DE3854471T2

DE3854471T2 - Nachweisverfahren.

Info

Publication number: DE3854471T2
Application number: DE3854471T
Authority: DE
Inventors: Megan Ash; Vincent Atrache; Huynh Ca Van
Original assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Tecra International Pty Ltd Melbourne Victoria
Priority date: 1987-07-28
Filing date: 1988-07-28
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2008-07-29
Also published as: EP0330688A4; EP0330688B1; JP2779509B2; WO1989001162A1; ATE127924T1; AU2127888A; AU610925B2; EP0330688A1; JPH02500219A; DE3854471D1

Description

Technischer Bereich

Die aktuelle Erfindung bezieht sich auf Methoden zum Nachweis von geringen Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen aus einer Mischkultur oder Probe unter Verwendung von Antikörpern und festphasigen Immunadsorbensträgern ohne Notwendigkeit einer vor- oder nachgeschalteten Wachstumsstufe in Selektivnährböden.

Hintergrund

Festphasen-Immunoassays, die Enzyme oder radioaktive Isotope als Marker verwenden, haben in der diagnostischen Mikrobiologie aufgrund ihrer hohen Spezifität und Sensibilität breite Anwendung gefunden.
Die Spezifität eines Immunoassays ist abhängig vom auf dem festen Träger immobilisierten Antikörper oder Antigen. Einer der Hauptvorteile der Festphasenassays besteht darin, daß sich überflüssiges Material nach Abschluß der Immunreaktion durch eine einfache Reinigungsstufe auf unkomplizierte Weise zeitsparend aus dem Antigen- Antikörperkomplex entfernen läßt. Eine Vielfalt an festphasigen Trägern hat in der Antikörper- bzw. Antigenimmobilisierung Anwendung gefunden, darunter Styropor, Polyvinylchlorid, Nylon, Titanhydroxid, Agar-Kügelchen und Nitrozellulose.
Immunoassays lassen sich nur dann erfolgreich auf den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe anwenden, wenn der entsprechende Organismus in genügender Zahl vorhanden ist. Diese kritische Konzentration ist abhängig von der Sensibilität des Immunoassays, die je nach Affinität und Reaktionsfreudigkeit eines bestimmten Antikörpers mit seinem Antigen erheblich schwanken kann. Aus diesem Grund muß für viele Immunoassays die Probe vor Durchführung des Tests kultiviert werden.
Dies erfordert normalerweise einen vorgeschalteten Anreicherungsschritt zur Reaktivierung beschädigter Mikroorganismen, gefolgt von selektiver Anreicherung zur Steigerung der Anzahl der betreffenden Mikroorganismen. Traditionell wurden durch Verwendung von Antibiotika oder spezifischen Nährbodenbedingungen oder durch die Beeinflussung von physikalischen Gegebenheiten des Nährbodens (z.B. Temperatur) Bedingungen geschaffen, die in der Kultur das Wachstum eines bestimmten Mikroorganismus im Vergleich zu seinen Konkurrenten förderte. Diese Verfahren können ein bis zwei Tage oder auch Wochen in Anspruch nehmen, je nach Organismus und Ausmaß der Kontamination mit anderer Mikroflora.
Die Verwendung von Immunadsorbentien zur Auswahl von Mikroorganismen aus einer Mischpopulation ist bekannt. Das Adsorbens immobilisiert eine bestimmte Spezies von Mikroorganismus, gegen die die Antikörper gerichtet werden. Auf diese Weise erfaßte Zellen können im Nährboden inkubiert und dann mit traditionellen Verfahren wie Plattenkultur und Koloniezählung gezählt werden.
Das US-amerikanische Patent Nr. 4 592 994 beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung oder Identifikation von Mikroorganismen oder Einzellern in einer Probe. In diesem Verfahren wird die Probe einem Adsorbens mit "spezifischer Bindekraft" ausgesetzt, das z.B. durch einen gegen den zu untersuchenden Mikroorganismus gerichteten Antikörper gegeben sein kann. Nicht gebundene Probeteile werden separiert und das Adsorbens mit den gebundenen Organismen einem Nährmedium ausgesetzt, um Stoffwechsel anzuregen. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Nährmediums verändern sich aufgrund der Stoffwechselaktivität. Diese Veränderungen können anhand von Eichkurven zur Bestimmung des Vorhandenseins bzw. der Menge des entsprechenden Mikroorganismus beobachtet werden. Der Versuch beinhaltet die indirekte Messung der ursprünglichen Anzahl von Organismen durch die Messung von Stoffwechselprodukten im Medium. Dies kann zu Schwierigkeiten bezüglich der Spezifität des Versuchs führen, da Stoffwechselprodukte von verschiedenen Mikroorganismen stammen können.
