CN105517565A - 组织纤溶酶原激活物抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

<b>本发明提供一种特异性结合至人组织纤溶酶原激活物（</b><b>TPA</b><b>）或</b><b>TPA</b><b>突变体以抑制人纤维蛋白凝块分解的抗体，该抗体具有</b><b>IC50</b><b>﹤</b><b>5nM</b><b>的亚纳摩尔级的亲和力，抑制人纤维蛋白凝块的分解而不影响</b><b>TPA</b><b>酰胺解活性和非纤维蛋白依赖激活，并且</b><b>TPA</b><b>突变体的氨基酸序列与</b><b>SEQ？ID？NO</b><b>：</b><b>1</b><b>或</b><b>SEQ？ID？NO</b><b>：</b><b>2</b><b>具有至少</b><b>65%</b><b>的一致性。进一步提供的是一种该抗体在对</b><b>TPA</b><b>治疗后的病人的系统性出血、脑出血和</b><b>/</b><b>或中风的治疗中的用途，包括给病人施用有效剂量的所述抗体，所述抗体在所述病人体内选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。</b>

Description

组织纤溶酶原激活物抗体及其用途
本发明利用美国政府的由美国国立卫生研究院基金授予的基金号HL58496、HL92750和NS073147(GR)的基金资助下形成。
相关申请的交叉引用
本申请是2014年1月22日提交的PCT国际申请PCT/US2014/012555的国家阶段申请，其要求2013年1月22日提交的序列号为61/755,298的美国临时专利申请的优先权，通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本申请提供一种组织纤溶酶原激活物抗体及其用途，特别是一种针对组织纤溶酶原激活物的单克隆抗体及其在组织纤溶酶原激活物治疗后出现的脑出血和系统出血中的用途。
背景技术
组织纤溶酶原激活物(TPA或tPA)是对缺血性中风的唯一有效治疗手段，而且它也能降低急性心肌梗死病人的死亡率(DomnanGA，DavisSM，ParsonsMW，MaH，DeweryHM，HowellsDW.如何在急性缺血性中风中更好地使用溶栓治疗(Howtomakebetteruseofthrombolytictherapyinacuteischemicstroke)，自然神经学综述(NatRevNeurol)，2011；7:400-409)。然而，TPA疗法会明显增加严重或致命性出血的风险。TPA治疗后的颅内出血会造成严重后果，并且大约1％的接受TPA治疗的中风病人会严重致残或产生致命性出血(SaverJL.中风溶栓疗法后的出血：临床相关病例数(Hemorrhageafterthrombolytictherapyforstroke:theclinicallyrelevantnumberneededtoharm)，卒中(Stroke)，2007；38:2279-2283。相似地，0.9-1.0％的接受TPA治疗的心肌梗死病人发生颅内出血且发生颅内出血的病人中超过50％死亡(GurwitzJH，GoreJM，GoldbergRJ，等.急性心肌梗死组织纤溶酶原激活物治疗后的颅内出血的危险.国家心肌梗死注册登记2(Riskforintracranialhemorrhageaftertissueplasminogenactivatortreatmentforacutemycocardialinfarction.ParticipantsintheNationalRegistryofMycocardialinfarction2).美国内科年鉴(AnnInterMed).1998；129:597-604)。尽管出血并发症常见于老年人，在儿童中同样存在由TPA导致的显著性出血的危险(GuptaAA,LeakerM,AndrewM,等.使用组织纤溶酶原激活物治疗儿童血管内血栓的溶栓安全性和效果(Safetyandoutcomesofthrombolysiswithtissueplasminogenactivatorfortreatmentofintravascularthrombosisinchildren).儿科杂志(JPediatr).2001；139:682-688)。对出血并发症的担心减少了对病人的TPA治疗用药，尽管这些病人可能会在某些方面受益((SaverJL.中风溶栓疗法后的出血：临床相关病例数(Hemorrhageafterthrombolytictherapyforstroke:theclinicallyrelevantnumberneededtoharm).卒中(Stroke).2007；38:2279-2283)。
一旦发生TPA诱发的出血，没有合适的特异性TPA抑制剂或解毒剂来治疗出血。为了恢复凝血，病人被频繁施用冷凝蛋白质、新鲜冰冻血浆、以及血小板，而上述这些疗法的有效性还没有取得决定性证据(MorgensternLB,HemphillJC,3rd,AndersonC等.自发性颅内出血指南：美国心脏协会/美国中风协会医疗用指南(Guidelinesforthemanagementofspontaneousintracerebralhemorrhage:aguidelineforhealthcareprofessionalsfromtheAmericanHeartAssociation/AmericanStrokeAssociation).中风(Stroke).201041:2108-2129)。抗纤维蛋白溶解剂如凝血酸、ε-氨基己酸、抑肽酶及新型纤溶酶抑制剂已被使用，但也仅在有限的范围内。不幸地是，这些试剂不仅抑制纤溶酶原(Pg)激活系统，也干扰其他分子途径。如，抑肽酶影响纤溶酶活性以及血管舒缓素系统，并且诱发严重过敏(Munozjj,BirkmeyerNJ,BirkmeyerJD,O'ConnorGT,DaceyLJ.利用心脏手术元分析分析ε-氨基己酸是否和抑肽酶一样有效地降低出血(Isepsilon-aminocaproicacidaseffectiveasaprotinininreducingbleedingwithcardiacsurgeryameta-analysis).循环(Circulation).999；99:81-89)。
对TPA诱发出血的机理仍知之甚少。相对于链激酶，TPA的纤溶酶原激活被纤维蛋白显著地放大，而且TPA的这种显著特性预计会增强纤维蛋白溶解而不增加出血并发症。然而，由TPA产生的过量纤溶酶可能会降解血液循环中的凝血因子，其影响凝血并且可能会加剧体内出血。TPA是一种通过其催化和非催化作用而发挥功效的多结构域分子。实验证明TPA的非催化活性(比如不引起纤溶酶原激活的)引起血脑屏障的分解并且是一些TPA诱发的脑出血产生的原因。TPA诱发的脑出血是否与TPA的催化活性有关也同样不清楚。TPA疗法对于缺血性中风和心肌梗死的治疗是有益的，但由于一些病人出现的严重或致命性脑部或其他位的出血又使该疗法复杂化。对TPA诱发的出血的担心已经限制了TPA的治疗应用。TPA诱发的出血和预后不良在长期局部缺血后更加常见。相似地，在实验性脑中风中，长期局部缺血后，TPA可反复地引起脑缺血、血脑屏障分解并加剧神经细胞死亡。
在非血栓性中风模型中，证据表明TPA可通过机制产生毒性，比如PDGF-CC断裂等，其不需要纤溶酶原激活或影响溶解纤维蛋白活性(SuEJ,FredrikssonL,GeyerM等.缺血性中风中被组织纤溶酶激活的PDGF-CC的活性损害血脑屏障的完整性(ActivationofPDGF-CCbytissueplasminogenactivatorimpairsblood-brainbarrierintegrityduringischemicstroke.).自然医学(NatMed).2008；14:731-737)。在如中风和心肌缺血的病理条件下，治疗性TPA的溶解纤维蛋白活性被提高的循环纤维蛋白片段(例如D-二聚体)水平所增强，其可以增强出血过程(BarberM,LanghorneP,RumleyA,LoweGD,StottDJ.D-二聚体预示缺血性中风的早期进展：常规临床检测确证(D-dimerpredictsearlyclinicalprogressioninischemicstroke:confirmationusingroutineclinicalassays).卒中(Stroke).2006；37:1113-1115)。
发明概述
本概述描述了本公开主题的多种实施方案，并且，在多种情况中，列出了这些实施方案的变化和变换。本概述仅仅是多种变化的实施方案的示例。给定的实施方案所提及的一或多个代表性特征同样是示例性的。这类实施方案中可以包含或不包含所提及的特征；同样地，这些特征可以应用于本公开主题的其他实施方案中，无论是否在本概述中列出。为避免过分重复，本概述不列出或示出这些特征的可能组合。
本发明通过提供可尤其抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解的抗体及其抗原结合片段满足上述需求及其相关。本发明的部分基于发现，即发现组织纤溶酶原激活物通过一种纤维蛋白依赖机制唯一地激活纤溶酶原，而纤溶酶原在缺血性中风中导致脑出血。协同单克隆抗体通过减少TPA治疗后的脑出血、手术出血和脑部细胞死亡阻断这种行为。
