JPH03105252A - コロニーブロッティング法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はプロツテイングの分野、即ち生化学的あるいは
免疫化学的検定といった目的に対して、画線（あるいは
拡敗）し、インキュベーションした露出コロニーをもつ
平板培養表面から、生物学的材料を転写するためのフィ
ルムあるいは膜のような材料の使用に関する。もう一つ
の面において、本発明は一般にはイムノブロツテイング
分野に、そしてとりわけリボ多糖類といった抗原のイム
ノブ口ツティングに閏する。もう一つの面において、本
発明は病原性微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７と称する株の検出法に関する。

［従来の技術］ プロットした分子の免疫検定を行なうことを含めて種々
な目的に対し、電気泳動で分離した生物学的分子を固体
支持体上にブロツテイングする方法が使用されて来た。

「『クエスターン　プロット」はこの点で恐らく最もよ
く知られた方法の一つであろう。この方法は固体支持体
の抗体ブローブの使用により、分離、ブロツテイングさ
れたタンパク質の同定を可能にしている。一般的には、
ＲＯｎａｒｔ　　Ｊ．およびＩ．　Ｖ．　Ｓａｎｄｏｖ
ａｌ，　　”ｈｅｓｔｅｒｎＢｌＯｔＳ″，　Ｈｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｉｏｌ．，３　３　草、１０４
巻、Ａｃａｄ．　Ｐｒｅｓｓ．　（　１　９　８　４　
）参照。

タンパク質や多糖類に加えて、リボ多糖類も転写技術に
より同定された。例えば、Ｐｙｌｅ，　Ｓ．　１４．お
よび１４．Ｂ．　Ｓｃｈｉｌｌ，　　“Ｒａｐｉｄ　Ｓ
ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ＾ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＢａＣ
ｔｅｒｉａｌ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｓ　ｂｙＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　）４
ｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”．Ｊ．ｌｍｓｕｎｏｌ、
｝ｌｅｔｈ．，８５　：３７　１−３８２　（１９８５
）参照。

「コロニーブロツテイング」として知られるもう一つの
技術【ま、表面に細菌コロニーをもつ寒天平板のような
平板培地表面から固体支持体へ生物学的分子を転写する
ものである。例えば、最初にコロニーを溶かす方法を記
述したＫＯｌｌｐ，　Ｄ．　Ｊ．およびＡ，　Ｆ．　ｃ
ｏｗｍａｎ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｅｄＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｂｙ　Ｄｉｒｅｃ
ｔ　ｌｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆＣｏｌｏｎｉｅｓ　
”，　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎｏｌ．，
８　３章、７９巻、八ｃａｄ．　Ｐｒｅｓｓ．　（　１
　９　８　１　）参照。

次に溶解細胞から放出されたタンパク質をＣＮＢｒ紙に
共有結合で結合し、放射性同位体でｖＡ識した抗体との
反応により検出する。

注入平板型培地に対してコロニープロップインクは普通
使用されない。この培地の場合には、コロニーの大多数
が培地表面に存在せず、また以下にもつと詳しく記述す
る再構成可能な乾燥培地と共に使用する方法については
以前に記述されたことがない。

要求される時間、努力、専門的知識および経費のため、
前記微生物の免疫化学的同定は研究室という情況で用い
るのが菖通であって、食品、化粧品、および医薬品工業
で、あるいは環境測定の目的で行なわれるスクリーニン
グのように、微１一物の存在を調べるため試料の日常的
大容量スクリーニングに対して使用するのとは非常に異
なっている。

これに対し、微生物の存在を調べるため試利を日常的な
大容損スクリーニングにかけるこのような方法が、依然
として骨の折れる、そして（または）比較的低感度の生
化学的あるいは微生物学的技術により実施されている。

これら技術は全細胞数の粋定および（または〉前濃縮ブ
イヨン培地の使用とその後の選択的寒天培地の使用をし
ばしば含ｌυでいる。このような技術は一般に全微生物
数に関する単純な定量的解答か、または関心をもたれる
特定の微生物種の存在に閏して定性的な（例えば、陽性
／陰性）解答かのいずれかをもたらすに過ぎない。現在
の迅速スクリーニング技術は、個々の微生物の存在の表
示ならびにその微生物の′ｍ度の指示の両方を与えつる
ケースはたとえあったとしてもごく稀であり、まして使
用者が同定された微生物をそれ以上培養し特徴づけるた
めに位置を決めＩＩｉ離ずることなど到底できない。

より良いスクリーニング法に対する必要性を強調した好
例は、肉試料中のｒ　Ｏ　１　５　７　：　Ｈ　７　Ｊ
として同定された病原性Ｅ．　ＣＯＩｉ株の流行である
。

例えば、ＲｉｌｅＶ．″Ｔｈｅ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏ１ｏ
ｇｉｃａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄ　Ｈｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｔｌｅ
ｎ＋ｏｒｒｈａｇｉｃＣｏｌｉｔｉｓ　ｕ　，　　＾ｎ
ｎ．　　Ｒｅｖ．　　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ．４　１　　
：　３　８　３−４０７　（１９８７）参照（この開示
は参考として水明ｉｌｌ中に取り入れている）。Ｅ．　
ｃｏｌｉ　Ｏ　１５７：口７の検出に対して有用である
と記載された試験にＤｏｙ　Ｉ　ｅ等、Ａｐｐｌｉｅｄ
　ａｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａＨｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ，　５３　（　１　０）　：　２３９４−２３
９６（１９８７）、およびＴｏｄｄ等、＾ｐｐｌｉｅｄ
　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｒｖｅｎｔａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇＶ．　５　４　（　１　０　）　：　２５３６
−２５４０　（１９８８）が記述した方法がある《これ
の開示は参考として木明ｌｌｌ書中に取り入れている〉
。

現在食肉産業は大部分上記Ｄｏｙｌｃの方法に頼ってい
る。この方法は基本的には濃縮法であって、試料を前濃
縮ブイヨンで発育さ『、希釈し、選択的寒天上で培養し
てＥ．ｃｏｌｉ０１５７：口７コロニーを非病原性バッ
クグランドＩｌｌＩ胞のコロニーの中から視覚的に同定
しようとするものである。この方法はＥ．　ｃｏｌｉ　
０１　５７　：Ｈ７のコロニーを他のコロニーから視覚
により識別する必要性を含めて幾つかの欠点がある。一
般に多数の非病原性細菌が存在したならば、Ｅ．　ｃｏ
ｌｉ　０１　５７　：目７細胞を見落とす可能性が多分
にあるので、望ましくない程多数の誤まった陰性判定に
つながる。

