JP2003514568A - 微生物の増殖および貯蔵のための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 微生物の増殖または貯蔵のための装置が記載されている。また、微生物のコロニー形成単位を同時に増殖し、複製するための方法も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は分子生物学の分野に関し、特に、組換え微生物を含む微生物の増殖お
よび分析に関わる方法に関する。

【０００２】 食品または他の試料における微生物の検出および計数のための再水和可能なド
ライフィルム平板培地が記載されている（例えば、米国特許第４，５６５，７８
３号）。例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉの特定の抗原株に対する試験用にドライフ
ィルム平板培地技術が用いられている。例えば、米国特許第５，１３７，８１２
号を参照。ドライフィルム培地技術を用いる典型的な装置は、水性試料１ｍｌの
添加が可能な冷水可溶性ゲル化システムを含む。このような装置により、適切な
インキュべーション条件下に装置内の標的生物の増殖が促進され、また装置内の
検出システムも提供され、装置におけるコロニー増殖の視覚化および計数が可能
となる。これらの装置は、特定の標的生物または指標生物の検出や計数が食品の
品質および／または安全性の指標として役立つ食品加工産業内で特別な有用性を
有する。

【０００３】 生物が将来使うためにほとんど貯蔵されていない微生物試験とは対照的に、分
子生物学者の間では将来使うためにブロス培地内または半流動培地上に組換え微
生物を貯蔵することが一般的である。組換え微生物を一次平板培地から貯蔵培地
へ移行する追加のステップが必要であり、多くの場合、貯蔵温度で配置される前
に貯蔵培地をインキュべートする追加の増殖期間（１６〜２４時間）が必要であ
る。

【０００４】 培養株貯蔵に用いる際の半流動培地（寒天）の不利な点は、水分がゲルから蒸
発する傾向があることである。密閉されていないペトリ皿の場合には、これは結
果として寒天の乾燥や培養株の死滅につながる。密閉されたペトリ皿の場合には
、これは結果としてプラスチックまたはガラスの皿における水分の濃縮につなが
り、これが結果として表面または寒天上の水分の拡散および平板上のコロニーの
相互汚染につながる。さらに、寒天は表面上に氷晶を発生させる傾向および／ま
たは凍結すると分裂する傾向があるため、寒天平板上で培養株を凍結することが
不可能である。これらの特徴の両方が、組換え生物の純粋なコロニーを維持しよ
うとする際に望ましくないコロニーの相互汚染の可能性を増大させる。また、組
換え生物を平板培養する主要な目的は、一般的に結果として細胞の破壊につなが
る遺伝子分析を行うことである。したがって、通常、各コロニーを選び、遺伝子
分析用のコロニーの残遺物を用いる前にそれをブロス培地または半流動培地にお
いて「複製」することが必要である。

【０００５】 本明細書中に記載された発明は、微生物の増殖または貯蔵のための装置に独特
の特性を提供するドライフィルム平板培地の新規な調製物に基づくものである。
このような調製物を含む装置を開放すると、平板上のコロニー増殖の一部分が両
方のフィルムに移行し、各コロニーの２つの複製物を提供する。また、平板上の
コロニーは市販のペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）^ＴＭ上に増殖するコロ
ニーよりも大きい。これらの特性は、半流動培地上に増殖した細菌コロニーを分
析または継代培養することを必要とする分子生物学者や他者にいくつかの利点を
提供する。

【０００６】 一態様において、本発明は微生物の増殖または貯蔵のための装置を特徴とする
。装置は第１層および第２層を含み、第１層はゲル化剤と微生物増殖培地とを含
み、第２層はゲル化剤を含み、装置はさらに指示薬と対応する誘導物質を含み、
第１層および第２層は互いに分離可能である。第１層および第２層は再水和可能
でありうる。可視微生物コロニーの少なくとも８０％（例えば、８５％または９
５％）は分割し、層の分離時に第１層および第２層において複製物を形成するこ
とができる。第１層および第２層における複製物は、拡大または非拡大の目視検
査により、または遺伝子分析により検出可能である。遺伝子分析による検出とし
て、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミド制限分析、ま
たは発現スクリーニング法を挙げることができる。

【０００７】 第１層および第２層における複製物は生存可能である。第１層または第２層の
ゲル化剤は、グアールガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニ
ルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリ
ドン、ゲランまたは低モノマー含量ポリアクリル酸でありうる。グアールガムが
特に有用である。

【０００８】 微生物増殖培地として、イオン性界面活性剤、例えば、デオキシコール酸、胆
汁酸塩または硫酸ラウリルもしくは塩など界面活性剤を挙げることができる。第
１層として、抗生物質またはアミノ酸欠乏（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｔｃｙ）など選択可能な薬剤を挙げることができる。指示薬は沈殿性また
は色素生産性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）でありうる（例えば、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドキシルエステル（トリフルオロ酢酸塩）、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドキシル−ｌ−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドキシル−３−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
キシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドキシル酪酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸
塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドキシル−β−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
キシル−β−Ｄ−グルクロン酸（シクロヘキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−クルクロン酸（ナトリウム塩）、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−ｌ−リン酸塩（
アンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マル
トトリオース、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミリスチン酸塩、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マノピラノシド、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドキシル−ノナン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドキシルオレイン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルパル
ミチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ｛２−ア
ミノ−２−メチル−１、３−プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドキシルリン酸塩（ジリチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドキシルリン酸塩（ジカリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドキシルリン酸塩（ジナトリウム塩セスキ水和物）、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドキシルリン酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドキシルリン酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドキシル硫酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル
硫酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルトリ
ミジン−３’−リン酸塩（シクロヘキシルアンモニウム塩）または５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシド）。誘導物質は、１
−Ｏ−メチルグルクロン酸、イソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、または１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドでありうる。指示薬および対応する誘導物質は同じ層にあること
ができる。

