CN113324819A - 一种生物组织透明化的复合加速剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物组织透明化的复合加速剂及其制备方法与应用。该方法包括：将蔗糖、N,N,N',N'‑四(2‑羟基丙基)乙二胺与肝素钠水溶液混合，加热溶解，直至溶液澄清透明，加入过氧化氢、L‑抗坏血酸，得到生物组织透明化的复合加速剂。所述应用方法包括：将生物组织进行固定，浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中2‑8小时，取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；再将清洗后的生物组织浸泡在组织透明化试剂中，得到透明化后的生物组织。本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂具有加速生物组织透明化进程的作用，缩短了透明化实验的周期，提升了获取实验数据的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物样本处理领域，具体涉及一种生物组织透明化的复合加速剂及其制备方法与应用。
背景技术
近年来光学成像技术的发展迅速，高分辨获取生物组织的微观结构信息已成为可能，但生物组织的不透明性制约了光学成像技术在生物医学领域中的应用。
生物组织透明化技术使得器官不必切片，就可在完整状态下进行观察研究。现有的生物组织透明化方法主要分为四类。第一类为简单浸泡型，代表性的方法有seeDB方案；第二类为有机溶剂型，如DISCO系列方案中的3DISCO与iDISCO；第三类为水凝胶技术型，如Clarity方案；第四类为水化作用型，代表性方法为CUBIC系列方案。综上四种方法，有机溶剂型方法中用到的试剂大多具有高毒性，对实验操作人员的安全造成威胁；水凝胶技术型方法对技术和设备的要求较高，且实验步骤繁琐，因此重复性不高；简单浸泡型和水化作用型方法所用试剂安全低毒，且对技术、设备条件的要求不高，操作步骤简单，重复性好。然而，简单浸泡型和水化作用型方法的实验周期较长，一个样品常需要处理超过十天乃至一个月，这极大的影响了获取实验数据的效率、增加了实验人员获取数据的时间成本。
因此，期待能够提高现有的安全、低毒、简单生物组织透明化方法的透明化效率，提供一种生物组织透明化的复合加速剂，配合现有透明化方法以缩短生物组织的透明化处理时间。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种生物组织透明化的复合加速剂及其制备方法与应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂，按照质量份数计，包括：
优选地，本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂，按照质量份数计，包括：
优选地，本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂，按照质量份数计，包括：
优选地，本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂，按照质量份数计，包括：
进一步地，所述过氧化氢溶液的浓度为2wt％-5wt％。
优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为3wt％。
本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂的制备方法，包括如下步骤：将蔗糖、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺、肝素钠及水混合均匀，加热溶解，直至溶液澄清透明，待溶液冷却至室温，加入过氧化氢溶液、L-抗坏血酸，混合均匀，得到所述生物组织透明化的复合加速剂。
进一步地，所述N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺的纯度为99％。
进一步地，所述肝素钠的生物效价为150U/mg。
进一步地，所述L-抗坏血酸的纯度为99.6％，所述L-抗坏血酸的比旋度为25°。
进一步优选地，所述L-抗坏血酸的分子量为176.13。
进一步地，所述加热溶解的温度为30-60℃。
本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂在生物组织透明化中的应用，包括如下步骤：
(1)将将生物组织进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将步骤(1)所述预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中，取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将步骤(2)所述清洗后的生物组织浸泡在组织透明化试剂中，得到透明化后的生物组织。
进一步地，步骤(1)所述生物组织为脑、心、皮肤、乳腺、睾丸、胃、肌肉、肾脏、肝脏、脾脏、肠或肺。
进一步地，步骤(1)所述固定的方式为使用福尔马林固定与使用4wt％多聚甲醛固定。
进一步地，步骤(2)中，将预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中的时间为2-8小时。
进一步地，步骤(3)中，清洗后的生物组织浸泡在组织透明化试剂中的时间为1-3天；所述组织透明化试剂为CUBIC组织透明化试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的生物组织透明化的复合加速剂具有加速生物组织透明化进程的作用，缩短了透明化实验的周期，提升了获取实验数据的效率。
