CN101995474A - 一种以sox2蛋白表达水平作为前列腺癌恶性程度判断的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种医学诊断用的方法，具体的说是一种通过检测前列腺癌组织中SOX2蛋白的表达情况来判断前列腺癌恶性程度的方法，该方法是通过免疫检测技术实现的，属于临床免疫诊断方法。前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，位于欧美国家男性肿瘤致死率第二位，仅次于肺癌。近几年，在我国的发病率呈上升趋势。通过实验研究发现，前列腺癌组织中SOX2蛋白表达程度越高，其分化程度越低，恶性程度越高，由此SOX2可以成为前列腺癌分化程度的标志蛋白，进而为前列癌的预后判断提供参考。本发明通过对病理组织的免疫组化反应，检测该组织中SOX2分子的表达数量，根据免疫组化反应的结果来判断前列腺癌的分化程度。
Description
技术领域
本发明属于一种医学诊断用的方法，具体的说是一种通过检测前列腺癌组织中SOX2蛋白的表达情况来判断前列腺癌恶性程度的方法，该方法是通过免疫检测技术实现的，属于临床免疫诊断方法，特别是运用免疫组化方法检测SOX2蛋白从而判断前列腺癌恶性程度的方法。
背景技术
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，位于欧美国家男性肿瘤致死率第二位，仅次于肺癌。近几年，在我国的发病率呈上升趋势。前列腺癌的预后与发现早晚、病理类型、患者年龄，及相应的治疗措施是否得当密切相关。癌细胞的分化程度与肿瘤的恶性程度和病人的预后密切相关。病理报告上常用Gleason评分来评价前列腺癌细胞的分化程度。因此，对前列腺癌的恶性程度的早期快速诊断可以对治疗及预后判断产生积极的作用。
SOX2(SRY-Related HMG-Box Gene 2)是SOX家族的一个成员，是干细胞的标志性基因之一，存在干细胞的核中，是一种维持干细胞特性的重要的转录因子，在维持胚胎干细胞及癌症干细胞的多能性及自我更新能力方面起到至关重要的作用。SOX2与癌症干细胞的致癌能力密切相关。因此癌细胞中的SOX2极有可能对癌症的分化程度进行密切的调节，并有可能成为肿瘤分化程度判断的标志蛋白。我们通过对127例前列腺癌组织芯片(包括病理分级1-3级，Gleason评分2-10分)的免疫组化染色分析发现SOX2的表达水平随着病理分级的增高以及Gleason评分的增高而表达水平显著增高，这表明SOX2可以成为前列腺癌分化程度的标志蛋白，进而为前列癌的预后判断提供参考。即在前列腺癌组织中SOX2蛋白表达程度越高，其分化程度越低，恶性程度越高。(见表1)
表1.SOX2表达水平与前列腺癌病理分级的关系
本实验以SOX2阳性细胞数占组织细胞的百分比作为阴性及阳性结果的判断，即＜10％为阴性(-)，而≥10％并＜30％为弱阳性(+)，≥30％并＜50％为中阳性(++)，≥50％为强阳性(+++)。结果表明SOX2的表达水平随着病理分级的增高以及Gleason评分的增高而表达水平增高，χ2检验分析显示两者之间均存在显著相关性。
发明内容
针对上述情况，本发明通过免疫组化的方法检测病理组织中的SOX2蛋白，以此判断前列腺癌的分化程度。具体的讲就是，通过对病理组织的免疫组化反应，检测该组织中SOX2分子的表达数量，根据免疫组化反应的结果来判断前列腺癌的分化程度。
其技术内容包括：免疫组化反应和显微镜观察等步骤。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.脱蜡和水化：
具体步骤如下：
①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟，
②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟，
③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟，
④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟，
⑤组织切片置于95％乙醇中浸泡10分钟，
⑥组织切片置于80％乙醇中浸泡10分钟，
⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟，
⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。
2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer(pH 6.0)通过微波炉，加热10分钟，放入组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。
3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。
4.将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。
5.用超纯水洗2次，各五分钟
6.滴加封闭液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。
7.滴加一抗(1∶100)50μL，室温静置1小时。
8.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
9.滴加二抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
10.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
11.滴加三抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
12.TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。
13.DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗10分钟。
14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。
15.脱水、透明：
具体步骤如下：
①组织切片置于80％乙醇中浸泡30秒，
②95％乙醇中浸泡3分钟，
③无水乙醇中II浸泡5分钟，
④无水乙醇I浸泡5分钟，
⑤二甲苯II中浸泡5分钟，
⑥二甲苯I浸泡5分钟，
16.树脂封片、镜检。
附图说明
图1在恶性程度较低，分化程度高的前列腺癌细胞中检测结果显示SOX2低表达。
图2在恶性程度较高，分化程度低的前列腺癌细胞中检测结果显示SOX2高表达。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1
样本：某妇女淋巴结的组织切片。
1.脱蜡和水化：
具体步骤如下：
①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟，
②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟，
③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟，
④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟，
