츄 생성물 형성의 경쟁적 억제 실험(예를 들면, CA-II의 경우에는 에톡스졸라미드(ethoxzolamide))을 하는 것은 소정의 히트가 효소의 활성자리 내 또는 활성자리 근처에서 형성되었는지 여부를 밝힐 수 있다. 검증된 인 시츄 히트를 화학적으로 합성하여, 결합 친화도를 측정하기 위한 생물학적 실험에서 특징분석할 수 있다. 효소가 1,4-2치환된 이성질체나 1,5-2치환된 이성질체를 형성할 수 있기 때문에 트리아졸의 치환 패턴 또한 측정할 수 있다. 이것은 Cu^I 로 촉매되는 아지드/아세틸렌 반응, Ru^II로 촉매되는 아지드/아세틸렌 반응, 그리고 고리화첨가반응 열반응을 사용하여 기준 화합물을 만듬으로써 달성할 수 있는데, 상기 반응에 따르면, 각각 1,4-2치환된 트리아졸과, 1,5-2치환된 트리아졸, 그리고 1,4- 및 1,5-2치환된 트리아졸의 혼합물이 생성된다.

당업자라면 본 발명의 여러가지 변형과 다른 양태들도 전술한 명세서내 제시 된 교시들의 이점을 보유하는 본 발명의 일부인 것으로 알 수 있다. 그러므로, 본 발명은 서술한 특정한 양태들로 그 범위가 국한되는 것이 아니고 변형들 및 다른 양태들도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 의도하고자 하는 것으로 숙지하여야 한다. 특정한 용어들이 본원에서 사용되었지만, 이들은 일반적으로 설명하기 위하여 사용된 것으로서 그 용어의 범위를 한정하고자 한 것은 아니다.

CA - II 인 시츄 스크리닝

개설 소 적혈구 유래 탄산무수화효소II(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 C2522; 제조번호 083K9295, 4,014 Wilbur-Anderson units/mg, 뷰렛 반응에 따르면 90% 단백질 함량)를 인 시츄 클릭 화학 실험과, 결합 상수의 계산을 위해 사용하였다. 본 발명자는 SDS 겔 전기영동에 의해 단백질을 시험하였고, 그 결과 29-30,000 분자량 유닛에 해당하는 단일 밴드를 보이는 것을 발견하였다. 인간 적혈구 유래 탄산무수화효소II(Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 C-6165, 4,260 wilbur-anderson units/mg)를 인간 효소에 대한 결합 친화도를 측정하기 위하여 사용하였다. 모든 형광 측정은 37℃에서 SPECTRA MAX GEMINI 형광판 리더(fluorescence plate reader)에서 수행하였다. Phenomenex C18 예비 컬럼이 장착된 30 X 2.1 mm Zorbax C8 컬럼을 사용하여 Agilent 1100 series LC/MSD (SL) 상에서 LC/MS 분석을 수행하였다. 화합물 검출은 포지티브로 선택한 이온 모드(LC/MS-SIM)에서 전기방사 질량분석기로 수행하였다. 용리 용매는 아세토니트릴 및 0.05% TFA를 함유한 물이었다.

인 시츄 클릭 화학 실험에 대한 일반적인 절차:

아지드 19F-1(20 mM), 에톡사졸라미드(20 mM) 및 에티닐 벤젠설폰아미드 (2 mM)의 스톡 용액을 DMSO에서 제조하였다. 알킨(3 ㎕)을, 효소(pH 7.4 250 mM 인산칼슘 완충액 중에 용해함으로써, 시판되는 90% 순도 단백질로부터 제조된 94 ㎕의 1 mg/㎖ 용액)를 함유하는 96-웰 마이크로적정 플레이트의 웰에 첨가하고, 아지드 반응물(2 ㎕) 및 DMSO( 1 ㎕)를 첨가하였다. 반응 플레이트를 37℃에서 40시간 동안 보관하였다.

최종 반응 농도는 다음과 같다:

효소(29 μM), 알킨(60 μM), 아지드(400 μM) 및 DMSO (6 vol-%). 동시에, 몇가지 대조군 반응도 준비하여 동일한 실험 조건에 투입하였다: (1) 에톡사졸라미드(1 ㎕, 200 μM 최종 농도)로 경쟁적 억제실험하는 대조군; (2) bCA-II 대신에 소 혈청 알부민(1 mg/㎖ 최종 농도)을 사용하여 비특이적 단백질 결합실험하는 대조군. 일부의 경우에는 본 발명자는 "단백질이 없는" 대조군 실험도 수행하였는데, bCA-II 대신에 pH 7.4 완충액을 사용한 것이었다. LC/MS-SIM 분석: 모든 샘플은 포지티브로 선택한 이온 모드에서 전기방사 질량분석기 검출기로 역상 HPLC에 의해 분석하였다. 주사 용적은 0.3 ㎖/분의 유속에서 30 ㎕였다. 하기의 용리 구배를 사용하였다: 16분에 걸쳐 0-100% 아세토니트릴/0.05% TFA 및 물/0.05% TFA, 2분간 100% 아세토니트릴/0.05% TFA, 그 다음 3분에 걸쳐 100-0% 아세토니트릴/0.05% TFA 및 물/0.05% TFA. 후반(post) 전개 시간은 2분이었다.

