DE68916362T2

DE68916362T2 - Immunologische Reagenz-Zusammensetzung und deren Verwendung zur Bestimmung von chlamydialen oder gonokokkalen Antigenen.

Info

Publication number: DE68916362T2
Application number: DE68916362T
Authority: DE
Inventors: Allan David Pronovost
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1988-10-07
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2009-09-30
Also published as: JPH02156158A; JPH07109420B2; US5047326A; EP0363091A3; EP0363091A2; DE68916362D1; EP0363091B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunologische Reagenzzusammensetzung, die für die Bestimmung von chlamydialen oder gonokokkalen Organismen in einer biologischen Probe verwendbar ist. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine Zusammensetzung mit einem chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper oder Anti-Antikörper, einem blockierenden Protein und einem amphoterem oberflächenaktiven Mittel.
In den vergangenen Jahren sind Immunoassays angewandt worden, um das Vorhandensein von infektiösen Krankheiten festzustellen. Damit der Assay anwendbar ist, muß er einen speziellen Organismus mit einem hohen Zuverlässigkeitsgrad ermitteln können. In den meisten Fällen erfordert dies die Isolierung und Umsetzung von Antigenen, die für den Organismus eigentümlich sind, mit entsprechenden Antikörpern. Damit der Test kommerziell erfolgreich ist, muß er ferner relativ billig, einfach anzuwenden und schnell durchführbar sein.
Ein derartiger Organismus, der durch ein Immunoassay bestimmt werden kann, ist Chlamydia trachomatis (hier als O. trachomatis bezeichnet), bei dem es sich um ein von zwei mikrobiellen Species des Genus Chlamydiaceae, der Ordnung Chlamydiales handelt. Es gibt 15 oder mehr Stämme dieser Species, die die Ursache einer Anzahl von menschlichen okularen und genitalen Krankheiten sind, einschließlich Trachoma, Einschlußkonjunktivitis, Lymphogranuloma venereum, nicht-gonokokkaler Urethritis sowie Proctitis. Eine Infektion von G. trachomatis greift in der allgemeinen Bevölkerung durch, wobei angenommen wird, daß jedes Jahr Millionen von Fälle allein im Falle von nicht-gonokokkaler Urethritis auftreten.
Gonorrhoe ist eine Krankheit, die gewöhnlich durch einen sexuellen Kontakt übertragen wird, verursacht durch ein Bakterium der Gattung Neisseria, insbesondere N. gonorrhoeae.
Die Krankheit hat die Menschheit seit Tausenden von Jahren geplagt, und obgleich Antibiotica geholfen haben, die Ausbreitung zu kontrollieren, existiert diese Krankheit dennoch in epidemischen Verhältnissen in vielen Teilen der Welt. Die Bedeutung der Erkennung und Behandlung dieses Organismus ist allgemein anerkannt. N. meningitidis und N. lactamica sind ebenfalls Species von besonderem medizinischen und diagnostischen Interesse.
Aufgrund der weit verbreiteten Natur dieser Krankheiten besteht ein bedeutendes Interesse für einen schnell durchzuführenden, einfachen und zuverlässigen Test für die Bestimmung von chlamydialen und gonokokkalen Organismen. Beträchtliche Forschungen sind unternommen worden, um geeignete Wege aufzufinden, um bestimmbares Antigen aus chlamydialen Organismen zu extrahieren. Assays für C. trachomatis und N. gonorrhoeae, die durchgeführt werden unter Verwendung eines festen Trägers, werden in den U.S.-Patentschriften 4 497 899 und 4 497 900 beschrieben. Die beschriebenen Assays werden durchgeführt durch Extraktion von Antigen aus dem Organismus und Auftragen desselben auf einen blanken festen Träger. Das aufgetragene Antigen wird dann bestimmt mit entweder einem oder zwei Antikörpern, von denen einer in geeigneter Weise markiert ist. Das kritische Merkmal dieser Assays scheint die Verwendung eines festen Trägers zur Bindung zu sein, der unbehandelt ist oder mit keinem Material beschichtet ist. Die Bindung von Antigen wird offensichtlich erreicht durch Inkubieren des beschichteten Trägers über eine ausreichende Zeitspanne, um eine Adsorption von Antigen zu bewirken. Der gesamte Assay, der in der U.S.-Patentschrift 4 497 899 beschrieben wird, dauert mindestens drei Stunden.
In der Praxis dieser bekannten Assays werden chlamydiale oder gonokokkale Antikörper (oder Anti-Antikörper) in Zusammensetzungen eingesetzt einschließlich eines nichtionogenen oberflächenaktiven Mittels und einschließlich von normalem menschlichem Serum. Das normale menschliche Serum wird verwendet, um nicht-spezifische Reaktionen der Antikörper bezüglich des festen Trägers zu vermindern oder "zu blockieren". Die Verwendung dieses Materials zur Verminderung derartiger Reaktionen hat jedoch Nachteile, nämlich die Kosten von normalen menschlichem Serum, ihre Veränderlichkeit bezüglich der Qualität und von schädlichen Pathogenen, die sie enthalten können. Eine verbesserte "Blockierungs-" Lösung ist aus einer Anzahl von Gründen höchst wünschenswert. Die oben erwähnten Probleme werden mit einer immunologischen Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung eines chlamydialen oder gonokokkalen Antigens überwunden, die einen Antikörper für ein chlamydiales oder gonokokkales Antigen enthält oder einen Antikörper für den chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper, wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie weiterhin ein nicht-immunologisches blockierendes Protein enthält mit einem pI von 4 bis 7, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung, sowie ein amphoteres oberflächenaktives Mittel in einer Menge von mindestens 0,001 Gew.-%.
Ein Verfahren zur Bestimmung eines chlamydialen oder gonokokkalen Antigens umfaßt:
A. Das Kontaktieren von chlamydialem oder gonokokkalem Antigen, extrahiert aus einer Probe, von der angenommen wird, daß sie chlamydiale bzw. gonokokkale Organismen enthält mit der immunologischen Reagenzzusammensetzung wie oben beschrieben, unter Erzeugung eines immunologischen Komplexes aus dem Antigen und dem Antikörper,
B. Unlöslich machen von entweder einem oder beiden, nämlich des Antigens oder des Antikörpers auf einem festen Träger unter Erzeugung eines gebundenen immunologischen Komplexes vor, gleichzeitig mit oder nach der Komplexbildung,
C. Abtrennung von nicht komplexgebundenen Materialien von dem gebundenen immunologischen Komplex,
D. Bestimmung des Vorhandenseins des gebundenen Komplexes als Anzeichen der Menge an chlamydialem oder gonokokkalem Organismus in der Probe.
Der Assay dieser Erfindung ist rasch, zuverlässig und einfach durchzuführen. Beispielsweise kann er in weniger als 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Er ist höchst zuverlässig für die Bestimmung von extrahiertem chlamydialen Antigen (wie beispielsweise von C. trachomatis), und insbesondere das Lipopolysaccarid-Antigen. Er kann ferner dazu verwendet werden, um rasch und empfindlich ein gonokokkales Antigen (beispielsweise von N. gonorrhoeae) zu bestimmen.
