DD264025A1

DD264025A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den humanen plasminogenaktivator urokinase (huuk)

Info

Publication number: DD264025A1
Application number: DD30637087A
Authority: DD
Inventors: Frank Schneider; Ute Zacharias; Horst Will; Franz Noll; Wilhelm Handschack
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1989-01-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern hoher Spezifitaet gegen den humanen Plasminogenaktivator Urokinase. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die Biotechnologie. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit Urokinase immunisiert wurden, mit Maus-Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridzellen selektiert, kloniert, weitervermehrt und erfindungsgemaess zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder nach Transplantation einsetzt. Die spezifischen Hybridzellklone ZIM-Uk-IE2, ZIM-Uk-IC11 und ZIM-Uk-IH6 wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie unter den Nummern DDR-0206, DDR-0205 und DDR-0204 hinterlegt.

Description

Die erfindungsgemäß hergestellten Hybridome wurden am I.Juli 1987 in der ZIM-Hinterlegungssteile unror folgenden Registriernummern: DDR-0204 ZIM-UK-IH 6 DDR-0205 ZIM-UK-IC11 DDR-0206 ZIM-UK-IE2 hinterlegt. Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutet.werden. Ausführungsbeispiele

1. Herstellung der Hybridome

Balb/c-Mäuse werden durch i. p-lnjektion von 50 ug Urokinase in kompletten Freund'schen Adjtivans immunisiert. Drei Tage vor der Fusion werden 60ug Urokinase i.V. appliziert. Die Fusion der Miizzellen einer immunisierten Maus mit positiven Serumtiter erfolgt mit Maus-Plasmajytomzellen SP.2/0 nach bekannten Veifahren (Köhler, G and C.Milstein, Nature 256, 495-497,1975, Hudson, L. and F.C.Hay: Practical Invnunology, 2. Auflage, Oxfort 1980).

2. Das Screening der Antikörper aus der Kulturflüssigkeit erfolgt mit einem Immunoassay auf einem Flächenträger bzw. in _v iviikrotitertestplatten unter Bindung des Enzyms an die feste Phase und Einsatz einas enzymmarkierten (Enzym: Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörper.

Di» Hybridome werden in Selektionsmedien (HAT oder Azaserin) in 96-well-Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 8-10 Tagen wird der Kulturüberstand auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet.

3. Die Eigenschaften der von den erhaltenen Hybridomklonen produzierten monoklonalen Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

	Immunglobu-	Epitnp	Rekation mit	Hemmung der	Hemmung der	Markier
	linklasse		LMW-UK (33 KD)	fibrinolytischen	amidolytischen	bar mit
				Aktivität	Aktivität	POD
mAK
ZIMUKIE 2	IgG 2 a	1	+	+ +	-	ja
ZIM-UK-IC11	IgG 2 a	2	-	(+)	-	ja
ZIM-UK-IH6	IgG 2 a	2	-	(+)	-	ja

Claims

Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen Plasminogenaktivator Urokinase (HuUk) durch Irnmunisiomng von Balb/c-Mäusen mit Urokinase, fusion ihrer Milzzellen mit Maus-Myelomzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridzellen mittels immunchemischer Testverfahren und Weitervormehrung der Hybridzeilklone durch Kultivierung bzw. Transplantationen auf Mäusen in der Ascitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone ZIM-UK-IE2 (Hinterlegungsnummer DDR-0206), ZIM-UK-IC11 (Hinterlegungsnummer DOR-0205) und ZIM-UK-IH6 (Hinterlegungsnummer DDR-0204) eingesetzt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen Plasminogenaktivator Urokinase.

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Medizin und die Biotechnologie;