在一些实施方案中，本发明提供特异性地结合至人组织纤溶酶原(TPA)或TPA突变体的分子。该分子具有亚纳摩尔级亲和力以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原活性，IC50﹤50nM。所述TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65％的一致性。在一些实施方案中，该分子不抑制人纤维蛋白凝块的降解，不影响TPA酰胺解活性或者非纤维蛋白依赖激活。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了一种用于TPA治疗后的病人所出现的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗方法。该方法包括给所述病人施用有效剂量的所述分子，其中所述分子选择性地抑制上述病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。在一些实施方案中，所述分子可以是抗体或抗体结合片段。
本发明的一些实施方案进一步提供一种提纯或分离的抗体，该抗体特异性结合至组织纤溶酶原激活物(TPA)并且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解。在一些实施方案中，本发明公开了一种提纯或分离的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性结合至TPA分子以抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解。更特定地，所述分离的单克隆抗体确定为可选择性地抑制纤维蛋白放大的纤溶酶原激活的TPAi-14和/或TPAi-23。
在本发明的一些实施方案中，提出一种由药物组合物和药物载体，该药物组合物由有效剂量的可治疗TPA诱发的系统性出血和脑出血的抗体构成。
本发明的一些实施方案进一步提供一种特异性结合至人组织纤溶酶原激活物(TPA)或TPA突变体的提纯或分离的抗体。在一些实施方案中，TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65％的一致性。在一些实施方案中，抗体具有亚纳摩尔级亲和性以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，IC50﹤5nM。在一些实施方案中，抗体不抑制人纤维蛋白凝块的降解，不影响TPA酰胺解活性或者非纤维蛋白依赖激活。
本发明的一些实施方案更进一步提供一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血、脑出血和/中风的方法，包括给所述病人施用有效剂量的抗体，其中所述抗体选择性地抑制病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
本发明的一些实施方式提供了一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血的试剂盒。该试剂盒包括特异性结合至TPA以抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的提纯或分离的抗体及其在治疗系统性出血、脑出血和/或中风中的说明。
本发明的一些实施方案进一步提供一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血的方法。该方法包括给病人施用有效剂量的至少一种提纯或分离的抗体，所述抗体能够结合至TPA表位。在一些实施方案中，该抗体在病人中特异性地抑制纤维蛋白放大的纤溶酶原激活。本发明在一些进一步的实施方案中，提纯或分离的抗体中的至少一种为以高亲和性结合至TPA不同表位的TPAi-14或TPAi-23或TPAi-14和TPAi-23。
本发明公开的一些实施方案进一步提供一种鉴别可抑制TPA诱发的人纤维蛋白溶解的分子的方法。该方法包括如下步骤：提供特异性地结合至TPA且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的单克隆抗体，固定所述单克隆抗体到一表面，提供TPA且引入一种阻断所述TPA的非特异性结合区域的试剂，引入一种候选分子至所述TPA，引入所述TPA至所述单克隆抗体，确定所述候选分子是否已结合至TPA表位，该表位是所述单克隆抗体结合至TPA的位置，任何结合至所述表位的候选分子确定作为能够抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的分子。
本领域的普通技术人员在研究本文的说明书、附图和非限制性实施例后，可明确得知本发明的优点。
附图说明
图1A-D示出了TPA诱发的人纤维蛋白溶解的抑制。
其中，图1A示出了通过ELISA评价的单克隆抗体(mAbs)至人TPA的整合、单克隆抗体(mAbs)至BSA(对照(ctrl))的整合；
图1B示出了人纤维蛋白溶解启动的终止。人血浆凝块的纤维蛋白溶解在不同浓度TPA非反应性对照抗体(对照(ctrl))、TPAi-14、TPAi-23和具有稳定活性的PA1-1突变体存在下通过0.5nMTPA诱发，2小时后测量纤维蛋白溶解百分比，抑制百分比按所述方法进行测量，至少三组独立实验的数据表示为平均值±标准差；
图1C示出了TPA单克隆抗体(mAb)的半数最大抑制浓度(IC50)，按所述方法自每一mAb或PAI-1(B)的剂量响应曲线计算IC50(平均值±标准差，95％CI)；
图1D示出了持续纤维蛋白溶解的终止。利用上述0.5nMTPA启动纤维蛋白溶解，1小时后加入抑制剂(25nM)，1和3小时时测量纤维蛋白溶解，并且计算相对于对照mAb的抑制百分比。
图2A-D示出了TPAi-14和TPAi-23的结合和抑制特异性的比较。
其中，图2A示出了TPAi-14和TPAi-23不竞争与TPA的结合，通过所述的竞争性结合ELISA法检测未标记的mAb是否抑制HRP标记的mAb对微孔板孔的孔中所负载的TPA的结合。TPAi-14抑制HRP标记的TPAi-14而不抑制TPAi-23；相似地，TPAi-23抑制HRP标记的TPAi-23而不抑制TPAi-14；
图2B示出了结合特异性，通过ELISA法检测A370nm处的mAb对TPA、TPA-PAI-1复合物和BSA(对照)包覆的孔的结合，为方便比较，抗PAI-1mAbMA-33HIF7对PAPAI-1孔的结合也见于该图；
图2C示出了人TPA而不是小鼠TPA对纤维蛋白溶解的特异性抑制，用5nM抗TPAmAb存在下的0.5nM人TPA或100nMTPAi-14存在下的2nM小鼠TPA诱发人血浆凝块的纤维蛋白溶解，用100nM的抗TPAmAb存在下的100nM人TPA或800nMTPAi-14存在下的160M小鼠TPA诱发小鼠血浆凝块的纤维蛋白溶解，加入TPA2小时后测定人或小鼠纤维蛋白溶解抑制的百分比；
图2D示出了对由TPA而非其他纤溶酶原激活物诱发的纤维蛋白溶解的特异性抑制，用5nMTPA非反应性mAb(对照)、抗TPAmAbTPAi-14和TPAi-23、PAI-1或抗uPA抑制mAbuPA-394存在下的40nMSAK或2.5单元uPA诱发人血浆凝块的纤维蛋白溶解，加入SAK或uPA2小时后测定人纤维蛋白溶解的抑制百分比，结果表示为至少两组独立实验的平均值±标准差。
图3A-D示出了TPAi-14和TPAi-23对TPA的抑制机制。
其中，图3A1、2A2示出了TPAi-14和TPAi-23不影响TPA利用三肽底物的酰胺解或催化活性，在10倍摩尔过量(1μM)TPA非反应性对照mAb(圆环)、TPAi-14(实心方块)或TPAi-23(阴影三角)存在下在405nm(左侧(leftpanel))处监测人TPA(100nM)的S2288断裂，按所述方案测量mAb对相关TPA活性(右侧(rightpanel))的影响且相对于对照mAb标准化；
图3B1、3B2示出了TPAi-14和TPAi-23不影响纤维蛋白存在下TPA利用三肽底物在的酰胺解或催化活性，利用S2288检测(左侧)测定在0.5μM对照、TPAi-14或TPAi-23和0.05mg/ml纤维蛋白片段存在下的50nM人TPA的酰胺解活性，且计算上述的相关TPA活性(右侧)；图3C1、3C2示出了在10倍摩尔过量(200nM)的对照mAb、TPAi-14或TPAi-23存在下的S2251测定对Glu-Pg(100nM)用TPA(20nM)对纤溶酶的激活进行的检测，记录405nM处的吸光度(右侧)，如方法部分描述的，通过反应初始阶段A405nm处每平方秒的变化值计算TPA的纤溶酶原激活比率，并且相对于对照mAb(右侧)标准化，对照和TPAi-23之间的差异是显著的(*p＝0.00006)；
图3D1、3D2示出了在10倍摩尔过量(10nM)的对照mAb、TPAi-14或TPAi-23和0.05mg/ml纤维蛋白片段存在下测定的Glu-Pg(100nM)用TPA(1nM)对纤溶酶的激活，对照和TPAi-14(*p＝0.002)或和TPAi-23(**p＝0.00006)之间的差异是显著的，所有数据表示为至少三组实验的平均值±标准差。
图4A-B示出了TPAi-14或TPAi-23对纤维蛋白溶解的协同抑制。
