JP6613552B2 - 超解像観察装置及び超解像観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。

光学系の解像限界を超えた解像度で標本を観察する超解像光学顕微鏡の一種に、誘導放出過程を利用したＳＴＥＤ（ＳＴＥＤ：Stimulated Emission Depletion）顕微鏡がある。

ＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の照射領域と誘導光（ＳＴＥＤ光）の照射領域とを標本上で部分的に重複させ、励起光の照射領域のうちＳＴＥＤ光の照射されていない領域で発生した蛍光のみを検出対象とすることで超解像を実現している。

特に、特許文献１に記載のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の単体に起因して生じた蛍光をＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた蛍光から分離して検出するために、励起光の強度を時間方向にかけて変調すると共に、標本で発生した蛍光のうち励起光と同じ周波数で変化する成分のみをロックイン検出している。これによって解像度を高く維持することができる。

因みに、特許文献１に記載のＳＴＥＤ顕微鏡のように、励起光の単体に起因して生じた蛍光をＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた蛍光から分離できる場合、ＳＴＥＤ光の光周波数に関する自由度が高まるという利点もある。例えば、ＳＴＥＤ光の光周波数を高めに設定することにより、誘導放出効率を維持しながらＳＴＥＤ光の照射強度を抑え、標本に含まれる細胞のダメージを軽減することもできる。

米国特許第８３９９８５７号明細書

本発明の目的は、ＳＴＥＤ顕微鏡の更なる性能向上にある。

本発明を例示する超解像観察装置は、物体に含まれる物質をｎ（ｎは２以上の整数）光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光し、励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明光学系と、前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部と、前記物体が発する蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部が検出する蛍光から前記変調の周波数のＮ（但し、Ｎは１〜ｎの整数）倍周波数で時間変化する第１〜第ｎ成分の各々を抽出することにより、前記光検出部が検出する蛍光から前記励起光の照射により生じる蛍光を抽出する検出部とを備える。

本発明を例示する超解像観察方法は、物体に含まれる物質をｎ（ｎは２以上の整数）光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光し、励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明手順と、前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調手順と、前記物体が発する蛍光を検出する光検出手順と、前記光検出手順により検出する蛍光から前記変調の周波数のＮ（但し、Ｎは１〜ｎの整数）倍周波数で時間変化する第１〜第ｎ成分の各々を抽出することにより、前記光検出手順により検出する蛍光から前記励起光の照射により生じる蛍光を抽出する検出手順とを備える。

本発明によれば、ＳＴＥＤ顕微鏡の更なる性能向上が可能である。

第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。 標本２０における励起光及びＳＴＥＤ光のＰＳＦを示す図である。 励起光源１１１から射出する励起光強度の時間変化波形、ＳＴＥＤ光源１１２から射出するＳＴＥＤ光強度の時間変化波形を説明する図である。 標本２０に入射する励起光強度の時間変化波形、標本２０に入射するＳＴＥＤ光強度の時間変化波形を説明する図である。 時間変化波形の別の例（パルス変調）を説明する図である。 時間変化波形の更に別の例（連続波）を説明する図である。 第３実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。 第３実施形態における励起光のＰＳＦ変調を説明する図である。 第４実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。 第４実施形態における励起光強度及びＳＴＥＤ光強度の時間変化波形を説明する図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態としてＳＴＥＤ顕微鏡を説明する。

図１は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。図１に示すとおりＳＴＥＤ顕微鏡には、励起光源１１１と、ＳＴＥＤ光源１１２と、レンズ１２１、１２２と、ミラーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５と、強度変調器１３１と、変調器駆動回路１３２と、位相板１４と、ダイクロイックミラー１５１、１５２と、光スキャナ１７と、１／４波長板１８と、対物レンズ１９と、標本２０と、フィルタ２１と、レンズ２２と、光検出器２３と、光路長調整機構２９と、制御装置３０と、パーソナルコンピュータなどの演算装置４０とが配置される。

このうち制御装置３０には、信号発生器（ＦＧ：Function Generator）２４、周波数混合器（ＭＩＸＥＲ）２５、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ：Band-Pass Filter）２６、ロックインアンプ（ＬＩＡ：Lock-In Amplifier）２７などが配置され、光スキャナ１７には、可動式の主走査ミラー１７１、可動式の副走査ミラー１７２などが配置され、光路長調整機構２９には、可動のミラーＭ２、Ｍ３などが配置される。以上のＳＴＥＤ顕微鏡における観察対象は、標本２０である。

標本２０は、例えば培養液と共に培養容器に収容された生体細胞であり、この生体細胞の特定の部位は蛍光物質（蛍光色素）で予め染色されている。この蛍光物質の電子を１光子吸収過程により励起準位へ励起するための励起光の光周波数をω_ｅｘ’とおくと、この蛍光物質の電子を２光子吸収過程（３次非線形光学効果の一種）により励起準位へ励起するための励起光の光周波数ω_ｅｘは、ω_ｅｘ＝ω_ｅｘ’／２で表される。光周波数ω_ｅｘを波長に換算すると、８００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲内の何れかの値、例えば１０６０ｎｍである。また、励起中の電子を誘導放出過程により基底準位へ移行させるための誘導光（後述するＳＴＥＤ光）の光周波数をω_ＳＴとおくと、光周波数ω_ＳＴは、蛍光物質から発せられる蛍光の光周波数帯域内の何れかの値であればよい。光周波数ω_ＳＴを波長に換算すると、例えば６６０ｎｍである。なお、光周波数ω_ｅｘ’、ω_ＳＴ、ω_ｅｘにはω_ｅｘ’＞ω_ＳＴ＞ω_ｅｘの関係が成り立つ。

以下、ＳＴＥＤ顕微鏡の基本動作を説明する。

先ず、励起光源１１１から射出した光（励起光）は、レンズ１２１により平行光束となり、強度変調器１３１を介してダイクロイックミラー１５１へ向かい、ダイクロイックミラー１５１を透過する。