［発明が解決しようとする課題］ ＩＪ．　　Ｓ．　　Ｆｏｏｄ　　ａｎｄ　　Ｄｒｕｇ　
　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（　ｒＦＤＡＪ　）そ
の他の機関が食品といった試料中の微生物病原体を同定
しかつ定量する必要性にますます関心を高めつつある事
実を、食品産業が迅速、高感度、経費効率のよい実用的
な方法を必要としている事実と合わせ考えると、現在手
に入る研究指向の技術はこのような目的に適さない。

［ｙ！題を解決寸るための手段Ｊ 本発明は微生物コロニーの存在を同定し、任意に位置を
突き止める方法を提供するもので、次の王稈： １）再構成可能な乾燥平板培地を、微生物を含むと思わ
れる試料から得た接種材で接種し、２）接種した平板を
、微生物コロニーの発育に適した条件下でインキュベー
ションし、３）平板の発育培地表面を露出させ、この露
出面を、微生物コロニー領域から膜が微生物特異性抗原
を抽出できるように適当な転写膜と接触させ、４）転写
膜を培地の表面から取り除き、５）転写膜上の微生物特
異性抗原の存在を適当な手段により測定する からなる。

本発明はまた再構或可能な乾燥平板培地を転写膜とのコ
ンビネーションとして含有するｌｍ物品を提供する。

特に適当な具体例を示すと、本発明方法ならびに物品は
微生物により産生されそしてその微生物に対して特異的
なリポ多糖類抗原を検出するために用いられる。また、
本発明の特に適当な具体例を示すと、この方法は抽出に
先立ちコロニーの細胞を積極的に溶かす必要を避け、ま
た抗体の望まない非特異的結合を防止するために抽出後
の転写膜を封鎖する必要もない。溶解工程および（また
は）封鎖工程は一般に従来のコロニーブロツテイングに
は必要なので、本発明方法が特に便利であることは明ら
かである。

更に本発明は、培地上に同時に存在する実質的にすべて
のコロニーのスクリーニングが可能であり、この点で更
に確認あるいは特徴づけのために選択的寒天平板から代
表数のコロニーを拾い出すことを必要とする方法とは全
く異なる。本発明に係る平板が表面画線培地あるいは表
面拡散培地よりも注入型平板培地に一居よく似ていると
いう事実を示せば、このような平板上で発育さじた実質
的にすべてのコロニーの抗原が平板の発育培地表面から
抽出できることは特に驚くべきことである。

本発明はまた使用者が平板表面上の微生物の最初のコロ
ニーの位置を決定できるようにするのでコロニーのそれ
から先のｔｉｔｓおよび特徴づ（ノを可能にする。

本発明方法および装叙は特異性を利用して実行する必要
のある微生物スクリーニングに、しかし商業的な乳製品
、食品、水、化粧品、および医薬品工業におけるように
、多数の試料に対して安価かつ迅速に実行する必要のあ
る微生物スクリー二ングに対して特に有用である。

本発明方法は、再構或可能な乾燥平板培地を、微生物を
含むと思われる試料で接種し、接種した平板をインキュ
ベーションし、インキュベーションした平板の発育培地
表面に転写膜を接触させて微生物に特異的な抗原を抽出
し、転写膜を取り除き、転写膜上の微生物特異的抗原の
存在を、そして任意に場所を決定するという諸工程を一
般に含んでいる。

これら工程を本発明の特に適当な具体例に関してもっと
詳しく記述することにするが、本法は抽出に先立ち微生
物細胞を溶解する必要を避け、また抗原検出に先立ち転
写膜を封鎖する必要もない。

後述する特に適当な具体例によると、この転写膜はポリ
スチレンフィルムから調製され、興味の対象となる微生
物はＥ，　ｃｏｌｉ　０　１　５７　：口７と称する株
であり、検出される抗原は面清型Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｑ１
５７に特異的なリボ多糖類である。

本発明方法における最初の段階として、再構或可能な乾
燥平板培地を、興味の対象となる微生物を含む疑いのあ
る試料から得た接種材で再水和する。

本発明に使用するのに適した培地は、使用の容易、興味
の対象となる微生物の迅速な発育、選択性、およびコス
トといった特性を最も良く兼有する培地である。培地は
、培地が寸法的にも構造的にも完全なままでその表面か
ら抗原を抽出でき、それによって後でコロニーの位置決
定および単離をできねばならない。

特に適当な培地の例は、米国特許第４，５６５．７８３
居明ｔｉ８ｍ、および同時出願中の米国特許願番号第３
５４．６２７号明Ｉ８書（１９８９年、５月１９日出願
）（これら両者の開示は参考として本明細書中に取り入
れてある）に記威されている。

これらの型の乾燥培地は現在３　Ｍ　　ｃｏｉＤａｎＶ
により商品名「Ｐｅｔｒｉｆｉｌｉ＋”Ｊで販売されて
いる。

Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｏ　１　５７　：口７の検出に使用す
るのに特に適当な乾燥平板培地は、例えばＰｅｔｒｉｆ
ｉｌｍ”大腸菌カウント平板、一層好ましくはＰｅｔｒ
ｉｆｉｌｍ”Ｅ．　ｃｏｌｉカウント平板のような大Ｉ
ｉ！菌選択性平板培地である。Ｐｅｔｒｉｆｉｌｇｉ１
Ｈ平板は製造者の説明書によると水性試料で接種するこ
とができるので、接種により再水和することができる。

この種の乾燥平板培地が更に好ましいのは、現在特に適
当な具体例によると、カバーシートが培地に対し大気か
ら密閉された環境を与えるからである。密閉された培地
の性質上、微生物により放出されたガス、例えば一般に
大ＷＡ菌類により放出されたガスが各コ〇二一の周りに
目に見える気泡を形づくる。本出願者等はこの培地の閉
鎖性がＬＰＳのような抗原の極性および非極性と合わさ
って抗原を培地とガスとの間の境界而に濃縮することが
できるので、本発明に係る特に適当な方法に従い容易に
かつ視覚的に検出できる特徴的な円形の表示が得られる
ことを発見した。

本発明方法への使用に適した試料は食品、水、化学薬品
、空気、および（または）　Ｉｆｆ境試料を含むがこれ
に限らない。必要な試料の量は、例えば要求される感度
および接種しようとする培地の型により変化する。例え
ば、試料１００９当り１細胞未満の感度を得るには、そ
して試料１００ｇ当り１細胞未満の統計学的保証を得る
ためには少なくとも試料１００ｇ、なるべ＜５００ｇの
試料を試験する必要がある。試料は当業者のよく知る種
種な方法で試験できる。例えば、試料を適当な発育培地
あるいは緩衝液で希釈しく例えば、１／１０、１／　１
００など）そして前濃縮の目的で均質化するか、または
試料を、例えば水または乳試料あるいは食品すすぎ液の
ようなときにはそのまま、培地を接種するために直接使
用できる。環境表面試料は、前濃縮の目的のためには、
表面域を拭き取り、スワブを適当な培地ですすぐか、あ
るいは培地に直接適用するために無菌の水または緩衝液
ですすぐことによりｊｒＪられる。