Der Assay ist hochempfindlich, zeigt wenig Hintergrund und nicht-spezifische Reaktionen zwischen Antikörpern und dem festen Träger der in dem Assay verwendet wird, werden stark reduziert. Diese Vorteile werden gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt durch die Verwendung einer immunologischen Reagenzzusammensetzung, die enthält einen chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper (oder Anti-Antikörper), ein nichtimmunologisches blockierendes Protein mit einem pI von 4 bis 7 und durch die Verwendung eines amphoteren oberflächenaktiven Mittels in einer Menge von mindestens 0,001 Gew.-%.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von C. trachomatis (oder einer anderen chlamydialen Species) oder des Vorhandenseins von N. gonorrhoeae (oder einer anderen gonokokkalen Species) in einer biologischen Probe, die erhalten worden ist von einem Patienten unter Anwendung einer beliebigen geeigneten medizinischen oder diagnostischen Technik. Zu derartigen Proben gehören beispielsweise Proben, erhalten aus dem Gebärmutterhals, der Harnröhre, dem Rachen oder dem After eines Patienten, sowie Körperflüssigkeiten wie beispielsweise synoviale Flüssigkeiten oder Flüssigkeiten aus Verletzungen. Im Falle der so erhaltenen biologischen Proben wird angenommen, daß sie chlamydiale oder gonokokkale Organismen enthalten, die das chlamydiale oder gonokokkale Antigen (oder Mischungen hiervon) enthalten, das bestimmt werden soll.
Obgleich der Assay durchgeführt werden kann um antigene Zentren der gesamten chlamydialen oder gonokokkalen Zellen zu ermitteln, ist es gewöhnlich wünschenswert die Antigene aus den Organismen zu extrahieren, um die Assay-Empfindlichkeit zu erhöhen. Standard-Methoden können für die Lyse des Organismus zum Zwecke der Freisetzung des Antigens angewandt werden, einschließlich beispielsweise einer Lösungsmittel-Verdünnung oder die Anwendung von Lyse-Lösungen mit einem hohen pH-Wert, ferner Enzym-Behandlungen und physikalische Bewegungen, wie beispielsweise eine Beschallung oder ein Zentrifugieren. Ein Erhitzen wird als eine Lyse-Technik in der EP-A-0 183 383 beschrieben. Die Verwendung von anionischen Detergenzien oder Salzen, wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat und Deoxycholat wird beschrieben in den U.S.-Patentschriften 4 497 899, 4 497 900 und 4 663 291.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung dazu angewandt werden, um das chlamydiale Lipopolysaccharid- (Glycolipid-Gruppe) Antigen (wie beispielsweise in der EP-A-0 193 431 beschrieben) zu ermitteln. Extraktionsverfahren werden ebenfalls hierin beschrieben. Im Falle einer anderen Ausführungsform kann das bestimmte Antigen das hauptsächliche äußere chlamydiale Membran- Protein des Organismus sein, der 60% des gesamten assoziierten äußeren Membran-Proteins umfaßt. Dieses Antigen sowie Methoden der Extraktion werden beschrieben in der U.S.-Patentschrift 4 427 782. In einigen Fällen wird bei Anwendung der vorliegenden Erfindung eine Mischung dieser chlamydialen Antigene bestimmt. Im Falle anderer Ausführungsformen wird die Erfindung dazu angewandt, um ein oder mehrere gonokokkale Antigene (IA oder IB-Proteine), oder Mischungen von Antigenen von individuellen gonokokkalen Stämmen zu bestimmen.
Eine bevorzugte Extraktionszusammensetzung umfaßt ein Alkoholamin oder Salz hiervon und weist einen hohen pH-Wert auf (von mindestens 8). Weitere Details dieser bevorzugten Zusammensetzung werden weiter unten im Zusammenhang mit den Beispielen angegeben.
Zusätzlich kann es wünschenswert sein eine Protease beim Extraktionsverfahren zu verwenden, um Proteine, ganzes Blut oder Schleim aufzubrechen.
Wenn das Antigen aus dem Organismus extrahiert worden ist, ist es wünschenswert, obgleich nicht erforderlich, wenn die Probe vorgefiltert wird, um Zelltrümmer, teilchenförmige Stoffe und andere unerwünschte Materialien vor der weiteren Bearbeitung abzutrennen. Eine Vorfilterung kann erfolgen in einem geeigneten Behälter mit einem Filter von bestimmtem Typ.
Die Extraktion kann in jedem geeigneten Behälter durchgeführt werden, einschließlich in Behältern, die speziell für die Extraktion eines Antigens bestimmt sind. Geeignete Vorrichtungen sind bekannt, einschließlich aus der U.S.-Patentschrift 4 746 614.
Vorzugsweise wird das extrahierte Antigen bestimmt unter Anwendung eines Immunoassays, bei dem es immunologisch mit einem oder mehreren geeigneten Antikörpern umgesetzt wird. Der anfallende immunologische Komplex wird bestimmt unter Anwendung eines geeigneten radiometrischen, colorimetrischen, fluorometrischen oder eines mit einem Enzym markierten Reagenz. In manchen Fällen ist das Reagenz ein markierter Antikörper für das Antigen und den anderen Fällen ist der markierte Anti- Antikörper gerichtet auf einen nicht-markierten Antikörper, der mit dem Antigen zu reagieren vermag. Zu derartigen Immunoassays gehören im allgemeinen die Bildung eines bestimmbaren immunologischen Komplexes auf einem festen Träger einiger Typen, die entweder beschichtet oder unbeschichtet sind, worauf sich geeignete Bestimmungsverfahren anschließen. Zu anderen Assays gehören eine Agglutination des immunologischen Komplexes, wenn mindestens eine Reaktionskomponente (wie beispielsweise ein Antikörper) des Komplexes an markierte oder unmarkierte Teilchen einiger Typen gebunden wird, die während der Komplexbildung zusammenklumpen.
Zu Beispielen für geeignete Assays gehören Wettbewerbs- Immunoassays oder enzym-gebundene Immunoabsorbent-Assays (oder die, die üblicherweise mit "ELISA" bezeichnet werden). Derartige Assays werden ganz allgemein beschrieben in der U.S.-Patentschrift 4 427 782 und von Schneider und anderen in der Literaturstelle J. Clin. Microbiol., 15 (5), Seiten 830-834 (1982). Die chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper, die verwendet werden, können gerichtet werden auf entweder ein oder mehrere Antigene, die aus den Organismen extrahiert werden. Im Falle einer Ausführungsform werden Antikörper gerichtet auf ein einzelnes Antigen, wie beispielsweise das Lipopolysaccharid von G. trachomatis. Im Falle anderer Ausführungsformen wird eine Mischung von verschiedenen Antikörpern auf verschiedene Antigene gerichtet, wie beispielsweise solche, die aus mehreren gonokokkalen Stämmen extrahiert worden sind.
