CN107300496A - 生物材料用透明化试剂、及其利用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物材料用透明化试剂、及其利用。本发明的生物材料用透明化试剂是含有浓度落在1M以上8.5M以下的范围内的选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物、以及浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油的溶液。

Description

生物材料用透明化试剂、及其利用
本申请是申请日为2012年5月18日，申请号为201280023902.6，发明名称为“生物材料用透明化试剂、及其利用”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种生物材料用透明化试剂、及其利用。
背景技术
在使用光学显微镜观察不透明的组织内部时，通常会利用透明化试剂来进行预处理(透明化处理)。
关于透明化试剂及预处理方法，具代表性的例如已有专利文献1及非专利文献1中揭示的由Ann-Shyn Chiang提出的Focus Clear(商品名)溶液、或非专利文献2中揭示的由Hans-Ulrich Dodt等人提出的组织透明法(tissue clearing method)。这些技术均用以使组织透明化，目的在于观察组织中所存在的荧光物质。
[现有技术文献]
专利文献1：美国专利第6472216号公告；授权日2002年10月29日。
非专利文献1：Ann-Shyn Chiang et al.:Insect NMDA receptors mediatejuvenile hormone biosynthesis.PNAS 99(1),37-42(2002).
非专利文献2：Hans-Ulrich Dodt et al.:Ultramicroscopy:three-dimensionalvisualization of neuronal networks in the whole mouse brain.Nature Methods 4(4),331-336(2007).
发明内容
[发明要解决的问题]
由于上述方法均需要将有机溶剂用作透明化处理的有效成分等，因此有难适用于活组织、适用对象一味地限于固定化样品的问题。另外，还有导致作为透明化处理对象的生物材料引起收缩的问题。
在本发明以前，本发明的发明者们发现如果使用尿素，便能使生物材料透明化。由于尿素是生物亲和性优异的成分，因此如果将尿素或尿素衍生物用作透明化处理的有效成分，就能解决上述的问题。
本发明的发明者们还着手于开发一种用尿素或尿素衍生物，针对脆弱的组织来能降低其组织变形等风险的透明化处理方法。
本发明正是为了解决上述的问题而完成的，其目的在于提供一种将尿素及尿素衍生物用作有效成分的新颖的生物材料用透明化试剂、及其利用。
[解决问题的技术手段]
为了解决所述课题，本发明的发明者们进行了锐意研究。其结果发现，通过使规定浓度以上的甘油共存于含有作为透明化处理有效成分的尿素或尿素衍生物的溶液中，便能对脆弱的组织来更确实地抑制其组织变形等。由此完成了本发明。
即，为了解决上述的问题，本发明的生物材料用透明化试剂的特征在于：其是含有浓度落在1M以上8.5M以下的范围内的选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物、以及浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油的溶液。
在上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂是含有尿素来作为所述化合物的溶液。
在上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂是水溶液。
在任意的上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂含有表面活性剂。
在本发明的生物材料用透明化试剂中，所述表面活性剂是非离子性的表面活性剂。
在本发明的生物材料用透明化试剂中，所述非离子性的表面活性剂是选自由TritonX(注册商标)、Tween(注册商标)、及NP-40(商品名)所组成的群中的至少一种。
在任意的上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂还含有水溶性的高分子化合物。
在本发明的生物材料用透明化试剂中，水溶性的所述高分子化合物是选自由Percoll(注册商标)、Ficoll(注册商标)、聚乙二醇、及聚乙烯吡咯烷酮所组成的群中的至少一种。
在任意的上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂含有浓度落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内的甘油。
在任意的上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂含有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内的所述表面活性剂。
在任意的上述方案的基础上，本发明的生物材料用透明化试剂使来自多细胞动物的组织或器官、或除人类以外的多细胞动物得以透明化。
为了解决上述的问题，本发明的生物材料透明化处理系统的特征在于：含有任意的所述生物材料用透明化试剂、以及经单离的生物材料；且为了使生物材料得以透明化，生物材料用透明化试剂浸润到了该生物材料的内部。
为了解决上述的问题，本发明的生物材料透明化方法的特征在于包括如下步骤：使任意的所述生物材料用透明化试剂浸润到经单离的生物材料中，以使该生物材料得以透明化。
本发明的生物材料用透明化处理试剂盒的特征在于：其含有任意的所述生物材料用透明化试剂。[发明的效果]
