CN110596096A - 透明化试剂及其在生物组织材料光学成像中的应用、活体皮肤组织透明化成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了透明化试剂及其在生物组织材料光学成像中的应用、活体皮肤组织透明化成像方法。透明化试剂为甘露糖、甘露糖与1,3‑二甲基‑2‑咪唑啉酮溶于溶剂中形成的混合物。透明化试剂可以在生物组织材料光学成像中的应用。活体皮肤组织透明化成像方法包括：剔除表面毛发清洁并干燥；将皮肤组织固定并置于光学成像系统焦面处；向成像位置的皮肤组织滴加透明化试剂，静置5‑30min；成像；在成像结束后，将透明化试剂擦除，用生理盐水或磷酸盐缓冲液反复擦洗清理皮肤组织表面，使皮肤组织恢复原始状态。本发明的试剂使用时不会产生明显的组织膨胀或组织皱缩、生物材料细节结构可完整保存、透明化时间短、透明化能力高，可应用到生物组织材料光学成像中。

Description

透明化试剂及其在生物组织材料光学成像中的应用、活体皮 肤组织透明化成像方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种用于生物组织的透明化试剂及透明化试剂在生物组织材料光学成像中的应用、应用方法。

背景技术

皮肤具有许多重要功能，如组织营养供应，体温调节和新陈代谢。其中，确保组织营养是最重要的功能，皮肤功能受损或营养供应不足常导致某些疾病。实际上，这些损伤通常反映在血管疾病中，如糖尿病，高血压，静脉功能不全等。因此，获取有关皮肤微循环的信息非常重要。非侵入性光学技术已显示出监测皮肤微循环的巨大潜力，通过将皮肤组织浸入一些具有高折射率和高渗透性的化学试剂中来减少散射并增强光穿透深度，该技术为获取更多有关皮肤微循环的信息提供了新的机会。

除了皮肤，多种生物器官均可以利用含多种有机化合物或离子去污剂的混合试剂对组织器官进行处理，使其光学特性发生改变，由强散射介质转变为弱散射介质，透光性增强，从而提高光学显微镜的成像深度，有利于实现对组织器官的三维重建和对细节微结构(如脑部神经元空间结构)的解析。

现有技术中，使用光学显微镜观察生物样本不透明的组织内部时，通常会利用透明化试剂来进行预处理(透明化处理)。目前光学透明技术可分为主动光学透明与被动光学透明。其中主动光学透明技术是指在组织光学透明过程中引入外力(如电场力)去除水、脂质等物质，此类虽然可以在一定程度上加快组织透明速率，但设备昂贵，且操作复杂，较难处理大批量样本。在被动型光学透明技术中，可分为有机溶剂光学透明技术和水基溶剂光学透明技术。基于有机溶剂的透明方法是利用甲醇或者乙醇等有机溶剂先对生物组织样本进行梯度脱水，然后再将脱水后的生物组织用高折射率有机溶剂浸泡进行折射率匹配，实现组织体的“光学透明”。这类方法可以快速实现很高的透明度，但会快速淬灭荧光蛋白，与亲脂性荧光染料(例如DiI)不兼容，缩小样品体积，影响样本内部细节结构。

相比较上两类方法，亲水性溶剂法较为温和，主要通过简单渐进浓度浸泡法或者基于尿素的水化作用法达到折射率匹配从而实现光学透明。目前较为常用的方法包括Scale，SeeDB，FRUIT，CUBIC和ScaleS。其中，SeeDB和FRUIT温和简单，荧光蛋白信号保存好，对组织形态保存好，但处理效率低且达到的透明度不高。Scale、CUBIC和ScaleS等方法处理的过程会导致组织大幅膨胀，且Scale的处理效率低。CUBIC的处理效率高，透明度高，但其利用含高浓度(15％)的Triton X-100的水基溶液对组织进行处理，虽然高浓度表面活性剂可加快细胞膜的通透性，但同时也大幅度增加了对细胞膜的破坏，这导致了组织精细结构的破坏以及同细胞膜染色的不兼容性。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中透明化试剂使用时会产生明显的组织膨胀或组织皱缩的缺陷，提供一种使用时不会产生明显的组织膨胀或组织皱缩、生物材料细节结构可以完整保存、透明化时间短、透明化能力高的透明化试剂。