소/인간 탄산무수화효소II 에 대한 인 비트로 결합 분석방법:

개설 보고 리간드로서 DNSA를 사용하여, Whitesides et al.( J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5057) 및 J.C. Kernohan (J Biol. Chem. 1967, 242, 5813)이 개발한 형광 경쟁 분석방법을 결합 친화도의 측정에 사용하였고, 이 때 보고 리간드는 시험 화합물에 의해 대체된다. 분석방법은 DNSA에 대해 최소한의 흡수치인, 290 mM에서 들뜰때 460 mM에서 검출된 형광 신호만이

복합체의 것이라는 관찰에 근거한다. 샘플 농도가 증가함에 따라,

에 기인한 형광 강도는 시험 화합물과 경쟁하는 것의 결과로서 감소하였으며, 이는 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)으로부터 해리 상수를 결정하게 해준다. 해리 상수는, DNSA에 대한 해리 상수(Kd)인, 0.39 μM(적정 실험에 의해 결정된 것이다) 및 총 효소 농도(0.18 μM)를 기준으로 하여, 용액 중의 DNSA에 결합한 CA의 농도인

, 비형광 샘플에 결합한 CA의 농도인

, 및 자유 CA 농도인 [CA]를 계산하기 위하여 질량 증감정도를 사용하여 각 시험 화합물에 대해 전개하였다. 분석방법의 조건: 시험 화합물의 양은 점점 늘려서(10 nM 내지 10000 nM로 늘림, DMSO 중에서 만들어진 스톡 용액), 96웰 마이크로적정 플레이트 중에 있는 5OmM pH 7.4 인산칼슘 완충액 중의 DNSA(20 μM) 및 소 또는 인간 CA-II(180 nM)의 용액에 첨가하였다. 용액을 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음에, 형광 강도의 변화를 형광판 리더(파장 290 nm에서 들뜨고, 파장 460 nm에서 방출)에서 측정하였다. Kd 값을 Whitesides et.al.이 기술한 바와 같은 하기의 방정식을 사용하여 스캐챠드 플롯으로부터 결정하였다.

용어

,

및 자유 CA는 각 반응에서

의 해리 상수 및 CA의 총 농도에 대해 공지된 값을 기준으로 하여, 질량 증감정도를 사용하여 계산하였다.

의 해리 상수(Kd)는, 각각의 효소(pH 7.4 포스페이트 완충액 중의 200 nM)를 DNSA(200 내지 1000 nM, DMSO 중에서 만들어진 스톡 용액)로 적정하고, 형광의 변화를 기록함으로써, 인간 탄산무수화효소II에 대비하여서는 0.425 μM였고, 소 탄산무수화효소II에 대비하여서는 0.393 μM인 것으로 측정되었다. 이러한 결과는 보고되어 있는 수치와 매우 근접한 것이다.

도 A, B 및 C는 전형적인 스크리닝으로부터 취해진 분취액의 SIM/MS 크로마토그램이다. 이 예에서, 생성물은 인 시츄 히트로서 확인되었다. 결합 분석결과, 화합물의 Kd는 0.5 nM인 것으로 밝혀졌다. 도 A는 탄산무수화효소II(1), 고정 분자(2) 및 아지드 단편(3)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 점선은 새로이 형성된 리간드에 대한 정체 시간을 나타낸다. 도 B는 탄산무수화효소II(1), 고정 분자(2), 아지드 단편(3) 및 탄산무수화효소 억제제(4)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 도 C는 소 혈청 알부민(5), 고정 분자(2), 및 아지드 단편(3)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 도 A는 리간드가 효소 템플레이션을 통해 형성된 것을 보여준다. 도 B는 공지된 억제제의 존재하에서, 희망하는 리간드는 형성되지 않았기 때문에, 리간드 형성이 템플레이팅된 효소라는 것을 암시한다. 마지막으로 도 C는 CA-II의 부재하에서, 리간드는 형성되지 않음을 나타낸다. 이러한 분자 이미징 후 보는 피리딘 골격내 파라-니트로기가 18F-플루오르화물로 쉽게 치환되기 때문에 방사성표지를 위해 선택되었다.

일반식:

공지된 문헌에 있는 절차(J. Organomet. Chem. 1997, 544, 163-174)에 따라 4-니트로-2-시아노 피리딘 합성을 수행하였다. 4-플루오로-2-시아노 피리딘을 공지된 문헌에 있는 절차(Org. Lett. 2005, 7, 577-579)에 따라 제조하였다.

4- 플루오로 -2- 아미노메틸 피리딘의 합성

THF (10 ㎖) 중에 4-플루오로-2-시아노 피리딘(278 mg, 2.3 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에, BH₃-THF (1M, 6 ㎖, 6 mmol)을 첨가하였다. 반응은 15분간 환류시켰다. 그 다음에 반응을 실온으로 냉각시키고 HCl(30 ㎖)을 배출시키면서 첨가하였다. 수성층을 Et₂0(3x')로 세척하였다. 수성층을 NaOH(15% aq.)를 사용하여 염기성으로 만들고, 극미량의 CH₂Cl₂를 써서 추출하였다. 합친 유기층을 염수(brine)로 세척하고, 건조시키며(MgSO₄), 여과한 다음에 냉수조에서 농축건조시켰더니, 투명하고 무색인 오일 150 mg이 얻어졌다.

L- 발린아지도산(valineazidoacid)과 4- 플루오로 -2- 아미노메틸 피리딘의 커플링

실온에서 교반중인, THF(1 ㎖)에 용해되어 있는 유리 바이얼 중의 L-발린아지도산(0.038g, 0.268 mM, 1 eq)에 4-플루오로-2-메틸아미노피리딘(0.04g, 0.317 mM, 1.2 eq)을 첨가한 다음에, 트리에틸아민(0.243 ㎖, 1.748 mM, 5 eq), EDC (0.085g, 0.559 mM, 1.6 eq), 및 HOBt (0.076g, 0.559 mM, 1.6 eq)을 첨가하고, 6시간 동안 반응하게 두었다. 반응이 완성된 후에, 물로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물로, 그 다음에는 중탄산나트륨, 염수로 세척한 다음에, MgSO₄ 위에서 건조시켰다. 유기층을 여과한 다음에, 농축건조시키고, 용리 용매로서 에틸아세테이트/헥산을 사용하여 컬럼 크로마토그래피함으로써 반응 혼합물을 정제하였다(80/20 Hex/EtOAc중에 로딩하고, 100 ㎖로 용리한 다음, 50/50 Hex/EtOAc까지 증가시킴). 생성물을 무색의 오일로서 분리하였다(0.021 g, 32%).