一方、ＳＴＥＤ光源１１２から射出した光（ＳＴＥＤ光）は、レンズ１２２により平行光束となり、ミラーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４を順に反射してから位相板１４を通過し、ミラーＭ５を反射する。ミラーＭ５を反射したＳＴＥＤ光は、ダイクロイックミラー１５１を反射し、ダイクロイックミラー１５１を透過した励起光と合波（光路が統合）される。

合波された励起光及びＳＴＥＤ光は、ダイクロイックミラー１５２を透過した後、主走査ミラー１７１、副走査ミラー１７２を順に反射すると、１／４波長板１８を介して対物レンズ１９の瞳側へ入射する。瞳側から対物レンズ１９へ入射した励起光及びＳＴＥＤ光は、対物レンズ１９の先端から射出すると、標本２０において集光する。

標本２０に向かう励起光及びＳＴＥＤ光の偏光状態は、１／４波長板１８の通過により、直線偏光から円偏光へと変換されているので、標本２０における励起光及びＳＴＥＤ光のＰＳＦ（点像分布関数）からは偏光依存性が排除されている。よって、標本２０に励起光及びＳＴＥＤ光が形成する光スポットの状態は、光軸の周りに等方的（光軸に関して回転対称）である。なお、光スポットの詳細は、後述する。

標本２０の光スポットでは、蛍光が発生する。この蛍光は、先端側から対物レンズ１９へ入射すると、対物レンズ１９の瞳側から平行光束となって射出し、１／４波長板１８、副走査ミラー１７２、主走査ミラー１７１を順に介してダイクロイックミラー１５２へ入射する。

ダイクロイックミラー１５２へ入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１５２を反射すると、フィルタ２１、レンズ２２を順に介して光検出器２３へ入射し、光検出器２３において電気信号に変換される。なお、フィルタ２１には、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットし、かつ、蛍光と同じ波長帯域の光の大部分を透過するような特性が付与されている。

光検出器２３は、フォトダイオードや光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）などで構成され、入射した蛍光の強度に応じて電気信号を生成し、その電気信号を制御装置３０のロックインアンプ２７へ与える。

ロックインアンプ２７は、与えられた電気信号から必要な信号成分をロックイン検出（同期検波）すると、その信号成分を演算装置４０へ与える。なお、ロックイン検出の詳細は、後述する。

光スキャナ１７は、主走査ミラー１７１及び副走査ミラー１７２により光の進行方向を制御するガルバノメータスキャナなどの光スキャナである。制御装置３０から与えられる駆動信号に応じて光スキャナ１７が主走査ミラー１７１及び副走査ミラー１７２を適切なパターンで姿勢変化させると、対物レンズ１９の光軸と垂直な面方向にかけて光スポットが標本２０を二次元走査する。よって、二次元走査中にロックインアンプ２７が順次に検出した信号成分は、対物レンズ１９の焦点面における蛍光強度分布を表す。なお、光スキャナ１７１の配置先は、対物レンズ１９の瞳の近傍又は対物レンズ１９の瞳と共役な面の近傍である。

演算装置４０は、二次元走査中にロックインアンプ２７が検出した信号成分を適切に配列することで標本２０の蛍光画像を作成し、不図示のメモリへ格納すると共に、不図示の表示装置へ表示させる。

以下、ＳＴＥＤ顕微鏡の超解像原理を説明する。

先ず、ＳＴＥＤ光の単独光路に配置された位相板１４には、位相遅延量分布が付与されている。周方向に亘る位相板１４の位相遅延量分布は、周位置が１８０°ずつズレた２つの位置の間の位相差が「π」となるような分布である。この場合、励起光の単体が標本２０に形成する光スポット（励起光スポット）の形状は円形であるのに対して、ＳＴＥＤ光の単体が標本２０に形成する光スポット（ＳＴＥＤ光スポット）の形状は、輪帯状（ドーナツ状）となる。励起光スポットの中心と、ＳＴＥＤ光スポットの中心とは、何れも対物レンズ１９の光軸上にある。

ここで、円形の励起光スポット（図２の符号Ａ_ｅｘ）の輪郭と、ドーナツ状のＳＴＥＤ光スポット（図２の符号Ａ_ＳＴ）の内輪郭は、本来的には何れも対物レンズ１９の解像限界に相当するサイズとなるはずである。但し、ＳＴＥＤ顕微鏡では、ＳＴＥＤ光の強度を十分に高く設定することにより、ＳＴＥＤ光スポット（図２の符号Ａ_ＳＴ）における誘導放出を飽和させ、ＳＴＥＤ光スポット（図２の符号Ａ_ＳＴ）の内輪郭を励起光スポット（図２の符号Ａ_ｅｘ）の輪郭よりも実質的に狭める。そのために、例えばＳＴＥＤ光の単独光路に挿入された不図示のＮＤフィルタの透過率が高めに設定される。

この場合、標本２０における励起光のＰＳＦ及びＳＴＥＤ光のＰＳＦは、例えば図２に示すとおりになる。図２では、光軸と垂直なｘ方向に亘るＰＳＦ（一次元ＰＳＦ）のみを描いたが、光軸と垂直な別の方向に亘るＰＳＦも同様である。図２に示すとおりＳＴＥＤ光スポットＡ_ＳＴは、励起光スポットＡ_ｅｘに対して部分的に重複し、励起光スポットＡ_ｅｘのうちＳＴＥＤ光スポットＡ_ＳＴのピーク（図２における外側の２つのピーク）は、励起光スポットＡ_ｅｘの周縁部に位置する。

したがって、ＳＴＥＤ顕微鏡では、先ず、標本２０に励起光が照射されると、励起光スポットＡ_ｅｘに位置していた蛍光物質の電子が励起され（但し、励起確率は励起光スポットＡ_ｅｘの中央部ほど高い。）、続いて、蛍光寿命の経過前に標本２０にＳＴＥＤ光が照射されると、励起光スポットＡ_ｅｘの周縁部に近い励起中の電子は、光周波数ω_ＳＴの誘導放出光を発生させるのに対して、励起光スポットＡ_ｅｘの中央部に近い励起中の電子は、誘導放出光を発生させることなく、蛍光寿命の経過後に自然放出光（蛍光）を発生させる。

