JP2018185297A - 生体組織を透明化するための組成物および同組成物を用いる生体組織の透明化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の別の目的は、変性させることなく、迅速な組織の透明化を可能にする、生体組織のための透明化方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、生体組織の透明化を容易にする、生体組織を透明化するためのキットを提供することにある。
本発明は、以下において、詳細に記載される。
本発明の一態様において、本発明は、以下の式1にて示される化合物あるいは同化合物の水和物を含む、生体組織を透明化するための組成物を提供する。
本発明の生体組織を透明化するための組成物は、光の透過を阻止する脂質成分および他の分子を生体組織から除去し、タンパク質の構造的変性を引き起こすことなく、かつ組織の引き締めを提供する。
本発明の生体組織に対する透明化方法を、以下において、より詳細に記載する。
特に、本発明の生体組織のための透明化方法は、組織を式1で表される化合物と接触させることにより、生体組織の物理化学的特性を変化させることにより生体組織をより透明にすることにより、光をより深く浸透させることを特徴とする。
より詳細には、生体組織の固定化は、必ずしも限定されるものではないが、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミド、またはこれらの組み合わせを使用して実施され得る。
本発明の方法によって透明化された生体組織におけるタンパク質またはmRNAは、GFP蛍光または免疫染色によって検出することができる。タンパク質が固定されるとき、固定プロセス時に、アミノ基が互いに結合して網目を形成し、それは安定性を付与する。一方、RNAまたはDNAといった核酸はアミノ基を有しておらず、固定された組織において、比較的不安定であることを示す。特に、電気泳動の過程で、核酸の電気的特性のために組織内においてその位置を変化させることができる。他方、本発明の方法によって透明化された生体組織は、GFP細胞およびコリンアセチルトランスフェラーゼ(コリン作動性ニューロンマーカー抗体)の蛍光染色において優れている。
生体組織を上記したサッカライド溶液で処理した場合、光の透過を回避する脂質成分および他の分子は予め生体組織から取り除かれ、脱水が誘導される。結果として、組織を固定するための試薬と生体組織のタンパク質との間の構造的結合力が高まり、それにより、変性が阻止され、組織をより硬化させることができる。さらに、透明化プロセス時に組織が膨潤することが回避され、抗体処理プロセスおよび洗浄プロセスの過程で、組織がクラッキングを起こすことが回避される。しかしながら、サッカライド溶液中のサッカライドの濃度が10w/v%未満である場合、上記したような効果が誘導されないかもしれない。これに対し、サッカライド溶液中のサッカライドの濃度が70w/v%を超える場合、処理は経済的ではない。
しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲内で改変および改良を行うことができることが理解されよう。
CHAPSのみを含む生体組織透明化剤に生体組織を接触させた際に、生体組織の透明化が容易に誘導されるか否かを評価するために、以下の実験を行った。この陳述に記載されているすべての動物試験は、韓国毒性学会動物資源委員会のガイダンス(承認番号:RS17003)に従って実施した。
図2は、マウスがCHAPSのみで処理された場合、マウスの脳の透明化が誘導されたことを示す写真である。
CHAPSおよび尿素を含む生体組織透明化剤に生体組織を接触させた際に、生体組織の透明化が容易に誘導されるか否かを評価するために、以下の実験を行った。この陳述に記載されているすべての動物試験は、韓国毒性学会動物資源委員会のガイダンス(承認番号:RS17003)に従って実施した。
本発明の透明化方法により透明化された脳の蛍光を調べるために、光学顕微鏡(Leica製)の下で1Xの対物レンズを用いて免疫染色された蛍光および緑色蛍光タンパク質(GFP)シグナルがマウスの脳で確認された。結果を図5に示す。
実験例4:CHAPSおよび尿素の濃度に従う生体組織の透明化の程度の評価
CHAPSおよび尿素を含有するPBS混合溶液中のCHAPSおよび尿素の濃度の変化によって生体組織の透明化が影響を受けるかどうかについて調べるために以下の実験を実施した。
図12に示されるように、仮にCHAPSまたは尿素の濃度が変更された場合でも、CHAPSおよび尿素を含むPBS混合溶液において、組織の変性を引き起こすことなく、マウスの脳の透明化を誘導した。
実験例2と同様の方法で生体組織の透明化が誘導されたときに、CHAPSとともに尿素の代わりにスクロースまたはグリセロールを使用し、生体組織の透明化の比較のために対照群の調製を誘導した。生体組織の透明化は、尿素のみを使用することによっても誘導された。さらに、処理を行っていない、未処理群の生体組織も観察した。結果を図13乃至17に示す。