Das US-amerikanische Patent Nr. 4 563 418 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung eines bestimmten, motilen Organismus in einer Probe, z.B. Geißelbakterien wie Salmonellaarten.
Dieses Verfahren beinhaltet die Anreicherung der Probe in einem für den jeweiligen motilen Organismus selektiven Anreicherungsmedium sowie das Füllen eines Motilitätsbehälters mit einem nichtselektiven Medium mit chemotaktischem Attraktans, das den zu untersuchenden Organismus und seine Konkurrenten für eine gewisse Zeit nach Inokulation im Medium immobilisiert. Für die Geißeln eines bestimmten Motilorganismus spezifische Antikörper werden über eine andere Öffnung im Motilitätsbehälter eingeführt. Der Behälter wird unter ausreichender Temperatur genügend lange inkubiert, damit die Motilorganismen das chemotaktische Attraktans metabolisieren können. Dadurch wird dessen Konzentration genügend verringert, um den vorhandenen Organismen Bewegung zu ermöglichen; die Organismen bewegen sich in der Folge im Medium, während die zu untersuchenden Motilorganismen von den Antikörpern immobilisiert werden. Die Menge der verwendeten Antikörper ist zur Schaffung eines permanenten Immobilisierungsbandes ausreichend.
Mohit et al. ["A Simple Single-Step Immunoimmobilization Method for the Detection of Salmonella in the Presence of Large Numbers of Other Bacteria", J. Med. Microbiol. 8 173 (1975)] beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von Salmonella in einer Mischpopulation. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung eines halb festen Selekivmediums, das die Migration der Salmonella fördert, gefolgt von Immobilisierung durch polyvalente H-Antiseren.
La Roche et al. ["Field Evaluation of the Membrane Filter-Disc Immobilization Technique in the Detection of Salmonella in Egg Products"] beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von Salmonella, bei dem Salmonella vor selektiver Migration mittels eines Membranfilters aus einer primären Anreicherungsbouillon konzentriert werden, um so die Rückgewinnung zu steigern.
Stannard beschrieb im Jahresbericht 1986 der Leatherhead RA Untersuchungen zur Separation von Salmonella von anderen Organismen, um so den Zeitbedarf für den Nachweis von Salmonella in Proben zu reduzieren.
Dieses Verfahren beruhte auf antikörperbeschichteten Magnetteilchen. Es ergab sich jedoch, daß die anscheinende Anreicherung mit Salmonella im Vergleich zu anderen, nah verwandten Organismen tatsächlich auf der unterschiedlichen Affinität dieser Organismen zum im Experiment verwandten Glas beruhte. Versuche, diese unterschiedliche Glasaffinität zur Anreicherung von Salmonella zu nutzen, blieben erfolglos, da der Effekt nicht spezifisch genug war.
J.W.L. Van Vuurde berichtet in Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 17, 139-148 (1987) von Bakterienadsorption auf z.B. Petrischalen unter Verwendung von selektiven Antikörpern. Bei diesem Verfahren werden nicht gebundene Bakterien weggespült; die relevanten Bakterien desorbiert und auf einem entsprechenden Medium als Plattenkultur aufgebracht.
Es kann so gezeigt werden, daß die oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen aus Mischpopulationen Möglichkeiten darstellen, geringe Mengen nachzuweisen, sofern eine Anreicherung in Selektivmedien stattfindet. Immunoimmobilisierung wurde zum Einsatz gebracht; diese Methode erwies sich jedoch als für den Nachweis geringer Mengen ungeeignet, falls nicht schon eine Selektion über ein Selektivmedium stattgefunden hat.