其中，图4A示出了TPAi-14或TPAi-23单独存在(0.5-1nM)或共同存在(各0.5nM)下0.5nMTPA对人血浆凝块的纤维蛋白溶解的诱发，如方法部分描述的，2小时后测量纤维蛋白溶解的抑制百分比，结果表示为至少三组实验的平均值±标准差；
图4B示出了TPAi-14或TPAi-23或二者组合存在下的上述人血浆凝块的纤维蛋白溶解的测定，TPAi-14或TPAi-23单独的剂量或其组合的剂量达到50％时，纤维蛋白溶解抑制见该图所示的等效应图(参见BerenbaumMC.试剂组合的预期效果：一般的解决办法(Theexpectedeffectofacombinationofagents:thegeneralsolution).理论生物学杂志(JTheorBiol)1985；114:413-431.)。该图示出了表示协同性、加和性和拮抗性的假设等效应线。
图5A-E示出了纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活的抑制作用减少TPA治疗中风后的脑出血、手术出血和梗死。MCA血栓栓塞诱发缺血性中风。用标准TPA剂量对小鼠进行处理2.5小时后，接着施用等摩尔剂量的TPAi-14和TPAi-23(n＝5)或空白(对照，n＝5)。TPA输注后测定出血时间。栓塞后6小时，麻醉的小鼠被无痛处死、输注，且如方法部分所描述的，收取脑部检查出血和梗死。其中，图5A是对照组和处理组的小鼠脑部组织切片的出血图片；图5B示出了脑出血的总百分比；图5C示出了脑的区域梗死的百分比；图5D示出了尾巴出血时间；图5E示出了出血时间内的总血红蛋白(Hgb)损失。**p<0.01,***p<0.001,*p<0.0001相比对照。
序列表简介
SEQIDNO:1是一种人组织纤溶酶原激活物，GenBank登录号AAA01378.1的氨基酸序列。
SEQIDNo:2是一种人组织纤溶酶原激活物，GenBank登录号AAA01895.1的氨基酸序列。
发明详述
本文阐述了其所公开主题的一或多个具体实施方案。本领域普通技术人员在研究了本文公开的内容之后，对本文公开的实施方案所做的变换都是显而易见的。本文公开的内容，特别是实施方案中的特定细节，是为了便于理解清晰，而非限制。若有冲突，对照本文说明书，包括定义。
此处公开的某些核酸序列交叉引用了GENABANK登录号。交叉引用GENBANK数据库的序列通过引用明确并入本文，且该序列及与其相关的序列存在于GENBANK数据库或其他公共数据库。通过引用明确并入的还有GENBANK数据库中与上述序列相关的所有注释。
虽然本文出现的术语能够被本领域普通技术人员很好的理解，仍然对其定义进行了阐述以有利于解释本文公开的主题。
除非另有定义，本文出现的所有科技术语为所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。本文就实施或测试本文公开的主题的代表性方法、设备和物质进行了描述，与其相近或等同的任何方法、设备和物质也可用于本发明中。
根据长期存在的专利法惯例，本发明所用的术语“一”指“一或多”，包括权利要求书中出现的“一”亦然。从而，如“一细胞”表示多个此种细胞，等等。
除非另有所指，说明书和权利要求书中表示成分、性质的数字，如反应条件等，均是可上下浮动的“大约”值。因此，除非另有说明，说明书和权利要求中出现的数值参数是随期望值变化的近似量。
如术语“大约”，当其修饰表示质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的数值时，在某些实施方案中，表示质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的实际值可在所述数值的±20％之内，在某些实施方案中在±10％之内，在某些实施方案中在±5％之内，在某些实施方案中在±1％之内，在某些实施方案中±0.5％之内，在某些实施方案中在±0.1％之内，上述范围适于本文所公开的方法。
本发明涉及抗体的分离和用途，该抗体作为TPA诱发的脑出血和手术出血中的纤维蛋白依赖的纤溶酶原的活性的特异性抑制剂。更特别地，某些单克隆抗体作为抑制物且比纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)更有效力地协同降低纤溶酶原活性和纤维蛋白溶解。在血栓栓塞性中风模型中，这些抑制剂显著减少TPA施用后的脑出血和手术出血。
本发明的一些实施方案提供一种用于特定地结合至人组织纤溶酶激活物(TPA)或TPA突变体以抑制人纤维蛋白凝块降解的分子。在一些实施方案中，该分子具有亚纳摩尔级亲和力以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原活性，IC50﹤50nM。在一些实施方案中，该分子不影响TPA酰胺解活性或者非纤维蛋白依赖的激活。在一些实施方案中，所述TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65％的同一性。TPA突变体因此可以具有与这些序列高于65％的同源性，比如70％，75％，80％，85％，90％，95％等。一个非限制性的TPA突变体是瑞替普酶，其是具有TPA全长67.7％基的TPA缺失突变体。在一些实施方案中，人TPA的氨基酸序列是SEQIDNO：1或SEQIDNO：2。在一些实施方案中，所述分子是抗体。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，本发明进一步提供了一种用于TPA治疗后的病人所出现的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗方法。该方法包括给所述病人施用有效剂量的所述分子，其中所述分子选择性地抑制上述病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。在一些实施方案中，本发明提供一种包含所述分子和可接受的医药载体的药物组合物。
活的有机体内的TPA诱发的脑出血和系统性出血被TPA纤维蛋白依赖纤溶酶原激活的强协同抑制剂所阻断。这意味着出血和纤溶酶原激活的TPA纤维蛋白靶向机制有关，而且此过程的这种靶向抑制剂可以作为TP相关出血的特定解毒剂。TPA疗法在缺血性中风和心肌梗死中是有益的，但一些病人的严重或致命性脑部或其他位点出血使TPA疗法复杂化。对TPA诱发的出血的担心已经限制了TPA的治疗性应用。在人体中，TPA诱发的出血及不利后果在长期的局部缺血后更加常见。相似地，在试验性脑中风中，长期局部缺血后，TPA可重复地引起脑缺血、血脑屏障分解及加剧神经细胞死亡。在非血栓性中风模型中，证据表明TPA可通过机制产生毒性，比如PDGF-CC分裂等，其不需要激活纤溶酶原或影响溶解纤维蛋白活性(SuEJ,FredrikssonL,GeyerM等.缺血性中风中被组织纤溶酶激活的PDGF-CC的活性损害血脑屏障的完整性(ActivationofPDGF-CCbytissueplasminogenactivatorimpairsblood-brainbarrierintegrityduringischemicstroke).自然医学(NatMed).2008；14:731-737。在如中风和心肌缺血的病理条件下，治疗性TPA的溶解纤维蛋白活性被增强的循环纤维蛋白片段(例如D-二聚体)水平所增强，其可以增强出血过程(BarberM,LanghorneP,RumleyA,LoweGD,StottDJ.D-二聚体预示缺血性中风的早期进展：常规临床检测确证(D-dimerpredictsearlyclinicalprogressioninischemicstroke:confirmationusingroutineclinicalassays).卒中(Stroke).2006；37:1113-1115。
除TPA的治疗用途之外，增高的TPA水平与过量的系统性出血相关。TPA诱发的出血被疑与病人的后心肺旁路有关。(参见ManjiRA,GrocottHP,LeakeJ等，心脏手术后的癫痫：凝血酸和其他风险因子的影响(Seizuresfollowingcardiacsurgery:theimpactoftranexamicacidandotherriskfactors).加拿大麻醉杂志(CanJAnaesth).2012；59:6-13)。以此类推，在如肝衰竭和移植等病状下，高水平的循环TPA与出血相关联(参见LeiperK,CrollA,BoothNA,MooreNR,SinclairT,BennettB，LeiperK,CrollA,BoothNA,MooreNR,SinclairT,BennettB.肝脏疾病中的组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂、及激活物-抑制剂复合物(Tissueplasminogenactivator,plasminogenactivatorinhibitors,andactivator-inhibitorcomplexinliverdisease).临床病理学杂志(JClinPathol).l.1994；47:214-21)。纤维蛋白溶解抑制剂(例如，凝血酸，ε-氨基己酸，抑肽酶等)降低手术后输血的风险(参见Bayes-GenisA,MateoJ,SantaloM,etal.D-二聚体是具有胸部疼病人痛冠状动脉缺血的早期诊断标志物(D-Dimerisanearlydiagnosticmarkerofcoronaryischemiainpatientswithchestpain).