希釈しない試料、あるいは希釈し次に適当な培地または
緩衝液で均質化した試料は、微生物ＩＩｌ胞数をふやす
ため、適当な方法で薗濃縮できる、例えば接種に先立ち
培養することができる。例えば、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｏ　
１　５７　：Ｈ７を検出する場合には、食品試料を、例
えば適当な液体培地で１対１０（重量対体積〉のオーダ
ーで希釈し、そして振盪しつつ、または振盪せずに、４
から２４時間、なるべくは６から８時間、２０℃から４
４℃、なるべくは３２℃から４２℃、最も好ましくは３
６℃においてインキュベーションすることにより試料を
調製できる。

前濃縮の後、試料の接種材を用いて培地を常法により接
種する、例えば乾燥平板培地、例えばｐｅｔｒ＋ｒ＋＋
ｓ”乾燥平板培地を再水和する。接種された培地は、興
味の対象となる微生物のコロニの発育を許すのに適した
条件下でインキュベーションする。例えば、再水和した
ＰｅｔｒｉｆｉｌｍＴＨ板を６から２４時間、なるべく
は１８から２４時間、２０℃から４４℃、なるべくは３
６℃から４２℃、最も好ましくは４２℃でインキュベー
ションする。

インキュベーシコン後、例えば平板の透明力バーシ一ト
を取り去ることにより平板の発育培地表面を露出させ、
膜が微生物特衣性抗原を微生物のコロニー領域の培地か
ら抽出するような方法で、この露出面を適当な転写膜と
接触させる。

適当な転写膜は適当な形、例えばフィルム様、繊維状、
あるいは微細多孔性としたもので、例えば有機または無
機の適当な材料からつくられたものでよい。適当な転写
膜は結合容復、強度および寸法安定性、疎水性、構造（
コンフィグレーション〉、および色といった諸性質を最
適に兼有する。

適当な転写膜にはタンパク質、リボタンパク質、および
リボ多糖類を吸着できるものが含まれるが、これに限定
ざれない。適当な転写膜は重合体、例えばボリブロビレ
ン、ポリエチレン、ボリスチレン、ニトロセルロース、
またはナイロンを用いてつくられる。

転写膜の厚さは、膜が意図する目的に合った厚さを有す
る限り特にＩＩＩ限はない。一般に、転写膜は２５．４
μから２５４μ（１ミルから１０ミル）のオーダーの厚
さ、なるべくは２５．４μから１２７μ（１くルから５
ミル）のオーダーの厚さである。

リボ多糖類といった疎水性抗原に対して使用するのに特
に適した転写膜は、一般にそれ自身が疎水性であるもの
である。膜の疎水性を表示する一つの便利な徴候は、例
えばＡＳＴＭ試験法Ｄ−５７０により測定される膜の水
吸収量である（これの開示は参考として本明［ｌ書中に
取り入れている〉。この方法によると、ＬＰＳ抗原に対
して用いるのに特に適当な膜は１％（Ｗ／Ｗ）未満のオ
ーダー、最も好ましくは０．１％未満のオーダーの水吸
収を示す。

ＬＰＳ抽出に対して使用するのに特に適当な転写膜はボ
リスチレン、ボリブロビレン、またはポリエチレンから
つくられる。特に適当なものは米国特許第４．５３９．
２５６号明細書（その開示は参考として本明細書中に取
り入れている）に記載された微細多孔性ポリエチレンお
よびポリプロピレン膜である。特に適当なボリスチレン
転写膜は商品名「Ｏｐｔｉｃｉｔｃ”＃　５　２　０　
Ｌａｂｅｌ　ＦｉｌｍＪとしてＤｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ．から入手できるフイルムからつくられる。こ
のフィルムはボリスチレンおよびスチレン／ブタジエン
共重合体を、合計重合休含最８０％で二酸化チタンと共
に含むと記載されていて、なるべくは２．５ミル〈メー
トル法で６３．５μＴｒＬ）厚のシートとして得るのが
よい。

このフィルムを望む形状に、例えば用いる発育培地の表
面と実質的に同じ寸法の円形に、切ることができる。

ＰＱｔｒｉｆｉｌＨＮ平板を用いた場合、抽出を行なう
には一般に上のカバーシートを分離して発育培地の表面
を露出させる必要がある。転写股をこの露出面と培地表
面から抗原を抽出するために適当な方法で接触させる。

本発明の特に適当な具体例を示すと、表面からの転写膜
によるＬＰＳの抽出は一般に瞬間的に起こる、即ち転写
膜を膜が実質的に培地の全面と接触するように培地上に
置き、それから直ちに取り除く。任意に膜をもっと長時
間培地表面と接触させておいても悪影響はない。膜をな
るべく培地と方向性をもたせて、例えば放射状に置くの
がよく、従って後に特定のコロニーの位置を決めるため
に膜と再び元通り並べられるようにできる。方向を決め
るには、適当な仕方で、例えば膜と培地の両方に印をつ
けるか切れ目をつけることにより行なうことができる。

抽出に先立ち、例えば培地中の微生物コロニーを物理的
、化学的、あるいは生物学的試剤に試露することにより
抗原を細胞から培地中に放出させる必要がある。解放用
の適当な試剤には、溶媒、例えばクロロホルム、洗浄剤
、例えば硫酸ドデシルナトリウム、キレート剤、例えば
ＥＤＴＡ，あるいは酵素、例えばリゾチーム（これは細
胞を溶かし、細胞内の抗原を放出させるのであろう〉が
含まれるが、これに限定しない。例えば、Ｇｒｕｎｓｔ
ｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．　Ｈａｔ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．　７２　（１０）：３９６１−３９６５　（１
９７５）参照（このｎ示は参考として本明細書中に取り
入れている）。性質上ｌｌｌ胞外である抗原に対しては
、抽出前に溶解工程を殆ど必要としないことが分かった
。

転写膜は適当な手段により、例えば膜を培地面に再暴露
したりあるいは裸の指のような酵素をもつ表面に暴露し
ないように注意しつつビンセットで持ち上げることによ
り、培地表面から取り除くことができる。膜はなるべく
外来物質を除去するため適当な条件下で十分な時間洗浄
するのがよい。