Vorzugsweise wird das extrahierte Antigen mit einem polymeren festen Träger in Kontakt gebracht, an den es gebunden werden kann. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Glas, zellulosische oder polymere Kügelchen, Filme, Röhren, Gele, Platten und andere Materialien, die allgemein bekannt sind. Vorzugsweise ist das Trägermaterial eine mikroporöse Membran, wie sie in größerem Detail unten beschrieben wird. Die Membran kann "blank" sein, d. h. unbeschichtet oder unbehandelt durch beliebige Substanzen (wie es in der U.S.-Patentschrift 4 497 898 beschrieben wird). Vorzugsweise ist die Membran jedoch behandelt oder beschichtet mit einer Substanz (z. B. einem oberflächenaktiven Mittel) die die Durchführung des Assays steigert.
Im Falle einiger Ausführungsformen weisen die festen Träger eine Vielzahl von positiv geladenen Gruppen an der Oberfläche auf. Diese positiv geladenen Gruppen erzeugen eine positive Oberflächenladung auf dem Träger, d. h. ein positives Zeta-Potential über einen breiten pH-Werts-Bereich. Das Zeta-Potential ist bekannt als das Potential zwischen dem Träger und einer Flüssigkeit, die sich im Kontakt mit dem Träger befindet. Jedes positiv geladene chemische Radikal, das zu dem gewünschten Zeta-Potential auf dem Träger führt, ist für die Durchführung der Praxis dieser Erfindung geeignet.
Beispielsweise kann der Träger aus jedem beliebigen natürlichen oder synthetischen polymeren Material aufgebaut sein, mit geeigneten kationischen Gruppen, die das extrahierte Antigen ionisch binden. Zu geeigneten Polymeren gehören Polyester, Polyamide, Polyethylenimine, Polycarbonate, Cellulosematerialien, Additionspolymere, hergestellt aus ethylenisch ungesättigten Vinylmonomeren und anderen monomeren mit den erforderlichen geladenen Gruppen. Im allgemeinen sind die kationischen Gruppen quaternäre Ammoniumsalze, quaternäre Phosphoniumsalze, quaternäre Sulfoniumsalze, quaternäre Pyridiniumsalze, quaternäre Pyrimidiniumsalze oder quaternäre Imidazoliumsalze. Quaternäre Ammoniumsalze werden bevorzugt verwendet.
Zu geeigneten polymeren festen Trägern gehören mikroporöse Membranen, die hergestellt und vertrieben werden von Pall Corp. als PosidyneTM oder BiodyneTM B-Membranen. Diese Träger weisen einen Nylon-Membran auf, die mit einem Polyester beschichtet ist, der quaternäre Ammoniumgruppen in den Poren aufweist. Zu anderen geeigneten Trägern gehören polymere Membrane, die mit oberflächenaktiven Mitteln beschichtet sind.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Ausführungsformen, bei denen das Antigen an den festen Träger vor der immunologischen Reaktion gebunden ist, kann der Assay dieser Erfindung auch durchgeführt werden durch Bildung des immunologischen Komplexes gleichzeitig mit oder vor der Bindung an den festen Träger. Mit anderen Worten: der Komplex kann in Lösung erzeugt werden mit anschließendem Kontakt mit dem festen Träger zur Bindung des Komplexes.
Der hier beschriebene Träger kann in Kombination mit einer anderen Ausrüstung verwendet werden (Flaschen, Teströhren, Tupfer, Becher oder Behälter) um den Assay durchzuführen. Alternativ und vorzugsweise ist der Träger eine mikroporöse Membran, die in eine Wegwerf-Testvorrichtung eingepaßt ist, in der der Assay durchgeführt werden kann, und in der alle Flüssigkeiten untergebracht sind. Geeignete Konfigurationen von Testvorrichtungen sind bekannt und werden beispielsweise beschrieben in den U.S.-Patentschriften 3 825 410, 3 888 629, 3 970 429 und 4 446 232. Besonders geeignete Vorrichtungen werden beschrieben in den EP-A-0 280 558 und EP-A-0 308 231.
Praktisch unmittelbar nach dem Kontakt des Antigens mit dem geladenen Träger wird das Antigen an den Träger gebunden. Falls erwünscht, kann jedes nichtgebundene Antigen von dem Träger entfernt werden durch Abwaschen mit jeder beliebigen geeigneten Waschlösung. Eine besonders geeignete Waschlösung enthält ein kationisches oberflächenaktives Mittel.
Eine repräsentative Lösung wird unten im Zusammenhang mit den Beispielen beschrieben.
Innerhalb von 10 Minuten, und vorzugsweise innerhalb von 1 bis 5 Minuten des Kontaktes, wird das gebundene Antigen mit chlamydialem oder gonokokkalem Antikörper in Kontakt gebracht, unter Bildung eines immunologischen Komplexes auf dem Träger. Flüssigkeit und ungebundene Materialien können rasch zum gleichen Zeitpunkt entfernt werden. Wird der Assay unter Verwendung einer Wegwerf-Testvorrichtung durchgeführt, so kann der Träger eine mikroporöse Membran sein, durch die Flüssigkeit und ungebundene Materialien in der Probe durchfließen gelassen werden, wenn das Antigen an die Membran gebunden wird.
Der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper kann in der immunologischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung verwendet werden, wobei die Zusammensetzung derart bezeichnet wird aufgrund des Vorhandenseins eines Antikörpers, der als immunologisches Reagenz betrachtet wird. Der Antikörper liegt in jeder geeigneten beliebigen Menge vor, die benötigt wird, um den Assay durchzuführen und die Menge hängt ab von der erwarteten Menge an zu bestimmendem Antigen. Im allgemeinen jedoch liegt der Antikörper in einer Menge von mindestens 1 ug/ml vor und zweckmäßiger in einer Menge von 2 bis 10 ug/ml.
Ferner vorhanden in der Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung sind ein oder mehrere nicht-immunologisch blockierende Proteine, wovon ein jedes einen pI-Wert von 4 bis 7 aufweist. Derartige Proteine werden als "nicht-immunologisch" bezeichnet, da sie nicht spezifisch mit einem entsprechenden Rezeptormolekül reagieren, wie beispielsweise einem antigenen Material oder einem anderen Protein. Diese Proteine sind "blockierend", da sie Zentren auf einem festen Träger blockieren, die mit dem Antikörper reagieren können. Zu blockierenden Proteinen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, gehören Casein, Alpha-Casein, Schweine-Gamma-Globulin und foetales Rinderserum. Andere sind bekannt. Falls erwünscht, können Mischungen verwendet werden.
Die Proteine werden ferner als solche mit einem pI von 4 bis 7 bezeichnet. Die Bezeichnung pI (oder isoelektrischer Punkt) ist bekannt als der pH-Wert, bei dem eine gleiche Anzahl von positiven und negativen Ladungen in einem Molekül exzistieren, so daß das Molekül bezüglich seiner Ladung neutral ist. Der pI-Wert eines Proteins kann unter Verwendung von Standard-Materialien und Standard-Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann der Wert gemessen werden durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer LKB-Ampholine PAG-Platte (Handelsbezeichnung, erhältlich von der Firma LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden), bei einem pH-Bereich von 3,5-9,5 und unter Verwendung von Standard- Kalibratoren. Das blockierende Protein liegt im allgemeinen in der Zusammensetzung dieser Erfindung in einer Menge von mindestens 0,05% und zweckmäßiger in einer Menge von 0,1 bis 2 Gew.-% vor.