本发明是将尿素或尿素衍生物用作有效成分的生物材料用透明化试剂，并发挥如下效果：能提供一种可更切实抑制透明化处理所引起的组织变形等的试剂及其利用。
附图说明
图1涉及本发明的一个实施例，是在用本发明的生物材料用透明化试剂对小鼠的脑切片进行透明化处理后，测定该脑切片的透光率而得的结果图。
图2涉及本发明的其他实施例，是用本发明的生物材料用透明化试剂处理了胎鼠后的结果图。
图3涉及本发明的参考例，是对尚未用含有作为主成分的尿素的生物材料用透明化试剂进行透明化处理前的生物材料、以及经透明化处理后又恢复成处理前的状态的生物材料进行免疫染色的结果图。
图4涉及本发明的另一实施例，是用本发明的生物材料用透明化试剂处理了胎鼠后的结果图。
图5涉及本发明的另一实施例，是用本发明的生物材料用透明化试剂处理了小鼠的大脑切片后的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
(生物材料用透明化试剂的有效成分)
本发明的“生物材料用透明化试剂”是含有“尿素”的溶液，尿素是生物材料透明化上所必需的有效成分。
本发明的其他方案中的“生物材料用透明化试剂”是含有“尿素衍生物”的溶液，该尿素衍生物也是生物材料透明化上所必需的有效成分。
所述尿素衍生物的种类并无特别限定，具体例如有各种烷基脲、以及下述通式(1)所示的化合物。在此，通式(1)所示的化合物包括一部分种类的烷基脲。本发明的生物材料用透明化试剂只要含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少1种化合物来作为有效成分即可，其中更优选含有尿素。
通式(1)所示的尿素衍生物中，R1、R2、R3、R4各自独立地为氢原子(但R1～R4全部为氢原子时，则就是尿素，因此该情况除外)、卤素原子或烃基；构成烃基的碳原子有多个时，这些碳原子的一部分也可被氮原子、氧原子、硫原子等杂原子所取代。烃基包括链状烃基及环状烃基。
作为所述链状烃基，例如可例示链状烷基、链状烯基及链状炔基等。构成链状烃基的碳的数量并无特别限定，例如可列举碳数为6以下的直链状或分支状的烃基，优选碳数为1～3的烷基。链状烃基也可以含有例如卤素原子等取代基。作为链状烷基的例子，可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。
作为所述环状烃基，例如可例示环烷基及环烯基等。环状烃基也可含有例如卤素原子等取代基。作为环烷基的例子，可列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基等碳数为3以上的环烷基，优选碳数为3以上6以下的环烷基。作为环烯基的例子，可列举环己烯基等碳数为3以上的环烯基，优选碳数为3以上6以下的环烯基。
作为所述卤素原子，可列举氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
另外，关于通式(1)所示尿素衍生物的更优选的具体例，例如有满足以下条件1)～2)的尿素衍生物。
条件1)：选自R1～R4的任意3个基为氢原子，剩余的1个基是卤素原子或碳数1～6的链状烃基；作为优选，剩余的1个基为碳数1～3或碳数1～2的烷基。
条件2)：选自R1～R4的任意2个基为氢原子，剩余的2个基各自独立地是卤素原子或碳数1～6的链状烃基；作为优选，剩余的2个基均是碳数1～3或碳数1～2的烷基；更优选的，作为氢原子的2个基的其中一方是R1或R2，另一方是R3或R4。
本发明的“生物材料用透明化试剂”含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物，且该化合物的浓度落在1M以上8.5M以下的范围内。该化合物的浓度优选落在3M以上5M以下的范围内，更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
(将尿素等用作有效成分时的优点)
尿素是来源于毒性极低的活体的成分。因此，本发明的“生物材料用透明化试剂”具有如下优点：1)不仅能用来对经固定化的生物材料进行透明化，还能用来对未经固定化的(活的)生物材料进行透明化；2)另外，尿素所导致的荧光蛋白质损害情况、及该荧光蛋白质的荧光消失情况相对较少，因此适于用荧光蛋白质来观察生物材料；3)尿素非常廉价，也容易获取，且操作性优异，因此能以非常低的成本及简单的步骤来进行透明化处理。
另外，除上述的优点以外，还具有如下优点：4)与现有技术中的生物材料用透明化试剂相比，可明显提高因光散射性高而不透明的生物材料的透明性，从而能观察处于超深部组织中的各种荧光蛋白质及荧光物质；5)尤其是就脑组织而言，能使目前还是深部观察中的一个屏障的白质层得以透明化，从而能观察比白质层更位于深部的区域(例如胼胝体)；6)用本发明的试剂来进行的透明化处理是可逆的，具体而言，仅通过将透明化处理后的生物材料浸渍到平衡盐类溶液中，便可恢复成透明化处理前的状态，且透明化处理前后的蛋白质等的抗原性也保持不变，所以能运用通常的组织染色法及免疫染色法来进行分析。
另外，用所述尿素衍生物代替尿素时，也能获得相同的优点。
(甘油)
本发明的“生物材料用透明化试剂”含有作为必需成分的“甘油”。“生物材料用透明化试剂”含有浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油。甘油通常用作干燥抑制成分，若需用作干燥抑制成分，则以20(w/v)％以下的浓度便可表现出充分的干燥抑制效果。但通过使所含甘油的浓度达到25(w/v)％以上，便能更确实地对被实施透明化处理的生物材料的变形等进行抑制。其结果，即使生物材料是极脆弱的组织，也可以在抑制其损伤及变形的基础上，进行透明化处理。另外，就迅速进行透明化处理的观点而言，使甘油的浓度落在35(w/v)％以下的范围内。甘油的浓度优选落在25(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内，更优选落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内。若甘油落入这些浓度范围内，则本发明的“生物材料用透明化试剂”中的、选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的浓度优选落在3M以上5M以下的范围内，更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。当甘油的浓度与尿素等的浓度均落在上述相应范围内时，便能显著地同时实现快速的透明化处理、以及生物材料的变形抑制效果。