【０００９】 第１層または第２層は接着剤をさらに含むことができる。第１層および第２層
は、プラスチック、ガラス、または被覆紙など水不浸透性基材を含むことができ
る。例えば、水不浸透性基材は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン
（例えば、二軸方向ポリプロピレン）、またはポリエステルでありうる。基材は
、第１層および第２層が互いに実質的に対向する折り畳みを有する物質の連続小
片を含むことができる。基材は取り外し可能であり、またはヒンジ、クラスプ、
グルー、ステープル、またはクランプなどにより互いに持続的に付着することが
できる。

【００１０】 微生物は、細菌、真菌、酵母菌、ファージ、またはマイコプラズマでありうる
。細菌は、好気性、嫌気性または微好気性、およびグラム陰性でありうる。例え
ば、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎｏｓでありうる。

【００１１】 本発明は、微生物コロニー形成単位のレプリカを同時増殖し得るための方法も
特徴とする。この方法は、微生物コロニー形成単位を含む接種菌を装置に塗布し
て接種装置を形成することであり、装置はゲル化剤と微生物増殖培地とを含む第
１層およびゲル化剤を含む第２層を含み、第１層および第２層は互いに分離可能
であることと；接種装置の第１層および第２層を接触してゲルを形成することと
；少なくとも１つの細胞分裂のために十分な時間にわたり接種装置をインキュべ
ートすることと；第１層および第２層を分離して微生物コロニー形成単位のレプ
リカを提供することと；微生物コロニー形成単位の分離を確認することとを含む
。装置は、指示薬と対応する誘導物質とを含むことができる。方法は、複製物の
少なくとも１つでの分子生物学操作を実施することをさらに含む。

【００１２】 他に特に規定がなければ、本明細書中で用いられているすべての技術用語およ
び学術用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される同じ意味を有す
る。本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いて本
発明を実施することはできるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明
細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の引例は、その
全体が参考として援用される。抵触の場合には、本明細書は、定義を含めて、対
照となる。また、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することは意
図されていない。

【００１３】 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らか
であろう。

【００１４】 装置の構成 本明細書中に記載される「装置」は複数の層を含む。本明細書中で用いられる
ように、「層」という用語は、固体基材および接着剤、指示薬、誘導物質、栄養
素、ゲル化剤、または固体基材を被覆する他の試薬のすべてを含む。図１Ａは、
本発明の培地とともに使用するために適切な装置を示している。装置は一般に米
国特許第４，５６５，７８３号、第５，０８９，４１３号、第５，２３２，８３
８号および第５，６０１，９９８号に記載されているように構成しうる。装置１
０は、水不浸透性基材１２など、自己支持固体基材（ｓｅｌｆ−ｓｕｐｐｏｒｔ
ｉｎｇ ｓｏｌｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で製造される第１層を含む。下部基
材１２は一般的に、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、またはガラ
スなど水を吸収することがない水不浸透性材料から成る比較的堅い材料である。
ポリエステルは特に有用な基材である。他の適切な耐水性材料として、「シェラ
ータイプＭＩＬ（Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ Ｔｙｐｅ ＭＩＬ）」写真印画紙（シェ
ラー株式会社、プラスキ、ニューヨーク州）など水不浸透性ポリエチレン被覆剤
を含有する紙など水透過精基材を含む。一般に、本発明の装置は、コロニーの視
認を可能にする透明または半透明である基材を用いて構成される。コロニーの視
認が不要である実施態様では、不透明な基材を用いることができる。基材の厚さ
は、約０．００３インチ乃至０．０２インチでありうる。例えば、ポリエステル
フィルムは一般的に厚さが約０．００４乃至約０．００７インチであり、ポリプ
ロピレンフィルムの厚さは約０．００４乃至約０．００８インチであり、ポリエ
ステルフィルムの厚さは約０．０１５インチである。

【００１５】 基材１２の上部表面は培地１４で被覆され、これはさらに乾燥して基材１２上
に乾燥培地を提供する。あるいは、粉末として適用しうる培地を保持するために
役立つ、接着剤を基材１２上に被覆しうる。接着剤は、被覆基材により視認する
場合に基材の表面上に増殖する細菌コロニーの視覚化を可能にするように水和す
ると十分に透明でなければならない。接着剤は、接着剤に培地を完全に包埋する
ことなく、乾燥培地で基材を均一に被覆される厚さで基材上に被覆もされなけれ
ばならない。

【００１６】 フォーム中に環状開口部を有するフォームスペーサー１６を基材１２の培地被
覆表面に付着することができる。フォームスペーサーは基材１２の周囲を覆い、
試料を接種すべき範囲を規定し、基材から試料が漏れるのを防ぐためにも役立つ
。環状開口部の直径は変更することができる。例えば、ポリプロピレンフォーム
ウェブは直径２’’〜２^３／_８’’のダイカット環状穴を有し、同容積の試料（
約１ｍｌ）とともに用いることができる。別の実施態様では、装置が試料を含有
するフォームスペーサーを含むことはできない。この装置では、試料の量は培地
のみの成分により基材上に包含され隔離される。