例えば、ボリブロビレン、ボリスチレン、およびポリエ
チレンからつくられた膜のように吸水性のない疎水性転
写膜に対しては、少陽の洗浄剤、例えばｒｗｅｅｎ　２
　０あるいはＴｗｅｅｎ　８　０を含み中性まで緩衝し
た洗浄溶液で３回洗えば十分である。

もっと親水性の股に対しては、付着したりトラツブされ
た外来物質を除去するために、洗浄溶液中で１０回まで
の洗浄サイクルを必要とすることがある。

転写膜による抽出後、しかし膜上の抽出された抗原の存
在の決定前に、抗体のような試薬と非特異的に結合しつ
る残りの部位を除去するために、使用者は膜を任意に封
鎖できる。封鎖は、例えば転写膜をゼラチン、アルブミ
ン、または再水和乾燥乳の溶液中０．１％から１０％、
なるべくは０．５％から５％（重量／体積〉のオーダー
の濃度で転写膜をインキユペーションすることにより達
或できる。例えば、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，　Ａｎａｌ，　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｈ２：１９５〜２０３　（１９８１
）参照（この開示は参考として本明細書中に取り入れて
いる）。

特に適当な転写膜は、抗体が膜へ非特異的に結合する傾
向がないので、封鎖工程を必要としない。

水明４Ｉ国中で用いた用語「抗原」は検出可能な生物学
的高分子、例えば本発明方法により微生物コロニーの領
域から転写膜によりインキュベーション後の平板から抽
出できる特異的な結合の相手を指す。

本明細書中で用いた用詔「抽出する」とは、抗原を培地
から膜へ移すことを言う。これは例えば受動的吸着、毛
細管作用による培質の取り込みなどによる結合へと導く
直接接触により行なわれる。

適当な抗原には、性質が実質的にタンパク質、リボタン
パク質、あるいはリボ多糖類である抗原が含まれるが、
これに限定されない。特に適当な抗原は微生物コロニー
の細胞外領域に存在し、全体的に疎水性か、または少な
くとも疎水性転写膜の表面によって抗原を素速く抽出で
きる程の疎水性部分をもつ。これら因子の両方が満足さ
れたとき、その抗原はしばしばコロニーを溶解すること
なく抽出することができ、そして前記のように封鎖しな
くとも検出できることが分かった。特に適当な抗原には
病原性微生物の表面ＬＰＳ類およびｆ８素が含まれる。

特に好ましい抗原の一例は、血清型Ｅ．ｃｏｌｉ　０１
５７：Ｈ７から得られ「〇一抗原」として同定されたＬ
ＰＳ抗原である。

転写膜により抽出された抗原は、従来の技術を用いる適
当な手段のいずれかにより測定できる、例えば検定また
は他の仕方による検出ができる。

例えば、Ｈａｗｋｅｓ，等、Ｊ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏ
ｃｈｅｉ．，１　１　９　：１４２〜１４７　（１９８
２）参照（これの開示は参考として本明細書中に取り入
れている）。適当な技術には、膜を特異的ｆｌｙ素ＩＩ
Ａ識抗体、放射能標識抗体、化学発光標識抗体、あるい
は蛍光標識抗体と共にインキュベーションする方法が含
まれるが、これに限定されない。適当な特異的抗体は転
写膜上の抗原に結合し、その存在、従って位置を適当な
方法で、例えば適当な基質系の使用により、例えばホス
ファターゼ標識抗体またはベルオキシダーゼ標識抗体に
対してはホスファターゼかベルオキシダーゼ基質系を用
いることにより検出できる。

特に適当な具体例を示すと、ＬＰＳ／抗体複合体は転写
膜上で放射検定、酵素検定、化学発光検定、あるいは蛍
光検定方式により位置決定できる。

転写躾により抽出されたＬＰＳを検出するには、なるべ
く酵素標識した抗−ＬＰＳ抗体を用いるのがよい。転写
膜上のＥ．ｃｏｌｉ０１５７　　ＬＰＳを検出ずるには
、なるべくホスフ７ターゼ標識抗一Ｅ．ｃｏｌｉ０１５
７　　ボリクローンあるいはモノクローン抗体を用いる
のがよい。

Ｅ．ＣＯＩｉ　　Ｏ一抗原に対して特異的な抗体は公知
の技術により、例えば−ｅｔｈｅｒｅ＋　１等、八ｌｏ
ｒ．Ｓｏｃ．　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ．第８８回年会、セ
ッションＮｏＨ５、要旨Ｎｏ．Ｃ１３４　（１９８８）
に記載のアフィニティー精製法によりつくることができ
、あるいは例えばカタログＮＯ、０５−９５−９０「Ｂ
ａｃ　　丁ｒａｃｅ　　ＡＨｉｎｉｔｙ　　Ｐｕｒｉｆ
ｉｅｄ　　Ａｎｙｂｏｄｙ　　ｔｏＥ．　ｃｏｌｉ　０
１　５　７　：　Ｈ７ＪとしてＫ　ｉ　ｒｋｅｏｏａａ
　ｒｄａｎｄ　Ｐｆ３ｒｒＶ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，　Ｉｎｃ．，ガイテルズブルグ、マリーランド州か
ら、あるいはＥ．　ｃｏｌｉａｎｔｉ−０　１　５　７
．カタログＮｏ．　２　９　７　０　−　４　７　−７
、ロｉｆｃｏ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ，デトロイト
、ミシガン州から市販ざれている。

本発明方法の特に適当な具体例の一つの特別な利点は、
元の平板そのものの上で同定された微生物のコロニーか
ら、実際の細胞を単離しつる能力である。膜と平板の方
向を適切に合わせることにより、使用者は転写膜上に見
出された抗原とそれらの場所を相互に関連づけることに
より、平板上の微生物コロニーの存在を位置づけできる
。次に、位置の決まったコロニーを使用して、例えば常
法により単離してそれらの同一性の確認または何か他の
目的に当てることができる。

望むコロニーの領域にしばしばバックデランド微生物の
発育がかなり起こり、高度に汚染された試料を使った場
合には特にそうである。このような場合、望むコロニー
は視覚で識別できないかもしれない。しかし本発明方法
に基づくと、このよようなコロニーに特異的な抗原の測
定を用いることにより多分そのコロニーを含むと思われ
る培地領域を位置決めできる。公知の技術に従って、こ
れらの領域を回収し、バックグランド微生物から望む微
生物を分離し、精製するか、あるいは本発明方法に従っ
て再接種することによりバックグランド微生物から望む
微生物を分離し精製できる。

