CN106556582A - 一种光透明化生物组织的方法 - Google Patents

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周宏福
刚亚栋
陈瑞希
刘秀丽
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Abstract

本发明公开了一种快速透明化生物组织的方法，通过采用强极性非质子溶剂进行去脂化，强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N‑甲基吡咯烷酮、1,3‑二甲基‑2‑咪唑啉酮、1,4‑二氧六环或2,5‑二甲基呋喃，然后选择特定的折射率匹配试剂中进行透明化处理，折射率匹配试剂的折射率在1.52～1.59之间，实现了生物组织的快速透明化，脱脂化和透明化处理一共仅需18个小时即可实现鼠脑组织的高度透明化，不仅能够实现脑组织透明化，而且可以将各个器官透明化，可以很好的保持生物组织的原始形貌，透明化程度及可重复率高，荧光保持效果好，胞体和神经纤维的荧光信号都较强，应用范围广。

Description

一种光透明化生物组织的方法
技术领域
本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种光透明化生物组织的方法。
背景技术
从完整的生物系统中获取详细的分子水平结构信息是一个跨领域的巨大挑战，可以促进未来整个科技领域的技术进步，特别是从完整的系统组织功能中研究大脑结构与功能之间的关系。一般而言，很多有价值的内部系统关系的统计信息将有助于我们全面的分析完整系统的结构而不是简单的对单个组织的信息重建。要实现在完整的生物系统中研究单个生物组织的分子结构信息依然存在很大的困难，目前有很多方法在研究哺乳动物大脑组织中涉及到断层扫描成像和3D结构重建，尤其是自动断层扫描成像技术已成功应用于探测分子标记的生物组织结构。但是，精细的3D结构重建仍然存在诸多限制。
另一方面，通过降低光散射提高光学显微镜探测深度的整体成像技术已经出现，但不适合进行完整生物组织的分子分型，并且制样需要准备较长时间，在整体上进行分子水平的解析生物组织在生物学上仍是难以克服的难题。
因此，将全脑透明化并结合光学显微成像技术是解决上述问题的有效方法，不仅可以实现多色标记快速多通道成像，而且可以在整体生物组织的基础上达到分子水平研究其结构与功能之间的关系。
然而，现有的生物组织透明化技术分为化学方法和物理与化学结合两种手段，化学方法中的水性试剂透明化时间较长，生物组织膨胀以致影响细胞原始形貌；物理与化学结合的方法是将水性试剂及水凝胶与电场手段结合起来，这种方法的操作流程复杂，可重复性差。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种快速透明化生物组织的方法，其目的在于通过采用强极性非质子溶剂进行去脂化处理，然后选择特定的折射率匹配试剂，与去脂后的生物组织的折射率匹配，实现最大化透明程度，由此解决现有生物组织透明化方法中存在的透明化速度慢、透明化程度不高、可重复性差的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种光透明化生物组织的方法，所述光透明化生物组织的方法包括去脂化步骤：将生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理，得到去脂后的生物组织。
优选地，所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种。
优选地，所述强极性非质子溶剂为1,4-二氧六环。
优选地，所述光透明化生物组织的方法还包括透明化处理步骤：将所述去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理。
优选地，所述折射率匹配试剂为折射率在1.52～1.59之间的液体试剂。
优选地，所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种。
优选地，所述折射率匹配试剂为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
优选地，所述光透明化生物组织的方法具体包括如下步骤：
（1）将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；
（2）将步骤（1）得到的固定后的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；
（3）将步骤（2）得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中在37℃环境下进行去脂化处理6～48小时，得到去脂后的生物组织；
（4）将步骤（3）得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，得到透明化的生物组织。
优选地，步骤（1）所述化学固定手段为采用醛类化合物溶液浸泡固定生物组织。
优选地，所述醛类化合物为甲醛、戊二醛和/或多聚甲醛中的一种或多种。
优选地，步骤（2）所述有机溶剂为可以与水互溶的有机试剂。
优选地，步骤（2）所述有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或异丁醇中的一种或多种。
按照本发明的另一个方面，提供了一种生物组织观察方法，所述生物组织观察方法包括如下步骤：
（1）将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；
（2）将步骤（1）得到的固定后的生物组织采用PBS缓冲溶液漂洗后，再进行免疫组化荧光标记，得到免疫组化标记的生物组织；