【００１７】 上部カバーシート２０がフォームスペーサー１６の上部の一端上に配置されて
いる。カバーシート２０は第２層であり、基材上に存在する細菌コロニーの計数
を容易にするために透明なフィルムまたはシート材料から成ることが好ましい。
また、カバーシート２０は、成分の汚染および劣化のリスクを回避するために細
菌および水蒸気に対して不透過性であることが好ましい。カバーシート２０の材
料は、増殖すべき微生物の種類に必要な酸素透過量を提供するために選択するこ
とができる。例えば、ポリエステルフィルムの酸素透過性は低く（厚さ０．００
１’’当り５ｇ／１００平方インチ／２４時間未満）、嫌気性細菌を増殖させる
ために適しているが、ポリエチレンフィルムの酸素透過性は高く（厚さ０．００
１’’当り約５００ｇ／１００平方インチ／２４時間）、好気性細菌を増殖させ
るために適している。カバーシート２０として使用するための好ましい材料は二
軸延伸ポリプロピレンである。カバーシートはゲル化剤を含み、随意的に微生物
増殖培地、指示薬、誘導物質、および／または接着剤を含みうる。

【００１８】 上記のことから、第１層および第２層の上部−下部方向性を逆にできることに
注意すべきである。

【００１９】 装置の第１層および第２層は取り外し可能であり、またはさまざまな方法によ
り互いに持続的に付着することができる。例えば、ヒンジ、クラスプ、グルー、
ステープル、またはクランプを用いて第１層と第２層を互いに付着することがで
きる。一実施態様では、第１層と第２層を互いに付着するために粘着剤が用いら
れる。

【００２０】 微生物増殖培地 一般に、装置の第１層および第２層は有効な量で、すなわち、それぞれの層の
分離時に、可視微生物コロニーのほとんどの部分、好ましくは、少なくとも８０
％が装置の両方の層において保持されるようにゲル化剤を含む。換言すれば、可
視微生物コロニーの少なくとも８０％が分割し、それぞれの層の分離後に第１層
および第２層において複製物を形成する。コロニーを分割し複製物を形成する図
１Ｂを参照のこと。例えば、コロニーの少なくとも８５％、９０％、９５％、ま
たは９９％が分割し、第１層および第２層において複製物を形成する。ゲル化剤
の非限定的な実施例として、グアール、キサンタン、ローカストビーンガム、ポ
リビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニル
ピロリドン、ゲラン、およびポリアクリル酸（低モノマー含量）が挙げられる。
グアールは特に有用なゲル化剤である。ゲル化剤の適切な濃度は、本明細書中に
記載された方法を用いて測定することができる。一般に、第１層および第２層に
おけるゲル化剤の量が異なる装置が製造される。装置は微生物を含有する水性試
料を接種され、適切な時間（例えば、１６〜２４時間）にわたりインキュべート
される。装置のそれぞれの層は分離され、第１層および第２層の両方に保持され
ているコロニーの画分が測定される。

【００２１】 第１層は微生物増殖培地をさらに含む。一部の実施態様では、微生物増殖培地
は第１層および第２層の両方にありうる。一般的に、第１層に含まれる基材にゲ
ル化剤および微生物増殖培地がいっしょに添加される。適切な微生物増殖培地は
一般的に脱水前の溶液の１％重量／量未満の濃度でゲル化剤を含有する。例えば
、脱水前のゲル化剤濃度は、０．４％乃至０．９％重量／量または０．６％乃至
０．８％重量／量でありうる。第１層におけるゲル化剤の最終量は、乾燥後の２
０ｍｇ乃至１００ｍｇ／２４平方インチである。例えば、第１層におけるゲル化
剤の最終量は、３０乃至８０または４０乃至５０ｍｇ／２４平方インチでありう
る。第２層におけるゲル化剤の量は一般的に、第１層における量よりも少なくと
も５倍多い（例えば、７倍、８倍、９倍、または１０倍）。例えば、第２層にお
けるゲル化剤の量は、３００乃至５００ｍｇ／２４平方インチまたは４００乃至
４５０ｍｇ／２４平方インチでありうる。

【００２２】 本発明の微生物増殖培地は、脱水前の溶液の約０．５％乃至約２％重量／量の
濃度で界面活性剤（例えば、イオン性界面活性剤）も含むことができる。界面活
性剤の非限定的な実施例として、デオキシコール酸、胆汁酸塩または硫酸ラウリ
ルが挙げられる。