另外，采用甘油时，免疫应答所造成的排斥便相对较低，且甘油相对不易被网状内皮系统捕获，且甘油蓄积在肝脏以及肾脏等中的忧患相对较低。因此甘油的利点在于有助于将所述“生物材料用透明化试剂”用于作为生物材料的活体。另外，甘油也有相对廉价的优点。
(表面活性剂)
本发明的“生物材料用透明化试剂”也可以视需要而含有表面活性剂。表面活性剂优选是非离子性的表面活性剂，其理由在于能缓慢地提升本试剂向生物组织的渗入。作为非离子性的表面活性剂，可列举：聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯等脂肪酸系表面活性剂；聚乙烯醇等高级醇系表面活性剂；聚氧乙烯辛基苯基醚等烷酚系表面活性剂。具体而言，例如可列举选自由下述产品所组成的群中的至少一种：TritonX-100、及TritonX-140等TritonX(注册商标)系列；Tween-20、Tween-40、Tween-60、及Tween-80等Tween(注册商标)系列；NP-40(商品名)。表面活性剂也可以视需要而混合两种以上来使用。
这些表面活性剂可提高尿素向生物材料的渗透性，提高透明化处理的效率。特别是若需要对脑组织白质层等这类透明化处理相对困难的生物材料进行透明化，则“生物材料用透明化试剂”中优选含有表面活性剂。
另外，与采用尿素的方案同样，所述表面活性剂也能提高尿素衍生物向生物材料的渗透性。
(水溶性的高分子化合物)
本发明的“生物材料用透明化试剂”也可视需要而进而含有水溶性的高分子化合物。在此，所谓高分子化合物是指，分子量例如高达5万～6万以上，从而实质上不会渗入细胞内的化合物。另外，高分子化合物优选是不会引起生物材料的改性等的化合物。作为水溶性的高分子化合物，具体例如可列举交联型蔗糖高分子物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Percoll(商品名；以聚乙烯吡咯烷酮皮膜来包覆胶体状二氧化硅而得的高分子物)等。作为交联型蔗糖高分子物，具体例如可列举Ficoll PM70(商品名))等。Ficoll PM70是，用表氯醇使蔗糖进行交联(共聚)而获得的重量平均分子量约7万的高分子物。
与尿素及尿素衍生物不同的是，这些水溶性的高分子化合物实质上不会浸入细胞内，且为水溶性，因此有助于调整细胞内外的渗透压差。因此，有助于维持作为透明化处理对象的生物材料的原型，特别是有助于防止生物材料的膨胀。虽无特别限定，但本发明的“生物材料用透明化试剂”的渗透压若相对较高，则优选该试剂含有这些水溶性的高分子化合物。
(其他成分)
本发明的“生物材料用透明化试剂”可以视需要而含有选自于羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、以及聚乙二醇(macrogol)中的至少一种化合物来作为“干燥抑制成分”。干燥抑制成分可防止作为透明化处理对象的生物材料发生干燥。特别是自完成透明化处理时起，至提供给利用光学显微镜做观察时为止的时间相对较长时，或提供给光学显微镜做观察的时间较长时，优选本发明的试剂含有所述干燥抑制成分。另外，本发明的“生物材料用透明化试剂”含有特定浓度的甘油作为必需成分，甘油也具有干燥抑制作用。因此，该生物材料用透明化试剂即使不另含所述干燥抑制成分，也具有超越这些干燥抑制成分的干燥抑制效果。
另外，本发明的“生物材料用透明化试剂”除了含有所述“尿素及/或尿素衍生物”、“表面活性剂”及“水溶性高分子化合物”以外，也可以视需要而例如含有pH值调整剂及渗透压调整剂等添加剂。
(溶剂)
本发明的“生物材料用透明化试剂”是含有可供溶解尿素的溶剂的溶液。溶剂只要可以供溶解尿素，则其种类无特别限定，优选使用水作为主溶剂，特别优选仅使用水作为溶剂。另外，本发明中，所谓“使用水作为主溶剂”，是指水在所使用的全部溶剂中的体积比例相比于其他溶剂为最多。水在所使用的全部溶剂的合计体积中的用量优选大于50％且100％以下。另外，把以水为主溶剂而制备的“生物材料用透明化试剂”，称为使用水溶液的“生物材料用透明化试剂”。
另外，在使用水作为主溶剂时，例如可将二甲基亚砜(DMSO)与水混合，并用到得以固定了的标本中。例如若将DMSO与水混合并用到得以固定了的标本中，就可期待提高试剂向生物材料的渗透性、及促进具有角质表面的组织的透明化处理等这些效果。
使用水作为溶剂时的主要优点如以下。1)本发明的“生物材料用透明化试剂”的有效成分即尿素在水中的溶解性优异，因此生物材料用透明化试剂的制备较容易且成本低。2)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，作为处理对象的生物材料不会在透明化处理的过程中发生脱水，因此可抑制生物材料收缩的问题。3)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，对荧光蛋白质造成损伤的可能性有显著的降低，因此能利用荧光蛋白质来观察经过了透明化处理的生物材料。4)并不仅限于是经固定了的材料，也能适于活体材料的透明化处理。5)如后文所述的，能实现透明化处理的可逆性，因此能视需要而使透明化处理后的活体试样恢复成透明化处理前的状态。6)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，操作的安全性更高。
