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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung, Aufreinigung und
Anreicherung von vermehrungsfähigen Salmonellen aus einer
flüssigen Probe.
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Salmonellen
sind gramnegative, größtenteils bewegliche Stäbchenbakterien.
Von den etwa 2000 bisher bekannten Salmonellenarten sind 120 Arten
in der Lage, beim Menschen eine Erkrankung hervorzurufen. Zu diesen
als Salmonellosen bezeichneten Infektionskrankheiten zählen
Typhus, Paratyphus und auf den Darm-Trakt beschränkte Entzündungen,
nämlich Enteritiden. Insbesondere die Spezies Salmonella
enterica verursachen beim Menschen häufig eine akute infektiöse
Gastroenteritis. Die Infektion mit Salmonellen erfolgt in der Regel
durch den Verzehr von Salmonellenkontaminierten Lebensmitteln. Um
beim immunkompetenten Menschen eine Infektion auszulösen,
bedarf es in der Regel einer Dosis von 10.000 bis 1 Mio. Keimen.
Bei Patienten mit Immunsuppression oder Immundefekt reicht jedoch
bereits eine geringere Infektionsdosis aus.
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Salmonellosen
gehören zumindest in Deutschland zu den meldepflichtige
Krankheiten, so dass schon aus diesem Grund ein großes
allgemeines Interesse daran besteht, sie zuverlässig und
schnell in einer zu testenden Probe nachweisen zu können.
Mikrobiologische Lebensmittelkontrollen werden deshalb regelmäßig sowohl
von der Industrie als auch von den zuständigen Behörden
durchgeführt.
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Die
konventionellen Methoden zum Nachweis von Salmonellen in Nahrungsmitteln
basieren auf dem Prinzip der einfachen Anreicherung der Bakterien
durch Kultivierung einer Nahrungsmittelprobe in speziellem Salmonellen
Kulturmedium und anschließender Ausplattierung. Mit dieser
Methode ist es möglich eine einzige Bakterienzelle in 25
Gramm Nahrungsmittelprobe nachzuweisen. Die Methode ist jedoch zeitaufwendig,
denn sie umfasst mehrere Kultivierungsschritte über bis
zu vier Tage, um eine erste Verdachtsdiagnose zu erhalten und bis
zu 7 Tage, um diese zu bestätigen.
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Es
besteht somit nach wie vor ein hoher Bedarf an einem einfachen und
reproduzierbaren Salmonellen-Nachweistest, der innerhalb kurzer
oder zumindest wesentlich kürzerer Zeit als die konventionellen
Tests Ergebnisse liefert, die ähnlich sensitiv sind wie
die der konventionellen Tests. Der vorliegenden Erfindung liegt die
Aufgabe zugrunde, einen solchen Test zu schaffen.
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Eine
Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines
Verfahrens zur Isolierung, Aufreinigung und Anreicherung von vermehrungsfähigen
Salmonellen aus einer flüssigen Probe, das die nachfolgend genannten
Schritte in den genannten Reihenfolge umfasst:
- (a) Überführen
der flüssigen Probe in ein Testgefäß,
an dessen Innenwände und/oder Boden Salmonellen-spezifische
Anti-Salmonellen-Antikörper gekoppelt sind,
- (b) Inkubation für 6 Stunden oder kürzer,
- (c) vollständiges oder nahezu vollständiges
Entleeren der Flüssigkeit aus dem Testgefäß,
- (e) Befüllen des Testgefäßes mit
Bakterien-Kulturmedium,
- (f) Inkubation des Testgefäßes für
6 Stunden oder weniger, und das dadurch charakterisiert ist, dass
die Schritte (b) und (f) bei einer Temperatur von 25°–45°C,
vorzugsweise 35°–37°C durchgeführt
werden, und dass nach Ablauf der Inkubationszeit von Schritt (f)
der Überstand in dem Testgefäß, nämlich
das Bakterien-Kulturmedium mit darin enthaltenen vermehrungsfähigen
Salmonellen als Verfahrensprodukt gewonnen wird und für
weitere Verwendungen, insbesondere weitergehende Untersuchungen
der Salmonellen, zur Verfügung steht.
