CN111458199A - 一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统及透明工艺 - Google Patents

Abstract

本发明请求保护一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统及工艺，所述组织透明化系统包括反应容器，超声装置，加样装置，真空装置，温度控制装置，心脏灌注装置和PLC控制器。本系统通过在组织透明化过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动，利用超声振动加速透明化试剂向组织中渗透。可显著提高组织透明化的程度，加快组织透明化的速度。本发明可实现自动组织透明化，反应过程中可精确控制反应条件，提高了实验的可重复性和稳定性。可帮助生物技术研究者实现更快质量更好的组织透明化，加速组织透明化技术在生物研究中的应用。

Description

一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统及透明工艺

技术领域

本发明属于医学成像领域，更具体的说是涉及一种叠加超声振动的自动化生物组织透明化系统。

背景技术

组织切片技术现在是了解组织病理结构的标准方法，这项技术依赖于将组织切成微米级的薄片来进行观察。然而，要更全面地理解病理机制，就需要对整个组织器官进行整体的观察，而不仅仅观察几个微米厚度的组织。但是，哺乳动物的组织是天然不透明的，深度超过几百微米后都不能进行高分辨率成像。

组织透明化技术是近几年发展起来进行组织观察的新方法，它可对完整的标本组织进行三维组织学观察。组织的不透明主要源于不同组织成分的光学折射率不同以及色素、钙化组织遮挡等，针对这些原理，开发了许多组织透明化技术，如PEGASOS，3DISCO,FluoClear,uDISCO,VDISCO,Scale,SeeDB,CLARITY,CUBIC,PACT,SWITCH,CUBIC-R,和BoneClarity等等。组织透明化是一个化学过程，主要是通过匹配完整组织的折射率，从而使它们光学透明，并允许深层组织成像。由于组织结构的复杂性，目前的透明化技术尚未实现理想的组织透明化程度。还有一些大块的、结构复杂的组织，其透明化一直是技术的难点。为解决这些问题，又开发出全身灌注等技术方案。但是全身灌注技术操作难度大，技术稳定性差使得透明化的可重复性差，结果可靠性差。目前的透明化技术方案耗时都比较长，反应时间从1周到数周不等，实验效率低下。目前的大部分技术的组织透明化过程都是依靠实验人员手动完成，实验中需定时更换试剂，反应条件控制困难，自动化程度低。

超声波是指频率高于人耳听觉上限的声波。功率超声是以超声能量使物体或物性的某些状态变化的应用技术，在国民经济建设中对提高产品质量、降低生产成本、防止环境污染、提高生产效率等具有特殊的潜在能力。目前，功率超声主要应用在以下方面：超声加工技术、超声悬浮、超声清洗、超声治疗、超声马达、声空化和声化学、超声雾化等，尚无在组织透明化方面的应用。我们创新性的使用超声来加速组织的透明化过程提高透明化程度。

发明内容

本发明旨在解决以上现有技术的问题。提出了一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统及工艺。本发明的技术方案如下：

一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其包括：反应容器、超声装置、加样装置、真空装置、温度控制装置、心脏灌注装置和PLC控制器，其中反应容器分别与加样装置、真空装置、温度控制装置、心脏灌注装置相连接，所述各部分装置分别与PLC控制器相连接，反应容器中设置有超声装置，用于在反应过程中对反应液和标本叠加超声振动；将组织与透明化试剂放置于反应容器中，在透明化的某一过程或者全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动，利用超声振动加速透明化试剂向组织中渗透。

进一步的，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器，所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，超声波发生器将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动的能量。

进一步的，所述超声能量转换器可分为两组或多组交替运行。

进一步的，所述反应容器包括工作容器、密封装置、金属网标本盒和反应液；所述工作容器分为两部分，工作容器的容器内部中间位置通过设置一密封装置保证气密性；所述工作容器内部设置有金属网标本盒浸泡在反应液中；所述工作容器内部设置有心脏灌注装置，用于对完整动物标本实行心脏灌注；所述工作容器内部设置有压力传感器，用于记录工作容器内的压力；所述工作容器中设置有超声装置，用于在反应过程中对反应液和标本叠加超声振动；所述工作容器中设置有温度控制装置，用于确保反应在设定的温度进行；所述工作容器外部连接有加样装置，用于自动向工作容器中添加试剂及排除废液；所述工作容器外部连接有真空装置，用于在反应过程中将容器内抽吸为真空状态，减少透明化气泡。