本発明物品、即ち転写膜との組み合わせとした再構成可
能な乾燥平板培地は適当な形式のいずれでも提供できる
。平板と膜は、例えばキットの成分部分として合わせる
ことができる。このキットはまた他の戒分、例えば抗体
および（または〉膜上の抗原の存在の測定に有用な基質
も含むことができる。このような具体例においては、膜
を本発明方法の過程で、使用者が平板培地の露出面と接
触させる。

別法として、平板と膜とを一休構造の成分部分として一
績にすることができる、例えば膜が平板の廟を形成し、
そして接種および培養の過程中ずっと培地と接触して存
在するようにできる。膜は後に油出された抗原の測定を
行なうため培地表面から取り除くことができる。例えば
、転写膜をカバーシートそのものとして、あるいはこの
ようなカバーシ一トの下側に使用すると、培地と膜との
間に必要な接触が得られる。

本発明を下記の例により更に説明するが、これら例の中
に引用された個々の材料およびその量ならびに他の条件
および詳細は本発明を不当にυ１限するものでない。

例 例１ 接種された平板に対する本法の使用 再構或可能な乾燥平板培地（　Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ”　
　Ｅ．ｃｏｌｉカウント平板、３Ｍ　ｃｏｓｐａｎｙ，
セントボール、ミネソタ州）を、各々非病源性Ｅ．　ｃ
ｏｌｉＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　，およびκｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａの実験室株を含む混合培養１ｌｄずつで接種し
た。全細菌数はおよそ２００個／ｄであった。各接種材
中に約１０ｍのＥ．ｃｏｌｉ　０１　５７　：ｌ−１７
が含まれていた。平板を３２℃で１８時間インキュベー
ションした。インキュベーションした平板を次のように
転写膜を用い室温でプロットした。各平板の上のフイル
ムを取り去って培地の表面を露出さ吐た。

幾つかの平板に対しては円形をしたニトロセルロース　
フィルター（直径６　４＃Ｉ，　ＮｉｔｒａｎＴＨ純白
ニトロセルロース、カタログ＃ＢＡ８５、ｓｃｈ＋ｅｔ
ｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｃｌｌ，　Ｉｎｃ．，キー
ン、ニューハンプシャー州から入手できる）を培地上に
１分間置いた。他の平板に対しては、下記例５で述べる
ように、ボリプＯビレン膜を露出した培地表面に置いた
。これらフィルターを培地から取り除き、２５０！ｄビ
ーカーに入れ、過剰のＭ衝液Ｉ’ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　
Ｊ　、０　．　１％のＴｗｅｅｎ　２　０を含有するリ
ン酸塩緩衝食塩水、ｐｌ１７．４）で洗浄した。緩衝液
を注ぎ出し、ニトロセルロースフィルターを含むビーカ
ーへ１艷の脱脂乳を加えて膜上に残存する結合部位を封
鎖した。ボリブロビレン膜は封鎖しなかった。

各フィルターを過剰のＰ　Ｂ　Ｓ　−　Ｔｗｃｅｎで３
回洗浄し、２ｄのアルカリ性ホスフ７ターゼ標識抗一０
１　５７　：口７抗体（およそ０．２マイクログラムの
抗体を含む、Ｋ　Ｐ　Ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）　テ３　０分間覆った。この抗体はＥ．　ｃｏｌｉ　
０１　５７のしＰＳに対して特異的であることが知られ
ているポリクローン製剤である。抗体溶液を注ぎ出し、
上記のようにフィルターをＰ　Ｂ　Ｓ　−　Ｔｗｅｅｎ
で３０分間洗浄した。ボスファターゼ基質（２Ｍ！、再
構成したもの、Ｋ　Ｐ　Ｌ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）ヲ加え、フィルターと共に５分間インキュベーショ
ンした。次にフィルターを過剰の脱イオン水中に入れて
酵素反応を停止させた。

各ニトロセルロースフィルター上およびボリプロビレン
円板上に約１０個の独特の黒円が見られ、Ｅ．　ｃｏｌ
ｉ　０１　５　７　：口７が平板上にその独特な円形の
ガス形成パターンで充育したこと、および該株のＬＰＳ
が本発明方法によって抽出および検出できたことを示し
た。しかし、ニトロヒル口−スの使用は好ましくない。

それは各フィルターが全体に青一黒の色合いを示し、こ
のことは抗体が非特異的であることを表わしていて、標
識された抗体の非特異的結合を防止するために膜を封鎖
するという追加の工程を必要とするからである。これと
は著しく異なり、ボリプロビレン円板は同様に封鎖しな
かったにも拘らず全体的バックグランド色がなかった。

例２ ハンバーガー試料に対する本法の使用 ５０個の生のハンバーガーと調理したハンバーガーの試
料をＥ．　ｃｏｌｉ　０１　５７　：口７で接種し、下
記実験計画に従い前述のＤｏｙｌｅ　Ｑ縮法により、ま
た本発明方法により試験した。０１５７：口７で接種し
た２０ｇ４の生のハンバーガー試料中１９個から２４時
間で本発明方法によりＥ．　ｃｏｌｉが検出された。従
来のＤｏｙｌｅ　＠縮法は３日後も２０個の試料中陽性
を検出できなかった。多分、従来法はバックグランド発
育過多のために検出できなかったのであろう。両方法共
２０個の接種した調理ハンバーガー試料中２０個とも検
出した。従来法は３日を必要としたのに対し本発明方法
は２４時間を要したのみだった。

本発明方法は、もし最初のバックグランド　ダラム陰性
菌数が約１０４個／グラム未満であれば、生ハンバーガ
ー１０グラム当りＥ．　ｃｏｌｉ　０１　５７　：Ｈ７
細胞１個のオーダーで検出できるようである。

もし最初の菌数が約１０”個／グラム未満であれば、感
度は生ハンバーガー５０グラム当りＥ．　ｃｏｌｉ　Ｏ
　１　５７　：ｌ−ｔ７細胞１個まで増大する。

前調理したハンバーガーに対しては明らかに感度はもっ
と大である。

プロトコール 試薬調製 １》　抗−０１５７：口７アフィニディー精製ポリクロ
ーンＩ　ＱＧ　（１　００μ９、ＫＰＬ，Ｉｎｃ，ガイ
セルズブルグ、マリーランド州、カタログ＃０５−９５
−９０＞を５０％グリセリン１ｍで再水和し、−２０℃
で貯蔵した。

２）　　ｒＢｃＩＰ／ＮＢＴＪ基質系（ＫＰＬ．Ｉｎｃ
．）は、ｍｔｉｉｘ液（０．　１Ｍ　Ｔｒｉｓ　％ｐＨ
９．　Ｏ＞１０部＋５〜プロモー４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェ・−ト（　ｒＢｃＩＰＪ　）１部十ニト
ロブルーテトラゾリウム（　ｒＮＢＴＪ　）（使用直前
につくる〉１部を用いて調製した。