【００２３】 増殖培地の別の成分として、塩化カルシウムや塩化マグネシウムなど塩、選択
可能な薬剤、指示薬、および誘導物質が挙げられる。例えば、選択可能な薬剤は
、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、スペクチノマイシン、ストレ
プトマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコー
ルなど抗生物質でありうる。他の選択可能な薬剤は、特定のアミノ酸の欠乏であ
りうる。指示薬は沈殿性、色素生産性、または蛍光性および／または蛍光発生性
でありうる。適切な蛍光性または蛍光発生性指示薬として、例えば、４−メチル
ウムベリフェリルリン酸塩（二ナトリウム塩三水和物または遊離酸）、４−メチ
ルウムベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウムベリフェ
リル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、４−メチルウムベリフェリル−ベータ−Ｄ−
ガラクトピラノシド、二酢酸フルオロセイン、またはフルオロセイン抗体抱合体
が挙げられる。沈殿性指示薬は、例えば、２，３，５−塩化トリフェニルテトラ
ゾリウムでありうる。色素生産性指示薬は一般的に、微生物による活性化まで、
例えば、酵素加水分解または化学結合の削減まで無色である。色素生産性指示薬
の非限定的実施例として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ
−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルエ
ステル（トリフルオロアセテート塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキ
シル−ｌ−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−３−酢酸塩、
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクト
サミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル酪酸塩、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドキシル−α−Ｌ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキ
シル−β−Ｄ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル
−β−Ｌ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α
−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ
−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルク
ロン酸（シクロへキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（ナトリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドキシルミオ−イノシトール−ｌ−リン酸塩（アンモニウム塩）、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マルトトリオース、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドキシルミリスチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドキシル−α−Ｄ−マノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドキシル−ノナン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルオレイン
酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルパルミチン酸塩、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ｛２−アミノ−２−メチル−１、
３−プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン
酸塩（ジリチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン
酸塩（ジカリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（
ジナトリウム塩セスキ水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリ
ン酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（
ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（カリ
ウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（ｐ−トルイジン
塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルトリミジン−３’−リン酸塩
（シクロヘキシルアンモニウム塩）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
キシル−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。亜テルル酸ナトリウムも適切
な指示薬である。

【００２４】 誘導物質は酵素を刺激して対応する指示薬を分割する。例えば、１−Ｏ−メチ
ルグルクロン酸は、グルコロニダーゼを刺激して５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（指示薬）を分割し、着色産物を生成する
。他の誘導物質と指示薬のペアとして、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキ
シル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩または３−インドキシル−β−Ｄ−
グルクロン酸、ナトリウム塩およびイソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、
ナトリウム塩；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドまたは−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；および５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドまたは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドおよび１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが挙げられる。

【００２５】 本発明の別の実施態様としてラック分化機序が挙げられる。装置は２つの色素
生産性指示薬を含むため、β−ガラクトシダーゼ欠乏性コロニーは第１指示薬を
活性化し、β−ガラクトシダーゼ生産性コロニーは第２指示薬を活性化すること
により、２つの色分化を生じる。

【００２６】 微生物の増殖または貯蔵のための装置の使用 使用時には、所定量の接種菌、一般的には約１ｍｌの接種菌を、カバーシート
２０を引き戻し、水性被験試料または水を基材１２の中央に添加することにより
、図１Ａに示した装置に添加する。次にカバーシート２０を基材１２上に戻し、
接種菌を基材上に均一に広げる。これを行うための便利な道具は、基材１２の特
定区域の接種菌を確認するためにも用いられる加重環状テンプレートである。接
種菌が基材１２上に接触し広がると、基材１２上の培地は水和し、増殖支持性栄
養ゲルを形成する。次に接種装置を所定の時間にわたりインキュべートし、その
後に基材上に増殖する多くの細菌コロニーの数を透明なカバーシート２０により
計算しうる。

【００２７】 本発明の装置により種々の微生物を増殖または貯蔵することができる。適切な
微生物として、細菌、真菌、酵母菌、ファージ、およびマイコプラズマが挙げら
れる。細菌は、好気性、嫌気性または微好気性、およびグラム陰性でありうる。
例えば、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓでありうる。本
発明の装置において使用される微生物増殖培地は各微生物の特定の必要のために
調節することができる。

【００２８】 組換えＤＮＡを含有する微生物を平板培養する現在の技術は、本明細書中に記
載された平板培地および方法により改善される。本発明の装置において用いられ
るゲル化剤と、誘導物質および指示薬を含む微生物増殖培地の独特の調製物は、
適切な時間わたるインキュべーション後に、同じ長さのインキュべーション後に
現在入手可能な市販のペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）^ＴＭプレート（３
Ｍ、セントポール、ミネソタ州）上に増殖するコロニーよりも大きな微生物コロ
ニーを提供する。さらに、平板の第１層および第２層の分離時に、微生物コロニ
ーが分割して第１層および第２層において複製物を形成する。したがって、コロ
ニーの一部分が第１層上に保持され、同じコロニーの一部分が第２層上に保持さ
れる。各フィルム上のコロニーの部分は生存可能であり、拡大または非拡大目視
検査により検出することができる。この特徴は、遺伝子分析または生化学分析を
実施すると同時に、貯蔵または将来の分析のためにコロニーの正確な遺伝子複製
物を保存する各コロニーの一部分の使用を容易にする。遺伝子分析および生化学
分析として、例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応、プラス
ミド制限消化分析、ＤＮＡ配列決定、または抗体仲介発現スクリーニングなど発
現スクリーニング法を挙げることができる。例えば、１つのフィルム（例えば、
第２層）上に保持されたコロニーを用いてコロニーブロッティング法／リフティ
ング法を行い、他のフィルムにおけるコロニー複製物を保持することができる。

【００２９】 したがって、本発明は、微生物コロニー形成単位を同時に増殖し複製すること
を可能にする。本明細書で用いるように、「コロニー形成単位」は少なくとも１
つの細胞を指し、コロニーなど、細胞の集合を含みうる。一般に、コロニー形成
単位を含有する接種菌を装置に添加し、第１層と第２層が接触してゲルを形成す
る。コロニー形成単位は少なくとも１つの細胞分裂を起こすために十分な時間に
わたる適切な条件下に増殖し、その後に第１層と第２層が分離して微生物コロニ
ー形成単位のレプリカを提供する。