美国心脏杂志(AmHeartJ).2000；140:379-384)。然而这些试剂对其他通路具有广泛的抑制作用和毒性。比如，凝血酸增加了心脏手术后的癫痫风险。(参见ManjiRA,GrocottHP,LeakeJ等，心脏手术后的癫痫：凝血酸和其他风险因子的影响(Seizuresfollowingcardiacsurgery:theimpactoftranexamicacidandotherriskfactors).加拿大麻醉杂志(CanJAnaesth).2012；59:6-13)。纤维蛋白溶解的广泛抑制可带来后续血栓栓塞的风险如中风，血栓栓塞等危险(参见FergussonDA,HebertPC,MazerCD等.抑肽酶和赖氨酸类似物在高风险心脏手术中的比较(Acomparisonofaprotininandlysineanaloguesinhigh-riskcardiacsurgery).新英格兰医学杂志(NEnglJMed).2008；358:2319-2331)。这种担忧被抑肽酶的使用增强术后死亡率的非预期结果放大(参见FergussonDA,HebertPC,MazerCD等.抑肽酶和赖氨酸类似物在高风险心脏手术中的比较(Acomparisonofaprotininandlysineanaloguesinhigh-riskcardiacsurgery).新英格兰医学杂志(NEnglJMed).2008；358:2319-2331)。
治疗TPA诱发的出血的抗纤维蛋白溶解剂的使用仍然受限，这可能是由于这些试剂会干扰其他生物通路。PAI-1或PAI-1突变体抑制术后的TPA诱发的出血已被证明。然而，除了抑制TPA，PAI-1还抑制uPA和其他一些蛋白酶。通过和玻连蛋白、肝素、低密度脂蛋白受体家族成员及其他分子的非蛋白酶相互作用，PAI-1对多种其他生物学过程具有多效性影响并且和多种疾病过程中的病理情况都有涉及。因此PAI-1在血管再生、细胞凋亡、细胞迁移和癌症中具有发挥抑制和非抑制功能的重要作用。
本发明的一个目的是制备一种具有亚纳摩尔级解离常数的对TPA具有特异性的分子(抗体-抗原亲和力的定义和测定综述(forareviewonthedifinitionsandmeasurementsofantibody-antigenaffinity)，参见Nerietal.(1996).TrendsinBiotechnol.14,465-470)。
本发明使用的术语“突变体”包括序列大体上与TPA相似的肽。与参考肽大体相似的氨基酸序列可以产生与参考肽在生理学、化学或功能性质上无实质性变化的突变肽在本领域是公知的。在这种情况下，参考肽和突变肽能被认为是基本等同的多肽。序列一致性用于计算两条序列的相似性；其通过计算两个序列对齐以具有最大的基位置一致性时所具有的相同基的百分比来测定。任何已知的方法都可被用作计算序列一致性；比如计算机软件。序列一致性能够通过BLAST-P、BLAST-N或FASTA-N软件或其他任何本领域已知的可用软件来计算。本发明的基本一致序列的序列一致性可以是至少65％。在其他实施方案中，基本一致序列的序列一致性可以是65、70、75、80、85、90、95或100％。
本发明使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们显示出期望的生物学活性。本发明使用的术语“单克隆抗体”是指从大大体上同源的抗体群中获得的抗体，即，除合理的自然突变外，构成群的各单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，直接对准单一抗原位点。如，本发明中有用的单克隆抗体能够通过Kohler等在自然杂志(Nature)256:495(1975)中描述的杂交瘤细胞方法制备，或者在细菌、真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见，如，专利号US4,816,567公开的专利文献)。此外，“单克隆抗体”也可以采用如Clackson等在自然杂志(Nature)352:624-628(1991)及Marks等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol)222:581-597(1991)中描述的方法从噬菌体抗体库中分离。
本发明中使用的单克隆抗体包括“嵌合的”抗体，及这些抗体的片段，只要它们显示出期望的生物学活性，其中其重链和/或轻链部分与源自特定种类的或属于特定抗体类或抗体子类的相关抗体序列一致或同源，而链的其余部分与源自其它种类的或属于其它抗体类或抗体子类的相关抗体序列一致或同源(参见专利号为US4,816,567的专利文献和Morrison等，美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:6851-6855(1984))。
本发明使用的术语“抗体”(Ab)也包括抗体片段。“抗体片段”是完整抗体的部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变区，包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；及diabody；及线性抗体(参见专利号为US5,641,870的专利文献中公开的实施例2；Zapata等，蛋白质工程(ProteinEng).8(10):1057-1062[1995])；及单链抗体分子；抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明的一些实施方案提供了一种提纯或分离的抗体。这些抗体特异性地结合至组织纤溶酶原激活物(TPA)并抑制tPA诱导的人凝块纤维蛋白溶解。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体是抗体结合片段、嵌合抗体、双特异性抗体、人抗体或人源化抗体。单克隆抗体包括但不限于TPAi-14和TPAi-23。TPAi-14和TPAi-23二者均选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶蛋白溶解激活。抗体TPAi-14和TPAi-23结合至tPA的不同表位。在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物。该组合物包括足以治疗系统性出血、脑出血、和/或中风的有效剂量抗体和医药学可接受的载体。
“纯化或分离的抗体”是从其所述自然环境中识别、分离、回收的组分。抗体所处自然环境中的污染组分影响抗体在诊断或治疗中的功能，污染组分可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。优选的，(1)至通过Lowry方法测定的抗体重量的95％以上，并最优选大于99％重量，(2)至足以通过采用转杯式测序仪(spinningcupsequenator)得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)至在还原或非还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体所处自然环境的至少一种组分会不存在。
在本发明的一些实施方案进一步提供一种特异性地结合至人纤溶酶原激活物(TPA)或TPA突变体以抑制人纤维蛋白凝块分解的提纯或分离的抗体。在一些实施方案中，抗体具有亚纳摩尔级亲和性以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，IC50﹤5nM。在一些实施方案中，抗体不影响TPA的酰胺解活性或非纤维蛋白依赖的激活。在一些实施方案中，TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65％的一致性。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
本发明的一些实施方案更进一步提供一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血、脑出血和/中风的方法，包括给所述病人施用有效剂量的抗体，其中所述抗体选择性地抑制病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。本发明的一些实施方案提供一种药物组合物，该药物组合物包括抗体和可接受的医药载体。
本发明的一些实施方式提供了一种能够在TPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血的试剂盒。该试剂盒包括特异性结合至TPA以抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的提纯或分离的抗体及其在治疗系统性出血、脑出血和/或中风中的说明。