Die aktuelle Erfindung beschreibt Verfahren zum Nachweis geringer Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen in einer Mischpopulation, bei denen aufgrund des Einsatzes einer Immunoimmobilisierungstechnik und nachfolgendem nichtselektivem Wachstum und Immunoassay keine Vorabselektion in Selektionsmedien erforderlich ist.
Diese Verfahren lassen sich besonders nutzbringend im Nachweis von Salmonella und Listeria spp einsetzen, da sie dem Bedürfnis nach zeitsparenden, sensiblen Verfahren zu deren Nachweis in Mischpopulationen entgegenkommen.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung bietet Verfahren zum zeitsparenden Nachweis eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen bei gleichzeitigem Vorhandensein konkurrierender Mikroflora. Diese Verfahren verwenden spezifische, auf einen festphasigen Träger adsorbierte Antikörper. Der immobilisierte Antikörper ist gegen das Antigen des Mikroorganismus gerichtet und gestattet dadurch die selektive Erfassung und Immobilisierung des entsprechenden Mikroorganismus, ohne dessen Replikationsfähigkeit einzuschränken. Geeignete Antikörper können gegen von Oberflächenstrukturen wie z.B. Geißeln oder Lipopolysaccharide gebildete Oberflächenantigene gerichtet sein. Selektive Konzentration des gewünschten Mikroorganismus bzw. der gewünschten Mikroorganismen auf dem Festphasenträger ermöglicht die schnelle Separation konkurrierender Mikroflora aus der Probe und läßt sich einfach durch Waschen des Trägers erreichen. Die immobilisierten Zellen lassen sich dann zur Replikation auf eine Nährstoffbouillon übertragen. Während dieses Zeitraums werden sich vermehrende Mikroorganismen weiterhin erfaßt und auf demFestphasenträger immobilisiert, bis die Antikörperregionen gesättigt sind.
Der Zeitaufwand für die Konzentration der Mikroorganismen auf ein nachweisbares Niveau ist abhängig von der Vermehrungsgeschwindigkeit des jeweiligen Mikroorganismus bzw. der Mikroorganismen sowie den Sensibilitätsgrenzen des Immunoassays.
Sobald ein nachweisbares Niveau erreicht ist, wird der Festträger einfach von der Nährbouillon getrennt, gewaschen und direkt untersucht.
Dieses Verfahren macht durch den schnellen, sensiblen Nachweis geringer Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen aus Mischkulturen hochtechnische und teure Anreicherungsmedien überflüssig.
In einer ersten Anwendung bietet die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis geringer Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen bei gleichzeitigem Vorhandensein konkurrierender Mikroflora in einer Probe. Dieses Verfahren ist wie folgt: Die Probe wird auf einen festphasigen Träger aufgestrichen, der für den nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifische Antikörper adsorbiert hat. Diese Antikörper sind in der Lage, den Mikroorganismus bzw. die Mikroorganismen selektiv zu erfassen und zu immobilisieren, ohne die Replikationsfähigkeit des Mikroorganismus bzw. der Mikroorganismen zu beeinträchtigen. Der Träger wird gewaschen, um nicht gebundene Materialien zu entfernen. Sterile Nährbouillon wird auf den Träger aufgebracht und der Träger in der Nährbouillon inkubiert. Die Inkubation findet unter Temperatur- und Zeitbedingungen statt, die der Vermehrungsrate des Mikroorganismus bzw. der Mikroorganismen entsprechen und dem an die Trägersubstanz gebundenen Mikroorganismus bzw. den Mikroorganismen das Erreichen einer nachweisbaren Konzentration gestatten. Der Träger wird gewaschen und ein Immunoassay unter Verwendung eines für den nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. die Mikroorganismen spezifischen Immunoreagens am Träger durchgeführt.
Der Antikörper ist bevorzugt gegen ein Oberflächenantigen des Mikroorganismus gerichtet. Beim Oberflächenantigen handelt es sich bevorzugt um ein Geißelprotein oder Lipopolysaccharid.