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Mit
diesem Verfahren gehen insbesondere die folgenden Vorteile einher:
Im Unterschied zu den üblicherweise durchgeführten
Enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), die nicht sensitiv
genug sind, um Salmonellen innerhalb von 24 Stunden nachweisen zu
können, leistet das erfindungsgemäße
Verfahren eben gerade einen solchen schnellen und präzisen
Nachweis.
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Im
Unterschied zu kostspieligen Alternativtests, die allesamt nicht
für ein Hochdurchsatzverfahren (high throuput screening,
HTS) geeignet sind und teilweise besonders gestaltete Reagenzmoleküle
und/oder Instrumente benötigen, ist dieses neue Verfahren
mit den gängigen Reagenzien und Geräten durchzuführen, und
die dabei gewonnene Mischung (Suspension) von Salmonellen in Nährlösung
ist für ein Hochdurchsatzverfahren (high throuput screening)
ausgezeichnet geeignet. Die Zeitspanne vom Zeitpunkt der Bereitstellung der
flüssigen Nahrungsmittelprobe oder einer sonstigen flüssigen
und auf das Vorhandensein von Salmonellen zu testenden Probe bis
zum Erhalt nachweisbarere Mengen von Salmonellen (sofern grundsätzlich
in der Probe vorhanden) beträgt nur einige Stunden (und
jedenfalls weniger als einen Tag). Die Salmonellen werden hoch selektiv
nicht nur isoliert sondern auch in signifikantem Umfang angereicht
und sie werden in lebendem und vermehrungsfähigem Zustand
erhalten. In diesem Zustand stehen sie für praktisch jedes
beliebige Visualisierungsverfahren (Farbrektion, Durchflusscytometrie
u. a.) zur Verfügung. Außerdem können
sie direkt und unmittelbar in einer PCR (= Polymerasekettenreaktion,
polymerase chain reaction) eingesetzt werden.
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Die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen
Salmonellen können im Idealfall zeitlich parallel mittels
PCR und mittels Konjugat-Substrat-Inkubation und anschließender
visuellen Untersuchung oder optischen Dichtemessung identifiziert
werden. Dadurch ist es möglicht in verhältnismäßig
sehr kurzer Zeit sowohl die Stärke der Salmonellenkontamination
in der Urspungsprobe als auch die vorliegenden Salmonellenserotypen
mit hoher Sicherheit und Genauigkeit festzustellen. Eine frühzeitige
und typengenaue Analyse ermöglicht wiederum den frühzeitigen
Einsatz von spezifischen Gegenmaßnahmen, wobei Frühzeitigkeit
und Spezienspezifität in der Regel zumindest mit Kosteneinsparungen
einhergeht.
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Der
neue Test kann für eine große Anzahl Proben gleichzeitig
durchgeführt werden, er kann in jeder Art von Mikrotiterplatte
durchgeführt werden und ist in weitem Umfang automatisierbar.
Je nach Anzahl der zu testenden Proben kann der Test mit geringem
oder größerem Inkubatorraum und mit geringeren
oder größeren Mediummengen durchgeführt
werden. Der Test ist mit den weltweit bekannten Standardtechnologien kompatibel,
weil er mit Standardgeräten wie insbesondere Multipipetten,
Waschauotmaten, Lesegeräten (Reader), Pipettierautomaten
(liquid dispensing units) uns sonstigen halb- oder vollautomatischen
Instrumenten durchführbar ist. Der Test ermöglicht
die einfache und zuverlässige Identifizierung jeder einzelnen
Probe und ist somit unanfällig für Verwechselungsfehler.
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Mit
dem neuen Testverfahren ist es möglich, 1 bis 5 Bakterien
in 25 g Nahrungsmittelprobe nachzuweisen.
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Die
Dauer der Inkubation in Schritt (b), also die Inkubationsphase I – beträgt
vorzugsweise 2–4 Stunden, besonders bevorzugt 30–60
Minuten, und idealerweise 30 Minuten oder kürzer.