进一步的，所述加样装置包括进液控制阀、流量计、抽液泵、试剂桶及排液控制阀；所述进液控制阀与工作容器和流量计相连，并与PLC控制器电性连接；所述流量计与进液控制阀和抽液泵相连，并与PLC控制器电性连接；所述抽液泵与流量计和试剂桶相连，抽液泵根据试剂种类的数量设置个数，并与PLC控制器电性连接；所述试剂桶根据试剂种类的数量设置个数，与抽液泵相连；所述排液控制阀与工作容器相连，并与PLC控制器电性连接。

进一步的，所述真空装置包括三通控制阀、真空泵、压力传感器；所述三通控制阀与工作容器、真空泵及空气相连，并与PLC控制器电性连接；所述真空泵与三通控制阀相连，并与PLC控制器电性连接；所述压力传感器安置于工作容器内部，与PLC控制器电性连接。

进一步的，所述温度控制装置包括温度传感器和加热冷却装置，精确控制反应体系温度，与PLC控制器电性连接；

所述心脏灌注装置包括蠕动泵、连接管；所述蠕动泵与连接管相连，与PLC控制器电性连接；所述连接管穿过蠕动泵，两端分别与反应液、动物左心室穿刺针相连，实现心脏灌注。

进一步的，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器，所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，超声波发生器将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动的能量。

一种采用所述系统的叠加超声振动的自动化组织透明化工艺，其包括以下步骤：

(1)实验动物以肝素PBS经心脏灌注，4％PFA经心脏灌注以固定组织；

(2)将步骤(1)处理后的标本解剖，获得所需组织器官标本；

(3)将步骤(2)得到的组织浸泡于4％PFA中室温下固定24小时；

(4)将步骤(3)得到的组织放置于金属网标本盒中，试剂更换为20％EDTA溶液，超声振动运行4天，期间每日均更换新的20％EDTA溶液，运行温度37摄氏度；

(5)试剂更换为去离子水，更换3次，每次超声振动运行30分钟，运行温度37摄氏度；

(6)试剂更换为25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，超声振动运行2天，期间每日均更换新的25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，运行温度37摄氏度；

(7)试剂更换为30％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(8)试剂更换为50％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(9)试剂更换为70％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(10)试剂更换为脱水溶液(75％叔丁醇，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行2天，期间每日均更换新的脱水溶液，运行温度37摄氏度；

(11)试剂更换为透明溶液(75％苯甲酸苄酯，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(12)将步骤(11)得到的透明化头部组织采用光学显微镜进行成像处理，所诉光学显微镜包括共聚焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜。

本发明的优点及有益效果如下：

本发明的创新点及优点：

1、本发明在组织透明化的过程中叠加超声振动，利用超声振动加速透明化试剂向组织中扩散，可显著提高组织透明化的程度，加快组织透明化的速度。

2、组织透明化过程中需要控制反应体系温度，而超声持续振动过程中会发热，本发明中加入了加热冷却装置可准确控制反应体系温度，确保反应在预定的温度中运行，提高了组织透明化过程的稳定性和可重复性；

3、本发明可实现组织的自动化透明，减少人工操作，节省人力；

4、本发明不指定组织透明化试剂，使用者可根据需要选择不同的透明化试剂及透明化方案；

5、相比与传统的摇床方法，本发明中无机械结构摇动，结构相对简单；

不容易想到的理由：

组织的透明化一般使用摇床来加速透明试剂向组织中渗透，但是使用摇床的透明化方法仍面临透明化程度不够和耗时过长等不足。超声波提取法广泛用于中药有效成分提取，其原理是利用了超声波的机械振动、超声空化、细胞破壁、超声热效应、超声冲流、超声湍流、流体边界层等综合效应达到加速植物细胞内容物向溶剂中扩散的目的。反向的，超声也能加速溶剂想组织细胞中的渗透。但是对组织长时间叠加超声振动可能引起组织损伤和反应体系温度升高，同时可能损伤超声设备。本发明需要低功率超声长时间的振动，发明人利用一台老旧的超声振动仪，其在长期工作后，其超声换能器的谐振频率已发生漂移，超声换能器振幅下降，实现了低功率超声，以这台超声仪为基础验证了透明化过程中叠加超声振动可提高组织透明化程度，加快组织透明化速度。