Die Antikörper sind vorzugsweise auf einem festphasigen Träger, einem Kügelchen, einer Röhre oder einem Probenkanal, immobilisiert.
Der Träger besteht bevorzugt aus Styropor, Polyvinylchlorid, Nylon, Titanhydroxid, Agar-Kügelchen oder Nitrozellulose.
Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Mikroorganismen gehören Salmonellaarten und Listeriaarten.
Die Probe wird dem antikörperbeschichteten Träger im allgemeinen eine Stunde lang oder weniger ausgesetzt. Die Waschvorgänge werden bevorzugt unter Verwendung steriler Salinepuffer, am besten Tris-salinischer Puffer, durchgeführt. In diesem Verfahren kann fast jede beliebige Nährbouillon verwendet werden; bevorzugt werden jedoch Tryptonsojabouillon und M-Bouillon. Die Inkubation im Nährmedium kann über Nacht, gewöhnlich bei 37ºC stattfinden. Zum Nachweis von Salmonella typhimurium haben sich jedoch Inkubationszeiten von etwa sechs Stunden als wirksam erwiesen. Sofern in der Originalprobe größere Mengen des betreffenden Mikroorganismus vorhanden sind, können Inkubationszeiten zwischen einer und sechs Stunden liegen. Der Immunoassay nimmt bevorzugt die Form eines ELISA-Tests an.
Das Verfahren umfaßt in seiner bevorzugten Form folgende Schritte: Eine Salmonella- Probe wird für 5 bis 30 Minuten einem Styroporträger, der Anti-Salmonella- Geißelantikörper adsorbiert hat, ausgesetzt, wobei die Antikörper in der Lage sind, Salmonella selektiv zu erfassen und immobilisieren, ohne die Replikationsfähigkeit der Salmonella zu beeinträchtigen. Der Träger wird daraufhin mit einer Erstlösung gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen, und sterile Nährbouillon wird zum Träger zugegeben. Der Träger wird bei einer Temperatur von 37ºC zwischen einer und sechs Stunden lang inkubiert und dann mit einer Zweitwäsche unterzogen. Ein für Salmonella spezifischer, enzymmarkierter Antikörper wird im folgenden zugegeben; nach fünf- bis dreißigminütiger Inkubation werden überzählige enzymmarkierte Antikörper entfernt und der Träger erneut gewaschen. Ein chromogenes, für das Enzym des enzymmarkierten Antikörpers spezifisches Substrat wird im folgenden zugegeben und schließlich die Umwandlung des chromogenen Substrats in die Farbverbindung gemessen.
Der Träger ist bevorzugt eine Röhre, ein Kügelchen oder ein Mikrotitrationskanal.
Beim enzymmarkierten Antikörper handelt es sich bevorzugt um ein (Anti-Salmonella) Antikörper-Peroxidase-Konjugat. Es ist jedoch anerkannterweise möglich, in einer indirekten Anordnung des Versuchs für gebundene Salmonella einen unmarkierten Anti- Salmonella-Antikörper zusammen mit einem markierten, gegen den Anti-Salmonella- Antikörper gerichteten Antikörper zu verwenden.
Der Waschvorgang ist bevorzugt unter Verwendung einer Tris-Salinelösung durchzuführen.
Beim Substrat handelt es sich bevorzugt um eine ABTS/H&sub2;O&sub2; (2,2'-azinobis (3-Ethylbenzthiazolin-Sulfosäure)/Wasserstoffperoxid)-Lösung.
Die Nährstoffbouillon besteht bevorzugt aus Tryptonsoja. Tryptonsojabouillon beinhaltet folgende Substanzen:
Gramm pro Liter
Caseinpepton, Pankreasdigest (RM 271) 17,0
Sojapepton (RM 322) 3,0
Di-Kaliumphosphat 2,5
Natriumchlorid 5,0
Glukose 2,5
pH 7,3 ± 0,2
Die Erfindung bietet weiter einen Analysesatz zum Nachweis geringer Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen in einer Mischpopulation. Dieser Satz besteht aus einem festphasigen Träger, an den für den nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. die Mikroorganismen spezifische Antikörper adsorbiert sind; einer Waschlösung; einem enzymmarkierten, für den nachzuweisenden Mikroorganismus bzw. die Mikroorganismen spezifischen Antikörper sowie einer chromogenen Substratlösung für das Enzym des enzymmarkierten Antikörpers.
Der Satz kann alternativ zum enzymmarkierten Antikörper einen Anti- Mikroorganismus-Antikörper sowie einen enzymmarkierten, gegen den Anti- Mikroorganismus-Antikörper gerichteten Antikörper beinhalten.