附图说明
图1为实验各组小鼠生物组织透明度测量的结果图。
图2为实验各组小鼠脑组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图3为实验各组小鼠肝组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图4为实验各组小鼠肾组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图5为实验各组小鼠肺组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图6为实验各组小鼠小肠组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图7为实验各组小鼠大肠组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图8为实验各组小鼠乳腺组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
图9为实验各组小鼠子宫组织透明度值BTCi的统计对比结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例与对比例中，所述生物组织包括脑、肝、肾、肺、小肠、大肠、乳腺、子宫。
对比例1
(1)将生物组织置于4wt％多聚甲醛溶液中，于4℃环境下摇晃12小时进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将上述预处理后的生物组织浸泡在CUBIC组织透明化试剂中，浸泡时间为3天，得到透明化后的生物组织。
对比例2
(1)将生物组织置于4wt％多聚甲醛溶液中，于4℃环境下摇晃12小时进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将上述预处理后的生物组织浸泡在水中，2小时后取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将上述预处理后的生物组织浸泡在CUBIC组织透明化试剂中，浸泡时间为3天，得到透明化后的生物组织。
实施例1
一种生物组织透明化的加速剂的制备方法，包括如下步骤：
1、生物组织透明化的复合加速剂的制备：
将蔗糖、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺、肝素钠及水混合均匀，并加热溶解直至溶液澄清透明，加热溶解的温度为60℃，待溶液冷却至室温，加入过氧化氢溶液(浓度为2wt％)、L-抗坏血酸，即得到所述生物组织透明化的复合加速剂。
所述生物组织透明化的复合加速剂的组成，包括：
2、复合加速剂的应用：
(1)将生物组织置于4wt％多聚甲醛溶液中，于4℃环境下摇晃12小时进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将上述预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中，2小时后取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将步骤(2)所述清洗后的生物组织浸泡在CUBIC组织透明化试剂中，浸泡时间为2天，得到透明化后的生物组织。
实施例2
一种生物组织透明化的加速剂的制备方法，包括如下步骤：
1、生物组织透明化的复合加速剂的制备：
将蔗糖、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺与肝素钠水溶液混合，并加热溶解，加热溶解的温度为30℃，直至溶液澄清透明，待溶液冷却至室温，加入过氧化氢溶液(浓度为5wt％)、L-抗坏血酸，即得到所述生物组织透明化的复合加速剂。
所述生物组织透明化的复合加速剂的组成，包括：
2、复合加速剂的应用：
(1)将生物组织置于4wt％多聚甲醛溶液中，于4℃环境下摇晃12小时进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将上述预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中，5小时后取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将步骤(2)所述清洗后的生物组织浸泡在CUBIC组织透明化试剂中，浸泡时间为2天，得到透明化后的生物组织。
实施例3
一种生物组织透明化的加速剂的制备方法，包括如下步骤：
1、复合加速剂的制备：
将蔗糖、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺、肝素钠及水混合均匀，并加热溶解，加热溶解的温度为50℃，直至溶液澄清透明，待溶液冷却至室温，加入过氧化氢溶液(浓度为3wt％)、L-抗坏血酸，即得到所述复合加速剂。
所述生物组织透明化的复合加速剂的组成，包括：
2、复合加速剂的应用：
(1)将生物组织置于4wt％多聚甲醛溶液中，于4℃环境下摇晃12小时进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将上述预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中，8小时后取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将步骤(2)所述清洗后的生物组织浸泡在CUBIC组织透明化试剂中，浸泡时间为2天，得到透明化后的生物组织。
实验效果验证：
生物组织透明度测量比较方案：将透明化处理后的生物组织放在带有黑线的白纸上进行拍照(如图1所示)，利用软件ImageJ计算生物组织透明度值BTCi，并比较实验各组生物组织的透明度值。