３》　洗浄溶液は、２５ｍｌ！の洗浄溶液濃厚液（０．
５Ｍ　　ｒｒｉｓ，４．８Ｍ　　ＮａＣｊ２、２％丁ｗ
ａｅｎ　２　０　）をＨの蒸留水に加えることにより調
製した（１）８７．２とする〉。

分析 （１）　　下記成分： トリプチカーゼ大豆ブイヨンｒＴｓＢＪ　：ＢＢＬ　（
　Ｈｉｃｒａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　
，　ｍｌ　ｙキーズビル、マリ一ランド州）３０ｇ、 胆汁酸塩ｒ　＃　３　Ｊ　（　Ｏｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，デトロイト、ミシガン州）１．５ｇ、 リン酸二カリウム　１．５ｇ、 ノボビオシン（Ｓｉｕａ　Ｃｈｅａｉｉｃａｌ　Ｃｏ．
，セントルイス、ミズーリ州）２０■、 ｐＨ７．４、３０秒間均質化 を用いてｍ製した２２５ＩＩ１のｒｉ飾トリプチカーゼ
大豆ブイヨンｌｍ　　ＴＳＢＪ前濃縮ブイヨン中に２５
ｇの試料ハンバーガーを１／１０（重量／休積）に希釈
。

（２）　　ホモジネートを５００１ｄフラスコに移し、
ｌｆｆｌｔ１！（６０回転／分）しつつ３６℃で６〜８
時間インキュベーション。

（３）　　複Ｖ　ＰｅｔｒｉｆｉｌｌＴＨＥ．　ｃｏｌ
ｉカウント平板をｆｔＪｌ縮物１Ｉｌ１で、あるいはイ
ンキュベーションした前濃縮ブイヨンの１／１０希釈物
ＩＭ１で接種。

（４）　　４２℃で１８〜２４時問インキュベーション
。

（５）　　上下のフィルムをはがし取ることによりＰｅ
ｔｒｉｆｉｌｍ１Ｍ平板の培地表面を露出させる。転写
膜が培地表面全体と接触し、培地と躾との問に気泡が残
らないように、この露出した培地表面と接触させて転写
膜を置く。転写膜および培地に後に方向を決めるため正
確に印を付ける。

（６）　　転写膜を取り除き、接触側を下にして、過剰
の洗浄溶液を入れたビーカー中に入れる。

バッチで行なうときには、ビーカーの底に網スベーサー
を入れてから、膜と不活性網スベーサーとを交互に入れ
る。ビーカーをまわす。洗浄溶液を注ぎ出す。これを繰
り返し、過剰の残留培地が躾に付着しないことを確かめ
る。

（７）　　洗浄溶液を注ぎ出す。４ｄ／膜の新しい洗浄
溶液およ（ｆ２ｕｌ／ｖＡ（Ｄ抗−０１５７：Ｈ７抗休
溶液を加える。

（８）　　まわしながら（６０回転／分）室温で３０分
インキュベーションし、膜同士が接着しないことを確か
める。

（９）　　抗体溶液を注ぎ出す。洗浄溶液（約１０ｄ／
Ｉｌｌ）ですすぐ。ビーカーをまわす。洗浄溶液を注ぎ
出す。２回繰り返す。

（１０）ビーカーに基質２ｄ／膜を加える。

（Ｈ）膜同士が接着しないように確かめて中程度にまわ
しながら５分間インキユベーシコンする。

（１２）水道水で膜をすすいで反応を終らせる。

（１３）膜をビーカーから取り出し、プロットを乾かす
。

推定に基づ＜０１　５７　：Ｈ７コロニーの回収と確認 （１４）当て物をした表面にバスツールビベットを用い
て印をつけ、転写膜上のスポットを取り除く。これはピ
ペットを下向きに押付けるときひねり運動を用いて真直
上向きに引いてスポットを取り去ると最も容易に行なえ
る。

（１５）　　フィルムの上に膜を置いて膜とフイルムの
印を合わじる。フエルトの先端のついたマーカーを用い
て、打ち抜いた孔の内側のトップフイルムに軽く触れる
。

（１６）トップフィルムを注意深く持ち上げ平らに置＜
　，　Ｐｒｏｍｐｔ”接種システム棒（ｆ３ＢＬＨｉＣ
ｒＯｂｉＯＩＯＱｉＣａｌ　ＳＶＳｔｅｌＳ，］　’／
キーズピル、マリーランド州〉を使用してマーカースポ
ットが示す培地に突き通す。僅かにひねって真直ぐ上に
引き培地を取り去る。棒１本につきｆｆｉ高３スポット
まで繰り返す。

（１７）　　Ｐｒｏｍ＋ｐＬＩＨ接種システムびん（Ｂ
ＢＬＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ
，カタログＮＯ．２６３０６、コッキーズビル、マリ一
ランド州）の１−びんを切ってあけ、棒を内側に入れる
。６０秒間うず巻運動を行ない微生物を棒から溶液中へ
十分に分配する。

（１８）　　ｒホッケーステッキ」型の細菌を移す装置
を用いて１００μｊ！，１０μｌ，および１μｌのＰｒ
ｏｍｐｔ溶液を３枚のｒＭｓＡＪ平板（２２．２９のＨ
ａＣＣＯｎｋｅｖＡＱａｒベースを１０９のＤ−ソルビ
トールと共に用い水でＨに調製）に塗る。平板へ１００
μｌの滅菌水を加えることにより１μｌおよび１０μｌ
試料の拡散を促進できる。

（１９）　　Ｍ　Ｓ　Ａ平板を４２℃で１８〜２４時間
インキュベーションする。

（２０）　　ｒＥ．　ｃｏｌｉ　Ｏ　１　５　７　Ｌａ
ｔｅｘ　Ｔｅｓｔ　Ｊ　、カタログ＃ＤＲ６２０，　Ｏ
ｘｏｉｄ　ｔｌ．　Ｓ．　Ａ．，　Ｉｎｃ．，　ｍｌロ
ンビア、マリーランド州を使用して、疑わしいコロニー
をラテックス凝集について試験する。

