DE69029772T2 - Kolonie-Blotting-Verfahren und Vorrichtung - Google Patents

Kolonie-Blotting-Verfahren und Vorrichtung

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Description

    TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Kolonie- Blotting, d.h. die Verwendung von Materialien wie Folien oder Membranen zur Übertragung von biologischen Materialien von der Oberfläche einer bestrichenen (oder bestreuten) und inkubierten Kulturplatte mit freiliegenden Kolonien zur Durchführung von biochemischen oder immunchemischen Analysen. In einer anderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung des Gebiet des Immun-Blotting allgemein und insbesondere des Gebiet des Immun-Blotting von Antigenen wie Lipopolysacchariden. In einer weiteren Ausgestaltung betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis pathogener Keime wie dem Stamm mit der Bezeichnung Escherichia coli O157:H7.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Blotting elektrophoretisch abgeschiedener biologischer Moleküle auffeste Träger wird für eine Vielzahl von zwecken eingesetzt, beispielsweise zur Durchführung von Immunoassays der geblotteten Moleküle. Das als "Western Blot" bezeichnete Verfahren ist in dieser Hinsicht vielleicht eines der bekanntesten, und es ermöglicht die Identifizierung abgeschiedener und dann geblotteter Proteine mit Hilfe von Antikörper-Sonden des festen Trägers. Siehe dazu allgemein Renart, J. und I.V. Sandoval, "Western Blots", Methods in Enzymol., Kapitel 33, Bd. 104, Acad. Press. (1984).
  • Außer Proteinen und Polysacchariden wurden auch Lipopolysaccharide mit Hilfe von Übertragungstechniken nachgewiesen. Siehe z.B. Pyle, S.W. und W.B. Schill, "Rapid Serological Analysis of Bacterial Lipopolysaccharides by Electrotransfer to Nitrocellulose", J. Immunol. Meth., 85:371-382 (1985).
  • Ein weiters Verfahren, das als "Kolonie-Blotting" bekannt ist, umfaßt allgemein die Übertragung biologischer Moleküle von der Oberfläche einer Kulturplatte, beispielsweise einer Agarplatte mit Bakterienkolonien auf ihrer Oberfläche, auf einen festen Träger. Siehe beispielsweise Kemp, D.J. und A.F. Cowman, "Detection of Expressed Polypeptides by Direct Immunoassay of Colonies", in Methods in Enzymol., Kapitel 83, Bd. 79, Acad. Press. (1981),.wo ein Verfahren beschrieben wird, bei dem die Kolonien zuerst lysiert werden. Die von den lysierten Zellen freigesetzten Proteine werden dann kovalent an CNBr-Papier gebunden und durch Reaktion mit radioaktiv markierten Antikörpern nachgewiesen.
  • Das Kolonie-Blotting wird im allgemeinen nicht bei Nährböden in Form von Gußplatten verwendet, wo ein Großteil der Kolonien auf der Oberfläche des Nährbodens nicht zugänglich ist, und es wurde bis jetzt auch noch nicht als zur Verwendung mit rekonstituierbaren Trockennährböden geeignet erklärt, wie sie im folgenden näher beschrieben werden.
  • Aufgrund des erforderlichen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwands und des erforderlichen Fachwissens wird der oben beschriebene immunchemische Nachweis von Keimen normalerweise im Rahmen eines Forschungslabors eingesetzt und nicht für routinemäßige großanlegte Untersuchungen von Proben auf das Vorhandensein von Keimen, wie dies beispielsweise in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Arzneimittelindustrie oder auf dem Gebiet des Umweltschutzes erfolgt.
  • Im Gegensatz dazu wird eine solche routinemäßige, großanlegte Untersuchung von Proben auf das Vorhandensein von Keimen normalerweise nach wie vor mit Hilfe mühsamer und/oder relativ grober biochemischer oder mikrobiologischer Verfahren durchgeführt. Bei diesen Verfahren wird oft eine Whole-cell- Bestimmung durchgeführt und/oder es werden im voraus angereicherte Nährlösungen und anschließend selektive Agarplatten verwendet. Bei diesen Verfahren erhält man im allgemeinen entweder eine einfache quantitative Antwort hinsichtlich der Keimzahl insgesamt oder eine qualitative Antwort (z.B. positiv/negativ) bezüglich des Vorhandenseins einer speziellen Keimart, die gerade von Interesse ist. Die derzeit üblichen Screening-Schnelltests sind selten, wenn überhaupt, in der Lage, sowohl einen Hinweis auf das Vorhandensein eines speziellen Keims als auch einen Hinweis auf die Keimkonzentration zu geben, geschweige denn, dem Benutzer des Tests die Lokalisierung und Isolierung des nachgewiesenen Keims, beispielsweise im Hinblick auf weiteres Wachstum und Charakterisierung, zu ermöglichen.
  • Ein gutes Beispiel, welches die Notwendigkeit besserer Screening-Verfahren deutlich macht, ist die Prävalenz des als "O157:H7" bezeichneten pathogenen Stammes von E. coli in Fleischproben. Siehe z.B. Riley, "The Epidemiological, Clinical, and Microbiological Features of Hemorrhagic Colitis", Ann. Rev. Microbiol. 41:383-407 (1987). Zu den als für den Nachweis von E. coli O157:H7 nützlich beschriebenen Tests gehören die von Doyle et al, Applied and Environmental Microbiology, 53(10):2394-2396 (1987) und Todd et al., Applied and Environmental Microbiology, 54(10) :2536-2540 (1988) beschriebenen Tests.
  • Die Fleischindustrie arbeitet derzeit zum großen Teil mit dem oben genannten Verfahren von Doyle. Bei diesem Verfahren handelt es sich im Prinzip um ein Anreicherungsverfahren, bei dem Proben in einer im voraus angereicherten Nährlösung gezüchtet, verdünnt und dann auf selektivem Agar gezüchtet werden, um auf diese Weise Kolonien von E. coli O157:H7 unter den Kolonien von nichtpathogenen Hintergrundzellen optisch hervorzuheben. Dieses Verfahren hat eine Reihe von Nachteilen, wie zum Beispiel die Tatsache, daß Kolonien von E. coli O157:H7 von anderen Kolonien optisch unterschieden werden müssen. Angesichts der normalerweise großen Anzahl vorhandener nichtpathogener Bakterien ist es sehr gut. möglich, daß Zellen von E. coli O157:H7 übersehen werden, was zu einer unerwünscht hohen Anzahl falscher negativer Ergebnisse führt.
  • S. Broome et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2746-2749 offenbaren ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins spezifischer Proteine als Antigene in Phagen-Plaques oder Bakterienkolonien. Sie beschichten Kunststoffolien mit Antikörpermolekülen, bringen die Folie mit lysierten Bakterien in Kontakt, so daß sich ein freigesetzter Antikörper daran binden kann, und markieren dann das immobilisierte Antigen mit radioiodierten Antikörpern. Das Antigen liegt also zwischen den auf die Kunststoffolie aufgebrachten Antikörpern und den radioaktiv markierten Antikörpern. Durch Autoradiographie wird dann die Lage antigenhaltiger Kolonien oder Phagen- Plaques sichtbar gemacht.
