ES2535583B1 - Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos - Google Patents

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Abstract

La invención trata de medios de cultivo e n p o l v o para microbiología, con gelificantes en frío añadidos e impregnados mecánicamente en soportes de fibra para ser posteriormente esterilizados por irradiación, obteniéndose así, a partir de un medio deshidratado, un medio preparado, estéril y listo para su uso, con la ventaja de auto-absorber la muestra sin necesidad de calentar, fundir y enfriar agares, de manera que tras incubar adecuadamente se obtienen colonias de aspecto prácticamente idéntico al obtenido en placas preparadas convencionales de los medios estándar, presentando como dos de las características fundamentales de novedad el hecho de que la impregnación del medio en la fibra se realiza en seco, y que no se necesitan aplicadores para la correcta autodifusión de la muestra.

Description

OBJETO DE LA INVENCiÓN
La presente invención se refiere a un control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos, y más concretamente a
10 un nuevo método y formato en los medios de cultivo utilizados para poder conseguir un medio preparado estéril, listo para su uso.
El objeto de la invención es conseguir que el medio, deshidratado pero preparado, estéril y listo para uso, tenga la ventaja de auto-absorber la muestra (siembra
15 en masa) sin necesidad de calentar, fundir ni enfriar agares, ni de emplear aplicadores, permitiendo obtener, tras una incubación adecuada, colonias de aspecto prácticamente idéntico al obtenido en placas preparadas convencionales de los medios estándar.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos, actualmente se realiza básicamente de tres formas o métodos
5 convencionales que corresponden a:
a) Mediante medios deshidratados no estériles que el usuario debe hidratar, esterilizar al autoclave, enfriar, dispensar en placas, tubos o frascos, y
posteriormente sembrar, o bien en masa a 45°C, o bien con asas, 10 membranas filtradas o escobillones, una vez sólido.
b) Mediante medios preparados en tubos o frascos estériles, que el usuario
debe hervir, enfriar, dispensar en placas y sembrar en ellas, o bien en masa a 45°C, o bien con asas, membranas filtradas o escobillones una vez
15 sólido. Estos dos métodos referidos requieren un elevado periodo de tiempo para llevar a cabo el proceso (el primero varias horas y el segundo cerca de 1 hora).
c) Mediante medios preparados en placa, que el usuario debe sembrar en 20 superficie con asas, membranas filtradas o escobillones, y que
habitualmente solo son capaces de absorber entre 0,1 Y 0,33 mi de muestra
(la absorción de un 1 mi tarda mucho y no es recomendada en normas ISO).
El avance de la placa preparada es que sólo requiere minutos de trabajo,
pero tiene la limitación de no poder sembrar en masa, mezclando el mi de
5 muestra con el medio, como requieren casi todos los métodos de recuento en placa (bacterias aerobias, enterobacterias, coliformes, estafilococos, anaerobios, levaduras ...): sólo sirve para sembrar en superficie con escobillones, asas o membranas. Además, el mantenimiento de la esterilidad
durante el transporte se ve muy comprometido y la caducidad muy 10 mermada, ya que frente a los 5 años del medio deshidratado, o frente a un año del tubo/frasco preparado, se reduce a solo 1-3 meses.
Por otro lado existen invenciones de las últimas décadas (como por ejemplo
Petrifilm-USA, CompactDry-Japón y productos similares de estos mismos 15 paises) que permiten la absorción en fria de 1 mi de muestra, de diversas
maneras, lo que permite tener un medio preparado similar a la placa preparada, con una caducidad muy superior, aproximadamente de un año, aunque tiene inconvenientes ya que se requieren forzosamente aplicadores para difundir la muestra en el primer caso, y la aparición de colonias deformes en el seg undo
20 caso.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
El medio de cultivo para control microbiológico según la invención, viene a resolver
5 los problemas anteriormente referidos, dando incluso un paso adelante
respecto de los métodos referidos en el último párrafo del apartado anterior, de manera que según la invención, es posible conseguir la autodifusión de la
muestra a analizar sin necesidad de aplicadores, así como obtener colonias prácticamente idénticas a las obtenidas con el método microbiológico convencional.
Más concretamente, según la invención, se parte de un medio deshidratado en
polvo fino que incluye gelificantes que permiten la autodifusión tridimensional de la
muestra en frío, sin necesidad de calentar y enfriar el medio, estando éste embebido en una lámina absorbente de una matriz fibrosa que reparte la muestra 15 a analizar, de manera que el conjunto de dichos tres componentes, denominado
" disco nutriente" , va envasado en, por ejemplo, una bolsa autosellable de
aluminio, o cualquier otro medio que protege esos discos nutrientes de la
humedad y de la luz, agentes éstos que son los que más estropean todos los
medios de cultivo.