例３ 地方ディケア　センターにおけるＥ．　ｃｏｌｉ　Ｏ　
１５７：Ｈ７大発生から得た大便試料を使用して二重め
くら臨床試験を行なった。例２の工程３から２０まで前
述したようにして、試料を接種し、インキュベーション
し、抽出し、検出したが、ただし、大便試料を（ＰＢＳ
で１：１０に希釈し、次に１：１０００に希釈してから
その１：１０００希釈液ＩＩｌｔ１ｒ　Ｐｅｔｒｉｒｉ
ｌｍ”　　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｈウント平板を再水和した
。下記表Ｉから分かるように、本発明方法は、捉出され
たすべての陽性臨床大便試料（１５試料中４つ〉を２４
時間以内に正しく同定した。その上、本法は総大腸菌お
よび総Ｅ．ｃｏｌｉを定量し、各試料中のＥ．　ｃｏｌ
ｉ　０１　５７　：口７の存在を同定した。

これとは違って、以前にこれら試料を、ＭＳＡ平板上に
大便試料のスワブを直接画線し、平板をインキュベーシ
ョンし、前記のラテックス凝集試験により試験すること
により分析していた。この方法は本発明方法によりもず
っと時間がかかり、そのｒ；Ａ度について、とりわけバ
ックグランド汚染度の高い試料（例えば、Ｅ．　ｃｏｌ
ｉ　０１　５　７　：口７Ｉｌｌ胞１個当り大腸菌約２
００個以上）の場合に限界があった。

試料＃ ７２０ ７２１ ７２２ ７２５ ７２６ ７２７ ７２８ ７３１ ７３３ ７３５ ７３７ ７３８ ７３９ ７４０ ７４１ ミネソタのデイケア 全大腸菌数 ４．　３Ｘ１０２／’Ｆ １．　ＯＸ１０’　／ｇ ７．　４Ｘ１０２／ｇ ８．　２Ｘ１０’／！７ １．　２ｘ１０５／ｇ ２．　３ｘ１０５／ｇ １．８Ｘ１０２／ｇ ｏ １．　４Ｘ１０４／ｇ ２−　ＯＸＩＱ１／ｇ ２．　３Ｘ１０”／ｇ ３．　１Ｘ１０６／ｇ ３．　１Ｘ１０’／ｇ １．　７Ｘ１０７／ｇ １．　２Ｘ１０５／ｇ 表■ センターでの集団発生−１９８８年８月全Ｅ．　ｃｏｌ
ｉ数　　　０１５７：目７数４×１０２／ｇ４Ｘ１０２
／ｇ ０　　　　　　　　　　０ ０　　　　　　　　　　０ ４ ３．　ＯＸＩＯ　／ｇ３．　ＯＸ１０４／！？４ ５．　１Ｘ１０　／ｇ３．　４Ｘ１０’／ｇ５ １．　５Ｘ１０　／９　　１．　５Ｘ１０５／ｇＯ　　
　　　　　　　　Ｏ Ｏ　　　　　　　　　　Ｏ Ｏ　　　　　　　　　　０ ０　　　　　　　　　　０ ２．　２ｘｌ０５／ｇ０ ５ １．Ｏｘ１０　　／ｇ　　　　　０ ４ ２．７Ｘ１０　　／ｇ　　　　　０ １ １．７Ｘ１０　　／９　　　　　　０ ５ １。２×１０　／ｇ　　　　　Ｏ 例４ ＬＰＳとしての抗原の同 次のようにして、ｒ．．　ｃｏｌｉ　０１５７　：口７
からＬＰＳを単離した。標準寒天平板《トリプトン５９
、酵母エキス２．５ｇ、ブドウ糖１？Ｊ，寒天１５ｇ、
水でＨとする）上で一晩培養したＥ．　ｃｏｌｉ　０１
　５７　：ｌ−ｔ７の単一コロニーを用いて丁ｒｙｐｔ
ｉｃ　　Ｓｏｙ　　Ｂｒｏｔｈ　　＜　　８　８　　Ｌ
　．　　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｉｃａｌｓｙｓｔｅｍ
ｓ，コッキーズビル、マリ一ランド州）の２ｄ管を接種
した。培地を３６℃で１８時間培養した。この培養を毎
分６０００回転で３分間延伸して細胞をベレット化した
。上澄を捨てた。細胞を０．ＯＩＭリン酸塩緩衝食塩水
、ｐｔｌ７．２（Ｎａ２口ＰＯ４１．２ｇ、 Ｎａｉｌ　　ＰＯ４−１−１２０　　０．２２ｇ、２ ＮａＣ１　　８．５ｇ、口，ＯでＨとする）１　００Ｈ
１申に再懸濁した。再懸濁Ｉｌｌ胞を沸騰水浴中２　１
７２時間加熱して細胞内容物を解放し、加水分解した。

この懸濁液を毎分６０００回転で３分ｌ１ｌ遠心し、上
澄を捨てた。ＬＰＳの可溶化を助けるため、２　５　０
　ｎｏ／一の澹度で０．１５％胆汁１！！ｊ！Ｉ＃３を
添加した０．０１Ｍリン酸塩緩衝食塩水にＬＰＳを懸濁
した。この抗原調製物５０μｌを転写膜（“Ｏｐｔｉｃ
ｉｔｅ”＃　５　２　０　”　）上ニスポットした。リ
ン酸塩緩衝食塩水５０μ１を対照として同じ膜にスポッ
トした。膜を室温で１０分間インキュベーションし、２
５０ｍガラスビーカー中の過剰の洗浄用緩衝液に入れた
。洗浄用緩衝液を直ちに注ぎ出し、２００ｎｏ抗−０１
５７：口７抗体（ＫＰｔＪ，　ＩＤＣ．）を含む新しい
洗浄用緩衝液４ｄを加え、室温で３０分間インキュベー
ションした。抗体溶液を注ぎ出し、フィルターを洗浄用
緩衝液で３回洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（２
ｄ）（ＫＰＬ．Ｔｎｃ．．　ガイセ）’ｖ：ｒ．１ルグ
、マリーランド州）を加え、室温で５分間インキュベー
ションした。過剰の脱イオン水を加えて反応を終らせた
。結合した抗−０１５７：口７ＬＰＳ抗休の存在を、抱
合したアルカリ性ホスファターゼの反応を示す青いじみ
の出現によ、り視覚で決定した。ＰＢＳの部位には発色
がなかった。