Eine kritische Komponente der immunologischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung ist ein amphoteres oberflächenaktives Mittel, das in einer Menge von mindestens 0,001%, und vorzugsweise von 0,005 bis 2%, auf Gewichtsbasis, vorhanden ist.
Geeignete amphotere oberflächenaktive Mittel sind in Wasser löslich oder dispergierbar, mit immunologischen Reagenzien, die bei dem Assay verwendet werden verträglich und inert bezüglich anderer Reagenzien, die in dem Assay eingesetzt werden. Nach der Definition ist das oberflächenaktive Mittel bezüglich positiver und negativer Ladungen ausgeglichen. Zu besonders geeigneten Klassen von oberflächenaktiven Mitteln gehören, ohne eine Beschränkung hierauf solche mit Betain-, Imidazolin-, Sultain- oder Glycinatgruppen. Solche mit einer Betaingruppe werden bevorzugt verwendet.
Zu repräsentativen geeigneten oberflächenaktiven Mitteln gehören Fettsäurebetaine (z. B. die Tego-BetaineTM von der Firma Goldschmidt Chemical Corp., ScherotaineTM von der Firma Scher Chemical, Inc., EmcolTM 37-18, DG und NA-30 von der Firma Witco Chemical Co.), langkettige Alkylamidoalkylbetaine (z. B. solche wie JortaineTM von der Firma Jordan Chemical Co., LexaineTM von Firma Inolex Chemical Co., MafoTM von der Firma Mazer Chemical, Inc., LonzaineTM C von der Firma Lonza Chemical Co.), Sultaine (wie z. B. Cocamidopropylhydroxysultain, erhältlich als JortaineTM von der Firma Jordan Chemical Co., Cocamidopropylsultaine, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Lexaine von der Firma Inolex Chemical Co.), Glycinate wie beispielsweise erhältlich von der Firma Sherex Chemical Co.), Sulfobetaine (wie beispielsweise solche, die erhältlich sind von der Firma Sherex Chemical Co.), und Fettsäureimidaozoline (wie z. B. solche, die erhältlich sind von der Firma Sherex Chemical Co. Zu anderen geeigneten amphoteren oberflächenaktiven Mitteln gehören die DeriphatsTM (von der Firma Henkel Corp.), Imidazolincarbonsäuren (wie z. B. AmphotergeTM von der Firma Lonza Chemical Co.), die Betaine von der Firma Hart Product Corp. (HartaineTM CB-40), amphotere Salze (MiranolTM von der Firma Miranol Chemical Co.), komplexe carboxylierte quaternäre Fettsäureverbindungen (SanacTM von der Firma Capital City Product Co.). LonzaineTM C ist ein bevorzugtes amphoteres oberflächenaktives Mittel.
Viele amphotere oberflächenaktive Mittel, die diesen Erfordernissen genügen, sind bekannt und können unter Anwendung von Routineversuchen ermittelt werden. Das Standard- Werk von McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, Ausgabe 1986, McCutcheon Division, Publishing Co., Glen Rock, N.J. 1986 kann konsultiert werden, um eine Anzahl von geeigneten amphoteren oberflächenaktiven Mitteln aufzufinden.
Die Zusammensetzung kann andere gegebenenfalls - Komponenten enthalten, wie beispielsweise Präservative, Antioxidationsmittel, Puffer und Dispergiermittel. Die Zusammensetzung ist im allgemeinen auf einen pH-Wert von 6 bis 9 abgepuffert, unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Puffers.
Der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper, der in diesem Assay verwendet wird, ist spezifisch immunoreaktiv mit einem oder mehreren chlamydialen oder gonokokkalen Stämmen (je nach dem, welcher Organismus von Interesse ist). Er kann polyklonal oder monoklonal sein. Ist er polyklonal, so ist er im Handel erhältlich oder kann in verschiedenen Tieren erzeugt werden, unter Anwendung bekannter Techniken unter Verwendung eines Antigens für den Stamm des Organismus, der bestimmt werden soll. Verwendet werden kann ein einzelner Antikörper oder eine Mischung von Antikörpern. Beispielsweise kann ein Antikörper für das chlamydiale Lipopolysaccharid oder das hauptsächliche äußere Membranprotein -Antigen verwendet werden oder es können Antikörper für beide Antigene in dem Assay eingesetzt werden. Vorzugsweise sind die Antikörper monoklonal, die entweder im Handel erhältlich sind oder die unter Anwendung der Standard-Hybridoma- Technologie erzeugt werden können. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Antikörpern werden beispielsweise beschrieben in der EP-A-0 193 431 und in der U.S.-Patentschrift 4 427 782.
Im Falle einer Ausführungsform ist der Antikörper für das Antigen für die Bestimmung markiert. Geeignete Markierungen sind bekannt, wobei zu ihnen gehören chemische oder biologische Verbindungen, die direkt bestimmbar sind unter Anwendung geeigneter Verfahren und einer geeigneten Vorrichtung, wie auch Verbindungen, die durch weitere chemische oder spezielle Bindungsreaktionen unter Erzeugung einer bestimmbaren Species ermittelt werden können. Zu Beispielen für geeignete Markierungen gehören Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen, Biotin oder seine Derivate, Avidin oder seine Derivate, Ferritin, magnetisierbare Teilchen, gefärbte Teilchen und andere für den Fachmann leicht erkennbare Markierungen. Radioisotope oder Enzyme sind bevorzugte Markierungen. Die Markierungen können Antikörper unter Anwendung bekannter Techniken angebracht werden. Ist die Markierung nicht direkt bestimmbar, so werden weitere Reagenzien oder Verbindungen benötigt, um die Reaktion oder das spezielle Bindungsprodukt bestimmbar zu machen. Besteht die Markierung beispielsweise aus Biotin, so kann sie mit Avidin umgesetzt werden, das mit einem Enzym konjugiert ist, unter Bildung einer bestimmbaren Species. Besteht die Markierung aus einem Enzym, wie beispielsweise Glucoseoxidase, Urease, Peroxidase, alkalischer Phosphatase und anderen, so werden ferner Substrate und Farbstoffe liefernde Reagenzien benötigt.
Im Falle einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Markierung aus Peroxidase und zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Assays werden Wasserperoxid und geeignete einen Farbstoff bildende Reagenzien zugegeben, um einen bestimmbaren Farbstoff zu erzeugen. Beispielsweise gehören zu Farbstoffe liefernden Reagenzien Leucofarbstoffe, wie z. B. Triarylimidazol-Leucofarbstoffe (wie in der U.S.-Patentschrift 4 089 747 beschrieben, oder andere Verbindungen, die unter Bildung eines Farbstoffes in Gegenwart von Peroxidase sowie Wasserstoffperoxid reagieren (d. h. Verbindungen, die bei katalytischer Einwirkung von Peroxidase unter Erzeugung eines Farbstoffes reagieren).
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform ist der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper nicht markiert und die Bestimmung des Antikörper-Antigenkomplexes, der auf dem Träger erzeugt und an diesen gebunden wurde, erfolgt unter Verwendung eines zweiten Antikörpers (wie unten beschrieben) der spezifisch für den nichtmarkierten Antikörper ist, und der in geeigneter Weise markiert ist.