4-니트로-2- 아세톡시메틸 피리딘의 합성

90℃에서 아세트산 무수물(80 ㎖)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 4-니트로-2-메틸 피리딘 N-옥사이드(10 g)를 첨가하였다. 반응은 120℃에서 밤새 지속하였다. 그 다음 반응을 농축건조시켰다. 반응 혼합물을 헥산(과량의 아세트산 무수물을 제거하기 위한 것), 그 다음에 30% Et₂O:Hex (4-아세트옥시-2-아세톡시메틸 피리딘을 제거하기 위한 것), 그 다음에 50% Et₂O :Hex를 사용하여 실리카 겔에서 정제하였더니, 3.5 g(27.5%)의 황색 고체가 얻어졌다.

4-니트로-2- 하이드록시메틸 피리딘의 합성

4-니트로-2-아세톡시메틸 피리딘(856 mg, 4.4 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 HCl(1N, 20 ㎖, 20 mmol)을 첨가하였다. 반응을 50℃까지 밤새 가열하 였다. 이어서 반응을 Et₂0에 쏟아부었다. 수성층을 Et₂0으로 세척하였다. 이어서 수성층을 포화된 Na₂CO₃으로 처리한 다음, CH₂Cl₂(3x)로 추출하였다. 합친 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과시킨 다음 농축건조시켰더니, 561 mg(83.4%)의 투명한 황색 오일이 얻어졌다.

4-니트로-2- 클로로메틸 피리딘의 합성

알콜(562 mg, 3.65 mmol) 및 CH₂Cl₂(5 ㎖)를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 0℃에서 SOCl₂(3.65 ㎖, 7.3 mmol)를 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 반응을 포화된 NaHCO₃ 위에 쏟아붓고 CH₂Cl₂로 추출하였다. 합친 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과시키고, 농축건조시켰다. 반응 혼합물을 1:1 Et₂O:Hex을 용리액으로서 사용하여 실리카 겔에서 정제시켰더니, 350 mg(55.8%)의 황색 고체가 얻어졌다.

4-니트로-2- 메틸아미노 피리딘의 합성

4-니트로-2-클로로메틸 피리딘(350 mg, 2.03 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 헥사메틸렌테트라아민(285 mg, 2.03 mmol) 및 CHCl₃(5 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 가열하였다. 생성된 ppt를 여과하고, Et₂0으로 세척하였더니, 400 mg의 백색 고체가 얻어졌다. 이어서 이 고체를 EtOH(7 ㎖)에 용해시키고, HCl(conc, 0.5 ㎖)로 처리하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 90℃에서 가열하였다. 이어서 반응을 농축건조시키고, 물 위에 쏟아붓고, Et₂0으로 세척하였다. 수성층을 Na₂CO₃를 첨가하여 염기성으로 만들었다. 생성물을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 합친 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과하고, 농축건조시켰더니, 175 mg의 투명한 무색 오일이 얻어졌다.

2- 아지도 -3- 메틸 -N-(4-니트로-피리딘-2- 일메틸 )- 부티라미드의 합성

4-니트로-2-메틸아미노 피리딘(175 mg, 1.14 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 THF (5 ㎖), Et₃N (1.6 ㎖, 11.4 mmol), 2-아지도-3-메틸-부티릴 아지드 (164 mg, 1.14 mmol), EDC (278 mg, 1.83 mmol) 및 HOBt (247 mg, 1.83 mmol)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 반응을 HCl(1N, 20 ㎖) 위에 쏟아붓고, EtOAc로 추출하였다. 합친 유기층을 포화된 NaHCO₃로 세척하고, 건조시키 고(MgSO₄), 여과하고, 농축건조시켰더니, 197 mg(61.8%)의 옅은 갈색 고체가 얻어졌다.

(2- 아지도 -3- 메틸 - 부티릴 )-(4-니트로-피리딘-2- 일메틸 )- 카밤산 tert -부틸 에스테르의 합성

출발 아지드 (400 mg, 1.44 mmol)를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 CH₃CN (10 ㎖), Boc₂O (470 mg, 2.16 mmol) 및 DMAP (9 mg, 0.07 mmol)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 반응을 물 위에 쏟아붓고 EtOAc로 추출하였다. 합친 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과시킨 후 농축건조시켰다. 잔여물을 2:1 Hex:Et₂O을 용리액으로서 사용하여 실리카 겔 위에서 정제하였더니, 309 mg(57%)의 백색 고체가 얻어졌다.

{3- 메틸 -2-[4-(4- 설파모일 - 페닐 )-[1,2,3] 트리아졸 -1-일]- 부티릴 }-(4-니트로- 피리딘-2- 일메틸 )- 카밤산 tert -부틸 에스테르의 합성

아지드(300 mg, 0.79 mmol), tBuOH (3 ㎖), 4-에틴-벤젠설폰아미드(144 mg)를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에, CuSO₄ (0.04 M, 1.5 ㎖) 및 아스코르브산 나트륨(0.1 M, 1.2 ㎖)을 첨가하였다. 반응을 아르곤 하에 밤새 교반하였다. 이어서 반응을 물 위에 쏟아붓고 EtOAc로 추출하였다. 합친 유기층을 5% NH₄OH로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 여과하고, 농축건조시켰다. 출발 반응물을 용리해내기 위해서 30% EtOAc:Hex을 먼저 사용하고, 그 다음 1:1 EtOAc:Hex을 사용하여 실리카 겔에서 잔여물을 정제하였더니, 350 mg 78.8%의 백색 고체가 얻어졌다.

{2-[4-(4-{[ 비스 -(4- 메톡시 - 페닐 )- 페닐 - 메틸 ]- 설파모일 }- 페닐 )- [1,2,3] 트리아졸 -1-일]-3- 메틸 - 부티릴 }-(4-니트로-피리딘-2- 일메틸 )- 카밤산 tert -부틸 에스테르의 합성

트리아졸(350 mg, 0.63 mmol), CH₂C1₂ (5 ㎖) 및 TEA (436 uL)를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 DMT-Cl (318 mg, 0.94 mmol)를 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC (1:1 EtOAc:Hex)는 출발 물질이 완전히 소모되었음을 암시하였다. 이어서 반응을 물 위에 쏟아붓고 EtOAc로 추출하였다. 합친 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과시키고, 농축건조시켰다. 더 높이 전개되는 물질을 용리시 켜내기 위하여 30% EtOAc:Hex를 사용하고, 그 다음 40% EtOAc:Hex를 사용하여서 실리카 겔에서 정제하였더니, 417 mg (77%)의 황색 고체가 얻어졌다.