したがって、ＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光スポットＡ_ｅｘの周縁部では誘導放出の分だけ蛍光の発生が抑制されるのに対して、励起光スポットＡ_ｅｘの中央部では蛍光の発生が抑制されない。ＳＴＥＤ顕微鏡では、この蛍光を検出対象とすることで超解像効果を得る。

以下、本実施形態における励起光及びＳＴＥＤ光に必要な条件を説明する。

先ず、本実施形態における励起光の光周波数は、蛍光物質の電子を２光子励起するための光周波数ω_ｅｘに設定される。また、励起光は、励起光スポットＡ_ｅｘの中央部にて２光子励起確率が十分に高まるよう、パルス幅の狭いパルス光に設定される。そのために、励起光源１１１としては例えばフェムト秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源が使用される。励起光源１１１のパルス幅ΔＴ_ｅｘは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）に設定され、励起光源１１１の繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐは、例えば８０ＭＨｚに設定される。よって、横軸を時間、縦軸をパルス強度として、励起光源１１１から射出する励起光の波形を示したならば、例えば図３（ａ）に示すとおりとなる。

一方、ＳＴＥＤ光の光周波数は、励起中の電子を誘導放出するための光周波数ω_ＳＴに設定される。また、ＳＴＥＤ光は、誘導放出確率が適度に高まるよう、パルス幅の適度に狭いパルス光に設定される。そのために、ＳＴＥＤ光源１１２としてはピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源が使用される。ＳＴＥＤ光源１１２のパルス幅ΔＴ_ＳＴは、例えば数ｐｓ（ピコ秒）〜数百ｐｓ（ピコ秒）に設定され、ＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐは、励起光源１１１の繰り返し周波数と共通に設定される。よって、横軸を時間、縦軸をパルス強度として、ＳＴＥＤ光源１１２から射出するＳＴＥＤ光の波形を示したならば、例えば図３（ｂ）に示すとおりとなる。

ここで、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０に励起光のパルスが到達するタイミングよりも、標本２０にＳＴＥＤ光のパルスが到達するタイミングの方が、若干遅延していることが望ましい。このため、標本２０に向かう励起光の光路長と、標本２０に向かうＳＴＥＤ光の光路長との関係は、予め調整されていると仮定する。図１の光路長調整機構２９は、この調整を行うために設けられた機構である。光路長調整機構２９は、ＳＴＥＤ光の単独光路に配置されたミラーＭ２、Ｍ３を適切な方向へ移動させるステージなどで構成される。標本２０の観察前、ＳＴＥＤ顕微鏡のオペレータは、光路長調整機構２９によりＳＴＥＤ光の光路長を調整し、標本２０に励起光のパルスが到達するタイミングから標本２０にＳＴＥＤ光のパルスが到達するタイミングまでの時間（ディレイ時間Δ）を調整する。

図３（ｃ）は、ディレイ時間Δを説明する図である。図３（ｃ）においてパルス幅の狭い方が励起光パルスを示しており、図３（ｃ）ではパルス幅の広い方がＳＴＥＤ光パルスを示している。図３（ｃ）に示すとおり標本２０に励起光パルスが到達するタイミングからＳＴＥＤ光パルスが到達するイミングまでのディレイ時間Δは、蛍光物質の蛍光寿命より短く、かつ、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとが時間的に重複しない範囲内で最も短い時間に設定される。なお、ディレイ時間Δの調整方法の詳細は、後述する。

以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡におけるロックイン検出の原理を説明する。

図１に示した光検出器２３には、励起光の単体に起因して生じた「必要な蛍光」だけでなく、ＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた「余分な蛍光」も混入している。この余分な蛍光を必要な蛍光から分離するために、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光とＳＴＥＤ光とのうち励起光のみを、変調周波数ｆ_ｍで時間方向にかけて強度変調する。よって、必要な蛍光は時間変化するのに対して、余分な蛍光は時間変化しない。このうち必要な蛍光の時間変化を、数式で説明する。

先ず、励起光の変調周波数をｆ_ｍとおき、励起光の強度平均値をＩ_０とおき、時間をｔとおくと、励起光強度の時間変化波形Ｉ_ｅｘは、以下の式（１）で表される。

また、比例係数をαとおくと、励起光の単体に起因して生じた必要な蛍光、すなわち、励起光による２光子吸収過程で発生する蛍光の強度Ｉ_ＴＰＦは、以下の式（２）で表される。

この式（２）の右辺を見ると、励起光の単体に起因して生じた必要な蛍光には、時間変化しないＤＣ成分（第１項）と、励起光の変調周波数ｆ_ｍと同じ周波数で時間変化する成分（第２項）と、励起光の変調周波数ｆ_ｍの２倍周波数で時間変化する成分（第３項）とが含まれていることがわかる。

一方、数式では示さなかったが、ＳＴＥＤ光は変調されないので、ＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた余分な蛍光には、ＤＣ成分しか含まれない。

したがって、２光子吸収過程を利用した本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光検出器２３の生成する電気信号のうち、時間変化しないＤＣ成分には、必要な蛍光と余分な蛍光との双方が反映されるが、周波数ｆ_ｍ又は２ｆ_ｍで変化する成分には、必要な蛍光と余分な蛍光とのうち前者のみが反映される。

そこで、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光検出器２３の生成する電気信号から、周波数ｆ_ｍで変化する成分と、周波数２ｆ_ｍで変化する成分とを、ロックイン検出する。これによって、余分な蛍光を検出対象から外すことができる。

以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡におけるロックイン検出の動作を説明する。

図１に示した信号発生器２４、変調器駆動回路１３２、強度変調器１３１、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、ロックインアンプ２７は、ロックイン検出のために搭載された要素である。