  • Angesichts der Tatsache, daß die U.S. Food and Drug Administration ("FDA" - zentrale Behörde für das Arzneimittelwesen in den USA) sowie andere Behörden sich zunehmend mit der Notwendigkeit des Nachweises und der Quantifizierung von pathogenen Keimen in Proben wie zum Beispiel Lebensmitteln befassen, in Kombination mit der Tatsache, daß die Lebensmittelindustrie ein Verfahren braucht, das schnell, empfindlich, kosteneffektiv und praktisch ist, sind die derzeit zur Verfügung stehenden forschungsorientierten Verfahren für derartige Zwecke nicht geeignet.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Feststellen, und wahlweise zum Lokalisieren, des Vorhandenseins von Keimkolonien, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (1) Impfen einer Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden, der aus einem im wesentlichen flachen selbsttragenden Körper und einer wenigstens auf einen Teil des Körpers aufgeklebten Abdeckfolie besteht, mit einem Inokulum von einer Probe, die vermutlich Keime enthält, (2) Inkubieren des geimpften Nährbodens unter Bedingungen, die geeignet sind, das Wachstum von Keimkolonien zu ermöglichen, (3) Freilegen einer Oberfläche des Nährbodens auf der Platte durch Entfernen der Abdeckfolie und die freiliegende Oberfläche mit einer eigenen Übertragungsmembran in Berührung bringen, wobei die Übertragungsmembran hydrophob ist, in einer Weise, die es der Übertragungsmembran erlaubt, keimspezifisches Antigen aus dem Bereich der Keimkolonien zu extrahieren, (4) Entfernen der Übertragungsmembran von der Oberfläche des Nährbodens, und (5) Feststellen des Vorhandenseins des keimspezifischen Antigens auf der Übertragungsmembran mit geeigneten Mitteln, wobei die Zellen der Kolonien vor der Extraktion nicht aufgelöst werden, die Übertragungsmembran nach der Extraktion nicht blockiert wird, die Antigene in dem extrazellulären Bereich der Keimkolonie vorhanden sind, die Antigene entweder vollständig hydrophob sind oder wenigstens einen hydrophoben Bereich aufweisen, durch den es möglich wird, daß das Antigen rasch durch die Oberfläche der hydrophoben Übertragungsmembran extrahiert wird, und wobei die Antigene ausgewählt sind aus jenen, die auf der Oberfläche Lipopolysaccharid (LPS) enthalten, und jenen, die Toxine pathogener Keime sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Gegenstand bereit, der eine Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden umfaßt mit einem im wesentlichen flachen selbsttragenden Körper und einer wenigstens auf einen Teil des Körpers aufgeklebten Abdeckfolie in Kombination mit einer hydrophoben Übertragungsmembran.
  • In der bevorzugten Ausführungsform werden das Verfahren und der Gegenstand der vorliegenden Erfindung zum Nachweis eines Lipopolysaccharid-Antigens verwendet, das von den Keimen produziert wird und für diese spezifisch ist. Bei diesem Verfahren ist es darüberhinaus nicht mehr notwendig, die Zellen der Kolonien vor der Extraktion aufzulösen, und es ist nicht mehr notwendig, die Übertragungsmembran nach der Extraktion zu blockieren, um eine unerwünschte, unspezifische Bindung von Antikörpern zu vermeiden. Da das Lysieren und/oder Blockieren bei herklmmlichen Kolonie-Blotting-Verfahren im allgemeinen notwendig ist, versteht es sich, daß die vorliegende Erfindung besonders praktisch ist.
  • Außerdem ermöglicht die vorliegende Erfindung die gleichzeitige Untersuchung von im wesentlichen allen auf dem Nährboden vorhandenen Kolonien, und es ist nicht mehr notwendig, eine repräsentative Anzahl von Kolonien zur weiteren Bestätigung oder Charakterisierung aus selektiven Agarplatten herauszugreifen. Angesichts der Tatsache, daß eine Platte der vorliegenden Erfindung eher einer Gußplatte als einem bestrichenen oder bestreuten Nährboden entspricht, ist es besonders überraschend, wenn auch wesentlich, daß Antigene von im wesentlichen allen auf einer solchen Platte gezüchteten Kolonien zugänglich sind, um von der Oberfläche des Nährbodens dieser Platte extrahiert zu werden. Die vorliegende Erfindung erlaubt es dem Benutzer auch, die ursprüngliche Keimkolonie auf der Oberfläche der Platte zu lokalisieren, so daß die weitere Isolierung und Charakterisierung der Kolonie möglich ist.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eignen sich besonders für einen Keimnachweis, der ganz spezifisch, aber auch schnell und kostengünstig für eine große Anzahl von Proben durchgeführt werden muß, beispielsweise in der Milch-, Lebensmittel, Wasser-, Kosmetik- und Arzneimittelindustrie.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt allgemein die folgenden Schritte: Impfen einer spezifischen Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden mit einer Probe, die vermutlich Keime enthilt; Inkubieren der geimpften Platte; eine Übertragungsmembran mit der Oberfläche des Nährbodens der inkubierten Platte in Berührung bringen, um davon keimspezifisches Antigen zu extrahieren; Entfernen der Übertragungsmembran; und Feststellen des Vorhandenseins, und wahlweise der Lage, von keimspezifischem Antigen auf der Übertragungsmembran.
  • Die Schritte werden mit Bezug auf die vorliegende Erfindung näher beschrieben, bei der die Notwendigkeit zum Auflösen der Keimzellen vor der Extraktion und auch die Notwendigkeit zum "Blockieren" der Übertragungsmembran vor dem Nachweis des Antigens umgangen wird. In der im folgenden beschriebenen besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Übertragungsmembran aus Polystyrolfolie hergestellt; bei dem relevanten Keim handelt es sich um den Stamm mit der Bezeichnung E. coli O157:H7; und das nachgewiesene Antigen ist ein für den Serotyp E. coli O157 spezifisches Lipopolysaccharid.
  • Als ersten Schritt bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden mit einem Inokulum von einer Probe, die vermutlich die relevanten Keime enthält, wieder befeuchtet.
  • Geeignete Nährböden zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind jene, die eine optimale Kombination von Eigenschaften wie leichte Verwendbarkeit, schnelles Wachstum der relevanten Keime, Selektivität und Kostengunstigkeit bieten. Ein Nährboden sollte die Antigenextraktion von seiner Oberfläche in einer Weise ermöglichen, bei der die Maße und die Struktur des Nährbodens unversehrt bleiben, 5Q daß eine spätere Lokalisierung und Isolierung von Kolonien möglich ist.
  • Beispiele für bevorzugte Nährböden werden im US-Patent Nr. 4,565,783 beschrieben. Trockennährböden dieses Typs werden derzeit verkauft von der 3M Company unter dem Handelsnamen "Petrifilm ". Bevorzugte Trockennährböden zur Verwendung beim Nachweis von E. coli O157:H7 sind für Coliforme selektive Nährböden wie die Coliform-Zählplatten der Marke Petrifilm , und noch mehr bevorzugt jene, die als E. coli Zählplatten der Marke Petrifilm bekannt sind. Die Petrifilm -Platten können nach Anweisung des Herstellers mit einer wäßrigen Probe geimpft und dadurch befeuchtet werden.
  • Derartige Platten mit Trockennährboden sind weiterhin von Nutzen, da eine Deckfolie für den Nährboden eine nach außen abgeschlossene Umgebung erzeugt. Die Abgeschlossenheit des Nährbodens führt dazu, daß von den Keime freigesetzte Gase, beispielsweise die normalerweise von Coliformen freigesetzten Gase, um jede Kolonie eine sichtbare Blase erzeugen. Die Anmelderin hat festgestellt, daß die Abgeschlossenheit des Nährbodens in Kombination mit der polaren und nichtpolareij Beschaffenheit von Antigenen wie LPS eine Konzentration des Antigens an der Grenzfläche zwischen dem Nährboden und dem Gas ermöglicht, was zu einem charakteristischen kreisförmigen Muster führt, das nach dem bevorzugten Verfahren dieser Erfindung ohne weiteres optisch zu erkennen ist.