另外，本发明的“生物材料用透明化试剂”也可以是，能对作为透明化处理对象的生物材料的理想pH值进行维持的缓冲液。此外，可以对本发明的“生物材料用透明化试剂”的渗透压的程度加以调整，以抑制成为透明化处理对象的生物材料发生变形，且使尿素充分渗透到该生物材料内。
另外，对于尿素衍生物，也可以与使用尿素的方案同样，使用上述溶剂。
(组分的量关系)
本发明的“生物材料用透明化试剂”中的“尿素”含量只要落在1M以上8.5M以下的范围内，则无特别限定。另外，“尿素”的含量的上限取决于尿素在所使用的溶剂中的溶解度，也取决于成为处理对象的生物材料的种类，但例如可以在“生物材料用透明化试剂”中的尿素含量相对较少时延长处理时间，在尿素含量相对较多时缩短处理时间。由此来进行所需的透明化处理。
另外，若要使用“表面活性剂”，则其含量无特别限定。表面活性剂的含量浓度优选落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内，更优选落在0.05(w/v)％以上0.5(w/v)％以下的范围内，特别优选落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的表面活性剂的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
另外，若要使用“水溶性的高分子化合物”，则其含量无特别限定。水溶性的高分子化合物的含量浓度优选落在2.5(w/v)％以上40(w/v)％以下的范围内。就生物材料的膨胀抑制效果、与透明化处理后的折射率之间的平衡性而言，所述含量浓度更优选落在5(w/v)％以上25(w/v)％以下的范围内，进而优选落在10(w/v)％以上20(w/v)％以下的范围内，特别优选落在10(w/v)％以上15(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的“水溶性的高分子化合物”的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
另外，若要使用“干燥抑制成分”，则其含量无特别限定。干燥抑制成分的含量浓度优选落在大于0(w/v)％且10(w/v)％以下的范围内，更优选落在1(w/v)％以上7(w/v)％以下的范围内，特别优选落在2.5(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的“干燥抑制成分”的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
(成为处理对象的生物材料)
在用本发明的“生物材料用透明化试剂”来进行的透明化处理中，成为处理对象的生物材料的种类并无特别限定，优选源自植物的材料或源自动物的材料，更优选源自鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类或哺乳类(哺乳动物)等动物的材料，特别优选源自哺乳动物的材料。另外，哺乳动物的种类并无特别限定，可列举：小鼠、大鼠、兔、土拨鼠、除人类以外的灵长类等实验动物；狗、猫等玩赏动物(宠物)；牛、马等家畜；人类。
另外，生物材料可以是生物个体本身(活着的人类个体除外)，也可以是从多细胞生物的个体中获取的器官、组织、或细胞。由于本发明的“生物材料用透明化试剂”具有优异的透明化处理能力，因此即使生物材料是源自多细胞动物的组织或器官(例如整个脑或其一部分)、或除人类以外的多细胞动物的个体(例如胚胎等)本身，透明化处理也能适用于其。由于本发明的“生物材料透明化试剂”对生物材料变形的抑制效果极大，所以特别适用于脆弱的生物材料的透明化。在此，所谓脆弱的生物材料，可列举对除植物细胞以外的细胞、生长初期阶段的动物胚胎、干细胞、初代培养细胞、株化细胞在特殊培养环境下进行三维培育而获得的块状物(球状体(spheroid)、神经球(neurosphere)、细胞团块(cellaggregates)等)等。
另外，所述生物材料可以是供进行显微镜观察的经固定(fixed)处理过的材料，也可以是未经固定化的材料。另外，若需使用经固定了的材料，则优选进行如下处理：在固定化处理后，例如在20(v/w)％蔗糖-PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲盐水)溶液中进行充分(例如24小时以上)浸渍。优选进而进行如下处理：将该材料埋于OCT组合物(Optimum Cutting Temperature compound)中并且用液态氮冷冻后，在PBS中解冻，用4(v/w)％PFA(Paraformaldehyde，多聚甲醛)-PBS液再次固定。
所述生物材料具体例如可以是：被注入了荧光性化学物质的活体组织、经荧光性化学物质染色的活体组织、被移植有表达了荧光蛋白质的细胞的活体组织、或表达了荧光蛋白质的转基因动物活体组织等。
(生物材料用透明化试剂的尤其良好的组分例)
本发明的“生物材料用透明化试剂”的尤其良好的组分例示以下。特别是对于对小鼠等哺乳动物的生长初期阶段胚胎进行透明化处理，这些透明化试剂极为合适。
·生物材料用透明化试剂(1)：
溶解有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素，且以含有浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油的水溶液。
·生物材料用透明化试剂(2)：
使水中含有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、以及浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油，从而获得的水溶液。
·生物材料用透明化试剂(3)：
使水中含有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油、以及浓度落在2.5(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内的“水溶性的高分子化合物(例如Ficoll)”，从而获得的水溶液。