Nachdem das gebundene Antigen mit dem chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper in Kontakt gebracht worden ist, wird auf dem Träger ein gebundener immunologischer Komplex erzeugt. Um die Bildung dieses Komplexes zu beschleunigen werden der Antikörper und das Antigen im allgemeinen bei einer Temperatur von 15 bis 30ºC bis zu 10 Minuten lang inkubiert. Vorzugsweise wird die Inkubierung durchgeführt bei 18 bis 25ºC (d. h. bei Raumtemperatur) innerhalb von 1 bis 5 Minuten. Diese milden Inkubations-Bedingungen stehen in scharfem Kontrast zu den 30 Minuten bei 37ºC, die in der U.S.-Patentschrift 4 497 899 als notwendig für die Adsorption von chlamydialem Antigen auf blanken Trägern angegeben werden.
Nach der Inkubation und innerhalb von 10 Minuten nach dem Antikörper-Antigen-Kontakt werden nicht komplexgebundene Materialien von dem gebundenen Komplex abgetrennt, gewöhnlich durch ein- oder mehrmaliges Waschen mit einer abgepufferten Waschlösung.
Im Falle der oben beschriebenen Ausführungsform, bei der der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper markiert ist, besteht das Assay-Verfahren nach dem Waschen darin, die Markierung direkt oder indirekt nach Zugabe geeigneter Reagenzien zu bestimmen. Dies erfolgt relativ schnell nach dem Waschen des gebundenen Komplexes, d. h. im allgemeinen innerhalb von 10 Minuten, und vorzugsweise innerhalb von 1 bis 5 Minuten. Falls erwünscht, kann die Markierungsbestimmung beschleunigt werden durch eine Inkubierung, wenn dies die Reagenzien rechtfertigen. Die Markierung wird dann unter Anwendung einer Standard-Vorrichtung und Standard- Verfahren bestimmt.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform ist der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper nicht markiert und nach dem Waschen des gebundenen Komplexes wird er mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der auf den nicht markierten Antikörper gerichtet ist. Dieser zweite Antikörper (d. h. ein Anti-Antikörper) ist in geeigneter Weise mit einer der oben beschriebenen Markierungen markiert und kann in der Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung zugeführt werden, in der die hier beschriebenen Komponenten vorliegen. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und entweder käuflich erworben sein oder unter Anwendung bekannter Techniken hergestellt worden sein. Im Falle eines chlamydialen Assays ist der Anti-Antikörper vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper, der reaktiv ist mit entweder dem Lipopolysaccharid oder hauptsächlichen äußeren Membranprotein-Antikörpern.
Nach diesem Kontakt wird der erhaltene markierte Antigen- Antikörper-Antikörper-Komplex, der an den Träger gebunden ist, bis zu 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 15 bis 30ºC, und vorzugsweise 1 bis 5 Minuten lang bei 18 bis 25ºC inkubiert.
Eine Abtrennung von nicht komplexgebundenen Materialien von dem gebundenen markierten Komplex wird dann im allgemeinen durchgeführt durch weiteres Waschen unter Verwendung einer geeigneten Waschlösung, und geeignete Enzymsubstrate oder andere erforderliche Reagenzien werden zugesetzt, um eine bestimmbare Species zu erzeugen.
Der gebundene Komplex aus markiertem Antigen-Antikörpermarkiertem Antikörper wird dann auf dem Träger bestimmt, unter Anwendung von standardisierten radiometrischen, colorimetrischen, fluoreszierenden oder anderen Erkennungstechniken.
Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung von chlamydialen oder gonokokkalen Organismen umfaßt:
A. Das Kontaktieren von chlamydialem oder gonokokkalem Antigen, das extrahiert worden ist aus einer Probe, von der angenommen wird, daß sie chlamydiale bzw. gonokokkale Organismen enthält, mit einem festen polymeren Träger, um das Antigen an den festen Träger zu binden,
B. Das Kontaktieren des gebundenen Antigens innerhalb von 10 Minuten des Kontaktes mit der immunologischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung mit einem nicht markierten chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper, einem blockierenden Protein und einem amphoterem oberflächenaktiven Mittel wie oben beschrieben, um einen immunologischen Komplex zu erzeugen, der an den Träger gebunden ist,
C. Das Abtrennen von nicht komplexgebundenen Materialien innerhalb von 10 Minuten des Antikörper-Antigen-Kontaktes von dem gebundenen immunologischen Komplex,
D. Das Kontaktieren des gebundenen Komplexes mit der immunologischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung mit einem markierten Antikörper für den nicht markierten Antikörper, einem blockierenden Protein und einem amphoteren oberflächenaktiven Mittel wie oben beschrieben, unter Erzeugung eines markierten Antikörper-Antikörper-Antigen- Komplexes, der an den Träger gebunden ist,
E. Die Abtrennung von nicht komplexgebundenen Materialien innerhalb von 10 Minuten des Kontaktes in der Stufe D von dem gebundenen markierten Komplex, und
F. Die Bestimmung des Vorhandenseins des markierten Komplexes auf dem Träger als Maß für die Menge an chlamydialem oder gonokokkalem Organismus in der Probe.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen, jedoch den Schutzbereich nicht beschränken.
Der monoklonale Mäuse-Antikörper zum chlamydialen Lipopolysaccharid-Antigen wurde unter Anwendung der Standard- Hybridoma-Technologie hergestellt, sowie unter Verwendung einer Mäuse-Zellinie, und der Antikörper wurde aufbewahrt in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,4), enthaltend 0,01 (bezogen auf das Gewicht) Azid.
Der markierte polyklonale Antikörper, der verwendet wurde, war ein Ziegen-Anti-Mäuse-IgG-Antikörper, konjugiert bezüglich Merrettich-Peroxidase. Dieses Konjugat wurde im Verhältnis 1 : 2000 in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung verdünnt, die enthielt 0,5% (bezogen auf das Gewicht) Casein und 0,01% (bezogen auf das Gewicht) eines amphoteren oberflächenaktiven Mittels, nämlich LonzaineTM C, es wurde durch ein 0,22 um-Filter filtriert, unter Gewinnung einer Arbeitslösung.
Eine Antigen-Extraktionslösung wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt: Natriumazid (25 mg in 25 ml), Natriumchlorid (2,5 ml einer 1,5 molaren Lösung, verdünnt auf 25 ml), Dithiothreitol-Reduktionsmittel (29 mg in 25 ml), Ethanolamin (6,25 ml einer 10%igen Lösung, verdünnt auf 25 ml), Ethylendiamintetraessigsäure (0,23 g in 25 ml) und Natriumhydroxid (0,1 molar, pH-Wert eingestellt auf 12,5). Zu 15 ml dieser Lösung wurden zugegeben 375 ul einer 10% (bezogen auf das Gewicht) Lösung eines kationischen oberflächenaktiven Mittels, nämlich EmcolTM CC-36 (quaternäre Ammoniumchloride von Polypropoxy-t-Aminen) in Methanol.