  • Geeignete Proben zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise unter anderem Lebensmittel, Wasser, Chemikalien, Luft und/oder Umweltproben. Die erforderliche Probenmenge variiert beispielsweise je nach der erforderlichen Empfindlichkeit und dem Typ des zu impfenden Nährbodens. Um eine Empfindlichkeit von weniger als 1 Zelle pro 100 g Probe zu erhalten, ist es beispielsweise allgemein notwendig, mindestens 100 g und vorzugsweise 500 g Probe zu testen, um eine statistische Garantie von weniger als 1 Zelle pro 100 g Probe zu erhalten. Proben können auf viele verschiedene, dem Fachmann vertraute Arten getestet werden, z.B. können sie mit einem geeigneten Nährmedium oder Puffer verdünnt (z.B. 1/10, 1/100 usw.) und zwecks vorheriger Anreicherung homogenisiert werden, oder sie können direkt zum Impfen des Nährbodens verwendet werden, z.B. als Wasser- oder Milchprobe oder als Lebensmittellösung. Oberflächenproben erhält man durch Bestreichen einer Oberfläche, Abspülen der bestrichenen Oberfläche in einer entsprechenden Nährlösung zwecks vorheriger Anreicherung oder in sterilem Wasser oder Puffer, um direkt auf den Nährboden aufgetragen zu werden.
  • Proben, die nicht verdünnt sind, oder die in einer entsprechenden Nähr- oder Pufferlösung verdünnt und homogenisiert wurden, können in jeder geeigneten Weise im voraus angereichert werden, z.B. vor dem Impfen gezüchtet werden, um die Zahl der Keimzellen zu erhöhen. Beim Nachweis von E. coli O157:H7, können Proben beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß eine Lebensmittelprobe in einer entsprechenden Nährlösung verdünnt wird, z.B. in der Größenordnung von 1 zu 10 (Gewicht zu Volumen), und mit oder ohne Schütteln zwischen 4 und 24 Stunden, vorzugsweise zwischen 6 und 8 Stunden, bei Temperaturen von 20ºC bis 44ºC, vorzugsweise von 32ºC bis 42ºC, und am meisten bevorzugt bei 36ºC, inkubiert wird.
  • Nach dem Anreichern wird ein Inokulum der Probe zum Impfen eines Nährbodens verwendet, z.B. zum Befeuchten einer Platte mit Trockennährboden, wie zum Beispiel einer Trockennährboden-Platte der Marke Petrifilm , in herkömmlicher Weise.
  • Geimpfte Nährböden werden unter Bedingungen inkubiert, die für ein Wachstum der in Frage kommenden Keimkolonien geeignet sind. Beispielsweise werden befeuchtete Petrifilm -Platten 6 bis 24 Stunden, vorzugsweise 18 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 20ºC bis 44ºC, vorzugsweise von 36ºC bis 42ºC, und am meisten bevorzugt bei 42ºC inkubiert.
  • Nach dem Inkubieren wird eine Oberfläche des Nährbodens auf der Platte freigelegt, z.B. durch Wegziehen der durchsichtigen Deckfolie der Platte, und die freiliegende Oberfläche wird mit einer geeigneten Übertragungsmembran in einer Weise in Berührung gebracht, daß die Membran keimspezifisches Antigen von dem Nährboden im Bereich der Keimkolonien extrahieren kann.
  • Geeignete Übertragungsmembranen können in jeder geeigneten Form vorliegen, z.B. als Folie, in faseriger oder mikroporöser Form, und aus jedem geeigneten Material bestehen, z.B. aus einem organischen oder anorganischen Material. Geeignete Übertragungsmembranen zeigen eine optimale Kombination von Eigenschaften wie Bindungsfähigkeit, Festigkeit und Maßhaltigkeit, Wasserabweisungsvermögen, Konfiguration und Farbe. Geeignete Übertragungsmembranen sind unter anderem jene, die in der Lage sind, Proteine, Lipoproteine und Lipopolysaccharide zu adsorbieren. Beispiele für geeignete Übertragungsmem btänen werden hergestellt mit den Polymeren Polypropylen, Polyethylen, Polystyrol, Cellulosenitrat oder Nylon.
  • Die Dicke einer Übertragungsmembran ist nicht kritisch, solange die Membran eine für den jeweiligen Verwendungszweck geeignete Dicke aufweist. Normalerweise haben Übertragungsmembranen eine Dicke in der Größenordnung von 25,4 µm (1 mil) bis 254 µm (10 mil), und vorzugsweise in der Größenordnung von 25,4 µm (1 mil) bis 127 µm (5 mil).
  • Übertragungsmembranen zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit hydrophoben Antigenen wie zum Beispiel Lipopolysacchariden sind jene, die selbst hydrophob sind. Ein praktischer Hinweis auf die hydrophobe Beschaffenheit einer Membran ist die Wasserabsorption der Membran, wie sie beispielsweise ermittelt wird mit dem ASTM-Testverfahren D-570. Nach diesem Verfahren besitzen bevorzugte Membranen zur Verwendung mit LPS-Antigenen eine Wasserabsorption in der Größenordnung von 1% (w/w) oder weniger, und am meisten bevorzugt in der Größenordnung von 0,1% oder weniger.
  • Besonders bevorzugte Übertragungsmembranen zur Verwendung bei der LPS-Extraktion bestehen aus Polystyrol, Polypropylen oder Polyethylen. Bevorzugt werden mikroporöse Polyethylen- und Polypropylen-Membranen, wie sie beschrieben sind im US-Patent Nr. 4,539,256. Bevorzugte Übertragungsmembranen aus Polystyrol werden hergestellt aus einer unter dem Handelsnamen "Opticite #520 Label Film" von Dow Chemical Co. erhältlichen Folie. Laut Beschreibung enthält diese Folie Polystyrol und ein Styrol/Butadien-Copolymer mit einem Polymergehalt von insgesamt 80% zusammen mit Titandioxid und ist vorzugsweise erhältlich als 63,5 µm (2,5 mil) dicke Folie. Die Folie kann auf die gewünschte Form, z.B. eine kreisrunde Form, mit im wesentlichen den gleichen Maßen wie die Oberfläche des verwendeten Nährbodens zugeschnitten werden.
  • Bei Verwendung von Petrifilm -Platten erfordert die Extraktion im allgemeinen das Entfernen der oberen Deckfolie, um die Oberfläche des Nährbodens freizulegen. Die Übertragungsmembran kann mit der freiliegenden Oberfläche in jeder geeigneten Weise in Kontakt gebracht werden, um Antigen von der Oberfläche des Nährbodens zu extrahieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt das Extrahieren von LPS von der Oberfläche mit Hilfe der Übertragungsmembran im allgemeinen sofort, d.h. die Übertragungsmembran kann so auf den Nährboden gelegt werden, daß sie im wesentlichen dessen gesamte Oberfläche berührt, und wird dann sofort wieder abgezogen. Wahlweise kann die Membran auch über längere Zeiträume ohne nachteilige Auswirkungen mit der Oberfläche in Kontakt gelassen werden. Die Membran ist vorzugsweise mit dem Nährboden, z.B. in radialer Richtung, ausgerichtet, so daß dieser später wieder mit der Membran ausgerichtet werden kann, um spezifische Kolonien zu lokalisieren. Die Ausrichtung kann in jeder geeigneten Weise erfolgen, z.B. durch Markieren oder Einkerben von Membran und Nährboden.