信号発生器２４は、励起光の変調周波数ｆ_ｍと同じ周波数で時間変化するリファレンス信号を、変調器駆動回路１３２、周波数混合器２５、ロックインアンプ２７の各々へ与える。但し、信号発生器２４は、周波数混合器２５に対しては、周波数ｆ_ｍで時間変化する２つのリファレンス信号を並行して与える。

変調周波数ｆ_ｍは、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐより低く、ｆ_ｍ≦ｆ_ｒｅｐ／２である。また、変調周波数ｆ_ｍは、ノイズの１／ｆ特性と系の検出感度とを考慮して適切な値に設定されることが望ましく、例えば数ＭＨｚ程度に設定される。

変調器駆動回路１３２は、リファレンス信号ｆ_ｍと同じ周波数で時間変化する駆動信号を、励起光の単独光路へ配置された強度変調器１３１へ与える。

強度変調器１３１は、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-Optic Modulator）などの光強度変調器であり、与えられた駆動信号に応じて励起光の強度を時間方向にかけて変調周波数ｆ_ｍで変調する。よって、強度変調器１３１から射出する励起光の強度は、例えば図４（ａ）に示すとおりに時間変化する。ここでは、図４（ａ）に点線で示すとおり励起光強度の変調波形を正弦波形と仮定する。

図１に示す周波数混合器２５は、周波数ｆ_ｍで時間変化する２つのリファレンス信号をミキシングすることにより、周波数２ｆ_ｍで時間変化する電気信号と、周波数ゼロで時間変化する電気信号とを生成し、それら２つの電気信号をバンドパスフィルタ２６へ与える。

バンドパスフィルタ２６は、電気的バンドパスフィルタであって、周波数２ｆ_ｍで時間変化する電気信号と、周波数ゼロで時間変化する電気信号とのうち、周波数２ｆ_ｍで時間変化する電気信号のみを選択してロックインアンプ２７へ与える。

したがって、ロックインアンプ２７には、周波数２ｆ_ｍで時間変化するリファレンス信号と、周波数ｆ_ｍで時間変化するリファレンス信号とが並行して与えられる。以下、周波数ｆ_ｍで時間変化するリファレンス信号を「第１リファレンス信号」と称し、周波数２ｆ_ｍで時間変化するリファレンス信号を「第２リファレンス信号」と称す。

ロックインアンプ２７は、光検出器２３の出力する電気信号から、第１リファレンス信号と同じ周波数（＝ｆ_ｍ）で時間変化する成分（以下、「第１信号成分」と称す。）をロックイン検出して演算装置４０へ与えると共に、光検出器２３の出力する電気信号から、第２リファレンス信号と同じ周波数（＝２ｆ_ｍ）で時間変化する成分（以下、「第２信号成分」と称す。）をロックイン検出して演算装置４０へ与える。

このうち、第１信号成分には、光検出器２３へ入射した蛍光のうち、励起光の変調周波数（＝ｆ_ｍ）と同じ周波数で時間変化する成分（式（２）の第２項）が反映され、時間変化しない成分は反映されない。つまり、第１信号成分には、必要な蛍光が反映され、余分な蛍光は反映されない。

また、第２信号成分には、光検出器２３へ入射した蛍光のうち、励起光の変調周波数（＝ｆ_ｍ）の２倍周波数で時間変化する成分（式（２）の第３項）が反映され、時間変化しない成分は反映されない。つまり、第２信号成分には、必要な蛍光が反映され、余分な蛍光は反映されない。

そして、図１の演算装置４０は、ロックインアンプ２７から並行して与えられる第１信号成分と第２信号成分との和又は平均を信号成分として求め、その信号成分により標本２０の蛍光画像を作成する。このように、演算装置４０が第１信号成分と第２信号成分との和又は平均をとれば、蛍光画像のＳＮ比が高まる。

以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡の効果を説明する。

本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、蛍光物質の電子の励起に２光子吸収過程を利用するので、検出対象である蛍光の発光元を、光スポット中央の極めて狭い領域のみに制限することができる。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、１光子吸収過程を利用する場合よりも、高い超解像効果を得ることができる。

また、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、２光子吸収過程を利用するので、検出対象である蛍光は、対物レンズ１９の焦点面近傍のみにおいて発生する。よって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、蛍光の発生元を光軸方向にかけても狭めることができる。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０の深部の蛍光画像を高コントラストで取得することができる。また、標本２０のうち対物レンズ１９の焦点面から外れた面の退色を避けることもできる。

また、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の変調周波数と同じ周波数で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数で変化する第２信号成分との双方をロックイン検出するので、余分な蛍光の影響を受けずに、必要な蛍光を漏れなく検知することができる。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、蛍光画像を高画質に取得することができる。
［第１実施形態の補足］
なお、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光強度の変調波形を図４に示すとおり正弦波形としたが、図５に示すとおり矩形波としてもよい。

また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、ＳＴＥＤ光をパルス光としたが、ＳＴＥＤ光を連続光としてもよい。その場合、例えば、ＳＴＥＤ光源１１２としてパルスレーザ光源の代わりに連続発振レーザ光源を使用すればよい。

因みに、励起光をパルス光、ＳＴＥＤ光を連続光とし、かつ、励起光の強度を正弦波で変調した場合は、図６に示すとおりとなる。

また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光路長調整機構２９の設け先をＳＴＥＤ光の単独光路としたが、励起光の単独光路であってもよいし、励起光の単独光路とＳＴＥＤ光の単独光路との双方であってもよい。

また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡において、ＳＴＥＤ光をパルス光とした場合、ディレイ時間Δの調整が必要となるが、ＳＴＥＤ光を連続光とした場合は、ディレイ時間の調整は不要なので、光路長調整機構２９を省略することが可能である。

また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光の強度を時間方向に変調するための強度変調器１３１としてＡＯＭを使用した。以下、強度変調器１３１として使用されるＡＯＭを詳しく説明する。