本发明的一些实施方案进一步提供一种能够在tPA治疗后的病人需要时治疗所出现的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗方法，该方法包括给所述病人施用有效剂量的所述分子，其中所述抗体选择性地抑制上述病人的纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。在某些实施方案中，抗体选自包含人抗体、小鼠抗体和单克隆抗体的组。而在某些实施方案中，所述抗体是抗体结合片段、嵌合抗体、双特异性抗体或人抗体或人源化抗体。所治疗的病人情况包括但不限于TPA治疗后的缺血性中风和急性心肌梗死。在某些实施方案中，抗体减少tPA诱导的脑部出血和手术出血。在某些实施方案中，抗体抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。在某些实施方案中，抗体抑制纤维蛋白溶解的启动。在某些实施方案中，抗体抑制过程中的纤维蛋白溶解。在某些实施方案中，抗体减少脑出血、手术出血和脑部细胞死亡。纯化或分离的抗体包括但不限于TPAi-14和TPAi-23。TPAi-14和TPAi-23二者都选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活，并且TPAi-14和TPAi-23二者都高亲和力地结合至tPA上的不同表位。在某些实施方案中，TPAi-14和TPAi-23一起使用且协同抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。
本发明的组合物包括“有效量”或“治疗有效量”或“预防有效量”的所述抗体或抗原结合部分。这些术语可以相互替换。“治疗有效量”是指在剂量或必需时间周期上达到期望治疗效果的有效的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以随疾病阶段、年龄、性别、治疗对象的体重和抗体或抗体部分在治疗对象内所产生的期望反应而变化。在此使用的剂量单元形式是指物理上的离散单元，适合治疗哺乳动物对象的单元剂量；每个单元包括计算得出的预定量的活性物质，以联合所需的医药载体产生期望的治疗效果。
本发明的一些实施方案涉及能够在治疗对象需要治疗手段时抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解的抗体和/或其抗原结合片段构成的组合物。在一些实施方案中，治疗对象是人。在另一些实施方案中，治疗对象是兽医学范畴的对象。治疗包括施用一种或多种抗体和/或其抗原结合片段，其可单独的或协同医药上可接受的载体抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。
本发明公开的一些实施方案进一步提供一种鉴别可抑制TPA诱发的人纤维蛋白溶解的分子的方法。该方法包括如下步骤：提供特异性地结合至TPA且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的单克隆抗体，固定所述单克隆抗体到一表面，提供TPA且引入一种阻断所述TPA的非特异性结合区域的试剂，引入一种候选分子至所述TPA，引入所述TPA至所述单克隆抗体，确定所述候选分子是否已结合至TPA表位，该表位是所述单克隆抗体结合至TPA的位置，任何结合至所述表位的候选分子确定作为能够抑制TPA诱导的人纤维蛋白溶解的分子。所述单克隆抗体包括但不限于TPAi-14和TPAi-23。在一个具体实施例中，TPAi-14被固定在微量滴定板的孔中。非特异性蛋白结合位点被阻断。预培养的TPA和潜在的新抑制剂分子的混合物被加入到固定有TPAi-14的孔中。1小时后，洗涤孔，加入耦合过氧化物酶的多克隆抗TPA抗体。1小时后，洗涤孔，加入过氧化物酶底物TMB，监测A370。A370减少的孔中含有与TPAi-14竞争TPA结合的分子，由此该分子作为TPA抑制剂的主要候选。这会在由TPA启动的人凝块溶解的详细研究证实。
本发明公开的主题进一步在如下特定而非限制的实施例中进行描述。
实施例：TPAi-14和TPAi-23对于人TPA诱发的纤维蛋白溶解的抑制效果具有特异性。
一旦发生TPA诱发的出血，目前尚无具有特异性的疗法。TPA治疗中提出了许多新方法来预防脑出血。证实抑制TPA诱导的NF-kB和基质转移蛋白酶信号通路的神经保护剂(如，自由基清除剂和活性蛋白C)减少TPA诱发的脑出血，但是它们对系统性出血的效果还未知。
在本研究中，TPA的纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活的特异性抑制减少脑出血和手术出血。这些特异性抑制剂也减少神经损伤并且具有减少脑肿胀的趋势。
和PAI-1相比，单克隆抗体(mAb)的抑制效果更特异且更受限。TPAi-14和TPAi-23都选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。然而，它们不抑制在缺乏纤维蛋白时TPA对纤溶酶原激活的催化能力，它们也不影响TPA对于小肽底物的催化活性。和具有超稳定性和强抑制活性的重组PAI-1突变体相比，这些mAb是对TPA诱发的纤维蛋白溶解的更有效和更特异的抑制剂，而且不影响其他纤溶酶原激活物。这些mAb的亲和力也限制了它们对TPA水平的病理性或药理上的提高的抑制功能。这是由于，凭借0.1-0.3nM的KDS，在TPA浓度≧1nM的条件下它们有效地抑制了TPA活性，但是在TPA是生理条件水平时，如低于0.5nM，它们的的抑制作用弱。
TPAi-14和TPAi-23是具有结合至TPA分子上不同位点的高亲和性的单克隆抗体。在机理研究中，TPAi-14和TPAi-23特异地抑制TPA的纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，但不抑制纤维蛋白非依赖的纤溶酶原激活，也不抑制TPA对于小底物的催化活性。TPAi-14和TPAi--23协同作用以抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解。与纤溶酶原激活物抑制剂-1突变体相比，TPAi-14和TPAi-23以更强的效能和特异性抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。在模拟人中风的鼠类血栓栓塞模型中，当TPA治疗引发后施用，TPAi-14和TPAi-23减少脑出血(5倍，p﹤0.01)和手术出血(4倍，p﹤0.01)以及脑细胞死亡。综上所述，这些数据表明TPA的纤溶酶原的纤维蛋白依赖的激活导致中风的出血和不良后果。这个过程的选择性抑制剂对于治疗TPA诱发的出血被证实是有用的。
原料
试剂采购于如下来源：DMEM高葡萄糖培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素溶液，L-谷氨酸，山羊抗小鼠(H+L)琼脂糖(英潍捷，格兰德岛，纽约(Invitrogen,GrandIsland,NY))；人TPA(基因泰克，旧金山，加利福尼亚(Genentech,S.SanFrancisco,CA))；人尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)(雅培药厂，北芝加哥，伊利诺伊(AbbottLaboratory,NorthChicago,IL))；重组葡激酶(葡激酶，ProSpec-TanyTechnogene，东布伦瑞克，新泽西(SAK，ProSpec-TanyTechnogene,EastBrunswick,NJ))；鼠TPA，人PAI-1突变体(4个氨基酸替代物，N150H,K154T,Q319L,和M3541)，鼠抗人PAi-7抗体MA-33HHIF7(分子创新，诺维，密歇根(MolecularInnovations,Novi,MI))；鼠抗体分型试剂盒(Zymed实验室，旧金山，加利福利亚(ZymedLaboratory,SanFrancisco,CA))，Glu(谷氨酸)-Pg，溴化氰溶解的人纤维蛋白原，anti(抗)-uPA抑制抗体394(美国诊断有限公司，斯坦福，康涅狄格(AmericanDiagnosticaInc.,Stanford,CT))；纤溶酶显色底物(H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-p-硝基苯胺二盐酸盐S2251)和TPA显色底物(H-D-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-p-硝基苯胺二盐酸盐S2288)(克洛基尼仪器实验室，列克星顿，马萨诸塞(ChromogenixInstrumentationLaboratory,Lexington,MA))；D-Phe-Pro-Arg甲基已基酮(PPACK)(卡尔生化，圣迭戈，加利福尼亚(Calbiochem,SanDiego,CA))；冰冻人枸橼酸钠血浆和鼠枸橼酸钠血浆(莱姆博生物实验室，派珀斯维尔，宾夕法尼亚(LampireBiologicalLaboratories,Pipersville,PA))；125I-纤维蛋白原(珀金埃尔默，沃尔瑟姆，马塞诸塞(Perkin-Elmer,Waltham,MA))；辣根过氧化物酶(HRP)与山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)的偶联物(圣克鲁斯生物科技有限公司，圣克鲁斯，加利福利亚(SantaCruzBiotechnology,Inc,SantaCruz,CA))，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，PiercePlus激活的HRP偶联试剂盒(飞世尔科技，罗克福德，伊利诺伊(FisherScientific,Rockfold,IL))；non(非)-TPA反应性抗体(IgGI)。RungeMS,BodeC,MatsuedaGR,HaberE.抗体增强的血栓溶解：体内组织纤溶酶原激活物的靶向.美国国家科学协会公报.1987；84:7659-7662(RungeMS,BodeC,MatsuedaGR,HaberE.Antibody-enhancedthrombolysis:targetingoftissueplasminogenactivatorinvivo.ProcNat]AcadSciUSA.1987；84:7659-7662)。如无特定说明，其他所有试剂来自西格玛，圣路易斯，密苏里(Sigma,St.Louis,MO)。