本发明进一步要解决的技术问题在于，提供一种透明化试剂在生物组织材料光学成像中的应用及其皮肤组织透明化成像方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种透明化试剂，为甘露糖溶于溶剂中形成的混合物；或者甘露糖与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶于溶剂中形成的混合物。

所述的透明化试剂中，所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖54-85、溶剂15-40；

或者所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖50-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮1-20、溶剂15-40。

进一步地，所述的透明化试剂中，优选所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖甘露糖60-71、溶剂29-40；

或者所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖60-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮10-20、溶剂25-35。

进一步地，所述的透明化试剂中，优选所述溶剂为水或生理盐水。

进一步地，所述的透明化试剂中，优选透明化试剂还包括重量份数为0.01-10的表面活性剂。

进一步地，所述的透明化试剂中，优选所述表面活性剂为Triton X-100。

进一步地，所述的透明化试剂中，优选透明化试剂还包括重量份数为1-5的尿素、或/和重量份数为3-25的葡甲胺。

上述的透明化试剂在生物组织材料光学成像中的应用。

一种活体皮肤组织透明化成像方法，包括以下步骤：

A、剔除皮肤组织表面毛发，清洁并干燥；

B、将皮肤组织固定并置于光学成像系统焦面处；

C、向成像位置的皮肤组织滴加透明化试剂，静置5-30min后成像；

D、利用光学相干层析成像技术、光学散斑成像技术或光声成像技术对所

述成像位置进行成像；

E、在成像结束后，将透明化试剂擦除，用生理盐水或磷酸盐缓冲液反复擦洗清理皮肤组织表面，使皮肤组织恢复原始状态。

本发明中，透明化试剂是采用甘露糖、甘露糖与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，将其溶于溶剂形成的。其中甘露糖与胶原蛋白相互作用，形成氢键桥，破坏胶原表面水合层，改变了蛋白质四级结构，减缓脑组织的膨胀，同时替换细胞溶液，提高整体组织的折射率匹配度，实现组织在光学波段的透明效果。

1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)可以溶解高折射脂质，高折射率透明试剂替代组织样本中水分，使组织内折射率分布均匀，降低组织散射，从而使得皮肤组织变得对光透明，提高成像深度，为获取皮层微血管结构的分布信息等提供了新的方法。

上述两种化合物都能很好地实现生物组织透明化，透明化时间短、透明化能力高，并且不会产生明显的组织膨胀或组织皱缩。

本发明采用甘露糖与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮配合，二者协同形成更强功效的透明化试剂。其中，甘露糖与胶原蛋白相互作用，破坏胶原表面水合层，初步产生组织透明效果，并且实现减缓脑组织的膨胀或组织皱缩的效果，而加上1,3-二甲基-2-咪唑啉酮可以溶解高折射脂质，同样也可部分减缓脑组织的膨胀。两者在各自作用的基础上，协同进一步提高溶液的折射率，共同替代组织样本中水分，使组织内折射率分布均匀，降低组织散射，从而使得皮肤组织变得对光透明，提高成像深度。

本发明的透明化试剂使用时不会产生明显的组织膨胀或组织皱缩的负面效果，对组织样品结构的破坏程度较小，透明速率与透明效果均较好。可以减少组织结构破损并获得更好的成像效果，能在保持生物材料原形的基础上不使生物材料中细胞的微小级别的结构发生大幅形状变化、且可以迅速进行透明化。并且所用原料都是市售产品，购买方便且价格便宜。

本发明的透明化试剂可以在生物组织材料光学成像中得到应用，即应用于生物组织透明化成像方法中，该方法步骤简单，简单易行。相对于现有的生物组织透明化成像方法，本方法可大大缩减样本处理所需的时间。此外，本方法适用性广泛，可用于多种生物组织，通过不同的成像手段得到图像。