ＡＯＭは、超音波の媒質と、媒質を振動させる圧電素子とを備え、圧電素子は、印加電圧（駆動信号）に応じて媒質を振動させることにより、媒質内に超音波を発生させる。媒質内に超音波が発生すると、媒質内に格子状の屈折率分布が生じ、回折格子としての機能がＡＯＭへ付与される。例えば、超音波の周波数がＭＨｚオーダーに設定されると、ＡＯＭではブラック回折が支配的となり、ＡＯＭへ入射した励起光は、主に０次回折光及び１次回折光の２種類に分岐される。標本２０へ導光される励起光は、０次回折光及び１次回折光のうち、１次回折光のみである。ＡＯＭに与えられる駆動信号の振幅が時間方向にかけて変調周波数ｆ_ｍで変調されると、１次回折光の強度が時間方向にかけて変調周波数ｆ_ｍで変調される。このように、標本２０へ導光される励起光として１次回折光を選択すれば、０次回折光を選択した場合と比べて励起光の強度変調のコントラストを高くすることができる。

なお、ＡＯＭを通過する励起光には分散が発生し、励起光のパルス幅が広がる傾向にあるので、ＡＯＭを使用する場合は、この分散を補償するための逆の分散が、ＡＯＭへ入射する前の励起光に対して予め付与されることが望ましい。逆の分散を励起光に付与する光学素子としては、例えば、１対のプリズムやチャープミラーなどを使用することができる。

また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、強度変調器１３１として例えばＡＯＭを使用したが、例えばＥＯＭ（ＥＯＭ：Electro-Optic Modulator）及び偏光子の組み合わせを使用したり、機械的なチョッパーを使用したりすることもできる。因みに、ＥＯＭと偏光子との組み合わせによると、光の偏光と位相との組み合わせが可変なので、所望の変調波形による光の強度変調が実現する。
［第２実施形態］
以下、第１実施形態におけるディレイ時間Δ（図３（ｃ）参照）の調整方法を、第２実施形態として説明する。

前述したとおり励起光のパルス幅ΔＴ_ｅｘはおよそ数百ｆｓに設定され、ＳＴＥＤ光のパルス幅ΔＴ_ＳＴは数ｐｓ〜数百ｐｓに設定される。そして、両者のディレイ時間Δは、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとが時間的に重複しない範囲内でなるべく短いことが望ましい。

なぜなら、励起光とＳＴＥＤ光とが標本２０へ同時に照射されている期間が存在しなければ、励起光とＳＴＥＤ光との同時照射による非線形相互作用の発生を回避することができるので、余分なノイズ光となる和周波光や４光波混合光の発生を回避することができるからである。また、励起光とＳＴＥＤ光とが標本２０へ同時に照射されている期間が存在しなければ、励起光とＳＴＥＤ光との同時照射による標本２０のダメージを回避することもできる。

そこで、本実施形態では、ディレイ時間Δの調整を以下の手順（１）〜（３）で行う。

（１）標本２０の位置をシフトさせ、標本２０における蛍光物質の分布領域を対物レンズ１９の焦点面から外す。このとき、対物レンズ１９の焦点面には例えば標本２０のカバーガラスのみが存在する。

（２）フィルタ２１の代わりに校正用フィルタを配置する。校正用フィルタには、４光波混合光と同じ波長の光を透過し、かつ、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットするような特性が付与される。この状態で光検出器２３に入射できる光は、基本的に４光波混合光のみとなる。因みに、励起光の波長をλ_ｅｘ＝１０６０ｎｍとおき、ＳＴＥＤ光の波長をλ_ＳＴ＝６６０ｎｍとおくと、４光波混合光の波長λ_ＦＷＭは、式（３）のとおり表される。

（３）光検出器２３の出力する電気信号の振幅を監視しながら、ＳＴＥＤ光の光路長が延長される方向へと光路長調整機構２９を移動させ、電気信号の振幅が最大となった後、さらに光路長調整機構２９を同じ方向に移動させ、電気信号のレベルがノイズレベルまで低下した時点で、光路長調整機構２９の移動を終了する。この時点で、ディレイ時間Δは最適値となる（以上、手順（３））。
［第２実施形態の補足］
なお、第２実施形態では、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとの時間的重複を検知するために、４光波混合光の発生の有無を検知したが、和周波光の発生の有無を検知してもよい。その場合、校正用フィルタには、和周波光と同じ波長の光を透過し、かつ、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットするような特性が付与される。因みに、励起光の波長をλ_ｅｘ＝１０６０ｎｍとおき、ＳＴＥＤ光の波長をλ_ＳＴ＝６６０ｎｍとおくと、和周波光の波長λ_ＳＨＧは、およそ４０７ｎｍとなる。

また、第２実施形態では、手順（１）〜（３）の一部又は全部をオペレータが手動で行ってもよいし、ＳＴＥＤ顕微鏡が自動で行ってもよい。

また、第２実施形態では、手順（１）、（２）の実行順序は、反対であってもよい。
［第３実施形態］
以下、第１実施形態の変形例として第３実施形態を説明する。

ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。第１実施形態では、励起光の特性のうち「強度」を変調対象としたが、本実施形態では、励起光のＰＳＦを変調対象とする。

図７は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡（図１）との相違点は、強度変調器１３１の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）５０が備えられた点にある。

空間光変調器５０は、変調器駆動回路１３２から与えられる駆動信号に応じて、通過光束の位相遅延量分布を時間変化させる位相板であり、例えば液晶などで構成される。

空間光変調器５０の配置先は、強度変調器１３１と同様に励起光の単独光路であるが、不図示のリレーレンズによって対物レンズ１９の瞳とほぼ共役に結ばれている必要がある。つまり、空間光変調器５０の配置先は、瞳共役面又はその近傍である。