Beispiel 1:

Immunologische Reagenzzusammensetzung, die sich für die Bestimmung von chlamydialen Organismen eignet

Die immunologische Reagenzzusammensetzung, die im Falle des Assays verwendet wurde, wurde hergestellt durch Zugabe einer Probe (19 ul) der Antikörperlösung, wie oben beschrieben, zu einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (Verdünnungsverhältnis 1 : 800), enthaltend Casein (0,5 Gew.-%) als nicht immunologisch blockierendes Protein und ein amphoteres oberflächenaktives Mittel, nämlich LonzaineTM C (0,01 Gew.-%), worauf durch ein 0,22 um-Filter filtriert wurde, um eine Zusammensetzung für die Verwendung in einem Assay für C. trachomatis zu erhalten.

Beispiel 2:

Bestimmung von Chlamydia trachomatis Lipopolysaccharid-Antigen

Dieses Beispiel veranschaulicht die Praxis der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von zwei Antikörpern, wovon der eine gerichtet ist auf das Lipopolysaccharid C. trachomatis Antigen, und wobei der zweite Antikörper markiert ist und gerichtet ist auf den chlamydialen Antikörper.
Der Assay wurde in einer Wegwerf-Testvorrichtung durchgeführt. Sie enthielt eine mikroporöse Membran mit quaternären Ammoniumgruppen auf der Oberfläche (im Handel erhältlich als Pall BiodyneTM B Membran, Pall Corp.). Vor der Verwendung wurde die Membran behandelt mit ZonylTM FSN (ein nichtionogenes fluoriertes oberflächenaktives Mittel, erhältlich von der Firma DuPont).
Chlamydiales Lipopolysaccharid-Antigen wurde von elementarem Körperprotein extrahiert (erhalten von Prof. W. J. Newhall der Indiana Universität) bei etwa 20ºC während etwa 5 Minuten unter Verwendung der oben beschriebenen Extraktionszusammensetzung. Citrat (100 ul einer 0,7 molaren Lösung) wurde dann zugegeben, um den pH-Wert auf etwa 7-8 zu vermindern, worauf eine im Handel erhältliche Protease zugegeben wurde (z. B. Protease P0652, erhältlich von Sigma Chemical, 400 ul einer 2 mg/ml mit Phosphat abgepufferten Salzlösung). Die Extraktion wurde weitere 5 Minuten lang bei etwa 20ºC fortgesetzt, worauf Wasserstoffperoxid und Natriumhydroxid (pH-Wert über 10) zugegeben wurden, um endogene Catalase, Peroxidase und Myeloperoxidase zu entfernen.
Die behandelte Probe wurde dann durch eine 5 Mikrometer- Membran filtriert, um unerwünschte Bestandteile zu entfernen. Der filtrierte Extrakt (120 ul) wurde in einen Testbehälter der Wegwerf-Testvorrichtung gegeben. Die Probenflüssigkeit wurde bei Kontakt durch die Membran fließen gelassen. Innerhalb von wenigen Sekunden war sämtliche Flüssigkeit durch die Membran abgeflossen und die oben beschriebene monoklonale Antikörperlösung wurde in den Testbehälter gegeben und entwässert.
Der an die Membran gebundene immunologische Komplex wurde zweimal mit einer Waschlösung gewaschen (160 ul) die als kationisches obenflächenaktives Mittel EmcolTM CC-9 (0,75 Gew.-%) in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH-Wert 7,2) enthielt.
Unmittelbar nach der zweiten Wäsche wurde die mit Peroxidase markierte polyklonale Antikörperlösung (120 ul) wie oben beschrieben in den Testbehälter gegeben und die Flüssigkeit wurde unmittelbar entwässert. Eine Inkubierung wurde bei etwa 20ºC durchgeführt, und zwar über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten, um einen Antigen-Antikörper-markierten Antikörperkomplex zu erzeugen, der ionisch an die Membran gebunden war.
Nach zweimaligem Waschen mit der oben beschriebenen Waschlösung (160 ul) wurde eine einen Farbstoff erzeugende Zusammensetzung (120 ul) in den Testbehälter gegeben. Diese Zusammensetzung enthielt Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)imidazol-Leucofarbstoff (0,005 Gew.-%), Poly(vinylpyrrolidon) (1 Gew.-%), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 mmolar).
Nach etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde ein roter Farbstoff in dem Testbehälter beobachtet, der das Vorhandensein von chlamydialem Antigen anzeigte, das aus der Probe erhalten worden war. Der gesamte Assay nach der Extraktion des Antigens wurde in weniger als 30 Minuten durchgeführt.

Beispiel 3:

Assay für LPS-Antigen unter Verwendung von stabilisiertem Dithiothreitol sowie einer Protease

Dieses Beispiel veranschaulicht die Praxis der vorliegenden Erfindung im Falle der Bestimmung des Lipopolysaccharid-Antigens von chlamydialen Organismen unter Verwendung der immunologischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung, AmideckTM-Protease (erhältlich von der Firma Eastman Kodak Company), und Dithiothreitol, stabilisiert durch Poly(acrylamid).
Es wurden 18 Proben von weiblichen Patienten unter Verwendung von Gebärmutterhalsabstrichen erhalten. Die Proben enthielten beträchtliche Mengen an ganzem Blut oder Schleim oder beides und wurden auf das Vorhandensein von C. trachomatis, unter Anwendung von Standard-Kulturtechniken getestet.