·生物材料用透明化试剂(4)：
使水中含有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、浓度落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范围的二甲基亚砜(DMSO)、浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油，从而获得的水溶液。
所述生物材料用透明化试剂(1)～(4)中的甘油浓度均优选落在25(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内，更优选落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内。另外，所述生物材料用透明化试剂(1)～(4)中的尿素浓度均优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，更优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
另外，若使用尿素衍生物(或尿素与尿素衍生物的混合物)代替尿素时，则只需采用与所述尿素浓度相同的浓度的尿素衍生物等来制备生物材料用透明化试剂(1)～(4)即可。
(生物材料用透明化试剂的制备)
本发明的“生物材料用透明化试剂”的制备方法如下：将“尿素及/或尿素衍生物”、“甘油”、以及视需要而使用的“表面活性剂”、“水溶性的高分子化合物”、“干燥抑制成分”等溶解到溶剂中。在溶剂中进行溶解或混合的顺序并无特别限定。
(用生物材料用透明化试剂来进行透明化处理的方法例)
用本发明的“生物材料用透明化试剂”来进行生物材料的透明化处理的方法包括：使“生物材料用透明化试剂”浸润到所述“生物材料”中的步骤(透明化处理步骤)。更具体而言，在供进行透明化处理用的容器内，使“生物材料用透明化试剂”浸润到所述“生物材料”中。
在所述透明化处理步骤中，将“生物材料用透明化试剂”与“生物材料”放入供进行透明化处理的容器内的顺序并无特别限定，优选首先放入“生物材料用透明化试剂”，然后放入“生物材料”(即，将生物材料投入到生物材料用透明化试剂中)。
进行所述透明化处理步骤时的处理温度并无特别限定，优选落在15℃以上45℃以下的范围内。另外，进行透明化处理的处理时间并无特别限定，优选落在2小时以上6个月以内的范围内，更优选落在72小时以上21日以内的范围内。另外，进行透明化处理时的压力并无特别限定。
关于所述透明化处理步骤中所用的放入有经透明化处理的生物材料的处理容器，其例如可以在室温或低温环境下保存(透明化试样保存步骤)，直至被提供给后述观察步骤为止。
(经透明化处理的生物材料的观察步骤)
经透明化处理的生物材料，继而被提供给例如利用光学显微镜来进行的观察步骤。可以视需要而在所述透明化处理步骤前，或在透明化处理步骤后且观察步骤前，对准备提供给观察步骤的生物材料实施染色或做标记等可视化处理步骤。
例如，可视化处理步骤中若需要利用荧光蛋白质，则可以在透明化处理步骤之前，通过对活的生物材料导入荧光蛋白质基因，来使该生物材料表达荧光蛋白质。
另外，若需要将荧光性化学物质(荧光蛋白质除外)注入生物材料，或需要用荧光性化学物质来对生物材料进行染色，则优选在所述透明化处理步骤前进行可视化处理步骤。但也可以在所述透明化处理步骤后进行可视化处理步骤。此外，作为可视化处理步骤，也可以用荧光性化学物质以外的化学物质来进行染色。
观察步骤，可使用各种光学显微镜来进行。例如，可以运用三维超分辨率显微镜技术(例如STED(stimulated emission depletion，受激发射损耗显微技术)、3D PALM(3Dphotoactivated localization microscopy，3D光激活定位显微技术)、FPALM(Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy，荧光光激活定位显微技术)、3D STORM(3D stochastic optical reconstruction microscopy，3D随机光学重构显微技术)、及SIM(structure illumination microscopy，结构照明显微技术))来实施观察步骤。另外，优选应用多光子激发型(通常为双光子激发型)光学显微镜技术来进行观察步骤。
另外，本发明中所述的透明化(处理)的一个指标为：在对处理前的生物材料与处理后的生物材料进行比较的情况下，处理后的生物材料的光(特别是可见光)透过度有所提高。
(其他应用)
用本发明的“生物材料用透明化试剂”来进行的透明化处理是可逆的。因此，对于经透明化处理的生物材料，例如可以将其浸渍到平衡盐类溶液中来除去生物材料透明化试剂的成分，使其恢复成透明化处理前的状态。在此，所谓平衡盐类溶液，具体例如可列举：PBS、HBSS等通过磷酸盐而成为缓冲液的平衡盐溶液；通过三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐而成为缓冲液的平衡盐溶液(TBS)；人工脑脊液(ACSF，artificial cerebrospinal fluid)；MEM(Minimum Essential Medium，最小限必需培养基)、DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium，杜氏改良培养基)、及Ham's F-12等用于培养细胞的基础培养基等。
若使用所述“生物材料用透明化试剂”，则不会在透明化处理的前后阶段、也不会在完成透明化处理并恢复到透明化处理前的状态时，引起生物材料中的蛋白质等的改性等。因此，生物材料中所含的蛋白质等的抗原性也能保持不变。因此，例如可以对生物材料进行透明化处理并利用光学显微镜进行观察，然后将该生物材料恢复成透明化处理前的状态，并运用通用的组织染色法、或免疫染色法来进行详细分析等。