针对活体皮肤组织，本发明的活体皮肤组织透明化成像方法中，通过引入透明化试剂使皮肤组织内部折射率均一化，降低组织散射，使得皮肤组织变得对光透明，从而在短时间内建立一个无损、非侵入的透明颅窗以实现皮层微脉管系统的高分辨成像，为获取皮层微血管结构的分布信息等提供了新的途径；该方法在十五分钟内即可使皮肤组织透明，且透明后用生理盐水可以将皮肤组织复性，恢复至原始的浑浊状态；该方法操作简单，透明程度高，成像质量高，生物相容性好，适用性强，可多次重复成像。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1a是本发明实施例的使用透明化试剂前对两个月月龄小鼠实施活体皮肤组织散斑光学成像图片；

图1b是本发明实施例的透明化试剂对两个月月龄小鼠实施活体皮肤组织光透明化后的散斑光学成像图片；

图2a是本发明实施例的使用透明化试剂前对两个月月龄小鼠实施活体皮肤组织散斑光学成像照片；

图2b是本发明实施例的透明化试剂对两个月月龄小鼠实施活体皮肤组织光透明化后的散斑光学成像照片；

图3是本发明实施例的透明化试剂(甘露糖)、现有技术透明化试剂对1mm厚度5周小鼠脑片处理前后明场结果的对比照片；

图4是本发明实施例的透明化试剂、现有技术透明化试剂对小鼠背部皮肤组织处理前后明场结果的对比照片；

图5是分光光度计测量离体皮肤组织在不同处理时间的光透过率的对比图；

图6是本发明实施例的透明化试剂、现有技术透明化试剂对小鼠脑薄片处理前后明场结果的对比照片；

图7a是分光光度计测量小鼠脑薄片在不同处理时间的光透过率的对比图；

图7b是本发明实施例的透明化试剂、现有技术透明化试剂对小鼠脑薄片的线形膨胀比的对比图；

图8a-8c为本发明实施例的透明化试剂透明化处理的1mm厚度5周小鼠脑片的海马区域的神经元成像结果，其中，8a、8b分别为1mm脑切片的OPT成像和10倍共聚焦成像，8c为海马区树突棘的63倍共聚焦成像；

图9a为本发明实施例的透明化试剂透明化处理前后的3周小鼠胸腺明场结果；

图9b为本发明实施例的透明化试剂透明化处理前后的3周小鼠肠的明场结果；

图10a-10b分别为本发明实施例的3周小鼠特异性标记平滑肌细胞的胸腺组织与肠组织用透明化试剂透明化处理后的共聚焦成像。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

一种透明化试剂，为甘露糖溶于溶剂中形成的混合物。

透明化试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖54-85、溶剂15-40；优选所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖60-71、溶剂29-40。

一种透明化试剂，为甘露糖与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶于溶剂中形成的混合物。透明化试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖50-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮1-20、溶剂15-40。优选所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖60-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮10-20、溶剂25-35。

上述透明化试剂中，优选所述溶剂为水或生理盐水。

进一步地，上述两种实施方式的透明化试剂中，优选透明化试剂还包括重量份数为0.01-10的表面活性剂。

进一步地，上述两种实施方式的透明化试剂中，优选所述表面活性剂为Triton X-100。

进一步地，上述两种实施方式的透明化试剂中，优选透明化试剂还包括重量份数为1-5的尿素；或/和重量份数为3-25的葡甲胺。

上述的透明化试剂可以在生物组织材料光学成像中的应用。

一种活体皮肤组织透明化成像方法，包括以下步骤：

A、剔除皮肤组织表面毛发，清洁并干燥；

B、将皮肤组织固定并置于光学成像系统焦面处；

C、向成像位置的皮肤组织滴加透明化试剂，静置5-30min后成像；

D、利用光学相干层析成像技术、光学散斑成像技术或光声成像技术对所

述位置进行成像；

E、在成像结束后，将透明化试剂擦除，用生理盐水或磷酸盐缓冲液反复擦洗清理皮肤组织表面，使皮肤组织恢复原始状态。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