  • Vor dem Extrahieren ist es nicht notwendig, Antigene von Zellen in den Nährboden abzugeben, z.B. dadurch, daß die Keimkolonien in dem Nährboden mit einem physikalischen, chemischen oder biologischen Mittel in Kontakt gebracht werden. Freisetzende Mittel sind unter anderem organische Lösungsmittel wie Chloroform, Reinigungsmittel wie Natriumdodecylsulfat, Chelatbildner wie EDTA, oder Enzyme wie zum Beispiel ein Lysozym, das die Zellen auflöst und intrazelluläre Antigene freisetzt. Siehe beispielsweise Grundstein et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(10):3961-3965 (1975). Bei von Natur aus extrazellulären Antigenen hat sich herausgestellt, daß ein Lysieren bzw. Auflösen vor der Extraktion nicht erforderlich ist.
  • Die Übertragungsmembran kann von der Oberfläche des Nährbodens durch jedes geeignete Mittel entfernt werden, z.B. durch Abheben mit einer Pinzette, wobei darauf zu achten ist, daß die Membran nicht wieder mit der Oberfläche bzw. mit enzymtragenden Oberflächen wie den bloßen Fingern in Kontakt kommt. Die Membran wird vorzugsweise unter geeigneten Bedingungen oft genug gewaschen, um Fremdkörper zu entfernen. Bei nicht wasserabsorbierenden hydrophoben Übertragungsmembranen, beispielsweise jenen aus Polypropylen, Polystyrol und Polyethylen, ist dreimaliges Waschen in einer Waschlösung, die eine geringe Menge bis zur Neutralität gepuffertes Reinigungsmittel, z.B. Tween 20 oder Tween 80, enthält, ausreichend. Bei hydrophileren Membranen können bis zu 10 Waschgänge in einer Waschlösung erforderlich sein, um anhaftende oder eingeschlossene Fremdkörper zu entfernen.
  • Nach der Extraktion durch die Übertragungsmembran, aber vor dem Feststellen des Vorhandenseins von extrahiertem Antigen auf der Membran ist es nicht notwendig, die Membran zu blokkieren, um verbleibende Stellen zu entfernen, die spätere Reaktionspartner wie zum Beispiel Antikörper in unspezifischer Weise binden könnten. Das Blockieren kann beispielsweise durch Inkubieren der Übertragungsmembran in einer Lösung von Gelatine, Albumin oder wieder befeuchteter Trockenmilch in einer Konzentration in der Größenordnung von 0,1% bis 10%, und vorzugsweise 0,5% bis 5% (Gewicht zu Volumen) erfolgen. Siehe beispielsweise Burnette, Anal. Biochem., 112:195-203 (1981). Die Übertragungsmembranen müssen nicht blockiert werden, da Antikörper sich im allgemeinen nicht in unspezifischer Weise an die Membranen binden.
  • Das Wort "Antigen", wie es hierin verwendet wird, bezeichnet jedes nachweisbare biologische Makromolekül, z.B. einen spezifischen Bindungspartner, das(der) von einer inkubierten Platte mit Hilfe einer Übertragungsmembran von dem Bereich einer Keimkolonie gemäß der vorliegenden Erfindung extrahiert werden kann. Das Wort "extrahieren", wie es hierin verwendet wird, bezeichnet das Entfernen von Antigen von dem Nährboden auf die Membran, z.B. durch direkten Kontakt, der zur Bindung durch passive Adsorption oder zur Aufnahme von Nährboden durch Kapillarwirkung führt&sub4; Geeignete Antigene sind unter anderem jene, die im wesentlichen ein Protein, Lipoprotein oder Lipopolysaccharid sind. Die Antigene sind im extrazellulären Bereich einer Keimkolonie vorhanden, und sie sind entweder vollkommen hydrophob oder haben wenigstens einen hydrophoben Bereich, der eine rasche Extraktion des Antigens durch die Oberfläche der hydrophoben Übertragungsmembran ermöglicht. Wenn diese beiden Faktoren erfüllt sind, kann das Antigen ohne Auflösen der Kolonie extrahiert und dann ohne Blockieren in der zuvor beschriebenen Weise nachgewiesen werden. Die Antigene werden ausgewählt aus Oberflächen- Lipopolysacchariden und Toxinen pathogener Keime. Ein Beispiel für ein besonders bevorzugtes Antigen ist das LPS- Antigen, das als "O-Antigen" vom Serotyp E. coli O157:H7 bezeichnet wird.
  • Mit Hilfe der Übertragungsmembran extrahiertes Antigen kann durch jedes geeignete Mittel unter Verwendung herkömmlicher Techniken ermittelt, z.B. mittels Analyse oder einem sonstigen Nachweis festgestellt werden. Siehe z.B. Hawkes et al., J. Anal. Biochem., 119:142-147 (1982). Geeignete Techniken sind unter anderem das Inkubieren der Membran mit spezifischen, mit Enzymen, radioaktiv, chemilumineszierend oder fluoreszierend markierten Antikörpern. Geeignete spezifische Antikörper binden sich an das Antigen auf der Übertragungsmembran, und ihr Vorhandensein und ihre Lage können wiederum in geeigneter Weise nachgewiesen werden, z.B. durch Verwendung entsprechender Substratsysteme wie Phosphatase- oder Peroxidase-Substratsysteme für mit Phosphatase oder Peroxidase markierte Antikörper.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können LPS/Antikörper- Komplexe auf der Übertragungsmembran durch radiometrische, enzymatische, chemilumineszierende oder fluoreszierende Analysesysteme lokalisiert werden. Vorzugsweise werden enzymmarkierte anti-LPS-Antikörper zum Nachweis von mit Hilfe der Übertragungsmembran extrahiertem LPS verwendet. Am meisten bevorzugt werden mit Phosphatase markierte polyklonale oder monoklonale anti-E. coli O157 Antikörper zum Nachweis von E. coli O157 LPS auf der Übertragungsmembran verwendet.
  • Für E. coli 0-Antigen spezifischer Antikörper kann mit bekannten Verfahren wie zum Beispiel Affinitätsreinigung hergestellt werden, wie sie beschrieben ist in Wetherell, et al., Amer. Soc. Microbiol. 88th Annual Meeting, Session No. 115, Abstract No. C134 (1988), oder ist im Handel erhältlich, z.B. als "BacTrace Affinity Purified Antibody to E. coli O157:H7" der Cat. Nr. 05-95-90 von Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, oder E. coli anti-O157, Cat. No. 2970-47-7, Difco Laboratories, Detroit, Michigan.
  • Ein besonderer Vorteil der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit zur Isolierung von tatsächlichen Zellen von Kolonien des nachgewiesenen Keims auf der ursprünglichen Platte selbst. Durch entsprechende Ausrichtung von Membran und Platte kann der Benutzer das Vorhandensein von Keimkolonien auf der Platte durch Korrelation ihrer Lage mit dem auf der Übertragungsmembran gefundenen Antigen feststellen. Die lokalisierten Kolonien können dann verwendet, z.B. in herkömmlicher Weise isoliert werden, um ihre Identität zu bestätigen, oder zu irgendeinem anderen Zweck.
  • Häufig wird es im Bereich der fraglichen Kolonien zu einem beachtlichen Wachstum von Hintergrundkeimen kommen, insbesondere bei Verwendung von stark kontaminierten Proben. In solchen Fällen lassen sich die fraglichen Kolonien unter Umständen optisch nicht unterscheiden. Aufgrund der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis eines für solche Kolonien spezifischen Antigens jedoch herangezogen werden, um die Bereiche des Nährbodens zu lokalisieren, die vermutlich die Kolonien enthalten. Diese Bereiche können herausgenommen werden, und die fraglichen Keime können nach bekannten Verfahren oder durch erneutes Impfen nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung von den Hintergrundkeimen getrennt und gereinigt werden.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich eine Platte mit rekonstituierbarern Trockennährboden in Kombination mit einer Übertragungsmembran, kann in jeder geeigneten Form bereitgestellt werden. Platte und Membran können kombiniert werden, z.B. als Komponenten eines Testkits. Wahlweise kann das Testkit auch andere Komponenten enthalten, beispielsweise einen Antikörper und/oder ein Substrat für den Nachweis des Vorhandenseins von Antigen auf der Membran. In einer solchen Ausführungsform wird die Membran im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens vom Benutzer mit der freiliegenden Oberfläche des Nährbodens auf der Platte in Kontakt gebracht.