附图说明

图1是本发明提供优选第一实施例叠加超声振动实现方式；

图2是本发明提供优选第二实施例叠加超声振动实现方式；

图3是本发明提供优选第三实施例叠加超声振动实现方式；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、详细地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其包括反应容器，超声装置，加样装置，真空装置，温度控制装置，心脏灌注装置和PLC控制器。本系统通过在组织透明化过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动，利用超声振动加速透明化试剂向组织中渗透。可显著提高组织透明化的程度，加快组织透明化的速度。可实现自动组织透明化，反应过程中可精确控制反应条件，提高了实验的可重复性和稳定性。需要指出的是，本发明的反应容器、超声装置、加样装置、真空装置、温度控制装置、心脏灌注装置和PLC控制器均是现有的单独的产品，其组合才是本发明的创新点所在，发明人无意中发现其组合具备意想不到的效果，通过本发明的系统，通过超声装置在组织和透明化试剂中叠加超声振动加快了组织的透明化，并提高了自动化程度，提高了效率，避免了人工化不精确和劳动程度高的缺陷。

叠加超声振动的方法有三种实现方式：技术方案1，将组织与透明化试剂放置于反应容器中，再将该容器放置于带超声振动发生器的容器中，在透明化的某一过程或者全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动(图1)；技术方案2，将组织与透明化试剂放置于带超声振动发生器的反应容器中，在透明化的某一过程或者全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动(图2)；技术方案3，将组织与透明化试剂放置于反应容器中，再将插入式超声换能器放入透明化试剂中，在透明化的某一过程或者全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动(图3)。

在技术方案1中，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器、水槽和水；所述超声能量转换器设置在水槽外部，可分为两组或多组，交替运行，确保超声能量转换器不因持续运行而损坏；所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动的能量；所述水槽外部设置有超声能量转换器，内部装有水，水中放置工作容器。

在技术方案2中，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器；所述超声能量转换器设置在工作容器外部，可分为两组或多组，交替运行，确保超声能量转换器不因持续运行而损坏；所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动和去除工件材料的能量。

在技术方案3中，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器；所述超声能量转换器放置在工作容器内部，浸入透明试剂中；所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动的能量。

以PEGASOS组织透明化技术路线完成小鼠头部组织透明化的过程举例说明。

一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，包括反应容器，超声装置，加样装置，真空装置，温度控制装置，心脏灌注装置和PLC控制器。

叠加超声振动的方法选用优选实施例1，将组织与透明化试剂放置于反应容器中，再将该容器放置于带超声振动发生器的容器中，在透明化的全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动(图1)。

所述反应容器包括工作容器1、密封装置13、金属网标本盒12和反应液16；所述工作容器1分为两部分，中间以密封装置13连接保证气密性；所述工作容器1内部设置有金属网标本盒12浸泡在反应液16中；所述工作容器1内部设置有压力传感器17，可记录工作容器内的压力；所述工作容器1外部设置有超声装置，可在反应过程中对反应液和标本叠加超声振动；所述工作容器1外部设置有温度控制装置，确保反应在设定的温度进行；所述工作容器1外部连接有加样装置，可自动向工作容器中添加试剂及排除液体；所述工作容器1外部连接有真空装置，可在反应过程中将容器内抽吸为真空状态，减少透明化气泡。

所述超声装置包括超声能量转换器2、超声波发生器3、水槽18和水19；所述超声能量转换器2设置在水槽18外部，可分为两组或多组，交替运行，确保超声能量转换器不因持续运行而损坏；所述超声波发生器3与超声能量转换器2相连接，将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器2往复振动和去除工件材料的能量；所述水槽18外部设置有超声能量转换器2，内部装有19水，水19中放置工作容器1。

所述加样装置包括进液控制阀4、流量计5、抽液泵6、试剂桶7、排液控制阀8；所述进液控制阀4与工作容器1和流量计5相连，并与PLC控制器电性连接；所述流量计5与进液控制阀4和抽液泵6相连，并与PLC控制器电性连接；所述抽液泵6根据试剂种类的数量设置个数，与流量计5和试剂桶7相连，并与PLC控制器电性连接；所述试剂桶根据试剂种类的数量设置个数，与抽液泵6相连；所述排液控制阀8与工作容器1相连，并与PLC控制器电性连接。