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Den
Schritten (c) und (e) kann eine Waschphase mit einer Pufferlösung
zwischengeschaltet sein. Diese Waschphase in diesem zwischengeschalteten
Schritt (d) wird mit 35°–37°C warmer
Pufferlösung in 1 bis 7 Waschschritten durchgeführt.
Als Pufferlösung eignet sich insbesondere eine Salzlösung,
vorzugsweise eine Phosphat-Buffer-Solution (PBS) mit einem pH-Wert
von 7,4.
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Als
Bakterien-Kulturmedium in Schritt (e) wird erfindungsgemäß ein
nicht-selektives Bakterien-Nährmedium, vorzugsweise Peptonwasser
vorgeschlagen.
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Für
spezielle Fällen, in denen eine Matrix untersucht werden
soll, die eine starke mikrobielle "Hintergrundflora" ("Backgroundflora")
erwarten lässt, wird für Schritt (e) ein Bakterien-Kulturmedium
vorgeschlagen, das gram-negative Bakterien in ihrem Wachstum fördert
und gram-positve Bakterien in ihrem Wachstum hemmt. Als solche kommen
insbesondere die Medien M-Broth und GN-Broth in Betracht.
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Als
Antikörper, der für die Gefäßbeschichtung
eingesetzte wird, ist ein polyklonaler affinitätsgereinigter Anti-Salmonellen-Antikörper
sehr gut geeignet. Ein monolonaler Antikörper kommt ebenso
gut in Betracht.
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Als
Testgefäß wird insbesondere eine Mikrotiterplatten-Kavität
(Mikrotiterplatten-Vertiefung) vorgeschlagen.
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Im
Hinblick auf den vorteilhaften Einsatz des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Anreicherung und Aufreinigung von Salmonellen für
eine PCR (Polymerase-Chain-Reaktion = Polymeraseketten-Reaktion)
umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Aufarbeitungskit zur
Salmonellen-Isolation und indirekten Generierung von amplifikationsfähiger
Salmonellen-DNA aus Lebensmittel- und Stuhlproben für den
Nachweis von Salmonellen-DNA mittels PCR. Dieser Kit ist dadurch
gekennzeichnet, dass er ein Testgefäß umfasst,
an dessen Innenwände und/oder Boden Salmonellenspezifische
Anti-Salmonellen-Antikörper gekoppelt sind, und das geeignet
und vorgesehen ist für (a) die Aufnahme von einer flüssigen
Nahrungsmittel- oder Stuhlrobe, (b) die nachfolgende Inkubation
der aufgenommenen Nahrungsmittel- oder Stuhlrobe für 6
Stunden oder kürzer bei einer Temperatur von 25°–45°C,
vorzugsweise 35°–37°C, (c) das nachfolgende
Entleeren der Flüssigkeit aus dem Testgefäß,
(e) das nachfolgende Befüllen des Testgefäßes
mit Bakterien-Kulturmedium, (f) die nachfolgende Inkubation des
Testgefäßes für 6 Stunden oder weniger,
bei einer Temperatur von 25°–45°C, vorzugsweise
35°–37°C, und (g) die nachfolgende Entnahme
eines Aliquots/Teils der Flüssigkeit für den direkten
Einsatz in der PCR
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Die
Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Beispiel 1: Vergleich der erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Isolierung, Aufreinigung und Anreicherung von Salmonellen
aus einer flüssigen Probe mit konventionellen Verfahren
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Herstellung
der flüssigen Probe aus einem zu untersuchenden Nahrungsmittel
Ein Aliquot des Nahrungsmittels wird in nicht-selektivem Bakterienmedium,
beispielsweise in gepufferter wässriger Peptonlösung (buffered
peptone water = BPW), typischerweise im Verhältnis 1 Teil
Probe und 9 Teile BPW (z. B. 25 g Probenmaterial in 225 ml BPW),
homogenisiert.
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Das
Homogenat wird bei 35–37°C für 16–20
Stunden inkubiert.