  • Alternativ können Platte und Membran beispielsweise als Komponenten einer einstückigen Struktur kombiniert werden, bei der die Membran eine Lage der Platte darstellt und während des Impfens und des Keimwachstums mit dem Nährboden in Kontakt steht. Die Membran kann später von der Oberfläche des Nährbodens entfernt werden, damit das extrahierte Antigen bestimmt werden kann&sub0; Die Verwendung einer Übertragungsmembran als Deckfolie an sich oder auf der Unterseite einer solchen Deckfolie stellt beispielsweise den erforderlichen Kontakt zwischen dem Nährboden und der Membran her.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden BEISPIELE näher erläutert, aber die in diesen BEISPIELEN genannten speziellen Materialien und deren Mengen sowie sonstige Bedingungen und Einzelheiten sollten nicht als unzulässige Einschränkung der Erfindung verstanden werden.
    • BEISPIELE BEISPIEL 1 Verwendung des Verfahrens bei geimpften Platten
  • Platten mit rekonstituierbarem Trockennährboden (E. coli Zählplatten der Marke Petrifilm , 3M Company, St. Paul, MN) wurden jeweils mit 1 ml aliquoten Teilen einer Mischkultur geimpft, die Laborstämme von nichtpathogenem E. coli, Citrobacter und Klebsiella enthielt. Die Gesamtzahl der Bakterien betrug ungefähr 200 pro ml. In jedes Inokulum wurden ungefähr 10 E. coli O157:H7 gegeben. Die Platten wurden 18 Stunden bei 320C inkubiert.
  • Die inkubierten Platten wurden in der folgenden Weise bei Zimmertemperatur mit Übertragungsmembranen geblottet. Die obere Folie jeder Platte wurde weggezogen, um die mittlere Fläche freizulegen.
  • Bei einigen Platten wurde ein kreistunder Cellulosenitratfilter (64 mm Durchmesser, einfarbig weißes Cellulosenitrat der Marke Nytran , Cat. #BA85, erhältlich bei Schleicher and Schuell, Inc., Keene, NH), eine Minute lang über den Nährboden gelegt. Bei anderen Platten wurde eine Polypropylen- Membran, wie unten in BEISPIEL 5 beschrieben, über freiliegende Flächen des Nährbodens gelegt. Die Filter wurden von dem Nährboden entfernt, in einen 250m1-Becher gegeben und in überschüssigem Puffer ("PBS-Tween", phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20, pH=7,4) gewaschen. Der Puffer wurde abgegossen, und in den Becher mit dem Cellulosenitratfilter wurde 1 ml Magermilch gegeben, um verbleibende Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren. Die Polypropylenmembranen wurden nicht blockert.
  • Jeder Filter wurde dreimal in überschüssigem PBS-Tween gewaschen und 30 Minuten mit 2 ml anti-O157:H7-Antikörper (enthielt ungefähr 0,2 µg Antikörper, KPL Laboratories) bedeckt, der mit alkalischer Phosphatase markiert war. Bei dem Antikörper handelte es sich um ein polyklonales Präparat, das bekanntlich für LPS von E. coli O157 spezifisch ist. Die Antikörperlösung wurde abgegossen, und der Filter wurde wie oben 30 Minuten mit PBS-Tween gewaschen. Phosphatase-Substrat (2 ml, rekonstituiert, KPL Laboratories) wurde zugegeben und zusammen mit dem Filter 5 Minuten inkubiert. Der Filter wurde dann in überschüssiges deionisiertes Wasser gegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  • Auf jedem der Cellulosenitratfilter und auf den Polypropylenscheiben tauchten ungefähr 10 charakteristische schwarze Kreise auf, was darauf hindeutete, daß auf der Platte E. coli O157:H7 in seinem charakteristischen kreisrunden, gasbildenden Muster gewachsen war, und daß das LPS von diesem Stamm gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung extrahiert und nachgewiesen werden konnte. Die Verwendung von Cellulosenitrat dient jedoch als Vergleich, da die Filter jeweils eine blau-schwarze Färbung zeigten, was darauf hindeutete, daß sie nichtspezifisch waren für Antikörper, und außerdem die Membran blockiert werden mußte, um eine unspezifische Bindung von markiertem Antikörper zu verhindern. Im Gegensatz dazu zeigte sich auf den Polypropylenscheiben keine Hintergrundfärbung, auch wenn sie nicht in ähnlicher Weise blockiert worden waren.
    • BEISPIEL 2 Verwendung des Verfahrens bei Hamburger-Proben
  • Fünfzig Proben von rohem Hamburger und gekochtern Hamburger, die mit E. coli O157:H7 geimpft waren, wurden nach dem zuvor erwähnten Anreicherungsverfahren von Doyle und nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß dem unten angegeben Protokoll getestet. Von 20 Proben von rohem Hamburger, die mit O157:H7 geimpft waren, wurden 19 nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung innerhalb von 24 Stunden bestimmt. Mit dem herkömmlichen Anreicherungsverfahren von Doyle konnten nach 3 Tagen bei den 20 Proben keine positiven Ergebnisse festgestellt werden. Vermutlich scheiterte das herkömmliche Verfahren, weil der Hintergrund überwuchert wurde. Mit beiden Verfahren wurden 20 von 20 geimpften Proben von gekochtem Hamburger bestimmt. Das herkömmliche Verfahren dauerte 3 Tage, während das Verfahren der vorliegenden Erfindung 24 Stunden dauerte.
  • Es scheint, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Grcßenordnung von einer E. coli O157:H7 Zelle pro 10 Gramm rohem Hamburger nachweisen kann, wenn der anfängliche gramnegative Wert im Hintergrund weniger als etwa 10&sup4; pro Gramm beträgt. Die Empfindlichkeit steigt auf 1 E. coli O157:H7 Zelle pro 50 Gramm rohem Hamburger, wenn der anfängliche Wert weniger als etwa 10³ pro Gramm beträgt. Bei vorgekochtem Hamburger ist die Empfindlichkeit eindeutig noch größer.
    • PROTOKOLL HERSTELLUNG DER REAKTIONSPARTNER:
  • 1) Affinitätsgereinigtes polyklonales anti-O157:H7 IgG (100 µg, KPL, Inc., Gaithersburg, MD, Cat. #05-95-90) wurde mit 1 ml von 50%igem Glycerol befeuchtet und bei -20ºC gelagert.
  • 2) Ein "BCIP/NBT"-Substratsystern (KPL, Inc.) wurde hergestellt mit 10 Teilen Puffer (0,1 M Tris, pH=9,0) und 1 Teil 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat ("BCIP") und 1 Teil Nitroblau-Tetrazolium ("NBT"), das kurz vor Gebrauch hergestellt worden war.
  • 3) Eine Waschlösung wurde hergestellt mit 25 ml Waschlösungskonzentrat (0,5 M Tris, 4,8 M NaCl, 2% Tween 20) auf 1 Liter destilliertem Wasser, pH eingestellt auf 7,2.