Optimales Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Die Erfindung wird im folgenden anhand einiger Beispiele näher beschrieben, die jedoch in keiner Weise den Rahmen der Erfindung einschränken.

Beispiel 1 Selektive Isolierung von Salmonella unter Verwendung antikörperbeschichteter Probenkanäle

Salmonella typhimurium (interne Art BTA 438) und Citrobacter diversus (BTA 1323) wurden getrennt in M-Bouillonlösung inokuliert und über Nacht bei einer Temperatur von 37ºC inkubiert.
M-Bouillon besteht aus folgenden Substanzen:
Gramm pro Liter
Caseinpepton, Pankreasdigest (RM 271) 12,5
Natriumchlorid 5,0
Natriumcitrat 5,0
Hefeextrakt 5,0
D-Mannose 2,0
Eisensulfat 0,04
Di-Kaliumphosphat 5,0
Magnesiumsulfat 0,8
Manganchlorid 0,14
Tween 80 0,75
pH 7,0 ± 0,2
Jede der Kulturen vermehrte sich auf 10&sup9; Organismen/ml, bevor sie wie folgt verdünnt wurde:
10&sup8; Zellen/ml C. diversus mit 10&sup4; Zellen/ml S. typhimurium
10&sup8; Zellen/ml C. diversus mit 10³ Zellen/ml S. typhimurium
10&sup8; Zellen/ml C. diversus mit 10² Zellen/ml S. typhimurium
10&sup8; Zellen/ml C. diversus mit 10¹ Zellen/ml S. typhimurium
10&sup8; Zellen/ml C. diversus mit 10&sup0; Zellen/ml S. typhimurium
10&sup8; Zellen/ml C. diversus (Kontrolle)
Mit hochreinen Antikörpern gegen Salmonellageißeln beschichtete Styroporkanäle wurden daraufhin den M-Bouillonlösungen mit den Mischkulturen zugegeben. Zur Kontrolle wurden mit Immunoglobulin von nichtimmunen Schafen beschichtete Probenkanäle in einen identischen Satz von Mischkulturen eingebracht. Die Lösungen wurden mit den Probenkanälen eine Stunde lang bei einer Temperatur von 37ºC bewegt.
Die Kanäle wurden sorgfältig entfernt, dreimal in Tris-Salinelösung gewaschen und in frische M-Bouillon eingebracht. Diese M-Bouillonlösungen wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert, damit sich die immobilisierten Organismen vermehren konnten. Die Kanäle wurden aus den M-Lösungen entfernt und mittels ELISA-Test untersucht.