空間光変調器５０の位相遅延量分布は、図８（ａ）に示す第１状態と、図８（ｂ）に示す第２状態との間で切り換わる。この切り換え（スイッチング）の周波数は、第１実施形態の変調周波数ｆ_ｍと同じである。

図８（ａ）に示す第１状態は、瞳共役面の全体に亘って位相遅延量が一様（位相遅延量がゼロ）な状態である。

図８（ｂ）に示す第２状態は、光軸を含む平面で瞳共役面を分割してなる一方の領域の位相遅延量と他方の領域の位相遅延量との差が「π」となった状態である。

空間光変調器５０の位相遅延量分布が第１状態（図８（ａ））であるときには、標本２０における励起光のＰＳＦは、図８（ａ’）に示すとおり、光軸上にピークを有した「通常のＰＳＦ」となる。

空間光変調器５０の位相遅延量分布が第２状態（図８（ｂ））であるときには、標本２０における励起光のＰＳＦは、図８（ｂ’）に示すとおり、光軸に関して対称な２つの位置にピークを有した「ふた山形状のＰＳＦ」となる。

一方、標本２０におけるＳＴＥＤ光のＰＳＦは、図８（ａ”）、（ｂ”）で示すとおり時間変化しない。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡において、励起光及びＳＴＥＤ光からなる光スポットの中央（光軸近傍）に着目すると、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様、ＳＴＥＤ光の強度は時間変化しないのに対して励起光の強度のみが周波数ｆ_ｍで時間変化することがわかる。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡も第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。
［第３実施形態の補足］
なお、第３実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、空間光変調器５０の位相遅延量分布を第１状態と第２状態との２状態の間で離散的に変化させた（すなわち励起光ＰＳＦの変調波形をパルス波形に設定した）が、空間光変調器５０の位相遅延量分布を第１状態と第２状態との間で連続的に変化させても（励起光ＰＳＦの変調波形を例えば正弦波形に設定しても）よい。

また、第３実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０に向かう励起光のＰＳＦを変調対象としたが、標本２０に向かう励起光の他の特性（例えば、位相、偏光状態、波長など）を変調対象としてもよい。

例えば、標本２０に向かう励起光の波長を時間方向にかけて変調すれば、標本２０に向かう励起光の強度を時間方向にかけて変調した場合と同様の効果が期待できる。

また、例えば、標本２０に向かう励起光の偏光方位を時間方向にかけて変調すると共に、変調された励起光の光路のうち標本２０の上流側に検光子を配置したならば、標本２０に向かう励起光の強度を時間方向にかけて変調した場合と同様の効果が期待できる。
［第４実施形態］
以下、第１実施形態の変形例として第４実施形態を説明する。

ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。

図９は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡（図１）との主な相違点は、強度変調器１３１、変調器駆動回路１３２、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６の代わりに、信号発生器を内蔵したコントローラ３１が備えられた点にある。ここでは、コントローラ３１を制御装置３０の一部とする。

コントローラ３１は、励起光源１１１の繰り返し周波数ｆ_{ｒｅｐｅｘ}と、ＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数ｆ_{ｒｅｐＳＴ}とを個別に制御し、繰り返し周波数ｆ_{ｒｅｐｅｘ}、ｆ_{ｒｅｐＳＴ}の間に差異を設ける。繰り返し周波数ｆ_{ｒｅｐｅｘ}は、第１実施形態の変調周波数ｆ_ｍの１／Ｍ倍（Ｍは２以上の整数）に設定され、繰り返し周波数ｆ_{ｒｅｐＳＴ}は、第１実施形態の変調周波数ｆ_ｍと同じに設定される。ここでは、ｆ_{ｒｅｐｅｘ}＝ｆ_ｍ／２、ｆ_{ｒｅｐＳＴ}＝ｆ_ｍに設定されたと仮定する。

この場合、標本２０に照射される励起光強度の時間変化波形、標本２０に照射されるＳＴＥＤ光強度の時間変化波形は、図１０に示すとおりとなる。

ここで、図１０の上段に示すとおり、本実施形態における励起光の波形は、繰り返し周波数ｆ_ｍ／２の単純なパルス波形であるが、このような励起光の波形は、「繰り返し周波数ｆ_ｍのパルス光の強度を、周波数ｆ_ｍ／２の矩形波で変調した場合」と同様の波形である。

よって、図１０の上段及び下段に示すとおり、本実施形態における励起光及びＳＴＥＤ光の波形は、「励起光とＳＴＥＤ光との双方を繰り返し周波数ｆ_ｍのパルス光とし、かつ、励起光のみの強度を、周波数ｆ_ｍ／２の矩形波で変調した場合」と同様の波形である。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡でも第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の現象が標本２０で発生する。

なお、本実施形態のコントローラ３１は、周波数ｆ_ｍ／２で時間変化する第１リファレンス信号と、周波数ｆ_ｍで時間変化する第２リファレンス信号とを、ロックインアンプ２７へ並行して与える。

また、本実施形態のロックインアンプ２７は、与えられた第１リファレンス信号及び第２リファレンス信号に応じて、第１実施形態のロックインアンプ２７と同様に第１信号成分及び第２信号成分をロックイン検出する。

したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、強度変調器１３１を使用しないにもかかわらず、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。

しかも、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、強度変調器１３１を使用しない（ＡＯＭを使用しない）ので、ＡＯＭの通過により励起光に発生する分散の問題、ひいては励起光のパルス幅に発生する拡がりの問題を、回避することもできる。
［第５実施形態］
以下、第４実施形態における励起光源１１１及びＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数の制御方法を、第５実施形態として詳しく説明する。

先ず、励起光源１１１、ＳＴＥＤ光源１１２の各々のパルス発生原理が、連続発振レーザ光源による直接変調法である場合、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐの制御は、連続発振レーザを駆動するための電気信号の周波数の制御により行うことができる。したがって、コントローラ３１は、電気信号の周波数を制御することで、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐを制御することができる。