    • ANALYSE:
  • 1. 25 g Hamburgerprobe ist im Verhältnis 1/10 (Gewicht/Volumen) in 225 ml modifizierter Trypton-Soja- Bouillon "MTSB" zu verdünnen, die unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt wurde:
  • - 30 g Trypton-Soja-Bouillon "TSB":BBL (Microbiological Systems, Cockeysville, MD)
  • - 1,5 g Gallensalze "#3" (Difco Laboratories, Detroit, MI)
  • - 1,5 g Dikaliumphosphat
  • - 20 mg Novobiocin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
  • - pH=7,4, und 30 Sekunden homogenisieren.
  • 2. Das Homogenat in einen 500m1-Kolben geben und 6-8 Stunden bei 36ºC unter Schütteln (60 Schüttelbewegungen pro Minute) inkubieren
  • 3. E. coli-Zählplatten (Kontrollplatten) der Marke Petrifilm mit 1 ml Anreicherungslösung oder 1 ml einer 1/10- Verdünnung von inkubierter, im voraus angereicherter Nährlösung impfena
  • 4. 18-24 Stunden bei 42ºC inkubieren.
  • 5. Die mittlere Fläche der Petrifilm -platte durch Abziehen der oberen und der unteren Folie freilegen. Die Übertragungsmembran mit der freiliegenden mittleren Fläche in Kontakt bringen, so daß die Übertragungsmembran die gesamte mittlere Fläche berührt und keine Luftblasen mehr zwischen der mittleren Fläche und der Membran vorhanden sind. Übertragungsmembran und mittlere Fläche für die spätere Ausrichtung genau markieren.
  • 6. Übertragungsmembran entfernen und in einen Becher mit überschüssiger Waschlösung mit der berührten Seite nach unten legen. Beim Zudosieren Membranen und inertes Trenngitter abwechseln, beginnend mit dem Trenngitter am Boden des Bechers. Becher schütteln. Waschlösung abgießen. Vorgang wiederholen und sicherstellen, daß kein überschüssiger restlicher Nährboden an der Membran haftet.
  • 7. Waschlösung abgießen. 4 ml neue Waschlösung pro Membran und 2 ml anti-O157:H7-Antikörperlösung pro Membran zugeben.
  • 8. 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter Schütteln (60 Schüttelbewegungen pro Minute) inkubieren, um sicherzustellen, daß die Membranen nicht aneinanderkleben.
  • 9. Antikörperlösung abgießen. In Waschlösung (ungefähr 10 ml pro Membran) spülen. Becher schütteln. Waschlösung abgießen. Zweimal wiederholen.
  • 10. 2 ml Substrat pro Membran in den Becher geben.
  • 11. 5 Minuten inkubieren unter leichtem Schütteln, um sicherzustellen, daß die Membranen nicht aneinanderkleben.
  • 12. Membranen in Leitungswasser spülen, um die Reaktion zu beenden.
  • 13. Membranen aus dem Becher nehmen und trockentupfen.
    • GEWINNUNG UND BESTÄTIGUNG VON VERMUTLICHEN O157:H7-KOLONIEN
  • 14. Mit einer Pasteur-Pipette auf einer wattierten Oberfläche Punkte auf einer Übertragungsmembran markieren und entfernen. Dies gelingt am einfachsten mit einer Drehbewegung, während die Pipette nach unten gedrückt und dann gerade nach oben gezogen wird, um den Punkt zu entfernen.
  • 15. Markierung auf Membran und Folie ausrichten, indem die Membran oben auf die Folie gelegt wird. Mit einem Markierungsstift mit Filzspitze die obere Folie leicht in dem ausgestanzten Loch berühren.
  • 16. Die obere Folie vorsichtig abheben und flach hinlegen. Mit einem Impfstab der Marke Prompt (BBL Microbiological Systems, Cockeysville, MD) den Nährboden dort berühren, wo der Markierungspunkt durchscheint. Leicht drehen und gerade hochziehen, um Nährboden wegzunehmen. Für maximal 3 Punkte pro Stab wiederholen.
  • 17. Ein 1ml-Röhrchen des Impfsystems der Marke Prompt (BBL Microbiological Systems, Cat. Nr. 26306, Cockeysville, MD) aufbrechen und den Stab einführen. 60 Sekunden verwirbeln, damit die Keime hinreichend vom Stab in die Lösung wandern können.
  • 18. Mit einer Bakterienübertragungsvorrichtung in der Form eines "Hockeyschlägers" 100 µl, 10 µl und 1 µl Prompt-Lösung auf 3 "MSA"-Platten (hergestellt mit 22,2 g MacConkey Agar- Basis mit 10 g D-Sorbitol auf 1 Liter Wasser) ausplattieren. Die 1µl- und 10µl-Proben lassen sich leichter ausstreichen bei Zugabe von 100 µl sterilem Wasser zu der Platte.
  • 19. MSA-Platte 18-24 Stunden bei 42ºC inkubieren.
  • 20. Die verdächtigen Kolonien auf Latexagglutination untersuchen mit einem "E. coli O157 Latex Test", Cat. # DR 620, Oxoid U.S.A., Inc., Columbia, MD.
    • BEISPIEL 3 Verwendung des Verfahrens bei klinischen Proben Direkte Probe
  • In einer örtlichen Tagesklinik wurde ein klinischer Doppelblindtest durchgeführt an Stuhlproben, in denen E. coli O157:H7 aufgetreten war. Die Proben wurden geimpft, inkubiert, extrahiert und bestimmt wie oben in BEISPIEL 2, Schritt 3 bis 20 beschrieben, außer daß die Stuhiproben im Verhältnis 1:10 in PBS verdünnt wurden und vor dem Befeuchten der E. coli-Zählplatten der Marke Petrifilm mit 1 ml der 1:1000 Verdünnung im Verhältnis 1:1000 verdünnt wurden. Wie aus der nachstehenden TABELLE 1 ersichtlich wird, wurden mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung alle vorgelegten positiven klinischen Stuhlproben (4 von 15) innerhalb von 24 Stunden korrekt identifiziert. Außerdem wurde mit dem Verfahren die Gesamtzahl der Koliformen und die Gesamtzahl von E. coli quantifiziert&sub1; und es wurde das Vorhandensein von E. coli O157:H7 in jeder Probe bestimmt.
  • Im Gegensatz dazu waren die Proben zuvor durch direktes Aufstreichen einer Stuhlprobe auf eine MSA-Platte, Inkubieren der Platten und Testen nach dem oben beschriebenen Latexagglutinationstest analysiert worden. Dies dauerte wesentlich länger als das Verfahren der vorliegenden Erfindung und war hinsichtlich der Empfindlichkeit begrenzt, vor allem bei Proben mit einer hohen Hintergrundkontamination (z.B. mehr als etwa 200 Koliforme pro E. coli O157:H7 Zelle). TABELLE I Auftreten von Keimen im Minnesota Daycare Center (August 1988) TABELLE I (Forts.) Auftreten von Keimen im Minnesota Daycare Center (August 1988)
    • BEISPIEL 4 Identifizierung eines Antigens als LPS
  • LPS wurde auffolgende Weise von E. coli O157:H7 isoliert. Eine einzelne Kolonie von E. coli O157:H7, die über Nacht auf einer Standard-Agarplatte (5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose, 15 g Agar, Wasser auf 1 Liter) gezüchtet worden war, wurde zum Impfen eines 2ml-Röhrchens mit Trypton-Soja- Bouillon (BBL Microbiological Systems, Cockeysville, MD) verwendet. Man ließ die Kultur 18 Stunden bei 36ºC wachsen. Die Kultur wurde 3 Minuten mit 6000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde weggegossen. Die Zellen wurden wieder in 100 µl von 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH=7,2; 1,2 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,22 g NaH&sub2;PO&sub4; H&sub2;O, 8,5 g NaCl, H&sub2;O auf 1 Liter) suspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in einem kochenden Wasserbad 2 1/2 Stunden erhitzt, um den Zellinhalt freizusetzen und zu hydrolysieren. Die Suspension wurde 3 Minuten mit 6000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde weggegossen.