しＰＳはＫｉＩＧｌ／，等、＋ｎｒ、Ｉｍｉ．３０：８
６２（１９８０）に記載のように、ＡＩｌｅｒｉＣａｎ
　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　２　９　５　２　３を有す
る＾ｃｔｉｎｏｂａｃｉｔｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏＩｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（”Ａａ″〉株から単餡した
。ＬＰＳの可溶化を助けるため、２５０ｎＭｄの濃度で
添加した０．１５％胆汁酸塩＃３を含む０．ＯＩＭのＰ
ＢＳ中にＬＰＳを懸濁した。この抗原調製物５０ｕ１ヲ
転写ｖ４（　”Ｏｐｔｉｃｉｔｅ”＃５２０”　）　上
ｋ：スポットした。ＰＢＳ　　５０μｌを対照として同
じ膜にスポットした。この膜を室温で１０分間インキュ
ベーションし、２５０ｄガラスビーカー中の過剰の洗浄
用緩衝液に入れた。洗浄用緩衝液を直ちに注ぎ出し、Ａ
ａのＬＰＳに対して特異的な抗−八ａ　抗休２　０　Ｏ
　ｎ（ｌを含む新しい洗浄用緩衝液／！ＩｔＩｌを加え
、室温で３０分インキュベーションした。抗体溶液を注
ぎ出し、フィルターを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。２
　０　０　ｎｏのホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩ　
ＱＧ　（ＫＰＬ，　Ｔｎｃ．，ガイセルズブルグ、マリ
ーランド州｝を含む新しい洗浄用Ｉｌ衝液４Ｉｄを加え
、室温で３０分インキュベーションした。この抗体含有
！ｌ衝液を注ぎ出し、膜を過剰の洗浄用緩衝液で２回洗
浄した。例２のように調製したＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶
液（２成）を加え、室温で５分インキュベーションした
。過剰の脱イオン水を加えて反応を終らぜた。結合した
抗一Ａａ　　ＬＰＳ抗体の存在を、抱合アルカリ性ホス
フ７ターゼの反応を示す青いじみの出現により視覚で決
定した。ＰＢＳの部位には色が見られなかった。

例５ 適当な転写膜の同定 例４記載のようにＥ．　ｃｏｌｉ　０１　５７　：口７
を一晩培養し、ＬＰＳ抗原を単離したが、ただし０．１
％胆汁酸塩＃３を含むＴＳＢブイヨンに最終ベレットを
再懸濁した。寸法約５ｃｍＸ５ｃｍ（２インチ×２イン
チ〉の正方形とした下記転写膜を用いた。

ポリスチレンー“Ｏｐｔｉｃｉｔｅ”，　Ｄｏｗ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＣＯ．，グレンビル、オハイオ州、カタロ
グ製品ＮＯ．０２４５５． 二トロセルロースー″ｘｙｔｒａｎ″，　Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒａｎｄ　Ｓｃｈｕａｌｌ，キーン、ニューハン
プシャー州、カタログ＃ＢＡ８５。

ナイロンー”　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ａ”，　ｐａｎｔ　Ｂ
ｉｏＳｕｐｐｏｒｔＣＯ．，グレンコーグ、ニューヨー
ク州、カタログ＃ＢＮＰＧＲ８７５。

ボリブロビレン（＠細多孔質）一米国特許第４，７２６
，９８９号明細書くその開示は参考として木明ＩＩＩ書
中に取り入れている〉の例９Ｄに記載のように、ボリブ
ロビレン４６．５％、絋油５５．３％、および０．２％
Ｈｉｌｌａｄ　　３　９　０　５成核剤を用いて調製し
た。

ポリエチレン（微細多孔質〉一米国特許第４，５３９，
２５６号明細潟の例８記載の方法に従い、ポリエチレン
４０％と鉱油６０％を用いて調製した。

これら微細多孔質ボリプロビレンおよびポリエチレンの
細孔寸法を、前記米国特許第４．５３９．２５６号明ａ
Ｓ記載のバブルポイント技術にょり測定したところ、そ
れぞれ０，２２μＴｒＬおよび０．４２４μ乳であり、
これも前記第４．５３９．２５６号明細書記載の方法に
より測定したところ、各々の気孔率はそれぞれ６３％お
よび８４％であった。

Ｅ．ｃｏｌｉ　０１５７：Ｈ７抗原Ｗ４製物５０μｌを
各膜上にスポットした。０．１５％胆汁酸塩を含むＴＳ
Ｂ培地５０μ１を対照として各膜上にスポットした。各
膜を室温で１０分間インキュベーションし，２５０ｄビ
ーカー中の過剰の洗浄用緩衝液に入れた。洗浄用緩衝液
を直ちに注ぎ出し、２　０　Ｏ　ｒ＋ｏの抗一Ｅ．　ｃ
ｏｌｉ　Ｏ　１　５７抗体（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．　）を含
む新しい洗浄用緩衝液４−を加え、室温で３０分間イン
キュベーションした。抗体含有緩衝液を注ぎ出し、膜を
過剰の洗浄用緩衝液で２回洗浄した。ホスファターぜ基
質溶液（２ｄ）を加え、５分間インキュベーションし、
その後、過剰の脱イオン水を加えて反応を終らぜた。

結合した抗−０１５７抗体の存在を、抱合アルカリ性ホ
スファターゼの反応を示す青いしみの出現により視覚で
決定した。個々の膜の全表面に全体的青い色合いが見ら
れるのは、例えば、膜自身にあるいは非ＬＰＳ抽出分子
に非特異的に結合する抗体の不当に高いバックグランド
レベルを示すものである。古色が存在しないことは検出
できる量のＬＰＳがその特別な膜により抽出されなかっ
たことを示す。

下記の表■から分かるように、より親水性の膜、ニトロ
ヒルロースおよびナイロンは望ましくない程高いバック
グランドレベルを示したが、これは多分これらが多量の
タンパク質を吸着する能力によるのであろう。これとは
非常に違って、用いたより疎水性のボリスチレン、ボリ
プロビレン、およびポリエチレン膜は明らかにタンパク
質を排除しながらＬＰＳを抽出し、そしてこのようなＬ
ＰＳと抗体との免疫反応に対する適当な支持体として動
らくことができる。特に、ボリスチレンは試験したすべ
ての転写膜のうちでＲ高のＬＰＳ結合および最低のバッ
クグランド色を示した。

転写膜 ポリスチレン ニトロセルロース ナイロン ボリブロビレン ボリエヂレン

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物のコロニーの存在を同定する方法において
   、次の工程： １）再構成可能な乾燥平板培地を、微生物を含むと思わ
   れる試料から得た接種材で接種し、２）接種した平板を
   微生物コロニーの発育に適した条件下でインキュベーシ
   ヨンし、 ３）平板の発育培地表面を露出させ、この露出面を、微
   生物コロニー領域から膜が微生物特異性抗原を抽出でき
   るように適当な転写膜と接触させ、４）転写膜を培地の
   表面から取り除き、 ５）転写膜上の微生物特異性抗原の存在を適当な手段に
   より測定する からなる上記方法。
2. （２）微生物が血清型Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７であ
   る、請求項第１項記載の方法。
3. （３）再構成可能な乾燥平板培地を転写膜との組み合せ
   として含有する物品。