一方、励起光源１１１、ＳＴＥＤ光源１１２の各々のパルス発生原理が、レーザ共振器によるモード同期法である場合、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐの制御は、レーザ共振器の共振器長Ｌの調整により行うことが可能である。したがって、コントローラ３１は、共振器長Ｌを制御することで、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐを制御することができる。

因みに、光速をｃとおくと、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐと、共振器長Ｌとは、以下の式（４）で表される。

したがって、共振器長Ｌにより繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐを制御することができることは明らかである。

なお、共振器長Ｌを制御可能とするためには、レーザ共振器の中に電気光学変調器（ＥＯＭ：Electro-Optic Modulator）を挿入しておけばよい。ＥＯＭは、例えばニオブ酸リチウム、あるいはＫＴＰ結晶等の基板に電圧印加用の電極を設けた素子であり、与えられた電圧に応じて結晶の屈折率を変化させる。結晶の厚みをｄとおき、結晶の屈折率をｎとおくと、結晶を透過する光の光路長はｎｄで表されるので、結晶の屈折率ｎを制御することで共振器長Ｌを制御することができる。よって、コントローラ３１は、ＥＯＭに与える電圧を制御することで、繰り返し周波数ｆ_ｒｅｐを制御することができる。
［各実施形態の補足］
上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、励起光の変調周波数の１倍周波数（＝ｆ_ｍ）で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数（＝２ｆ_ｍ）で時間変化する第２信号成分との双方としたが、蛍光画像の画質向上よりも演算負荷軽減を重視するのであれば、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、第１信号成分と第２信号成分との一方のみとしてもよい。

因みに、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第１信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７に与えられるリファレンス信号は、周波数ｆ_ｍで時間変化する第１リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第１信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。

また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第２信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数２ｆ_ｍで時間変化する第２リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第２信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、第１信号成分及び第２信号成分の双方をロックイン検出するモードと、第１信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分のみをロックイン検出するモードとのうち、少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、２光子吸収過程を利用したが、３光子吸収過程を利用してもよい。３光子吸収過程を利用する場合、励起光の光周波数ω_ｅｘは、ω_ｅｘ＝ω_ｅｘ’／３に設定される。

また、３光子吸収過程を利用する場合、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象は、励起光の変調周波数と同じ周波数（＝ｆ_ｍ）で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数（＝２ｆ_ｍ）で変化する第２信号成分と、励起光の変調周波数の３倍周波数（＝３ｆ_ｍ）で変化する第３信号成分とのうち、少なくとも１つとされる。

例えば、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、第３信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数３ｆ_ｍで時間変化する第３リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第３信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。

また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第２信号成分及び第３信号成分の２つとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数２ｆ_ｍで時間変化する第２リファレンス信号と、周波数３ｆ_ｍで時間変化する第３リファレンス信号との２つとなり、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第２信号成分及び第３信号成分の和又は平均をとることにより、蛍光画像の高画質化を図ればよい。

また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の３つとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数ｆ_ｍで時間変化する第１リファレンス信号と、周波数２ｆ_ｍで時間変化する第２リファレンス信号と、周波数３ｆ_ｍで時間変化する第３リファレンス信号との３つとなり、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の和又は平均をとることにより、蛍光画像の高画質化を図ればよい。

また、３光子吸収過程を利用する場合、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の３つをロックイン検出するモードと、第１信号成分及び第２信号成分のみをロックイン検出するモードと、第１信号成分及び第３信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分及び第３信号成分のみをロックイン検出するモードと、第１信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分のみをロックイン検出するモードと、第３信号成分のみをロックイン検出するモードとのうち、少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。

要するに、Ｍ光子吸収過程を利用する場合（Ｍは２以上の整数）、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の光周波数ω_ｅｘをω_ｅｘ＝ω_ｅｘ’／Ｍに設定し、第１信号成分〜第Ｍ信号成分のうち少なくとも１つをロックイン検出し、検出した１又は複数の信号成分で蛍光画像を作成すればよい。但し、ここでいう「第Ｍ信号成分」とは、周波数Ｍｆ_ｍで変化する成分のことである。

また、Ｍ光子吸収過程を利用する場合（Ｍは２以上の整数）、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、ロックイン検出の対象の異なる少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。但し、２つのモードの各々におけるロックイン検出の対象は、第１信号成分〜第Ｍ信号成分のうち１又は複数の信号成分である。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、複数の信号成分を並行してロックイン検出するために、１台のロックインアンプ２７を使用したが、複数台のロックインアンプを使用してもよい。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光及びＳＴＥＤ光を生成するために２台のレーザ光源を使用したが、１台のレーザ光源と１台の光パラメトリック発振器との組み合わせ、或いは、１台のレーザ光源と２台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０を光スポットで走査する手法として、光スキャナ１７によるスキャン（光スキャン）を採用したが、不図示の標本ステージによるスキャン（ステージスキャン）を採用してもよい。ステージスキャンは、光軸と垂直なｘｙ方向に標本２０を移動させることによって行われる。因みに、光スキャンの方がステージスキャンよりもスキャンの高速化が容易である。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０へ同時に形成される光スポットの個数を単数としたが、複数としてもよい。光スポットの個数を複数化すれば、標本２０をスキャンするのに要する時間を短縮することができる。

また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、標本２０の照明タイプとして落射型を採用したが、透過型を採用してもよいことは言うまでもない。
［各実施形態のまとめ］
上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、物体（標本２０）に含まれる物質（蛍光物質）を多光子励起するための励起光を物体（標本２０）に向けて集光すると共に、励起中の前記物質（蛍光物質）を誘導放出するための誘導光（ＳＴＥＤ光）を、励起光の集光領域（励起光スポットＡ_ｅｘ）と部分的に重複する領域（ＳＴＥＤ光スポットＡ_ＳＴ）に向けて集光する照明光学系（レンズ１２１、１２２、位相板１４、ダイクロイックミラー１５１、１／４波長板１８、対物レンズ１９）と、物体（標本２０）へ向かう励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部（強度変調器１３１、変調器駆動回路１３２、空間光変調器５０、コントローラ３１）と、励起光及び誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（光スポット）に存在する物質（標本２０）が自然放出した蛍光のうち、変調の周波数（ｆ_ｍ）のＮ倍周波数（Ｎ×ｆ_ｍ）で時間変化する成分（信号成分）を検出する検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）とを備える（但し、Ｎは１以上の整数）。