  • LPS wurde in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,15 % Gallensalzen Nr. 3 suspendiert, die in einer Konzentration von 250 ng/ml zugegeben wurden, damit das LPS leichter in Lösung gehen konnte. 50 µl des Antigenpräparats wurden auf eine Übertragungsrnembran ("Opticite #520") aufgetupft. 50 µl phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurden als Kontrolle auf dieselbe Membran aufgetupft. Die Membran wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und in überschüssige Pufferlösung in einem 250ml-Glasbecher gelegt. Die Pufferlösung wurde sofort abgegossen, und es wurden 4 ml neue Pufferlösung, die 200 ng anti-O157:H7-Antikörper (KPLY Inc.) enthielt, zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Antikörperlösung wurde abgegossen, und der Filter wurde 3 mal in Pufferlösung gewaschen. Es wurde eine BCIP/NBT-Substratlösung (2 ml) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) zugegeben und 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Es wurde überschüssiges deionisiertes Wasser zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Das Vorhandensein von gebundenem anti-O157:H7-Antikörper wurde durch Sichtprüfung anhand des Auftretens von blauen Flecken ermittelt, die auf eine Reaktion der konjugierten alkalischen Phosphatase hindeuten. Am Ort des PBS war keine Farbe festzustellen.
  • LPS wurde von dem Actinobacillus actinomycetemcomitans ("Aa") Stamm mit der American Type Culture Collection Accession No. 29523 isoliert, wie sie in Kiley et al., Inf. Imm. 30:862 (1980) beschrieben ist. LPS wurde in 0,01 M PBS mit 0,15% Gallensalzen Nr. 3 suspendiert, die in einer Konzentration von 250 ng/ml zugegeben wurden, damit das LPS besser in Lösung gehen konnte. 50 U¹ des Antigenpräparats wurden auf ein& Übertragungsmembran ("Opticite #520) aufgetupft. 50 µl PBS wurden als Kontrolle auf dieselbe Membran aufgetupft. Die Membran wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und in überschüssige Pufferlösung in einem 250ml-Glasbecher gelegt. Die Pufferlösung wurde sofort abgegossen und 4 ml neue Pufferlösung, die 200 ng für das LPS von Aa spezifische anti- Aa-Antikörper enthielt, wurden zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Antikörperlösung wurde abgegossen, und der Filter wurde 3 mal in Pufferlö: sung gewaschen. 4 ml neue Pufferlösung, die 200 ng phosphatasemarkiertes anti-Maus-IgG von Ziegen (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) enthielt, wurde zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die antikörperhaltige Pufferlösung wurde abgegossen, und die Membran wure zweimal mit herschüssiger Pufferlösung gewaschen. Eine gemäß BEISPIEL 2 hergestellte - BCIP/NBT-Substratlösung (2 ml) wurde zugegeben und 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Es wurde überschüssiges deionisiertes Wasser zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Das Vorhandensein von gebundenem anti-Aa LPS-Antikörper wurde durch Sichtprüfung anhand des Auftretens von blauen Flecken ermittelt, die auf eine Reaktion der konjugierten alkalischen Phosphatase hindeuteten. Am Ort von PBS wurde keine Farbe festgestellt.
    • BEISPIEL 5 Bestimmung geeigneter Übertragungsmembranen
  • E. coli O157:H7 wurde über Nacht gezüchtet, und LPS-Antigen wurde gemäß BEISPIEL 4 isoliert, außer daß die am Ende entstehenden Pellets wieder in TSB-Bouillon, die 0,1 % Gallensalze Nr. 3 enthielt, suspendiert wurden. Es wurden Quadrate der folgenden Übertragungsrnembranen mit einer Größe von ungefähr 5 cm x 5 cm (2 in. x 2 in.) verwendet:
  • Polystyrol - "Opticite", Dow Chemical Co., Granville, Ohio, Cat. Produkt Nr. 02455
  • Cellulosenitrat - "Nytran", Schleicher and Schuell, Keene, N.H., Cat. Nr. 8A85
  • Nylon - "Biodyne A", Pall Biosupport Co., Glen Cove, N.Y., Cat. Nr. BNPGRB75 Polypropylen (mikroporös) - hergestellt mit 46,5 % Polypropylen, 55,3 % Mineralöl und 0,2 % Keimbildner "Millad 3905" gemäß Beispiel 9D von US-Patent Nr. 4,726,989
  • Polyethylen (mikroporös) - hergestellt mit 40 % Polyethylen und 60 % Mineralöl gemäß dem in Beispiel 8 von US-Patent Nr. 4,539,256 beschriebenen Verfahren.
  • Die Porengröße des mikroporösen Polypropylens und Polyethylens betrug 0,22 Um und 0,424 Um, ermittelt nach dem in dem Patent '256 beschriebenen "bubble-point" Verfahren, und das Porenvolumen betrug 63 % bzw. 84 %, ebenfalls ermittelt nach dem in dem Patent '256 beschriebenen Verfahren.
  • 50 µl des E. coli O157:H7 Antigenpräparats wurden auf jede Membran getupft. 50 µl TSB-Nährboden mit 0,15 % Gallensalzen wurden als Kontrolle auf jede Membran getupft. Jede Membran wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und in überschüssige Pufferlösung in einem 250ml-Becher gelegt. Die Pufferlösung wurde sofort abgegossen, und 4 ml neue Pufferlösung, die 200 ng anti-E. coli O157:H7 Antikörper (KPL, Inc.) enthielt, wurden zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die antikörperhaltige Pufferlösung wurde abgegossen, und die Membranen wurden zweimal mit überschüssiger Pufferlösung gewaschen. Phosphatasesubstratlösung (2 ml) wurde zugegeben und 5 Minuten inkubiert, wonach überschüssiges deionisiertes Wasser zugegeben wurde, um die Reaktion zu beenden.
  • Das Vorhandensein von gebundenem anti-O157 Antikörper wurde durch Sichtprüfung anhand des Auftretens blauer Flecke ermittelt, die auf eine Reaktion der konjugierten alkalischen Phosphatase hindeuten. Eine bläuliche Färbung auf der gesamten Oberfläche einer bestimmten Membran deutete auf eine umerwünscht hohe Hintergrundkonzentration hin, z.B. einen unerwünscht hohen Anteil an Antikörpern, die sich unspezifisch an die Membran selbst oder an nicht mit LPS extrahierte Moleküle binden. Das Fehlen jeglicher blauen Farbe deutete darauf hin, daß keine nachweisbaren Mengen LPS durch die spezielle Membran extrahiert wurden.