即，从其他观点看，本发明是生物材料的一种复原方法，其包括如下步骤：对用所述“生物材料用透明化试剂”进行透明化处理而得以了透明化的生物材料，用平衡盐类溶液进行浸润，从而使所述生物材料恢复成透明化处理前的状态。
(生物材料用透明化处理试剂盒)
本发明的“生物材料用透明化处理试剂盒”具备所述“生物材料用透明化试剂”。“生物材料用透明化处理试剂盒”也可以进而具备以下至少一方：所述透明化处理步骤中使用的“处理容器”、“生物材料夹持器具(镊子等)”、用以将透明化处理后的生物材料恢复成透明化处理前的状态的“平衡盐类溶液”、以及“试剂盒的操作说明书”。另外，试剂盒的操作说明书中例如记载有上述“(用生物材料用透明化试剂来进行透明化处理的方法例)”栏中叙述的透明化处理方法的顺序等。
(生物材料透明化处理系统)
在本发明的生物材料透明化处理系统中，包含本发明的“生物材料用透明化试剂”以及经单离的所述“生物材料”，且为了使该“生物材料”得以透明化而使“生物材料用透明化试剂”浸润到了该“生物材料”的内部。即，该处理系统的定义中例如包括：含有处在透明化处理过程中的生物材料的处理系统、含有已完成了透明化处理的生物材料的处理系统。
[实施例]
根据以下的实施例、及比较例等对本发明进行更具体说明，但本发明并不限定于此。
[实施例1：脑切片的观察]
(全身固定步骤)
使用出生后6周龄的野生型(非转基因)的正常C57BL6系列雄小鼠，用蠕动泵自小鼠的左心室灌注冰冷PBS，然后灌注冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)来将小鼠的全身完全固定。
(生物材料的摘出及固定步骤)
之后，除去小鼠的头盖骨，十分小心地摘出整个脑。然后，在4℃的环境下使摘出的脑在冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)中浸渍一晚。其后，将该脑转移到20％蔗糖-PBS溶液中，并在4℃的环境下缓慢振荡24小时。
接着，用20％蔗糖-PBS溶液对所述脑实施了完全的置换后，将其埋于OCT组合物(compound)中，并用液态氮进行冷冻。接着，将冷冻后的脑转移到PBS中，在室温下解冻。将解冻后的脑再次在4％多聚甲醛-PBS中固定1小时。
(生物材料的透明化处理及观察步骤)
最后，用再固定了的脑，制作了包含海马区的冠状截面切片(厚度3mm)。然后，将该冠状截面切片，沿其中央线切断成右半球侧切片与左半球侧切片。接着，在室温下，将一方的半球侧切片在SCALE-A2试剂中浸渍、振荡48小时，以进行透明化处理。在室温下，还将另一方的半球侧切片在生物材料用透明化试剂U中浸渍、振荡48小时，以进行透明化处理。然后，从这些冠状截面切片上，切下含有海马区的厚1.5mm的冠状截面切片。将如此获得的冠状截面切片提供给观察步骤。
在此，所述SCALE-A2试剂是将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、10％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。所述生物材料用透明化试剂U是将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、30％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。
观察步骤中，用光谱仪(日立株式会社制造，产品名U-3310Spectro photometer)，测定了1.5mm厚的所述冠状截面切片在波长范围300nm～920nm下的透光光谱。
另外，作为参考例，还用再固定了的脑，制作了包含海马区的冠状截面切片(厚度3mm)，然后将该冠状截面切片沿其中央线切断成右半球侧切片与左半球侧切片，并在室温下，将一方的半球侧切片在PBS中浸渍、振荡48小时，从而制得了含有海马区的厚1.5mm的冠状截面切片。
观察的结果示于图1。图1中“U”表示的是用生物材料用透明化试剂U进行了处理的实施例的结果，“SCALE-A2”表示的是用SCALE-A2试剂进行了处理后的结果，“PBS”表示的是用PBS进行了处理的参考例的结果。如图1所示，虽然因波长的不同而结果不同，但与参考例相比，“U”及“SCALE-A2”表明了明显的透明化结果。
另外，虽然未显示数据，但SCALE-A2试剂、生物材料用透明化试剂U、PBS及水在300nm～920nm的波长范围下的透光光谱彼此几乎相同。
[实施例2：小鼠胎仔的透明化处理]
将表达Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)和Fucci-G1-RED(Fucci-G1)的转基因小鼠(日本理化学研究所脑科学综合研究中心的细胞功能探索技术开发小组所独自制造、繁殖的小鼠；参考文献：Sakaue-Sawano et al.,Cell,132(3):487-98,2008.)的胎生第11.5天、及胎生后第13.5天的胎仔，用4(v/w)％PFA-PBS固定2天后，将其浸渍到20(v/w)％蔗糖-PBS溶液中，暂时冷冻后又进行了解冻。然后，再次用4(v/w)％PFA-PBS固定了1小时。在此，所述转基因小鼠，是通过使表达了Fucci-S/G2/M的#504系列小鼠与表达了Fucci-G1的#596系列小鼠交配而得的。该转基因小鼠的处于细胞周期中“S/G2/M期”的细胞发出绿色荧光，处于“G1期”的细胞发出红色荧光。另外，#504系列与#596系列是所述参考文献中记载的小鼠，第三者也可获取。
然后，将这些胎仔浸渍到与实施例1相同的生物材料用透明化试剂U中3个月，以进行透明化处理。
而后，将所述胎仔封入琼脂糖凝胶(浓度0.5％(w/v)以下)中，利用共焦三维荧光显微镜(macro zoom LSCM(AZ-C1)，Nikon公司制造)，对所述胎仔照射给定的激励光来进行观察。另外，供进行拍摄的物镜(AZ-Plan Flour,N.A.＝0.2,W.D＝45mm)的倍数为2倍。