화합물의 방사성표지

탄산무수화효소 F18 실험절차

산소-18 물(>97% 농축)을 11MeV 양성자(RDS-111 Eclipse, Siemens Molecular Imaging)를 사용하여 방사선을 조사하여 [¹⁸F] 플루오르화물 이온을 통상적인 방법으로 발생시켰다. 충격의 마지막에, [¹⁸F]플루오르화물 이온을 함유하는 [¹⁸O]물을 탄탈륨 표적으로부터 자동 친핵성 플루오르처리 모듈로 이동시켰다(explora RN, Siemens Biomarker Solutions). 컴퓨터 제어하에서, [¹⁸O]물/[¹⁸F]플루오르화물 이온 용액을 이미 물(5 ㎖), 수성 탄산수소칼륨(0.5M, 5 ㎖), 및 물 (5 ㎖)로 헹군 작은 음이온 교환 수지 컬럼(Chromafix 45-PS-HCO₃, Machery-Nagel)에 이동시켰다. [¹⁸O]물(1.8 ㎖)를 그 다음에 정제 및 재사용을 위해 회수하였다. 트랩된 [¹⁸F] 플루오르화물 이온을 물(0.4 ㎖)중의 탄산칼륨(3.0mg)의 용액으로, 반응 용기에 용리시켰다. 아세토니트릴(1.0 ㎖)중의 Kryptofix 222 (K222, 20 mg)의 용액을 첨가하였고, 혼합물을 진공하에 가열(70 내지 95℃)하였고 아르곤의 증기에서 아세토니트릴 및 물을 증발시켰다. 냉각 후에, "건조" 반응성 [¹⁸F]플루오르화물 이온, K222, 및 탄산칼륨의 잔여물에 아세토니트릴(0.9 ㎖)중의 4-니트로피리딘-N-Boc-발린-N-다이메톡시트리틸-벤젠설폰아미드(1, 17 mg, 19.7 ㎛ol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밀봉된 용기(P_max = 2.3 bar)에서 교반하면서(마그네틱) 10분 동안 110℃까지 가열하였다. 앞에서와 같이 혼합물을 55℃로 냉각시켰고 대부분의 아세토니트릴을 진공 및 아르곤 증기 하에서 증발시켰다.

정제하지 않은 보호된 [¹⁸F]플루오르화된 중간체(2)에 수성 염산(1.0 M, 1.0 ㎖)을 첨가하였고, 혼합물을 3분 동안 105℃로 가열하였다. 35℃로 냉각한 후에, 수성 아세트산 나트륨(2.0 M, 0.5 ㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 샘플 루프(1.5 ㎖)로 이동시켰고, 세미-프렙 고압 액체 크로마토그래피(semi-prep HPLC)컬럼으로 주입하였다(Phenomenex Gemini 5μ C 18, 250 x 10 mm, 25% 아세토니트릴, 75% 물, 0.05% 트리플루오로아세트산 이동상, 5.0 ㎖/분). 생성물 4-[¹⁸F]플루오로피리딘-발린-벤젠설폰아미드(3, [¹⁸F]FPVBS)를 유동식 방사선 검출 및 UV(254nm)에 의해 모니터링 한 바와 같이 15-16분에서 용리시켰다. 생성물(7-8 ㎖)을 함유하는 HPLC 용출액을 마그네틱 교반 바가 있는 30 ㎖의 바이얼 속에 수집하고, 물(20 ㎖)을 첨가하였다. 수용액을 완전히 혼합하고, 물/이동상 용액으로 C18 Sep-Pak을 통과하도록 하여, 폐기 용기에 들어가도록 한다. C18 Sep-Pak를 추가의 물 분취액(20 ㎖)으로 세척하였다. 생성물을 에탄올(1.0 ㎖)을 사용하여 C18 Sep-Pak으로부터 용리하고, 멸균 바이얼을 향해 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통과하도록 하였다. 이어서 물(9.0 ㎖)을 멸균 필터를 통해 멸균 생성물 바이얼에 첨가하여, 에탄올 농도를 10%로 만들었다.

약 900mCi의 [¹⁸F]플루오르화물 이온으로 출발하는 전형적인 제조로, 합성 및 HPLC 정제, 및 C18 고체상 추출 및 10% 에탄올 중의 재용해한 지 64분 후에, 분리된 91 mCi의 생성물 (EOB에서 136 mCi, 15 % 수율)를 얻었다.

수집된 생성물을 HPLC(Phenomenex Gemini 5μ C 18, 150 x 4.6 mm, 25% 아세토니트릴, 75% 물, 0.05% 트리플루오로아세트산 이동상, 1.0 ㎖/분)로 분석하였다. 방사능 및 UV(254nm) 검출에 의해 모니터링 한 바와 같이, 이 생성물은 12분의 정체 시간 및 99.4%의 방사화학물질 순도를 가진다.

18F-표지된 CA-II 이미징제는 CA-II의 높은 발현 수준을 가진 폐, 신장 및 혈액에 상응하는 웰에 차별적으로 결합한다.

COX - 2 인 시츄 스크리닝

개설. Sf21 세포(Cayman Chemical company, 카탈로그 번호 60122, 24,016 Units/mg) (반응 중에 7μM 최종 농도로 희석)의 배큘로바이러스(Baculovirus) 과다발현된 시스템으로부터 분리한 COX-II 인간 재조합 효소를 인 시츄 클릭 화학에 사용하였다.