  • Wie aus TABELLE II unten hervorgeht, zeigten die hydrophileren Membranen, Cellulosenitrat und Nylon, unerwünscht hohe Hintergrundkonzentrationen, vermutlich aufgrund ihrer Fähigkeit, große Proteinmengen zu adsorbieren. Im Gegensatz dazu waren die verwendeten hydrophoberen Polystyrol-, Polypropylen- und Polyethylenmembranen in der Lage, sowohl LPS bis zum offensichtlich Ausschluß von Protein zu extrahieren und als geeigneter Träger für die Immunreaktion eines solchen LPS mit einem Antikörper zu dienen&sub0; Insbesondere zeigte das Polystyrol die höchste LPS-Bindung und die geringste Hintergrundfarbe aller untersuchten Übertragungsmembranen. TABELLE II

Claims (7)

1. Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von Keimkolonien, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (1) Impfen einer Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden, der aus einem im wesentlichen flachen selbsttragenden Körper und einer wenigstens auf einen Teil des Körpers aufgeklebten Abdeckfolie besteht, mit einem Inokulum von einer Probe, die vermutlich Keime enthält, (2) Inkubieren des geimpften Nährbodens unter Bedingungen, die geeignet sind, das Wachstum von Keimkolonien zu ermöglichen, (3) Freilegen einer Oberfläche des Nährbodens auf der Platte durch Entfernen der Abdeckfolie und die freiliegende Oberfläche mit einer eigenen Übertragungsmembran in Berührung bringen, wobei die Übertragungsmembran hydrophob ist, in einer Weise, die es der Übertragungsmembran erlaubt, keimspezifisches Antigen aus dem Bereich der Keimkolonien zu extrahieren, (4) Entfernen der Übertragungsmembran von der Oberfläche des Nährbodens, und (5) Feststellen des Vorhandenseins des keimspezifischen Antigens auf der Übertragungsmembran mit geeigneten Mitteln, wobei die Zellen der Kolonien vor der Extraktion nicht aufgelöst werden, die Übertragungsmembran nach der Extraktion nicht blockiert wird, die Antigene in dem extrazellulären Bereich der Keimkolonie vorhanden sind, die Antigene entweder vollständig hydrophob sind oder wenigstens einen hydrophoben Bereich aufweisen, durch den es möglich wird, daß das Antigen rasch durch die Oberfläche der hydrophoben Übertragungsmembran extrahiert wird, und wobei die Antigene ausgewählt sind aus jenen, die auf der Oberfläche Lipopolysaccharid (LPS) enthalten, und jenen, die Toxine pathogener Keime sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend den Schritt des Lokalisierens der Kolonien auf der Oberfläche des Nährbodens, indem die Lage des Antigens auf der Übertragungsmembran mit der Lage der Kolonien auf dem Nährboden in Zusammenhang gebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Übertragungsmembran ein Polymer enthält, das ausgewählt ist aus Polystyrol, Polyethylen und Polypropylen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Keime vom Serotyp E. coli O157:H7 sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Antigen ausgewählt ist aus Proteinen, Lipoproteinen und Lipopolysacchariden.
6. Gegenstand zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 1, umfassend eine Platte mit einem rekonstituierbaren Trockennährboden, bestehend aus einem im wesentlichen flachen, selbsttragenden Körper und einer auf wenigstens einen Teil des Körpers aufgeklebten Abdeckfolie in Kombination mit einer hydrophoben Übertragungsmembran.
7. Gegenstand nach Anspruch 6, bei dem die Membran und die Platte als Bestandteile eines Testkits bereitgestellt werden, und die Membran zum Zeitpunkt des Gebrauchs mit dem Nährboden auf der Platte physisch in Kontakt gebracht wird.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658790A (en) * 1986-09-04 1997-08-19 Bio 101, Inc. Cell culture media formulated in unit dose
DE3903777A1 (de) * 1989-02-09 1990-08-16 Bruker Analytische Messtechnik Verfahren zur schnellen detektion von mikroorganismen in proben und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens
JPH05137595A (ja) * 1991-11-15 1993-06-01 Kazuyuki Sugawara 選択的細菌培養検査片
US5411872A (en) * 1993-09-08 1995-05-02 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transfected cell selection
US5750357A (en) * 1994-05-18 1998-05-12 Microquest Diagnostics, Inc. Method of rapid analyte detection
US5681712A (en) * 1995-06-02 1997-10-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Surface colony counting device and method of use
EP0857201A1 (de) * 1995-09-18 1998-08-12 Minnesota Mining And Manufacturing Company Granulierte mediumteilchen enthaltende dünnen film kultur schicht
US6022682A (en) * 1996-08-14 2000-02-08 Minnesota Mining And Manufacturing Company Article and method for detection of enterotoxigenic staphylococci
US5958675A (en) * 1997-04-18 1999-09-28 3M Innovative Properties Company Method for detecting bacteria using bacteriophage, contrast-coloring dye and precipitable dye
US5976827A (en) 1997-12-12 1999-11-02 Akzo Nobel, N.V. Sensor device for detecting microorganisms and method therefor
US5912115A (en) * 1997-12-12 1999-06-15 Akzo Nobel, N.V. Evacuated sensor device for detecting microorganisms in blood samples, and method thereof
US6251624B1 (en) 1999-03-12 2001-06-26 Akzo Nobel N.V. Apparatus and method for detecting, quantifying and characterizing microorganisms
US6649406B1 (en) 1999-11-23 2003-11-18 3M Innovative Properties Company Device for propagation and storage of microorganisms
WO2001074168A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-11 Home Health Science Inc. Method and kit for detecting microorganisms
US6632661B2 (en) * 2000-12-07 2003-10-14 3M Innovative Properties Company Self-spreading microbiological culture device
ATE470859T1 (de) * 2001-09-06 2010-06-15 Straus Holdings Inc Schneller und empfindlicher nachweis von molekülen
CA2623408C (en) * 2005-09-26 2014-04-01 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette containing growth medium
JP4915527B2 (ja) * 2007-09-27 2012-04-11 凸版印刷株式会社 電気泳動兼転写用積層体、電気泳動兼転写用チップ、電気泳動兼転写装置、電気泳動兼転写方法、電気泳動兼転写用積層体の製造方法
AU2009296528A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Straus Holdings Inc. Imaging analyzer for testing analytes
US8828682B2 (en) 2008-12-09 2014-09-09 3M Innovative Properties Company Methods and articles for detecting hemolytic microorganisms
BRPI1005946A2 (pt) 2009-02-26 2019-09-24 3M Innovative Properties Co métodos para detectar um microorganismo e para detectar atividade desoxirribonuclease, artigo de detecção e kit
JP6105613B2 (ja) 2011-11-07 2017-03-29 ラピッド マイクロ バイオシステムズ インコーポレイテッド 無菌試験用カセット
WO2013158666A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cell culturing device
BR112015001570A2 (pt) 2012-07-25 2017-07-04 3M Innovative Properties Co método para fabricar um meio de nutriente, composição, kit e dispositivo de cultura de filme fino
ES2535583B1 (es) * 2013-11-11 2016-02-25 Marhlidy MONCADA AMAYA Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos
JP6688561B2 (ja) * 2015-04-28 2020-04-28 デンカ生研株式会社 微生物抗原の回収法
US10662460B2 (en) 2015-12-07 2020-05-26 3M Innovative Properties Company Method of enumerating coliform colonies
EP3387106B1 (de) 2015-12-07 2022-03-02 3M Innovative Properties Company Vorrichtung und verfahren zur ausgabe von mikroorganismuskulturplatten
EP3607083B1 (de) 2017-04-03 2021-11-10 3M Innovative Properties Company Schneller nachweis von e. coli in einem dünnschichtkulturvorrichtung
WO2018187195A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 3M Innovative Properties Company Rapid detection of e. coli in a thin film culture device
US20200399574A1 (en) 2017-12-13 2020-12-24 3M Innovative Properties Company Water-reconstitutable culture medium resistant to liquefaction by microorganisms
AU2019255388A1 (en) 2018-04-19 2020-12-17 First Light Diagnostics, Inc. Detection of targets

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565783A (en) 1981-01-27 1986-01-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Dry culture media
US4539256A (en) * 1982-09-09 1985-09-03 Minnesota Mining And Manufacturing Co. Microporous sheet material, method of making and articles made therewith
US4617265A (en) * 1984-09-19 1986-10-14 Board Of Regents, University Of Texas System Colony blot assay for enterotoxigenic bacteria
US4726989A (en) * 1986-12-11 1988-02-23 Minnesota Mining And Manufacturing Microporous materials incorporating a nucleating agent and methods for making same

Also Published As

Publication number Publication date
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