Verwendete Materialien:

Eine Extraktionsvorrichtung, wie jene, die in der U.S.-Patentschrift 4 746 614 beschrieben wird, wurde mit separaten getrockneten Beschichtungen hergestellt aus: (1) Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (von 20 ul einer 1,65 molaren Lösungen, pH 11,1) mit Thimerosal-Präservativ (0,1 Gew.-%), und (2) einer Mischung von Dithiothreitol (0,188 molar) von einer 50 ul Lösung, enthaltend 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (10 mmolar, pH 6,0), Natriumazid (1,54 mmolar), Ethylendiamintetraessigsäure (5,4 mmolar), Dimedon (21,4 mmolar) und Poly(acrylamid) (6,35 Gew.-%).
Eine Protease-Lösung wurde hergestellt mit AmideckTM- Protease (4 mg/ml, 170 Einheiten/mg), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (10 mmolar, pH 6), Natriumchlorid (50 mmolar), Calciumchlorid (5 mmolar), 1,2-Propandiol (10% w/v) und Präservativ (0,01 Gew.-%).
Eine Wasserstoffperoxid-Lösung wurde hergestellt mit 12% (bezogen auf das Gewicht) Wasserstoffperoxid, Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar) und Thimerosal-Präservativ (0,01 Gew.-%).
Die Waschlösung enthielt 3-Cyclohexylamino-2-hydroxy- 1-propansulfonsäure-Puffer (pH 10,0, 0,05 molar), ein kationisches oberflächenaktives Mittel, nämlich EmcolTM CC-9 (0,75 Gew.-%) und Präservativ (0,01 Gew.-%).
Eine zu Vergleichszwecken verwendete immunologische Reagenzzusammensetzung enthielt Anti-Kreatin-Kinase-MB-Antikörper (5 ug/ml), Casein (0,5 Gew.-%), ein amphoteres oberflächenaktives Mittel, nämlich LonzaineTM C (0,01 Gew.-%), Präservativ (0,01 Gew.-%) in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,2).
Eine immunologische Reagenzzusammensetzung wurde hergestellt mit monoklonalen Antikörpern bezüglich des Lipopolysaccharid-Antigens (4 ug/ml), erhalten in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,2), enthaltend Casein, als amphoteres oberflächenaktives Mittel LonzaineTM C und Präservativ, wie im Zusammenhang mit der Vergleichszusammensetzung angegeben.
Ziegen-Antimäuse-IgG-Antikörper, konjugiert bezüglich Merrettich-Peroxidase (Konjugat erhältlich von Bio-Rad) (Verdünnung 1 : 700) wurde geliefert in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,2) enthaltend Casein, als amphoteres oberflächenaktives Mittel LonzaineTM C und Präservativ, wie oben angegeben, wie auch 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar).
Eine Leucofarbstoffzusammensetzung enthielt 2-(4-Hydroxy- 3-methoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-imidazol-Leucofarbstoff (0,008 Gew.-%), Poly(vinyl-pyrrolidon) (1 Gew.-%), Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8, 10 mmolar), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar), 4'-Hydroxyacetanilid (2 mmolar) und Wasserstoffperoxid (10 mmolar).

Assay:

Der Assay wurde wie folgt beschrieben im Falle einer jeden der 18 Proben durchgeführt, unter Verwendung einer separaten Testvorrichtung im Falle einer jeden Probe. Die Proteaselösung (etwa 280 ul) wurde in die Extraktionsvorrichtung gegeben und der Abstrich eines Patienten wurde eingeführt, worauf 5 bis 10 Sekunden lang rotiert wurde, mit anschließender Inkubation 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (d. h. 18 bis 22ºC).
Dann wurde die Extraktionslösung (etwa 280 ul) in die Vorrichtung gegeben, die den Abstrich enthielt, die dann weitere 5 bis 10 Sekunden lang rotiert wurde, unter anschließender Inkubation bei Raumtemperatur über 3 Minuten.
Die Wasserstoffperoxidlösung wurde in die Vorrichtung gegeben und das Verfahren wurde wiederholt.
Die in der Extraktionsvorrichtung erhaltene Lösung wurde dann aus der Vorrichtung entfernt, und zwar unter Verwendung eines Pipette, sie wurde vorfiltriert und in jeden Behälter einer Wegwerf-Testvorrichtung gegeben, wobei etwa 160 ul in jeden Behälter gegeben wurden. Ein Behälter (#1) einer jeden Testvorrichtung wurde als Vergleichsbehälter betrachtet, während zwei andere Behälter (#2 und #3) als Testbehälter betrachtet wurden. Die Belüftung in der Vorrichtung wurde geöffnet, so daß eine Drainage aller Flüssigkeiten ermöglicht wurde. Jeder Behälter wurde dann mit der gleichen Waschlösung wie oben beschrieben (160 ul) gewaschen, unter Drainage.
Die Vergleichs-Antikörperlösung (etwa 80 ul) wurde in den Behälter #1 gegeben, während die Lipopolysaccharid-Antikörperlösung (etwa 80 ul) in jeden der Behälter #2 und #3 gegeben wurde, ohne Drainage. Die Inkubierung bei Raumtemperatur erfolgte über einen Zeitraum von 2 Minuten.
Nach der Drainage wurde die Waschstufe wiederholt, und die mit Peroxidase markierte Anti-Antikörperlösung (etwa 80 ul) wurde zu sämtlichen Behältern ohne Drainage zugegeben, worauf sich eine Inkubation bei Raumtemperatur über 5 Minuten anschloß.
Nach der Drainage und einer anderen Waschstufe wurde die Leucofarbstoffzusammensetzung in jeden Behälter ohne Drainage zugegeben. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur über 5 Minuten wurde die Farbstoffbildung durch Zugabe einer 0,01%igen Natriumazidlösung (etwa 120 ul) zu jedem Behälter unterbrochen und es erfolgte eine Drainage. Der Farbstoff, der sich auf der Membran eines jeden Behälters gebildet hatte, wurde visuell untersucht und beurteilt (0 bis 10, wobei 0 für keine Farbe steht). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt, in der die Assay-Ergebnisse mit jenen verglichen werden, die bei Anwendung der Standard-Kulturtechniken erzielt wurden. Ersichtlich ist, daß der Assay sehr genau war, unter Bestimmung sämtlicher negativer Proben und 83% der positiven Proben. TABELLE I Probe Kultur-Ergebnisse Visuell abgelesene Werte Vergleich Behälter Assay +/- Positiv Negativ Negativ Positiv * Kein Test, d. h. das Assayverfahren war inkorrekt.