（3）将步骤（2）得到的免疫组化标记的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；
（4）将步骤（3）得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理6～48小时，得到去脂后的生物组织；
（5）将步骤（4）得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，得到透明化的生物组织；
（6）将步骤（5）得到的透明化的生物组织采用光学显微镜进行成像处理。
优选地，步骤（6）所述光学显微镜为双光子显微镜或光片显微镜。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。
（1）本发明提供的生物组织光透明化方法采用强极性非质子去脂试剂进行生物组织的去脂化处理，并结合特定的折射率匹配试剂，实现了生物组织的快速透明化，采用1,4-二氧六环进行去脂化处理，采用2-苯氧乙醇进行透明化处理，小鼠脑块的高度透明化仅需18小时。
（2）本发明提供的快速光透明化生物组织的方法透明化程度高，不仅能够实现脑组织透明化，而且可以将各个器官透明化，可以很好的保持生物组织的原始形貌，透明化程度及可重复率高，应用范围广；
（3）本发明透明化工艺简单、采用的试剂便宜易得；
（4）本发明提供的光透明化生物组织的方法适用于外源性荧光染料标记的生物组织的透明化，保存荧光信号强，可以实现生物组织的快速成像，为研究大体积生物组织的神经网络结构提供一种快速方法。
附图说明
图1是本发明提供的光透明生物组织的流程图；
图2是实施例1免疫组化3000μm小鼠脑块的光片显微镜成像；
图3是实施例2小鼠腿部光透明化效果，图3（a）为透明化前，图3（b）为透明化后；
图4是实施例3鼠脑全脑的明化效果，图4（a）为透明化前，图4（b）为透明化后；
图5是实施例4小鼠整体透明化效果，图5（a）为透明化前，图5（b）为透明化后。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供了一种光透明化生物组织的方法，包括去脂化步骤：将生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理。所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种，优选为1,4-二氧六环。
所述光透明化生物组织的方法还包括透明化处理步骤：将去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理。所述折射率匹配试剂为折射率在1.52～1.59之间的液体试剂。所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
图1是本发明提供的光透明生物组织的流程图，本发明所述的光透明化生物组织的方法具体包括如下步骤：
（1）将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；所述化学固定手段为采用醛类化合物溶液浸泡固定生物组织；所述醛类化合物为二元醛化合物，优选为甲醛、戊二醛和/或多聚甲醛中的一种或多种。
（2）将步骤（1）得到的固定后生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；所述有机溶剂为可以与水无限互溶的有机试剂，优选为甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或异丁醇中的一种或多种。
（3）将步骤（2）得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理6～48小时，优选为12～48小时，得到去脂后的生物组织；所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种，优选为1,4-二氧六环。
（4）将步骤（3）得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，优选为6～24小时，得到透明化的生物组织。所述折射率匹配试剂为折射率在1.52～1.59之间的液体试剂。所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
本发明提供的一种生物组织观察方法，包括将生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理步骤，优选地，所述生物组织观察方法具体操作步骤如下：
（1）将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；所述化学固定手段为采用醛类化合物溶液浸泡固定生物组织；所述醛类化合物为二元醛化合物，优选为甲醛、戊二醛和/或多聚甲醛中的一种或多种。
（2）将步骤（1）得到的固定后的生物组织采用PBS缓冲溶液漂洗后，再进行免疫组化荧光标记，得到免疫组化标记的生物组织；
（3）将步骤（2）得到的免疫组化标记的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；所述有机溶剂为可以与水无限互溶的有机试剂，优选为甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或异丁醇中的一种或多种。
（4）将步骤（3）得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理6～48小时，优选为12～48小时，得到去脂后的生物组织；所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种，优选为1,4-二氧六环。