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Humane Urokinase ist eine Serinprotease, die von Körperzellen sezerniert wird. Urokinase wandelt das Zymogen Plasminogen, das im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten vorhanden ist, in aktives Plasmin um. Das System Urokinase/Plasniin ist an der Katalyse diverser extrazellulärer proteolytischer Prozesse beteiligt (E. Reich in: Biological Markes of Neoplasia: Basic and Applied Aspects [R. N. Ruddon, ed.] Elsevier, New York 491-500, 1978). Humane Urokinase wird als Therapeutikum für die l.yse thrombotischer Verschlüsse bei Herzinfarkt, Lungenembolie und anderen thrombotischen Erkrankungen eingesetzt (M. Verstraete, D. Collen, Blood 67,1529-1541,1986). Urokinase ist weiterhin als Markerenzym für den Nachweis einer Reihe von physiologischen und pathologischen Prozessen, u.a. Tumorwachstum und Metastasierung, geeignet. Monoklonal Antikörper gegen Urokinase gibt es seit 1981 (z.B. Herion, P.; Glineur, C; Franssen, J.-D.; Urban, J.; Bollen, Α.; Bioscience Reports 1, 885-892,1981). Die Herstellung der Antikörper eingesetzt. Die Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgte nach an sich bekannten Verfahren (Köhler, G. and Milstein, C. Nature 256,495-497,1975). Solche Antikörper werden vorzugsweise für den Urokinase-Nachweis in biologischen Flüssigkeiten und Geweben sowie für die Reinigung und Isolierung des Enzyms eingesetzt.

Urokinase weist verschiedene Antigendeterminanten auf, zu deren eindeutigen Charakterisierung eine Vielzahl von unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern eingesetzt werden müssen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen humanon Plasminogenaktivator Urokinase mit geeigneter Affinitätskonstante und hoher Spe ;ifität herzustellnn. Die Antikörper sollen zur E itwicklung rationeller Testbestecks zur selektiven Analytik in der medizinischen Diagnostik sowie für biochemische Untersuchungen einschließlich der Herstellung von effektiven Immunosorbentien zui Immunaffinitätsihromatographie von Urokina 5epräparaten eingesetzt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von monokloru len Antikörpern gegen humanen Plasminogenaktivator Urokinase werden zunächst in an sich bekannter Weise Milzzellen von B ilb/c-Ms usen, die mit gereinigter Urokinase bis zum Erscheinen von Serumantikörpern immunisiert v/urden, mit Maus-Myelomzelleri hybridisiert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotiterplatien kultiviert. Mit einem Immunoassay erfolgt der Nachweis der antiköroerproduzierenden Hybridome. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert und ihre Antigenspezifität bestimmt. Die spezifischen Hybridome gegen humanen Plasminogenaktivator Urokinase werden ausgewählt, weitervermel'rt und gegebenenfalls nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsyemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper erfolgt entweder in vitro in Zellkultur als Mono'ayer-, Roller-, Suspensionskultur und in Mikrobeads aus modifizierter Zellulose oder h vivo in Ascitesflüssigkeit nach Transplantation der spezifischen Hybridomzellen in Balb/c-Mäusen und/oder deren Hybride. Die monoklonalen Antikörper ZIM-UK-IE2; ZIM-UK-IC11 und ZIM-UK-IH6 gehören der Immunglobulinkiasse lgG2a im. Die Antikörper erkennen unterschiedliche Epitope. Der monoklonale Antikörper ZIM-UK-IE2 hemmt wie die beiden anderen monoklon älen Antikörper nicht die amidolytische Aktivität der Urokinase, ist aber in der Lage, die fibrinolytische Aktivität vollständig zu unterdrücken. Seine Bindungsstelle hat der monoklonale Antikörper ZIM-UK-IE2 am aktiven Zentrum (Epitop 1) des Urokimisemoleküles. Er reagiert mit der höhermolekularen Form der Urokinase und mit der niedermolekularen Form (33 KD), die im wesentlichen aus der sogenannten Serinproteasekette mit dem aktiven Zentrum besteht. Der Vorteil dieses Antikörpers liegt in der Erkenntnis von enzymatisch aktiver Urokinase. ZIM-UK-IE2 kann als spezifischer Inhibitor von Urokinase verwendet werden. Die Bindungsstelle der beiden monoklonalen Antikörper ZIM-UK-IC11 und ZIM-UK-IH6 liegt außerhalb der did niedermolekulare Form der Urokinase repräsentierenden Molekülregion (Epitop 2). Die Affinitätükonstunten aller drei monoklonalen Antikörper sind größer als 1 χ 10"⁸mol/l. Die monoklonalen Antikörper weisen keine Kröuzreaktivität mit dem gewebsspezifischen Plasminogenaktivator !-PA und mit anderen Bestandteilen des Humanvullserums auf. Die Zeilklone produzieren sowohl in Zellkultur als auch in Mäusen bedeutende Mengen von Antikörpern mit einer hohen Affinität. Die Antikörner eignen sich zur Bestimmung der Urokinase in der medizinischen Diagnostik und zur Hochreinigung (Tab. 1).