인 비트로 COX-2 색상분석(Ovine) 활성 분석방법을 위해, Cayman Chemical company의 억제제 스크리닝 분석 키트(카탈로그 번호 760111)를 사용하였다. 모든 흡광도 측정은 28℃에서 PECTRA MAX M2 플레이트 리더 상에서 수행하였다. Phenomenex C 18 예비 컬럼이 장착된 30 X 2.1 mm Zorbax C 8 컬럼을 사용하여 Agilent 1100 series LC/MSD (SL) 상에서 LC/MS 분석을 수행하였다. 화합물 검출은 포지티브로 선택한 이온 모드에서 전기방사 질량분석기로 수행하였다(LC/MS-SIM). 용리 용매는 아세토니트릴 및 0.05% TFA가 함유된 물이다.

1,4- 2치환된 (" 안티 ")트리아졸의 합성에 대한 개괄적인 절차:

tert-부탄올(0.400 ㎖) 중에서 알킨(leq) 및 아지드(leq)의 혼합물을 실온에서 밤새, CuSO₄(pH 7.4 포스페이트 완충액 중의 0.04M 용액, 7.5 mol%), 아스코르브산 나트륨(pH 7.4 포스페이트 완충액 중의 0.1M 용액, 15 mol%)의 존재하에 반응시켰다. 반응 혼합물을 물 위에(몇 ㎖) 쏟아붓고, 에틸아세테이트로 추출하였으며, 5% 수산화암모늄 수용액으로 세척한 후, MgSO₄ 위에서 건조시키고 농축시켰더니, 98-99% 순수한 트리아졸이 백색 고체로서 수득되었다. 최적화하지 않은 수율은 40%였다. 순수하지 않은 화합물에 대해(90% 미만의 순도) 정제를 위한 용리액으로서 에틸 아세테이트:헥산 혼합물을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다.

인 시츄 클릭 화학 실험에 대한 개괄적인 절차:

아지드(20 mM), 발데콕십(Valdecoxib)(20 mM) 및 알킨(3mM)의 스톡 용액을 DMSO 중에서 제조하였다. 알킨(1 ㎕)을 효소(47.5 ㎕의 시판 중인 Cayman Chemical company의 COX-2 인간 재조합 효소)를 함유하는 에펜도르프 튜브(0.5 ㎖ 용적)에 첨가한 다음, 아지드 반응물(1 ㎕) 및 DMSO(0.5 ㎕)를 첨가하였다. 반응 플레이트를 37℃에서 18-20시간 동안 보관하였다. 최종 반응물 농도는 다음과 같다: 효소 (7 μM), 알킨 (60 μM), 아지드 (400 μM) 및 DMSO (5 vol%).

동시에, 대조군 반응도 준비하여 동일한 실험 조건에 투입하였다: (1) 발데콕십으로 경쟁적 억제하는 대조군(1 ㎕, 200 μM 최종 농도); (2)소 혈청 알부민 대조군 실험, 300 μM DDC가 함유된, 1OmM TrisHCl (pH 8.0) 완충액 중의 1 mg/㎖ BSA 사용.

LC/MS-SIM 분석: 포지티브로 선택한 이온 모드에서 전기방사 질량분석 검출을 사용하여 역상 HPLC에 의해 모든 샘플을 분석하였다. 주사 용적은 0.3 ㎖/분의 유속에서 15 ㎕였다. 하기의 용리 구배를 사용하였다: 20분간 10-100% 아세토니트릴/0.05% TFA 및 물/0.05% TFA, 2분간 100% 아세토니트릴/0.05% TFA 다음에, 3분간 100-10% 아세토니트릴/ 0.05% TFA 및 물/0.05% TFA. 후반 전개 시간은 3분이었다.

도 A, B, C, D 및 E는 전형적인 스크리닝으로부터 취해진 분취액의 SIM/MS 크로마토그램이다. 이러한 예에서, 생성물 6이 인 시츄 히트로서 확인되었다. 결합 분석 결과, 화합물의 Kd는 대충 10 nM인 것으로 드러났다. 도 A는 COX-2(1), 고정 분자(2) 및 아지드 단편(3)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 점선은 새로이 형성된 리간드에 대한 정체 시간을 나타낸다. 도 B는 COX-2 (1), 고정 분자 (2), 아 지드 단편 (3) 및 COX-2 억제제인, 발데콕십 (4)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 도 C는 소 혈청 알부민 (5), 고정 분자 (2) 및 아지드 단편 (3)의 인큐베이션 혼합물의 분취액이다. 도 D는 Cu(I)의 존재하에 (2)와 (3)을 커플링함으로써 조립된 순수한 생성물의 주사를 나타낸다. 도 E는 (6)의 존재를 증명하기 위해 도 A에서의 반응물에 (6)을 동시 주사한 것이다. 도 A는 효소 템플레이션을 통해 리간드가 형성되었음을 나타낸다. 도 B는 공지된 억제제의 존재하에, 희망하는 리간드가 형성되지 않았으므로, 리간드 형성은 템플레이팅된 효소라는 것을 암시한다. 도 C는 COX-2의 부재하에 리간드는 형성되지 않았음을 나타낸다. 이러한 분자 이미징 후보는 피리딘 골격내 파라-니트로기가 18F-플루오르화물로 쉽게 치환되기 때문에 방사성 표지를 위해 선택되었다.

전구체에 대한 합성 개요(계속):

실험절차:

클로로메틸 설폰아미드를 문헌에 기재된 방법(참조: Talley, J. J. et al J. Med. Chem. 2000, 43, 775-777)에 따라 제조하였다.

설폰아미드 알데하이드: 아르곤 하에서 교반하며, 둥근 바닥 플라스크에 있는 트리메틸-N-옥사이드 (1.72g, 22.98 mM, 4eq)를 DMSO(1O ㎖) 중의 클로로설폰아미드(2.0Og, 5.74 mM)에 첨가하였다. 출발 물질이 TLC 상에서 보이지 않을 때 한시간 후에 물로 반응을 냉각시켰다. 이어서 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한 다음에 유기층을 물로 2회 세척하고, MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하고, 농축건조시켰다. 정제되지 않은 분리된 생성물은 회색을 띤 백색 분말(~ 1.0Og, 50% 수율)이었고, 다음 단계에 사용하였다.