上述实施例1-28采用制备方法：将以上配比的原料置于容器中混合均匀即得透明化试剂。

实施例1-28中皮肤透明化率的测试方法：采用离体小鼠背部皮肤进行透明化率测试：

A小鼠断颈处理后，剥下背部皮肤组织。

B将皮肤组织固定后用镊子轻轻而完整的剥离脂肪层，然后用刮毛刀刮干净所有的毛，得到干净的皮肤组织。

C将处理好的皮肤组织切片后浸泡在实施例1-28配置好的透明化试剂中，在10分钟时通过分光光度计测得其透过率。

从上述实施例的透明化率测试中可以看出，甘露糖溶液本身具有相对较好的透明化能力，普遍透明化率＞30％，相对于现有技术中20％左右的透明化率，有了很大提高，在添加其他辅助材料(尿素、表面活性剂或/和葡甲胺)后，更是相应提高了透明化率。

甘露糖溶液与DMI配合形成的透明化试剂，更能有效提高透明化率，透明化率在40％以上，优选配比可以达到60％左右。

上述实施例的透明化试剂可以在生物组织材料光学成像中的应用。具体以小鼠为生物材料进行详细说明。

实施例29、一种活体皮肤组织透明化成像方法：

A、将小白鼠麻醉后用刀片将其耳部毛发刮除,清理干净。

B、用鼠固定器固定鼠，用双面胶将鼠耳粘于固定器上，并置于光学成像系统焦面处，将吹干的鼠耳固定在成像位置，两次实验对小白鼠成像得到如图1a、2a所示的光学散斑图像。

C、向固定在固定器表面的鼠耳滴加实施例1-28中任意的透明化试剂，5-30min后即实现皮肤组织的光透明化(尤其可以使用实施例15-28的透明化试剂，以加速透明化过程)，可用于光学显微成像系统进行成像，本实施例是将光透明化的生物组织用激光散斑成像系统进行成像处理；其中，通过引入本发明透明化试剂使组织内部折射率均一化，降低组织散射，使得皮肤组织变得对光透明。例如采用实施例16的透明化试剂得到如图1b的光学散斑图像；采用实施例17的透明化试剂得到如图2b的光学散斑图像；

D、在成像实验结束后，将上述透明化溶液擦除，用生理盐水或磷酸盐缓冲液反复擦洗清理鼠耳表面，使皮肤组织恢复原始浑浊状态。

从图1a和图1b中可以看出，加透明化试剂前，活鼠软骨区域血管成像模糊，微血管不清，加透明化试剂后，活鼠软骨区域微血管透明效果较好，微血管数量数倍增加。

从图2a和图2b中可以看出:加透明化试剂前，活鼠软骨区域血管成像数量少，微血管不清，加透明化试剂后，活鼠软骨区域微血管透明效果较好，活鼠耳部血管无堵塞情况，利于进一步血氧数据测试。

通过上述实施例可以看出，本发明实施例通过向活体皮肤表面滴加透明化试剂，与皮肤组织相互作用，使组织内部折射率均一化，降低组织散射，使得皮肤组织变得对光透明，从而在短时间内建立一个无损、非侵入的透明化方法以实现微脉管系统的实时高分辨成像，克服了因皮肤高散射特性导致成像质量不高、深度不深的问题；该方法在5-20min内即可使皮肤组织透明，且透明后用生理盐水或磷酸盐缓冲液可以将皮肤组织复性，恢复至原始的状态。该方法操作简单，透明程度高，成像质量高，生物相容性好，适用性强，可多次重复成像。

实施例30、离体皮肤组织透明化成像方法：

将小白鼠麻醉处死后用刀片将其皮肤组织(如：背部皮肤、鼠耳)取下，刮除毛并清理干净。将鼠耳离体组织浸泡在实施例6的透明化试剂(其主要成分为甘露糖)。10-30min后即实现鼠耳离体组织的光透明化，利用相机拍照得到如图3所示的明场图像，从图中看出：与现有技术中的PBS、果糖、甘油、PEG 400等透明化效果进行比较，本发明采用甘露糖的透明化试剂具有良好的透明效果，30min后可以清晰看到鼠耳后方的背景格线，而采用PBS、果糖、甘油、PEG 400无法观察到鼠耳后方的完整的背景格线，甚至无法显示背景格线，因此，本发明的透明化试剂具有非常好的透明化效果。