（5）将步骤（4）得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，优选为6～24小时，得到透明化的生物组织；所述折射率匹配试剂为折射率在1.52～1.59之间的液体试剂。所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
（6）将步骤（5）得到的透明化的生物组织采用光学显微镜进行成像处理，所述光学显微镜优选为双光子显微镜或光片显微镜，优选为光片荧光显微镜。
本发明提供的生物组织观察方法，更具体地，包括以下步骤：
（1）将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，采用4%的多聚甲醛在4℃环境中固定24小时；
（2）将固定后的生物组织采用PBS缓冲溶液漂洗12小时后，再进行免疫组化荧光标记，首先采用20%的DMSO和1%的triton X-100打孔，然后加入血清孵育12小时，再加入一抗孵育48小时，漂洗1小时/3次，然后加入二抗孵育8小时，漂洗1小时/3次；
（3）将免疫组化标记的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，脱水按照50%/2小时+75%/2小时+95%/2小时+100%/2小时+100%/12小时的程序进行梯度脱水；
（4）将脱水后的生物组织放入强极性非质子溶剂中进行去脂处理，去脂试剂放在室温中避光保存至生物组织半透明；
（5）将去脂后的生物组织放入折射率匹配试剂中进行透明化处理，匹配试剂在室温中避光保存至生物组织透明；
（6）将透明化的生物组织采用光学显微镜进行成像处理。
本发明提供的光透明化生物组织方法采用强极性非质子溶剂进行去脂化处理，并结合折射率为1.52～1.59之间的无色透明液体试剂作为折射率匹配试剂，实现了生物组织的快速光透明化，且透明化程度很高。所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种，优选为1,4-二氧六环；所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
本发明选择采用的强极性非质子溶剂通过溶解脂质的作用实现除去细胞膜上的脂质的效果，折射率匹配试剂通过将与除去脂质的生物组织折射率相近的试剂充满生物组织间隙，从而使整个生物组织的光折射率一致，实现了整个生物组织的高度、快速透明化，取得了意想不到的技术效果。
按以下方法将实施例进行了各项性能的测试：
荧光强度测试：
样品：3000微米鼠脑冠状面脑片。仪器：奥林巴斯光片荧光显微镜。测试条件：激发光488nm；吸收谱509-600nm；成像间隔5微米。
以下为实施例：
实施例1
（1）将3000μm小鼠脑块采用化学固定手段进行固定处理，采用4%的多聚甲醛在4℃环境中固定24小时；
（2）将固定后的小鼠脑块采用PBS缓冲溶液漂洗12小时后，再进行免疫组化荧光标记，首先采用20%的DMSO和1%的triton X-100打孔12小时，然后加入血清孵育12小时，再加入一抗孵育48小时，漂洗1小时/3次，然后加入二抗孵育8小时，漂洗1小时/3次；
（3）将免疫组化标记的小鼠脑块采用四氢呋喃进行脱水处理，脱水按照50%四氢呋喃/2小时+75%四氢呋喃/2小时+95%四氢呋喃/2小时+100%四氢呋喃/2小时+100%四氢呋喃/12小时的程序进行梯度脱水；
（4）将脱水后的小鼠脑块放入强极性非质子溶剂1,4-二氧六环中，放在室温中避光环境下进行浸渍去脂处理12小时至小鼠脑块半透明；
（5）将去脂后的小鼠脑块放入折射率匹配试剂2-苯氧乙醇（折射率为1.536-1.54）在室温闭光环境下进行透明化浸渍处理6小时，至小鼠脑块透明；
（6）将透明化的小鼠脑块采用光学显微镜进行成像处理。
图2为按照本发明的光透明化方法及显微组织观察方法得到的免疫组化3000μm小鼠脑块的光片显微镜成像结果图，可以看出，小鼠脑块经处理后脑块组织透明化程度高，光片成像效果好，光的穿透率高，荧光保持效果好，胞体和神经纤维的荧光信号都较强；而且透明化速度快，脱脂化处理和透明化一共仅需要18小时，即可将小鼠脑块高度透明化。
实施例2
（1）将小鼠腿部采用化学固定手段进行固定处理，采用4%的多聚甲醛在4℃环境中固定24小时；
（2）将固定后的小鼠腿部采用乙醇进行脱水处理，脱水按照50%乙醇/2小时+75%乙醇/2小时+95%乙醇/2小时+100%乙醇/2小时+100%乙醇/12小时的程序进行梯度脱水；
（4）将脱水后的小鼠腿部放入强极性非质子溶剂1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中进行室温中避光浸渍去脂处理48小时至生物组织半透明；
（5）将去脂后的小鼠腿部放入折射率匹配试剂中进行透明化处理，匹配试剂邻二氯苯（折射率为1.55-1.552）在室温中避光浸渍24小时至生物组织透明；
（6）将透明化的小鼠腿部进行拍照。
图3是本实施例小鼠腿部的透明化前后效果对比图，图3（a）为透明化前，图3（b）为透明化后，本实施例中本实施例中的图3(b)可以看出，小鼠腿部下的网格线清晰可见，同时小鼠腿部中的骨骼部分下的网格线也清晰可见，说明不仅实现了小鼠的肌肉组织透明化，骨骼也同样可以实现透明化。
实施例3
（1）将小鼠全脑采用化学固定手段进行固定处理，采用4%的多聚甲醛在4℃环境中固定24小时；
（2）将小鼠全脑采用四氢呋喃进行脱水处理，脱水按照50%乙醇/2小时+75%乙醇/2小时+95%乙醇/2小时+100%乙醇/2小时+100%乙醇/12小时的程序进行梯度脱水；