DMT 보호된 알데하이드: 아르곤 하에 교반하면서, 메틸렌 클로라이드(15 ㎖) 중의 설폰아미드 알데하이드(0.328 g, 0.998 mM)에 트리에틸 아민(0.56 ㎖, 3.99 mM, 4 eq)을 첨가한 다음, DMT-클로라이드(0.44 g, 1.29 mM, 1.3 eq)를 첨가한 후, 18시간 동안 반응하도록 두었다. 반응 혼합물을 물로 냉각시킨 다음 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 유기층을 염수로 세척한 다음, MgSO₄ 위에서 건조시켰다. 유기층을 여과하고 농축건조시킨 후, 용리액으로서 에틸아세테이트/헥산 혼합물로 실리카 겔에서 크로마토그래피함으로써 생성물을 정제하였다. 분리된 생성물은 옅은 황색의 유색 분말(0.44 g, 70%)이었다.

DMT 보호된 알킨: 아세토니트릴(20 ㎖) 중에서 아르곤 하에 교반되고 있는 토실 아지드 (0.304 g, 1.54 mM) 및 탄산칼륨(0.32 g, 2.31 mM)의 혼합물에 포스포네이트 반응물(0.128 g, 0.77 mM)을 첨가하였다. 반응은 점점 흐려졌다. 2시간 후에, 메탄올:아세토니트릴(20 ㎖:20 ㎖) 중에 용해되어 있는 알데하이드(0.407 g, 0.65 mM)를 천천히 첨가하였더니, 이종 반응 혼합물은 시간이 지남에 따라 균질한 황색 용액이 되었다. 6시간 후에 반응 혼합물을 물로 냉각시키고, 에틸아세테이트로 추출하며, 물로 세척하고, MgSO₄ 위에서 건조시켰다. 여과하고, 농축건조시킨 다음에, 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였더니, 백색의 발포성 화합물 (0.2g, 50%)로서 알킨이 수득되었다.

안티 트리아졸을 제조하기 위한 개괄적 절차에서 기술된 바와 같이, 1,4-2치환된 트리아졸에 대한 개괄적인 절차를 사용하여 트리아졸을 합성하였다.

18F-표지된 COX -2 이미징제의 제조

N-[ 비스 -(4- 메톡시 - 페닐 )- 페닐 - 메틸 ]-4-{5-[1-(3,5- 다이메틸 -4-니트로-피리딘-2- 일메틸 )-1H-[1,2,3] 트리아졸 -4-일]-3- 페닐 - 아이소자졸 -4-일}- 벤젠설폰아미드의 합성

알킨(157 mg, 0.25 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에, tBuOH (10 ㎖), CuSO₄ (0.04M, 624uL), 아스코르브산 나트륨(0.1M, 500 uL) 및 아지드(52 mg, 0.25 mmol)를 첨가하였다. 이종 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 EtOAc 위에 쏟아붓고 희석 NH₄OH 및 물로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과하며 농축건조시켰다. 잔여물을 처음에 CH₂Cl₂를 로딩함으로써 실리카 겔(1:1 EtOAc:Hex을 사용하여 채워진 것) 상에서 정제하고, 다음에 1:1 EtOAc:Hex로 용리하였더니, 115 mg (55%)의 백색 고체가 얻어졌다.

2- 아지도메틸 -3,5- 다이메틸 -4-니트로-피리딘

CH₂Cl₂ (1O ㎖) 중에 4-니트로-1-하이드록시메틸-3,5-다이메틸피리딘(0.91 g, 5 mmol)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 트리에틸아민(558 uL, 8 mmol) 및 p-톨루엔설포닉 무수물(1.96 g, 6 mmol)을 첨가하였다. 반응물은 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 물 위에 쏟아붓고, CH₂Cl₂에서 추출하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과한 뒤 농축건조시켰다. 고체를 MeOH (25 ㎖)중에 재용해시키고, 물(5 ㎖)에 미리 용해시켜둔 NaN₃(390 mg, 6 mmol)으로 처리하였다. 반응을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서 반응을 물 위에 쏟아붓고 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과한 뒤 농축건조시켰다. 고체를 40% Et₂O :Hex를 용리액으로서 사용하여 실리카 겔에서 정제하였더니, 600 mg (58%)의 무색 투명한 오일이 얻어졌다.

COX -2 클릭 F-18 실험

산소-18 물을 11MeV 양성자(RDS-111 Eclipse, Siemens Molecular Imaging)를 사용하여 방사선을 조사하여 [¹⁸F] 플루오르화물 이온을 통상적인 방법으로 발생시켰다. 충격의 마지막에, [¹⁸F]플루오르화물 이온을 함유하는 [¹⁸O]물을 탄탈륨 표적으로부터 자동 친핵성 플루오르처리 모듈로 이동시켰다(explora RN, Siemens Biomarker Solutions). 컴퓨터 제어하에서, [¹⁸O]물/[¹⁸F]플루오르화물 이온 용액을 이미 물(5㎖), 수성 탄산수소칼륨(0.5M, 5 ㎖), 및 물 (5 ㎖)로 헹군 작은 음이온 교환 수지 컬럼(Chromafix 45-PS-HCO₃, Machery-Nagel)에 이동시켰다. [¹⁸O]물(1.8 ㎖)를 그 다음에 정제 및 재사용을 위해 회수하였다. 트랩된 [¹⁸F] 플루오르화물 이온을 물(0.4 ㎖)중의 탄산칼륨(3.0mg)의 용액으로 반응 용기에 용리시켰다. 아세토니트릴(1.0㎖)중의 Kryptofix 222 (K222, 20 mg)의 용액을 첨가하였고, 혼합물을 진공 및 아르곤 증기하에 가열(70 내지 95℃)하여 아세토니트릴 및 물을 증발시켰다. 냉각 후에, "건조" 반응성 [¹⁸F]플루오르화물 이온, K222, 및 탄산칼륨의 잔여물에 아세토니트릴(800㎕) 중의 4-{5-[1-(4-니트로-3,5-다이메틸-피리딘-2-일메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-3-페닐-아이소자졸-4-일}-N-다이메톡시트리틸-벤젠설폰아미드(1, 8.0 mg, 9.6 μMol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밀봉된 용기(P_max = 2.3 bar)에서 교반하면서(마그네틱) 10분 동안 110℃까지 가열하였다. 앞에서와 같이 혼합물을 55℃로 냉각시켰고 대부분의 아세토니트릴을 진공 및 아르곤 증기 하에서 증발시켰다.