EIA-Verfahren

Die Probenkanäle wurden dreimal mit Tris-Salinelösung-Tween (TST) gewaschen, bevor Anti-Salmonella IgG-meerrettichperoxidasemarkiertes Konjugat eingebracht wurde. Nach einer dreißigminütigen Inkubation bei 37ºC wurden die Kanäle dreimal mit TST gewaschen, bevor Substrat (2,2-azinobis(3-Ethylbenzthiazolin-Sulfosäure)) in Citrat- Phosphat-Puffer (0,1M, pH4) mit Wasserstoffperoxid (0,005%) eingebracht und die Färbungsreaktion beobachtet wurde. Organismen/ml C. diversus S. typhimurium Optische Dichte¹ Mit Salmonella Ab beschichtete Kanäle Kontrollkanäle² ¹ Optische Dichten wurden mittels eines ELISA-Meßgeräts für duale Wellenlängen bei 414nm und 490nm abgelesen. ² Mit Immunglobulin von nichtimmunen Schafen beschichtete Probenkanäle.

Beispiel 2

Ein Vergleich des Verfahrens mit dem Standardprotokoll zur Kulturanreicherung [AOAC Official Methods of Analysis 963-971 (1984)] ergab gesteigerte Testgeschwindigkeit, verbesserte Selektivität und Sensibilität wie im folgenden näher beschrieben.
Das Protokoll entsprach dem in Beispiel 1 oben beschriebenen, außer daß 1ml der die Mischkulturen enthaltenden M-Lösung in 10ml Tetrathionatbouillon eingebracht und sechs Stunden lang bei 37ºC inkubiert wurde.
Im Anschluß wurden die Lösungen mittels ELISA getestet. Mit hochreinen Antikörpern gegen Salmonellageißeln beschichtete Probenkanäle wurden in die verbleibenden 9ml Bouillon eingebracht. Das Verfahren folgte dem in Beispiel 1 dargestellten, außer daß die Inkubationszeit für die M-Bouillon nur sechs Stunden betrug, bevor ein ELISA-Test durchgeführt wurde. Organismen/ml C. diversus S. typhimurium Optische Dichte¹ Mit Salmonella Ab beschichtete Kanäle Tetrathionat-Bouillon Kontrolle ¹ Optische Dichten wurden mittels eines ELISA-Meßgeräts für duale Wellenlängen bei 414nm und 490nm abgelesen.
Nach sechs Stunden ergab ELISA 10³ Salmonella bei Vorhandensein von 10&sup8; Citrobacter von den beschichteten Kanälen, während nach sechsstündiger selektiver Anreicherung in Tetrathionat ELISA keine Salmonella nachwies.

Beispiel 3

Testkit zum schnellen Salmonella-Nachweis

Dieser Prüfsatz gestattet dem Benutzer den schnellen Nachweis von Salmonella in Lebensmittel-, Umwelt- oder klinischen Proben. Zur Erfassung von Salmonellaorganismen in einer Probe werden für Salmonellageißeln hochspezifische, auf die Oberfläche von Styroporröhren aufgebrachte Antikörper verwendet. Die zu untersuchende Probe wird in der antikörperbeschichteten Röhre kurzzeitig, z.B. 5-30 Minuten lang, inkubiert. Die Röhre wird im Anschluß sorgfältig gewaschen, um freies Material zu entfernen. Sterile Nährbouillon, z.B. Tryptonsojabouillon, wird eingebracht und die Röhre bei 37ºC eine bis sechs Stunden lang inkubiert. Während dieser Zeit vermehren sich die immobilisierten Salmonella und werden weiterhin durch freie Antikörper auf der Röhrenoberfläche erfaßt. Dadurch läßt sich eine genügend hohe Organismuskonzentration erzielen, um einen Nachweis durch Immunoassay zu ermöglichen.
Das Vorhandensein der erfaßten Organismen läßt sich nachweisen, indem die Kulturbouillon abgegossen und ein enzymmarkierter, für Salmonella spezifischer Antikörper eingebracht wird. Nach einer kurzen, fünf- bis dreißigminütigen Inkubationszeit wird überschüssiges Enzym-Antikörper-Reagens entfernt und die Röhre gewaschen.
Das spezifisch an die immobilisierten Organismen gebundene Enzym-Antikörper- Konjugat läßt sich durch Hinzufügung eines Substrats für das Enzym nachweisen.