将背部皮肤离体组织浸泡在实施例16的透明化试剂(甘露糖和DMI的混合试剂)中，也同样浸泡在甘油、PEG 400中。5-30min后即实现背部皮肤组织的光透明化，利用相机拍照得到如图4所示的明场图像，其中对应20min后局部放大图中可以看出：本发明试剂具有较高的光透过率，光透过率远远高于甘油、PEG 400的光透过率。利用分光光度计测量离体皮肤组织在不同处理时间的光透过率，结果如图5所示，本发明的透明化试剂光透过率基本接近60％，而甘油的光透过率在20％左右，PEG 400的光透过率不足40％。

从图3-5中可以看出，加本发明透明化试剂前，小鼠离体皮肤组织浑浊不透明，加透明化试剂后，离体皮肤组织变得逐渐透明，更适合光学成像。

除了上述对皮肤进行成像外，还可以对其他生物材料提供透明化成像的应用。

实施例31，在脑组织的光学成像中的应用。

脑组织的固定和分离，实施例采用小鼠大脑，其固定和分离过程如下：20mL针管分别装多聚甲醛、PBS(磷酸盐缓冲液)，排空气泡。质量浓度10％的水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后腹面向上固定好老鼠。打开小鼠胸腔，充分显露心脏和肝脏，尽可能多暴露心脏。找到鼠心尖，用止血钳预夹住心尖，持针从心尖略偏右下进，插入有突破感即停，剪破右心耳，注入PBS，红色血液从右房流出并冲出全身血液，时间约2-3分钟，每只小鼠先灌注20mL生理盐水，再换质量浓度4％的多聚甲醛灌注40mL。灌流成功情况下肝脏完全变白，大脑完全变白，剥离小鼠的大脑。后续将脑部置于质量浓度4％多聚甲醛4摄氏度固定过夜。将脑切成厚度为1mm的脑切片，浸泡在实施例26的透明化试剂(甘露糖和DMI的混合试剂)中。

20-37摄氏度静置(也可使用30rpm摇床进行加速)处理，直到组织变得透明。明场结果如图6所示，从图中可以看出，小鼠脑薄片透明前无法看到样本下面的背景格线，2h透明后完全可以清晰看到组织样本后面的背景格线，而采用PBS、CUBIC、ScaleSQ透明化的样本无法清晰显示背景格线。利用分光光度计测量离体脑切片组织在不同处理时间的光透过率，结果如图7a所示。另外，通过图6中的明场图片计算组织的线形膨胀比，结果如图7b所示。可见在相同的实验条件下，相较于常用的CUBIC和ScaleS而言，本透明化试剂可以得到更高的光学透过率和更好的组织膨胀比。

因脑切片已被透明化，可以对样本进行较大深度的光学成像。例如，可用光学投影层析成像技术对整个脑切片样本进行三维荧光成像，得到脑切片神经元的分布图，如图8a所示。可用共聚焦显微成像系统对脑切片的局部进行Z轴多层扫描得到局部区域的高精度三维成像，结果如图8b(脑平层神经元分布)和8c(大脑树突棘)所示。

实施例32，器官组织的固定和分离，实施例采用小鼠器官，其固定和分离过程如下：

20mL针管分别装多聚甲醛、PBS(磷酸盐缓冲液)，排空气泡。质量浓度10％的水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后腹面向上固定好老鼠。打开小鼠胸腔，充分显露心脏和肝脏，尽可能多暴露心脏。找到鼠心尖，用止血钳预夹住心尖，持针从心尖略偏右下进，插入有突破感即停，剪破右心耳，注入PBS，红色血液从右房流出并冲出全身血液，时间约2-3分钟，每只小鼠先灌注20mL生理盐水，再换质量浓度4％的多聚甲醛灌注40mL。灌流成功情况下肝脏完全变白，大脑完全变白，剥离小鼠的组织器官(胸腺、肠)。后续将胸腺、肠组织置于质量浓度4％多聚甲醛4摄氏度固定过夜。