정제하지 않은 보호된 [¹⁸F]플루오르화된 중간체(2)에 아세토니트릴 중에 있는 40%의 트리클로로아세트산 용액(600 ㎕)을 첨가하였고, 혼합물을 5분 동안 90℃까지 가열하였다. 35℃로 냉각한 후에, 수성 아세트산 나트륨(2.0 M, 0.5 ㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 샘플 루프(1.5 ㎖)로 이동시켰고, 세미-프렙 고압 액체 크로마토그래피(semi-prep HPLC)컬럼으로 주입하였다(Phenomenex Gemini 5μ C 18, 250 x 10 mm, 55% 아세토니트릴, 45% 물, 0.01% 트리플루오로아세트산 이동상, 5.0 ㎖/분). 생성물 4-{5-[1-(4-[¹⁸F]플루오로-3,5-다이메틸피리딘-2-일메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-3-페닐-아이소자졸-4-일}-벤젠설폰아미드(3, 5-[1-(4-[¹⁸F]플루오로-3,5-다이메틸-피리딘-2-일메틸)1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-발데콕십, [¹⁸F]FPVC)를 유동식 방사선 검출 및 UV(254nm)에 의해 모니터링 한 바와 같이 pH 8.5-9.5에서 용리시켰다. 생성물(7-8㎖)을 함유하는 HPLC 용출액을 마그네틱 교반 바가 있는 30 ㎖의 바이얼 속에 수집하고, 물(20㎖)을 첨가하였다. 수용액을 완전히 혼합하고, 물/이동상 용액으로 C18 Sep-Pak을 통과하도록 하여, 폐기 용기에 들어가도록 한다. C18 Sep-Pak를 추가의 물 분취액(20 ㎖)으로 세척하였다. 생성물을 에탄올(1.0 ㎖)을 사용하여 C18 Sep-Pak으로부터 용리하고, 멸균 바이얼을 향해 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통과하도록 하였다. 이어서 물(9.0 ㎖)을 멸균 필터를 통해 멸균 생성물 바이얼에 첨가하였더니, 에탄올 농도가 10%가 되었다.

660 mCi의 [¹⁸F]플루오르화물 이온으로 출발하는 전형적인 제조로, 합성 및 HPLC 정제, 및 C18 고체상 추출 및 10% 에탄올 중의 재용해한 지 52분 후에, 분리된 69.3 mCi의 생성물 (EOB에서 96.2 mCi, 14.6 % 수율)을 얻었다.

수집된 생성물을 HPLC(Phenomenex Gemini 5μ C 18, 150 x 4.6 mm, 55% 아세토니트릴, 47.5% 물, 0.01% 트리플루오로아세트산 이동상, 1.0 ㎖/분)로 분석하였다. 방사능 및 UV(254nm) 검출에 의해 모니터링 한 바와 같이, 이 생성물은 6.1분의 정체 시간 및 99.9%의 방사화학물질 순도를 가진다.

Claims (40)

1. 하기의 a) 내지 h) 단계를 포함하는 후보 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법으로서, 하기 클릭 화학 반응은 1,3-이극성 고리화첨가반응이다.

   a) 후보 화합물의 제1 라이브러리를 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계로서, 화합물의 제1 라이브러리의 각 화합물은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 제1 작용기를 포함하는 것이고, 각각의 화합물은 제1 결합자리와 제2 결합자리를 포함하는 표적 생체거대분자의 제1 결합자리에 대해서 선택적으로 친화도를 보이는 것이다;

   b) 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 제1 구성원을 확인하는 단계;

   c) 제1 결합자리에 대해 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 확인된 제1 구성원을 표적 생체거대분자와 접촉시키는 단계;

   d) 후보 화합물의 제2 라이브러리와, 제1 구성원 및 표적 생체거대분자를 접촉시키는 단계로서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 제2 결합자리에 대해 선택적으로 친화도를 보이며, 후보 화합물의 제2 라이브러리의 각각의 화합물은 제1 작용기와의 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 상보적인 제2 작용기를 포함하고, 여기에서 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 독립적으로, 각각이 선택적으로는 링커를 통해 부착된, i) 적어도 하나의 방사성 동위원소를 포함하는 화학 원소의 비방사성 동위원소, ii) 이탈기, iii) 금속 킬레이트기, 및 iv) 형광기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이다;

   e) 후보 이미징 프로브를 형성하기 위하여, 생체거대분자 유발성 클릭 화학 반응을 통해서, 상보적인 제1 작용기와 제2 작용기를 반응시키는 단계;

   f) 후보 이미징 프로브를 분리하고 확인하는 단계;

   g) 화학 합성에 의해 후보 이미징 프로브를 제조하는 단계; 및

   h) 이미징에 적용하기 위해서, 원소의 비방사성 동위원소를 방사성 동위원소로 전환시킴으로써, 또는 이탈기를 방사성 반응물로 치환시킴으로써, 또는 방사성 금속과 복합체를 형성하도록 함으로써, 후보 이미징 프로브를 이미징 프로브로 전환시키는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 생체거대분자는 효소, 수용체, DNA, RNA, 이온 채널 및 항체로 구성되는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 표적 생체거대분자는 알츠하이머병 환자의 뇌조직에 있는 베타-아밀로이드인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 제2 결합자리는 제1 결합자리의 일부를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 금속 킬레이트기 또는 형광단 또는 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 1 항에 있어서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드 및 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 알킨이거나, 또는 제1 작용기는 알킨이고 제2 작용기는 아지드인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 알킨은 말단의 알킨인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, a) 내지 f)의 단계는 최적의 결합, 생체내분포, 대사 및 약물동력학 성질을 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 또는 제2 라이브러리 또는 둘 모두를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 이탈기는 표지된 유도체를 형성하기 위해 교환 반응, 친핵 치환 반응 또는 친전자 치환 반응에 의해 전환될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 확인된 후보 이미징 프로브는 방사성 동위원소로 표지되며, 생성물 방사성 이미징 프로브는 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성되는 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 하기의 a) 내지 h)의 단계를 포함하는 후보 이미징 프로브를 확인하기 위한 방법으로서, 하기 클릭 화학 반응은 1,3-이극성 고리화첨가반응이다.