所述真空装置包括三通控制阀10、真空泵11、压力传感器17；所述三通控制阀10与工作容器1、真空泵11及空气相连，并与PLC控制器电性连接；所述真空泵11与三通控制阀10相连，并与PLC控制器电性连接；所述压力传感器17安置于工作容器1内部，与PLC控制器电性连接。

所述温度控制装置9包括温度传感器和加热冷却装置，精确控制反应体系温度，与PLC控制器电性连接。

所述心脏灌注装置包括蠕动泵14、连接管15；所述蠕动泵与连接管相连，与PLC控制器电性连接；所述连接管穿过蠕动泵，两端分别与反应液、动物左心室穿刺针相连，实现心脏灌注。

优选的，以PEGASOS组织透明化技术路线完成小鼠头部组织透明化的过程中，标本为小鼠头部，无法叠加心脏灌注，心脏灌注装置无需开机。

优选的，在上述一种叠加超声振动的自动化生物组织透明化系统中，系统更换试剂的过程可概括为：超声装置停机，三通控制阀10连通空气与工作容器1，打开排液控制阀8，排出废液后关闭排液控制阀8，打开进液控制阀4，抽液泵6泵入试剂，然后关闭进液控制阀4，三通控制阀10联通工作容器1与真空泵11，真空泵11开机将工作容器1抽为真空，再关闭三通控制阀10，超声装置开机。

优选的，在上述一种叠加超声振动的自动化生物组织透明化系统中，反应过程中监测温度，温度控制装置9维持反应温度在设定的温度值；反应过程中监测工作容器压力，必要时真空装置反复开机，维持工作容器内的真空状态。

以PEGASOS组织透明化技术路线完成小鼠头部组织透明化的具体过程如下：

(1)实验动物麻醉处死后，立即以50–100ml肝素PBS经心脏灌注.50ml4％PFA经心脏灌注。

(2)将步骤(1)处理后的标本解剖，除去眼球及下颌，得到小鼠头部

(3)将步骤(2)得到的组织浸泡于50ml4％PFA中室温下固定24小时。

(4)将步骤(3)得到的组织放置于金属网标本盒12中，关闭工作容器1，锁紧密封装置13，试剂更换为50ml20％EDTA溶液，更换过程如前述，运行4天，期间每日均更换新的50ml20％EDTA溶液，运行温度37摄氏度。

(5)试剂更换为50ml去离子水，更换过程如前述，更换3次，每次运行30分钟，运行温度37摄氏度。

(6)试剂更换为50ml25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，更换过程如前述，运行2天，期间每日均更换新的50ml25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，运行温度37摄氏度。

(7)试剂更换为50ml30％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，更换过程如前述，运行1天，运行温度37摄氏度。

(8)试剂更换为50ml50％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，更换过程如前述，运行1天，运行温度37摄氏度。

(9)试剂更换为50ml70％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，更换过程如前述，运行1天，运行温度37摄氏度。

(10)试剂更换为50ml脱水溶液(75％叔丁醇，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，更换过程如前述，运行2天，期间每日均更换新的50ml脱水溶液，运行温度37摄氏度。

(11)试剂更换为50ml透明溶液(75％苯甲酸苄酯，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，更换过程如前述，运行1天，运行温度37摄氏度。

(12)将步骤(11)得到的透明化头部组织采用光学显微镜进行成像处理，所诉光学显微镜包括共聚焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜。

在人工操作条件下对照实验，以PEGASOS组织透明化技术路线完成小鼠头部组织透明化，对比在反应过程中叠加超声振动和使用摇床，结果表明叠加超声振动后的透明化程度明显优于摇床。在人工操作条件下对照实验，以PEGASOS组织透明化技术路线完成小鼠脑组织透明化，对比在反应过程中叠加超声振动和使用摇床，结果表明叠加超声振动后可实现脑组织高度透明化，并且比使用摇床所需时间更短，从加入25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液开始到实现完全透明化，摇床需要7天，叠加超声振动后只需要2天。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (8)