Finalmente. el medio de cultivo referido es esterilizado, permitiendo al
usuario poder utilizarlo en el soporte que desee, preferentemente en placas Petri estériles de 55-60 mm de diámetro.
Los medios de cultivo empleados en la invención, serán a menudo agares cromogénicos para cada parámetro microbiológico: recuento y detección de
bacterias aerobias, recuento y detección de hongos (levaduras y mohos),
recuento y detección de Enterobacterias, recuento y detección de E.co/; y
10 demás cOliformes, recuento y detección de Staphylococcus aureus, recuento y detección de Pseudomonas aeruginosa, recuento y detección de Burkholderia
cepacia, recuento y detección de Lisleria monocytogenes, recuento y detección de
Bacillus cereus, detección de Salmonella spp., recuento y detección de Vibrio
SPP. recuento y detección de Gandida albícans.. , que en este caso su agar
15 agar no interviene en la gelificación del medio, pero si ayuda a estabilizar,
tamponar y robustecer la mezcla, pudiéndose utilizar cualquier medio de cultivo deshidratado en polvo, sea cual sea su granulometría, siempre que incluya
gelificantes en frio y se incluya en láminas de fibra absorbente.
20 En cuanto a los gelificantes utilizados, y que permiten la autodifusión
tridimensional de la muestra en frío, podrá utilizarse cualquiera que absorba agua en frío, sea sintético o natural, añadido al medio de cultivo y embebido en seco en la
lámina de fibra.
5 Por su parte, la lámina absorbente de matriz fibrosa, que se acaba de
comentar en el párrafo anterior, ayuda al medio a absorber la muestra en frío, sin
necesidad de calentar y enfriar el medio, todo ello sin necesidad de aplicadores, repartiéndola de forma homogénea y prácticamente instantánea por capilaridad ,
siendo sus poros lo suficientemente amplios como para absorber y mantener el
10 medio de cultivo en polvo y para absorber la muestra, pero lo suficientemente
finos como para que las colonias crezcan con aspectos prácticamente idénticos a las colonias crecidas en medios convencionales.
La polimerización del medio se consigue en las tres dimensiones gracias a la
15 composición del gelificante en la matriz fibrosa , pudiéndose utilizar una lámina de
fibra absorbente cualquiera, ya sea sintética o natural, sea cual sea su tamaño en cualquiera de sus tres dimensiones, sea cual sea el diámetro medio de su
malla, su forma geométrica (circular, cuadrada, hexagonal, etc.), siempre que
embeba mecánicamente el medio de cultivo en polvo con gelificante en frío.
La esterilización en un medio cerrado se llevará a cabo preferentemente en
bolsas autosellables de aluminio, que protegen de la humedad, de la luz y de la
contaminación externa, aunque puede utilizarse cualquier medio para
guardar/almacenar el cultivo propiamente dicho.
En cuanto a la esterilización, la misma se realizará mediante irradiación, aunque puede utilizarse cualquier sistema o método conocido de esterilización.
En cuanto al soporte sobre el que el usuario puede utilizar, podrá ser también
10 cualquiera siempre que dicho soporte sea hidrófugo y preferentemente transparente por ambas caras, para observar mejor las colonias por arriba y/o por
abajo, resultando óptima la utilización de una placa Petri por cada disco nutriente, para que el usuario no tenga que buscarse soportes.
15 Añadir que utilizando el disco nutriente estéril sobre un 1 mi de muestra, el peso del
mismo atrapa la muestra y sus microorganismos, autodifundiéndose instantáneamente sin necesidad de calentar ni enfriar y, tras la incubación tiempo/temperatura adecuados para el microorganismo buscado, aparecen aproximadamente tantas colonias como unidades formadoras de colonias
20 vivifica bies habia en la muestra. Y que algunos medios requieren la adición de la
muestra sobre el disco, en vez de la adición del disco sobre la muestra.
La transparencia de la matriz fibrosa y los componentes cromogénicos del medio,
permiten ver las colonias crecidas en todo el grosor del disco nutriente, tanto
5 desde arriba como desde abajo.
A menudo la sinergia de los componentes permite acortar los tiempos de
incubación, obteniendo resultados más rápidos que el método convencional; por
ejemplo permite recuentos estimativos en sólo 24 h para aerobios, Pseudomonas...