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Aliquots
dieser flüssigen Probe werden (A) mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren und (B) mit konventionellen Verfahren weiterbehandelt
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(A) Erfindungsgemäßes
Verfahren
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Verwendete Materialien:
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- – handelsübliche Mikrotiterplatte,
deren Kavitäten an Boden und/oder Wanden mit einem Salmonellen-spezifischen
Anti-Salmonellen-Antikörper beschichtet sind.
- – Waschpuffer (z. B. PBS pH 7,4) erwärmt auf
35–37°C.
- – Salmonella Nährmedium, vorzugsweise M-Borth,
rehydriert mit sterilem destilliertem Wasser durch Erhitzen auf
100°C für 10 Minuten und abgekühlt auf
35–37°C.
- – Positiv-Kontrolle (z. B. hitzeinaktivierte Salmonellenkultur)
- – Negativ-Kontrolle (z. B. Medium)
- – Konjugat (z. B. Peroxidase-markierter Anti-Salmonellen-Antikörper)
- – TMB-Substrat
- – Stopp-Lösung
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Testlauf:
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- – Wenigstens eine der mit dem Anti-Salmonellen-Antikörper
beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte wird mit 100–300 μl
des vorbereiteten Probenmaterials, wenigstens eine weitere Kavität
mit 100 μl einer positiven Kontrollprobe und wenigstens
eine weitere Kavität mit 100 μl einer negativen
Kontrollprobe befüllt.
- – Die Platte wird bei 35–37°C für
30 Minuten inkubiert = Inkubationsphase I.
- – Nach Ablauf dieser Inkubationsphase werden die Kavitäten
entleert und mehrmals, beispielsweise 7 mal, mit 35–37°C
warmer Waschpuffer gewaschen (automatisch mittels Plate Washer oder
manuell)
- – Anschließend wird zu jeder bestückten
Kavität 100–250 μl des auf 35–37° Cerwärmten
Salmonellen-Nährmedium gegeben und die Platte bei 35–37°C
für 4 Stunden inkubiert = Inkubationsphase II.
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Nach
Ablauf dieser zweiten Inkubationszeit befinden sich im Nährmedium
signifikante Mengen von vitalen Salmonellen, die mit allen üblichen
Nachweismethoden detektiert und quantifiziert (zahlenmäßig
bzw. mengenmäßig) werden können. Dieses
bakterienhaltige Nährmedium und ebenso die – nach
dessen Entnahme zurückbleibenden – leeren Kavitäten
(deren Wänden und/oder Boden mittels Antikörper
gebundene Salmonellen aufweisen) stehe für Detektionsmethoden
zum qualitativen Nachweis der Salmonellen zur Verfügung
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Das
beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren ist für
alle Salmonellen-Serotypen anwendbar. Auch nicht frei bewegliche
Salmonellen-Stämme wie S. pullorum and S. gallinarium konnten
mit diesem Verfahren spezifisch und in signifikanten Mengen angereichert
werden.
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Kontrollversuche
mit anderen Enterobakterien (Nicht-Salmonellen) ergaben ein negatives
Ergebnis, was ebenfalls die Spezifität des erfindungsgemäßen
Verfahrens bestätigt.
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Verglichen
mit der im Stand der Technik bekannten ISO 6579:2002 Methode
ist das erfindungsgemäße Verfahren mindestens
ebenso effizient in der Isolierung, Aufreinigung und Anreicherung
von Salmonellen aus einer flüssigen Probe, die durch Inokulation
eines auf natürliche Weise kontaminierten Nahrungsmittels gewonnen
wurde.
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Verwendete Materialien:
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- – handelsübliche Mikrotiterplatte,
deren Kavitäten an Boden und/oder Wänden mit einem
Salmonellen-spezifischen Anti-Salmonellen-Antikörper beschichtet
sind.