Beispiel 4

Assay für chlamydiales Antigen unter Verwendung eines markierten chlamydialen Antikörpers

Dieses Beispiel veranschaulicht einen Assay für C. trachomatis unter Verwendung eines markierten chlamydialen Antikörpers und einer immunologischen Reagenzzusammensetzung gemäß dieser Erfindung. Zwei verschiedene Antikörper, gerichtet auf das hauptsächliche äußere Membranprotein (MOMP) wurden bezüglich Meerrettichperoxidase nach einer bekannten Methode (Yoshitake, Eur. J. Biochem., 101, 395, 1979) konjugiert. Die Konjugate wurden in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,4) aufbewahrt, die 0,01% (bezogen auf das Gewicht) Thimerosal enthielt, bis eine Verwendung im Assay erfolgte.
Elementare Serovar-H-Antigenkörper wurden von Professor W. J. Newhall von der Indiana Universität erhalten. Chlamydiales MOMP-Antigen wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur extrahiert, um Lösungen von extrahiertem Antigen herzustellen, die Antigen-Endkonzentrationen von 1500 und 4500 pg enthielten. Wasserstoffperoxid (1,5 ml einer 8%igen Lösung) wurde zu jeder Antigen-Extraktlösung zugegeben, hiermit vermischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten.
Die Lösungen (120 ul) wurden dann in Wegwerf-Testvorrichtungen gegeben, die eine mikroporöse Membran vom Typ BiodyneTM Nylon enthielten mit einer Vorbeschichtung mit einem oberflächenaktiven Mittel, nämlich ZonylTM FSN (0,05 Gew.-%), wobei die Lösungen durchfließen gelassen wurden.
Die mit Peroxidase markierten Antikörper (Konjugate 1 und 2) wurden zu jeder von zwei immunologischen Reagenzzusammensetzungen dieser Erfindung gegeben (120 ul), enthaltend Casein und als amphoteres oberflächenaktives Mittel LonzaineTM, wie folgt: Die Zusammensetzung 1 enthielt 1,25% (bezogen auf das Gewicht) Casein und 0,025% (bezogen auf das Gewicht) des oberflächenaktiven Mittels und die Zusammensetzung 2 enthielt 2% (bezogen auf das Gewicht) Casein und 0,04% (bezogen auf das Gewicht) des oberflächenaktiven Mittels. Es schloß sich eine 5 Minuten lange Inkubation bei Raumtemperatur an.
Die Membranen wurden dann zweimal mit einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (160 ul), enthaltend als kationisches oberflächenaktives Mittel EmcolTM CC-9 (0,75 Gew.-%) gewaschen. Leucofarbstofflösung (120 ul) wurde in die Testvorrichtungen gegeben, worauf sich eine 10 Minuten lange Inkubation bei Raumtemperatur anschloß, worauf die Farbstoffdichte bestimmt wurde.
Eine Vergleichslösung ohne Antigen wurde in entsprechender Weise getestet, um die Hintergrunddichte zu ermitteln.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt, in Form des Unterschiedes in der Transmissionsdichte (DeltaT) zwischen der Testlösung und der Vergleichslösung. TABELLE II Antigen Konzentration Antikörper Konjugat 1 DeltaT Antikörper Konjugat 2

Claims

1. Immunologische Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung eines chlamydialen oder gonokokkalen Antigens mit einem Antikörper für ein chlamydiales oder gonokokkales Antigen oder einen Antikörper für den chlamydialen oder gonokokkalen Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung weiterhin aufweist ein nicht-immunologisches blockierendes Protein mit einem pI von 4 bis 7, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung, und ein amphoteres oberflächenaktives Mittel in einer Menge von mindestens 0,001 Gew.-%.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das amphotere oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 0,005 bis 2 Gew.-% vorliegt.

3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 und 2, in der das oberflächenaktive Mittel eine Betain-, Imidazolin- oder Sultaingruppe aufweist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der das oberflächenaktive Mittel ein langkettiges Alkylamidoalkylbetain ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das Protein Casein, α-Casein, Porcin-gamma-globulin oder fetales Rinderserum ist.

6. Verfahren zur Bestimmung eines chlamydialen oder gonokokkalen Antigens, bei dem man:

A. chlamydiales oder gonokokkales Antigen, das aus einer Probe extrahiert worden ist, von der vermutet wird, daß sie chlamydiale bzw. gonokokkale Organismen enthält, mit einer immunologischen Reagenzzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kontakt bringt, um einen immunologischen Komplex des Antigens und des Antikörpers zu erzeugen, und bei dem man

B. vor, gleichzeitig mit oder nach der Komplexbildung entweder das Antigen oder den Antikörper oder beide auf einem festen Träger unlöslich macht, unter Erzeugung eines gebundenen immunologischen Komplexes, bei dem man

C. die nicht-komplex gebundenen Materialien von dem gebundenen immunologischen Komplex abtrennt, und bei dem man

D. das Vorhandensein des gebundenen Komplexes als Anzeichen der Menge an chlamydialem oder gonokokkalem Organismus in der Probe bestimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper markiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Antikörper mit einem Enzym markiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der chlamydiale oder gonokokkale Antikörper nicht markiert ist, und bei dem der gebundene nicht-markierte Antikörper-Antigenkomplex mit einem markierten Anti-Antikörper umgesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, für die Bestimmung eines chlamydialen Antigens.

11. Verfahren für die Bestimmung eines chlamydialen Organismus, bei dem man:

A. chlamydiales Antigen, das aus einer Probe extrahiert worden ist, von der vermutet wird, daß sie chlamydiale Organismen enthält, mit einem polymeren festen Träger kontaktiert, um das Antigen an den festen Träger zu binden, bei dem man

B. innerhalb von 10 Minuten des Kontaktes die Probe von dem gebundenen Antigen abtrennt und bei dem man das gebundene Antigen mit einem immunologischen Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kontaktiert, um einen immunologischen Komplex zu erzeugen, der an den Träger gebunden ist, bei dem man

C. innerhalb von 10 Minuten des Antikörper-Antigen- Kontaktes die nicht-komplex gebundenen Materialien von dem gebundenen immunologischen Komplex abtrennt, bei dem man

D. den gebundenen Komplex mit einer immunologischen Reagenzzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kontaktiert,

um einen markierten Antikörper-Antikörper-Antigen- Komplex, der an den Träger gebunden ist, zu erzeugen, bei dem man

E. innerhalb von 10 Minuten des Kontaktes in Stufe D die nicht-komplex gebundenen Materialien von dem gebundenen markierten Komplex abtrennt, und bei dem man

F. das Vorhandensein des markierten Komplexes auf dem Träger als Maß für die Menge des chlamydialen Organismus in der Probe bestimmt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, das mit einer mikroporösen Membran in einem Wegwerf-Testgerät durchgeführt wird.