观察的结果示于图2。如图2所示，通过用本实施例的生物材料用透明化试剂进行透明化处理，小鼠胎仔的全身明显变得透明。其结果是，可检测构成胎仔的各部位的细胞的细胞周期状态，可制作全身的细胞周期映射三维图。另外，透明化处理的步骤中，实质上未引起小鼠胎仔的体积变化(膨润)。
[参考例1：透明化处理后的组织的恢复]
用GFP转基因小鼠及YFP转基因小鼠(GFP-M line及YFP-H line，由美国哈佛大学Josh Sanes教授提供)的海马区，制作了2.5mm厚的切片，先用SCALE-A2试剂(参照实施例1)进行了5天的透明化处理来实施透明化，然后用PBS冲洗3次而恢复成非透明状态的组织，并将恢复成非透明状态时的免疫染色性、与尚未用SCALE-A2试剂进行透明化处理前的免疫染色性进行了比较。
在此，所述SCALE-A2试剂与实施例1～2中所用的生物材料用试剂U同样，含有尿素来作为透明化处理活性成分。
免疫染色的步骤如下：将可对幼稚神经细胞表面上存在的PSA-NCAM的聚唾液酸进行识别的源自小鼠的抗PSA-NCAM(polysialilated neural cell adhesion molecule)单克隆抗体(Millipore公司制造)、以及在星形胶质细胞中可对特异性中间丝GFAP(glialfibrillary acidic protein，胶质原纤维酸性蛋白)进行识别的源自兔的抗GFAP多克隆抗体(Sigma公司制造)作为1次抗体，在4℃下反应24小时，然后用PBS进行冲洗；其后，使用被Alexa Fluor 546标记了的抗小鼠IgM抗体(Invitrogen，Molecular Probes公司制造)作为2次抗体，使其与抗PSA-NCAM单克隆抗体在室温下进行3小时的反应，还使用被Alexa Fluor633标记了的抗兔IgG抗体作为2次抗体(Invitrogen，Molecular Probes公司制造)，使其与GFAP多克隆抗体在室温下进行3小时的反应，由此进行了免疫组织染色。由于这些切片的荧光无衰减，因此获得了包括GFP和YFP的荧光在内的3重荧光影像。观察时，使用倒置式共焦激光显微镜(FV500，Olympus公司制造)，并用20倍物镜(UplanApo20，Olympus公司制造)来进行了观察。
如图3所示，无论是用SCALE-A2进行处理前(图中“SCALE处理前”所示的部分)还是处理后(图中“恢复后”所示的部分)，海马区齿状回中存在的幼稚神经细胞、以及自该细胞沿伸到CA3区域的苔状纤维均通过抗PSA-NCAM单克隆抗体而得以实质正常地染色。另外，星形胶质细胞也通过抗GFAP多克隆抗体而同样被正常地染色。
[实施例3：小鼠胎仔的透明化处理]
将与实施例2中使用的小鼠为相同种类的转基因小鼠的胎生第14.5天的胎仔，各自浸渍到PBS、生物材料用透明化试剂U、及SCALE-A2试剂中，并在室温下振荡7天来进行培养。在此，生物材料用透明化试剂U、及SCALE-A2试剂与实施例1中使用的相应试剂的组分相同。
将培养的结果示于图4。图4中的A是，在各溶液中于室温下振荡7天而培养的各胎仔的比较图。在用PBS进行处理方案中，胎仔几乎未得到透明化。而在用生物材料用透明化试剂U进行处理的方案中，胎仔除其肝脏以外，其他部分均得以了透明化，且可透视看到背景图案，其与用PBS进行处理的方案相比，体积几乎无变化。与此相比，在采用SCALE-A2试剂的方案中，稍发生了透明化，但与采用PBS的处理以及采用生物材料用透明化试剂U的处理相比，发生了膨润。
图4中的B是胎仔膨润程度的数值化图表。胎仔的体积测定均是通过以下步骤来进行的：在形状相同且相同尺寸的容器中预先加入一定量的溶液，然后将作为检体的胎仔逐个浸渍到该溶液中，用微量吸管计量了当胎仔浸渍到溶液中时所增加的液量，并将计量出的液量作为胎仔体积。将如此测定的体积作为初始值(Initial；在0天，将各胎仔浸渍到PBS中来测定)，在最初的体积测定结束后，立即将各胎仔浸渍到新的PBS、生物材料用透明化试剂U、以及SCALE-A2试剂中，并在经过了3天时的阶段，换成一定量的新溶液来浸渍胎仔，且在经过了7天时的阶段，再次换成一定量的新溶液来浸渍胎仔。如此，通过该方法测定了增加的体积。设初始值(Initial，0day)为100％，算出了各阶段下的体积相对于初始值的相对比值。对2只胎仔在各阶段溶液中浸渍时的所述相对比值，取了平均值。
自开始在各阶段的溶液中浸渍时起，至第7天时的体积变化情况分别如下：在使用PBS的方案中，变为了初始值(Initial)的98.0％；在使用SCALE-A2试剂的方案中，变为了初始值(Initial)的125.3％；在使用生物材料用透明化试剂U的方案中，变为初始值(Initial)的106.1％。即，发现与使用SCALE-A2试剂的方案相比，通过使用生物材料用透明化试剂U，胎生第14.5天的小鼠胎仔的体积变化率较小，且透明化也有所增强。
[实施例4：小鼠的大脑切片的透明化处理]
首先，使用4只8周龄的野生型C57BL6/J系列小鼠(从Japan SLC公司购入)，通过丙烯酸系树脂制的脑切片机(brain slicer，日本室町机械株式会社制造)，制作了厚3mm的包含海马区区域的切片。其中，在制作切片时，是以左右中心线的末尾部为基准位置，在自该基准位置起向大脑前侧3mm的位置上以横断两半球的方式来切断大脑的。在这4只小鼠大脑的大致相同的位置上切取了包含海马区区域的4片大脑切片后，以各大脑切片的中心线为基准将各大脑切片切割成了左右大致均等的8片切片。
然后，将所述8片切片中的3片切片各自浸渍到冰冷固定液、所述生物材料用透明化试剂U、生物材料用透明化试剂U1中，并在室温下振荡6天，由此进行了培养。这3片切片在浸渍处理前的大小几乎相同。所述冰冷固定液为4％多聚甲醛(PFA)-PBS。另外，生物材料用透明化试剂U1是将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、25％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。结果如图5的(a)所示。在此，为了容易比较，将左右切开的切片的图像中的、位于拍摄图像左侧的右半球图像反转，从而使两个半球的朝向相同。