- – Waschpuffer, üblicherweise Tris-salinisierter
Puffer
- – Salmonella Nährmedium
- – Positiv-Kontrolle
- – Negativ-Kontrolle
- – Konjugat
- – TMB-Substrat
- – Stopp-Lösung
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Testlauf:
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- – Wenigstens eine der mit dem Anti-Salmonellen-Antikörper
beschichteten Kavitäten der Mikrotiterplatte wird mit 100 μl
des vorbereiteten Probenmaterials, wenigstens eine weitere Kavität
mit 100 μl einer positiven Kontrollprobe und wenigstens
eine weitere Kavität mit 100 μl einer negativen
Kontrollprobe befüllt.
- – Die Platte wird für 30 Minuten inkubiert
= Inkubationsphase I.
- – Nach Ablauf dieser Inkubationsphase I werden die
Kavitäten entleert und mit Waschpuffer gewaschen (automatisch
mittel Plate Washer oder manuell)
- – Anschließend wird zu jeder bestückten
Kavität Salmonellen-Nährmedium gegeben und die
Platte bei 37°C für 1–6 Stunden inkubiert
= Inkubationsphase 11.
- – Nach Ablauf dieser Inkubationsphase 11 werden die
Kavitäten entleert und mit Waschpuffer gewaschen (automatisch
mittel Plate Washer oder manuell).
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Die
entleerten Kavitäten, deren Wänden und/oder Boden
mittels Antikörper gebundene Salmonellen aufweisen, und
nur diese – stehen für Detektionsmethoden zum
Nachweis der Salmonellen zur Verfügung.
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Beispiel 2: Temperatur-Variationen des
erfindungsgemäß Verfahrens
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Herstellung der flüssigen Probe
aus einem zu untersuchenden Nahrungsmittel
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Ein
Aliquot des Nahrungsmittels wurde in nicht-selektivem Bakterienmedium,
beispielsweise in gepufferter wässriger Peptonlösung
(buffered peptone water = BPW), typischerweise im Verhältnis
1 Teil Probe und 9 Teile BPW (z. B. 25g Probenmaterial in 225 ml
BPW), homogenisiert.
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Das
Homogenat wurde in vier gleichgroße Teilmengen, nämlich
Probe (I), Probe (II), Probe (III) und Proben (IV) aufgeteilt.
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Diese
Proben wurden für 16–20 Stunden bei 37°C
inkubiert.
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Anschließend
wurden diese Proben analog der Beschreibung in Beispiel 1 (A) weiterbehandelt,
jedoch mit folgenden Abwandlungen:
- – Die
Inkubationsphase I wurde für die verschiedenen Proben bei
folgenden Temperaturen durchgeführt:
Probe (I) bei
20°C
Probe (II) bei 37°C
Probe (III)
bei 41°C
Probe (IV) bei 50°C.
- – Die Temperatur des Waschpuffers in der Waschphase
zwischen Inkubationsphase I und Inkubationsphase II betrug für
alle vier Proben 37°C.
- – Die Inkubationsphase II wurde für die verschiedenen
Proben mit M-Both-Medium bei folgenden Temperaturen durchgeführt:
Probe
(I) bei 20°C
Probe (II) bei 37°C
Probe
(III) bei 41°C
Probe (IV) bei 50°C.
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Am
Ende der Inkubationsphase II wurde die Salmonellen-Dichte in der
Nährlösung photometrisch gemessen. Die Ergebnisse
in Form von OD-Werten sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:
| Test-Temperatur | 20°C | 37°C | 41°C | 50°C |
| Salmonella-Probe | 0,408 | 1,799 | 1,209 | 0,332 |
| Negativ-Kontrolle | 0,044 | 0,047 | 0,052 | 0,056 |
| Positiv-Kontrolle | 1,64 | 2,019 | 1,675 | 1,228 |
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Aus
dieser Ergebnisübersicht ist ersichtlich, dass die Anreicherung
der Salmonellen bei 37°C und 41°C um den Faktor
30–40 höher liegt als bei 20°C oder 50°C.
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Beispiel 3: PCR-Nachweis von Salmonellen,
die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert
und angereichert wurden.
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Die
gemäß Beispiel 1 (A) oder Beispiel 2 isoliert
und angereicherten Salmonellen in Salmonellen-Nährlösung
stehen direkt für einen Einsatz in der PCR (= Polymerasekettenreaktion,
polymerase chain reaction) zur Verfügung.