将胸腺、肠组织浸泡在实施例15的透明化试剂(甘露糖和DMI的混合试剂)中。

20-37摄氏度静置或采用30rpm摇床处理，直到组织变得透明。结果如图9a-9b所示，从图中可以看出，小鼠胸腺(Thymus)、肠组织(Intestine)透明前(Uncleared)无法看到样本下面的背景格线，组织器官透明后一天，即可基本显示出背景格线，透明化2天可以看到清晰的组织样本后面的背景格线。

因组织已被透明化，可以对样本进行免疫标记(Alexa 488标记平滑肌细胞)，从而进行大深度成像，对样本Z轴多层扫描并进行图像匹配可完成对样本的三维重建，小鼠胸腺、肠组织的平滑肌结构结果如图10a-10b所示。

通过实施例29-32的实验结果可以看出，甘露糖、以及甘露糖与DMI结合的透明化试剂，适用于多种组织器官(活体鼠耳、离体鼠皮肤、离体鼠脑片、离体鼠肠、离体鼠胸腺等)的光学透明，在组织器官膨胀比较小，组织细节保存较好，透明速率及透明效果较好的情况下，可以适用于光学相干层析成像技术、光学散斑成像技术或光声成像技术中，也可与多种荧光标记技术和光学成像方法结合做进一步研究。

除了上述实施例外，分别添加表面活性剂Triton X-100、尿素、葡甲胺可以增加透明速率、透明效果、调节组织膨胀比，尤其是三者配合，能即增加透明速率和透明效果，还可以保证较低的组织膨胀比。

其中尿素的水化作用增加细胞膜流动性，辅助其它试剂去除脂类从而提高样本透明度，用于非破坏性的溶解细胞膜以及使蛋白质结构松散化，加速透明化进程；并且加入尿素和生理盐水(PBS)配合，利用生理盐水(PBS)清洗和折射率匹配阶段来尽量恢复样本形态，以减少尿素带来的组织膨胀的负面影响。

表面活性剂Triton X-100的加入，能够去除脂质，改变细胞膜结构，加速透明化进程。

葡甲胺的加入，可以形成高折射率、高渗透性的水基光学透明溶剂。其多羟基结构可以与胶原蛋白分子相互作用，形成氢键桥。而氢键桥能够跨越胶原三螺旋分子的表面，对胶原表面水合层造成一定的破坏，实现溶剂对组织样本中水分的取代，最终使得组织内部的折射率分布均匀，实现光学透明。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种透明化试剂，其特征在于，为甘露糖溶于溶剂中形成的混合物；或者甘露糖与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶于溶剂中形成的混合物。

2.根据权利要求1所述的透明化试剂，其特征在于，所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖54-85、溶剂15-40；

或者所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖50-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮1-20、溶剂15-40。

3.根据权利要求2所述的透明化试剂，其特征在于，所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖60-71、溶剂29-40；

或者所述试剂各组分的重量份数分别为：甘露糖60-85、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮10-20、溶剂25-35。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的透明化试剂，其特征在于，所述溶剂为水或生理盐水。

5.根据权利要求2所述的透明化试剂，其特征在于，透明化试剂还包括重量份数为0.01-10的表面活性剂。

6.根据权利要求5所述的透明化试剂，其特征在于，所述表面活性剂为Triton X-100。

7.根据权利要求2或5所述的透明化试剂，其特征在于，透明化试剂还包括重量份数为1-5的尿素、或/和重量份数为3-25的葡甲胺。

8.权利要求1-7任意一项所述的透明化试剂在生物组织材料光学成像中的应用。

9.一种活体皮肤组织透明化成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、剔除皮肤组织表面毛发，清洁并干燥；

B、将皮肤组织固定并置于光学成像系统焦面处；

C、向成像位置的皮肤组织滴加透明化试剂，静置5-30min后成像；

D、利用光学相干层析成像技术、光学散斑成像技术或光声成像技术对所述成像位置进行成像；

E、在成像结束后，将透明化试剂擦除，用生理盐水或磷酸盐缓冲液反复擦洗清理皮肤组织表面，使皮肤组织恢复原始状态。