另外，将所述8片切片中的2片切片各自浸渍到生物材料用透明化试剂U2及U3(参考例)中，并在室温下振荡6天，由此进行了培养。这2片切片是通过将1片大脑切片左右大致均等地切开而得的，它们在浸渍处理前的大小几乎相同。生物材料用透明化试剂U2是将6M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、25％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。生物材料用透明化试剂U3是将6M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、15％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。结果如图5的(b)的上半部分所示。
还将所述8片切片中的2片切片各自浸渍到生物材料用透明化试剂U4及U5(参考例)中，并在室温下振荡6天，由此进行了培养。这2片切片是通过将1片大脑切片左右大致均等地切开而得的，它们在浸渍处理前的大小几乎相同。生物材料用透明化试剂U4是将8M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、25％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。生物材料用透明化试剂U5是将8M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、15％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而得的水溶液。结果如图5的(b)的下半部分所示。
浸渍到生物材料用透明化试剂U、U1、U2、及U4中的切片均发生了透明化。在此需要说明的是，水分向被皮肤覆盖的胎仔小鼠全身的渗入是缓慢发生的，而切片与此不同，水分会在一段时期内从切断面多量地渗入。因此与胎仔小鼠全身相比，切片的膨润程度较大。在理解了这一事项的基础上，分别比较了生物材料用透明化试剂U2与U3、U4与U5，发现生物材料用透明化试剂U2及U4比生物材料用透明化试剂U3及U5更显著地抑制了切片的膨润。
本发明并不限于上述各实施方式及实施例，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，适当地组合不同实施方式中揭示的技术方案而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。
[产业上的可利用性]
本发明可提供一种将生物亲和性更高的成分用作有效成分的新颖的生物材料用透明化试剂、及其利用。

Claims (11)

1.一种生物材料的观察方法，其特征在于：
包括通过光学显微镜来观察被透明化的生物材料的步骤，
所述生物材料通过包含如下步骤的方法得以透明化：使生物材料用透明化试剂浸润到经单离的生物材料中，利用选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的作为有效成分的至少一种化合物使该生物材料透明化，
所述生物材料用透明化试剂的特征在于：其是含有浓度落在1M以上8.5M以下的范围内的所述化合物、以及浓度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范围内的甘油的溶液。
2.根据权利要求1所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂是含有尿素来作为所述化合物的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂是水溶液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂含有表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述表面活性剂是非离子性的表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述非离子性的表面活性剂是选自由TritonX(注册商标)、Tween(注册商标)、及NP-40(商品名)所组成的群中的至少一种。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂还含有水溶性的高分子化合物。
8.根据权利要求7所述的生物材料的观察方法，其特征在于：水溶性的所述高分子化合物是选自由Percoll(注册商标)、Ficoll(注册商标)、聚乙二醇、及聚乙烯吡咯烷酮所组成的群中的至少一种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂含有浓度落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范围内的甘油。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料用透明化试剂含有浓度落在3M以上5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内的所述表面活性剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的生物材料的观察方法，其特征在于：所述生物材料是来自多细胞动物的组织或器官、或除人类以外的多细胞动物。
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