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Die
Salmonellen liegen isoliert und praktisch in Reinkultur vor, sie
sind zahlenmäßig angereichert und aufgrund der
Waschschritte mit dem Waschpuffer zwischen den beiden Inkubationsphasen
I und II ist die Lösung bereits frei von PCR-Inhibtoren
und sonstigen die PCR störende Substanzen.
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(Die
als Ergebnis der konventionellen Methode (B) erhaltene Mikrotiterplatte
mit an Wänden und Boden haftenden Salmonellen ist für
einen solchen Einsatz in der PCR nicht geeignet.)
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DNA-Präparation:
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Durch
Schütteln der Mischung (Suspension) von Salmonellen in
Salmonellen-Nährlösung werden die Salmonellen
weitgehend gleichmäßig in der Nährlösung
verteilt.
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5 μl
dieser Mischung werden als Probe für die PCR entnommen.
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Diese
5 μl-Probe wird direkt in die PCR gemäß üblicher
Verfahrensprotokolle eingesetzt.
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PCR-Nachweis:
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Jedes
Bakterium enthält artspezifische Erbinformation in Form
von Desoxiribonukleinsäure (DNA). Befinden sich Bakterien
in oder auf Lebensmitteln, kann die bakterielle DNA artspezifisch
nachgewiesen werden.
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Beim
Nachweis mittels PCR werden spezifische Bereiche aus dem Erregergenom
amplifiziert. Die Detektion findet bei der Real-time PCR mit Hilfe
von Fluoreszenzfarbstoffen statt. Diese sind in der Regel an Oligonukleotid-Sonden
gekoppelt, die spezifisch an das PCR-Amplifikat binden. Die Detektion
der Fluoreszenzintensitäten im Verlauf der Real-time PCR
ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung der Produkte,
ohne die Probenröhrchen nach der PCR wieder öffnen
zu müssen.
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Im
Verlauf der PCR gemäß üblichen Verfahrensprotokollen
wird die Probe 10–30 Minuten bei 95°C erhitzt.
Dabei platzen die Bakterienzellen und setzen ihre DNA frei, die
dann in den weiteren PCR-Schritten als Matrize genutzt wird.
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Verwendet
werden kann für die Real-time PCR beispielsweise folgender
PCR-Ansatz:
Erregerspezifische TaqMan Sonde markiert mit 5'-FAM
und 3'-TAMRA (30 nM), erregerspezifische Primer (je 0,5 μM),
MgCl2 (2,5 mM), dNTP's (0,16 mM) und eine
Hot-Start Taq Polymerase (0,5 U), 5 μl Probe (wie oben beschrieben)
in einem 25 μl Ansatz.
Programm: 95°C 20
Minuten
95°C 30 Sekunden
60°C 60 Sekunden
je 40×
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Von
dem herkömmlichen Methodenweg, der bisher für
die Durchführung einer PCR-Analyse an Salmonellen aus kontaminierten
Nahrungsmitteln oder Stuhl beschritten werden musste, unterscheidet
sich die PCR in Kombination mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren vor allem in den folgenden Punkten.
- – Beim
herkömmlichen Methodenweg wird die DNA aus den Salmonellen
dadurch gewonnen, dass die verflüssigte Nahrungsmittelprobe
(vgl. Beispiel 1 "Herstellung der flüssigen Probe aus einem
zu untersuchenden Nahrungsmittel") oder Stuhlprobe mittels handelsüblicher
DNA-Präparationskits aufgearbeitet werden.
Die Aufreinigung
der DNA aus der Probe erfolgt durch Lyse der Bakterien und anschließende
Bindung an Silikamembranen, die sich in speziellen Säulchen
befinden. Nach mehrmaligem Waschen wird die DNA dann von der Silikamembran
eluiert. Durch dieses Verfahren wird neben der Salmonellen-DNA auch
die DNA von weiteren Bakterien, die sich evtl. in der Probe befinden
sowie die DNA der Nahrungsbestandteile (z. B. Pflanzen) mit isoliert.