10 que en el método tradicional requieren 2-3 dias de incubación.
Como consecuencia de ahorrarse el proceso de fusión y enfriamiento de agares, el usuario se ahorra el punto crítico más importante en la microbiología de las siembras por inclusión en masa: el hecho de añadir el medio demasiado caliente en la
15 muestra (para que el agar-agar no solidifique antes de mezclar el medio con la muestra), y por lo tanto el derivado hecho de impedir que crezcan todas las
unidades formadoras de colonias, de modo que mediante el sistema de la invención se aumenta la exactitud de los recuentos y el límite de detección de los aislamientos: a menudo el número de colonias obtenido se acerca más al
20 número de ufc presentes en la muestra que el número de colonias obtenido en los
métodos convencionales.
Entre las ventajas más destacables del invento, además de las anteriormente
comentadas, pueden citarse las siguientes:
La impregnación del med io se realiza en seco y de forma mecánica.
No se utiliza alcohol para la impregnación.
No se utilizan pegamentos. La fibra es de poro tan fino que las colonias no toman
10 macroscópicamente la forma de la fibra, sino la misma forma típica del medio agarizado clásico. Los med ios empleados aportan avances sobre los estándar, siguiendo la mayoría de ellos las más modernas normas ISO que les aplican, además están agarizados y son de polvo extremadamente fino.
15 No se necesitan aplicadores para que la muestra autodifunda, ni superficies lisas y sólidas para trabajar con dichos aplicadores, por lo
que la invención se puede emplear en muestras de laboratorio y también en muestras de campo. La muestra autodifunde por el simple peso de colocar la lámina nutriente
20 sobre ella, sea en el soporte que sea, de manera que algunos medios difunden la muestra mucho más rápido que otros (desde sólo 1
segundo), en función de su composición más o menos hidrófila, pero que en todos los casos la muestra se autodifunde en menos de un minuto. En algunos medios incluso no se necesita el peso del disco nutriente para la
5 autodifusión, por lo que se puede añadir la muestra sobre el disco en vez
de hacerlo al revés. La muestra o el agua al mezclarse con el cultivo de la invención, permite
que éste se quede adherido al soporte (por ejemplo placa Petri), de
modo que si se desea sembrar con asa, membrana filtrada o 10 escobillón, el disco nutriente ni se desplaza ni se arruga.
Utilización f I e x i b I e de soportes, con las ventajas que de ello se
derivan, aunque preferentemente se utilizará una placa Petri estéril de
55-60 mm por cada disco nutriente.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de
    5 patógenos, utilizando medios de cultivo preparados de una u otra forma para
    conseguir un producto con med io deshidratado y estéril, que se comporta como medio preparado y listo para su uso, caracterizado porque incluye un medio
    deshidratado en polvo fino, que incluye gelificantes que permiten la autodifusión
    tridimensional de la muestra en frío; con la particularidad de que dicho medio de 10 cultivo está impregnado en una lámina absorbente de una matriz fibrosa que reparte
    la muestra a analizar; habiéndose previsto que el producto resultante de la combinación del medio deshidratado en polvo fino, los gelificantes y la lámina
    absorbente, es esterilizado por irradiación en ambiente cerrado herméticamente, permitiendo su colocación y utilización final sobre un soporte.
    15 2.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos, según reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo
    deshidratado en polvo, es susceptible de tener cualquier granulometría.
    20 3.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de
    patógenos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el gelificante en frío es susceptible de ser sintético o natural, y siempre añadido al medio de
    cultivo y embebido en seco en la lámina de fibra.
    5 4.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de
    patógenos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lámina absorbente de matriz fibrosa presenta unos poros suficientemente amplios para
    perm itir absorber y mantener el medio de cultivo en polvo y para absorber la
    muestra y sus microorganismos, y lo suficientemente finos para que las colonias 10 crezcan con aspecto prácticamente idéntico a las colonias crecidas en medios
    convencionales; habiéndose previsto que dicha lámina absorbente de matriz fibrosa
    es susceptible de ser sintética o natural, tener cualquier tamaño y diámetro medio de su malla, así como tener cualquier forma geométrica.
    15 5.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de
    patógenos, según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte sobre
    el que el usuario puede emplear el medio de cultivo resultante es hidrófugo y
    preferentemente transparente por ambas caras.
    20 6.-Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de
    patógenos, según reivindicación 5, caracterizado porque el soporte estará constituido preferentemente por una placa Petri o material similar.
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