【００３０】 本発明の装置は、ゲルの脱水、分解、またはコロニーの相互汚染のリスクがな
い冷蔵庫またはフリーザー内に貯蔵できるという点で寒天平板と付随した問題を
回避する。このような特徴は、培地の独特のゲル化特性と結合された密封可能な
装置の構成により提供される。したがって、微生物コロニー形成単位は、装置の
第１層および第２層を密封することにより保存することができる。一般的に、コ
ロニー形成単位は保存前に少なくとも１つの細胞分裂のために適切な条件下にイ
ンキュべートされる。コロニー形成単位は、細胞分裂が抑制される条件下に（例
えば、フリーザー内で）貯蔵することにより保存される。

【００３１】 本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、これらは請求の範囲に記載
された発明の範囲を限定するものではない。

【００３２】 実施例１−コロニー複製および貯蔵装置の組成：Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−
１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板を、ペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）^{Ｔ Ｍ} Ｅ．ｃｏｌｉ算定平板と同様の物品として構成した。例えば、米国特許第４，
５６５，７８３号を参照。長方形の平板は、直径２’’の環状平板区域を有する
約４’’×３’’であった。用いた被覆されていないフィルムは厚さが約０．４
乃至約３ｍｉｌであった。第１層（この場合、上部フィルム）はおよその直径が
約０．６ｍｉｌであり、第２または下部層のおよその厚さは約２ｍｍであった。

【００３３】 Ｇｅｎ−１Ａ平板および１Ｂ平板の上部層は、Ｍｅｙｐｒｏｇａｔ １５０グ
アールガム（米国特許第４，５６５，７８３号に記載）とＣａｂｏｓｉｌ（２１
９ｍｇ／２４平方インチ被覆）の混合物（重量比１０９．５：１）で粉末被覆し
た、ＲＤ１２７２接着剤（１９５ｍｇ／２００ｃｍ^２に被覆した、イソ−オクチ
ルアクリレート：アクリルアミド９６：４）で被覆した二軸延伸ポリプロピレン
（ＢＯＰＰ）から成るものであった。被覆後、約１６．７ｍｇグアール／平方イ
ンチが認められた。Ｇｅｎ−２平板の上部層は、接着剤層における塩化トリフェ
ニルテトラゾリウムを含めて市販のペトリフィルムＥ．ｃｏｌｉ算定平板（カタ
ログ番号６４１４、３Ｍ社、セントポール、ミネソタ州）と同じ上部層であった
。

【００３４】 表１に示した栄養素／阻害剤組成物は被覆され、Ｇｅｎ−１ＡおよびＧｅｎ−
２については接着剤被覆紙下部フォルム上で、Ｇｅｎ−１ＢについてはＭｅｌｉ
ｎｅｘポリエステル（デュポン、ウィルミントン、デラウェア州）上で乾燥した
。被覆されたブロス混合物の乾燥重量は、３つの平板全てに対して１２．５ｍｇ
／平方インチであった。表１に示した調製物はおよそ１ｍｌの微生物の試料を用
いて再水和するために考えられたものである。

【００３５】

【表１】 表１ ^*重量比６：１：１２．９９で混合。

【００３６】 直径２’’のダイカット環状穴を有するポリスチレンフォームウェブ（接着剤
による裏面を厚さ２０ｍｉｌで被覆）を下部フィルムのブロス被覆表面に付着さ
せ、Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板において「フ
ォームダム」を形成した。装置を長さ４’’×幅３’’の長方形に切断し、ブロ
ス被覆下部フィルムを露出する直径２’’の穴（長方形の平板におおよそ中心が
ある）を有した。二重粘着テープ（幅３／８’’）を長方形の３’’の端の１つ
に貼り、これを用いてグアール被覆上部フィルムをポリスチレンフォームウェブ
に固定し、平板の構成を完了した。

【００３７】 実施例２．Ｇｅｎ−１Ａ平板の各層から生存可能な細胞の回収：実施例１に記
載したように構成された平板にＥ．ｃｏｌｉ株Ｐ１６を接種した。接種菌はコロ
ニーを５ｍｌのトリプシンダイズブロス（Ｒｅｍｅｌ株式会社、レネクサ、カン
サス州）に入れ３７℃下に一夜、培養株をインキュべートすることにより調製し
た。接種菌を１０^−８の最終希釈に連続希釈した（１：１００）。市販のＥ．ｃ
ｏｌｉ／大腸菌型算定ぺトリフィルム^ＴＭ平板を接種するための標準方法に従い
２つのＧｅｎ−１Ａ平板のそれぞれに１ｍｌの最終希釈液を接種した。平板は３
７℃下に一夜（１８時間）接種した。１３個のコロニーを含有する平板の１つを
試験用に用いた。平板を開放し、２つの層を注意深く分離した。各コロニーの部
分がそれぞれの層の両方に移行しているのが確認された。それぞれの層をコロニ
ーを上にしてベンチ上に配置した。６個のコロニーを無作為に選択した。個別の
滅菌した使い捨て式接種ループ（ディフコ；デトロイト、ミシガン州）を用いて
コロニー物質を両方のフィルム上の選択された各コロニーから選んだ。コロニー
物質を用いて小点をトリプシンダイズ寒天平板（Ｒｅｍｅｌ）上に接種した。平
板を２４時間、３７℃下にインキュべートし、コロニーの増殖について検査した
。インキュべーション後、トリプシンダイズ寒天平板上のすべての点は増殖し、
平板の両方のフィルムに保持された生存可能な細胞の存在を示した。