Bei Stuhlproben befindet sich zusätzlich die DNA des Wirtsorganismus
mit im aufgereinigten DNA-Pool.
Beim erfindungsgemäßen
Verfahren befinden sich in der zur PCR verwendeten Probe ausschließlich
die durch Waschschritte aufgereinigten Salmonellen und deren DNA.
Es ist also weder mit Kontaminationen durch Fremd-DNA zu rechnen
noch ist ein aufwendiger Isolationsschritt nötig. Zusätzlich
ist durch die Anreicherung der Salmonellen in der Mikrotiterplatte
eine signifikante Sensitivitätssteigerung möglich.
- – Einen der wichtigsten Aspekte beim Nachweis von erregerspezifischer
DNA aus Lebensmittel- und Stuhlproben mittels PCR stellt die Eliminierung
von möglichen PCR-Inhibitoren dar. Dies erfolgt bei den
handelsüblichen Kits durch Inkubation mit verschiedenen
Substanzen, beispielsweise Aktivkohle. Nicht bei jeder Probe können
jedoch Inhibitoren auf diese Weise entfernt werden. Bei der anschließenden
PCR-Reaktion wird daher häufig ein nicht-erregerspezifisches
DNA-Template als interne Amplifikationskontrolle mitgeführt.
Wird diese interne Kontrolle bei der PCR amplifiziert, ist dies
ein Indiz dafür, dass keine PCR-Inhibitoren in der Probe
vorhanden sind.
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Beispiel 4: Vergleich des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Probenaufarbeitung für eine PCR mit einem
konventionellen DNA-Präparationskit für den gleichen
Zweck
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Der
Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Probenaufarbeitung und einem konventionellen Verfahren mittels
DNA-Präparationskit zu dem gleichen Zweck ist in 1 graphisch
dargestellt. Bei dem in diesem Beispiel eingesetzten herkömmlichen
Präparationskit handelt es sich um den NucleoSpinR Tissue Kit der Firma Macherey-Nagel GmbH & CoKG, Düren,
Deutschland.
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Anhand
der Gegenüberstellung ist deutlich zu erkennen, dass bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren erheblich weniger
Handhabungsschritte notwendig sind als bei dem konventionellen Verfahren.
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Da
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die zu testende
Probe in Mikrotiterplatten vorbehandelt (aufbereitete) und bereitgestellt
wird, passt dieses Verfahren in jedes Routinelabor und ist gut automatisierbar, da
die Mikrotiterplatten den Vorschriften der SBS (Society of Biomolecular
Screening) entsprechen. Die herkömmlichen Aufarbeitungskits
zur DNA-Präparation arbeiten dagegen alle mit einzelnen
Reaktionsgefäßen, bei denen es sowohl leichter
zu Probenverwechslungen kommen kann als auch das Handling bei einem
großen Probenaufkommen zu Problemen führt (z.
B. weil pro Zentrifugation standardmäßig nur 24
Proben möglich sind).
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Im
Anschluss an die Probenaufarbeitung ist das erfindungsgemäße
Verfahren für verschiedene Detektionsmethoden einsetzbar.
Mit dem Salmonellen-enthaltenden Überstand kann sowohl
ein ELISA als auch ein PCR-Nachweis durchgeführt werden.
Zusätzlich besteht die Möglichkeit den Überstand
auf Nährböden auszuplattieren. Es sind also mehrere
verschiedene Untersuchungen parallel auf verschiedenen Testplattformen
möglich.
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Bei
Aufarbeitung mit einem DNA-Präparationskit steht dagegen
lediglich die Salmonellen-DNA und keine lebensfähigen Salmonellen
zur Verfügung, sodass weder ein ELISA noch ein kultureller
Nachweis sondern allein eine PCR durchgeführt werden kann.
Für Paralleluntersuchungen mit anderen Testsystemen müssen
separate Aufarbeitungen der Salmonellenprobe durchgeführt
werden. Die damit einhergehenden Nachteile liegen auf der Hand.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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