また、多光子励起は、２光子励起であり、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数（ｆ_ｍ）の１倍周波数（ｆ_ｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆ_ｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）とのうち、少なくとも１つを検出する。

また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数（ｆ_ｍ）の１倍周波数（ｆ_ｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆ_ｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）との各々を検出する。

また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、第１成分（第１信号成分）と第２成分（第２信号成分）との和又は平均を求める。

また、多光子励起は、３光子励起であり、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数の１倍周波数（ｆ_ｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆ_ｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）と、変調の周波数の３倍周波数（３ｆ_ｍ）で時間変化する第３成分（第３信号成分）とのうち、少なくとも１つを検出する。

また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数の１倍周波数（ｆ_ｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆ_ｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）と、変調の周波数の３倍周波数（３ｆ_ｍ）で時間変化する第３成分（第３信号成分）との各々を検出する。

また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、第１成分（第１信号成分）と第２成分（第２信号成分）と第３成分（第３信号成分）との和又は平均を求める。

また、励起光の前記特性は、励起光の強度である。或いは、前記変調部は、前記励起光のＰＳＦを変化させることにより、前記励起光の強度を変調する。

また、物体（標本２０）に照射される励起光は、パルス光であり、物体（標本２０）に照射される誘導光（ＳＴＥＤ光）は、パルス光である。

また、物体（標本２０）に照射される励起光のパルスと誘導光（ＳＴＥＤ光）のパルスとの間には、互いのパルスが時間的に重複しないようディレイ時間（Δ）が設けられている。

また、ディレイ時間は、物質（蛍光物質）の蛍光寿命よりも短く設定される。

また、励起光の集光領域（励起光スポットＡ_ｅｘ）の形状は、円形であり、誘導光の集光領域（ＳＴＥＤ光スポットＡ_ＳＴ）の形状は、輪帯状であり、励起光の集光領域（励起光スポットＡ_ｅｘ）の中心と誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（ＳＴＥＤ光スポットＡ_ＳＴ）の中心とは一致する。

また、上述した実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光及び誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（光スポット）で物体（標本２０）を走査する走査部（光スキャナ１７、標本ステージ）を更に備える。
［その他の補足］
上述した各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１１１…励起光源、１１２…ＳＴＥＤ光源、１２１、１２２…レンズ、Ｍ１〜Ｍ５…ミラー、１３１…強度変調器、１３２…変調器駆動回路、１４…位相板、１５１、１５２…ダイクロイックミラー、１７…光スキャナ、１８…１／４波長板、１９…対物レンズ、２０…標本、２１…フィルタ、２２…レンズ、２３…光検出器、２９…光路長調整機構、３０…制御装置、４０…演算装置、５０…空間光変調器、３１…コントローラ

Claims (12)

1. 物体に含まれる物質をｎ（ｎは２以上の整数）光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光し、
   励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明光学系と、
   前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部と、
   前記物体が発する蛍光を検出する光検出部と、
   前記光検出部が検出する蛍光から前記変調の周波数のＮ（但し、Ｎは１〜ｎの整数）倍周波数で時間変化する第１〜第ｎ成分の各々を抽出することにより、前記光検出部が検出する蛍光から前記励起光の照射により生じる蛍光を抽出する検出部と、
   を備える超解像観察装置。
2. 請求項１に記載の超解像観察装置において、
   前記検出部は、
   前記第１成分〜前記第ｎ成分の和又は平均を求める
   超解像観察装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記特性は、前記励起光の強度である
   超解像観察装置。
4. 請求項３に記載の超解像観察装置において、
   前記変調部は、前記励起光のＰＳＦを変化させることにより、前記励起光の強度を変調する
   超解像観察装置。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
   前記物体に照射される前記励起光は、パルス光であり、
   前記物体に照射される前記誘導光は、パルス光である
   超解像観察装置。
6. 請求項５に記載の超解像観察装置において、
   前記励起光のパルス光の繰り返し周波数と、前記誘導光のパルス光の繰り返し周波数とは同じである
   超解像観察装置。
7. 請求項５又は請求項６に記載の超解像観察装置において、
   前記変調の周波数は、前記励起光のパルス光の繰り返し周波数の１／２以下である
   超解像観察装置。
8. 請求項５〜請求項７の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
   前記物体に照射される前記励起光のパルスと前記誘導光のパルスとの間には、互いのパルスが時間的に重複しないようディレイ時間が設けられている
   超解像観察装置。
9. 請求項５〜請求項８の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
   前記ディレイ時間は、前記物質の蛍光寿命よりも短く設定される
   超解像観察装置。
10. 請求項１〜請求項９の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
    前記励起光の集光領域の形状は、円形であり、
    前記誘導光の集光領域の形状は、輪帯状であり、
    前記励起光の集光領域の中心と前記誘導光の集光領域の中心とは一致する
    超解像観察装置。
11. 請求項１〜請求項１０の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
    前記励起光及び前記誘導光の集光領域で前記物体を走査する走査部を更に備える
    超解像観察装置。
12. 物体に含まれる物質をｎ（ｎは２以上の整数）光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光し、
    励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明手順と、
    前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調手順と、
    前記物体が発する蛍光を検出する光検出手順と、
    前記光検出手順により検出する蛍光から前記変調の周波数のＮ（但し、Ｎは１〜ｎの整数）倍周波数で時間変化する第１〜第ｎ成分の各々を抽出することにより、前記光検出手順により検出する蛍光から前記励起光の照射により生じる蛍光を抽出する検出手順と、
    を備える超解像観察方法。

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