図14は、20w/v%CHAPSおよび50w/v%スクロースを使用することによる生体組織の透明化を誘導した結果を示す写真である。
図16は、20w/v%CHAPSおよび50w/v%尿素を使用することによる生体組織の透明化を誘導した結果を示す写真である。
図13乃至17に示されるように、CHAPSおよび尿素を含む生体組織透明化剤で生体組織の透明化を誘導するとき、スクロースまたはグリセロールを含む生体組織を透明化するための組成物、あるいは尿素のみを含む生体組織透明化剤を使用した場合と比較して、タンパク質変性を引き起こすことなく、透明化が迅速に誘導された。
サッカライドの前処理に従う組織透明化の程度に任意の変化があるかどうかについて以下の実験を行った。この陳述に記載されているすべての動物試験は、韓国毒性学会動物資源委員会のガイダンス(承認番号:RS17003)に従って実施した。
図18は、固定ステップと前処理ステップの両方が完了したマウスの脳の画像と、固定ステップのみが完了したマウスの脳の画像とを示す一組の写真である。図18の底部の蛍光画像は、紫外線(UV)を用いて測定した脳におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ67−GFP(GAD67−GFP)蛍光の強度の変化を示す。
図19は、5時間の間、固定ステップ、前処理ステップおよび透明化ステップのすべてのステップを完了したマウスの脳の画像と、前処理ステップを行わずに固定ステップおよび透明化ステップを完了した対照群マウスの脳の画像と、を示す一組の写真である。図19の底部の蛍光画像は、紫外線(UV)を用いて測定した脳におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ67−GFP(GAD67−GFP)蛍光の強度の変化を示す。
以下の実験は、実験例6において透明化された組織を再び洗浄および透明化したとき、サッカライド前処理を行う場合と行わない場合の組織透明化の程度の変化を調べるために実施した。
Claims (12)
- 以下の式1によって示される化合物またはその水和物を含む生体組織を透明化するための組成物。
- 生体組織を透明化するための組成物は、尿素、CHAPSO(3−([3−コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート)、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、Triton(登録商標)X−100、Tween(登録商標)−20、2,2’−チオジエタノール、イオヘキソール、抱水クロラールからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含む、請求項1に記載の生体組織を透明化するための組成物。
- 固定化された生体組織を請求項1に記載の生体組織を透明化するための組成物と接触させることによる生体組織を透明化するステップを含む、生体組織のための透明化方法。
- 生体組織は、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓および腸からなる群より選択される、請求項3に記載の生体組織のための透明化方法。
- 固定化された生体組織は、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒドおよびポリアクリルアミドからなる群より選択される1以上の材料で固定化されている、請求項3に記載の生体組織のための透明化方法。
- 生体組織のための透明化方法は、4℃〜50℃の温度にて実施される、請求項3に記載の生体組織のための透明化方法。
- 固定化された生体組織をサッカライド溶液で前処理するステップと、前処理された組織を、請求項1に記載の生体組織を透明化するための組成物と接触させるステップによる、生体組織を透明化するステップと、を含む、生体組織のための透明化方法。
- サッカライドは、モノサッカライド、ジサッカライドおよびポリサッカライドからなる群より選択される1以上の材料である、請求項7に記載の生体組織のための透明化方法。
- 前記モノサッカライドは、フルクトース、ガラクトース、グルコースまたはマンノースであり、前記ジサッカライドは、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースまたはセロビオースであり、前記ポリサッカライドは、デキストラン、ジエチルアミノエチル−デキストラン、デキストリン、セルロースまたはβ−グルカンである、請求項8に記載の生体組織のための透明化方法。
- 前記サッカライド溶液は、サッカライドを含有する水溶液である、請求項7に記載の生体組織のための透明化方法。
- 前記サッカライド溶液中のサッカライドの濃度は、10〜70w/v%である、請求項7に記載の生体組織のための透明化方法。
- 生体組織を透明化するための前処理組成物と、請求項1に記載の生体組織を透明化するための組成物と、を含む、生体組織を透明化するためのキット。
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