单克隆抗体制备
C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，缅因州(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME))通过重组人TPA免疫之后，采用常规杂交瘤技术与用骨髓瘤细胞分离自免疫小鼠的脾细胞融合。NelsonPN,ReynoldsGM,WaldronEE,WardE,GiannopoulosK,MurrayPG.单克隆抗体.分子病理学.2000；53:111-117(NelsonPN,ReynoldsGM,WaldronEE,WardE,GiannopoulosK,MurrayPG.Monoclonalantibodies.MolPathol.2000；53:111-117)。通过微孔板ELISA法筛选下述的阳性克隆。阳性克隆通过有限稀释进行亚克隆以创建稳定的单克隆抗体(mAb)。所有细胞培养在DMEM培养基中并位于37℃，5％CO2/95％的空气孵育箱中进行，供给5％胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酸和1％青霉素-链霉素。利用山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)琼脂糖将鼠mAb从培养基中提纯，并且进一步用小鼠抗体分型试剂盒进行表征。
ELISA法测定TPA和抗TPAmAb的结合
为筛选阳性TPA整合克隆或检测TPA和抗TPAmAb的结合，微孔板位于室温下的磷酸缓冲液中1小时以包覆上1-211g/mlTPA(人/鼠TPA或牛血清白蛋白(BSA))，之后用在PBS中的1％BSA阻断小时。在此之后，负载小鼠血清、杂交瘤细胞培养上清液或提纯自PBS的2-5μg/ml抗TPA单克隆抗体，培养1小时。随着TMB底物，通过HRP与山羊抗小鼠免疫球蛋白G的偶联物检测结合mAb。在某些情形，在添加抗TPA之前，在PTA包覆的BSA阻断的孔中加入3μg/ml的人PAI-1以检查mAb和TPA-PAI-1复合物的结合；通过用鼠抗人PAI-1mAb检测结合中的PAI-1来确认复合物形成。通过使用ELISA法的饱和结合实验评估TPA和抗TPAmAb的结合常数。简言之，PBS中7.5μg/ml的提纯的抗TPAmAb与室温1小时包覆在微孔板上，之后在PBS中使用1％的BSA阻断。然后，不同浓度的人TPA(0-4μg/ml)加载在用20μMPPACK和200激肽释放酶抑制剂单位抑肽酶预先淬灭的人血清上。使用HRP-偶联的小鼠抗人TPA多克隆抗体检测整合TPA，随后用TMB底物。在微孔板读数器的动态范围内于A370nm处监测反应。使用GraphpadPrism软件(LaJolla，CA)计算结合常数。为测定抗TPAmAb是否彼此竞争与TPA的结合，微孔板包覆211g/mlTPA。在PBS中用1％BSA阻断后，加入不同浓度的HRP标记的抗TPAmAb。洗涤后，TMA底物检测结合mAb。在一些孔中，向固定量的HRP标记抗TPAmAb中加入不同浓度的提纯抗TPAmAb以竞争包覆TPA的整合。基于提纯的抗TPAmAb中缺少的结合HRP标记的mAb和存在的结合HRP标记的mAb的差计算结合抑制百分比。
TPA活性分析
TPA酰胺解活性使用500μM的显色底物S2288进行检测。通过TPA的纤溶酶原激活通过用500μMS2251监控纤溶酶的酰胺解活性测定。前述所有实验均在37℃下的Tris-Nacl缓冲液(50mMTris-HCl,100mMNaCl,pH7.4)中进行。SazonovaIY,McNameeRA,HoungAK,KingSM,HedstromL,ReedGL.相比组织纤溶酶原激活，重组链激酶对纤维蛋白靶向和血栓溶解更有效(Reprogrammedstreptokinasesdevelopfibrin-targetinganddissolvebloodclotswitbmorepotencythantissueplasminogenactivator).血栓和止血杂志(JThrombHaemost).2009；7:1321-1328。用抑肽酶-琼脂糖小球对纤溶酶原在4℃下预处理4小时，以去除污染的纤溶酶。在这两种检测中，持续记录在405nm(A405nm)处的吸光度。TPA的酰胺解活性由A405nm处的吸光度随时间的初始斜率确定。按照Longstaffetal.LongstaffC,WhittonCM.用于纤溶酶原激活物的可在SI单元中计算酶活性的参考方法(AproposedreferencemethodforplasminogenactivatorsthatenablescalculationofenzymeactivitiesinSIunits).血栓和止血杂志(JThrombHaemost).2004；2:1416-1421，通过反应初始阶段A405nm处吸光度净变化低于0.1时吸光度每平方米秒的变化值测定TPA的纤溶酶原对纤溶酶的激活率。在某些情形，用TPA培养抗TPAmAb或纤维蛋白(Fn)片段以检测它们对TPA活性或纤溶酶原激活的作用。
纤维蛋白溶解
通过将20μl的人血浆(用微量125I-纤维蛋白原)和5μl凝血酶和钙溶液的混合物(终浓度：试管内1UI/ml凝血酶和10nMCaCl2)混合形成人血凝块。凝块在37℃下培养1小时，随后加入总计45μl的不同量的有或无抗TPAmAb的人TPA、uPA或SAK。取样时，收集10μl的上清液，用CobraII伽马计数器(珀金埃尔默帕卡德科学，沃尔瑟姆，马塞诸塞(Perkin-Elmer-PackardBioscience,Waltham,MA))检测该样品的放射性。伽马计数后，样品重新放回试管。将上清液的放射性除以凝块初始放射性来确定纤维蛋白溶解的百分比。被mAb抑制的纤维蛋白溶解的百分比参照缺少mAb的纤维蛋白溶解量来计算。
小鼠中脑动脉血栓栓塞性中风和出血
动物实验获得动物保护和利用委员会批准。实验自始至终，C57BL/6J成年小鼠(29到35g，杰克逊实验室(JacksonLab)，(巴尔港)BarHarborME)用1.5-2％的异氟烷和氧气的混合物进行麻醉。利用恒温器控制的加热垫使直肠温度维持在37℃。颈部切口后分离左颈总动脉，且颈外动脉、甲状腺和枕动脉被结扎。在颈动脉和枕动脉上临时放置微血管。在颈外动脉进行小动脉切开术以逆行置入含有125I-纤维蛋白原(～5000cpm/2μl)的PES导管。含有凝块的PES导管插入左颈动脉，穿入颈外脑部动脉向上至中部颈外动脉(MAC)的起源。血栓在100μl盐溶液中以0.45ml/min的速度形成。使用连续的激光-多普勒监测评价区域性脑灌注以保证栓塞足够形成(灌注降低至﹤缺血前基线的20％)。右颈静脉插管以使用药物。小鼠注入20％大剂量，SO％TPA(10mg/kg2.5小时达到局部缺血)超过30分钟。在大剂量TPA后，静脉注射化学计量单位的TPAi-14和TPAi-23对给与mAb抑制剂的小鼠进行治疗。测定出血时间20分钟。TPA注入且监测30分钟后，测定37℃的3mL水浴盐溶液预温5分钟的尾部出血量和出血时间。尾巴流血引起的血红蛋白(Hgb)减少通过Drabkin’s试剂盒依制造商的说明书(SigmaSt.Louis，MO)进行测定。血栓栓塞6小时后，分离脑部，切成2mm冠状切片，室温下在2％氯化三苯基四氮唑(Sigma，St.Louis，MO)溶液中培养30分钟。接下来转移染色玻片至4％多聚甲醛中进行固定。数码相机拍摄4个脑切片的图像。脑半球尺寸、严重出血面积和梗死面积用ImageProPlus6.2软件和改进的Swanson方法进行数码分析。SwansonRA,MortonMT,Tsao-WuG,SavalosRA,DavidsonC,SharpFR.测量脑梗体积的半自动方法(Asemiautomatedmethodformeasuringbraininfarctvolume).脑部血流和代谢杂志(JCerebBloodFlowMetab).1990；10:290-293。通过比较脑部剩余血栓放射性和初始凝块放射量确定凝块溶解量。
统计学分析
结果表达为平均值±标准差。通过双尾测验(twotailedttests)分析两组的比对。p≦0.05的差异是显著的。