1.一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，包括：反应容器、超声装置、加样装置、真空装置、温度控制装置、心脏灌注装置和PLC控制器，其中反应容器分别与加样装置、真空装置、温度控制装置、心脏灌注装置相连接，所述各部分装置分别与PLC控制器相连接；所述反应容器中放置有超声装置，将组织与透明化试剂放置于反应容器中，在透明化的某一过程或者全过程中对组织和透明化试剂叠加超声振动，利用超声振动加速透明化试剂向组织中渗透。

2.根据权利要求1所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述超声装置包括超声能量转换器、超声波发生器，所述超声波发生器与超声能量转换器相连接，超声波发生器将工频交流电转换为超声频振荡，以供给超声能量转换器往复振动的能量。

3.根据权利要求2所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述超声能量转换器可分为两组或多组交替运行。

4.根据权利要求1-3之一所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述反应容器包括工作容器、密封装置、金属网标本盒和反应液；所述工作容器分为两部分，工作容器的容器内部中间位置通过设置一密封装置保证气密性；所述工作容器内部设置有金属网标本盒浸泡在反应液中；所述工作容器内部设置有心脏灌注装置，用于对完整动物标本实行心脏灌注；所述工作容器内部设置有压力传感器，用于记录工作容器内的压力；所述工作容器中设置有超声装置，用于在反应过程中对反应液和标本叠加超声振动；所述工作容器外部设置有温度控制装置，用于确保反应在设定的温度进行；所述工作容器外部连接有加样装置，用于自动向工作容器中添加试剂及排除废液；所述工作容器外部连接有真空装置，用于在反应过程中将容器内抽吸为真空状态，减少透明化气泡。

5.根据权利要求1-3之一所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述加样装置包括进液控制阀、流量计、抽液泵、试剂桶及排液控制阀；所述进液控制阀与工作容器和流量计相连，并与PLC控制器电性连接；所述流量计与进液控制阀和抽液泵相连，并与PLC控制器电性连接；所述抽液泵与流量计和试剂桶相连，抽液泵根据试剂种类的数量设置个数，并与PLC控制器电性连接；所述试剂桶根据试剂种类的数量设置个数，与抽液泵相连；所述排液控制阀与工作容器相连，并与PLC控制器电性连接。

6.根据权利要求1-3之一所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述真空装置包括三通控制阀、真空泵、压力传感器；所述三通控制阀与工作容器、真空泵及空气相连，并与PLC控制器电性连接；所述真空泵与三通控制阀相连，并与PLC控制器电性连接；所述压力传感器安置于工作容器内部，与PLC控制器电性连接。

7.根据权利要求1-3之一所述的一种叠加超声振动的自动化组织透明化系统，其特征在于，所述温度控制装置包括温度传感器和加热冷却装置，精确控制反应体系温度，与PLC控制器电性连接；

所述心脏灌注装置包括蠕动泵、连接管；所述蠕动泵与连接管相连，与PLC控制器电性连接；所述连接管穿过蠕动泵，两端分别与反应液、动物左心室穿刺针相连，实现心脏灌注。

8.一种采用权利要求1-7所述系统的叠加超声振动的自动化组织透明化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)实验动物以肝素PBS经心脏灌注，4％PFA经心脏灌注以固定组织；

(2)将步骤(1)处理后的标本解剖，获得所需组织器官标本；

(3)将步骤(2)得到的组织浸泡于4％PFA中室温下固定24小时；

(4)将步骤(3)得到的组织放置于金属网标本盒中，试剂更换为20％EDTA溶液，超声振动运行4天，期间每日均更换新的20％EDTA溶液，运行温度37摄氏度；

(5)试剂更换为去离子水，更换3次，每次超声振动运行30分钟，运行温度37摄氏度；

(6)试剂更换为25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，超声振动运行2天，期间每日均更换新的25％N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺溶液，运行温度37摄氏度；

(7)试剂更换为30％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(8)试剂更换为50％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(9)试剂更换为70％叔丁醇溶液(用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(10)试剂更换为脱水溶液(75％叔丁醇，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行2天，期间每日均更换新的脱水溶液，运行温度37摄氏度；

(11)试剂更换为透明溶液(75％苯甲酸苄酯，25％聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，用N,N,N’,N‘-四(2-羟基丙基)乙二胺将PH值调整到9.5以上)，超声振动运行1天，运行温度37摄氏度；

(12)将步骤(11)得到的透明化头部组织采用光学显微镜进行成像处理，所诉光学显微镜包括共聚焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜。

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