Inhalt des Testkits:

- mit Anti-Salmonella-Antikörper beschichtete Styroporröhren,
- Anti-Salmonella-Antikörper-Peroxidase-Konjugat,
- Tris-Saline-Tween-Waschlösung,
- Substratlösung - ABTS/H&sub2;O&sub2;.
Durch die Verwendung von Listeria-Reagentien anstelle der Salmonella-Reagentien kann dieser Prüfsatz für den Nachweis von Listeria umgerüstet werden.
Diese Verfahren sind im Vergleich zu traditionellen Kulturanreicherungsprotokollen beschleunigt; ein positives Resultat ist bereits nach sechs Stunden erhältlich, während Standardkulturverfahren mindestens einen Zeitraum von 48 Stunden in Anspruch nehmen.

Industrielle Verwertung

Die aktuelle Erfindung bietet eine Alternative zur Verwendung spezieller Selektionsmedien zum Nachweis geringer Mengen eines bestimmten Mikroorganismus bzw. bestimmter Mikroorganismen in Mischkultur.

Claims

1. Eine Methode für das Aufspüren von geringen Mengen eines bestimmten Mikroorganismus oder Mikroorganismen in Gegenwart von konkurrierenden Mikroflora in einer Probe, welche Methode besteht aus: die Probe einer festen Unterlage auszusetzen, an welche Antikörper spezifisch für den aufzuspürenden Mikroorganismus oder Mikroorganismen adsorbiert sind; diese Antikörper besitzen die Fähigkeit der selektiven Einnahme und Immobilisierung des Mikroorganismus oder Mikroorganismen ohne deren Fähigkeit zu reproduzieren zu kompromittieren; Waschen der Unterlage um ungebundene Materialen zu entfernen; die Unterlage in eine sterile Nährlösung zu begeben, bei einer bestimmten Temperatur und für eine bestimmte Dauer, abhängig von der Generationszeit des Mikroorganismus oder Mikroorganismen, ausreichend für den an die Unterlage gebundenen Mikroorganismus oder Mikroorganismen messbar zu werden; Waschen der Unterlage; und anschließend Ausführen einer Immunitätsprüfung an der Unterlage unter Verwendung eines Reagens spezifisch für den zu prüfenden Mikroorganismus oder Mikroorganismen.

2. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 1, wobei die Antikörper von einem Oberflächen-antigen des Mikroorganismus oder Mikroorganismen angehoben sind.

3. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 2, wobei das Oberflächen-antigen ein Geißelprotein oder ein Lipopolysaccharid ist.

4. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 3, wobei die feste Unterlage eine Perle, Schlauch oder Schacht ist.

5. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 4, wobei die Unterlage Styropor, Polyvinylchlorid, Nylon, Titanhydroxid, Perlen oder Stickstoffzellulose ist.

6. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 5, wobei der Mikroorganismus Salmonella oder Listeria ist.

7. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Probe der Unterlage für eine Stunde oder kürzer ausgesetzt ist

8. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 7, wobei die Unterlage mit einer sterilen Salzpufferlösung gewaschen wird.

9. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 8, wobei die sterile Salzpufferlösung Tris-Saline Puffer ist.

10. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 9, wobei die Nährlösung Trypton-Soyalösung oder M-lösung ist.

11. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 10, wobei das Ausreifen in der Nährlösung über Nacht bei 37 Grad Celsius stattfindet.

12. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 11, wobei das Ausreifen in der Nährlösung für 6 Stunden bei 37 Grad Celsius stattfindet.

13. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 12, wobei der Immunitätsprüfer ein ELISA ist.

14. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 13, wobei das Immunitätsreagens ein enzym-bezeichneter anti-Mikroorganismus Antikörper ist.

15. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 13, wobei das Immunitätsreagens einen anti-Mikroorganismus Antikörper und einen enzym-bezeichneten Antikörper, der gegen den anti- Mikroorganismus Antikörper angehoben ist, enthält.

16. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 1 bis 14, welche beinhaltet: das Aussetzen für zwischen 5 und etwa 30 Minuten einer Salmonella-probe auf eine Styroporunterlage, auf welche anti-Salmonella flagella Antikörper adsorbiert sind; diese Antikörper besitzen die Fähigkeit der selektiven Einnahme und Immobilisierung der Salmonella ohne deren Fähigkeit zu reproduzieren zu kompromittieren; Waschen der Unterlage mit einer ersten Waschlösung; Zufügung einer sterilen Nährlösung zu der Unterlage; Ausreifen der Unterlage bei 37 Grad Celsius für zwischen 1 und etwa 6 Stunden; Waschen der Unterlage mit einer zweiten Nährlösung; Zufügen eines enzym-bezeichneten Antikörpers spezifisch für Salmonella; Ausreifen für circa zwischen 5 und 30 Minuten; Entfernung jeglichen Überschusses an enzym-bezeichneten Antikörpern; und Messung der Umwandlung der chromogenischen Substrate zu einer farbigen Mischung.

17. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 16, wobei die Unterlage ein Schlauch, Perle oder Mikrotritierschacht ist.

18. Die Methode wie Beschrieben in Anspruch 16 oder 17, wobei der enzym-bezeichnete Antikörper ein (anti-Salmonella) Antikörper-peroxidase Konjugat ist.

19. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 16 bis 18, wobei das erste Waschen unter Verwendung einer Tris - Saline - Lösung ausgeführt wird, und das zweite Waschen unter Verwendung einer Tris - Saline - Tween Lösung ausgeführt wird.

20. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 16 bis 19, wobei das Substrat eine ABTS H2 O2 Lösung ist.

21. Die Methode wie Beschrieben in Ansprüchen 16 bis 20, wobei die Nährlösung eine Trypton-soyalösung ist.

22. Eine Testausrüstung für das Aufspüren von geringen Mengen eines Mikroorganismus oder Mikroorganismen in einer gemischeten Kultur, welche besteht aus: einer festen Unterlage, an welche Antikörper spezifisch für den aufzuspürenden Mikroorganismus oder Mikroorganismen adsorbiert sind; diese Antikörper besitzen die Fähigkeit der selektiven Einnahme und Immobilisierung des Mikroorganismus oder Mikroorganismen ohne deren Fähigkeit zu reproduzieren zu kompromittieren; ein enzym-bezeichneter Antikörper spezifisch für den aufzuspürenden Mikroorganismus oder Mikroorganismen; und eine Lösung eines chromogenischen Substrats für das Enzym des enzym-bezeichneten Antikörpers.

23. Die Testausrüstung wie Beschrieben in Anspruch 22, wobei die Unterlage anti Sallmonella Antikörper-beschichtete Schläuche einschliesst.

24. Die Testausrüstung wie Beschrieben in Anspruch 22 oder 23, wobei der enzym-bezeichnete Antikörper anti - Salmonella - Antikörper-Peroxidase Konjugat enthält.

25. Die Testausrüstung wie Beschrieben in Ansprüchen 22 bis 24, wobei die Substratlösung ABTS H2 O2 enthält.

26. Eine Testausrüstung für das Aufspüren von geringen Mengen eines Mikroorganismus oder Mikroorganismen in einer gemischeten Kultur, welche besteht aus: einer festen Unterlage, an welche Antikörper spezifisch für den aufzuspürenden Mikroorganismus oder Mikroorganismen adsorbiert sind; diese Antikörper besitzen die Fähigkeit der selektiven Einnahme und Immobilisierung des Mikroorganismus oder Mikroorganismen ohne deren Fähigkeit zu reproduzieren zu kompromittieren; ein enzym-bezeichneter Antikörper spezifisch für den Mikroorganismus oder Mikroorganismen; und eine Lösung eines chromogenischen Substrats für das Enzym des enzym- bezeichneten Antikörpers.