参阅图1，在ELISA检测中17种杂交瘤细胞产生特异性地结合至TPA的mAbs(图1A)。mAb中的两种，TPAi-14和TPAi-23，在筛选检测中抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。与对照(非反应性)mAb相比，TPAi-14和TPAi-23对纤维蛋白溶解的抑制呈剂量依赖关系(图1B)。TPAi-23在1nM浓度时抑制50％的纤维蛋白溶解(IC50＝1.12nM，95％可靠区间(CI)＝0.88-1.4nM，图1C)而且在2nM浓度时接近100％。TPAi-14的效力较弱并且在3nM浓度达到50％抑制((IC50＝3.59nM,95％C12.85-4.54nM,图1C)。TPAi-14和TPAi-23的抑制效力和PAI-1的稳定突变体进行比较。YangD,NemkulN,ShereenA,等.纤溶酶原激活物抑制剂-1的治疗性施用防止新生儿的缺血缺氧脑损伤(Therapeuticadministrationofplasminogenactivatorinhibitor-1preventshypoxic-ischemicbraininjuryinnewborns).神经科学杂志(JNeurosci).2009；29:8669-8674。抑制50％的凝块溶解需要接近4uM的PAI-1([C50＝4.53nM,95％CI＝3.99-5.14nM,图IB和1C)。
除抑制纤维蛋白溶解的启动之外，TPAi-14和TPAi-23也在过程中抑制纤维蛋白溶解。在纤维蛋白溶解启动1小时后加入，TPAi-14抑制52±22％的后续纤维蛋白溶解，TPAi-23抑制87±6％，且稳定的PAI-1突变体在随后的2小时中抑制66±1％的溶解。
TPAi-14和TPAi-23表现出对人TPA的高亲和力(分别为Kn＝257±70pM和134±23pM)。TPAi-14和TPAi-23均不彼此竞争人TPA，说明它们识别不同表位(图2A)。TPAi-14和TPAi-23都等价地结合至人TPA和TPA-PAI-1复合物，说明人TPA上的mAb结合位点不和它的PAI-1结合位点竞争(图2B)。
TPAi-14结合至小鼠TPA而TPAi-23则不结合(图2B)。然而，无论是在人还是小鼠血浆凝块中，TPAi-14不影响小鼠TPA诱发的纤维蛋白溶解。TPAi-14和TPAi-23都抑制人TPA引发的小鼠血浆凝块溶解(图2C)。因此，这两种mAb特异地抑制人TPA但不抑制小鼠TPA。以相似的方式，TPAi-14和TPAi-23都不抑制由低分子量uPA诱导的纤维蛋白溶解、另一种具有重要生理作用的内源纤溶酶原激活。相反，PAI-1有效抑制uPA诱导的纤维蛋白溶解(图2D)。此外，TPAi-14和TPAi-23都不影响由葡激酶引发的纤维蛋白溶解，其是一种与纤溶酶形成复合物的间接纤溶酶原激活物(图2D)。
TPAi-14和TPAi-23对TPA催化活性的影响
TPAi-14和TPAi-23抑制由TPA诱发的纤维蛋白溶解而不影响由其他纤溶酶原激活物诱导的纤维蛋白溶解的发现表明其特异性地干扰TPA诱发的纤溶酶溶解或者催化功能。为测试对催化功能的直接影响，我们在缺乏或存在溴化氰溶解的纤维蛋白片段的情况下切割小肽底物S-2288放大TPA的活性，检测mAb是否影响TPA的酰胺解活性。甚至TPA10摩尔过量时，TPAi-14和TPAi-23都不影响TPA的酰胺解活性。相似地，TPAi-14和TPAi-23在存在纤维蛋白时不影响TPA的酰胺解活性。
尽管TPAi-14和TPAi-23均不影响TPA用小肽底物的酰胺解活性，它们可以影响由TPA导致的纤溶酶原激活裂解。在缺少TPA时，mAb本身也不影响纤溶酶原的自发激活(数据未显示)。有趣的是，当用20nMTPA激活100nM纤溶酶原时，TPAi-14些微地加速纤溶酶原激活；相反，相比非反应性mAb对照，TPAi-23降低纤溶酶原激活率(图3C)。然而，在缺少纤维蛋白时，其显著放大纤溶酶原激活，TPAi-14和TPAi-23对纤维蛋白溶解的抑制呈剂量依赖关系(数据未显示)(图3D)。综上所述，这些结果表明TPAi-14和TPAi-23均通过干扰TPA的纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活发挥它们主要的抑制作用。
TPAi-14和TPAi-23协同作用以中和TPA诱发的纤维蛋白溶解
竞争结合研究表明TPAi-14和TPAi-23结合至TPA分子的不同位点(图2A)并对TPA诱导纤溶酶原激活发挥不同作用(图3C和3D)。用已建立的药学标准，我们检测了这两种试剂是否以附加的、拮抗的或协同的方式相互作用而影响TPA诱发的纤维蛋白溶解。BerenbaumMC.试剂组合的预期效果：一般的解决办法(Theexpectedeffectofacombinationofagents:thegeneralsolution).理论生物学杂志(JTheorBioi).1985；114:413-431。与等摩尔剂量的各单独抗体相比，0.5nM的TPAi-14和0.5nM的TPAi-23的联用具有更强的抑制作用，相对单独的每种等量(1nM)mAb而言(图4A)。为更清楚的描述，建立了一种等效应图，见BerenbaumMC.试剂组合的预期效果：一般的解决办法(Theexpectedeffectofacombinationofagents:thegeneralsolution).理论生物学杂志(JTheorBioi).1985；114:413-431，该等效应图显示了TPAi-14和TPAi-23单独或联用对TPA诱发的纤维蛋白溶解的等价抑制水平(图4B)。单独TPAi-14(3nM)和TPAi-23(1nM)等效地达到50％纤维蛋白溶解抑制。然而，如图4B所示，这两种mAbs的低剂量联用相比各单独mAb的更大剂量施用获得了等效或更强的纤维蛋白溶解抑制，证实TPAi-14和TPAi-23相互协同地抑制TPA。
TPA诱发的纤溶酶原激活的失活减少TPA治疗缺血性脑中风后的脑出血和流血
TPA诱导的脑出血和流血是缺血性脑中风的TPA疗法的严重并发症。在模拟重中脑动脉中风的血栓栓塞模型中，施用2.5小时后TPA诱导脑出血(图5A)。在TPA治疗开始后以协同组合方式使用，TPAi-14和TPAi-23降低出血达5倍以上(2.0+0.7％对比0.4+0.6％，p﹤0.01，图5A和5B)多。已经被TPA施用(55.1±1.1％vs.56.1±2.6％,p＝0.453)所启动的纤维蛋白溶解没有降低。然而，中风梗死面积显著减小，与TPA诱发的神经毒性减小相一致(52.5±5.6％vs.27.3±6.6％,p﹤O.001,图5C)。具有降低脑肿胀的趋势(12.7±5.4％vs.7.2±1.7％,p＝0.062)。TPA治疗后施用mAb还减少手术尾部出血(surgicaltailbleeding)；出血时间从照组的25.7±1.3min降低到实验组的6.5±5.1min(p﹤O.0001，图5D)。总血红蛋白损失显著降低(6.4±2.7mg对比.1.6±1.5mg,p<0.01,图5E)。因此TPA治疗后的TPA特异性失活显著地降低脑出血和出血时间。
已验证纤溶酶原的TPA纤维蛋白依赖激活的特异性抑制剂是否能够减少缺血性中风的TPA治疗开始后的出血。筛选杂交瘤以制备抑制TPA诱导的纤维蛋白溶解的单克隆抗体(MAbs)。分子表征和提纯后，测试这些MAbs阻止由缺血性脑中风的TPA治疗引起的脑出血和系统性出血的能力。
结果：选择了两种以高亲和力(亚纳摩尔级解离常数)结合至TPA分子不同表位的MAb。这些MAb优选的抑制TPA的纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活而非其他催化功能；它们不影响其他试剂对纤溶酶原激活。当加入至人血凝块中，这些MAbs比稳定形式的纤溶酶原激活物抑制剂1以更高的特异性和有效性协同阻断TPA纤维蛋白溶解。当在缺血性中风的TPA治疗开始后施用，这些MAb显著地减少脑出血(P<0.05)而不恶化梗死。这些MAb也显著减少麻醉小鼠中TPA引发的出血时间和血红蛋白损失。
结论
本研究显示TPA的纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活的特异性抑制减少脑出血和手术出血。这些特异性抑制剂也降低神经损伤(脑梗死)并且具有降低脑肿胀的趋势。本研究提供一种实证，给出了TPA的纤维蛋白依赖机制的纤溶酶原激活的特异性抑制的特异性抑制，其减少了TPA治疗血栓栓塞的缺血性中风后的脑出血、梗死和手术出血。这说明纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活自身导致了这些不利后果。选择性地抑制该过程以治疗TPA诱导的出血的试剂有助于推动TPA病人中的使用，这些病人很可能从TPA治疗中受益。
此处所有出版物、专利和专利申请通过引用并入，类似各单独出版物或专利申请特定或单独通过引用并入。前述的详细说明是为了便于理解清晰，而非限制，在此基础上所做的任何改进对于本领域技术人员来说都是显而易见的。这并非是指：此处提供的任何信息是现有技术或与本发明相关，或者任何特定或引用的公开都是现有技术。除非另有定义，此处使用的所有科技具有被本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
虽然结合特定实施方案对本发明进行了具体阐述。但应理解本发明能够进一步改进且该申请有意涵盖任何变化、用途或在后发明的适应性变化，通常的，该发明的原理以及包括像本发明所属领域的已知或习惯做法范围内或应用于上文提出的必要特征和按照在所附权利要求范围内均应涵盖在本发明内。
序列
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<110>田纳西大学研究基金会（UNIVERSITYOFTENNESSEERESEARCHFOUNDATION）