⑤组织切片置于95％乙醇中浸泡10分钟，
⑥组织切片置于80％乙醇中浸泡10分钟，
⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟，
⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。
2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer(pH 6.0)通过微波炉，加热10分钟，放入组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。
3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。
4.将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。
5.用超纯水洗2次，各五分钟
6.滴加封闭液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。
7.滴加一抗(1∶100)50μL，室温静置1小时。
8.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
9.滴加二抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
10.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
11.滴加三抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
12.TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。
13.DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗10分钟。
14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。
15脱水、透明：
具体步骤如下：
①组织切片置于80％乙醇中浸泡30秒，
②95％乙醇中浸泡3分钟，
③无水乙醇中II浸泡5分钟，
④无水乙醇I浸泡5分钟，
⑤二甲苯II中浸泡5分钟，
⑥二甲苯I浸泡5分钟，
16.树脂封片、镜检。
镜检结果如图1所示。
可见该组织切片中SOX2的表达程度低，有少量棕黄色颗粒，为SOX2检测弱阳性(+)
结果，后经病理检测结果为低恶性、高分化前列腺癌，Gleason评分4分。
实施例2
样本：某妇女前列肿瘤浸润转移的淋巴结组织切片。
1.脱蜡和水化：
具体步骤如下：
①组织切片置于二甲苯I中浸泡10分钟，
②组织切片置于二甲苯II浸泡10分钟，
③组织切片置于无水乙醇中I浸泡10分钟，
④组织切片置于无水乙醇II浸泡10分钟，
⑤组织切片置于95％乙醇中浸泡10分钟，
⑥组织切片置于80％乙醇中浸泡10分钟，
⑦组织切片置于自来水中浸泡1分钟，
⑧组织切片置于蒸馏水中浸泡5分钟。
2.抗原修复，将10mM的Citrate Buffer(pH 6.0)通过微波炉，加热10分钟，放入组织切片中低火加热10-15分钟，在室温下晾凉。
3.用超纯水洗处理过的组织切片3次，每次五分钟。
4.将3％双氧水溶液滴加在载玻片上，室温静置10分钟，甩去多余液体。
5.用超纯水洗2次，各五分钟
6.滴加封闭液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在室温下孵育一小时，甩去多余液体。
7.滴加一抗(1∶100)50μL，室温静置1小时。
8.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
9.滴加二抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
10.TBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
11.滴加三抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时。
12.TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。
13.DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗10分钟。
14.苏木精复染20秒，自来水冲洗10分钟。
15.脱水、透明：
具体步骤如下：
①组织切片置于80％乙醇中浸泡30秒，
②95％乙醇中浸泡3分钟，
③无水乙醇中II浸泡5分钟，
④无水乙醇I浸泡5分钟，
⑤二甲苯II中浸泡5分钟，
⑥二甲苯I浸泡5分钟，
16.树脂封片、镜检。
镜检结果如图2所示。
可见该组织切片中SOX2的表达程度高，有明显棕黄色颗粒，为SOX2检测强阳性(+++)
结果，后经病理检测结果为高恶性、低分化前列腺癌，Gleason评分10分。
Claims (3)
1.一种以SOX2蛋白表达水平作为前列腺癌恶性程度判断的方法，其特征在于，处理病病理组织切片，抗原修复，对病理组织的进行免疫组化反应，将组织切片脱水、透明化处理，并树脂封片，镜检，由此检测该组织中SOX2分子的表达数量，根据免疫组化反应的结果来判断前列腺癌的分化程度。
2.根据权利要求1所述的一种以SOX2蛋白表达水平作为前列腺癌恶性程度判断的方法，其特征在于，免疫组化反应所滴加的抗体：
滴加一抗(1∶100)50μL，室温静置1小时；
滴加二抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时；
滴加三抗(1∶100)50μL，室温静置0.5小时；
DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，在达到满意效果后放入清水中终止染色，后用自来水冲洗10分钟。
3.根据权利要求1所述的一种以SOX2蛋白表达水平作为前列腺癌恶性程度判断的方法，其特征在于，显微镜观察检测该组织中SOX2分子的表达数量，从而判断前列腺癌的分化程度。
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| CN103602720A (zh) * | 2013-06-24 | 2014-02-26 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 前列腺癌基因标记物在标记前列腺癌复发和转移中的用途及方法 |
| CN107085106A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-08-22 | 广州市第人民医院 | 用于前列腺癌进展预后的检测试剂及试剂盒 |
| CN107300496A (zh) * | 2011-05-20 | 2017-10-27 | 独立行政法人理化学研究所 | 生物材料用透明化试剂、及其利用 |
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2010
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110330 |