BTCi的计算(参照式1)：
BTCi＝(255-a)/(255-b)………………………(式1)
其中，a：网格纸上有生物组织时，组成网格细线的平均像素强度；
b：网格纸上无生物组织时，组成网格细线的平均像素强度。
表1
分组情况如表1所示。
第一组：空白组，对比例1，不加生物组织透明化的复合加速剂，对预处理后生物组织直接进行CUBIC透明化处理，3天后计算BTCi。
第二组：对比组，对比例2，以水代替生物组织透明化的复合加速剂，并对其处理后的生物组织进行CUBIC透明化处理，3天后计算BTCi。
第三组：实验组，实施例1，按实施例1制备生物组织透明化的复合加速剂，并对其处理后的生物组织进行CUBIC透明化处理，2天后计算BTCi。
第四组：实验组，实施例2，按实施例2制备生物组织透明化的复合加速剂，并对其处理后的生物组织进行CUBIC透明化处理，2天后计算BTCi。
第五组：实验组，实施例3，按实施例3制备生物组织透明化的复合加速剂，并对其处理后的生物组织进行CUBIC透明化处理，2天后计算BTCi。
实验结果(参照图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9所示)。
上述对比观察实验的结果显示，空白组和对比组中经透明化处理3天的各生物组织，其透明度并无显著性差异；而实验组(即表1中第三、四、五组)中经透明化处理2天的各生物组织的透明度显著高于经透明化处理三天的空白组、对比组的各生物组织的透明度。说明本发明的产品能够显著加速生物组织的透明化进程，缩短透明化实验的周期，提升了获取实验数据的效率。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物组织透明化的复合加速剂，其特征在于，按照质量份数计，包括：
2.根据权利要求1所述的生物组织透明化的复合加速剂，其特征在于，所述过氧化氢溶液的浓度为2wt％-5wt％。
3.一种制备权利要求1-2任一项所述的生物组织透明化的复合加速剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将蔗糖、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺、肝素钠及水混合均匀，加热溶解，直至溶液澄清透明，待溶液冷却至室温，加入过氧化氢溶液、L-抗坏血酸，混合均匀，得到所述生物组织透明化的复合加速剂。
4.根据权利要求3所述的生物组织透明化的复合加速剂的制备方法，其特征在于，所述加热溶解的温度为30-60℃。
5.权利要求1-2任一项所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用。
6.根据权利要求5所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将将生物组织进行固定，得到预处理后的生物组织；
(2)将步骤(1)所述预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中，取出，用PBS缓冲液清洗，得到清洗后的生物组织；
(3)将步骤(2)所述清洗后的生物组织浸泡在组织透明化试剂中，得到透明化后的生物组织。
7.根据权利要求6所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用，其特征在于，步骤(1)所述生物组织为脑、心、皮肤、乳腺、睾丸、胃、肌肉、肾脏、肝脏、脾脏、肠或肺。
8.根据权利要求6所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用，其特征在于，步骤(1)所述固定的方式为使用福尔马林固定与使用4wt％多聚甲醛固定。
9.根据权利要求6所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用，其特征在于，步骤(2)中，将预处理后的生物组织浸泡在所述生物组织透明化的复合加速剂中的时间为2-8小时。
10.根据权利要求6所述的生物组织透明化的复合加速剂在在生物组织透明化中的应用，其特征在于，步骤(3)中，清洗后的生物组织浸泡在组织透明化试剂中的时间为1-3天；所述组织透明化试剂为CUBIC组织透明化试剂。
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| CN104568553A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 深圳先进技术研究院 | 一种组织光透明剂及其应用 |
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| CN107132101A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-09-05 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种组织光透明剂及其制备方法和应用 |
| CN110596096A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-12-20 | 深圳技术大学 | 透明化试剂及其在生物组织材料光学成像中的应用、活体皮肤组织透明化成像方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANAT PERETS 等: "Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113324819B (zh) | 2023-04-21 |
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