<120>组织纤溶酶原激活物抗体及其用途
<150>US61/755,298
<151>2013-01-22
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>562
<212>PRT
<213>未知
<220>
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Claims (40)

1.一种特异性结合至TPA或TPA突变体以抑制人纤维蛋白凝块分解的分子，其特征在于：所述分子具有亚纳摩尔级亲和力以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，IC50﹤5nM，且所述TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65%的一致性。
2.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述分子不影响TPA酰胺解活性和非纤维蛋白依赖活性。
3.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述分子是抗体。
4.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：所述分子是单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的分子，其特征在于：人TPA的氨基酸序列是SEQIDNO：1或SEQIDNO：2。
6.一种如权利要求1所述的分子在对TPA治疗后的病人的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗中的用途，其特征在于：包括给病人施用有效剂量的所述分子，所述抗体在所述病人体内选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
7.一种药物组合物，其特征在于：包括如权利要求1的分子和一种药学上可接受的载体。
8.一种特异性结合至TPA且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的提纯或分离的抗体。
9.根据权利要求8所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体是单克隆抗体。
10.根据权利要求8所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体是抗体结合片段、嵌合抗体、双特异性抗体、人抗体或人源化抗体。
11.根据权利要求9所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体为TPAi-14且其选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
12.根据权利要求9所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体为TPAi-23且其选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
13.根据权利要求8-12任一项所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体TPAi-14和TPAi-23结合至TPA的不同表位。
14.一种药物组合物，其特征在于：包括一种有效量的如权利要求8-13任一项所述的抗体和一种药学上可接受的载体，所述抗体能够治疗系统性流血和出血。
15.一种特异性结合至TPA或TPA突变体以抑制人纤维蛋白凝块分解的提纯或分离的抗体，其特征在于：所述抗体具有亚纳摩尔级亲和力以抑制纤维蛋白依赖的纤溶酶原激活，IC50﹤5nM，且所述TPA突变体的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少65%的一致性。
16.根据权利要求15所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体不影响TPA的酰胺解活性和非纤维蛋白依赖活性。
17.根据权利要求15所述的提纯的或分离的抗体，其特征在于：所述抗体是单克隆抗体。
18.一种如权利要求15所述的抗体在对TPA治疗后的病人的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗中的用途，其特征在于：包括给病人施用有效剂量的所述抗体，所述抗体在所述病人体内选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
19.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求15所述的抗体和一种药学上可接受的载体。
20.一种用于治疗TPA治疗产生的系统出血的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括特异结合至TPA以抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的提纯或分离的抗体和使用所述抗体治疗系统性出血、脑出血和/或中风的说明书。
21.一种抗体在对TPA治疗后的病人的系统性出血、脑出血和/或中风的治疗中的用途，其特征在于：包括给病人施用有效剂量的至少一种能够结合至TPA表位的提纯或分离的抗体，所述抗体在所述病人中选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体选自包括人抗体、小鼠抗体和单克隆抗体的组。
23.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体是抗体结合片段、嵌合抗体、双特异性抗体、人抗体或人源化抗体。
24.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体在所述病人的缺血性中风治疗中的应用。
25.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体在所述病人的急性心肌梗死治疗中的应用。
26.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体减少TPA诱发的脑出血和手术出血。
27.根据权利要求21所述的用途，其特征在于：所述抗体抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。
28.根据权利要求27所述的用途，其特征在于：所述抗体抑制纤维蛋白溶解的启动。
29.根据权利要求27所述的用途，其特征在于：所述抗体在过程中抑制的纤维蛋白溶解。
30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于：所述抗体减少脑出血，手术后出血和脑细胞死亡。
31.根据权利要求21-30任一项所述的用途，其特征在于：所述至少一种提纯或分离的抗体抗体为TPAi-14。
32.根据权利要求31所述的用途，其特征在于：TPAi-14选择性地抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
33.根据权利要求21-30任一项所述的用途，其特征在于：所述至少一种提纯或分离的抗体抗体为TPAi-23。
34.根据权利要求33所述的用途，其特征在于：TPAi-23选择性抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
35.根据权利要求21-30任一项所述的用途，其特征在于：所述至少一种提纯或分离的抗体抗体为TPAi-14和TPAi-23，TPAi-14和TPAi-23以高亲和力结合至TPA的不同表位。
36.根据权利要求35所述的用途，其特征在于：TPAi-14和TPAi-23都选择性抑制纤维蛋白增强的纤溶酶原激活。
37.根据权利要求35所述的用途，其特征在于：TPAi-14和TPAi-23联用且协同抑制TPA诱发的纤维蛋白溶解。
38.一种可抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的分子的鉴别方法，其特征在于，包括：
提供特异性地结合至TPA且抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的单克隆抗体；
固定所述单克隆抗体到一表面；
提供TPA和引入阻断所述TPA的非特异性结合区域的试剂至所述TPA；
引入候选分子至所述TPA；
引入所述TPA至所述单克隆抗体；
确定所述候选分子是否已结合至TPA表位，该表位是所述单克隆抗体结合至TPA的位置；及
任何结合至所述表位的候选分子确定为可抑制TPA诱发的人凝块纤维蛋白溶解的分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：所述单克隆抗体是TPAi-14。
40.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：所述单克隆抗体是TPAi-23。
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