    a) 후보 화합물의 제1 라이브러리를 표적 효소와 접촉시키는 단계로서, 화합물의 제1 라이브러리의 각 화합물은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 제 1 작용기를 포함하는 것이고, 각 화합물은 제1 결합자리와 제2 결합자리를 포함하는 표적 효소의 제1 결합자리에 대해서 선택적으로 친화도를 보이는 것이다;

    b) 제1 결합자리에 대한 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 제1 구성원을 확인하는 단계;

    c) 제1 결합자리에 대해 친화도를 보이는 후보 화합물의 제1 라이브러리로부터 확인된 제1 구성원을 표적 효소와 접촉시키는 단계;

    d) 후보 화합물의 제2 라이브러리와, 제1 구성원 및 표적 효소를 접촉시키는 단계로서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 제2 결합자리에 대해 선택적으로 친화도를 보이며, 후보 화합물의 제2 라이브러리의 각 화합물은 제1 작용기와의 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 상보적인 제2 작용기를 포함하고, 여기에서 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 독립적으로, 각각이 선택적으로는 링커를 통해 부착되는, i) 적어도 하나의 방사성 동위원소를 포함하는 화학 원소의 비방사성 동위원소, ii) 이탈기, iii) 금속 킬레이트기, 및 iv) 형광기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이다;

    e) 후보 이미징 프로브를 형성하기 위하여, 클릭 화학 반응을 통해서, 상보적인 제1 작용기와 제2 작용기를 반응시키는 단계;

    f) 후보 이미징 프로브를 분리하고 확인하는 단계;

    g) 화학 합성에 의해 후보 이미징 프로브를 제조하는 단계; 및

    h) 이미징에 적용하기 위해서, 원소의 비방사성 동위원소를 방사성 동위원소로 전환시킴으로써, 또는 이탈기를 방사성 반응물로 치환시킴으로써, 후보 이미징 프로브를 이미징 프로브로 전환시키는 단계.
17. 제 16 항에 있어서, 표적 효소는 COX-2, AKT, P13K, 및 CA-9/CA-12로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 삭제
19. 제 16 항에 있어서, 제2 결합자리는 제1 결합자리의 일부를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 16 항에 있어서, 제1 라이브러리의 각 화합물 또는 제2 라이브러리의 각 화합물 중 하나, 또는 화합물의 제1 라이브러리 및 제2 라이브러리 모두의 각 화합물은 금속 킬레이트기 또는 형광단 또는 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 제 16 항에 있어서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드 및 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 16 항에 있어서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 말단의 알킨이거나, 또는 제1 작용기는 말단의 알킨이고 제2 작용기는 아지드인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 16 항에 있어서, a) 내지 f)의 단계는 최적의 결합 친화도를 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 또는 제2 라이브러리 또는 둘 모두를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 16 항에 있어서, 이탈기는 교환 반응, 친핵 치환 반응 또는 친전자 치환 반응에 의해 표지된 유도체를 형성하도록 개조될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 27 항에 있어서, 확인된 후보 이미징 프로브는 방사성 동위원소로 표지되며, 생성물 방사성 이미징 프로브는 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성되는 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 16 항에 있어서, 상보적인 클릭 작용기는 아지드와 알킨을 포함하고, 클릭 반응은 생성물을 포함하는 1,2,3 트리아졸을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 16 항에 있어서, 제1 작용기는 아지드이고 제2 작용기는 알킨이거나, 또는 제1 작용기는 알킨이고 제2 작용기는 아지드인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 16 항에 있어서, a) 내지 f)의 단계는 최적의 결합, 생체내분포, 대사 및 약물동력학 성질을 갖는 후보 이미징 프로브가 확인될 때까지 화합물의 신규 제1 라이브러리 또는 제2 라이브러리 또는 둘 모두를 만드는 절차와, 이를 다시 스크리닝하는 절차가 반복 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 16 항에 있어서, 이탈기는 표지된 유도체를 형성하기 위해서 교환 반응, 친핵 치환 반응, 친전자 치환 반응을 통해, 또는 방사성 금속과 복합체를 형성하는 것을 통해 전환될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 이탈기는 할로, 하이드록시, 아실옥시, 니트로, 다이아조늄염 및 설포닐옥시기로 구성되는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 33 항에 있어서, 확인된 리간드 화합물은 방사성 동위원소로 표지되고, 생성물 리간드 화합물은 PET, SPECT, 및 광학적 이미징으로 구성된 군 중에서 선택되는 이미징 방법을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 방사성 동위원소는 F-18, C-11, I-123, I-124, I-125, I-127, I-131, Br-75, Br-76, Cu-64, Tc-99m, Y-90, Ga-67, Ga-68, Cr-51, In-111, Ir-192, 177-Lu, Mo-99, Sm-153 및 Tl-201로 구성되는 군 중에서 선택되는 것을 특 징으로 하는 방법.
37. 제 16 항에 있어서, 후보 화합물의 효소 결합자리 내의 결합이, 임의의 외부로부터 첨가된 촉매가 부재하는 가운데에서도 클릭 화학 반응을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 16 항에 있어서, 후보 화합물의 제2 라이브러리는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 16 항에 있어서, 후보 화합물의 제1 라이브러리 또는 후보 화합물의 제2 라이브러리 또는 둘 모두는, 화합물과 제1 작용기 간의 링커, 또는 화합물과 제2 작용기 간의 링커, 또는 둘 모두를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 39 항에 있어서, 링커는 화합물과 작용기 간의 링커 사슬에 1 내지 10개의 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

Images