（4）将脱水后的小鼠全脑放入强极性非质子溶剂中进行去脂处理，去脂试剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)放在室温中避光浸渍48小时至生物组织半透明；
（5）将去脂后的小鼠全脑放入折射率匹配试剂3-苯氧基苄醇（折射率为1.592-1.594）中进行透明化处理，在室温中避光浸渍12小时至生物组织透明；
（6）将透明化的小鼠全脑进行拍照。
图4是本实施例小鼠全脑的透明化前后效果对比图，图4（a）为透明化前，图4（b）为透明化后，从图4(b)可以看出，鼠脑下的网格线清晰可见，小鼠全脑的透明化程度高，透明化速度较快。
实施例4
（1）将小鼠采用化学固定手段进行固定处理，采用4%的多聚甲醛在4℃环境中固定24小时；
（2）将免疫组化标记的小鼠采用四氢呋喃进行脱水处理，脱水按照50%四氢呋喃/2小时+75%四氢呋喃/2小时+95%四氢呋喃/2小时+100%四氢呋喃/2小时+100%四氢呋喃/12小时的程序进行梯度脱水；
（4）将脱水后的小鼠放入强极性非质子溶剂六甲基磷酰三胺(HMPA)中进行去脂处理，放在室温中避光浸渍48小时至生物组织半透明；
（5）将去脂后的小鼠放入折射率匹配试剂溴苯（折射率为1.558-1.560）中进行透明化处理，在室温中避光浸渍24小时至生物组织透明；
（6）将透明化的小鼠进行拍照。
图5是本实施例小鼠整体透明化前后效果对比图，图5（a）为透明化前，图5（b）为透明化后，从图5(b)可以看出，整鼠的透明化程度高，除小鼠肠中因有食物存在而无法透明化外，小鼠的脑外层的颅骨也同样实现了透明化。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述光透明化生物组织的方法包括去脂化步骤：将生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理，得到去脂后的生物组织。
2.如权利要求1所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述强极性非质子溶剂为甲基丙烯酸甲酯、六甲基磷酰三胺、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、1,4-二氧六环和/或2,5-二甲基呋喃中的一种或多种，优选为1,4-二氧六环。
3.如权利要求1所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述光透明化生物组织的方法还包括透明化处理步骤：将所述去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理。
4.如权利要求3所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述折射率匹配试剂为折射率在1.52～1.59之间的液体试剂。
5.如权利要求3所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述折射率匹配试剂为二苄醚、2-苯氧基乙醇、3-苯氧基苄醇、溴苯、苯甲硫醚和/或邻二氯苯中的一种或多种，优选为2-苯氧基乙醇和/或3-苯氧基苄醇。
6.如权利要求1或2所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述光透明化生物组织的方法具体包括如下步骤：
(1)将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；
(2)将步骤(1)得到的固定后的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；
(3)将步骤(2)得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中在37℃环境下进行去脂化处理6～48小时，得到去脂后的生物组织；
(4)将步骤(3)得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，得到透明化的生物组织。
7.如权利要求6所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，步骤(1)所述化学固定手段为采用醛类化合物溶液浸泡固定生物组织。
8.如权利要求7所述的光透明化生物组织的方法，其特征在于，所述醛类化合物为甲醛、戊二醛和/或多聚甲醛中的一种或多种。
9.如权利要求6所述的透明化生物组织的方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶剂为可以与水互溶的有机试剂，优选为甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或异丁醇中的一种或多种。
10.一种生物组织观察方法，其特征在于，所述生物组织观察方法包括如下步骤：
(1)将生物组织采用化学固定手段进行固定处理，得到固定后的生物组织；
(2)将步骤(1)得到的固定后的生物组织采用PBS缓冲溶液漂洗后，再进行免疫组化荧光标记，得到免疫组化标记的生物组织；
(3)将步骤(2)得到的免疫组化标记的生物组织采用有机溶剂进行脱水处理，得到脱水后的生物组织；
(4)将步骤(3)得到的脱水后的生物组织浸渍在强极性非质子溶剂中进行去脂化处理6～48小时，得到去脂后的生物组织；
(5)将步骤(4)得到的去脂后的生物组织浸渍在折射率匹配试剂中进行透明化处理2～24小时，得到透明化的生物组织；
(6)将步骤(5)得到的透明化的生物组织采用光学显微镜进行成像处理，所述光学显微镜优选为双光子显微镜或光片显微镜。
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