【００３８】 実施例３−Ｇｅｎ−１Ｂ平板の各層からの遺伝子物質の回収：実施例１に記載
したように構成された平板をこの実施例において用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５
αをすべての実験において用いた。細胞はＣａＣＩ_２を用いて適格性に作成し、
プラスミドｐｕｃ−ｇｆｐ３で形質転換した。ｐｕｃ−ｇｆｐ３は、緑色蛍光タ
ンパク質をコードする遺伝子を含有するＰｕｃｌ９誘導体である。形質転換およ
び回収後、すべての細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するバターフ
ィールドの緩衝液（ハーディ・ディアグノスティックス；サンタクララ、カリフ
ォルニア州）中に希釈し、１ｍｌの希釈液をＧｅｎ−１Ｂ平板上に蒔いて培養し
た。平板を１４乃至１８時間、３７℃下にインキュべートした。装置を開放する
前にコロニーを無作為に選択し、上部層および下部層を選択したコロニーの周囲
に円でマーキングするとともに、装置を開放した。

【００３９】 プラスミド分離−それぞれの層におけるコロニー複製物からプラスミド標本を
作成した。滅菌したつまようじを用いてそれぞれのコロニー複製物からの物質を
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する５ｍｌのルリア−ブレタニ（ＬＢ
）寒天の中へ移し、攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃下に１６時間、増殖さ
せた。平板の上部および下部のフィルムから４種類のコロニーでプラスミド標本
を作成した。培養株の吸光度を一夜増殖後にＯＤ_６００で測定し、上部および下
部のフィルムからの培養株間のい吸光度はほぼ同じであった。Ｗｉｚａｒｄ Ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐキット（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）を用いたアル
カリ法により５ｍｌの培養液からＤＮＡを分離した。プラスミドをＥｃｏＲＩで
切断し、０．７％アガロースゲルにより電気泳動した。結果は、平板の上部層お
よび下部層における選択されたコロニー複製物のすべてからプラスミドＤＮＡが
得られることを示した。

【００４０】 コロニーＰＣＲ−コロニーを選択し、上記のように標識した。それぞれの層の
分離後、各コロニーの複製物を２５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＰＣＲ（Ｐ
Ｅバイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州）またはＱｉａｇ
ｅｎ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ株式会社、バレンシア、カリ
フォルニア州）反応混液中に懸濁し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００サー
モサイクラーにおいて４０サイクルのＰＣＲを行った。実験を下部層と上部層の
両方からの５個のコロニーで２回反復した。ＰＣＲ後、生成物を０．７％アガロ
ースゲルにより電気泳動した。臭化エチジウム染色は、上部層または下部層から
なお５個のコロニーの各々からのＰＣＲによる生成物の量がほぼ同じであること
を示した。結果は、同じＰＣＲ増幅生成物が上部層および下部層から取られたコ
ロニー複製物で構成された反応のすべてから得られることも示した。

【００４１】 実施例４−Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板の貯
蔵の予測的実施例：形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞がＬＢ寒天平板上および本明
細書に記載された平板上に蒔いて培養する。平板を１８時間、３７℃下にインキ
ュべートする。インキュべーション後、平板を再密封可能な（ＺｉｎＬｏｃｋ^{Ｔ Ｍ} ）プラスチックバッグ内に配置し、−２０℃下に置く。少なくとも１週間の凍
結温度での貯蔵後、平板を冷凍庫から取り出し、室温に温めた。コロニーを滅菌
ループでピックアップし、（ａ）コロニーをブロス培地（例えば、ＬＢブロス）
へ継代培養するとともに（ｂ）コロニー内の遺伝子物質のポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）分析を行う。

【００４２】 コロニーを凍結／融解サイクル中に保存し、クローンの相互汚染を回避する。
これにより使用者は、平板が解凍した後にきわめて容易に継代培養するためのコ
ロニーをピックアップすることが可能である。さらに、コロニーは、培地の表面
上ではなく、培地内で増殖しているため、コロニー内の遺伝子物質が凍結／融解
サイクル中に相互汚染する可能性がほとんどない。

【００４３】 対照的に、表面コロニーの寒天平板の凍結は、寒天表面上の氷晶の蓄積につな
がる。平板を解凍させると、この表面の水分は隣接コロニーに相互汚染を引き起
こし、継代培養株の純度およびＰＣＲまたは他の遺伝子分析のためのコロニーか
ら分離した核酸物質の遺伝子完全性を破壊する。さらに、さらに、寒天が凍結温
度で残る時間が長ければ長いほど、ゲルの脱水により寒天内に亀裂が形成する可
能性が高まる。これらの亀裂は解凍サイクル中の水分の濃縮および融合のための
追加の表面を提供し、これによりコロニーの崩壊および相互汚染の可能性が増大
する。

【００４４】 実施例５−コロニーサイズの対する平板組成の影響：この実験の目的は、本明
細書中に記載された平板上のプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ株の増殖を他の市
販のドライフィルム培地と比較することであった。インキュべーション後、各平
板上の平均コロニーサイズの関数として増殖を比較した。

【００４５】 ４．５ｍＬのトリプシンダイズブロス（Ｒｅｍｅｌ株式会社、レネクサ・カン
サス州）を含有する管にアンピシリン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント
ルイス、ミズーリ州、最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加することにより接種菌を
調製した。ｐＧＦＰ３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂのコロニーを管
の中へ接種し、培養株を攪拌せずに３７℃下に一夜インキュべートした。

【００４６】 インキュべーション後、ボルテックス措置により管を混合し、均質の懸濁液を
得た。懸濁液を１０^−７の最終希釈にバターフィールドの緩衝液（ハーディ・デ
ィアグノスティックス；サンタクララ、カリフォルニア州）中に連続希釈した。

【００４７】 本発明に記載された平板のほかに、以下の市販のぺトリフィルム（Ｐｅｔｒｉ
ｆｉｌｍ）^ＴＭ平板を接種した：Ｅ．ｃｏｌｉ算定（ＥＣ）、大腸菌型算定（Ｃ
Ｃ）、腸内細菌科算定（ＥＢ），急速大腸菌型算定（ＲＣＣ）、および好気性算
定（ＡＣ）。平板のすべては３Ｍ社（セントポール、ミネソタ州）から入手可能
である。

【００４８】 ペトリフィルム平板製品の挿入物に従い、１．０ｍＬの希釈細胞懸濁液で平板
を接種した。ペトリフィルム平板スプレッダーを用いてプレーティング範囲内に
接種菌を分布した。

【００４９】 接種平板を８〜１２のスタック内に配置し、１６時間、３７℃下にインキュべ
ートした。インキュべートした平板をヒューレット−パッカード・スキャンジェ
ット６１００Ｃ平台型スキャナーでスキャニングした。「Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴ
用画像処理」ソフトウェア（ワング・ラボラトリーズ株式会社；ビルリカ、マサ
チューセッツ州）によりＩＢＭ ３００ＰＬコンピュータで画像を確認した。画
像は１０００％に拡大し、個々のピクセルが確認できるようにした。

【００５０】 コロニーサイズは個々のコロニーの寸法（ピクセル単位）を測定することで推
定した。コロニーは、コロニーが青色であったＧｅｎ−１およびＥＣの調製物を
除きすべての平板上で赤色であった。ＥＢ平板上のコロニーサイズを測定する場
合、コロニー径の一部としてコロニー周囲の気泡は算定しなかった。平均コロニ
ーのピクセル数を計算した（表２）。平板上に黄色のグリッドを載せたコロニー
はコロニーサイズの推定用に用いなかった。各分析において用いたコロニーの数
が表２に示されている。表２における「^＊」は、１６時間のインキュべーション
後にＣＣ平板上には視認された小さな酸の区域であるが、その区域の中心におけ
るコロニーは視認されなかったことを指し、「^＊＊」は１６時間のインキュべー
ション後にＥＣ平板において視認された１つのコロニーのみを指す。このコロニ
ーは黄色のグリッド線の１つの上に重なり、したがって、分析には含まれなかっ
た。

【００５１】

【表２】 表２

【００５２】 これらのデータは、Ｇｅｎ−１ＡおよびＧｅｎ−２の調製物の明らかなコロニ
ーサイズが、試験した他のペトリフィルム平板よりも大きいことを示している。
Ｇｅｎ−１Ａにおける平均コロニーサイズは試験した平板のすべてのうち最大で
あった。各平板におけるコロニーの比較的少数は結果として平板上の栄養素に対
して競合を示さなくなる。したがって、これらの実験に用いたインキュべーショ
ン温度では、コロニーは各調製物において最適に増殖していた。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 装置の一実施態様を示す概略図である。

【図１Ｂ】 装置の一実施態様および微生物コロニーの分割を示す概略図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バサバパトナ・エス・ラジャゴパル アメリカ合衆国55133−3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB01 CC02 CC03 CC07 FA04 FA09 FA10 4B065 AA26X AA41X AA53X BB08 BB36 BB40 BC46 CA46

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１層および第２層を含む微生物の増殖または貯蔵のための
   装置であって、前記第１層がゲル化剤と微生物増殖培地とを含み、前記第２層が
   ゲル化剤を含み、前記装置が指示薬と対応する誘導物質とをさらに含み、前記第
   １層および第２層が互いに分離可能である装置。
2. 【請求項２】 可視微生物コロニーの少なくとも８０％が分割し、前記層の
   分離時に前記第１層および第２層において複製物を形成する、請求項１に記載の
   装置。
3. 【請求項３】 前記第１層または第２層における前記複製物が拡大または非
   拡大目視検査により検出可能である、請求項２に記載の装置。
4. 【請求項４】 前記第１層または第２層における前記複製物が遺伝子分析に
   より検出可能である、請求項２に記載の装置。
5. 【請求項５】 前記遺伝子分析による検出がハイブリダイゼーション、ポリ
   メラーゼ連鎖反応、プラスミド制限分析、または発現スクリーニングである、請
   求項４に記載の装置。
6. 【請求項６】 前記第１層または第２層における前記複製物が生存可能であ
   る、請求項２に記載の装置。
7. 【請求項７】 前記第１層または第２層が再水和可能である、請求項１に記
   載の装置。
8. 【請求項８】 前記第１層または第２層の前記ゲル化剤がグアールガム、キ
   サンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチ
   ルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲランまたは低モノマー
   含量ポリアクリル酸である、請求項１に記載の装置。
9. 【請求項９】 前記第１層または第２層の前記ゲル化剤がグアールガムであ
   る、請求項１に記載の装置。
10. 【請求項１０】 前記微生物増殖培地が界面活性剤を含む、請求項１に記載
    の装置。
11. 【請求項１１】 前記界面活性剤がイオン性界面活性剤である、請求項１０
    に記載の装置。
12. 【請求項１２】 前記イオン性界面活性剤がデオキシコール酸塩、胆汁酸塩
    または硫酸ラウリルである、請求項１１に記載の装置。
13. 【請求項１３】 前記微生物増殖培地が塩を含む、請求項１に記載の装置。
14. 【請求項１４】 前記第１層が選択可能な薬剤をさらに含む、請求項１に記
    載の装置。
15. 【請求項１５】 前記選択可能な薬剤が抗生物質である、請求項１４に記載
    の装置。
16. 【請求項１６】 前記選択可能な薬剤がアミノ酸欠乏である、請求項１４に
    記載の装置。
17. 【請求項１７】 前記指示薬が沈殿性である、請求項１に記載の装置。
18. 【請求項１８】 前記指示薬が色素生産性である、請求項１７に記載の装置
    。
19. 【請求項１９】 前記指示薬が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシ
    ル−β−Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
    ドキシルエステル（トリフルオロ酢酸塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
    ドキシル−ｌ−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−３−酢酸
    塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラ
    クトサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β
    −Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル酪酸塩、５
    −ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸塩、５−ブロモ−４−クロ
    ロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−
    インドキシル−α−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
    キシル−β−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル
    −β−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−
    Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ
    −ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−
    グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グル
    コピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロ
    ン酸（シクロヘキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
    キシル−β−Ｄ−グルクロン酸（ナトリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３
    −インドキシルミオ−イノシトール−ｌ−リン酸塩（アンモニウム塩）、５−ブ
    ロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マルトトリオース、５−ブロモ
    −４−クロロ−３−インドキシルミリスチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３
    −インドキシル−α−Ｄ−マノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
    ドキシル−ノナン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルオレイン酸
    塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルパルミチン酸塩、５−ブロモ−
    ４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ｛２−アミノ−２−メチル−１、３
    −プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸
    塩（ジリチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸
    塩（ジカリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ
    ナトリウム塩セスキ水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン
    酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ｐ
    −トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（カリウ
    ム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（ｐ−トルイジン塩
    ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルトリミジン−３’−リン酸塩（
    シクロヘキシルアンモニウム塩）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキ
    シル−β−Ｄ−キシロピラノシドである、請求項１８に記載の装置。
20. 【請求項２０】 前記誘導物質が１−Ｏ−メチルグルクロン酸、イソプロピ
    ル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
    ド、または１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１に記載
    の装置。
21. 【請求項２１】 前記第１層または第２層が接着剤をさらに含む、請求項１
    に記載の装置。
22. 【請求項２２】 前記第１層および第２層が水不浸透性基材を含む、請求項
    １に記載の装置。
23. 【請求項２３】 前記水不浸透性基材がプラスチック、ガラス、または被覆
    紙である、請求項２２に記載の装置。
24. 【請求項２４】 前記水不浸透性基材がポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
    プロピレン、またはポリエステルである、請求項２２に記載の装置。
25. 【請求項２５】 前記ポリプロピレンは二軸延伸ポリプロピレンである、請
    求項２４に記載の装置。
26. 【請求項２６】 前記基材が、前記第１層および第２層が互いに実質的に対
    向する折り畳みを有する物質の連続小片を含む、請求項２２に記載の装置。
27. 【請求項２７】 前記基材が取り外し可能であり、または互いに持続的に付
    着される、請求項２３に記載の装置。
28. 【請求項２８】 前記基材がヒンジ、クラスプ、グルー、ステープル、また
    はクランプなどにより互いに付着される、請求項２７に記載の装置。
29. 【請求項２９】 前記微生物が細菌、真菌、酵母菌、ファージ、またはマイ
    コプラズマである、請求項１に記載の装置。
30. 【請求項３０】 前記細菌が好気性、嫌気性または微好気性である、請求項
    ２９に記載の装置。
31. 【請求項３１】 前記細菌がグラム陰性である、請求項２９に記載の装置。
32. 【請求項３２】 前記細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス
    （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
    ｎａｓ）である、請求項２９に記載の装置。
33. 【請求項３３】 可視微生物コロニーの少なくとも８５％が分割し、前記層
    の分離時に前記第１層および第２層において複製物を形成する、請求項２に記載
    の装置。
34. 【請求項３４】 前記可視微生物コロニーの少なくとも９５％が分割し、前
    記層の分離時に前記第１層および第２層において複製物を形成する、請求項２に
    記載の装置。
35. 【請求項３５】 前記第２層が微生物増殖培地をさらに含む、請求項１に記
    載の装置。
36. 【請求項３６】 前記指示薬および前記対応する誘導物質が同じ層にある、
    請求項１に記載の装置。
37. 【請求項３７】 微生物コロニー形成単位のレプリカを同時増殖し、得るた
    めの方法であって、 ａ）微生物コロニー形成単位を含む接種菌を装置に塗布して接種装置を形成す
    ることと、 ｂ）前記接種装置の前記第１層および第２層を接触してゲルを形成することと
    、 ｃ）少なくとも１つの細胞分裂のために十分な時間にわたり前記接種装置をイ
    ンキュべートすることと、 ｄ）第１層および第２層を分離して前記微生物コロニー形成単位のレプリカを
    提供することと、 ｅ）前記微生物コロニー形成単位の分離を確認することと、を含む方法。
38. 【請求項３８】 前記第１層または第２層が指示薬と対応する誘導物質とを
    さらに含む、請求項３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記方法が少なくとも１つの前記複製物における分子生物
    学操作を実施することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。